CZ304320B6 - Farmaceutický prostředek obsahující bílkoviny tyrozin kinázy Src a Yes, společně s farmaceuticky přijatelným nosičem a předmět výroby - Google Patents
Farmaceutický prostředek obsahující bílkoviny tyrozin kinázy Src a Yes, společně s farmaceuticky přijatelným nosičem a předmět výroby Download PDFInfo
- Publication number
- CZ304320B6 CZ304320B6 CZ2002-2156A CZ20022156A CZ304320B6 CZ 304320 B6 CZ304320 B6 CZ 304320B6 CZ 20022156 A CZ20022156 A CZ 20022156A CZ 304320 B6 CZ304320 B6 CZ 304320B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- src
- protein
- vascular permeability
- yes
- pharmaceutical composition
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 239
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 174
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 61
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 title claims abstract description 38
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 title claims abstract description 37
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 title claims abstract description 19
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 claims abstract description 255
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 81
- 101150001535 SRC gene Proteins 0.000 claims description 368
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 141
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 94
- 102000009076 src-Family Kinases Human genes 0.000 claims description 80
- 108010087686 src-Family Kinases Proteins 0.000 claims description 80
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 64
- 239000005483 tyrosine kinase inhibitor Substances 0.000 claims description 50
- 229940121358 tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 claims description 49
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 37
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 34
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 31
- 150000004917 tyrosine kinase inhibitor derivatives Chemical class 0.000 claims description 30
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 29
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 26
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 25
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 claims description 24
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 claims description 21
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 20
- 230000008733 trauma Effects 0.000 claims description 17
- 230000002792 vascular Effects 0.000 claims description 17
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 17
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 claims description 14
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000013000 chemical inhibitor Substances 0.000 claims description 14
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 13
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000035699 permeability Effects 0.000 claims description 10
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 claims description 9
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 claims description 9
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 8
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 8
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims description 8
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 8
- JRZJKWGQFNTSRN-UHFFFAOYSA-N Geldanamycin Natural products C1C(C)CC(OC)C(O)C(C)C=C(C)C(OC(N)=O)C(OC)CCC=C(C)C(=O)NC2=CC(=O)C(OC)=C1C2=O JRZJKWGQFNTSRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 claims description 7
- QTQAWLPCGQOSGP-GBTDJJJQSA-N geldanamycin Chemical compound N1C(=O)\C(C)=C/C=C\[C@@H](OC)[C@H](OC(N)=O)\C(C)=C/[C@@H](C)[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H](C)CC2=C(OC)C(=O)C=C1C2=O QTQAWLPCGQOSGP-GBTDJJJQSA-N 0.000 claims description 7
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims description 6
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims description 5
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 claims description 5
- WYZWZEOGROVVHK-GTMNPGAYSA-N radicicol Chemical compound C/1=C/C=C/C(=O)CC2=C(Cl)C(O)=CC(O)=C2C(=O)O[C@H](C)C[C@H]2O[C@@H]2\1 WYZWZEOGROVVHK-GTMNPGAYSA-N 0.000 claims description 5
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 claims description 4
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 4
- 206010048962 Brain oedema Diseases 0.000 claims description 3
- 208000006752 brain edema Diseases 0.000 claims description 3
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 claims description 3
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 claims description 3
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 claims description 2
- 208000014912 Central Nervous System Infections Diseases 0.000 claims description 2
- 208000010248 Cerebrovascular Trauma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims description 2
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 claims description 2
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 claims description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 claims description 2
- 208000010926 vascular brain injury Diseases 0.000 claims description 2
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 claims 2
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 claims 2
- 208000011341 adult acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 claims 2
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 claims 2
- 208000025222 central nervous system infectious disease Diseases 0.000 claims 1
- 230000009693 chronic damage Effects 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 161
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 140
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 122
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 93
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 93
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 93
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 93
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 86
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 77
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 77
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 71
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 65
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 61
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 61
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 57
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 47
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 40
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 40
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 35
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 34
- 102000001332 SRC Human genes 0.000 description 32
- 108060006706 SRC Proteins 0.000 description 32
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 32
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 32
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 30
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 30
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 30
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 29
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 29
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 26
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 26
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 24
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 24
- 102000029330 CSK Tyrosine-Protein Kinase Human genes 0.000 description 23
- 108010069682 CSK Tyrosine-Protein Kinase Proteins 0.000 description 23
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 23
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 23
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 23
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 23
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 22
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 22
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 22
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 22
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 21
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 21
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 19
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 19
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 19
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 19
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 19
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 18
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 18
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 18
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 18
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 18
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 17
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 17
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 17
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 16
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 16
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 16
- 102100025580 Calmodulin-1 Human genes 0.000 description 15
- 101001091610 Homo sapiens Krev interaction trapped protein 1 Proteins 0.000 description 15
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 15
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 15
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 14
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 14
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 14
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 14
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 14
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- 101100058944 Gallus gallus CALM gene Proteins 0.000 description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 12
- ZOJBYZNEUISWFT-UHFFFAOYSA-N allyl isothiocyanate Chemical compound C=CCN=C=S ZOJBYZNEUISWFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 12
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 11
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 11
- 102000038008 SrcA subfamily Human genes 0.000 description 11
- 108091008119 SrcA subfamily Proteins 0.000 description 11
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 11
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 11
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 11
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- 201000006474 Brain Ischemia Diseases 0.000 description 10
- 206010008120 Cerebral ischaemia Diseases 0.000 description 10
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 description 10
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 10
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 10
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 10
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 9
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 9
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 9
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 9
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 9
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 8
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 8
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 8
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 8
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 8
- COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O Chemical compound CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N 0.000 description 7
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 7
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 7
- 208000000172 Medulloblastoma Diseases 0.000 description 7
- 229960003699 evans blue Drugs 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 7
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 7
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 7
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 7
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 6
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 6
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 6
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 6
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 6
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 6
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 6
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101000820294 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase Yes Proteins 0.000 description 5
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 5
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 5
- 235000016720 allyl isothiocyanate Nutrition 0.000 description 5
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 5
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 5
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 5
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 5
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 5
- 102000048099 human YES1 Human genes 0.000 description 5
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 5
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 description 5
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 4
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 4
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 4
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 4
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 4
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 4
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 4
- 102100024193 Mitogen-activated protein kinase 1 Human genes 0.000 description 4
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 4
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 4
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 4
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 4
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- -1 phosphoribosyl Chemical group 0.000 description 4
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 4
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 3
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000713800 Feline immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 3
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 3
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 3
- 102000038012 SFKs Human genes 0.000 description 3
- 108091008118 SFKs Proteins 0.000 description 3
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 3
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- GXJABQQUPOEUTA-RDJZCZTQSA-N bortezomib Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)B(O)O)NC(=O)C=1N=CC=NC=1)C1=CC=CC=C1 GXJABQQUPOEUTA-RDJZCZTQSA-N 0.000 description 3
- 229960001467 bortezomib Drugs 0.000 description 3
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 210000003711 chorioallantoic membrane Anatomy 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000014399 negative regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 3
- 201000003142 neovascular glaucoma Diseases 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 108700026239 src Genes Proteins 0.000 description 3
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 3
- 101150024474 yes gene Proteins 0.000 description 3
- LCJINPXTMHVZGV-UHFFFAOYSA-N 2,3,5-triphenyl-1h-tetrazol-4-ium;chloride Chemical compound [Cl-].[NH2+]1N(C=2C=CC=CC=2)N(C=2C=CC=CC=2)N=C1C1=CC=CC=C1 LCJINPXTMHVZGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000713826 Avian leukosis virus Species 0.000 description 2
- 241000713842 Avian sarcoma virus Species 0.000 description 2
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 2
- 206010008111 Cerebral haemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 2
- ITRJWOMZKQRYTA-RFZYENFJSA-N Cortisone acetate Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(=O)COC(=O)C)(O)[C@@]1(C)CC2=O ITRJWOMZKQRYTA-RFZYENFJSA-N 0.000 description 2
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 2
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 2
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 2
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000922131 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase CSK Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010051151 Hyperviscosity syndrome Diseases 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100022337 Integrin alpha-V Human genes 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 2
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010037423 Pulmonary oedema Diseases 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000713675 Spumavirus Species 0.000 description 2
- 229940122924 Src inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 241000030538 Thecla Species 0.000 description 2
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016549 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010048673 Vitronectin Receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000009692 acute damage Effects 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 2
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 208000037516 chromosome inversion disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 229960003290 cortisone acetate Drugs 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 2
- 230000000437 effect on angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000055892 human CSK Human genes 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 2
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 2
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 230000004089 microcirculation Effects 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 2
- 239000008164 mustard oil Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 210000004789 organ system Anatomy 0.000 description 2
- 108700025694 p53 Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 2
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 2
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 230000018883 protein targeting Effects 0.000 description 2
- 230000007398 protein translocation Effects 0.000 description 2
- 208000005333 pulmonary edema Diseases 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 2
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 230000004862 vasculogenesis Effects 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- OOIBFPKQHULHSQ-UHFFFAOYSA-N (3-hydroxy-1-adamantyl) 2-methylprop-2-enoate Chemical compound C1C(C2)CC3CC2(O)CC1(OC(=O)C(=C)C)C3 OOIBFPKQHULHSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N (3e)-3-(1h-imidazol-5-ylmethylidene)-1h-indol-2-one Chemical compound O=C1NC2=CC=CC=C2\C1=C/C1=CN=CN1 VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 150000005206 1,2-dihydroxybenzenes Chemical class 0.000 description 1
- KEUDMLLLHGLIGH-UHFFFAOYSA-N 1h-pyrazole;pyrimidine Chemical compound C=1C=NNC=1.C1=CN=CN=C1 KEUDMLLLHGLIGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 2-(ethylamino)ethanol Chemical compound CCNCCO MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 102100026802 72 kDa type IV collagenase Human genes 0.000 description 1
- 101710151806 72 kDa type IV collagenase Proteins 0.000 description 1
- 101150094949 APRT gene Proteins 0.000 description 1
- 108010024223 Adenine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029457 Adenine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 102000000412 Annexin Human genes 0.000 description 1
- 108050008874 Annexin Proteins 0.000 description 1
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 208000022211 Arteriovenous Malformations Diseases 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 101000645291 Bos taurus Metalloproteinase inhibitor 2 Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 208000004020 Brain Abscess Diseases 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100328086 Caenorhabditis elegans cla-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004031 Carboxy-Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000489 Carboxy-Lyases Proteins 0.000 description 1
- 229920000298 Cellophane Polymers 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 229940122097 Collagenase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010010144 Completed suicide Diseases 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 229940123736 Decarboxylase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 206010014612 Encephalitis viral Diseases 0.000 description 1
- 208000032274 Encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 208000035126 Facies Diseases 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 101000669513 Homo sapiens Metalloproteinase inhibitor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 101100321817 Human parvovirus B19 (strain HV) 7.5K gene Proteins 0.000 description 1
- 241000714192 Human spumaretrovirus Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical group 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- VVNCNSJFMMFHPL-GSVOUGTGSA-N L-penicillamine Chemical compound CC(C)(S)[C@H](N)C(O)=O VVNCNSJFMMFHPL-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 206010027202 Meningitis bacterial Diseases 0.000 description 1
- 102100039364 Metalloproteinase inhibitor 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010027480 Metastatic malignant melanoma Diseases 0.000 description 1
- 101100261636 Methanothermobacter marburgensis (strain ATCC BAA-927 / DSM 2133 / JCM 14651 / NBRC 100331 / OCM 82 / Marburg) trpB2 gene Proteins 0.000 description 1
- GMPKIPWJBDOURN-UHFFFAOYSA-N Methoxyamine Chemical compound CON GMPKIPWJBDOURN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701029 Murid betaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 208000009565 Pharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010034811 Pharyngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 101100124346 Photorhabdus laumondii subsp. laumondii (strain DSM 15139 / CIP 105565 / TT01) hisCD gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004211 Platelet factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000778 Platelet factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical class [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010021833 Proto-Oncogene Proteins c-yes Proteins 0.000 description 1
- 102000007696 Proto-Oncogene Proteins c-yes Human genes 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000007737 Retinal degeneration Diseases 0.000 description 1
- 206010038933 Retinopathy of prematurity Diseases 0.000 description 1
- 206010038997 Retroviral infections Diseases 0.000 description 1
- 208000005074 Retroviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 1
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 1
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 108060008245 Thrombospondin Proteins 0.000 description 1
- 102000002938 Thrombospondin Human genes 0.000 description 1
- 208000026062 Tissue disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 208000024248 Vascular System injury Diseases 0.000 description 1
- 208000012339 Vascular injury Diseases 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108070000030 Viral receptors Proteins 0.000 description 1
- JOOSFXXMIOXKAZ-UHFFFAOYSA-H [Au+3].[Au+3].[O-]C(=O)CC(S)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(S)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(S)C([O-])=O Chemical compound [Au+3].[Au+3].[O-]C(=O)CC(S)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(S)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(S)C([O-])=O JOOSFXXMIOXKAZ-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 102000019997 adhesion receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010013985 adhesion receptor Proteins 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 230000000320 anti-stroke effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000005744 arteriovenous malformation Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009904 bacterial meningitis Diseases 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 230000008344 brain blood flow Effects 0.000 description 1
- 201000008247 brain infarction Diseases 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 1
- 238000012410 cDNA cloning technique Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011116 calcium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 210000001627 cerebral artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000002442 collagenase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000010226 confocal imaging Methods 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000011254 conventional chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000007887 coronary angioplasty Methods 0.000 description 1
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000004246 corpus luteum Anatomy 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002385 cottonseed oil Substances 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- WZHCOOQXZCIUNC-UHFFFAOYSA-N cyclandelate Chemical compound C1C(C)(C)CC(C)CC1OC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 WZHCOOQXZCIUNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003954 decarboxylase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 125000001028 difluoromethyl group Chemical group [H]C(F)(F)* 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 208000002173 dizziness Diseases 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 230000000459 effect on growth Effects 0.000 description 1
- VLCYCQAOQCDTCN-UHFFFAOYSA-N eflornithine Chemical compound NCCCC(N)(C(F)F)C(O)=O VLCYCQAOQCDTCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 230000009762 endothelial cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 210000001652 frontal lobe Anatomy 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 125000002795 guanidino group Chemical group C(N)(=N)N* 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 201000011066 hemangioma Diseases 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 101150113423 hisD gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- CTCHDPAJHVDPRN-UHFFFAOYSA-N integrin Chemical compound C=1C(OC)=CC(O)=C(C(C=2CC=C(C)C)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C=C1O CTCHDPAJHVDPRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000003447 ipsilateral effect Effects 0.000 description 1
- 235000014413 iron hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- NCNCGGDMXMBVIA-UHFFFAOYSA-L iron(ii) hydroxide Chemical class [OH-].[OH-].[Fe+2] NCNCGGDMXMBVIA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000021 kinase assay Methods 0.000 description 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 208000021039 metastatic melanoma Diseases 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000037843 metastatic solid tumor Diseases 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 229960001639 penicillamine Drugs 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000026341 positive regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000019705 regulation of vascular permeability Effects 0.000 description 1
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 208000037974 severe injury Diseases 0.000 description 1
- 230000009528 severe injury Effects 0.000 description 1
- 210000000998 shell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- MNQYNQBOVCBZIQ-JQOFMKNESA-A sucralfate Chemical compound O[Al](O)OS(=O)(=O)O[C@@H]1[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](COS(=O)(=O)O[Al](O)O)O[C@H]1O[C@@]1(COS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)O1 MNQYNQBOVCBZIQ-JQOFMKNESA-A 0.000 description 1
- 229960004291 sucralfate Drugs 0.000 description 1
- 239000012622 synthetic inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 210000000966 temporal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940124788 therapeutic inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000003556 thioamides Chemical class 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008736 traumatic injury Effects 0.000 description 1
- YFDSDPIBEUFTMI-UHFFFAOYSA-N tribromoethanol Chemical compound OCC(Br)(Br)Br YFDSDPIBEUFTMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 101150081616 trpB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150111232 trpB-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 150000003668 tyrosines Chemical class 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000003966 vascular damage Effects 0.000 description 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006444 vascular growth Effects 0.000 description 1
- 210000004509 vascular smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 201000002498 viral encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N vitamin D3 Chemical class C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 1
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/45—Transferases (2)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Farmaceutický prostředek obsahující bílkoviny tyrozin kinázy Src a Yes, společně s farmaceuticky přijatelným nosičem. Použití farmaceutického prostředku pro ovlivnění vaskulární permeability (VP) v tkáních. Zahrnuty jsou rovněž související prostředky a výrobek.
Description
Oblast techniky
Navrhovaný vynález obecně spadá do oblasti medicíny a konkrétně popisuje způsoby a prostředky pro ovlivňování a inhibici vaskulámí permeability (VP).
Dosavadní stav techniky
Angiogeneze je proces vaskularizace tkáně, který zahrnuje růst nově se vyvíjejících krevních cév v tkáni a bývá také označován jako neovaskularizace. Proces je ovlivňován infiltrací endotheliálních buněk a buněk hladkého svalstva. Věří se, že tento proces probíhá jedním ze tří způsobů: céva se může oddělit zjiž dříve existující cévy, vývoj cévy de novo může probíhat z prekurzorových buněk (vaskulogeneze) nebo existující malá céva může zvětšovat svůj průměr. Blood et al., Bioch. Biophys. Acta, 1032:89-118 (1990). Aby angiogeneze mohla probíhat, endotheliální buňky musí nejprve degradovat a prostoupit bazální membránu krevní cévy podobným způsobem, jaký používají nádorové buňky během invaze a tvorby metastáz. Antiogeneze obvykle neprobíhá v dospělých nebo zralých tkáních, ačkoliv může probíhat při hojení zranění a během růstového cyklu žlutého tělíska (corpus luteum). Viz např. Moses et al., Science, 248:1408-1410 (1990). Zatímco angiogeneze je důležitý proces během neonatálního růstu, je rovněž nesmírně důležitá při hojení zranění a je důležitým faktorem při patogenezi celé řady klinických poruch zahrnujících záněty tkání, artritidu, nádorový růst, diabetickou retinopatii a pigmentózní degenerace sítnice a podobně. Tyto klinické projevy spojené s angiogenezí jsou označovány jako angiogenní choroby. Folkman et al., Science, 235:442^147 (1987).
Bylo zjištěno, že potlačení angiogeneze může být užitečnou terapií pro omezování růstu nádoru. K inhibici angiogeneze může docházet (1) potlačením uvolňování „angiogenních molekul“, jako jsou bFGF (basic fibroblast growth factor), (2) neutralizací angiogenních molekul například pomocí anti-pbFGF protilátek, (3) použitím inhibitorů receptorů vitronektinu ανβ.3 a (4) potlačením reakce endotheliálních buněk na angiogenní stimuly. Nejnadějnější je tato poslední strategie, kdy Folkman et al., Cancer Biology, 3:89-96 (1992) popisuje některé inhibitory reakce endotheliálních buněk zahrnující inhibitor kolagenázy, inhibitory převrácení bazální membrány, angostatické steroidy, inhibitory angiogeneze pocházející zhub, faktor destiček 4, thrombospondin, léky užívané pro léčbu artritidy, jako je např. D-penicillamin athiomalát zlatý, analogy vitamínu D3, interferon alfa apod., kdy všechny tyto látky jsou rovněž použitelné pro inhibici angiogeneze. Další použitelné inhibitory angiogeneze je možno nalézt v Blood et al., Bioch. Biophys. Acta, 1032:89-118 (1990), Moses et al., Science, 248:1408-1410 (1990), Ingber et al., Lab. Invest., 59:44-51 (1988) a patenty US 5 092 885, 5 112 964, 5 192 744, 5 202 352, 5 753 230, 5 766 591. Přesto v žádné z výše uvedených referencí nejsou mezi inhibitory angiogeneze zahrnuty proteiny Src.
Již dříve bylo zjištěno, že angiogeneze závisí na interakci mezi vaskulámími integriny a proteiny mezibuněčné hmoty. Brooks et al., Science, 264:569-571 (1994). Dále bylo zjištěno, že programovaná buněčná smrt (apoptóza) angiogenních vaskulámích buněk je spuštěna interakcí, která může být potlačena některými konkrétními antagonisty vaskulámích integrinů ανβ3. Brooks et al., Cell, 79:1157-1164 (1994). Nejnovější zjištění ukazují, že vazba metaloproteázy-2 mezibuněčné hmoty (MMP-2) na receptor vitronektinu (ανβ3) může být potlačena pomocí ανβ5 antagonistů a tímto způsobem je možné potlačit enzymatickou funkci této proteázy. Brooks et al., Cell, 85:683-893 (1996). Bylo zjištěno, že integriny av představují důležitou složku nezbytnou pro přežívání endotheliálních buněk během angiogeneze cév. Specifický antagonista integrinů otv blokuje diskrétní angiogenetické dráhy indukované růstovými faktory. Např. angiogeneze indukovaná pomocí vaskulámího endotheliálního růstového faktoru (VEGF) je blokována
- 1 CZ 304320 B6 pomocí antagonistů integrinu avp5, zatímco angiogeneze indukovaná bazickým fibroblastovým růstovým faktorem (bFGF) je blokována pomocí antagonistů integrinu ανβ3·
Mozkové cévy jsou charakteristické vysoce specifickou krevně mozkovou bariérou, která zabraňuje malým molekulám prostupovat do přilehlé mozkové tkáně. Povaha krevně mozkové bariéry u savců je středem zájmů celé řady farmakologických studií, neboť celá řada léčiv právě díky této vysoce specifické krevně mozkové bariéře nemůže prostupovat z krevního řečiště do mozku. Navrhovaný vynález zahrnuje rovněž nepředpokládané zjištění, že vaskulární permeabilita, měřená pomocí propustnosti krve, může být ovlivněna pomocí proteinu Src nebo Yes. Dále bylo zjištěno, že vaskulární permeabilita je spojena s angiogenezi a celou řadou patologických stavů. Zánětem vyvolaná zvýšená vaskulární permeabilita je spojena s otokem tkáně a jejím svraštěním.
Nezbytnost tyrozin kinázové aktivity proteinu Src pro angiogenezi indukovanou v EGF, ale ne bFGF, ukazuje, že v regulaci a aktivaci těchto signálů existují podstatné rozdíly, jak v kuřecím embryu, tak myších modelech. Eliceiri et al., Molecular Cell, 4:915-924 (1999).
Změny ve vaskulární permeabilitě dané angiogenními signály z nádorových buněk představují model pro sledování signalizačních drah spojených s rakovinou, přestože vaskulární permeabilita způsobená zraněním, nemocí nebo jiným traumatem krevních cév je ve většině případů zvýšená propustnost cév a otok spojený s poškozením tkáně. Například, cerebrovaskulámí choroba spojená s mozkovou příhodou nebo jiným vaskulárním poškozením mozku nebo míšní tkáně je nejběžnější neurologická porucha a v mnoha případech důvod invalidity. Obvykle poškození mozku nebo tkáně míchy v oblasti mozkové příhody vyvolává propustnost cév a/nebo edém. Mozková příhoda může zahrnovat zranění způsobené mozkovou ischémií, přerušením normálního průtoku krve do mozku, mozkovou nedostatečností způsobenou přechodnými poruchami krevního toku, infarktem způsobeným embolií nebo trombózou buď intrakraniálních, nebo extrakraniálních cév, krvácením, arteriovenózními malformacemi. Ischemická mrtvice a mozkové krvácení může vzniknout náhle a důsledek těchto příhod je obvykle závislý na poškozené oblasti mozku (viz. The Merck Manual, 16. vydání, kapitola 123, 1992).
Kromě mozkových příhod rovněž infekce nebo choroby centrálního nervového systému (CNS) mohou ovlivnit krevní cévy v mozku a míše a mohou způsobit zánět nebo edém tak, jak například způsobuje bakteriální meningitida, virová encefalitida a formování mozkových abscesů (viz. The Merck Manual, 16. vydání, kapitola 125, 1992). Systémové choroby mohou rovněž oslabit stěnu krevních cév a tím způsobit zvýšenou propustnost cév a otoky tak, jako v případě diabetů, nemocí ledvin, arterosklerózy apod. Vaskulární propustnost a vznik otoků jsou tedy kritické patologie, odlišné a nezávislé na rakovině, v případě kterých je třeba efektivního specifického terapeutického zásahu, a to zejména v případě celého spektra poranění, traumat nebo chorob.
Bylo zjištěno, že selektivní inhibici tyrozin kináz rodiny Src snížíme poškození nebo trauma spojené se zvýšením vaskulární permeability v tkáních, což vede k potlačení patologických stavů spojených se zvýšenou propustností krevních cév a/nebo vznikem otoků.
Podstata vynálezu
Navrhovaný vynález je zaměřen na ovlivnění vaskulární permeability tyrozin kinázou Src, zde bude označována jako Src, nebo tyrozin kinázou Yes, rovněž označovanou pouze jako Yes, nebo selektivní inhibici aktivity tyrozin kináz rodiny Src.
Vynález se týká farmaceutického prostředku obsahujícího bílkoviny tyrozin kinázy Src a Yes, společně s farmaceuticky přijatelným nosičem.
-2CZ 304320 B6
Tedy, jedním aspektem navrhovaného vynálezu je farmaceutický prostředek určený k ovlivnění vaskulámí permeability v cílové tkáni savců. V prostředcích podle navrhovaného vynálezu je obsaženo terapeuticky efektivní množství směsi tyrozin kináz Src a Yes ovlivňující vaskulámí permeabilitu ve farmaceuticky přijatelném nosiči.
Předpokládaný účinek prostředku, který obsahuje aktivní Src a Yes kinázy, je posílení nebo zvýšení vaskulámí permeability krevních cév v cílové tkáni. V případě, že požadovaný Src protein je aktivní kináza, nej vhodnější Src je Src-A. Dalším vhodným aktivním Src proteinem je ten, kde aminokyselinový zbytek na pozici 527 proteinu Src je jakákoliv aminokyselina kromě tyrozinu, šeřinu nebo threoninu. 'Nejvhodnější aktivní Yes protein by měl mít kinázovou aktivitu divokého typu lidského Yes, jako je například Yes-1 protein. Dalším vhodným aktivním Yes proteinem je takový, kde kinázové inaktivační fosforylační místo proteinu Yes je mutováno, aby zabránilo nebo minimalizovalo inaktivační fosforylaci, podobně jako mutace aminokyselinového zbytku 527 proteinu Src na jakoukoliv aminokyselinu kromě tyrozinu, šeřinu nebo threoninu.
Předpokládaný účinek prostředku, který obsahuje Src a Yes protein, které jsou ve formě neaktivních kináz, je snížení nebo potlačení vaskulámí permeability krevních cév v cílové tkáni. V případě, že požadovaný Src protein je neaktivní protein, nejvhodnějším Src je Src 251. Dalším vhodným neaktivním Src je Src K295M. Vhodný neaktivní Yes proteine bude postrádat kinázovou aktivitu na rozdíl od proteinu divokého typu.
Dalším aspektem navrhovaného vynálezu je farmaceutický prostředek obsahující therapeuticky účinné množství nukleových kyselin umožňující expresi tyrozin kináz Src a Yes ovlivňující vaskulámí permeabilitu, po transfekci do cílových buněk ve vhodném farmaceutickém nosiči. Exprimovatelné nukleové kyseliny kódující Src a Yes kinázy mohou obsahovat sekvence nukleových kyselin kódující celé proteiny nebo jejich části kináz Src nebo Yes. Po transfekci do cílových buněk dochází v těchto buňkách k přepisu a transkripci a translaci nukleových kyselin, což vede k expresi požadovaných proteinů.
Pokud cílem ovlivnění je posílení nebo zvýšení vaskulámí permeability krevní cév v cílové tkáni, nukleové kyseliny kódující Src budou kódovat aktivní formy Src a nukleové kyseliny kódující Yes budou kódovat aktivní formu Yes kinázy. Jakmile jsou přeneseny do cílové hostitelské buňky, jsou tyto nukleové kyseliny hostitelskou buňkou exprimovány. Nejvhodnější nukleové kyseliny kódující Src jsou ty, které kódují aktivní Src-A protein. Další vhodnou nukleovou kyselinou kódující Src je nukleová kyselina kódující mutované Src, kde aminokyselinový zbytek na pozici 527 exprimovaného Src proteinu je jakákoliv aminokyselina kromě tyrozinu, šeřinu nebo threoninu. Nejvhodnější nukleová kyselina kódující Yes protein kóduje protein divokého typu, nebo protein u modifikovaného tak, aby postrádal nebo potlačoval inaktivační fosforylační místo Yes proteinu podobným způsobem mutace aminokyselinového zbytku 527 proteinu Src, jak bylo popsáno výše.
Pokud je požadovaný účinek prostředku snížení nebo potlačení vaskulámí permeability krevních cév v cílové tkáni, nejvhodnější nukleovou kyselinou kódující neaktivní Src protein je nukleová kyselina kódující Src 251 protein. Další vhodnou nukleovou kyselinu kódující Src je nukleová kyselina kódující neaktivní Src K.295M. Nejvhodnější neaktivní nukleová kyselina kódující protein Yes bude kódovat protein, který postrádá proteinovou aktivitu.
Je zřejmé, že prostředek podle navrhovaného vynálezu může obsahovat směs nukleových kyselin, kde každá nukleová kyselina může obsahovat exprimovatelný gen pro Src nebo Yes. Navíc je také zřejmé, že jedna molekula nukleové kyseliny může obsahovat oba geny kódující jak Src protein, tak Yes protein. Pro požadované ovlivnění angiogeneze a vaskulámí permeability v cílové tkáni, farmaceutický prostředek podle navrhovaného vynálezu může obsahovat směs aktivních nebo neaktivních tyrozin kináz Src nebo tyrozin kináz Yes. Podobně farmaceutický prostředek podle navrhovaného vynálezu může obsahovat směs nukleových kyselin umožňujících expresi aktivní nebo neaktivní formy tyrozin kináz Src nebo tyrozin kináz Yes.
-3 CZ 304320 B6
Použitím různých množství první tyrozin kinázy podané současně s druhým vyšším množstvím druhé tyrozin kinázy, podle navrhovaného vynálezu, umožní citlivější modulaci. Podle této konkrétní varianty použitím promotorů s různou intenzitou exprese nebo jiných regulačních elementů, první tyrozin kináza, jejíž gen je exprimován v nižší míře, může být podávána zároveň s vysoce exprimovaným genem pro druhou tyrozin kinázu, podle navrhovaného vynálezu. V této konkrétní variantě může být dosaženo nárůstu angiogeneze nebo jejího udržení, minimalizací nebo potlačením vaskulámí permeability pomocí prvního genu s nízkou expresní aktivitou pro Src v kombinaci s druhým vysoce expresně aktivním Yes genem. Tato současná aplikace může být uskutečněna při použití oddělených expresních vektorů nebo pomocí jednoho kombinovaného expresního vektorového konstruktu. Podobně, snížení angiogeneze může být dosaženo nebo udrženo posílením nebo zvýšením vaskulámí permeability, za použití prvního genu s nízkou expresní aktivitou pro Src vkombinaci s druhým vysoce expresně aktivním Yes genem. Další stupně modulace mohou být dosaženy pomocí různých permutací vysokých/nízkých a Src/Yes v kombinaci s volbou aktivity promotorových elementů a indukovatelných promotorů.
Je zřejmé, že jednotlivé geny pro Src a Yes mohou být pod regulační kontrolou stejné nebo různých regulačních sekvencí nukleové kyseliny, kterými mohou být například posilovače, represory a promotory. V případě, že jeden nebo více proteinů je exprimováno ze stejného vektoru, je zřejmé, že regulace a kontrola transkripce nezávislých genů pro jednotlivé proteiny může být pod kontrolou stejných regulačních jednotek. Je také zřejmé, že regulace a kontrola transkripce může probíhat pomocí dvou nebo více nezávisle operujících regulačních jednotek. Regulační elementy známé v současném stavu techniky mohou být konstitutivně aktivní, nebo indukovatelné, posilovače, promotory, supresory nebo podobné nukleotidové sekvence.
Je zřejmé, že prostředek obsahující nukleové kyseliny podle navrhovaného vynálezu může obsahovat virové a/nebo nevirové vektory pro přenos genů obsahující nukleotidové sekvence kódující proteiny Src a/nebo Yes. Retrovirové a nevirové vektory zajišťující přenos a expresi genu jsou známé v současném stavu techniky a zkráceně popsány dále.
Nejvhodnější nukleová kyselina bude kódovat Src-A protein. Další vhodný aktivní Src protein je takový, ve kterém aminokyselina na pozici 527 proteinu Src je jakákoliv aminokyselina, kromě tyrozinu, šeřinu nebo threoninu.
Je zřejmé, že směs Src a Yes proteinů a/nebo nukleových kyselin kódující tyto kyseliny může kombinovat aktivní a neaktivní formy těchto proteinů v závislosti na požadované míře ovlivnění a společném požadovaném účinku na angiogenezi a vaskulámí permeabilitu, jak je uvedeno v navrhovaném vynálezu.
Prostředek obsahující proteiny Src nebo Yes může obsahovat přečištěný protein, biologicky aktivní fragmenty přirozených proteinů, rekombinantně produkované Src nebo Yes proteiny nebo proteinové fragmenty fúzních proteinů, nebo geny/nukleotidové expresní vektory pro expresi Src nebo Yes proteinů, nebo jejich směsi. V případě, že Src nebo Yes proteiny jsou inaktivované nebo inhibované, ovlivněním je potlačení vaskulámí permeability. V případě, že proteiny Src nebo Yes jsou aktivní nebo aktivované, ovlivněním je posílení vaskulámí permeability.
Navrhovaný vynález zahrnuje způsoby léčby savčí tkáně pomocí prostředku obsahujícího therapeuticky účinné množství Src nebo Yes, nebo jejich kombinací, které bude ovlivňovat vaskulámí permeabilitu. Podle způsobů navrhovaného vynálezu jsou tyrozin kinázy Src a Yes, nebo nukleové kyseliny ve formě expresních vektorů zajišťující expresi těchto proteinů aplikované do tkáně trpící poruchou, která může být ovlivněna modulací vaskulámí permeability. V případě, že jako terapeutický zásah při ovlivnění vaskulámí permeability je požadováno zvýšení nebo posílení vaskulámí permeability, je třeba aplikovat aktivní formy Src proteinu a/nebo Yes proteinu. Podobně, je popsán způsob aplikace exprimovatelných nukleových kyselin, které kódují aktivní nebo neaktivní formy Src a/nebo Yes proteinu.
-4CZ 304320 B6
Tkáň, kteráje léčena může být jakákoliv tkáň, ve které je třeba ovlivnit vaskulámí permeabilitu. Terapeutická léčba probíhá aplikací efektivního množství prostředku s požadovaným účinkem do cílové tkáně a dostatečně dlouhým působením proteinu nebo nukleových kyselin obsažených v léčebném prostředku v cílové tkáni. Pro potlačení vaskulámí permeability je užitečné ošetřit porušenou tkáň v místě, kde je propustnost cév narušena. Příkladem takové tkáně je tkáň, ve které probíhá zánět, tkáň zasažená mrtvicí, infarkt myokardu nebo jiného zablokování normálního průtoku apod.
Pro posílení je vhodné léčit pacienty trpící ischemickými chorobami končetin, ve kterých je oslabený krevní oběh v případě diabetů, nebo jiných poruch, nebo pro posílení prostupu léčiv určených pro léčbu mozku přes krevně mozkovou bariéru. Pacienti s chronickými zraněními, která se nehojí, mohou být rovně léčeni díky nárůstu proliferace vaskulámích buněk a neovaskularizaci, kteráje ovlivněna vaskulámí permeabilitou.
Dalším aspektem navrhovaného vynálezu je předmět výroby, která zahrnuje balicí materiál a farmaceutický prostředek obsažený uvnitř uvedeného balicího materiálu, kde tento farmaceutický prostředek je schopen ovlivnit vaskulámí permeabilitu v tkáni trpící chorobou, přičemž uvedený balicí materiál obsahuje etiketu, na které je uvedeno, že popisovaný farmaceutický prostředek může být použit pro léčbu chorob pomocí ovlivnění vaskulámí permeability a kde tento farmaceutický prostředek obsahuje therapeuticky účinné množství tyrozin kináz Yes ve farmaceuticky přijatelném nosiči. Tato varianta popisuje protein Yes v aktivní nebo neaktivní formě a také nukleovou kyselinu kódující nebo neaktivní protein Yes. Jak retrovirové, tak nevirové přenosové/expresní vektory pro přenos genů mohou obsahovat nukleotidovou sekvenci kódující protein Yes buď v aktivní nebo neaktivní formě, nebo oboje. Pokud jsou přítomny obě, aktivní i neaktivní, formy protein kinázy, je třeba, aby geny byly pod kontrolou oddělených indukovatelných promotorů umožňujících alternativní expresi podle požadavků léčby.
Dalším aspektem navrhovaného vynálezuje předmět výroby popisující farmaceutický prostředek obsahující therapeuticky účinné množství tyrozin kináz Src a Yes ovlivňující vaskulámí permeabilitu, ve farmaceuticky přijatelném nosiči. V případě, že příslušné balení je určeno pro ovlivnění ve smyslu posílení vaskulámí permeability, Src a Yes jsou v aktivní formě. Vhodná aktivní forma proteinu Src je Src-A protein. Další vhodný aktivní Src protein je takový, kde aminokyselina v pozici 527 proteinu Src je jakákoliv aminokyselina kromě tyrozinu, šeřinu nebo threoninu.
Dalším aspektem navrhovaného vynálezu popisuje předmět výroby, která zahrnuje farmaceutické prostředky, přičemž tento farmaceutický prostředek zahrnuje therapeuticky účinné množství neaktivní tyrozin kinázy Src a Yes ovlivňující vaskulámí permeabilitu, ve farmaceuticky přijatelném nosiči, přičemž smyslem požadovaného ovlivnění je potlačení nebo snížení vaskulámí permeability. Vhodný neaktivní protein Src je protein Src 251. Neaktivním proteinem Src je protein Src K295M.
Podobně dalším aspektem navrhovaného vynálezu jsou oblasti výroby, kde farmaceutický prostředek obsahuje nukleovou kyselinu umožňující expresi tyrozin kináz Src a Yes ve vhodném farmaceutickém nosiči. Nejvhodnější nukleové kyseliny tvořící část tohoto farmaceutického prostředku, podle této oblasti výroby, kódují aktivní protein Src, přičemž smyslem ovlivnění je posílení nebo aktivace vaskulámí permeability. Další možností jsou nukleové kyseliny kódující aktivní Yes protein. Vhodná aktivní forma proteinu Src je Src-A protein. Další vhodný aktivní Src protein je takový, kde aminokyselina v pozici 527 proteinu Src je jakákoliv aminokyselina kromě tyrozinu, šeřinu nebo threoninu. Je také zřejmé, že je možné připravit jednu nukleovou kyselinu, kteráje schopna exprimovat oba geny Yes i Src buď nezávisle regulované, nebo pod transkripční kontrolou stejného promotoru, posilovače, supresoru, represoru, nebo jiných vhodných regulačních sekvencí nukleové kyseliny.
-5CZ 304320 B6
Poškození tkáně spojené se zvýšenou propustností cév a/nebo otokem spojeným se změnami vaskulární permeability je možné léčit pomocí inhibitoru tyrozin kináz rodiny Src. Za tímto účelem je do narušené tkáně, která má být léčena aplikováno efektivní množství inhibitoru tyrozin kináz rodiny Src schopných ovlivnit vaskulární permeabilitu. Poškození tkáně způsobené zvýšenou propustností cév nebo otokem je tímto způsobem možno podstatně snížit.
Navrhovaný vynález popisuje konkrétně způsob inhibice zvýšení vaskulární permeability v tkáni trpící poruchou spojenou se zvýšenou propustností cév a/nebo otokem aplikováno efektivní množství inhibitoru tyrozin kináz rodiny Src schopných ovlivnit vaskulární permeabilitu zároveň s farmaceuticky aktivním nosičem. V nej vhodnější variantě je specifický inhibitor tyrozin kinázy Src aplikován do tkáně.
Jakýkoliv patologický stav zahrnující zhoubné zvýšení vaskulární permeability vyvolané zraněním a poškození tkáně způsobené propustností cév nebo otokem může být touto metodou léčen. Tyto patologické stavy mohou zahrnovat trauma krevních cév, jako je fyzické napojení, zablokování, oddělení, uzavření, trauma apod. Další systémové patologické stavy, jako je arterioskleróza, diabetózní retinopatie, zánětlivé choroby způsobené mikrobiálními infekcemi, artritida apod. mohou být rovněž léčeny pomocí způsobů podle navrhovaného vynálezu.
Způsoby navrhovaného vynálezu jsou použitelné pro léčbu cerebrovaskulámích chorob nebo traumat potlačením poškození tkáně, které je způsobeno zvýšenou vaskulární propustností a/nebo otokem, kterýje s touto poruchou spojen. Konkrétně, způsoby podle navrhovaného vynálezu jsou použitelné pro ochranu tkáně před poškozením spojeným s nárůstem vaskulární permeability indukovaným VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) a mediovaným Src. Přesto způsoby podle navrhovaného vynálezu nejsou omezeny pouze pro VEGF indukovaný nárůst vaskulární permeability, ale jsou také vhodné pro ovlivnění nárůstu vaskulární permeability vyvolaném tyrozin kinázami rodiny Src v odpovědi na další regulační signály.
Konkrétně, inhibici tyrozin kináz Src (také zde zkráceně označovanou jako Src) a blízkou příbuznou tyrozin kinázou Yes (také zde zkráceně označovanou jako Yes) léčená tkán může být specificky ovlivněna tak, aby v ní došlo ke snížení vaskulární permeability spojené se zraněním nebo chorobou.
Vhodný inhibitor tyrozin kináz rodiny Src pro účely navrhovaného vynálezu může být chemický inhibitor patřící do skupiny zahrnující PPI, PP2, PD173955, AGF1872, PD162531, Radiciol R2146 a Geldanamycin. Pro použití podle navrhovaného vynálezu je možno použít i jiné chemické inhibitory tyrozin kináz rodiny Src.
Vaskulární permeabilita může být také ovlivněna aplikací inhibitorů tyrozin kináz rodiny Src, kterým je proteinový inhibitor do tkáně, jako je neaktivní Src protein, jako Src K295M, nebo Src 215, nebo neaktivní Yes protein, nebo aktivní c-terminální Src kinázový protein (CSK).
Pro ovlivnění vaskulární permeability v tkáni jsou také důležité nukleové kyseliny kódující inhibiční protein tyrozin kináz rodiny Src, jako je neaktivní Src, neaktivní Yes anebo aktivní CSK protein. Tyto inhibitory tyrozin kinázové aktivity rodiny Src na bázi nukleových kyselin mohou zahrnovat jeden nebo více retrovirových expresních vektorů, nevirové expresní vektory, apod. Tyto inhibitory tvořené nukleovou kyselinou by měly obsahovat vhodné regulační signály, jako jsou promotory nebo posilovače jednoho nebo více exprimovatelných segment nukleových kyselin na libovolné molekule nukleové kyseliny.
Další aspekt navrhovaného vynálezu se týká oblasti výroby zahrnující balicí materiál a farmaceutický prostředek obsažený uvnitř tohoto balicího materiálu, přičemž tento farmaceutický prostředek je schopen ovlivnit vaskulární permeabilitu vtkáni trpící příslušnou chorobou. Balicí materiál obsahuje etiketu, na které je uvedeno, že příslušný farmaceutický prostředek může být použit pro léčbu vaskulární propustnosti nebo otoků spojených s poruchou a farmaceutický
-6CZ 304320 B6 prostředek obsahuje terapeuticky účinné množství inhibitorů tyrozin kináz rodiny Src ve farmaceuticky přijatelném nosiči.
Vzhledem k výrobě, navrhovaný vynález může obsahovat jako součást farmaceutického prostředku inhibitor tyrozin kináz rodin Src chemické povahy. Konkrétně, nej vhodnější inhibitor tyrozin kináz rodin Src chemické povahy by měl patřit do skupiny zahrnující PPI, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicol R2146 a Geldanamycin, nebo látky s podobnou schopností inhibovat aktivitu Src. Nej vhodnějším inhibitorem je PPI.
V oblasti výroby podle navrhovaného vynálezu je rovněž zahrnut farmaceutický prostředek obsahující proteinový inhibitor tyrozin kináz rodiny Src, kterým je neaktivní protein Src, jako je např. Src K295M nebo Src 251, neaktivní protein Yes nebo aktivní CSK protein.
Dále je možné, aby farmaceutický prostředek obsahoval nukleovou kyselinu kódující inhibitor tyrozin kináz rodiny Src ve farmaceuticky přijatelném nosiči. V tomto farmaceutickém prostředku může být inhibitorem kódovaným nukleovou kyselinou neaktivní protein Src, jako je např. Src K295M nebo Src 251, neaktivní protein Yes nebo aktivní CSK protein.
Předmět výroby může zahrnovat jeden nebo více farmaceutických prostředků, které obsahují terapeutické inhibitory tyrozin kináz rodiny Src nebo sub-terapeutické množství jednoho nebo více inhibitorů tyrozin kináz rodiny Src ve farmaceuticky přijatelném nosiči.
Farmaceutický prostředek podle navrhovaného vynálezu může obsahovat směs jednoho nebo více inhibitorů tyrozin kináz rodiny Src v sub-terapeutickém množství ovlivňujícím vaskulámí permeabilitu, které při společném působení zajistí požadované snížení vaskulámí permeability v ošetřené tkáni. Farmaceutický prostředek popisovaný v článku výroby podle navrhovaného vynálezu se může odlišovat podle požadovaného modulačního účinku a etiketa na obalu by měla odpovídat těmto změnám.
Farmaceutický prostředek popisovaný v článku výroby podle navrhovaného vynálezu se může odlišovat podle požadovaného modulačního nebo inhibičního účinku a etiketa na obalu by měla odpovídat těmto změnám.
Detailní popis vynálezu
A. Definice
Aminokyselinový zbytek: aminokyselina vzniklá chemickým štěpením (hydrolýzou) polypeptidu v peptidových vazbách. Aminokyselinové zbytky zde popisované jsou nejčastěji v „L“ izomemí formě. Přesto, zbytky v „D“ izomemí formě mohou nahradit jakýkoliv L-aminokyselinový zbytek, dokud si polypeptid zachová svoje funkční vlastnosti. NH2 označuje volný konec aminokyseliny nacházející se na amino-konci polypeptidu. COOH označuje volný konec aminokyseliny nacházející se na karboxy-konci polypeptidu. V souladu se standardní nomenklaturou polypeptidů (viz J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969) a uznáno jako 37 CFR §1.822 (b) (2)).
Je třeba uvést, že všechny sekvence aminokyselinových zbytků jsou zde uváděny ve vzorcích, u kterých je pravo-levá orientace v konvenčním směru od amino-konce ke karboxy-konci. Dále je třeba uvést, že uvozovky na začátku, a nebo konci sekvence aminokyselinových zbytků označují peptidovou vazbu k další sekvenci jednoho nebo více aminokyselinových zbytků.
Polypeptid: popisuje lineární sérii aminokyselinových zbytků napojených navzájem peptidovou vazbou mezi α-amino skupinou a karboxy koncem následující aminokyseliny.
-7CZ 304320 B6
Peptid: tak, jak je zde používán, popisuje tento termín lineární sérii ne více než 50 aminokyselinových zbytků napojených navzájem stejně jako v případě polypeptidu.
Cyklický peptid: tak, jak je zde používán, popisuj tento termín sloučeninu s kruhovou strukturou heteroatomu, která zahrnuje několik amidových vazeb jako v typickém peptidů. Cyklický peptid může být homodetický „začátek ke konci“ zacyklený lineární peptid, kde n-konec lineárního peptidů tvoří amidovou vazbu s c-terminálním karboxylem lineárního peptidů, nebo může obsahovat kruhovou strukturu kde polymer je heterodetický a obsahuje amidové vazby a/nebo jiné vazby které uzavírají cyklus, jako jsou disulfidické vazby, thioestery, thioamidy, guanidino a podobné vazby.
Protein: tak, jak je zde používán, popisuje tento termín lineární sérii více než 50 aminokyselinových zbytků napojených navzájem stejně jako v případě polypeptidu.
Fúzní protein: tak, jak je zde používán, popisuje tento termín polypeptid obsahující alespoň dvě odlišné polypeptidové domény operativně spojené typickou peptidovou vazbou (fúzované), kde dvě domény odpovídají peptidům, které se v přirozeném prostředí fúzované nenacházejí.
Syntetický peptid: tak, jak je zde používán, popisuje tento termín chemicky připravený řetězec aminokyselinových zbytků spojených dohromady peptidovou vazbou, který neobsahuje přirozeně se vyskytující proteiny ajejich fragmenty.
B. Obecné předpoklady
Navrhovaný vynález popisuje obecně: (1) zjištění, že vaskulámí permeabilita vyvolaná pomocí VEGF je specificky vyvolána tyrozin kinázami rodiny Src a Yes a že vaskulární permeabilita může být ovlivněna aplikací buď aktivní, nebo neaktivní formy proteinů Src a Yes pro potlačení, nebo posílení angiogeneze, respektive, (2) další zjištění, že vaskulámí propustnost a/nebo otok spojené s traumatem, poruchou nebo zraněním vyvolávajícím nárůst vaskulámí permeability mohou být specificky ovlivněny a potlačeny inhibici aktivity tyrozin kináz rodiny Src, a (3) zjištění, že aplikace inhibitoru tyrozin kináz rodiny Src in vivo zmenší poškození tkáně způsobené nárůstem vaskulámí permeability vyvolané chorobou nebo zraněním, v případě že se nejedná o rakovinu nebo angiogenezí.
Toto zjištění je důležité, díky úloze, kterou vaskulámí permeabilita hraje v celé řadě chorob, procesů a ve spojení s angiogenezí, tvorbou nových krevních cév. V případě, že je tkáň postižena chorobou vyžadující angiogenezí pro růst tkáně, je žádoucí potlačit angiogenezí a tím potlačit chorobný růst tkáně. Angiogeneze může být účinněji potlačena za současného snížení vaskulámí permeability. V případě, že poškozená tkáň vyžaduje pro růst a uzdravení angiogenezí, je žádoucí posílit nebo vyvolat vaskulární permeabilitu a tím angiogenezí a tak zajistit růst tkáně a uzdravení.
V případě, že vznik nových krevních cév je příčinou, nebo průvodním jevem, patologie spojené s nemocnou tkání, potlačení vaskulámí permeability a tím angiogeneze sníží zhoubný účinek choroby. Potlačením vaskulámí permeability spojené s angiogenezí je možné ovlivnit průběh choroby, potlačit její příznaky a v některých případech dokonce chorobu vyléčit.
V některých případech je zvýšení vaskulámí permeability žádoucí pro zvýšení účinnosti přenosu léčiv po systémovém podání. Krevně mozková bariéra je termín popisující přesnou regulaci vaskulámí permeabilita způsob minimalizace prostupu dokonce i malých molekul do mozku z krevního oběhu. Schopnost selektivně a specificky ovlivnit permeabilitu krevně mozkové bariéry pomocí ovlivnění vaskulámí permeability v příslušných krevních cévách umožní aplikaci léčiv, které by jinak nebyly schopny projít z krevního oběhu do mozkové tkáně.
-8CZ 304320 B6
Podobně, řada patologií a poškození vyvolaných mrtvicí je vyvoláno následným nárůstem vaskulámí permeability a tedy možnost specificky ovlivňovat vaskulámí permeabilitu umožní nové a účinné léčebné postupy pro potlačení nežádoucích účinků mrtvice.
Způsoby podle navrhovaného vynález jsou velmi účinné neboť taková terapie je vysoce selektivní pro vaskulámí permeabilitu a ne pro další biologické procesy.
Navrhovaný vynález popisuje v jedné části zjištění, že angiogeneze je vyvolána proteinem tyrozin kinázou Src a tedy že antiogenezi je možno ovlivňovat aplikací buď aktivní, nebo neaktivní formy proteinu Src pro posílení nebo potlačení angiogeneze.
Toto zjištění je důležité díky úloze kterou angiogeneze, tedy tvorba nových krevních cév, hraje v celé řadě chorob. V případě, že tkáň postižená chorobou vyžaduje angiogenezi pro růst tkáně, je žádoucí angiogenezi potlačit a tím potlačit růst nemocné tkáně. V případě, že zraněná tkáň vyžaduje angiogenezi pro růst tkáně a hojení, je žádoucí posílit nebo vyvolat angiogenezi a tím dosáhnout růstu a hojení tkáně.
V případě, že růst nových krevních cév je příčinou, nebo průvodním jevem, patologie spojené s nemocnou tkání, potlačení angiogeneze sníží zhoubný účinek choroby. Potlačením angiogeneze je možné ovlivnit průběh choroby, potlačit její příznaky a v některých případech dokonce chorobu vyléčit.
Příkladem tkáně spojené s chorobou a neovaskularizací, kde je přínosem potlačit angiogenezi jsou např. revmatoidní artritida, diabetická retinopatie, zánětlivé choroby, restenosis a podobně.
V případě, že růst nových cév je nezbytný pro podporu růstu zhoubné tkáně, potlačení angiogeneze sníží krevní zásobení tkáně a tím přispěje ke snížení množství tkáně díky nezbytnosti krevního zásobení. Příkladem může být růst nádorů, kde neovaskularizace je neustálým požadavkem pro to aby nádor výrost na více než několik milimetrů a pro vznik metastazujícího pevného nádoru.
V případě že růst nových krevních cév přispívá k uzdravování tkáně, posílení angiogeneze napomáhá hojení. Příkladem může být léčení pacienta s ischemickými končetinami, kdy v končetinách je slabý krevní oběh způsobený diabetem nebo jinou poruchou. Také je tuto léčbu možno použít u pacientů s chronickými zraněními, která se nehojí a tím přispět ke zvýšení proliferace vaskulámích buněk a neovaskularizací.
Způsoby podle navrhovaného vynálezu jsou velmi účinné neboť taková terapie je vysoce selektivní pro angiogenezi a ne pro další biologické procesy.
Jak je uvedeno výše, angiogeneze zahrnuje celou řadu procesů zahrnujících neovaskularizací tkání včetně dorůstání tkáně, vaskulogenezi nebo zvětšování cév, přičemž ve všech těchto procesech je klíčový Src protein. Kromě hojení traumatických poranění, tvorby žlutého tělíska a embryogeneze, věří se, že většina procesů angiogeneze je spojena s chorobami a tedy použití popisovaných terapeutických postupů je selektivní pro nemoci a nemá nežádoucí vedlejší účinky.
Navrhovaný vynález také popisuje, v jedné části, objev, že vaskulámí propustnost a/nebo otok spojené s traumatem, nemocí nebo zraněním vyvolávajícím nárůst vaskulámí permeability může být specificky ovlivněno a potlačeno inhibicí aktivity tyrozin kináz rodiny Src. Konkrétně, navrhovaný vynález popisuje zjištění, že podání inhibitoru tyrozin kináz rodiny Src in vivo, zmenší poškození tkáně vyvolané nemocí nebo zraněním způsobeným nárůstem vaskulámí permeability, která není spojena s rakovinou nebo angiogenezi.
Zatímco podání inhibitoru tyrozin kináz rodiny Src ovlivní nárůst vaskulámí permeability vyvolaný VEGF, specifická inhibice aktivity tyrozin kináz rodiny Src minimalizuje poškození
-9CZ 304320 B6 okolní tkáně vyvolané propustnosti cév nebo otokem, přesto je signál rodiny tyrozin kináz Src aktivovaný.
Vaskulámí permeabilita je zapojena do řady chorobných stavů, které nemusí přímo souviset s angiogenezí. Např. celá řada patologií a poškození vyvolaných mrtvicí je vyvoláno následným nárůstem vaskulámí permeability díky traumatu v krevních cévách a tedy možnost specificky ovlivnit vaskulámí permeabilitu umožňuje nové účinné léčebné postupy pro potlačení nežádoucích projevů při mrtvici.
Příkladem tkáně spojené s chorobou a nebo zraněním, kdy dochází ke zvýšené propustnosti cév a/nebo otoku, je přínosem specifická inhibice aktivity tyrozin kináz rodiny Src jsou např. revmatoidní artritida, diabetická retinopatie, zánětlivé choroby, restenosis a podobně.
Traumatické poranění mozku nebo míchy a další cerebrovaskulámí příhody obvykle vyvolané ischemií nebo krvácením jsou hlavní příčinou neurologických poruch a spojených zranění. Mozkové otoky a propustnost cév vyvolané těmito příhodami jsou životu nebezpečné patologie, které spouštějí systémové a rozptýlené poškození mozku a míchy (centrální nervový systém, CNS) a možnost specificky ovlivnit propustnost cév a otok které poškozují okolní tkáně je v takových případech velmi důležitá.
Infekce CNS, jako je meningitida, cerebritida, encefalitida mohou vést k různým mozkovým patologiím, včetně mozkového otoku. Léčba takové infekce může být podpořena specifickou terapií pro snížení vaskulámí propustnosti nebo otoku.
Bylo uvedeno, že systémová neutralizace proteinu VEGF pomocí fúzního proteinu VEGF receptor IgG, sníží velikost infarktu následujícího po cerebrální ischemií, a tento efekt je pravděpodobně způsoben snížením vaskulámí permeability vyvolávané VEGF. N. van Bruggen et al., J. Clin. Inves. 104:1613-1620 (1999). Přesto VEGF není ten klíčový mediátor nárůstu vaskulámí permebility, kterým, jak bylo zjištěno, je Src.
Další poruchy nebo nemoci, kde je zapojeno zvýšení vaskulámí permeability pomocí Src ajsou tedy vhodným cílem pro léčení pomocí způsobů a prostředků podle navrhovaného vynálezu mohou být např. mozkové krvácení, mozkové a míšní trauma, hypoxií vyvolané poškození mozku a míchy, zánětlivé poruchu CNS: virové nebo bakteriální infekce (např. meningitida, HIV encefalopatie), autoimunitní poruchy (např. mnohoěetná skleróza), poruchy vedoucí k chronickému zvýšení propustnosti krevně mozkové bariéry (např. Morbus Alzheimer), chirurgické zákroky, kde může být dočasně přerušeno prokrvení a zásobování kyslíkem může sloužit jako ochranné agens, revmatoidní artritida a diabetická retinopatie.
C. Tyrozin kinázy rodiny Src
Proteiny typu tyrozin kináz použitelné v navrhovaném vynálezu se mohou odlišovat v závislosti na zamýšleném použití. Termíny „protein Src“ a „Src“ jsou společně používány pro různé formy tyrozin kináz Src zde popisovaných, buď aktivní, nebo neaktivní formy. Termíny „protein Yes“ a„Yes“ jsou společně používány pro různé formy tyrozin kináz Yes zde popisovaných, buď aktivní, nebo neaktivní formy. Dále jsou v kontextu popisu, uváděny odkazy na genové sekvence nukleových kyselin a geny kódující Src a Yes. Termín „rodina Src“ popisuje skupiny tyrozin kináz, které jsou podobné funkcí a aminokyselinovou sekvencí se Src.
Termín „aktivní protein Src“ popisuje jakoukoliv formu proteinu Src která posiluje angiogenezí nebo vaskulámí permeabilitu. Termín „aktivní protein Yes“ popisuje jakoukoliv formu proteinu Yes která posiluje vaskulámí permeabilitu. Způsoby stanovování posílení angiogeneze nebo vaskulámí permeability jsou popisovány dále a nemohou být brány jako limitace. Protein je brán jako aktivní když míra angiogeneze nebo vaskulámí permeability je alespoň o 10 % vyšší, lépe
- 10CZ 304320 B6 pak o 25 % vyšší a nejlépe o 50 % vyšší než kontrolní hladina, kde nebyl do systému přidán žádný protein.
Nejvhodnější technika pro stanovování míry posílení angiogeneze je CAM technika využívající virový vektor RCAS jak je popisováno v příkladech, kde angiogenní index je vypočítán jako množství rozvětvení.
Nejvhodnější techniky stanovování posílení vaskulámí permeability je Milesova technika za použití Evansovy modře u myší jak je popisováno v příkladech, kde je vaskulámí permeabilita měřena jako množství Evansovy modře která prostoupí z cév.
Nej vhodnější aktivní proteiny Src a Yes vykazují tyrozin kinázovou aktivitu. Příklady aktivních proteinů Src a Yes jsou popsány v příkladech a zahrnují Src-A a Yes-1.
Termín „neaktivní protein Src“ popisuje jakoukoliv formu proteinu Src která potlačuje angiogenezi nebo vaskulámí permeabilitu. Termín „neaktivní protein Yes“ popisuje jakoukoliv formu proteinu Yes která potlačuje vaskulámí permeabilitu. Způsoby stanovování potlačení nárůstu vaskulámí permeability jsou popisovány dále a nemohou být brány jako limitace. Protein Src je brán jako neaktivní když míra angiogeneze je alespoň o 10 % nižší, lépe pak o 25 % nižší a nejlépe o 50 % nižší než kontrolní hladina, kde nebyl do systému přidán žádný protein.
Protein Src nebo Yes je brán jako neaktivní když míra vaskulámí permeability je alespoň o 10 % nižší, lépe pak o 25 % nižší a nejlépe o 50 % nižší než kontrolní hladina, kde nebyl do systému přidán žádný protein Src nebo Yes.
Nejvhodnější technika pro stanovování míry posílení angiogeneze je CAM technika využívající virový vektor RCAS jak je popisováno v příkladech, kde angiogenní index je vypočítán jako množství rozvětvení.
Nejvhodnější techniky stanovování posílení vaskulámí permeability je Milesova technika za použití Evansovy modře u myší jak je popisováno v příkladech, kde je vaskulámí permeabilita měřena jako množství Evansovy modře která prostoupí z cév.
Nejvhodnější aktivní proteiny Src a Yes vykazují sníženou tyrozin kinázovou aktivitu. Příklady neaktivních proteinů Src a Yes jsou popsány v příkladech a zahrnují Src-251 a Src K295M.
Protein Src použitelný v navrhovaném vynálezu může být připraven libovolným způsobem známým v současném stavu techniky, včetně izolace z přirozených zdrojů, jako např. z tkáně, přípravou rekombinantní DNA, její expresí a přečištěním a podobně. Src a/nebo Yes mohou být rovněž připraveny in sítu zavedením terapeutického genu do tkáně která je postižena, a kdy tento gen zajistí expresi příslušného proteinu v tkáni.
Gen kódující Src nebo Yes proteiny může být připraven celou řadou způsobů známých v současném stavu techniky a vynález nemůže být výčtem těchto technik nijak limitován. Např. vývoj genu pro Src je dobře znám a zahrnuje celou řadu homologů ze savčích, ptačích, virových a podobných druhů, a gen může být správně klonován za použití klonovací techniky cDNA z jakékoliv tkáně exprimující tento protein. Nejvhodnější Src pro použití v navrhovaném vynálezu je buněčný protein, jako jsou savčí nebo ptačí homology označované jako c-src. Nejvhodnější je lidský c-src. Nejvhodnější Yes pro použití v navrhovaném vynálezu je lidský buněčný protein cyes. Nej vhodnější je lidský c-yes-1 kódující aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 11. Protein Yes-1 na obr. 11 je kódován úsekem nukleové kyseliny uvedené na obr. 12 a označen jako kódující doménový segment.
- 11 CZ 304320 B6
D. Rekombinantní molekuly DNA a expresní systémy pro expresi proteinů Src a Yes.
Navrhovaný vynález popisuje některé nukleotidové sekvence použitelné v navrhovaném vynálezu. Tyto sekvence zahrnují sekvence kódující Src protein použitelný v navrhovaném vynálezu a různé části DNA, rekombinantní DNA (rDNA) molekuly a vektory navržené pro expresi proteinu Src. Tyto sekvence také zahrnují sekvence kódující Yes protein použitelný v navrhovaném vynálezu a řadu DNA segmentů, rekombinantní DNA (rDNA) molekuly a vektory navržené pro expresi proteinu Yes.Molekuly DNA (segmenty) podle navrhovaného vynálezu mohou tedy zahrnovat sekvence kódující celé strukturní geny, fragmenty strukturních genů nebo kombinace těchto genů a transkripční jednotky jak je zde uvedeno dále.
Nejvhodnější oblast DNA je nukleotidová sekvence kódující protein Src nebo Yes nebo oba, jak jsou zde definovány, nebo jejich biologicky aktivní fragmenty.
Sekvence aminokyselinových zbytků a nukleotidová sekvence nej vhodnějších Src a Yes je uvedena v příkladech.
Vhodná sekvence DNA kóduje sekvenci aminokyselinových zbytků v podstatě stejnou, a skládající se zejména ze sekvence aminokyselinových zbytků nebo jejich částí odpovídající proteinům Src a Yes, tak jak jsou zde popisovány. Reprezentativní a vhodné DNA sekvence jsou dále popsány v příkladech.
Aminokyselinová sekvence proteinu nebo polypeptidu přímo odpovídá genetickému kódu sekvence deoxyribonukleové kyseliny (DNA) strukturních genů které kódují protein. Tedy, strukturní gen nebo segment DNA může být definován vzhledem k aminokyselinové sekvenci, tzn. proteinu nebo polypeptidu, který kóduje.
Důležitým a dobře známým rysem genetického kódu je jeho degenerovanost. To znamená, že většina aminokyselin použitých pro tvorbu proteinů je kódována více než jedním kódujícím nukleotidovým tripletem (kodónem) který pak kóduje stejný aminokyselinový zbytek. Je tedy možné, že jednu konkrétní aminokyselinovou sekvenci kóduje několik různých sekvencí nukleotidů. Tyto nukleotidové sekvence jsou funkčně stejné, neboť jejich výsledkem je produkce stejného aminokyselinového zbytku ve všech organismech. Někdy je možné do sekvence zabudovat methylované purinové nebo pyrimidinové varianty nukleotidů. Přesto tato methylace neovlivňuje žádným způsobem kódování.
Nukleová kyselina je jakýkoliv polynukleotid nebo fragment nukleové kyseliny, buď polyribonukleotid nebo polydeoxyribonukleotid, tzn. RNA nebo DNA, nebo jejich analogy. V nejvhodnějších případech je nukleová kyselina ve formě segmentů dvoj šroubovice DNA, tzn. jako DNA sekvence, ačkoliv v některých molekulárně—biologických technikách je výhodnější jednořetězcová DNA nebo RNA.
Sekvence DNA jsou připravované celou řadou způsobů včetně chemické syntézy a pomocí rekombinantních postupů, zejména pak pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). Sekvence DNA kódující části proteinu Src mohou být snadno syntetizovány pomocí chemických postupů, např. fosfotriesterovou technikou podle Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc., 103:3185-3191 (1981), nebo pomocí automatického syntetizátoru. Dále je možné delší sekvence DNA připravit pomocí technik známých v současném stavu techniky, jako je syntéza skupin oligonukleotidů, která definuje DNA sekvenci, následovaná hybridizací a Iigací oligonukleotidů tak, aby vznikla celá sekvence. Alternativní technikou je izolace požadované DNA sekvence pomocí PCR za použití dvojice primerů z cDNA knihovny o které je známo že obsahuje sekvence kódující protein Src.
Je zřejmé, že během chemické syntézy je možné provádět libovolné modifikace jednoduchou záměnou příslušné báze za takovou, která kóduje přirozenou sekvenci aminokyselinových
- 12CZ 304320 B6 zbytků. Tento způsob je dobře známý v současném stavu techniky a je možné ho aplikovat na přípravu různých modifikovaných proteinů Src jak jsou zde popisovány.
Dále DNA sekvence skládající se zejména ze strukturních genů kódujících proteiny Src a Yes mohou být následně pozměněny tak, aby bylo dosaženo požadované náhrady.
1. Klonování genů Src a Yes
Geny Src a Yes podle navrhovaného vynálezu mohou být klonovány z vhodného zdroje genomové DNA nebo mediátorové RNA (mRNA) celou řadou biochemických technik. Klonování těchto genů může probíhat podle obecných technik popisovaných v příkladech a známých v současném stavu techniky.
Zdroje nukleových kyselin pro klonování genů Src a Yes pro použití ve způsobech podle navrhovaného vynálezu mohou zahrnovat genomovou DNA nebo mediátorovou RNA (mRNA) ve formě cDNA knihovny z tkáně o které je známo, že exprimuje tyto proteiny, nej vhodnější tkání, je lidská plicní tkáň, ačkoliv je samozřejmě možné použít i jiné tkáně.
Nejvhodnější klonovací technikou je příprava sDNA knihovny za použití standardních technik a izolace nukleotidové sekvence kódující SRC nebo Yes pomocí PCR amplifikace za použití dvojice oligonukleotidových primerů založených na zde popsané nukleotidové sekvenci.
Další možností je, že požadované klony cDNA mohou být identifikovány a izolovány z cDNA nebo genové knihovny pomocí konvenčních hybridizačních technik nukleových kyselin pomocí hybridizačních sond založených na nukleotidových sekvencích zde popisovaných. Další techniky izolace a klonování, použitelné pro nukleové kyseliny kódující Src a Yes jsou dobře známé každému odborníkovi v současném stavu techniky.
2. Přenos genu a/nebo expresního vektoru
Navrhovaný vynález popisuje rekombinantní molekuly DNA (rDNA) obsahující DNA sekvenci kódující Src nebo Yes protein, nebo oba, jak je zde popsáno. Exprimovatelná rDNA může být připravena operativním (v exprimovatelném čtecím rámci) napojením vektoru na sekvenci DNA kódující Src nebo Yes podle navrhovaného vynálezu. Tedy rekombinantní molekula je hybridní molekula obsahující alespoň dvě nukleotidové sekvence, které dají vzniknout takové nukleotidové sekvenci, která se normálně v přírodě nevyskytuje.
Volba vektoru, do něhož je sekvence DNA podle navrhovaného vynálezu operativně zapojena závisí, podle pravidel známých v současném stavu techniky na požadovaných funkčních vlastnostech, tzn. expresi proteinu a hostitelské buňce, která má být transformována. Je třeba zvážit všechny možnosti známé v současném stavu techniky při konstrukci rekombinantních molekul DNA. Vektor použitelný v navrhovaném vynálezu by měl být schopný řízené replikace a lépe pak také exprese strukturních genů zapojených do sekvence DNA, ke které je připojen.
V případě, že vektor obsahuje exprimovatelné sekvence src i yes, oba geny mohou být regulované stejnými regulačními jednotkami proti směru prvního genu, nebo mohou být regulovány nezávislými regulačními jednotkami.
Odborníkům v současném stavu techniky jsou známé, jak prokaryotické, tak eukaryotické expresní vektory, a dále jsou popsány v Ausebel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York (1993) a v Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989). Tyto publikace také popisují řadu dalších technik rekombinantní DNA zde uvedených.
- 13 CZ 304320 B6
V jedné variantě, vektor použitelný v navrhovaném vynálezu by mohl být prokaryotický replicon, tzn. sekvence DNA se schopností autonomní replikace a udržování rekombinantní DNA mimo chromozóm prokaryotických hostitelských buněk, jako jsou bakteriální buňky tímto vektorem transformované. Tyto replikony jsou známé v současném stavu techniky. Navíc, tato varianta používající prokaryotický replikon také obsahuje gen, jehož exprese zajišťuje rezistenci k některému léčivu po transformaci do bakteriálních buněk. Typickým genem lékové rezistence jsou geny přinášející rezistenci k ampicilinu nebo tetracyklinu.
Takové vektory které zahrnují prokaryotické replikony mohou také obsahovat prokaryotický promotor schopný přímé exprese (transkripce a translace) strukturních genů u bakteriálních hostitelských buněk, jako je např. transformovaná E. coli. Promotor je kontrolní jednotka exprese tvořený DNA sekvencí, která umožňuje vazbu RNA polymerázy a počátek transkripce. Promotorové sekvence kompatibilní s bakteriálními hostiteli jsou obvykle umístěné v plazmidových vektorech obsahujících vhodná restrikční místa pro vložení sekvencí DNA podle navrhovaného vynálezu. Typickým příkladem těchto plazmidových vektorů jsou pUC8, pUC9, pBR322 a pBR329 dostupné od BioRad Laboratories (Richmond CA), pRSET dostupný od Invitrogen (San Diego, CA) a pPL a pKK223 dostupné od Pharmacia, Piscataway, NJ.
Expresní vektory kompatibilní s eukaryotickými buňkami, zejména ty kompatibilní se savčími buňkami, mohou být také použity pro přípravu rekombinantních molekul DNA podle navrhovaného vynálezu. Eukaryotické expresní vektory jsou dobře známé v současném stavu techniky a jsou dostupné z celé řady komerčních zdrojů. Obvykle jsou tyto vektory navrženy tak, aby obsahovaly vhodné restrikční místo pro vložení požadované sekvence DNA. Typickým příkladem těchto vektorů pak jsou pSVL a pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-l/pML2d (Intemational Biotechnologies, Inc.), pTDTl (ATCC, # 31 255), pRc/CMV (Invitrogen Inc.), nejvhodnější vektor popsaný v příkladech a podobné eukaryotické expresní vektory.
Nejvhodnější systém pro expresi genů podle navrhovaného vynálezu zahrnuje transportní složku, to znamená schopnost nasměrovat gen do tkáně kde je třeba. Vhodné vektory jsou infekční vektory, jako jsou rekombinantní DNA viry, adenoviry nebo retrovirové vektory, které jsou upravené pomcí genového inženýrství, tak aby exprimovaly požadovaný protein a měly takové vlastnosti, které umožní infekci předem zvolené cílové tkáně. Nejvhodnějším vektorem je replikačně kompetentní ptačí sarkomový virus (RCAS), kterýje zde popsaný.
Je možno rovněž připravit savčí buněčný systém, které využívají rekombinantní viry nebo virové částice pro přímou expresi. Například při použití adenovirového expresního vektoru, kódující sekvence polypeptidu může být napojena na adenovirový transkripční/translační kontrolní komplex, tzn. pozdní promotor, a trojdílnou počáteční sekvenci. Takový chimemí gen může být poté vložen do adenovirového genomu pomocí in vitro nebo in vivo rekombinace. Vložením do neesenciální oblasti virového genomu (tzn. oblast El nebo E3) povede ke vzniku rekombinantního viru, který je živý a schopný exprimovat polypeptid v infikovaném hostiteli (např. viz. Logan et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 81:3655-3659 (1984)). Další možností je použít promotor 7.5K. z viru vakcinie (např. viz. Mackett et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 79: 7415-7419 (1982), Mackett et al., J. Virol., 49:857-864 (1984), Panicali et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 79:4927^4931 (1982)). Obzvláště zajímavé jsou vektory založené na hovězí papilomaviru, který má schopnost replikovat se jako extrachromozomální jednotka (Sarver et al., Mol. Cell. Biol., 1:486 (1981)). Obecně po vstupu této DNA do cílové buňky se plazmid namnoží na 100 až 200 na buňku. Transkripce vložené cDNA nevyžaduje integraci plazmidu do hostitelova chromozomu a tím je zajištěna vysoká hladina exprese. Takové vektory mohou být použity pro zajištění stabilní exprese, pokud je v plazmidu použit selektovatelný znak, jako např. gen neo. Další možností je zpravit retrovirový genom tak, aby byl použitelný jako vektor umožňující zavedení a přímou expresi nukleotidové sekvence kódující polypeptid v hostitelské buňce (Cone et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 81:6349-6353 (1984)). Vysokou hladinu exprese je možné zajistit také za použití indukovatelných promotorů včetně např. promotoru pro metallothionin IIA a promotoru teplotního šoku.
- 14 CZ 304320 B6
V poslední době bylo rovněž studováno dlouhodobé přežívání cytomegalovirového (CMV) promotoru vzhledem k promotoru Rousova sarkomaviru (RSV) řízené thymidin kinázové (TK) genové terapie u holých myší trpících lidským ovariálním karcinomem. Účinnost buněčného zabíjení adenovirem vyvolané CMV promotorem řízené herpes simplex TK genové terapie prokázalo, že je dvakrát až desetkrát účinnější než případě terapie řízené RSV (Tong et al., 1999, Hybridoma 18 (1):93-97). Design chimemích promotorů pro aplikaci v genové terapii, kde je žádoucí nízká hladina exprese následovaná indukovatelnou vysokou úrovní exprese, již byl rovněž dříve popsán (Suzuki et al., 1996, Human Gene Therapy, 7:1883-1893).
Pro dlouhodobou produkci s vysokým výtěžkem rekombinantních proteinů je vhodnější stabilní exprese. Raději, než používat expresní vektory obsahující virové počátky replikace, je transformovat hostitelské buňky pomocí cDNA kontrolované příslušnou kontrolní jednotkou (tzn. sekvencemi promotorů a enhancerů, konců transkripce, polyadenylačních míst, atd.), a selektovatelných znaků. Jak je uvedeno výše, selekční znak v rekombinantním plazmidu zajišťuje rezistenci proti zvolenému léčivu a umožní buňce stabilně integrovat plazmid do jejího chromozomu a nárůst formy kolonie, ze které je možné buňky klonovat a rozdělit do buněčných linií.
Například, po zavedení cizorodé DNA mohou být transformované buňky ponechány jeden až dva dny v obohaceném médiu a poté přeneseny do selektivního média. Je možné použít celou řadu selekčních systémů, včetně např. herpes simplex virus thymidin kinázy (Wigler et al., Cell, 11:223 (1977)), hypoxantin, guanin, fosforibosyl transferázy (Szybalska et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 48:2026 (1962)), a adeninfosforibosyl transferázy (Lowy et al., Cell, 22:817 (1980)) genů, které mohou být použité pro tk~, hgprf nebo aprt buněk. Je také možné použít geny zajišťující rezistenci proti antimetabolitům pro vlastní selekci, např. gen pro dhfř, který zajišťuje rezistenci k methotrexátu (Wigler et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 77:3567 (1980)), O'Hare et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 78:1527 (1981), gpt, který zajišťuje rezistenci ke kyselině mykofenolové, (Mulligan et al., proč. Nati. Acad. Sci., USA, 78:2072 (1981)), neo, který zajišťuje rezistenci k aminoglykosilu G418 (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150:1 (1981)) a hygro, který zajišťuje rezistenci k hygromycinu (Santerre et al., Gene, 30:147 (1984)). V poslední době byly popsány další selektovatelné geny, zejména trpB, který umožňuje buňkám využívat indol namísto tryptofanu, hisD, který umožňuje buňkám využívat histinol namísto histidinu (Hartman et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 85:804 (1988)) a ODC (omithin dekarboxyláza), který zajišťuje rezistenci k inhibitoru omithin dekarboxylázy, 2-(difluormethyl)-DL-omithin, DFMO (McConlogue L., Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed., (1987)).
Vhodné vektory použitelné pro lidskou genovou terapii jsou odvozené z retrovirového původu (Wilson, 1997, Clin. Exp. Immunol., 107 (Sub. 1):31-32, Bank et al., 1996, Bioassays, 18 (12):999-1007, Robbins et al., 1998, Pharmacol. Ther., 80( 1 ):35-47). Terapeutický potenciál genového přenosu a antisense therapie je podpořen vývojem celé řady vektorových systémů určených pro léčbu různých chorob. (Vaskulatura, Stephan et al., 1997, Fundan. Clin. Pharmacol., 11(2):97-110, Feldman et al., 1997, Cardiovasc. Res., 35(3):391-404, Vassalli et al., 1997, Cardiovasc. Res., 35(3):459^169, Baek et al., 1998, Circ. Res., 82(3):295-305, Fedviny, Fien et al., 1997, Kidney Int. Suppl., 61:585-8, Játra, Ferry et al., 1998, Hum. Gene Ther., (14):1975-81, Svaly, Marshall et al., 1998, Curr. Opn. Genet. Def., 8(3):360-5) kromě těchto tkání kritickým cílem pro genovou terapii u lidí je rakovina, a to bud’ nádor sám o sobě, anebo asociované tkáně (Runnebaum, 1997, Anticancer Res., 17(4B):2887-90, Spear et al., 1998, J. Neurovirol., 4(2):133^17).
Specifickými příklady virových vektorů pro genovou terapii, který jsou přizpůsobené pro použití ve způsobech podle navrhovaného vynálezu jsou zkráceně popsány dále. Transport genu pomocí retrovirů byl naposledy popsán v Federspiel and Gughes (1998), Methods in Cell Biol., 52:179-214), kde je popisována zejména rodina retrovirů viru ptačí leukózie (AFV) (Federspiel et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 93:4931 (1996), Federspiel et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA,
- 15 CZ 304320 B6
91:11241 (1994)). Retrovirové vektory včetně ALV a myšího leukemického viru (MLV) byly dále popsány v Svoboda (1998), Gene, 206:153-163.
Modifikované retrovirové/adenovirové expresní systémy by měly být správně přizpůsobené pro praxi ve způsobech podle navrhovaného vynálezu. Například virus myší leukémie (MLV) byl popsán v Karavanas et al., 1998, Cric. Ref. in Oncology / Hematology, 28:7-30. Adenovirové expresní systémy byly popsány ve Von Segger and Nemerow, Gene Expressions Systems (ed. Femandes and Hoeffler, Academie Press, San Diego, CA, 1999, kapitola 5, str. 112-157).
Proteinové expresní systémy byly prokázány jako účinné jak in vivo, tak in vitro. Například, pro účinný přenos genů do buněk lidského dlaždicovitého karcinomu pomocí herpes simplex viru (HSV) typu 1 byl popsán amplikonový vektor. (Carew et al., 1998, Am. J. Surg., 176:404—408). Herpes simplex virus byl použit pro přenos do buněk nervového systému (Goins et al., 1997, J. Neurovirol. 3, (Sub. l):S80-8). Cílené sebevražedné vektory využívající HSV-TK byly testovány pro použití u pevných nádorů. (Smiley et al., 1997, Hum. Gene, Ther. 8(8):965-77). Herpes simplex virus typu 1 byl použit pro protinádorovou terapii v případě rakoviny tlustého střeva. (Yoon et al., 1998, Ann. Surg., 228(3):366-374. Hybridní vektory byly vyvinuty pro prodloužení doby transfekce, včetně HSV/AV (adeno-asociovaných virů) hybridů pro léčbu lepatocytů (Fraefel et al., 1997, Mol. Med., 3(12):813-825).
Virus vakcínie byl vyvinut pro lidskou genovou terapii díky jeho rozsáhlému genomu (Peplinski et al., 1998, Surg. Oncol., Clin. N. Am. 7(3):575-88). Virus vakcínie s deletovaným genem pro thymidin kinázu exprimující purinnukleosid pyrofosforylázu byl popsán pro použití jako nádorově směřující vektor pro genovou terapii (Puhlman et al., 1999, Human Gene Therapy 10:649-657).
Adeno-asociovaný virus 2 (AAV) byl popsán jako použitelný pro genovou terapii u lidí přesto, že AAV vyžaduje pomocný virus (jako adenovirus nebo herpes viru) pro optimální replikaci a sbalování v savčích buňkách. (Snoeck et al., 1997, Exp. Nephrol. 5(6):514-20, Rabinowitz et al., 1998, Curr. Opn. Biotechnol. 9(5):470-5). Přesto in vitro sbalování infekčních rekombinantních AAV bylo popsáno, což činí tento systém také slibným. (Ding et al., 1997, gene Therapy 4:1167-1172). Bylo zjištěno, že pomocí AAV vyvolaný přenos ekotropní virové receptorové cDNA umožňuje ekotropní retrovirovou transfekci zralých a primárních lidských buněk. (Qing et al., 1997, J. Virology 71 (7):5663-5667). Protinádorová terapie využívající vektor AAV exprimující lidský protein p53 divokého typu byla rovněž popsána. (Qazilbash et al., 1997, Gene Therapy 4:675-682). Rovněž byl prokázán přenos genu do vaskulámích buněk pomocí AAV vektorů (Maeda et al., 1997, Cardiovascular Res. 35:514-521). AAV se ukázalo býti vhodným vektorem i pro genovou terapii směrovanou proti játrům (Xiao et al., 1998, J. Virol. 72(12):10222-6). AAV vektory byly uznány jako použitelné i pro genovou terapii mozkové tkáně a centrálního nervového systému (Chamberlin et al., 1998, Brain Res. 793 (1-2):169-75, During et al., 1998, Gene Therapy, 5(6), 820-7). Vektory AAV byly také porovnávány s adenovirovými vektory (AdV) v případě genové terapie směrované do plic a přenosu lidské cystické fibrózy epitheliálních buněk (Teramoto et al., 1998, J. Virol., 72(11):8904-12).
Chimemí AdV/retrovirové vektorové systémy pro genovou terapii, které spojují nejvhodnější vlastnosti jednotlivých virů tak, aby vznikly neintegrativní AdV, které by byly funkčně integrativní prostřednictvím přechodné generace buněk produkujících retrovirus (Feng et al., 1997, Nat. Biotechnology 15(9):866-70, Bilbao et al., 1997, FASEB J. 11(8)624-34). Tato slibná nová generace vektorů pro genovou byla přizpůsobena tak, aby se stala směrovanou protinádorovou terapií (Bilbao et al., 1998, Adv. Exp. Med. Biol. 451:365-74). Jednou injekcí AdV exprimujících p53 byl potlačen růst podkožního nádoru buněk lidského karcinomu prostaty (Asgari et al., 1997, Int. J. Cancer 71(3):377-82). Dále byl popsán přenos divokého typu genu p53 pomocí AdV vektorů u pacientů s pokročilým nemalobuněčným karcinomem plic. (Schuler et al., 1998, Human Gene Therapy 9:2075-2082). Stejný druh rakoviny byl cílem terapie nahrazující gen p53 pomocí AdV vektoru. (Roth et al., 1998, Semin. Oncol. 25(3 Suppl. 8):33-7). Přenos genu p53
- 16CZ 304320 B6 pomocí AdV zpomalí diferenciaci endotheliálních buněk a angiogenezi in vivo. (Riccioni et al.,
1998, Gene Ther. 5(6):74754). Adenovirem vyvolaná exprese melanomového antigenu gp75 jako imunoterapie metastatického melanomu se rovněž jeví jako slibná. (Hirschowitz et al., 1998, Gene Therapy 5:975-983). AdV zajišťuje infekci lidských buněk ekotropním retrovirem a zvyšuje účinnost retrovirové infekce. (Scott-Taylor et al., 1998, GeneTher. 5(5):621-9). AdV vektory byly použity pro přenos genu do buněk vaskulárního hladkého svalstva (Li et al., 1997, Chin. Med. J. (Engl) 110( 12):950-4), buněk dlaždicovitého karcinomu (Geobel et al., 1998, Otolarynol Head Neck Surg 119(4):331-6), buněk rakoviny hltanu (Senmaru et al., 1998, Int J. Cancer 78(3):366-71), mezengiálních buněk (Nahman et al., 1998, J. Investig. Med. 46(5):2049), gliových buněk (Chen et al., 1998, Cancer Res. 58(16):3504-7), a do kloubů zvířat (Ikeda et al., 1998, J. Rheumatol. 25(9):1666-73). V poslední době byl prokázán katétrem aplikovaný perikardiální přenos genu pomocí AcV vektorů. (March et al., 1999, Clin. Cardiol. 22(1 Suppl. 1):123-9). Manipulace s kontrolními genetickými jednotkami AdV systému umožní ovlivňovat AdV přenášený gen a jeho expresi in vivo. (Burcin et al., 1999, PNAS (USA) 96(2):3 55—60).
Alfavirové vektory byly vyvinuty pro aplikaci v lidské genové terapii s buněčnými liniemi vhodnými pro transfekci pomocí expresních kazet použitelných v Sindbis viry a Semliki Forest viry a odvozenými vektory (Polo et al., 1999, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 96:4598^4603). Byly rovněž vyvinuty necytopatické flavivirové replikonové systémy založené na RNA (Vamavski et al.,
1999, Virology, 255(2):366-75). Sebevražedný EISV-TK gen obsažený v Sindbis virovém vektoru byl použit pro buněčné specifické směrování do nádorových buněk (Iijima et al., 1998, Int. J. Cancer 80(1):110-8).
Retrovirové vektory založené na lidských spumavirech (EIFV-Human Foamy Virus) mají také slibné vlastnosti pro použití jako vektory genové terapie (Trobridge et al., 1998, Human Gene Therapy 9:2517-2525). Spumavirové vektory byly vybrány pro sebevražednou genovou terapii (Nestler et al., 1997, Gene Ther. 4(11):1270-7). Rekombinantní myší cytomegaloviry a promotorové systémy jsou rovněž používány jako vektory díky vysoké hladině exprese. (Manning et al., 1998, J. Virol. Meth. 73(1):31-9, Tong etal., 1998, Hybridoma 18(1):93-7).
Přenos genu do nedělících se buněk může být uskutečněn díky přípravě vektorů odvozených od Sendai virů. (Nakanishi et al., 1998, J. Controlled Release 54(1):61-8).
V dalším úsilí umožnit transformaci nedělících se somatických buněk byly testovány lentiviry. Genová terapie cystické fibrózy pomocí replikačně defektivního lidského viru získaného selhání imunity (HIV) byla rovněž popsána. (Goldman et al., 1997, Human Gene Therapy 8:2261-2268). Byla rovněž prokázána stabilní exprese genů doručených do jater a svalů pomocí lentivirových vektorů. (Kafri et al., 1997, Nat. Genet. 17(3):314-7). Přesto bezpečnost je nejdůležitějším parametrem a vývoj nových virových vektorů jde velmi rychle kupředu. (Kim et al., 1998, J. Virol. 72(2):994-1004). Studiem HIV LTR a Tat přináší důležité informace o organizaci genomu pro rozvoj dalších vektorů. (Sadaie et al., 1998, J. Med. Virol. (54(2):118-28). Tedy, genetické požadavky pro účinný vývoj vektorů založených na HIV je v současné době daleko jasnější. (Gasmi et al., 1999, J. Virol. 73(3):1828-34). Byly popsány vektory, kteréjsou schopny samy se inaktivovat nebo dočasné buněčné linie (například Zuffery et al., 1998, J. Virol., 72(12):9873-80, Miyoshi et al., 1998, J. Virol. 72(10):8150-7, Duli et al., 1997, J. Virol. 72(11):8463-71 a Kaul et al., 1998. Virology 249(1):167-74). Účinná transformace lidských lymfocytů a CD34+ buněk pomocí HIV vektorů již byla rovněž popsána. (Douglas et al., 1999, Hum. Gene Ther. 10(6):93545, Miyoshi et al., 1999, Science 283(5402):682-6). Dále byla popsána účinná transformace nedělících se lidských buněk pomocí lentivirového vektoru odvozeného z kočičího viru získaného selhání imunity (FIV), což minimalizuje bezpečnostní problémy spojené s používáním virových vektorů založených na HIV. (Poeschla et al., 1998, Nátuře Medicine 4(3):354-57). Byla prokázána produktivní infekce lidských krevních mononukleámích buněk pomocí FIV vektorů. (Johnston et al., 1997, J. Virol. 73(3):2491-8).
- 17CZ 304320 B6
S řadou virových vektorů se špatně pracuje a jejich kapacita pro množství vložené DNA je omezená, což jsou jejich největší nevýhody. Například kromě zjednodušených buněčných linií sloužících pro sbalování virů, minivirových vektorů odvozených z lidských herpes virů, herpes simplex viru typu 1 (HSV-1), a Epstein-Barrova viru, byly vyvinuty pro zjednodušení manipulace s genetickým materiálem a přípravu virových vektorů. (Wang et al., 1996, J. Virology 70(12):8422-8430). Adaptorové plazmidy, jak bylo dříve zjištěno, zajišťují vstup cizorodé DNA do retrovirových vektorů nezávislých na pomocných složkách. (1987, J. Virology 61(10):30043012).
Virové vektory nejsou jediným způsobem pro účinnou virovou terapii, neboť byla popsána celá řada nevirových vektorů. Směrovaný nevirový vektor pro transport genu založený na použití epidermální růstový faktor/DNA polyplex (EGF/DNA) se ukázal jako účinný a efektivní pro specifický transport genů. (Cristiano et al., 1998, Anticancer Res. 17:3241-3246). Genová terapie vaskulámích tkání a centrálního systému se ukázala jako možná pomocí kationických lipozómů. (Yang et al., 1997, J. Neurotrauma 14(5):281-97). Přechodné genové terapie pankreatitidy bylo dosaženo rovněž pomocí kationických lipozómů. (Denham et al., 1998, Ann. Surg. 227(6): 812-20). Jako účinné pro transport genů se ukázaly rovněž komplexy vektor/DNA odvozené od chitosanu. (Erbacher et al., 1998, Pharm. Res. 15(9):1332-9). Dále byl popsán nevirový DNA vektor založený na terplex systému. (Kim et al., 1998, 53(1-3):175-82). Virové částice potažené komplexy lipozómů jsou rovněž dobře použitelné pro přenos genů. (Hirai et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun. 241(1):112-8).
Byla popsána genová terapie přímou injekcí nevirového vektoru T7 kódujícího thymidin kinázový gen do nádoru. (Chen et al., 1998, Human Gene Therapy 9:729-736). Pro přímý přenos genu injekcí je důležitá příprava plazmidové DNA. (Hom et al., 1995, Hum. Gene Ther. 6(5):656-73). Modifikované plazmidové vektory jsou přizpůsobené pro přímou injekční aplikaci. (Hartikka et al., 1996, Hum. Gene Ther. 7(10):1205-17).
V současném stavu techniky je tedy známa celá řada vektorů a konstruktů použitelných pro přenos genu nebo genovou terapii. Tyto vektory jsou většinou přizpůsobeny pro použití ve způsobbech podle navrhovaného vynálezu. Příslušnou manipulací za použití rekombinantních technik DNA a molekulární biologie je možné vložit správně orientované geny pro Src nebo Yes, nebo oba (buď aktivní, nebo neaktivní) do zvoleného expresního/transportního vektoru, přičemž je možné použít celou řadu ekvivalentních vektorů pro použití v navrhovaném vynálezu.
E. Způsoby ovlivnění vaskulámí permeability
Navrhovaný vynález popisuje způsob ovlivnění vaskulámí permeability v krevních cévách a tkáních postižených chorobou nebo poruchou a tím ovlivnit dopad projevů, které souvisí s vaskulámí permeabilitou, na tkáň. Obecně, tyto způsoby zahrnují aplikaci prostředku obsahujícího protein Src nebo Yes v množství ovlivňujícím vaskulámí permeabilitu, nebo jejich směsi, nebo nukleotidových vektorů exprimujících aktivní nebo neaktivní formy Src nebo Yes, nebo obou, nebo inhibitoru rodiny tyrozin kináz Src, jako je chemický inhibitor Src, proteinový inhibitor Src, nebo nukleotidový inhibitor Src, do tkáně postižené nemocí nebo poruchou, podle způsobů navrhovaného vynálezu.
Jak je zde popisováno, jakákoliv tkáň nebo orgán představující organizovanou strukturu může být cílem choroby nebo poruchy ovlivňující vaskulámí permeabilitu, včetně mozku, pokožky, svalů, střev, pojivové tkáně, kloubů, kostí, apod., tedy tkáním, ve kterých se vyskytují krevní cévy.
Pacient léčený podle navrhovaného vynálezu je ve většině variant člověk, ačkoliv je zřejmé, že z principu navrhovaného vynálezu je navrhovaný vynález účinný u všech savců, a tedy všichni mohou být zahrnuty v termínu „pacient“. V tomto kontextu se savcem rozumí jakýkoliv savčí druh, u kterého léčba tkáně postižené poruchou postihují angiogenezi je nezbytná, konkrétně pak chovný dobytek a zdomácnělé savčí druhy.
- 18CZ 304320 B6
Způsob podle navrhovaného vynálezu zahrnuje aplikaci terapeuticky účinného množství fyziologicky tolerovatelného prostředku obsahujícího proteiny Src nebo Yes nebo jejich směsi, nebo nukleotidových vektorů exprimujících aktivní nebo neaktivní formy Src nebo Yes, nebo obou, nebo inhibitoru rodiny tyrozin kináz Src, jako je chemický inhibitor Src, proteinový inhibitor Src, nebo nukleotidový inhibitor Src pacientovi.
Rozmezí dávky proteinu Src nebo Yes určeného k podání závisí na formě proteinu, jeho účinnosti, jak je popisováno dále, a toto množství by mělo být dostatečné, aby vyvolalo požadovaný efekt ve vaskulámí permeabilitě a tím mohli být příznaky choroby, které jsou vyvolány vaskulární permeabilitou, potlačeny. Dávky by neměly být příliš vysoké, neboť by mohli způsobovat nežádoucí vedlejší eťekty, jako jsou syndromy hyperviskozity, plicní otoky, dočasná selhání srdce, apod. Obecně, dávka bude záviset na věku, kondici, pohlaví a rozsahu choroby u pacienta a měl by ji stanovit odborník v současném stavu techniky. Dávka by také mohla být upravena lékařem pro případ komplikací.
Terapeuticky účinné množství ovlivňující vaskulámí permeabilitu, je takové množství proteinů Src nebo Yes nebo jejich směsi, nebo nukleových kyselin kódujících proteiny Src nebo Yes, dostatečné pro vyvolání měřitelného ovlivnění vaskulámí permeability, tzn. množství ovlivňující vaskulámí permeabilitu. Ovlivnění vaskulámí permeability může být měřeno pomocí technik zde popisovaných, nebo pomocí technik známých odborníkovi v oboru.
Ovlivnění vaskulámí permeability je možno měřit Millerovou technikou, která je zde popsána, nebo jakoukoliv jinou technikou známou odborníkům v současném stavu techniky.
Proteiny Src nebo Yes, nebo nukleotidové vektory by mohly být aplikovány parenterálně pomocí injekce nebo postupnou inťúzí během dne. Protože tkáň, která má být léčena, je obvykle dosažitelná i pomocí systémové aplikace, a tedy v nej obvyklejším případě je léčena pomocí intravenózní aplikace terapeutického prostředku, další tkáně a způsoby transportu musí být také testovány, neboť existuje jistá pravděpodobnost, že cílová tkáň obsahuje cílovou molekulu. Prostředek podle navrhovaného vynálezu tedy může být podáván intravenózně, intraperitoneálně, intramuskulárně, subkutánně, intrakavitálně, transdermálně a může být doručován pomocí peristaltických technik.
Terapeutické prostředky obsahující proteiny Src nebo Yes nebo nukleotidové vektory exprimující proteiny Src nebo Yes je možné obvykle podávat intravenózně jako např. pomocí injekce v jednotkové dávce. Termín Jednotková dávka“, pokud je použit jako odkaz vzhledem k terapeutickému prostředku podle navrhovaného vynálezu, popisuje fyzicky diskrétní jednotku vhodnou jako jednu dávku pro subjekt, kdy každá dávka obsahuje předem stanovené množství předem stanovené složky, vypočítané tak, aby bylo dosaženo požadovaného terapeutického účinku po požadovaném naředění, např. nosičem nebo vehikulem.
V jedné konkrétní variantě navrhovaného vynálezu jsou látky podávány v jedné dávce intravenózně. Lokalizovaná aplikace může proběhnout přímou injekcí nebo zvolením anatomicky izolovaných kompartmentů, izolací mikrocirkulace cílového orgánového systému, reperfúzí v cirkulačním systému nebo katétru dočasně zavedeného do cílového orgánu a vaskulatury spojené s porušenou tkání.
Prostředky jsou podávány způsobem kompatibilním s lékovou formou a v terapeuticky účinném množství. Množství, které má být podáno, a časování aplikací závisí na léčeném subjektu, schopnosti pacientova organizmu reagovat na aktivní složku a stupni požadovaného terapeutického účinku. Přesná množství aktivní složky nezbytná pro aplikaci závisí na úsudku odborníka aje rozdílná pro každý jednotlivý případ. Ačkoliv jsou zde popisována vhodná rozmezí dávek pro systémovou aplikaci, závisí rovněž na způsobu aplikace. Vhodné protokoly aplikace jsou také variabilní, ale obvykle se sjednocují po úvodní dávce následované opakovanými dávkami v jedno- nebo více hodinovém intervalu a následnou injekcí při další aplikaci. Další možností je
- 19CZ 304320 B6 kontinuální intravenózní infuze schopná udržet koncentraci v krvi v rozmezí hodnot specifických pro zamýšlenou in vivo terapii. Existuje celá řada chorob, u kterých se zdá potlačení angiogeneze jako klíčové, jsou pak označované jako angiogenní choroby, kterými mohou být např. zánětlivé poruchy, jako jsou imunitní a neimunitní záněty, chronický artikulámí revmatismus, lupénka, poruchy spojené s nežádoucím nebo nevhodným zablokováním cév, jako je diabetická retinopatie, neovaskulámí glaukom, restinóza, kapilární proliferace v arteriosklerotických plácích a osteoporóza a poruchy spojené s rakovinou, jako jsou pevné nádory, metastázy pevných nádorů, angofibromy, retrolentální fibroplázie, hemangiomy, Kaposiho sarkom a podobná nádorová onemocnění, která pro růst nádoru vyžadují neovaskularizaci.
Vaskulámí permeabilita je důležitou složkou angiogeneze aje spojena s celou řadou škodlivých patologií. Například poškození způsobené zvýšenou vaskulámí permeabilitou vyvolanou mrtvicí může způsobit poškození i díky vyvolání zánětu.
Tedy způsoby potlačení vaskulární permeability v tkáni postižené nemocí nebo poruchou potlačí příznaky této choroby a v závislosti na jejím typu mohou přispět k léčbě choroby. V jedné variantě navrhovaný vynález zahrnuje potlačení vaskulámí permeability na místě postiženém poruchou. Míra vaskulámí permeability v tkáni a tedy míra její inhibice dosažená popisovanými způsoby může být stanovená celou řadou způsobů.
V jedné konkrétní variantě podle navrhovaného vynálezu je léčenou tkání tkáň postižená zánětem a vaskulámí permeabilita je zvýšena díky stimulaci VEGF. Do této oblasti spadá způsob potlačení vaskulámí permeability v artritické tkáni, jako v případě pacientů s chronickým artikulámím revmatismem, v případě tkání postižených zánětem, v tkáni postižené lupénkou, apod.
V další variantě je léčenou tkání rohovka pacienta s nemocnou rohovkou, jako v případě diabetické retinopatie, makulámí degenerace, nebo neovaskulámího glaukomu a vaskulámí permeabilitu je třeba potlačit v tkáni rohovky v místech, kde došlo k neovaskularizaci. Způsoby podle navrhovaného vynálezu jsou také účinné při zabraňování tvorby metastáz, neboť (1) jejich vznik vyžaduje vaskularizaci primárního nádoru tak, aby mohly metastatické nádorové buňky opustit přimámí nádor a (2) jejich usazení a růst v cílovém místě vyžaduje neovaskularizaci.
V další variantě popisuje navrhovaný vynález spojení způsobu podle navrhovaného vynálezu s dalšími terapeutickými postupy, jako je konvenční chemoterapie namířená proti pevným nádorům a pro kontrolu tvorby metastáz. Aplikaci inhibitoru vaskulámí permeability obvykle probíhá během nebo po chemoterapii, ačkoliv je vhodnější vaskulámí permeabilitu potlačit po chemoterapeutickém zásahu ve chvíli, kdy nádorová tkáň po toxickém zásahu zvýší vaskulámí permeabilitu tak, aby obnovila zásobování nádorové tkáně a živinami. Kromě toho je možné použít způsob inhibice vaskulámí permeability po chirurgickém zásahu, když je pevný nádor odstraněn, jako prevenci tvorby metastáz.
V případě, že popisovaný způsob je použit pro potlačení vaskulámí permeability v případě metastáz, je tento způsob také použitelný pro potlačení vzniku metastáz a potlačení růstu již vzniklých nádorů.
Restenosis je proces migrace buněk hladkého svalstva (SMC) ajejich proliferace v tkáních a na místech, kde perkutánní transluminální koronární angioplastiky, který snižuje pravděpodobnost úspěchu tohoto zákroku. Migrace a proliferace buněk hladkého svalstva během restenózy je možné označit jako proces, který je možné ovlivnit potlačení vaskulámí permeability pomocí způsobů podle navrhovaného vynálezu. Tedy, navrhovaný vynález také zahrnuje potlačení restenosis pomocí snížení vaskulární permeability podle navrhovaného vynálezu u pacientů, kteří podstoupili angioplastiku. V případě potlačování restenosis je inaktivovaná tyrozin kináza podávána obvykle po angioplastice, neboť stěna koronárních cév je rizikovou oblastí pro vznik restenózy, a to obvykle od 2 do asi 28 dní, spíše však během prvních 14 dnů po zákroku. Způsob podle navrhovaného vynálezu pro potlačení vaskulámí permeability v tkáni postižené chorobou, a tedy . ?n CZ 304320 B6 rovněž postup způsobu léčby chorob spojených se změnami vaskulární permeability, zahrnuje kontakt tkání, ve kterých dochází ke zvýšení vaskulární permeability, nebo kde je zvýšené riziko zvýšení vaskulární permeability s prostředkem obsahujícím terapeuticky účinné množství inaktivovaných proteinů Src a/nebo Yes, nebo vektorů zajišťujících expresi těchto proteinů.
V případě, že je třeba zvýšit nebo posílit vaskulární permeabilitu, je vhodnější použít aplikaci aktivních forem proteinů Src a/nebo Yes do tkáně. Způsob a načasování aplikace je podobné jako v případě způsobů popsaných výše týkajících se potlačení vaskulární permeability.
Například, ovlivnění propustnosti krevně mozkové bariéry pro umožnění vstupu léčiv do tkáně mozku je rovněž předmětem navrhovaného vynálezu. Zvýšení vaskulární permeability krevně mozkové bariéry umožní léčivům, která normálně nejsou schopná tuto bariéru překročit, vstoupit do tkáně mozku.
Může být nezbytné ovlivňovat angiogenezi pomocí vaskulární permeability velmi citlivě a v tom případě může být žádoucí použít směs aktivních a neaktivních forem proteinů Src nebo Yes nebo nukleových kyselin kódujících a zajišťujících expresi proteinů Src nebo Yes.
Potlačení nebo posílení angiogeneze obvykle nastává 5 až 7 dní po prvním kontaktu s terapeutickým prostředkem podle navrhovaného vynálezu. Podobně ovlivnění vaskulární permeability by mělo probíhat v podobném časovém rámci. První účinky se mohou dostavit v poměrně krátkém časovém úseku po aplikaci terapeutického prostředku. Limitujícím faktorem je míra absorpce tkání, buněčná intemalizace, translokace proteinu nebo translace nukleové kyseliny (závisí na terapeutickém prostředku) a směrování proteinu. Je tedy možné, že první projevy ovlivnění vaskulární permeability nastanou již za méně než hodinu po podání. Je možné následné nebo prodloužené podávání neaktivního Src a/nebo Yes proteinu za použití správných podmínek. Modifikací těchto parametrů tedy získáme celou řadu možných terapeutických časových úseků, které mohou být navrženy.
Způsob podle navrhovaného vynálezu také zahrnuje aplikaci prostředku obsahujícího inhibitor tyrozin kináz rodiny Src do tkáně postižené chorobou, zraněním krevních cév nebo traumatem. Inhibitor tyrozin kináz rodiny Src může být chemický inhibitor Src, proteinový inhibitor Src nebo nukleotidový inhibitor Src.
Příklady vhodných chemických inhibitorů tyrozin kináz rodiny Src jsou např. PPI, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicol R2146, Geldanamycin apod.
PPI (od Biomol, licence od Pfizer) je syntetický inhibitor Src používaný v této studii. PPI je členem rodiny pyrazol pyrimidinu - inhibitorů Src. Další syntetické inhibitory Src zahrnují PP2 (Calbiochem, licence od Pfizer), který je strukturně podobný PPI a ukázal se také účinným blokátorem aktivity tyrozin kináz rodiny Src. (Hanke et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(2): 695-701). Další specifický inhibitor tyrozin kinázy Src je PD173955 (Moasser et al., 1999, Cancer Res. 59:6145-6152), jehož struktura byla publikována. PD162531 (Owens et al., 2000, Mol. Biol. Cell 11:51-64) je také specifickým inhibitorem kináz Src od Parke Davise, ale struktura není z literatury dostupná. Geldanamycin je další inhibitor kinázy Src dostupný od Life Technologies. Radiciol je komerčně dostupný od různých firem (např. Calbiochem, RBI, Sigma), je antifungální makrocyklické laktonové antibiotikum, které rovněž působí jako nespecifický inhibitor tyrozin kináz a byla prokázána jeho schopnost potlačit jeho aktivitu tyrozin kinázy Src. Nejvhodnější chemické inhibitory jsou PPI a PP2 nebo podobně, nejvhodnější chemický inhibitor je pak PPI.
Další vhodné inhibitory tyrozin kináz rodiny Src je možné identifikovat a charakterizovat pomocí technik známých v současném stavu techniky. Například je možné testování chemických látek jako potenciálních a selektivních inhibitorů Src nebo jiných tyrozin kináz a výsledkem může být pak identifikace chemické skupiny použitelné jako účinný inhibitor tyrozin kináz rodiny Src.
-21 CZ 304320 B6
Například, katecholy byly identifikovány jako důležité vazebné elementy pro celou řadu inhibitorů tyrozin kináz pocházejících z přirozených zdrojů a rovněž byly nalezeny v látkách vybraných pomocí kombinační cílené selekce pro selektivní inhibici c-Src. (Mály, D. J. et al., 2000, Combinatorial Target - Guided Ligand Assembly: Identification of Potent Subtypes - Selective c-Src Inhibitors, PNAS (USA) 97(6):2419-2424). Vyhledávání založené na kombinační chemii možných látek s inhibičními vlastnostmi využívá skupiny, o kterých je známé, že jsou důležité pro inhibici Src, jako výchozí bod, a je důležitým a účinným způsobem pro izolaci a charakterizaci dalších chemických inhibitorů tyrozin kináz rodiny Src.
Ještě opatrnější výběr potenciálních vazebných elementů založených na možnosti napodobení je v případě širokého spektra funkčních skupin nacházejících se na polypeptidech a nukleových kyselinách, které mohou být použité pro provádění kombinačního vyhledávání aktivních inhibitorů. Například knihovny popisující O-methyloxim jsou pro tento účel obzvláště vhodné, neboť tyto knihovny jsou snadno připravené pomocí kondenzace O-methylhydroxylaminu s velkým množství komerčně dostupných aldehydů. Vznik O-alkyloximu je slučitelný s celou řadou funkčních skupin, které jsou stabilní při fyziologické pH. (Malay et al., viz. výše).
Jak bylo popsáno, vhodné inhibitory tyrozin kináz rodiny Src rovněž zahrnují množství neaktivních proteinů Src nebo Yes, nebo jejich směsí, nebo nukleotidových vektorů exprimujících neaktivní Src nebo Yes, nebo obojí, schopných potlačit vaskulámí permeabilitu, podle navrhovaného vynálezu.
Další vhodné inhibitory tyrozin kináz rodiny Src mohou být CSK - nebo nukleotidové vektory umožňující expresi CSK v množství zajišťující inaktivaci, podle navrhovaného vynálezu.
Jak bylo popsáno výše, jakákoliv tkáň, nebo orgán, skládající se z organizovaných tkání, může být místem poruchy vaskulámí permeability, a to včetně mozku, pokožky, svalů, střeva, pojivové tkáně, kloubů, kostí a dalších tkání, ve kterých se nacházejí krevní cévy.
Pacient, který může být léčen pomocí způsobů uvedených v navrhovaném vynálezu, by měl být zejména lidský pacient, ačkoliv je zřejmé z principu navrhovaného vynálezu, že uvedené principy by byly účinné u všech savců. Z toho vyplývá i definice termínu „pacient“, jak je zde používán. V tomto kontextu je jako savec rozuměn jakýkoliv savčí druh, u kterého je třeba léčit jakékoliv poškození tkáně spojené s propustností cév nebo otoky, zejména pak savčí druhy důležité pro zemědělství nebo domácí zvířata.
Způsob podle navrhovaného vynálezu zahrnuje aplikaci terapeuticky účinného množství chemického inhibitoru tyrozin kináz rodiny Src, neaktivních proteinů Src nebo Yes, aktivního proteinu CSK, nukleové kyseliny kódující tyto proteiny, nebo jejich směsi, ve fyziologicky tolerovatelném prostředku savčímu pacientovi v souladu se způsoby podle navrhovaného vynálezu. Rozmezí dávek pro aplikaci chemických inhibitorů tyrozin kináz rodiny Src, jako je např. PPI, může být rozmezí od 0,01 mg/kg tělesné hmotnosti od asi 10 mg/kg tělesné hmotnosti, nebo může být limitováno rozpustností aktivní složky ve farmaceutickém nosiči. Je vhodné, aby terapeutické dávky byly v rozmezí od 1 mg/kg tělesné hmotnosti do asi 9 mg/kg tělesné hmotnosti. Nižší dávky, jako např. od 0,1 mg/kg tělesné hmotnosti do asi 1 mg/kg tělesné hmotnosti mohou být přizpůsobeny opakované aplikaci pro léčbu chronických poruch. Typické dávky pro léčbu akutních poruch, které jsou méně závažné, snadno dostupné a kde způsob aplikace je jednodušší mohou být od asi 1 mg/kg tělesné hmotnosti do asi 3 mg/kg tělesné hmotnosti. V závislosti na závažnosti poranění, lokalizaci nebo způsobu aplikace mohou být použity vyšší dávky od asi 3 mg/kg tělesné hmotnosti od asi 10 mg/kg tělesné hmotnosti (nebo podle rozpustnosti látky ve farmaceutickém nosiči), a to zejména v případě závažných poranění, lokalizací, které jsou těžko přístupné, nebo aplikací, které mohou probíhat pouze prostřednictvím nepřímé systémové aplikace.
-22CZ 304320 B6
V případě akutního poranění nebo traumatu je nejvhodnější zahájit léčbu co nejdříve po poranění. Přesto časový limit pro účinnou aplikaci inhibitorů tyrozin kináz rodiny Src může být v rozmezí asi 48 hodin po poranění nebo traumatu, v případě akutních případů. Je vhodnější, aby k aplikaci došlo během prvních 24 hodin, přičemž lépe 12 hodin a nejvhodnější případ je, když aplikace proběhne během prvních 6 hodin. Aplikace 48 hodin po poranění může být účinná pro odstranění dalšího poškození tkáně způsobeného následnou vaskulární propustností nebo otokem a dokonce i účinek původního poškození tkáně může být takovouto aplikací snížen.
V případě preventivní aplikace určené pro preventivní ochranu tkáně před vaskulární propustností nebo otokem v případě chirurgického zákroku nebo v případě diagnostického předpokladu, by k aplikaci mělo dojít před vlastním nárůstem vaskulární permeability, nebo během nástupu nárůstu vaskulární permeability. Pro léčbu chronických poruch vedoucích k nárůstu vaskulární permeability a s tím spojené vaskulární propustnosti a otoku aplikace aktivních inhibitorů tyrozin kináz rodiny Src by měla probíhat v kontinuálním dávkovacím protokolu.
Rozmezí dávek pro aplikaci neaktivních proteinů Src nebo Yes, nebo aktivního proteinu CSK závisí na formě proteinu, jeho účinnosti, jak je popsáno dále, a použité množství by mělo být dostatečné, aby bylo dosaženo požadovaného efektu, kdy vaskulární permeabilita a příznaky chorob spojené s vaskulární permeabilitou, jsou potlačeny. Dávka by neměla být natolik vysoká, aby způsobila nežádoucí vedlejší účinky, jakými může být syndrom hyperviskozity, plicní otok, selhání srdce způsobené překrvením apod.
Terapeuticky účinné množství ovlivňující vaskulární permeabilitu je takové množství aktivního SCK nebo neaktivní proteinů Src nebo Yes, nebo jejich směsí, nebo nukleových kyselin kódujících tyto proteiny, které je dostatečně pro to, aby bylo dosaženo měřitelné změny vaskulární permeability v léčené tkáni, tzn. množství ovlivňující vaskulární permeabilitu. Ovlivnění vaskulámí permeability může být stanoveno pomocí technik popsaných výše, nebo pomocí způsobů známých odborníkům v současném stavu techniky. Ovlivnění vaskulární permeability může být stanoveno pomocí Millerovy techniky, jak je zde popsáno, nebo pomocí jiných technik známých v současném stavu techniky.
Obecně, dávka může záviset na věku, podmínkách, pohlaví a rozsahu choroby u pacienta a měla by být určena odborníkem v současném stavu techniky. V případě jakýchkoliv komplikací by tato dávky měla být upravena příslušným lékařem.
Farmaceutický prostředek podle navrhovaného vynálezu by mohl být aplikován parenterálně pomocí injekce nebo postupnou infúzi během dne. Protože tkáň, která má být léčena, je obvykle dosažitelná i pomocí systémové aplikace, a tedy v nejobvyklejším případě je léčena pomocí intravenózní aplikace terapeutického prostředku, další tkáně a způsoby transportu musí být také testovány, neboť existuje jistá pravděpodobnost, že cílová tkáň obsahuje cílovou molekulu. Prostředek podle navrhovaného vynálezu tedy může být podáván intravenózně, intraperitoneálně, intramuskulámě, subkutánně, intrakavitálně, transdermálně a může být doručován pomocí peristaltických technik.
Intravenózní aplikace probíhá např. pomocí injekce v jednotkové dávce. Termín Jednotková dávka“, pokud je použit jako odkaz vzhledem k terapeutickému prostředku podle navrhovaného vynálezu, popisuje fyzicky diskrétní jednotku vhodnou jako jednu dávku pro subjekt, kdy každá dávka obsahuje předem stanovené množství předem stanovené složky, vypočítané tak, aby bylo dosaženo požadovaného terapeutického účinku po požadovaném naředění, např. nosičem nebo vehikulem.
V jedné konkrétní variantě navrhovaného vynálezu jsou látky podávány v jedné dávce intravenózně. Fokalizovaná aplikace může proběhnout přímou injekcí nebo zvolením anatomicky izolovaných kompartmentů, izolací mikrocirkulace cílového orgánového systému, reperfúzí v cir-23 CZ 304320 B6 kulačním systému nebo katétru dočasně zavedeného do cílového orgánu a vaskulatury spojené s porušenou tkání.
Prostředky jsou podávány způsobem kompatibilním s lékovou formou a v terapeuticky účinném množství. Množství, které má být podáno, a časování aplikací závisí na léčeném subjektu, schopnosti pacientova organizmu reagovat na aktivní složku a stupni požadovaného terapeutického účinku. Přesná množství aktivní složky nezbytná pro aplikaci závisí na úsudku odborníka aje rozdílná pro každý jednotlivý případ. Ačkoliv jsou zde popisována vhodná rozmezí dávek pro systémovou aplikaci, závisí rovněž na způsobu aplikace. Vhodné protokoly aplikace jsou také variabilní, ale obvykle se sjednocují po úvodní dávce následované opakovanými dávkami v jedno- nebo více hodinovém intervalu a následnou injekcí při další aplikaci. Další možností je kontinuální intravenózní infúze schopná udržet koncentraci v krvi v rozmezí hodnot specifických pro zamýšlenou in vivo terapii.
Tedy způsoby podle navrhovaného vynálezu potlačující poškození tkáně díky vaskulámí propustnosti nebo otoku spojeném s nemocí nebo poruchou potlačí příznaky této choroby a v závislosti na jejím typu mohou přispět k léčbě choroby. Zvýšení vaskulámí permeability v tkáni, a tedy účinnost inhibice dosažené pomocí navrhovaného vynálezu, může být stanoveno celou řadou technik. Konkrétně se jedná o způsoby vhodné pro potlačení mrtvice nebo další mozkových příhod spojených s poškozením centrálního nervového systému, který je dáno vyvolaným zvýšení vaskulámí permeability následnou zvýšenou propustností cév a/nebo vzniklým otokem, který poškodí přilehlou tkáň.
V jedné konkrétní variantě podle navrhovaného vynálezu je léčenou tkání tkáň postižená zánětem a vaskulámí permeabilita je zvýšena díky stimulaci VEGF. Do této oblasti spadá způsob potlačení vaskulámí permeability v artritické tkáni, jako v případě pacientů s chronickým artikulámím revmatismem, v případě tkání postižených zánětem, v tkáni postižené lupénkou, apod.
V další variantě je léčenou tkání rohovka pacienta s nemocnou rohovkou, jako v případě diabetické retinopatie, makulámí degenerace, nebo neovaskulámího glaukomu a vaskulámí permeabilitu je třeba potlačit v tkáni rohovky v místech, kde došlo k neovaskularizaci. Popisovaný způsob podle navrhovaného vynálezu pro nížení vaskulámí permeability v tkáni postižené zraněním nebo chorobou rovněž použitelný jako způsob léčby chorob spojených s porušením vaskulámí permeability, zahrnuje kontakt tkáně, ve které došlo k nárůstu vaskulámí permeability, nebo tkáně, kde je zvýšené riziko nárůstu vaskulámí permeability s prostředkem obsahujícím terapeuticky účinné množství inhibitoru tyrozin kináz Src.
Ovlivnění vaskulámí permeability a zabránění poškození tkáně způsobeném propustností cév a otokem by mělo nastat během krátkého časového úseku po aplikaci terapeutického prostředku. Většina terapeutických účinků je patrná během 3 dní po podání, v případě akutního zranění nebo traumatu. Účinky chronické aplikace nejsou obvykle tak patrné.
Limitujícím faktorem je míra absorpce tkání, buněčná intemalizace, translokace proteinu nebo translace nukleové kyseliny (závisí na terapeutickém prostředku) a směrování proteinu. Účinky ovlivňující poškození tkáně pak mohou nastat již za méně než hodinu po podání. Je možné následné nebo prodloužené podávání inhibitoru tyrozin kináz rodiny Src za použití správných podmínek. Modifikací těchto parametrů tedy získáme celou řadu možných terapeutických časových úseků, které mohou být navrženy.
F. Terapeutický prostředek (obecná pravidla)
Navrhovaný vynález popisuje terapeutické prostředky použitelné pro použití v léčebných postupech zde popisovaných. Terapeutické prostředky podle navrhovaného vynálezu obsahují fyziologicky tolerovatelný nosič zároveň s proteiny Src a Yes, nebo vektory schopné expresi proteinů Src a Yes zajistit, jak je zde popsáno, nebo inhibitor tyrozin kináz rodiny Src, který je zde popsa-24CZ 304320 B6 ný, kterým může být chemický inhibitor Src, proteinový inhibitor Src nebo nukleotidový inhibitor Src, rozpuštěný nebo rozptýlený v nosiči jako aktivní složka. V nejvhodnější variantě není terapeutický prostředek imunogenní po aplikaci savcům nebo lidským pacientům za terapeutickým účelem.
Proteiny Src a Yes mohou být aktivní, neaktivní, nebo se může jednat o jejich směsi, v závislosti na požadovaném účinku. Nejvhodnější formy Src a Yes jsou popsány výše. Protein CSK by měl být přítomný v aktivní formě.
Jak jsou používány zde termíny „farmaceuticky přijatelný“ a nebo „fyziologicky tolerovatelný“ a jejich gramatické varianty, popisující prostředky, nosiče, rozpouštědla a složky, mohou být zaměněny a představují takové materiály, které je možno podat savcům, aniž by vyvolaly nežádoucí fyziologické efekty, jako je nevolnost, závrať, podráždění žaludku a podobně.
Příprava farmaceutického prostředku, který obsahuje rozpuštěné nebo rozptýlené aktivní složky je dobře známá v současném stavu techniky a nemůže být limitována zvolenou formou. Tyto prostředky jsou obvykle připraveny v injekční formě, a to jak v kapalné formě nebo suspenzi, přesto že pevná forma vhodná pro přípravu roztoku nebo suspenze v kapalině před použitím, je rovněž použitelná. Prostředek může být také ve formě emulze nebo jako lipozómový prostředek. Aktivní složka může být smíchána s nosičem, který je farmaceuticky přijatelný a kombinovatelný s aktivní složkou v množství dostatečném pro použití v terapeutických technikách zde popsaných. Vhodnými nosiči mohou být například voda, fyziologický roztok, dextróza, glycerol, ethanol a podobně, nebo jejich kombinace. Dále pokus je třeba prostředek může obsahovat menší množství dalších složek, jako jsou zvlhčovadla nebo emulzifikátory, pufry a podobně, které zvyšují účinnost aktivní složky.
Terapeutický prostředek podle navrhovaného vynálezu může obsahovat farmaceuticky přijatelné soli použitých látek. Farmaceuticky přijatelné soli zahrnují soli vzniklé přidáním kyseliny (tvořené aminoskupinami polypeptidu) tvořené neorganickými solemi, jako jsou např. kyselina chlorovodíková nebo fosforečná, organickými kyselinami, jako je kyselina octová, tartarová, mandelová atd. Soli tvořené volnými karboxylovými skupinami mohou být také odvozené od anorganických zásad, jako je např. sodík, draslík, amoniak, vápník nebo hydroxidy železa a organickými zásadami jako je izopropylamin, trimethylamin, 2-ethylaminoethanol, histidin, prokain a podobně.
Fyziologicky přijatelné nosiče jsou dobře známé v současném stavu techniky. Příkladem kapalných nosičů jsou sterilní vodné roztoky, které neobsahují žádné další přísady, kromě aktivních složek a vody, nebo mohou obsahovat pufr jako fosforečnan sodný s fyziologickým pH, fyziologický roztok nebo oboje, jako je fosfátový fyziologický roztok. Dále vodné nosiče mohou obsahovat více než jednu pufrovací sůl, jako jsou sodné nebo draselné chloridy, dextróza, polyethylenglykol a další roztoky.
Kapalný prostředek může také obsahovat kapalnou fázi kromě té, ve které je voda. Příkladem těchto dalších kapalných fází je glycerin, rostlinné oleje, jako je bavlníkový olej a emulze voda-olej.
F(i) Terapeutické prostředky podle navrhovaného vynálezu pro ovlivnění vaskulámí permeabilify
V jedné variantě navrhovaného vynálezu terapeutické prostředky obsahují takové množství proteinů Src a/nebo Yes, které je dostatečné pro ovlivnění vaskulámí permeability, nebo účinný rekombinantní DNA expresní vektor schopný zajistit expresi účinného množství proteinů Src a Yes, obvykle ve formě obsahující alespoň hmotnostních 0,1 % proteinů Src nebo Yes z celkové hmotnosti terapeutického prostředku. Hmotnostní procenta jsou určena jako poměr hmotnosti proteinů Src nebo Yes k celkovému množství prostředku. Tedy např. 0,1 % hmotnosti předsta-25 CZ 304320 B6 vuje 0,1 g proteinů Src nebo Yes z lOOg celkové hmotnosti prostředku. Pro DNA expresní vektory je aplikované množství závislé na vlastnostech expresního vektoru, léčené tkáni a dalších podmínkách.
F(ii) Terapeutické prostředky podle navrhovaného vynálezu obsahující inhibitor tyrozin kináz rodiny Src
Chemické terapeutické prostředky podle navrhovaného vynálezu obsahují fyziologicky tolerovatelný nosič zároveň s inhibitorem tyrozin kináz rodiny Src rozpuštěným nebo rozptýleným v nosiči jako aktivní složka.
Proteinové terapeutické prostředky podle navrhovaného vynálezu obsahují fyziologicky tolerovatelný nosič zároveň s neaktivním Src, neaktivním Yes nebo aktivním proteinem CSK rozpuštěným nebo rozptýleným v nosiči jako inhibitor tyrozin kináz rodiny Src.
Nukleotidové terapeutické prostředky podle navrhovaného vynálezu obsahují fyziologicky tolerovatelný nosič zároveň s nukleovou kyselinou kódující neaktivním Src, neaktivním Yes nebo aktivním proteinem CSK rozpuštěnou nebo rozptýlenou v nosiči jako inhibitor tyrozin kináz rodiny Src.
Vhodné inhibitory tyrozin kináz rodiny Src by měly specificky inhibovat biologickou aktivitu tyrozin kináz rodiny Src. Nejvhodnější inhibitory tyrozin kináz rodiny Src by měly být zejména specifické pro inhibici aktivity pp60Src proteinu a sekundárně inhibovat nejbližší příbuzné členy rodiny tyrozin kináz Src, jako je Yes. Vhodný inhibitor tyrozin kináz rodiny Src může být inhibitor patřící do skupiny zahrnující PPI, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radiciol R2146 a Geldanamycin. Další vhodné inhibitory tyrozin kináz rodiny Src mohou být identifikovány a charakterizovány pomocí standardních technik známých v současném stavu techniky. Mutanty Src vykazující inhibiční účinek na vaskulární permeabilitu namísto aktivace, jsou označovány jako neaktivní mutanty Src. Proteiny obsahující mutace, které jim dávají inhibiční aktivitu, jsou také označovány jako dominantně negativní proteiny Src, které potlačují vaskulámí permeabilitu, a to i v případě, že je výsledkem endogenní aktivity Src, stejně jako posílené aktivity Src způsobené stimulací růstovým faktorem. Některé mutace divokého typu c-Src podle navrhovaného vynálezu mohou rovněž sloužit jako dominantně negativní vzhledem kjejich schopnosti blokovat růst krevních cév a vaskulámí permeabilitu, např. snížením vaskulámí permeability in vivo. Tedy další vhodné inhibitory tyrozin kináz rodiny Src, včetně neaktivních forem proteinů Src a Yes které mohou sloužit jako antagonisté aktivity proteinů Src nebo Yes což vede k inhibici nebo snížení vaskulární permeability krevních cév v cílové tkáni. Nejvhodnější neaktivní protein Src je protein označovaný jako Src 251. Dalším vhodným proteinem je protein Src K295M. Vhodný neaktivní protein Yes b měl mít potlačenou kinázovou aktivitu vzhledem k divokému typu proteinu. Další inhibitory tyrozin kináz rodiny Src mohou být antisens nukleové kyseliny, analogy nukleových kyselin, nebo nukleové kyseliny kódující protein které potlačují expresi genů Src a Yes v cílových buňkách. Antisens molekuly mohou být terapeuticky účinné látky ovlivňující vaskulámí permeabilitu v případě, že tyto antisens nukleové kyseliny schopné hybridizovat s mRNA kódující protein Src nebo Yes, mohou hybridizovat s mRNA, což vede k inhibici buněčné exprese tyrozin kináz Src nebo Yes po transfekci do cílové buňky ve farmaceuticky přijatelném nosiči.
Jak bylo uvedeno výše, vhodným inhibičním proteinem c-Src je protein Src251, kde je exprimováno pouze 251 počátečních aminokyselin. Tento konstrukt postrádá celou kinázovou doménu a je tedy označován jako „mrtvá kináza“ Src. Další konstrukt je Src K295M mutant, kde aminokyselina lysin v pozici 295 je zaměřena za aminokyselinu methionin. Tato bodová mutace v kinázové doméně brání vazbě ATP a rovněž blokuje na kináze závislou funkci Src nezbytnou pro signalizaci vaskulámích a nádorových buněk a proliferaci.
-26CZ 304320 B6
Kromě bodových mutací, jakákoliv mutace vedoucí k dosažení požadované inhibiční aktivity je použitelná pro použití v navrhovaném vynálezu. Konstrukty fúzních proteinů kombinující požadovaný protein Src (mutantu nebo jeho fragment) s exprimovaným aminokyselinovým tágem, antigenním epitopem, fluorescenčním proteinem nebo jinými proteiny či peptidy jsou rovněž použitelné, tak dlouho dokud požadovaný modulační účinek proteinu Src zůstává nezměněný.
Podobně, přidáním exogenního inhibitoru aktivity proteinu Src nebo stimulací exprese těchto inhibitorů v cílové tkáni, jak je to proveditelné pomocí CSK (c-terminální Src kináza), je rovněž způsobem inhibice aktivity Src. Fosforylace tyrozinu inaktivujícího Src, je způsobem negativní regulace c-terminální kinázy je účinkem popsaným u CSK (Nada et al., 1991, Nátuře 351:69-72, Okada et al., 1991, J. Biol. Chem. 266 (36):24249-24252). Když CSK fosforyluje aminokyselinu 527 v divokém typu proteinu Src, protein Src inaktivuje, tedy CSK je rovněž použitelné jako silný inhibitor aktivity Src. Sekvence aminokyselin lidského CSK obsahuje 450 aminokyselin a je označena přístupovým číslem P41240 a nachází se v proteinové databázi Swiss. sekvence mRNA nukleové kyseliny kódující lidský protein CSK je označen přístupovým číslem NM 004383 v databázi GenBank.
V jedné konkrétní variantě navrhovaného vynálezu farmaceutický prostředek obsahující takové množství proteinů Src nebo Yes a/nebo CSK schopné ovlivnit vaskulámí permeabilitu, nebo účinný expresní vektor zajišťující expresi účinného množství neaktivních proteinů Src, Yes nebo aktivního proteiny CSK, obvykle ve formě obsahující alespoň hmotnostních 0,1 % proteinů Src nebo Yes z celkové hmotnosti terapeutického prostředku. Hmotnostní procenta jsou určena jako poměr hmotnosti proteinů Src nebo Yes k celkovému množství prostředku. Tedy např. 0,1 % hmotnosti představuje 0,1 g proteinů Src nebo Yes z 100 g celkové hmotnosti prostředku. Pro expresní vektory je aplikované množství závislé na vlastnostech expresního vektoru, léčené tkáni a dalších podmínkách. Tedy účinné množství inhibitoru tyrozin kináz rodiny Src ve farmaceutickém prostředku je takové množství, které vede k terapeuticky účinnému ovlivnění vaskulámí permeability regulované proteinem Src. Terapeutické množství jakéhokoliv farmaceutického prostředku je takové, které samo o sobě vede k potlačení vaskulámí propustnosti nebo otoku způsobující poškození tkáně.
G(i) Obecné předpoklady, předmět výroby jak je použit zde, termín balicí materiál popisuje jakýkoliv materiál, jako je sklo, plast, papír, fólie a podobně, schopný udržet farmaceutický prostředek nezměněný. Tedy např. balicí materiál může být plastová nebo skleněná lahvička, laminovaná obálka a podobné nádoby, které obsahují farmaceutický prostředek.
V nejvhodnější variantě balicí materiál obsahuje etiketu na které je zřetelně popsán obsah, způsob výroby a použití farmaceutického prostředku obsaženého uvnitř.
G(ii) Terapeutické prostředky ovlivňující vaskulámí permeabilitu, předmět výroby
Navrhovaný vynález zahrnuje i předmět výroby popisující označenou nádobu obsahující terapeuticky účinné množství směsi proteinů Src a Yes. Předmět výroby popisuje i balicí materiál a farmaceuticky aktivní složku obsaženou uvnitř balicího materiálu.
Farmaceutická složka v oblasti výroby je jakýkoliv prostředek podle navrhovaného vynálezu obsahující proteiny Src nebo Yes v farmaceuticky přijatelné lékové formě tak, jak je popsána v přiloženém popisu. Tedy, prostředek může obsahovat protein Src nebo Yes nebo molekulu DNA umožňující expresi proteinu Src, molekulu DNA umožňující expresi proteinu Yes nebo molekulu DNA umožňující expresi obou proteinů. Předmět výroby popisuje takové množství farmaceutického agens dostatečného pro léčbu poruch popsaných výše, a to buď v jednotce, nebo v několika dávkách.
-27CZ 304320 B6
Proteiny Src mohou být aktivní nebo neaktivní, nebo to může být jejich směs v závislosti na požadované úrovni ovlivnění. Nejvhodnější formy aktivních nebo neaktivních proteinů Src nebo Yes jsou popsány výše.
Obalový materiál by měl obsahovat etiketu, na které je zřetelně označeno použití obsaženého farmakologického prostředku, tzn. pro léčbu poruch spojených s oslabením nebo posílením vaskulámí permeability a spojených poruch zde popisovaných. Etiketa může dále obsahovat instrukce pro použití a související informace, které mohou být důležité pro obchod. Balicí materiál může obsahovat nádobu nebo nádoby pro skladování farmaceutického prostředku.
G(iii) Terapeutické prostředky podle navrhovaného vynálezu obsahující inhibitor tyrozin kináz rodiny Src, předmět výroby.
Navrhovaný vynález zahrnuje i předmět výroby popisující označenou nádobu obsahující terapeuticky účinné množství inhibitoru tyrozin kináz rodiny Src. Inhibitorem může být balený chemický, proteinový nebo nukleotidový inhibitor tyrozin kináz rodiny Src, kombinace několika nebo jejich směs. Předmět výroby popisuje i balicí materiál a farmaceuticky aktivní složku obsaženou uvnitř balicího materiálu. Předmět výroby může také obsahovat dvě nebo více subterapeutických dávek farmaceutického prostředku, jejichž účinek se sčítá, což vede k potlačení poškození tkáně vyvolanému propustností cév nebo otokem.
Farmaceutická složka v oblasti výroby je jakýkoliv prostředek podle navrhovaného vynálezu obsahující inhibitor tyrozin kináz rodiny Src ve farmaceuticky přijatelné lékové formě tak, jakje popsána v přiloženém popisu. Tedy, prostředek může obsahovat chemické inhibitory jako PPI, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicol R2146 a Geldanamycin, proteinové inhibitory jako je neaktivní Src nebo Yes, aktivní protein CSK nebo molekulu nukleové kyseliny schopnou zajistit expresi těchto proteinů nebo jejich kombinací. Předmět výroby popisuje takové množství farmaceutického agens dostatečného pro léčbu poruch popsaných výše, a to buď v jednotce, nebo v několika dávkách.
Obalový materiál by měl obsahovat etiketu, na které je zřetelně označeno použití obsaženého farmakologického prostředku, tzn. pro léčbu poruch spojených s potlačením nárůstu vaskulámí permeability a spojených poruch zde popisovaných. Etiketa může dále obsahovat instrukce pro použití a související informace, které mohou být důležité pro obchod. Balicí materiál může obsahovat nádobu nebo nádoby pro skladování farmaceutického prostředku.
Přehled obrázků na výkresech
K obrazům tvořícím část tohoto spisu:
Obr. 1 je cDNA sekvence kuřecího c-Src kterou je kompletní sekvence s introny které byly deletovány jak bylo popsáno v Takeya et al., Cell, 32:881-890 (1983). Tato sekvence je dostupná v GenBank pod přístupovým číslem J00844. Sekvence obsahuje 1759 nukleotidů s částí kódující protein začínající a končící na příslušných kódujících sekvencích 112 a 1713 (sekvence č. 2).
Obr. 2 je kódovaná aminokyselinová sekvence kuřecího c-Src kódující sekvence z obr. 1 (sekvence č. 3).
Obr. 3 je cDNA sekvence lidského c-Src kterou poprvé popsal Braeuninger et al., proč. Nati. Acad. Sci., USA., 88:10411-10415 (1991). Tato sekvence je dostupná v GenBank pod přístupovým číslem X59932. Sekvence obsahuje 1759 nukleotidů s částí kódující protein začínající a končící na příslušných kódujících sekvencích 134 a 1486 (sekvence č. 4).
-28CZ 304320 B6
Obr. 4 je kódovaná aminokyselinová sekvence lidského c-Src kódující sekvence z obr. 3 (sekvence č. 5).
Obr. 5 ukazuje aktivaci endogenního Src pomocí bFGF nebo VEGF jak popisuje příklad 4. Vrchní část obrázku ukazuje výsledky in vitro kinázového testu s mírou aktivace endogenního c-Src buď pomocí bFGF, a nebo VEGF. Spodní část obrázku je blot kinázové techniky značený anti-Src protilátkou jako kontrola ekvivalentu Src a obsahu IgG.
Obr. 6 popisuje účinek retrovirem zajištěné exprese genu c-Src A na angiogenezi kuřecího CAM jak je popisováno v příkladu 4. Devítidenní kuřecí CAMy byly vystaveny RCAS-Src A aktivní mutant c-Src) nebo kontrolního RCAS-GFP (Green Fluorescent Protein = zeleně fluoreskující protein sloužící jako expresní sonda) retrovirům nebo pufru po dobu 72 h. Míra angiogeneze byla kvantifikována tak, jak je uvedeno v obr. 6A s reprezentativními mikrofotografiemi (4x) na obr. 6B odpovídajícími každém léčbě snímanými pomocí stereomikroskopu.
Obr. 7 ukazuje retrovirovou expresi c-Src A při aktivaci fosforylace vaskulámí MAP kinázy. Obr. 7A ukazuje tkáňové extrakty 10-ti denních kuřecích CAM které byly vystaveny VEGG nebo PMA po dobu 30 minut nebo po infekci c-src a retroviru po dobu 48 hodin. NT zkratka znamená kontrola bez léčby. Src bylo imunoprecipitováno z ekvivalentního množství celkového proteinového extraktu a vystaveno in vitro imunokomplexové kinázové technice za použití FAK-GST fuzního proteinu jako substrátu, rozděleno na elektroforéze a přeneseno na nitrocelulózu. V alikvotech výše popsaného lyzátu z celé tkáně byla rovněž stanovována fosforylace endogenního ERK pomocí anti-fosfo-ERK protilátky. Obr. 7B ukazuje 10 dní staré CAM, které byly infikovány buď „prázdným“ RCAS nebo RCAS obsahujícím Src A. Po dvou dnech byly CAM rozpitvány, zamraženy v OCT a nařezány na 4 gm řezy. Tyto řezy byly značeny pomocí antifosfo-ERK protilátky (New Englang Biolabs), promyty a detekce proběhla pomocí kozí antikráličí sekundární protilátky značené FITC. Fluorescenční obrazy byly zachyceny pomocí chlazené CCD kamery (Princeton Inst.).
Obr. 8 ukazuje selektivní požadavky pro Src aktivitu během VEGF, ale ne bFGF indukované angiogeneze. Devět dní staré kuřecí CAM byly vystaveny RCAS-Src 251 nebo kontrolní RCAS-GFP retroviru nebo pufru po dobu 20 hodin a poté inkubovány dalších 72 hodin v přítomnosti nebo v absenci bFGF nebo VEGF. Míra angiogeneze byla kvantifikována na obr. 8A jak je popisováno výše a reprezentativní mikrofotografíe (6x) byly snímány stereomikroskopem, jak ukazuje obr. 8B. Obr. 8C ukazuje blot značený pomocí anti-Src protilátky pro potvrzení exprese Src251 v transfekovaných buňkách a jako kontrola slouží slepé transfektanty.
Obr. 9 ukazuje výsledky retrovirového zavádění RCAS-Src 251 u lidských nádorů. Obr. 9A je mikrofotografíe, která ukazuje fragment lidského medulloblastomového nádoru infikovaného RCAS-GFP (RCAS-Green Fluorescent Protein) exprimujícímu GFP exkluzivně v nádorové vaskulatuře (označeno šipkou), jak bylo zjištěno na optických sekcích získaných pomocí laserového skenovacího konfokálního mikroskopu BioRad (značka = 500 gm). Obr. 9B ukazuje data z nádorů ošetřených povrchovou aplikací retroviru, které byly ponechány růst 3 až 6 dní, poté vyoperovány a byla stanovena jejich váha. Vynesená data představují průměrnou změnu v hmotnosti nádoru (od 50 mg výchozí hmotnosti nádoru) +/- SEM dvou opakování. Obr. 9C ukazuje reprezentativní mikrofotografíe meduloblastomů chirurgicky vyjmutých z embryí (značka = 350 gm). Spodní část obrázku představují velká zvětšení jednotlivých nádorů ukazující vaskulaturu každého nádoru v detailu (značka = 350 gm). Šipka označuje porušení krevních cév u nádorů ošetřených RCAS-Src251.
Obr. 10 je diagram ukazující restrikční mapu RCASBP (RCAS) vektorového konstruktu (sekvence č. 1).
Obr. 11 ukazuje kódovanou aminokyselinovou sekvenci lidského proteiny c-Yes v jednopísmenném kódu (sekvence č. 8).
-29CZ 304320 B6
Obr. 12 ukazuje nukleotidovou sekvenci cDNA kódující lidský protein c-Yes. Tato sekvence je dostupná v GenBank pod přístupovým číslem MI5990. Sekvence obsahuje 4517 nukleotidů s částí kódující protein začínající a končící na příslušných kódujících sekvencích 208 a 1839 a přepsaná do aminokyselinové sekvence zobrazené na obr. 11 (sekvence č. 7),
Obr. 13 ukazuje výsledky retrovirového přenosu Src251 a CSK u myšího modelu angiogeneze po podkožní aplikaci. Obr. 13A ukazuje výsledky imunoblotu pro detekci exprese flk. Obr. 13B ukazuje výsledky imunoblotu z techniky sledující flk po stimulaci VEGF a bFGF. Obr. 13C je graf, který zobrazuje počet CD34 pozitivních krevních cév (průměr trojic náhodných polí při zvětšení 20x) po ošetření VEGF a bFGF v přítomnosti GFP, Src 251 nebo CSR retrovirů.
Obr, 14 popisuje výsledky z modifikované Milesovy techniky pro stanovení vaskulámí permeability v pokožce myší deficitních v expresi Src, fyn a Yes. Obr. 14A je fotografie ošetřených uší, obr. 14B je graf experimentálních výsledků pro stimulaci různých deficitních myší. Obr. 14C ukazuje množství vymytého barviva Evansova modř po léčbě.
Obr. 15 je graf zobrazující relativní velikost infarktů u Src +/-, Src divokého tyu (wt) a divokého typu myší ošetřených PPI. Při léčbě PPI byla použita koncentrace 1,5 mg/kg tělesné hmotnosti.
Obr. 16 ukazuje sekvenční MRI skenování mozků kontrolních myší a myší ošetřených PPI, ukazující méně mozkových infarktů u myší ošetřených PPI (vpravo) než u kontrolních zvířat (vlevo).
Příklady provedení vynálezu
Následující příklady vztahující se k navrhovanému vynálezu jsou pouze ilustrací a nemohou být brány jako limitující faktory. Navíc varianty navrhovaného vynálezu, již nyní známé nebo v budoucnu vyvinuté odborníkem v současném stavu techniky mohou rovněž spadat do rámce navrhovaného vynálezu, tak, jak je uvedeno v nárocích.
Příklad 1. Příprava expresního konstruktu c-src a c-yes
Pro přípravu expresního konstruktu použitelného pro ovlivnění vaskulámí permeability a angiogeneze pomocí způsobů podle navrhovaného vynálezu, je cDNA kódující c-src upravena a vložena do vhodného expresního vektoru/konstruktu.
Sekvence cDNA kódující divoký typ (tzn. endogenní) kuřecí c-src je zobrazen na obr. 1 (sekvence č. 2) s kódovanou aminokyselinovou sekvencí uvedenou na obr. 2 (sekvence č. 3). Kódovaná proteinová sekvence je překládána z cDNA od nukleotidu na pozici 112 do pozice 1713. Nukleotidová sekvence odpovídající nukleotidové sekvenci lidské cDNA kódující c-src (sekvence č. 4) a sekvence kódovaných aminokyselin (sekvence č. 5) jsou uvedeny na obr. 3 a 4. Pro lidskou proteinovou sekvenci, kódující pozice začíná na nukleotidu 134 a končí na 1486 cDNA.
Byl připraven divoký typ, stejně jako celá řada mutovaných variant cDNA kódující c-src. Mutované c-Src konstrukty byly připraveny cílenou mutagenezí, jak popisuje Kaplan et al., EMBO J., 13:4745^1756 (1994). Mutovaný c-Src konstrukt kódující mutované proteiny Src pro použití ve způsobech podle navrhovaného vynálezu, je popsán v Kaplan et al., EMBO J., 13:4745-4756 (1994). Kaplan et al., popisuje různé mutované varianty c-Src konstruktu kódující proteiny pro použití ve způsobech podle navrhovaného vynálezu. Např. Kaplan et al., ukazuje různé produkty kuřecích c-src alel na obr. 1, zahrnuje SrcA a Src251.
-30CZ 304320 B6
Navrhovaný vynález popisuje dvě kategorie funkcí c-Src při ovlivnění vaskulámí permeability. Jak bylo uvedeno dříve, do jedné kategorie spadají molekuly Src, které zvyšují vaskulámí permeabilitu ajsou tedy označené jako aktivní proteiny. Divoký typ Src a celá řada dalších mutant je v navrhovaném vynálezu označena proteiny indukující vaskulámí permeabilitu. Jedna mutace divokého typu c-src, která je schopna indukovat růst krevních cév a vaskulámí permeability je mutant SrcA s bodovou mutací v aminokyselině na pozici 527, kdy došlo k záměně tyroziny 257 na fenylaíanin. Toto místo je za normální situace místem negativní regulace c-Src kinázy pomocí kinázy označované jako CSK. V případě, že dojde k fosforylaci tyrozinu 527 v divokém typu proteinu Src pomocí CSK, je tento protein deaktivován. V mutantě označené jako SrcA je regulační tyrozin změněn na fenylaíanin a tím se stává tento protein trvale aktivním a nelze deaktivovat pomocí fosforylace.
Další mutace Src, u kterých byl prokázán opačný modulační účinek na vaskulání permeabilitu, to znamená, že vaskulámí permeabilitu potlačuje, namísto, aby ji zvyšoval. Tyto mutace jsou označovány jako neaktivní mutanty Src. Proteiny obsahující mutace, které zajišťují jejich inhibiční účinek, jsou také označovány jako dominantně negativní proteiny Src, neboť snižují vaskulámí permeabilitu, včetně vaskulámí permeability vyvolané endogenní aktivitou Src, stejně tak, jako zvýšenou aktivitu Src vyvolanou stimulací růstovými faktory. Některé mutace c-src divokého typu podle navrhovaného vynálezu může rovněž fungovat jako dominantně negativní, díky jejich schopnosti blokovat růst krevních cév a vaskulámí permeability a tedy snížení vaskulámí permeability in vivo.
Vhodným inhibičním proteinem c-Src je např. Src 251 kde je exprimováno pouze prvních 521 aminokyselin. Tento konstrukt neobsahuje celou kinázovou doménu aje proto označován jako „mrtvá kináza“ Src. Další konstrukt je Src K295M mutant, kde aminokyselina lysin v pozici 295 je zaměřena za aminokyselinu methionin. Tato bodová mutace v kinázové doméně brání vazbě ATP a rovněž blokuje na kináze závislou funkci Src nezbytnou pro signalizaci vaskulárních a nádorových buněk a proliferaci.
Kromě bodových mutací, jakákoliv mutace vedoucí k dosažení požadované inhibiční aktivity je použitelná pro použití v navrhovaném vynálezu. Konstrukty fúzních proteinů kombinující požadovaný protein Src (mutantu nebo jeho fragment) s exprimovaným aminokyselinovým tágem, antigenním epitopem, fluorescenčním proteinem nebo jinými proteiny Či peptidy jsou rovněž použitelné, tak dlouho dokud požadovaný modulační účinek proteinu Src zůstává nezměněný.
Např. aktivní mutace Src v pozici 527, dokud není výslednou aminokyselinou v této pozici tyrozin, serin nebo threonin, navrhovaný vynález uvádí, že přítomnost jakékoliv jiné aminokyseliny v této pozici dá vzniknout proteinu, kterýje aktivní a má požadovanou aktivitu posilující vaskulámí permeabilitu.
Kináza Ye z rodiny Src již byla popsána dříve, ale o jejích funkcích v buňce je dosud známo jen velmi málo. (Burek et al., 1988, The Oncogenes, Springer - Verlag, New York, str. 133-155, Marth et al., 1985, Cell, 43:393, Semba et al., 1986, PNAS (USA) 83:5459, Shibuya et al., 1982, J. Virol. 42:143, Yoshida et al., 1985, Jpn. J. Cancer Res. 76:559). Nejvhodnější aktivní lidský protein Yes je kódovaný nukleovou kyselinou popsanou v Sukegawa et al., (1987, Mol. Cell Biol. 7:41-47). Inaktivované modifikace lidského proteinu Yes a nukleové kyseliny kódující Yes mohou být připraveny stejně jako v případě Src.
- 31 CZ 304320 B6
Tabulka 1
Mutace Src_funkce Src_vliv na vaskulámí permeabilitu a angiogenezi
c-Src | Ί- | aktivní | stimuluje |
SrcA (T527F) | Α | aktivní | stimuluje |
Src527 (bodová) | + | aktivní | stimuluje |
Src251 | - | neaktivní | inhibuj e |
Src (zkrácená) | - | neaktivní | inhibuj e |
Src (K295M) | - | neaktivní | inhibuj e |
Src (bodová) | - | neaktivní | inhibuj e |
Vhodným expresním konstruktem použitelným v navrhovaném vynálezu je konstrukt RCASBP (A) (sekvence č. 1). Tento expresní vektor je odvozen od skupiny replikačně kompetentních ptačích sarkomových virů s posílenou Bryanovou polymerázou (BP) pro zvýšení titru a je specifický pro obalový glykoprotein typu A exprimovaný v normálních ptačích buňkách (přehled je v Methods in Cell Biology, 52:179-214 (1997), viz také Hughes et al., 1987, J. Virol. 61:3004-3012, Fekete & Čepko, 1993, Mol. Cellular Biol. 13(4):2604-2613, Itoh et al., 1996, Development 122:291-300, Scott et al., 1998, BioTechniques 24:660-666). Kompletní sekvence RCASBP (A) (sekvence č. 1) je uvedena ve výpisu sekvencí a restrikční mapa konstruktu je zobrazena na obr. 10 a označena jako RCAS.
Původní konstrukt Src 251 byl subklonován Dr. Pam Schwartzbergem v NIH z laboratoře Dr Harolda Varmuse. Klonování sekvence cDNA kódující src zajišťující expresi byl připraven vložením spojky obsahující restrikční místa Not I-BstBl-Not I do jedinečného restrikčního místa Not I na 5' konci Src 251. Src obsahuje jedinečné Cla I místo na 3' konci. Štěpením Src 251 pomocí BstBl a Cla I vznikne BstBl-Cla I fragment, který je poté vklonován do Cla I místa na RCASBP (A). Přesahy BstBl umožňují spojení s přesahy Cla 1 a tato napojená místa pak již nejsou enzymem Cla I štěpitelná. Src konstrukt použitelný v navrhovaném vynálezu je možné připravit zvýše popsaného vektoru nejprve štěpením RCAS vektoru obsahujícího Src 251 pomocí Not I a Cla I (v DAM+ pozadí) tak, aby bylo možné vložit podobně naštěpenou cDNA pro Src. Tedy konstrukt RCASBP (A) původně obsahující Src 251 může být dále použit pro klonování dalších Src konstruktů jak je popisováno v Kaplan et al., (1994, EMBO J. 13(20):4745-4756) do RCASBP (A) pomocí fragmentů připravených pomocí Not I - Cla I z Src 251 konstruktu. Tak, aby bylo možno připravit požadované mutace c—src v c—DNA, byly použity standardní postupy cílené mutageneze, které jsou známé každému odborníkovi v současném stavu techniky. PCR primery určené pro přípravu příslušné mutace byly rovněž navrženy s restrikčními místy tak, aby bylo možno dosáhnout následných klonovacích kroků. Celé segmenty sekvence nukleové kyseliny kódující Src jsou odstraněny z nukleotidového konstruktu pomocí PCR amplifikačních technik založených na známé sekvenci cDNA kuřecího, lidského a dalších homologů Src a následné přípravě nového konstruktu.
V jedné konkrétní variantě podle navrhovaného vynálezu je 3' PCR primer použit pro oba amplifíkaci nukleové kyseliny kódující src ve správném čtecím rámci. Použití tohoto primeru přidá tag obsahující 9E10-myc epitop na karboxy konec vzniklého Src konstruktu. Následující aminokyseliny byly přidány za aminokyselinu 251 Src tak, aby byl připraven vektorový konstrukt obsahující tag s 9E10-myc epitopem:VDMEQKLIAEEDLN (sekvence č. 6). Proběhly dvě oddělené PCR reakce pro každý konstrukt a byly získány podobné výsledky. Všechny mutantní konstrukty připravené pomocí PCR byly rovněž sekvenovány pomocí PCR tak, aby byla potvrzena předpokládaná sekvence DNA klonů. Divoký typ a mutované Src cDNA pro
-32CZ 304320 B6 použití v expresních systémech podle navrhovaného vynálezu jsou také dostupné od Upstate Biotech Laboratories, Lake Placid, NY, odkud je možné koupit ptačí i lidský src a některé mrtvé kinázy a aktivované mutované formy.
Další možnosti použitelných expresních vektorů pro použití při expresi proteinů Src nebo Yes, jsou adenovirové vektory popisované v patentech US 797 368, US 5 173 414, US 5 436 146, LIS 5 589 377 a US 5 670 488. Dalšími způsoby pro transport modulačních proteinů Src a Yes zahrnují transport Src a Yes cDNA pomocí nevirových vektorových systémů jak je popsáno v patentu US 5 675 954 a transport cDNA samotné ve formě „nahé“ DNA je popsán v patentu US 5 589 466. Transport konstruktů podle navrhovaného vynálezu není rovněž omezeno na povrchovou aplikaci virových vektorů, jak je popsáno v CAM technice uvedené výše. Např. prostředek obsahující virový vektor je pomocí injekce aplikován intravenózně pro systémové podání do krevního řečiště. Tyto vektory je také možno směrovat do míst zvýšené neovaskularizace pomocí např. lokalizované injekce do nádoru.
Proteiny exprimované in vitro jsou rovněž použitelné pro jejich aplikaci následované po expresi a přečištění zvolených proteinů Src pomocí technik použitelných pro aplikaci proteinů a polypeptidů. Jednou z těchto technik je použití lipozómů, jak je popsáno v patentu US 4 356 167, US 5 580 575, US 5 542 935 a US 5 643 599. Každému odborníkovi v současném stavu techniky jsou dobře známé další vektoiy a transportní systémy proteinů, které jsou použitelné pro expresi s transport proteinů Src a Yes podle navrhovaného vynálezu.
Příklad 2. Charakteristika neošetřené kuřecí membrány kryjící chorioallantois (CAM)
A. Příprava CAM
Angiogenezi je možné vyvolat v membráně kuřecího chorioallantoisu (CAM), kdy během normální embryonální angiogeneze dochází k tvorbě zralých krevních cév. Bylo prokázáno, že angiogeneze je vyvolána reakcí na specifické cytokiny nebo nádorové fragmenty jak popisuje Leibovich et al., Nátuře, 329:360 (1987) anebo Asprunk et al., Am. J. Pathol., 79:597 (1975). CAM byly připraveny z kuřecích embryí pro následnou indukci angiogeneze a její inhibici. Desetidenní kuřecí embrya byla získána z Mclntyre Polutry (Lake Side, CA) a inkubovány při 37 °C v 60% vlhkosti. Na konci vejce přímo nad vzduchovým vakem byla vyrobena malá dírka skrz skořápku pomocí malého vrtáčku (Dremel, Division of Emerson Electric Co., Racine WI). Druhá dírka byla vyvrtána na široké straně vejce v oblasti postrádající embryonální krevní cévy, což bylo nejprve zjištěno prosvícením vejce. Na první dírku byl vyvinut negativní tlak, což vede k tomu, že membrána kryjící chorioalantois se odchlípla od membrány skořápky a vytvořila falešný vzduchový tlak nad CAM. Otvor o velikosti 1 x 1 cm byl vyříznut do membrány v místech, kde se nacházela CAM za použití modelářského řezacího kolečka (Dremel). Tento malý otvor umožnil přímý přístup do CAM. Takto upravené CAM byly buď použity v šestém dni embryogeneze, stádiu typickém aktivní neovaskularizací, bez další léčby CAM, které pak sloužily jako kontrolní model pro stanovení vlivu na embryonální vaskularizaci, nebo byly použity až desátý den embryogeneze, kdy míra angiogeneze značně poklesne. Takto připravené CAM byly tedy použity v navrhovaném vynálezu pro indukci obnovení angiogeneze v reakci na léčbu cytokiny anebo po kontaktu s nádorem, jak je popsáno níže.
Příklad 3. Stanovení CAM angiogeneze
A. Angiogeneze indukovaná růstovými faktory
Angiogeneze, jak bylo prokázáno, může být vyvolána cytokiny nebo růstovými faktory. Angiogeneze byla vyvolána umístněním 5x5 mm Whatmanova filtračního papírku (Whatmanův filtrační papír č. 1) napuštěném Hanksovým roztokem (HBSS, Gibco, Grand Island, New York)
-33CZ 304320 B6 nebo HBSS obsahujícím 2 pg/ml rekombinantního bazického fibroblastového růstového faktoru (bFGF) nebo vaskulámího endotheliálního buněčného růstového faktoru (VEGF) (Genzyme, Cambridge, MA) na CAM buď devátý, nebo desátý den vývoje kuřecího embrya v oblasti postrádající krevní cévy a otvor ve skořápce byl uzavřen lepící páskou. Jiné koncentrace růstových faktorů byly pro vyvolání růstu krevní cév také účinné. Pro techniky, ve kterých je hodnocena inhibice angiogeneze pomocí intravenózní injekce antagonistů byla angiogeneze nejprve vyvolána 1 až 2 pg/ml bFGF nebo VEGF ve fibroblastovém růstovém médiu. Míra angiogeneze byla poté stanovena pomocí mikrofotografie po 72 hodinách.
B. Embryonální angiogeneze
Příprava CAM nezbytných pro stanovení účinků inhibitorů angiogeneze na přirozenou tvorbu embryonální vaskulatury v šestidenních kuřecích embiyích byla popsána výše. V tomto stádiu vývoje rostou krevní cévy de novo a tím představují použitelný systém pro stanovení míry ovlivnění angiogeneze pomocí proteinů Src podle navrhovaného vynálezu. CAM jsou připraveny stejně, jak bylo popsáno výše s tou výjimkou, že tato technika probíhá šestý den embryonálního vývoje spíše než devátý či desátý den.
Příklad 4. Ovlivnění angiogeneze stanovené pomocí CAM techniky
Pro stanovení vlivu proteinu Src na angiogenezí byly následující techniky provedeny na desetidenních kuřecích CAM. 54 μg konstruktu RCAS připraveného podle popisu v příkladu 1 bylo pomocí transfekce zavedeno do kuřecích imortalizovaných fibroblastů linie DF-1 (dar od Douga Fostera Univ. of Min.). Tato buněčná linie stejně jako primární kuřecí embryonální fibroblasty byla schopna produkovat virus, nicméně buňky DF-1 produkovaly vyšší titr. Virové supematanty byly odebrány z narostlých DF-1 buněk produkujících virus v bezsérovém CLM médiu (složení: základ média F—10 doplněný DMSO, kyselinou listovou, kyselinou glutamovou a roztokem vitamínů MEM). 35 ml supematantu obsahujícího viry bylo zahuštěno pomocí ultracentrifugace při 4 °C po dobu dvou hodin při 22000 rpm. Takto zahuštěné virové pelety byly zahuštěny v 1/100 původního objemu v bezsérovém CLM médiu, rozdělené na alikvoty a zamražené při -80 °C. Koncentrace byla stanovena sériovým ředěním kontrolních virových vektorů obsahujících nukleotidovou sekvenci kódující zeleně fluoreskující protein (GFP), označované jako RCAS-GFP, infikovaných primárních kuřecích embryonálních fibroblastů, které byly inkubovány 48 až 72 hodin. Koncentrace těchto virových alikvotů obvykle přesahovala 108 I.U./ml. Pro CAM techniku využívající tyto virové alikvoty byly připraveny kortison acetátem nasáklé v Hartmanovy filtrační disky, 6 mm v průměru, které byly připraveny 30 minutovou lázní v 3 mg/ml kortison acetátu v 95 % ethanolu. Disky byly vysušeny v lamináru a poté na ně bylo naneseno 20 μΐ suspenze viru. Poté byly disky přitisknuty na CAM devíti nebo desetidenních kuřecích embryí, zalepeny celofánovou páskou a inkubovány 37 °C po dobu 18 až 24 hodin. Poté bylo k CAM přidáno buď samotné PBS, nebo růstové faktory v koncentraci 5 pg/ml ve 20 μΐ objemu k příslušné virové dávce jako další posilovač účinku viru v tkáni CAM. Po 72 hodinách byly CAM sebrány a změny v angiogenním indexu byly stanoveny pomocí dvou slepých odčítání počtu rozvětvení cév v CAM ležícím pod diskem. Pro kinázovou techniku byla tkáň ležící pod diskem odebrána do RIPA homogenizována pomocí motorizovaného mixéru a Src byla pomocí imunoprecipitace vybrána z příslušného množství celkového proteinu a použita v in vitro kinázové technice využívající FAK-GST tužní protein jako substrát. Pro imunofluorescenční studii byla tkáň CAM ležící pod diskem zamražena v OCT, nařezána na 4 pm řezy, fixována v acetonu po dobu 1 minuty, inkubována ve 3 % normálního kozího séra po dobu 1 hodina následně inkubována s primární králičí protilátkou anti-fosforylované ERK, jak je popsáno v Eliceiri et al., J. Cell Biol., 140:1255-1263 (1998), promyta v PBS a označena fluorescenčně značenou sekundární protilátkou.
-34CZ 304320 B6
A. Aktivace endogenního Src pomocí bFGF nebo VEGF
Pro stanovení účinku růstových faktorů na aktivitu Src při ovlivnění angiogeneze byla použita následující technika. Tkáňové extrakty z desetidenních kuřecích CAM, které byly vystaveny účinkům bFGF nebo VEGF (2 pg/ml po dobu 2 hodin) byly lyžovány. Endogenní Src bylo pomocí imunoprecipitace vybráno z příslušného množství celkového proteinu a použita v in vitro kinázové technice využívající FAK-GST fuzní protein jako substrát, rozděleno pomocí elektroforézy a převedeno na nitrocelulózu. Výsledky této techniky jsou zobrazeny na obr. č. 5, kde je patrný nárůst aktivity Src v dráze ovlivněné buď bFGF, nebo VEGF ve srovnání s kontrolními vzorky, které ukazují běžnou aktivitu Src v normální CSM tkáni. Jak bFGF, tak VEGF způsobují asi dvojnásobný nárůst aktivity endogenní Src nacházející se v CAM. Výše popisovaný kinázový blot byl také značen pomocí anti-Src protilátky pro kontrolu nanesení ekvivalentu Src a obsahuje IgG.
B. Účinek retrovirem vyvolané genové exprese SrcA na angiogenezi v kuřecích CAM
Následující techniky testovala vliv mutovaných Src proteinů na angiogenezi kuřecích CAM. V této technice byly devítidenní kuřecí CAM vystaveny účinkům RCAS-SrcA nebo RCAS-GFP expresním retrovirům nebo pufru po dobu 72 hodin a detekce probíhala tak, jak je popsáno výše. Výsledky této techniky jsou zobrazeny na obr. č. 6a, kdy angiogeneze je kvantifikována pomocí výše popsaných postupů. Reprezentativní mikrofotografie (4x) byly získány pomocí stereomikroskopu, jak ukazuje obr. č. 6b. Základní aktivita normální endogenní Src má angiogenní index přibližně 50. Naopak, CAM vystavené vlivu retrovirového vektoru zajišťujícího expresi RCAS-SrcA s bodovou mutací v aminokyselině na pozici 527, kde je tyrosin zaměněn za fenylalanin, vede ke zvýšení (indukci) angiogeneze a angiogenní index je přibližně 90. Zvýšení angiogeneze vyvolané pomocí SrcA je rovněž zřejmé z fotografií uveřejněných na obr. č. 6b.
C. Retrovirová exprese SrcA aktivuje fosforylaci vaskulámí MAP kinázy
Byl sledován vliv SrcA a srovnán s vlivem růstových faktorů VEGF a PMA na fosforylaci vaskulámí MAP kinázy pomocí následujících technik a technik popsaných výše. Tkáňové extrakty desetidenních kuřecích CAM vystavených působením VEGF nebo PMA (jiný mitogen ve srovnatelné koncentraci) po dobu 30 minut byly srovnávány s CAM infikovanými pomocí retroviru zajišťujícího expresi SRCA po 48 hodinách. Endogenní Src bylo pomocí imunoprecipitace vybráno z příslušného množství celkového proteinu a použita v in vitro kinázové technice využívající FAK-GST fúzní protein jako substrát, rozděleno pomocí elektroforézy a převedeno na nitrocelulózu.
Výsledky této techniky jsou uvedeny na obr. č. 7a, kde neovlivněné CAM (NT) vykazují obvyklou míru fosforylace vaskulámí MAP kinázy vyvolané endogenním Src. Jak VEGF, tak PMA vedou k zhruba dvojnásobnému nárůstu nad normál. Oproti tomu SrcA zvyšuje aktivitu asi na pěti až desetinásobek neovlivněného vzorku. Alikvoty výše popsaného tkáňového lyzátu byly rovněž použity pro stanovení fosforylace endogenní ERK pomocí imunoblotu s anti-fosfo-ERK protilátkou, jak je uvedeno na obr. č. 7b. Pro tento experiment byly desetidenní CAM infikovány buď prázdným RCAS, nebo RCAS zajišťujícím expresi SrcA. Po dvou dnech byla tkáň CAM zamražena v OCT, nařezána na 4pm řezy. Řezy byly inkubovány s protilátkou anti-fosforylované ERK (Nwe England Biolabs), promyta v PBS a označena pomocí kozí anti—králičí fluorescenčně značené sekundární protilátky. Fluorescenční obrázky byly získány chlazenou CCD kamerou (Princeton Inst.). Mikrofotografie ukazují zvýšenou imunofluorescenci ve vzorcích ošetřených SrcA po srovnání s kontrolními vzorky.
D. Selektivní požadavky pro aktivitu Src během angiogeneze vyvolané VEGF, ale ne bFGF
Pro stanovení vlivu modulační aktivity Src na angiogenezi vyvolanou růstovými faktory byla použita následující technika. Devítidenní kuřecí CAM byly vystaveny preparátu retrovirového
-35 CZ 304320 B6 vektoru, který zajišťoval expresi dominantně negativní mutace Src označované jako Src251 nebo Src K295M, jak bylo popsáno výše. CAM byly inkubovány s RCAS-Src251 nebo kontrolními RCAS-GFP retroviry po dobu 20 hodin a poté inkubovány dalších 72 hodin v přítomnosti nebo absenci bFGF nebo VEGF.
Míra angiogeneze kvantifikovaná tak, jak bylo popsáno výše, je uvedena na obr. č. 8a. Reprezentativní mikrofotografie (6 x uvedené na obr. č, 8b) byly získány pomocí stereomikroskopu. Obr. č. 8c ukazuje blot označený pomocí anti-Src protilátky potvrzující expresi Src251 vtransfekovaných buňkách ve srovnání s negativní kontrolou. Výsledky těchto technik popsaných výše, že jak bFGF, tak VEGF ošetřené CAM v přítomnosti RACS-GFP kontrolují indukci angiogeneze přes míru angiogeneze vyvolané Src, která byla pozorovatelná u negativních kontrol nebo neinkubovaných CAM preparátů. Exprimovaný dominantně negativní mutant Src251 byl účinný při inhibici VEGF indukované angiogeneze zpátky na základní hladinu, ale nebyl účinný pro potlačení angiogeneze vyvolané bFGF. Mikrofotografie uvedené na obr. č. 8b potvrzují údaje obr. č. 8a. Tedy, díky retrovirům exprimovaných Src251 je účinný inhibitor angiogeneze v případě, že angiogeneze je vyvolána VEGF.
Aplikace proteinu Src podle navrhovaného vynálezu i v jiných modelech angiogeneze, jak je popsáno v následujících příkladech, spadá rovněž do rámce navrhovaného vynálezu.
Příklad 5. Potlačení růstu nádorové tkáně pomocí modulátorů Src, jak bylo stanoveno pomocí modelové techniky v oku králíka in vivo
Vliv modulačních proteinů Src na angiogenezí vyvolanou růstovými faktory může být pozorován v přirozeně průhledných strukturách jako například na rohovce oka. Nové krevní cévy rostou od okraje rohovky, která je bohatě krevně zásobena, směrem k jejímu centru, které obvykle nemá dostatečné krevní zásobení. Stimulátory angiogeneze, jako je bFGF po aplikaci na rohovku vyvolají růst nových krevních cév z okraje. Antagonisté angiogeneze po aplikaci na rohovku potlačí růst nových krevních cév vyrůstajíccích z okraje rohovky. Tedy, v rohovce probíhá angiogeneze jako invaze indotheliálních buněk z okraje rohovky směrem do tuhé kolagenem naplněné tkáně rohovky, což je velmi dobře viditelné. Na modelu králičího oka je tedy v in vivo systému velmi dobře pozorovatelná stimulace nebo inhibice angiogeneze následující po implantaci látek podle navrhovaného vynálezu na rohovku v oku.
A. Model králičího oka in vivo představuje vhodný model pro sledování angiogeneze indukované růstovými faktory
Angiogeneze je indukována in vivo v oku králíka pomocí růstových faktorů bFGF nebo VEGF, jak je popsáno v následujících odstavcích.
Podle popisu v D'Amato et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 91:4082-4085, 1994, byly připraveny pelety polymeru obsahujícího růstové faktory. Každá peleta obsahovala 650 ng růstových faktorů navázaných na sukralfát (Carafed, Marion Merrel Dow Corp.) tak, aby byl růstový faktor stabilizován a bylo zjištěno jeho pomalé uvolňování do přilehlé tkáně. Kromě toho byly připraveny pelety polymerů obsahující požadovaný retrovirus zajišťující expresi Src, jak bylo popsáno výše. Pelety jsou použity ve speciálně připravených v teflonových kapslích, které obsahují 2,5mm jádro. Asi 12 μΐ materiálu je umístěno do každé kapsle a polymerizace probíhá přes noc ve sterilním prostředí. Pelety jsou poté vy sterilizovány pomocí ultrafialového záření. Účinky proteinů Src jsou potom stanoveny pomocí výše popsaných technik.
-36CZ 304320 B6
Příklad 6. Potlačení růstu nádorové tkáně in vivo pomocí proteinů Src u chimér myš:člověk
In vivo chimemí model myšičlověk je připraven nahrazením části pokožky myší kmene SCID lidskou neonatální pokožkou. Tento in vivo chimemí model myš člověk je připraven podle popisu Yan et al., J. Clin. Invest., 91:986-996 (1993). Přibližně 2 cm2 pokožky je chirurgicky odstraněno z myši kmene SCID ve věku 6 až 8 týdnů a nahrazeno lidskou neonatální pokožkou. Myš je uspána a oholena v ploše asi 5 cm2 z každé strany v laterálně abdominální oblasti. Dva kruhové štěpy o ploše asi 2 cm2 jsou připraveny odstraněním pokožky o plné tloušťce až na úroveň facie. Lidské kožní štěpy o plné tloušťce a stejné velikosti odvozené z lidské neonatální pokožky jsou umístěny a na místo jsou přišity. Štěp je překryt pomocí obvazu, který je připevněn k pokožce. Pro překrytí zranění je také použita mikropórová krycí páska. Lidská melanomová buněčná linie M21-L nebo linie karcinomu prsu MDA 23.1 (ATCC HTB 26, ανβ3 negativní pomocí imunoreaktivity v tkáňové sekci mAb LM 609), jsou testované formy solidních lidských nádorů, které byly aplikovány na lidské štěpy na SCID myších. Buněčná suspenze 5 χ 106 buněk M21-L nebo MDA 23.1 byla injikována interdermálně do lidského kožního štěpu. Myši byly poté pozorovány 2 až 4 týdny, aby byl umožněn růst měřitelných lidských nádorů. Jakmile je zřetelný a měřitelný nádor patrný, je myši do ocasní žíly injekcí aplikován prostředek obsahující retrovirus podle navrhovaného vynálezu nebo PBS. Po 2 až 3 týdnech je nádor vyjmut a zvážen a je provedena histologická analýza. Nakonec je stanoven vyli exprimovaného proteinu Src na příslušný nádor.
Příklad 7. In vitro potlačení růstu lidského nádoru pomocí proteinu Src, stanovením pomocí CAM techniky
Růst nádoru je závislý na angiogenezi (Lolkman, 1992, J. Biol. Chem. 267:10931-10934, Weidner et al., 1991, Ν. E. J. Med. 324:1-8, Brooks et al., 1994, Cell 79:1157-1164). Nejnovější publikace ukazují, že růst nádoru je možné ovlivnit pomocí antagonistů VEGF receptorů, které mají protiangiogenní účinky (Kim et al., 1993, Nátuře 362:8451-844). Ujišťovali jsme, zda potlačení angiogeneze aplikací deletované kinázy Src251 ovlivní růst lidského meduloblastomu (DAOY), vysoce angiogenního nádoru, o kterém je známé, že produkuje VEGF a velmi malé množství bFGF. Na kuřecích CAM byla třetí a šestý den prováděna technika růstu meduloblastomu DAOY stejně, jak bylo popsáno dříve (Brooks et al., 1994, viz výše). Buňky DAOY v množství 5 χ 106 inkubované v RPMI 1640 obsahujícím 10% fetálního telecího séra bylo promyto a přeneseno na CAM desetidenního embrya tak, aby vznikly DAOY nádorové fragmenty. Po sedmi dnech 50 mg nádorových fragmentů bylo vyoperováno a přeneseno na další embryo a inkubováno další tri až šest dní zároveň s povrchovou aplikací (25 μΐ) buď kontrolního RCAS-GFP retroviru RCAS-Src251, nebo bez léčby. Pomocí konfokálního zobrazení celé tkáně příslušného nádoru jsme byli schopni stanovit, zda dochází k dostatečné expresi RCAS konstruktu v okolí a uvnitř nádorových fragmentů po této povrchové aplikaci. Nádor byl odstraněn a zvážen ve dvou slepých pokusech, a to tak, že byla vyjmuta pouze jednoznačně definovatelná nádorová hmota (Brooks et al., 1194, viz. výše). Hmotnost syrového nádoru po třech nebo šesti dnech byla srovnána s původní hmotností a procentuální hmotnosti byly stanoveny pro každou jednotlivou skupinu. Tyto nádory rostoucí na CAM a vyvolávající aktivní angiogenezi (obr. č. 9) nám umožňují selektivně směrovat ptačí specifický RCAS retrovirus do ptačího nádoru pocházejícího z vaskulární tkáně.
Obr. č. 9 ukazuje výsledky prokazující, že doručení retroviru RCAS-Src251 do lidského nádoru rostoucího na kuřecím CAM je schopno zvrátit růst nádoru. Obr. č. 9a ukazuje lidský meduloblastom, který narostl na kuřecích embryích tak, jak bylo popsáno výše. Retroviry obsahující RCA-GFP nebo RCAS-Src251 byli povrchově aplikována na nádory narostlé do velikosti více než 50 mg. Reprezentativní fotografie fragmentu meduloblastomu infikovaného RCAS-GFP exprimujícího dokazuje exklusivní expresi v nádorových cévách (označeno šipkou), jak bylo zjištěno pomocí optických sekcí na BioRad konfokálním skenovacím mikroskopu (značka = 500 pm). Obr. č. 9b ukazuje výsledky nádorů ošetřených, jak bylo uvedeno výše, které rostly tři až
-37CZ 304320 B6 šest dní, načež byly vyoperovány a byla stanovena jejich surová hmotnost. Data jsou vynesena jako průměrná změna hmotnosti nádoru (odlišující se od 50 mg - výchozí hmotnosti nádoru) +/směrodatná odchylka dvou opakování. RCAS-Src251 měl podstatný vliv na růst po třech dnech (*, P<0,002) a po šesti dnech (**, P<0,005). Obr. č. 9c ukazuje reprezentativní mikrofotografie meduloblastomu chirurgicky odstraněného z embryí, které byly získány pomocí stereomikroskopu Olympus (značka = 350 pm). (spodní panel) Mikrofotografie jednotlivých nádorů s velkým zvětšením ukazuje vaskulaturu příslušných nádorů v detailu (značka = 350 pm). Šipka ukazuje porušení krevních cév v nádorech ošetřených RCAS-Src251. Výsledky ukazují, že aplikace RCAS obsahujícího Src251 do narostlých meduloblastomů vede k selektivně virové expresi v krevních cévách uvnitř nádoru (obr. č. 9a), a to podstatně vede ke zpomalení růstu těchto nádorů během šesti dnů (obr. č. 9b). Je důležité, že krevní cévy uvnitř nádoru u zvířat léčených pomocí viru obsahujícího Src251 byly poškozené a podstatně méně rozvinuté co do počtu vzhledem k nádorové vakulatuře kontrolních zvířat (obr. č. 9c). Fakt, že nádory infikované RCASGFP vykazují lokalizaci GFP pouze v nádorové vaskulatuře ukazuje, že protinádorový účinek pozorovaný u retrovirem přenášené sekvence Src251 je dán jeho účinky zabraňující angiogenezi.
Příklad 8. Nezbytnost Src pro přežití endotheliálních buněk během angiogeneze vyvolané VGEF, ale ne bFGF
Nejnovější důkazy ukazují, že receptory růstových faktorů (Choi and Ballermann, 1995, J. Biol. Chem., 270:21144-21150, Satake et al., 1998, Biochem. Biophys. Res. Comm., 244:642-646) a integriny (Meredith et al., 1993, Mol. Biol. Cell., 4:953-961., Brooks et al., 1994 a, Science, 264:569-571) posilují přežívání angiogenních endotheliálních buněk. Fakt, že jak růstové faktory, tak adhezivní receptory rovněž ovlivňují aktivitu Src, ukazuje na možnou úlohu Src v přežívání endotheliálních buněk během angiogeneze. CAM stimulované pomocí bFGF nebo VEGF byly infikovány retrovirem obsahujícím Src251 a zmrazené řezy těchto tkání byly testovány na přítomných apoptotických buněk.
Obecně kryořezy CAM ošetřené RCAS-GFP nebo RCAS-Src251 inkubované s bFGF nebo VEGF byly porovnávány na přítomnost apoptotických buněk pomocí sady Apoptotag (Oncor Gaitherzburg, MD). Tyto řezy byly rovněž značené pomocí králičí polyklonální anti-vWf (biogenix, San Ramon, CA) a označeny pomocí jednoho pg/ml DAPI. Fluorescenční obrázky byly získány pomocí chlazené CCD kamery (Roper, Trenton, NJ) a poté byly upraveny a srovnány výsledky z různých experimentálních zásahů, jak bylo popsáno dříve (Ellcelri et al., 1998, viz výše).
Pro stanovení apoptotického indexu v retrovirem infikované tkáni CAM byl annexin V konjugovaný s FITC (Clontech, Palo Alto, CA) použit pro značení buněčné suspenze a promyté buňky byly analyzovány pomocí průtokové cytometrie. Buněčné suspenze CAM buněk byly připraveny z negativních kontrol i virem infikovaných CAM po naštěpení nadrobno rozstříhané tkáně CAM 0,1 % kolagenázou typu IV (Worthington Biochemicals, Fakewood, NJ), v RPMI 1640 po dobu 1 hodiny při 37 °C, jak bylo popsáno výše (Brooks et al., 1994, b) a přefiltrovány přes 100 pM nylonový filtr (Becton Dickinson, Fountain Fakes, NJ). Fluorescence byla měřena pomocí průtokového cytometru (Becton Dickinson) při počtu 10 000) buněk.
Měření vWf značení pomocí faxu probíhalo souběžně s kolagenázou naštěpenou CAM tkání, která byla fixována 1,8 % paraformaldehydem, permeabilizována v 70 % methanolu, inkubována s anti-vWf protilátkou a detekována pomocí sekundární protilátky s připojeným FITC.
Aplikace Src251 způsobí výrazné značení technikou TUNEF v krevních cévách pozitivních pro antigeny příbuzné faktoru VIII (von Willebrandův faktor = vWf) u CAM stimulovaných VEGF, ale ne bFGF. Fakticky minimální míra apoptózy byla pozorována u dalších buněčných typů v CAM, což ukazuje, že Src kinázová aktivita zajišťující přežívání buněk v krevních cévách aktivovaných VEGF má vysokou specifitu pro endotheliální buňky. V další sérii experimentů
-38CZ 304320 B6 retrovirem infikované CAM stimulované pomocí VEGF nebo bFGF byly nejprve natráveny kolagenázou tak, aby bylo možno připravit buněčnou suspenzi. Takto získaná suspenze buněk pocházející z CAM obsahuje přibližně 20 až 50 % endotheliálních buněk v Wf pozitivních a byla analyzována na přítomnost apoptotických buněk pomocí průtokové cytometrie značením annexinem V, který značí časně apoptotické buňky. Buňky získané z CAM infikovaných Src251 a stimulovaných VEGF vykázaly podstatný nárůst značení annexinem V v porovnání s buňkami infikovanými RCAS-GFP pocházejícími z ACM stimulovaných VEGF. Naopak buňky za slepě infikovaných CAM nebo buňky infikované RCAS-Src251 a stimulované pomocí bFGF vykázaly minimální nebo žádné značení annexinem V. Žádné značení annexinem nebylo rovněž prokazatelné u buněk připravených z nestimulovaných nebo bFGF stimulovaných CAM. Tato data prokazují, že kinázová aktivita Src je selektivně nezbytná pro přežívání endotheliálních buněk v CAM během angiogeneze vyvolané VEGF, ale ne bFGF.
Příklad 9. Selektivní požadavky na aktivitu Src kinázy v podkožním myším modelu angiogeneze
Pro další analýzu úlohy Src v angiogenezí byl použit myší model. V tomto případě byla angiogeneze indukována podkožní injekcí Matrigelu zbaveného růstových faktorů a doplněného buď bFGF (100 ng/ml), nebo VEGF (400 ng/ml) u athymických myší wehl (nu/nu) a analyzována po pěti dnech (Passaniti et al., 1992). Angiogeneze byla kvantifikována odstraněním a homogenizací tkáně, izolací proteinů a imunoblotem s protilátkami proti VEGF receptorů (flk—1) (obr. č. 13a), které jsou specifické pro endotheliální buňky. Stejně, jako bylo zjištěno u kuřat, exprese cDNA kódující deletovanou kinázu Src251 blokuje u tohoto myšího modelu angiogenezí vyvolanou VEGF, ale nemá žádný vliv na angiogenezí vyvolanou bFGF (obr. č. 13b). Pro stanovení úlohy endogenního Src v tomto modelu byly tkáně infikovány retrovirem zajišťujícím expresi Cak, který inhibuje aktivitu endogenního Src pomocí fosforylace c-koncového regulačního místa (Nada et al., 1991, Nátuře, 361:68-72). Exprese Cak blokuje angiogenezí vyvolanou VEGF, ale ne bFGF (obr. č. 13), což potvrzuje úlohu aktivity endogenního Src při angiogenezí vyvolané VEGF.
Neovaskularizace těchto tkání stimulovaných VEGF a infikovaných virem byla potvrzena přímou imunofluorescenční pomocí FITC značené anti-DC34 (obr. č. 13) nebo pomocí anti-flk-1-protilátky a kvantifikována podle počtu pozitivně značených CD34 krevních buněk v jednotlivých zmražených řezech (obr. č. 13c).
Obecně, angiogeneze byla indukována pomocí podkožní injekce Matrigelu zbaveného růstových faktorů obsahujícího solný roztok nebo VEGF (400 ng/ml) zároveň 2 χ 106 podpůrných buněk exprimujících GFP retrovirus do boku athymických wahl (nu/nu) myší a analyzována po pěti dnech inkubace. Angiogeneze byla kvantifikována pomocí imunoblotu s protilátkou proti receptoru VEGF (flk—1), která je specifická pro endotheliální buňky. Na obr. č. 15a jsou uvedeny výsledky imunoblotu. Vliv deletované kinázy Src251, Csk, nebo GFP retrovirů na angiogenezí vyvolanou VEGF (400 ng/ml) nebo bFGF (400 ng/ml) byl analyzován pomocí imunoblotu tkáňového lyzátu pomocí anti-fik-1 protilátky. Příklady těchto výsledků jsou zobrazeny na obr. č. 15b. Vliv retrovirů zajišťujících expresi Src251 anebo Csk na neovaskularizaci vyvolanou VEGF byl kvantifikován pomocí počtu CD34 pozitivních buněk v tkáňových řezech, které byly značeny pomocí nepřímé imunofluorescence a počítány ve třech opakováních v náhodném poli při zvětšení dvacetkrát. Řezy byly rovněž použity pro imunofluorescenční značení anti-CD34 protilátkou nebo anti-flk-1 protilátkou, vyfotografovány a kvantifikovány stejně, jak bylo popsáno výše v případě CAM technik.
Kompletní detekce přímé fluorescence nádorového fragmentu infikovaného RCAS-GFP byla získána vyjmutím nádorového fragmentu a zobrazením nefixované tkáně přímo pomocí laserové konfokální mikroskopie (MRC 1024, BioRad, Hercules, CA).
-39CZ 304320 B6
Příklad 10. Vliv intradermální exprese VEGF v uších Src-/- nebo Src+/- myší
V návaznosti na výsledky získané z kuřecího a myšího modelu angiogeneze, přímé genetické postupy byly použity pro sledování intradermální angiogeneze indukované VEGF u Src-/- myší. Rovněž testován byl vliv na vaskulámí permeabilitu, neboť o VEGF je známo, že nejen aktivuje růst cév, ale zároveň zvyšuje vaskulámí permeabilitu (Senger et al., 1983, Science, 218:983-985, Ferreraand Davis-Smith, 1997, Endocr. Ref., 16:4-25).
Intradermální injekce adenovirů zajišťujících expresi lidského VEGF byly aplikovány od uší Src-/- a Src+/- myší, zatímco kontrolní adenovirus zajišťující expresi β-galaktosidázy byl pomocí injekce aplikován do druhého ucha každé myši. Růst nových cév vyvolaný VEGF v uších Src+/- myší byl poprvé detekovatelný po 48 hodinách a neovaskularizace byla analyzována po pěti dnech.
Obecně, byly připraveny deficitní myši (129/8V/Ev x C57B16/J) v pp60c Src. pp60c Ycs, pp60c lyn podle dříve popsaných technik (Soriano et al., 1991, Cell, 64:693-702). Další dávky byly získány z Jackson Labs. Myší uši byly injikovány intradermálně (Eriksson et al., 1980, Microvass. Res., 19:374-378) s 5 μΙ adenoviru zajišťujícího expresi buď VEGF, nebo β-galaktosidázy a uši byly vyfotografovány po pěti dnech pomocí stereomikroskopu. Bylo zjištěno, v X-gal značených uších předem injikovaných adenovirem zajišťujícím expresi β-galaktosidázy, že míra exprese u Src+/- a Src-/- je stejná. V případě uší Src-/- injikovaných VEGF nebyl prokázán žádný měřitelný nárůst angiogeneze pomocí stanovování rozvětvení (p<0,05). Překvapivě nej zřetelnější fenotypový znak těchto zvířat byla naprostá blokáda vaskulámí propustnosti ve srovnání s ušima myší Src+/- po injekci VEGF. Sledování uší injikovaných VEGF potvrdilo nárůst vaskulámí propustnosti Src+/- myší, zatímco v Src-/- myších zcela schází. Vaskulámí propustnost u těchto zvířat naznačuje, že aktivita vaskulámí permeability, kterou je možné in vivo spojovat s angiogenezí (Dvorak et al., 1995, Am. J. Pathol., 148:1029-1039), může být selektivně narušen u pp60c Src deficitních myší.
Přikladli. VEGF není schopné porušit krevně mozkovou bariéru u myších postrádajících pp60cSrc
Mozková vaskulatura je charakteristická vysoce restriktivní krevně mozkovou bariérou, která brání malým molekulám pronikat z cév do přilehlé mozkové tkáně. Nádory rostoucího mozku mohou porušit tuto bariéru zejména díky produkci angiogenního růstového faktoru, kterým může být VEGF. Proto jsme sledovali povahu krevně mozkové bariéry u Src+/- nebo Src-/- myší. V tomto případě byl VEGF nebo fyziologický roztok stereotakticky aplikován do pravé nebo levé hemisféry mozku. Všechny myši obdržely systémové injekce Evansovy modři pro sledování aktivity vaskulámí permeability.
Obecně, fyziologický roztok nebo VEGF (200 ng ve 2 μΐ) byly aplikovány stereotakticky do levého nebo pravého frontálního laloku 92 mm nalevo nebo napravo od střední osy, 0,5 mm rostrálně od průsečíku švu šípového a věnčitého a 3 mm do hloubky od tvrdé pleny mozkové. Zvířata dostala 30 minut po injekci intravenózně dávku roztoku Evansovy modři, jak bylo popsáno výše. Po dalších 30 minutách byly myši promyty a mozky byly vyjmuty. Fluorescence Evansovy modři byla pozorována pomocí laserového konfokálního mikroskopu na čerstvých nefixováných zamražených řezech z mozků.
Vaskulámí propustnost byla lokalizována v hemisféře, do které bylo injikováno VEGF u Src+/myší, ale v případě Src-/- myší nebyla prokázána žádná vaskulámí propustnost. Byl to rovněž případ, kdy sledování vaskulámí permeability bylo stanovováno pomocí nahromadění Evansovy modři a detekováno epifluorescenční analýzou zamražených řezů těchto mozků. VEGF tedy narušuje krevně mozkovou bariéru způsobem, kterýje závislý na aktivních funkcí pp60c Src.
-40CZ 304320 B6
Příklad 12. Vaskulámí permeabilita vyvolaná VEGF, ale už ne vaskulámí permeabilita spojená se zánětem, je závislá na pp60c Src
Pro další analýzu a kvantifikaci účinku VEGF jako faktoru ovlivňujícího vaskulámí permeabilitu u Src+/- nebo Src-/- myší byla použita Milesova technika (Miles and Miles, 1952) pro kvantitativní stanovení vaskulámí permeability v pokožce těchto zvířat. VEGF bylo aplikováno intradermálně u Src+/- nebo Src-/- myší, kterým byla podána intravenózní systémová injekce Evansovy modři. Během 15 minut po injekci VEGF došlo k trojnásobnému nárůstu vaskulámí permeability u Src+/- myší. Přesto u Src-/- myší nebyl pozorovatelný žádný nárůst vaskulámí permeability. Míra zabarvení injikovaných kožních oblastí byla kvantifikována a srovnána s kontrolními vzorky a bFGF. Kontroly injikované bFGF nebo fyziologickým roztokem na rozdíl od VEGF neprokázaly žádný nárůst ve vaskulámí permeabilitě. Milesova technika (Miles et al., 1962) byla přizpůsobena pro myši injikované 10 μΐ VEGF (400 ng/ml), alylizothiokyanátem (hořčičný olej, 20 % hmotnosti v minerálním oleji) nebo fyziologickým roztokem intradermálně u myší, kterým předem bylo aplikováno intravenózně 100 μΐ 0,5 % Evansovy modři. Po 15 minutách byly vyjmuty kožní vzorky, fotografovány, promyty ve formalínu při 5 8 °C a vzniklý roztok byl kvantifikován pomocí spektrofotometru.
Vaskulámí propustnost/permeabilitu se zvyšuje i během zánětu, což umožňuje akumulaci adhezivních proteinů a prozánětlivých buněk v tkáni. Je pravdou, že prozánětlivé signály samy o sobě zvyšují vaskulámí propustnost. Jedna z látek vyvolávajících záněty, alylizothiokyanát, známý také jako hořčičný olej (Inoue et al., 1997, viz. výše), byla testována u Src+/- nebo Src-/myší vzhledem ke své schopnosti zvyšovat vaskulámí permeabilitu. Na rozdíl od pozorování u Src-/- myší stimulovaných VEGF, nebyl pozorován nárůst vaskulámí permeability po injekci látky vyvolávající zánět alylizothiokyanátu. Z toho vyplývá, že Src hraje klíčovou roli při zvyšování vaskulámí permeability pomocí VEGF, ale není schopné ovlivnit vaskulámí permeabilitu spojenou se zánětlivými procesy.
Příklad 13. Vaskulámí permeabilita vyvolaná VEGF závisí na Src a Yes, ale ne na Fyn
Specifita požadavků Src pro aktivaci vaskulámí permeability byla testována pomocí vaskulámí permeability vyvolané VEGF spojené se SFK, jako jsou Fyn nebo Yes, které, podobně jako Src, jsou exprimovány endotheliálními buňkami (Bull et al., 1994, FEBS Letters, 361:41 -44, Kiefer et al., 1994, Curr. Biol. 4:100-109). Bylo potvrzeno, že tyto tři SFK jsou exprimovány rovnoměrně v aortách myší divokého typu podobně jako Src-/- myši zvířata deficitní na Yes mají defekt při zvyšování vaskulámí permeability pomocí VEGF. Překvapivě myši postrádající Fyn jsou schopny prudce měnit vaskulámí permeabilitu v reakci na VEGF, a to takovou měrou, která se neliší od kontrolních zvířat. Zablokování indukce vaskulámí permeability pomocí VEGF u Src-/- nebo Yes-/-myší prokazuje, že kinázová aktivita specifických SFK je nezbytná pro signalizaci prostřednictvím VEGF a umožňuje ovlivnění vaskulámí permeability, ale ne angiogeneze. Ovlivnění vaskulámí permeability pomocí VEGF v pokožce Src+/- (obr. č. 14a, levý obrázek) nebo Src-/- (obr. č. 14a, pravý obrázek) myší bylo stanovováno intradermální aplikací PBS nebo VEGF (400 ng) do myší, kterým byla intravenózně podána Evansova modř. Po 15 minutách byly kožní vzorky fotografovány (měřítko - 1 mm). Hvězdička označuje místo injekce. Oblast přilehlá k místu aplikace VEGF, bFGF nebo PBS vyjmuta a vaskulámí permeability byla kvantifikována vymytím Evansovy modře ve formamidu (58 °C, 24 hodin) a absorbance byla stanovována při 500 nm (obr. č. 14b, levý graf). Schopnost látky vyvolávající zánět (alylizothiokyanát), o které je známé, že vyvolává zánět a zvyšuje vaskulámí permeabilitu, byla testována u Src+/- nebo Src-/myší (obr. 14b vpravo).
Schopnost VEGF zvyšovat vaskulámí permeabilitu byla porovnávána u Src-/-, Fyn -/- nebo Yes-/- myší pomocí Milesovy techniky (obr. č. 14c). Údaje z jednotlivých měření Milesovou technikou jsou vyneseny jako průměr ± směrodatná odchylka z tří nezávislých opakování.
-41 CZ 304320 B6
Zvířata Src-/- a Yes-/- defektní při vyvolání vaskulární permeability byla srovnávána s kontrolními zvířaty na statistickou odchylku (*p<0,05, dvojvýběrový t-test), přičemž poruchy vaskulární permeability po injekci VEGF ani u Fyn-/-, ani u alylizothiokyanátem ošetření Src+/myší nebyly statisticky významné (**p<0,05).
Příklad 14. Myši po aplikaci inhibitorů tyrosin kináz rodiny Src a Src-/- myši vykazují snížené poškození tkáně během traumatu nebo poranění krevních cév než neošetřené myši divokého typu
Specifická aplikace inhibitorů tyrosin kináz rodiny Src slouží k potlačení patologické propustnosti cév a permeability během poranění cév při poruchách, jakými je například mrtvice. Vaskulární endothelium je dynamický buněčný typ, který reaguje na řadu podnětů různými způsoby, jako je například oddělení nové krevní cévy během angiogeneze v nádoru nebo regulace permeability cévní stěny během mrtvicí vyvolaného otoku a poškození tkáně.
Snížení vaskulární permeability u dvou modelů myší mrtvice pomocí inhibice aktivační dráhy Src pomocí léčiv je dostatečné pro zabránění poškození mozku snížením propustností cév vyvolaným ischemií. Navíc, u myší geneticky deficitních v Src, které mají sníženou vaskulární propustnost, je rovněž snížen objem infarktu. Kombinací údajů získaných se syntetickými Src inhibitory s dalšími genetickými důkazy o snížené vaskulární propustnosti během mrtvice a dalších podobných modelů dokazují fyziologickou relevanci těchto postupů při snižování poškození mozku během mrtvice. Inhibici těchto signalizačních drah pomocí celé řady dostupných inhibitorů tyrosin kináz rodiny Src, které zablokují tuto signalizační kaskádu, má podstatný léčebný přínos při ochraně mozku při poškození způsobeným zvýšenou propustností cév.
Pro indukci fokální mozkové ischemie byly použity dvě různé techniky. Oba zvířecí modely fokální cerebrální ischemie jsou dobře definované a široce používané při výzkumu mrtvice. Oba modely byly již dříve používány pro výzkum patofyziologie mozkové ischemie stejně jako pro testování nových léčiv proti mrtvici.
A) Myši byly uspány pomocí avertinu a tělesná teplota byla udržována udržováním zvířat na vyhřívané podložce. Byl proveden řez mezi pravým uchem a pravým okem. Z lebky byl oddělen spánkový sval a malá dírka byla vyvrtána v oblasti nad střední mozkovou tepnou (MCA). Mozkové pleny byly odstraněny a pravá MCA byla ucpána pomocí koagulace krve zahřívacím vláknem. Zvířata byla probuzena a navrácena do klecí. Po 24 hodinách byly mozky promyty, vyjmuty a nařezány na 1 mm řezy. Řezy byly zality do 2 % 2,3,5-trifenyltetrazolchloridu (TTC) a část mozku postižená infarktem byla identifikována jako neoznačená (bílá) tkáň obklopená živou (červenou) tkání. Objem infarktu byl definován jako suma neoznačených oblastí v řezech násobenou jejich tloušťkou.
Myši deficitní v Src (Src-/-) byly použity pro studii úlohy Src při mozkové ischemii. Src+/myši sloužily jako kontroly. Zjistili jsme, že Src-/- myši mají snížený objem infarktu z 26 ± 10 mm3 na 16 ± 4 mm3 u kontrol 24 hodin po zásahu. Tento účinek byl ještě posílen, když C57B16 myši divokého typu dostaly 1,5 mg/kg PPI ve formě intraperitoneální injekce 30 minut po uzavření cévy. Velikost infarktu byla potom snížena z 31 ± 12 mm3 v případě neošetřených myší na 8 ± 2 mm3 v případě myší, kterým bylo podáno PPI.
Β) V druhém modelu fokální cerebrální ischemie byla MCA ucpána umístěním ucpávky do MCA. Jeden díl na fibrin bohatého 24 hodin starého homologního strupu byl umístěn k počátku MCA pomocí upraveného PE-50 katétru. Vyvolání cerebrální ischemie bylo prokázáno snížením průtoku krve mozkem v ipsilaterální hemisféře ve srovnání s kontrolaterální hemisférou. Po 24 hodinách byly mozky vyjmuty, byly z nich připraveny řezy, které byly obarveny hematoxilineosinem (HE). Objem infarktů byl stanoven součtem infarktových ploch v sériových řezech násobeno vzdáleností mezi jednotlivými řezy.
-42CZ 304320 B6
Dávky PP používané v této studii (1,5 mg/kg i.p.) byly vybrány empiricky. Je známo, že VEGF je prvně exprimováno asi 3 hodiny po cerebrální ischemii v mozku s maximálním účinkem během 12 až 24 hodin. Této studii bylo PPI podáno 30 minut pro rozběhnutí infarktu tak, aby byl zcela zablokován nárůst vaskulámí permeability vyvolaný VEGF. Podle časového průběhu obvyklé exprese VEGF potenciální terapeutické okno vhodné pro aplikaci inhibitorů Src by mělo být do 12 hodin po mrtvici. U chorob spojených se stabilním nárůstem vaskulámí permeability je vhodnější nepřetržité podávání látek potlačující účinky Src.
Obr. č. 15a je graf zobrazujících srovnání výsledků průměrných objemu infarktů (mm3) v myších mozcích po zranění, kdy myši byly heterozygoti (Src+/-), dominantně negativní Src mutanty (Src-/-), divoké typy myší (WT), nebo divoké typy myší, kterým bylo podáno 1,5 mg/kg (PPI).
Obr. č. 16 ukazuje vzorky sekvenčních MRI skenů izolovaných promytých myších mozků po vyvolání poškození CNS, přičemž progrese skenů u myší ošetřených PPI (vpravo) jednoznačně prokazuje menší infarkt než progrese skenů v případě kontrolních neošetřených myší.
Způsoby podle navrhovaného vynálezu jsou přizpůsobeny konkrétně pro specifické ovlivnění poškození tkáně vyvolané vaskulámí permeabilitu, neboť cílem je inhibice tyrosin kináz rodiny Src vedoucí ke snížení vaskulámí permeability bez dlouhodobého účinku na další reakce vyvolané VEGF, které mohou být důležité pro hojení zranění. Na rozdíl od neutralizačních VEGF proteinů, inhibice Src neinterferuje s kumulativním angiogenním efektem VEGF, který může být přínosný v pozdějších stádiích choroby.
Použití syntetických inhibitorů s nízkou molekulovou hmotností je obecně bezpečnější a snadněji proveditelné než použití velkých proteinů. Použití rekombinantních proteinů, jako je fúzní protein VEGF receptor - myší imunoglobulin, může být potenciálně nebezpečné a není použitelné pro opakovanou reakci díky vyvolání alergické odpovědi u lidí (vznik lidských antimyších protilátek, HAMA).
Nakonec VEGF není jediným aktivátorem signalizační kaskády vedoucí k Src, i jiné cytokiny jsou zapojené do patofyziologie mozkové ischemie, která může ovlivnit vaskulámí permeabilitu, jako je IF-6 a TNF-α. Tedy inhibice VEGF nemusí nutně potlačit poškození tkáně, které je způsobené aktivací Src. Fakticky snížení velikosti infarktu pomocí PPI je vhodnější než použití antagonistů VEGF, což ukazuje, že jiné signalizační dráhy mohou aktivovat Src kinázy a tím zajistit nárůst vaskulámí permeability.
Výše popsaná specifikace je zamýšlena tak, že umožní odborníkovi v současném stavu techniky pochopit vynález. Navrhovaný vynález nemůže být limitován použitím některých buněčných linií, neboť uvedené varianty jsou pouze jako jednoduché ilustrace aspektů podle navrhovaného vynálezu a jakákoliv buněčná linie, která je použitelná v rámci navrhovaného vynálezu spadá do rámce. Přiložený materiál by měl být natolik jasný, aby umožnil jakéhokoliv aspektu navrhovaného vynálezu včetně nejvhodnějších variant navrhovaného vynálezu a nemůže být brán jako limitace rámce nároků vzhledem ke konkrétním příkladům, které popisuje. Navíc, různé modifikace navrhovaného vynálezu, kromě těch, které jsou ukázány a popsány, budou každému odborníkovi v současném stavu techniky zřejmé po přečtení předcházejícího popisu a rovněž bude zřejmé, že spadají do rámce připojených nároků.
Claims (10)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje bílkoviny tyrozin kinázy Src a Yes, společně s farmaceuticky přijatelným nosičem.-43 CZ 304320 B6
- 2. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že bílkovina Src je Src-A nebo má na aminokyselinovém zbytku v pozici 527 jakýkoliv aminokyselinový zbytek, kromě tyrozinu, šeřinu nebo threoninu, nebo bílkovina Src je neaktivní.
- 3. Farmaceutický prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že neaktivní bílkovina Src je Src K295M neboje Src 251.
- 4. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že bílkovina Yes je neaktivní bílkovina Yes.
- 5. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje neaktivní bílkovinu tyrosin kinázy Yes nebo směs neaktivních bílkovin tyrosin kinázy Src a Yes pro použití ve způsobu ovlivnění vaskulámí permeability ve tkáni postižené projevy nemocí a obsahující kontakt tkáně s terapeuticky účinným množstvím farmaceutického prostředku ovlivňujícím vaskulámí permeabilitu, kde projev nemoci je vybrán ze skupiny sestávající ze škod způsobených mrtvicí, růstu tumorů, infarktu myokardu, arteriosklerózy, edému mozku, cerebrovaskulámích onemocnění nebo traumat, revmatické artritidy, diabetické retinopatie, artritidy, zánětlivých onemocnění, chronického kloubního revmatizmu a psoriázy, restenózy, krvácení mozku, traumatu mozku a páteře, hypoxií vyvolaného poranění mozku a páteře, zánětlivých onemocnění centrálního nervového systému, virových nebo bakteriálních infekcí centrálního nervového systému, autoimunitních onemocnění, onemocnění s chronickým zvýšením propustnosti hematoencefalické bariéry a syndromu respirační tísně dospělých (ARDS) a tvorby metastáz.
- 6. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje aktivní bílkovinu tyrosin kinázy Yes nebo směs aktivních bílkovin tyrosin kinázy Src a Yes pro použití ve způsobu ovlivnění vaskulámí permeability ve tkáni postižené projevy nemoci a obsahující kontakt tkáně s farmaceutickým prostředkem v množství terapeuticky účinným pro ovlivňování vaskulámí permeability, kde projev nemoci je vybrán ze skupiny sestávající z ischemických končetin a chronického poranění.
- 7. Výrobek složený z obalového materiálu a farmaceutického prostředku obsaženého uvnitř tohoto obalového materiálu, vyznačující se tím, že farmaceutický prostředek je schopný ovlivnit vaskulámí permeabilitu v tkáni postižené projevem nemoci a obalový materiál obsahuje etiketu, na které je uvedeno, že obsažený farmaceutický prostředek může být použit pro léčbu projevu nemoci ovlivněním vaskulámí permeability, a kde farmaceutický prostředek obsahuje bílkoviny tyrosin kinázy Src a Yes, ve farmaceuticky přijatelném nosiči.
- 8. Výrobek složený z obalového materiálu a farmaceutického prostředku obsaženého uvnitř tohoto obalového materiálu, vyznačující se tím, že farmaceutický prostředek je schopný ovlivnit vaskulámí permeabilitu v tkáni postižené projevem nemoci a obalový materiál obsahuje etiketu, na které je uvedeno, že obsažený farmaceutický prostředek může být použit pro léčbu projevu nemoci ovlivněním vaskulámí permeability, a kde farmaceutický prostředek obsahuje bílkovinu tyrosin kinázy Yes, ve farmaceuticky přijatelném nosiči.
- 9. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje inhibitor rodiny tyrozin kináz pro použití ve způsobu zlepšení postižené tkáně související svaskulámím prosakováním nebo edémem, obsahující kontakt tkáně s farmaceutickým prostředkem v množství terapeuticky účinným pro ovlivňování vaskulámí permeability, kde inhibitor rodiny tyrozin kinázy Src je vybrán ze skupiny sestávající z neaktivní bílkoviny Yes, směsi neaktivní bílkoviny Src a neaktivní bílkoviny Yes, a směsi neaktivní bílkoviny Yes a/nebo neaktivní bílkoviny Src společně s chemickým inhibitorem vybraným z PPI, PP2, PD173955, AGF1872, PD162531, Radicicolu R2146 a Geldanamycinu.-44CZ 304320 B6
- 10. Výrobek složený z obalového materiálu a farmaceutického prostředku obsaženého uvnitř tohoto obalového materiálu, vyznačující se tím, že farmaceutický prostředek je schopný ovlivnit zvýšení vaskulámí permeability vtkáni postižené projevem nemoci, a kde obalový materiál obsahuje etiketu, na které je uvedeno, že obsažený farmaceutický prostředek5 může být použit pro léčbu vaskulárního prosakování nebo edému spojeného s projevy onemocnění, a kde farmaceutický prostředek obsahuje inhibitor rodiny tyrozin kinázy Src a farmaceuticky přijatelný nosič, kde inhibitor rodiny tyrozin kinázy Src je vybrán ze skupiny sestávající z neaktivní bílkoviny Yes, směsi inaktivní bílkoviny Src a inaktivní bílkoviny Yes, směsi inaktivní bílkoviny Yes a/nebo inaktivní bílkoviny Src společně s chemickým inhibitorem ío vybraným z PPI, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicolu R2146 a Galdanamycinu.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US09/470,881 US6685938B1 (en) | 1998-05-29 | 1999-12-22 | Methods and compositions useful for modulation of angiogenesis and vascular permeability using SRC or Yes tyrosine kinases |
US53824800A | 2000-03-29 | 2000-03-29 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ304320B6 true CZ304320B6 (cs) | 2014-03-05 |
Family
ID=27043259
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ2002-2156A CZ304320B6 (cs) | 1999-12-22 | 2000-12-22 | Farmaceutický prostředek obsahující bílkoviny tyrozin kinázy Src a Yes, společně s farmaceuticky přijatelným nosičem a předmět výroby |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP1250155B1 (cs) |
JP (1) | JP2003518077A (cs) |
KR (1) | KR100813818B1 (cs) |
CN (1) | CN1434727A (cs) |
AT (2) | ATE392215T1 (cs) |
AU (1) | AU781444B2 (cs) |
BR (1) | BR0016547A (cs) |
CA (1) | CA2395136A1 (cs) |
CZ (1) | CZ304320B6 (cs) |
DE (1) | DE60038631T2 (cs) |
DK (2) | DK1905457T3 (cs) |
ES (2) | ES2383763T3 (cs) |
HU (1) | HU229628B1 (cs) |
NO (1) | NO20023036L (cs) |
PL (1) | PL356815A1 (cs) |
PT (2) | PT1905457E (cs) |
RU (1) | RU2271216C2 (cs) |
SK (1) | SK287575B6 (cs) |
WO (1) | WO2001045751A1 (cs) |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030130209A1 (en) * | 1999-12-22 | 2003-07-10 | Cheresh David A. | Method of treatment of myocardial infarction |
WO2002016369A2 (en) | 2000-08-25 | 2002-02-28 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Novel macrocycles and uses thereof |
AU2003220390A1 (en) * | 2002-03-18 | 2003-10-08 | Medtronic Ave Inc. | Medical devices for delivering anti-proliferative compositions to anatomical sites at risk for restenosis |
WO2004006947A1 (en) * | 2002-07-12 | 2004-01-22 | Yihai Cao | A method for inhibiting vascular permeability and tissue edema |
EP1413887A1 (en) * | 2002-10-22 | 2004-04-28 | Aventis Pharma S.A. | Inhibitors of Src kinase for use in Alzheimer's disease |
WO2004056386A2 (en) * | 2002-12-19 | 2004-07-08 | To-Bbb Holding B.V. | Nucleic acids involved in blood-brain barrier control |
GB0307333D0 (en) * | 2003-03-29 | 2003-05-07 | Astrazeneca Ab | Therapeutic agent |
EP2260849A1 (en) * | 2004-01-21 | 2010-12-15 | Emory University | Compositions and methods of use for tyrosine kinase inhibitors to treat pathogenic infection |
US20060094682A1 (en) | 2004-10-29 | 2006-05-04 | Odyssey Thera, Inc. | Kinase inhibitors for the treatment of diabetes and obesity |
WO2007076454A1 (en) * | 2005-12-23 | 2007-07-05 | Alcon, Inc. | Pharmaceutical formulation for delivery of receptor tyrosine kinase inhibiting (rtki) compounds to the eye |
BRPI0711901A2 (pt) * | 2006-05-22 | 2012-03-06 | The Regents Of The University Of California | Composições e métodos para a liberação de oxigênio |
EP1862802B1 (en) * | 2006-06-01 | 2008-12-10 | Cellzome Ag | Methods for the identification of ZAP-70 interacting molecules and for the purification of ZAP-70 |
DE102007037008B4 (de) * | 2007-08-06 | 2015-09-10 | Siemens Aktiengesellschaft | Diagnosesubstanz zur Anwendung in einem Verfahren zur Bestimmung der Aggressivität eines Prostatatumors |
JP5701308B2 (ja) * | 2009-10-29 | 2015-04-15 | インダストリー−アカデミック コーポレーション ファウンデーション,ヨンセイ ユニバーシティ | 新規血管漏出遮断剤 |
US8557513B2 (en) * | 2011-06-27 | 2013-10-15 | Biocrine Ab | Methods for treating and/or limiting development of diabetes |
US10293023B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-05-21 | Children's Medical Center Corporation | Method of altering vascular permeability and uses thereof |
CN105288654B (zh) * | 2015-01-23 | 2018-11-30 | 中国人民解放军第二军医大学 | 蛋白酪氨酸激酶fyn癌基因在防治肠道病毒71型感染中的应用 |
CN105311645B (zh) * | 2015-01-23 | 2018-11-30 | 中国人民解放军第二军医大学 | 胚胎fyn相关底物efs在防治肠道病毒71型感染中的应用 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1991011719A1 (en) * | 1990-01-26 | 1991-08-08 | Washington Research Foundation | Immune reactivity to expressed activated oncogenes for diagnosis and treatment of malignancy |
WO1998050356A1 (en) * | 1997-05-07 | 1998-11-12 | Sugen, Inc. | 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity |
WO1998053051A1 (en) * | 1997-05-21 | 1998-11-26 | The Children's Medical Center Corporation | Short peptides which selectively modulate intracellular signalling |
WO1999017770A1 (en) * | 1997-10-06 | 1999-04-15 | Basf Aktiengesellschaft | Indeno[1,2-c]pyrazole derivatives for inhibiting tyrosine kinase activity |
US5922697A (en) * | 1996-10-02 | 1999-07-13 | Warner-Lambert Company | Compounds, compositions and methods for inhibiting the binding of proteins containing an SH2 domain to cognate phosphorylated proteins |
WO1999061590A1 (en) * | 1998-05-29 | 1999-12-02 | The Scripps Research Institute | Methods and compositions useful for modulation of angiogenesis using tyrosine kinase src |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4356167A (en) | 1978-01-27 | 1982-10-26 | Sandoz, Inc. | Liposome drug delivery systems |
US5092885A (en) | 1987-02-12 | 1992-03-03 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Peptides with laminin activity |
US5112946A (en) | 1989-07-06 | 1992-05-12 | Repligen Corporation | Modified pf4 compositions and methods of use |
US5542935A (en) | 1989-12-22 | 1996-08-06 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Therapeutic delivery systems related applications |
US5580575A (en) | 1989-12-22 | 1996-12-03 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Therapeutic drug delivery systems |
US5192744A (en) | 1990-01-12 | 1993-03-09 | Northwestern University | Method of inhibiting angiogenesis of tumors |
DE69114782T2 (de) | 1990-08-08 | 1996-04-18 | Takeda Chemical Industries Ltd | Intravaskulär embolisierendes Mittel mit Gehalt an einem die Angiogenesis hemmenden Stoff. |
US5753230A (en) | 1994-03-18 | 1998-05-19 | The Scripps Research Institute | Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis |
US5643599A (en) | 1995-06-07 | 1997-07-01 | President And Fellows Of Harvard College | Intracellular delivery of macromolecules |
US6093740A (en) * | 1997-04-30 | 2000-07-25 | Eli Lilly And Company | Therapeutic treatment for skin disorders |
US6420338B1 (en) * | 1997-06-13 | 2002-07-16 | New York University Medical Center | Inhibition of the Src kinase family pathway as a method of treating HBV infection and hepatocellular carcinoma |
JP2002529421A (ja) * | 1998-11-06 | 2002-09-10 | ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト | 血管過浸透性の阻害方法 |
-
2000
- 2000-12-22 JP JP2001546690A patent/JP2003518077A/ja active Pending
- 2000-12-22 SK SK849-2002A patent/SK287575B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-12-22 DE DE60038631T patent/DE60038631T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-22 PT PT07020078T patent/PT1905457E/pt unknown
- 2000-12-22 KR KR1020027008102A patent/KR100813818B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-12-22 PT PT00990365T patent/PT1250155E/pt unknown
- 2000-12-22 AT AT00990365T patent/ATE392215T1/de active
- 2000-12-22 ES ES07020078T patent/ES2383763T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-22 CN CN00819151A patent/CN1434727A/zh active Pending
- 2000-12-22 PL PL00356815A patent/PL356815A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2000-12-22 EP EP00990365A patent/EP1250155B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-22 WO PCT/US2000/035396 patent/WO2001045751A1/en active Application Filing
- 2000-12-22 RU RU2002119399/15A patent/RU2271216C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-12-22 DK DK07020078.7T patent/DK1905457T3/da active
- 2000-12-22 AT AT07020078T patent/ATE553782T1/de active
- 2000-12-22 DK DK00990365T patent/DK1250155T3/da active
- 2000-12-22 CA CA002395136A patent/CA2395136A1/en not_active Abandoned
- 2000-12-22 HU HU0203957A patent/HU229628B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2000-12-22 BR BR0016547-6A patent/BR0016547A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-12-22 ES ES00990365T patent/ES2303514T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-22 EP EP07020078A patent/EP1905457B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-22 AU AU27400/01A patent/AU781444B2/en not_active Ceased
- 2000-12-22 CZ CZ2002-2156A patent/CZ304320B6/cs not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-06-21 NO NO20023036A patent/NO20023036L/no not_active Application Discontinuation
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1991011719A1 (en) * | 1990-01-26 | 1991-08-08 | Washington Research Foundation | Immune reactivity to expressed activated oncogenes for diagnosis and treatment of malignancy |
US5922697A (en) * | 1996-10-02 | 1999-07-13 | Warner-Lambert Company | Compounds, compositions and methods for inhibiting the binding of proteins containing an SH2 domain to cognate phosphorylated proteins |
WO1998050356A1 (en) * | 1997-05-07 | 1998-11-12 | Sugen, Inc. | 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity |
WO1998053051A1 (en) * | 1997-05-21 | 1998-11-26 | The Children's Medical Center Corporation | Short peptides which selectively modulate intracellular signalling |
WO1999017770A1 (en) * | 1997-10-06 | 1999-04-15 | Basf Aktiengesellschaft | Indeno[1,2-c]pyrazole derivatives for inhibiting tyrosine kinase activity |
WO1999061590A1 (en) * | 1998-05-29 | 1999-12-02 | The Scripps Research Institute | Methods and compositions useful for modulation of angiogenesis using tyrosine kinase src |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Selective Requirement for Src Kinases during VEFG-Induced Angiogenesis and Vascular Permeability Molecular Cell, Vol. 4, s. 915-924 (1999) * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1434727A (zh) | 2003-08-06 |
ES2383763T3 (es) | 2012-06-26 |
ATE392215T1 (de) | 2008-05-15 |
DE60038631T2 (de) | 2009-06-10 |
AU781444B2 (en) | 2005-05-26 |
PT1250155E (pt) | 2008-06-06 |
DK1250155T3 (da) | 2008-08-25 |
ATE553782T1 (de) | 2012-05-15 |
RU2271216C2 (ru) | 2006-03-10 |
HUP0203957A3 (en) | 2005-07-28 |
HU229628B1 (en) | 2014-03-28 |
NO20023036L (no) | 2002-07-22 |
DK1905457T3 (da) | 2012-05-29 |
NO20023036D0 (no) | 2002-06-21 |
WO2001045751A1 (en) | 2001-06-28 |
EP1905457A1 (en) | 2008-04-02 |
KR20020063259A (ko) | 2002-08-01 |
EP1250155A4 (en) | 2003-08-20 |
SK8492002A3 (en) | 2002-11-06 |
EP1250155A1 (en) | 2002-10-23 |
EP1250155B1 (en) | 2008-04-16 |
PT1905457E (pt) | 2012-05-25 |
BR0016547A (pt) | 2002-10-29 |
DE60038631D1 (de) | 2008-05-29 |
ES2303514T3 (es) | 2008-08-16 |
EP1905457B1 (en) | 2012-04-18 |
CA2395136A1 (en) | 2001-06-28 |
PL356815A1 (en) | 2004-07-12 |
RU2002119399A (ru) | 2004-02-27 |
JP2003518077A (ja) | 2003-06-03 |
AU2740001A (en) | 2001-07-03 |
SK287575B6 (sk) | 2011-03-04 |
HUP0203957A2 (hu) | 2003-03-28 |
KR100813818B1 (ko) | 2008-03-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CZ304320B6 (cs) | Farmaceutický prostředek obsahující bílkoviny tyrozin kinázy Src a Yes, společně s farmaceuticky přijatelným nosičem a předmět výroby | |
US7585841B2 (en) | Methods and compositions useful for modulation of angiogenesis using tyrosine kinase Src | |
US20060040853A1 (en) | Methods and compositions useful for modulation of angiogenesis using protein kinase Raf and Ras | |
US20230135501A1 (en) | Gene therapy | |
MXPA02006207A (en) | Angiogenesis and vascular permeability modulators and inhibitors | |
ZA200201761B (en) | Methods and compositions useful for modulation of angiogenesis using protein kinase Raf and Ras. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20161222 |