HU229628B1 - Angiogenesis and vascular permeability modulators and inhibitors - Google Patents
Angiogenesis and vascular permeability modulators and inhibitors Download PDFInfo
- Publication number
- HU229628B1 HU229628B1 HU0203957A HUP0203957A HU229628B1 HU 229628 B1 HU229628 B1 HU 229628B1 HU 0203957 A HU0203957 A HU 0203957A HU P0203957 A HUP0203957 A HU P0203957A HU 229628 B1 HU229628 B1 HU 229628B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- src
- protein
- yes
- pharmaceutical composition
- tyrosine kinase
- Prior art date
Links
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 title claims description 68
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 title claims description 25
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 title description 15
- 101150001535 SRC gene Proteins 0.000 claims description 360
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 246
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 192
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 107
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 88
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 81
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 79
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 78
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 78
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 73
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 71
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 71
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 68
- 230000002792 vascular Effects 0.000 claims description 64
- 102000009076 src-Family Kinases Human genes 0.000 claims description 55
- 108010087686 src-Family Kinases Proteins 0.000 claims description 55
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 claims description 44
- 239000005483 tyrosine kinase inhibitor Substances 0.000 claims description 43
- 229940121358 tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 claims description 42
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 37
- 230000000051 modifying effect Effects 0.000 claims description 37
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 claims description 36
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 36
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 36
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 36
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 31
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 30
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 30
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 29
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 29
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 29
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 28
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 claims description 26
- 150000004917 tyrosine kinase inhibitor derivatives Chemical class 0.000 claims description 26
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 claims description 24
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 claims description 22
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 21
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 claims description 20
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 17
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 17
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 17
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 16
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 claims description 15
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 15
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 claims description 15
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 claims description 15
- 230000008733 trauma Effects 0.000 claims description 15
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 13
- 230000035699 permeability Effects 0.000 claims description 13
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 claims description 13
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 12
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims description 12
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 10
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 9
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 claims description 9
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 claims description 8
- 239000003607 modifier Substances 0.000 claims description 8
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 7
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 claims description 7
- 239000013000 chemical inhibitor Substances 0.000 claims description 7
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 7
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims description 7
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 claims description 7
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 7
- JRZJKWGQFNTSRN-UHFFFAOYSA-N Geldanamycin Natural products C1C(C)CC(OC)C(O)C(C)C=C(C)C(OC(N)=O)C(OC)CCC=C(C)C(=O)NC2=CC(=O)C(OC)=C1C2=O JRZJKWGQFNTSRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 claims description 6
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 claims description 6
- QTQAWLPCGQOSGP-GBTDJJJQSA-N geldanamycin Chemical compound N1C(=O)\C(C)=C/C=C\[C@@H](OC)[C@H](OC(N)=O)\C(C)=C/[C@@H](C)[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H](C)CC2=C(OC)C(=O)C=C1C2=O QTQAWLPCGQOSGP-GBTDJJJQSA-N 0.000 claims description 6
- 101150024474 yes gene Proteins 0.000 claims description 6
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 claims description 5
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims description 5
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 claims description 5
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 claims description 5
- 206010048962 Brain oedema Diseases 0.000 claims description 4
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 claims description 4
- 208000006752 brain edema Diseases 0.000 claims description 4
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 claims description 4
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 claims description 3
- 206010008111 Cerebral haemorrhage Diseases 0.000 claims description 3
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 claims description 3
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 3
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 claims description 3
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 claims description 3
- WYZWZEOGROVVHK-GTMNPGAYSA-N radicicol Chemical compound C/1=C/C=C/C(=O)CC2=C(Cl)C(O)=CC(O)=C2C(=O)O[C@H](C)C[C@H]2O[C@@H]2\1 WYZWZEOGROVVHK-GTMNPGAYSA-N 0.000 claims description 3
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 claims description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 claims description 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims description 2
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 claims description 2
- ZVPDNRVYHLRXLX-UHFFFAOYSA-N 1-ter-butyl-3-p-tolyl-1h-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-ylamine Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1C1=NN(C(C)(C)C)C2=NC=NC(N)=C12 ZVPDNRVYHLRXLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims 2
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 claims 1
- 208000022306 Cerebral injury Diseases 0.000 claims 1
- 208000010248 Cerebrovascular Trauma Diseases 0.000 claims 1
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 claims 1
- KKCIOUWDFWQUBT-AWEZNQCLSA-N L-thyronine Chemical compound C1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC=C1OC1=CC=C(O)C=C1 KKCIOUWDFWQUBT-AWEZNQCLSA-N 0.000 claims 1
- 208000001738 Nervous System Trauma Diseases 0.000 claims 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 claims 1
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 claims 1
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 claims 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 claims 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 claims 1
- 208000028412 nervous system injury Diseases 0.000 claims 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 claims 1
- 208000010926 vascular brain injury Diseases 0.000 claims 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 126
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 77
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 75
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 70
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 53
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 51
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 48
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 36
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 33
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 31
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 31
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 29
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 27
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 27
- 102000029330 CSK Tyrosine-Protein Kinase Human genes 0.000 description 26
- 108010069682 CSK Tyrosine-Protein Kinase Proteins 0.000 description 26
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 24
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 22
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 22
- 108060006706 SRC Proteins 0.000 description 21
- 102000001332 SRC Human genes 0.000 description 21
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 21
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 21
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 21
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 20
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 19
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 18
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 18
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 17
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 16
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 16
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 16
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 16
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 15
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 15
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 15
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 15
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 14
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 14
- 229940122924 Src inhibitor Drugs 0.000 description 13
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 13
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 13
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 13
- COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O Chemical compound CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N 0.000 description 12
- 229960003699 evans blue Drugs 0.000 description 12
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 12
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 12
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 12
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 11
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 11
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 11
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 11
- 201000006474 Brain Ischemia Diseases 0.000 description 10
- 206010008120 Cerebral ischaemia Diseases 0.000 description 10
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 10
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 10
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 9
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 9
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 9
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 9
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 8
- ZOJBYZNEUISWFT-UHFFFAOYSA-N allyl isothiocyanate Chemical compound C=CCN=C=S ZOJBYZNEUISWFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 8
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 8
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 7
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 7
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 7
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 7
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 6
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 6
- 210000003657 middle cerebral artery Anatomy 0.000 description 6
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 6
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 6
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 6
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 6
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 6
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 5
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 5
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 5
- 208000000172 Medulloblastoma Diseases 0.000 description 5
- 102100024193 Mitogen-activated protein kinase 1 Human genes 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 description 5
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 5
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 5
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 108091006086 inhibitor proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 238000000021 kinase assay Methods 0.000 description 5
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 5
- 108700026239 src Genes Proteins 0.000 description 5
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 4
- 101100328086 Caenorhabditis elegans cla-1 gene Proteins 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 4
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 4
- 101000820294 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase Yes Proteins 0.000 description 4
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 4
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 4
- -1 amino- Chemical class 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 4
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000048099 human YES1 Human genes 0.000 description 4
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 4
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 4
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010008190 Cerebrovascular accident Diseases 0.000 description 3
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 3
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 3
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 3
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 3
- 102000052812 Ornithine decarboxylases Human genes 0.000 description 3
- 108700005126 Ornithine decarboxylases Proteins 0.000 description 3
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 3
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 3
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 3
- 102000038012 SFKs Human genes 0.000 description 3
- 108091008118 SFKs Proteins 0.000 description 3
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 3
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 3
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 3
- 208000024248 Vascular System injury Diseases 0.000 description 3
- 208000012339 Vascular injury Diseases 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 235000016720 allyl isothiocyanate Nutrition 0.000 description 3
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 3
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 3
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 3
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 201000003142 neovascular glaucoma Diseases 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 3
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 2
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 2
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 2
- ITRJWOMZKQRYTA-RFZYENFJSA-N Cortisone acetate Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(=O)COC(=O)C)(O)[C@@]1(C)CC2=O ITRJWOMZKQRYTA-RFZYENFJSA-N 0.000 description 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100058944 Gallus gallus CALM gene Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 101000946124 Homo sapiens Lipocalin-1 Proteins 0.000 description 2
- 101000922131 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase CSK Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 102100034724 Lipocalin-1 Human genes 0.000 description 2
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical class [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 230000009692 acute damage Effects 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000001668 ameliorated effect Effects 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 2
- 210000004246 corpus luteum Anatomy 0.000 description 2
- 229960003290 cortisone acetate Drugs 0.000 description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 239000007933 dermal patch Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 2
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 2
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- GVVPGTZRZFNKDS-JXMROGBWSA-N geranyl diphosphate Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CO[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O GVVPGTZRZFNKDS-JXMROGBWSA-N 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000055892 human CSK Human genes 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N hydron Chemical compound [H+] GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 230000004089 microcirculation Effects 0.000 description 2
- VYGYNVZNSSTDLJ-HKCOAVLJSA-N monorden Natural products CC1CC2OC2C=C/C=C/C(=O)CC3C(C(=CC(=C3Cl)O)O)C(=O)O1 VYGYNVZNSSTDLJ-HKCOAVLJSA-N 0.000 description 2
- 239000008164 mustard oil Substances 0.000 description 2
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 210000004789 organ system Anatomy 0.000 description 2
- 108700025694 p53 Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 2
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 229920002338 polyhydroxyethylmethacrylate Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001185 psoriatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- AECPBJMOGBFQDN-YMYQVXQQSA-N radicicol Chemical compound C1CCCC(=O)C[C@H]2[C@H](Cl)C(=O)CC(=O)[C@H]2C(=O)O[C@H](C)C[C@H]2O[C@@H]21 AECPBJMOGBFQDN-YMYQVXQQSA-N 0.000 description 2
- 229930192524 radicicol Natural products 0.000 description 2
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 2
- 230000006444 vascular growth Effects 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 2
- BFCDFTHTSVTWOG-PXNSSMCTSA-N (1r,2s)-2-(octylamino)-1-(4-propan-2-ylsulfanylphenyl)propan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCN[C@@H](C)[C@H](O)C1=CC=C(SC(C)C)C=C1 BFCDFTHTSVTWOG-PXNSSMCTSA-N 0.000 description 1
- PKDBCJSWQUOKDO-UHFFFAOYSA-M 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC=CC=C1C(N=[N+]1C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 PKDBCJSWQUOKDO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 2-(ethylamino)ethanol Chemical compound CCNCCO MIJDSYMOBYNHOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBLDQZASZZMNSL-QMMMGPOBSA-N 4-[(2s)-2-amino-3-hydroxypropyl]phenol Chemical compound OC[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 DBLDQZASZZMNSL-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 101150094949 APRT gene Proteins 0.000 description 1
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 208000003120 Angiofibroma Diseases 0.000 description 1
- 206010059245 Angiopathy Diseases 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 241000713842 Avian sarcoma virus Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000004020 Brain Abscess Diseases 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- 101100042265 Caenorhabditis elegans sem-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100534229 Caenorhabditis elegans src-2 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229920000298 Cellophane Polymers 0.000 description 1
- 208000014912 Central Nervous System Infections Diseases 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 101000573945 Coccidioides posadasii (strain C735) Neutral protease 2 homolog MEP2 Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241000283014 Dama Species 0.000 description 1
- 101100136092 Drosophila melanogaster peng gene Proteins 0.000 description 1
- 241001269524 Dura Species 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 208000002403 Encephalocele Diseases 0.000 description 1
- 208000032274 Encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 102100027723 Endogenous retrovirus group K member 6 Rec protein Human genes 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000195955 Equisetum hyemale Species 0.000 description 1
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000713800 Feline immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102100035233 Furin Human genes 0.000 description 1
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 206010018498 Goitre Diseases 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 206010018852 Haematoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 102100029217 High affinity cationic amino acid transporter 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000633751 Homo sapiens High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101100321817 Human parvovirus B19 (strain HV) 7.5K gene Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029098 Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100022337 Integrin alpha-V Human genes 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical group 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- VVNCNSJFMMFHPL-GSVOUGTGSA-N L-penicillamine Chemical compound CC(C)(S)[C@H](N)C(O)=O VVNCNSJFMMFHPL-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 235000000421 Lepidium meyenii Nutrition 0.000 description 1
- 240000000759 Lepidium meyenii Species 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 206010027202 Meningitis bacterial Diseases 0.000 description 1
- 206010027260 Meningitis viral Diseases 0.000 description 1
- 206010027480 Metastatic malignant melanoma Diseases 0.000 description 1
- 241001502129 Mullus Species 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101150087854 NEXN gene Proteins 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 108030004039 Non-specific protein-tyrosine kinases Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100124346 Photorhabdus laumondii subsp. laumondii (strain DSM 15139 / CIP 105565 / TT01) hisCD gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004211 Platelet factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000778 Platelet factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Chemical class 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101710150593 Protein beta Proteins 0.000 description 1
- 206010037423 Pulmonary oedema Diseases 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010038933 Retinopathy of prematurity Diseases 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 1
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- GRXKLBBBQUKJJZ-UHFFFAOYSA-N Soman Chemical compound CC(C)(C)C(C)OP(C)(F)=O GRXKLBBBQUKJJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000038008 SrcA subfamily Human genes 0.000 description 1
- 108091008119 SrcA subfamily Proteins 0.000 description 1
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 102000002938 Thrombospondin Human genes 0.000 description 1
- 108060008245 Thrombospondin Proteins 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010047141 Vasodilatation Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010048673 Vitronectin Receptors Proteins 0.000 description 1
- JOOSFXXMIOXKAZ-UHFFFAOYSA-H [Au+3].[Au+3].[O-]C(=O)CC(S)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(S)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(S)C([O-])=O Chemical compound [Au+3].[Au+3].[O-]C(=O)CC(S)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(S)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(S)C([O-])=O JOOSFXXMIOXKAZ-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000964 angiostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 230000000320 anti-stroke effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000008135 aqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 201000009904 bacterial meningitis Diseases 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000025698 brain inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 235000019846 buffering salt Nutrition 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 238000012410 cDNA cloning technique Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940087373 calcium oxide Drugs 0.000 description 1
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 1
- 150000001765 catechin Chemical class 0.000 description 1
- ADRVNXBAWSRFAJ-UHFFFAOYSA-N catechin Natural products OC1Cc2cc(O)cc(O)c2OC1c3ccc(O)c(O)c3 ADRVNXBAWSRFAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005487 catechin Nutrition 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 230000003727 cerebral blood flow Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- OGEBRHQLRGFBNV-RZDIXWSQSA-N chembl2036808 Chemical compound C12=NC(NCCCC)=NC=C2C(C=2C=CC(F)=CC=2)=NN1C[C@H]1CC[C@H](N)CC1 OGEBRHQLRGFBNV-RZDIXWSQSA-N 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002385 cottonseed oil Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013499 data model Methods 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 229940124447 delivery agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- JNSGIVNNHKGGRU-JYRVWZFOSA-N diethoxyphosphinothioyl (2z)-2-(2-amino-1,3-thiazol-4-yl)-2-methoxyiminoacetate Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC(=O)C(=N/OC)\C1=CSC(N)=N1 JNSGIVNNHKGGRU-JYRVWZFOSA-N 0.000 description 1
- 208000002173 dizziness Diseases 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- VLCYCQAOQCDTCN-UHFFFAOYSA-N eflornithine Chemical compound NCCCC(N)(C(F)F)C(O)=O VLCYCQAOQCDTCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 230000009762 endothelial cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 235000020774 essential nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229960004887 ferric hydroxide Drugs 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 210000001652 frontal lobe Anatomy 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 101150022010 gam gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000002175 goblet cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000003872 goiter Diseases 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000011066 hemangioma Diseases 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 101150113423 hisD gene Proteins 0.000 description 1
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- IEECXTSVVFWGSE-UHFFFAOYSA-M iron(3+);oxygen(2-);hydroxide Chemical compound [OH-].[O-2].[Fe+3] IEECXTSVVFWGSE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical group 0.000 description 1
- 235000012902 lepidium meyenii Nutrition 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000007443 liposuction Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 210000003584 mesangial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000006510 metastatic growth Effects 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000021039 metastatic melanoma Diseases 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003595 mist Substances 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000018103 negative regulation of vascular permeability Effects 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 229960001639 penicillamine Drugs 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 210000003516 pericardium Anatomy 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Chemical class 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000018883 protein targeting Effects 0.000 description 1
- 230000007398 protein translocation Effects 0.000 description 1
- 208000005333 pulmonary edema Diseases 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 108091006082 receptor inhibitors Proteins 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000019705 regulation of vascular permeability Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000000979 retarding effect Effects 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 238000006798 ring closing metathesis reaction Methods 0.000 description 1
- 102220049163 rs35498994 Human genes 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000012868 site-directed mutagenesis technique Methods 0.000 description 1
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 1
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 229960004291 sucralfate Drugs 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 238000012385 systemic delivery Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000003556 thioamides Chemical class 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 description 1
- 230000000287 tissue oxygenation Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- YFDSDPIBEUFTMI-UHFFFAOYSA-N tribromoethanol Chemical compound OCC(Br)(Br)Br YFDSDPIBEUFTMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 101150081616 trpB gene Proteins 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 150000003668 tyrosines Chemical class 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 230000006459 vascular development Effects 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010055031 vascular neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004509 vascular smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004862 vasculogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000005526 vasoconstrictor agent Substances 0.000 description 1
- 230000024883 vasodilation Effects 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
- 208000037997 venous disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007998 vessel formation Effects 0.000 description 1
- 201000010044 viral meningitis Diseases 0.000 description 1
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 1
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/45—Transferases (2)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
AZ BRKBPBÓDÉST ÉS AZ ÉRRENDSZERI FERMEABIOTÁST MÓDOSÍTÓ ÉS GÁTLÓ HATÓANYAGOK
A találmány az érképződést (angiogenézíst) és az érrendszer permeabílltását (vaszkuláris átjárhatóságát) módosító és gátló hatóanyagokra, vonatkozik.
Kormányzati jogok megállapítása
E munka egy részét részben az NIH támogatta, az Amerikai Egyesült Államok nevében adott ösztöndíjakkal. Ennek alapján az Amerikai Egyesült Államok a találmányban bizonyos jogokkal rendelkezhetik.
Műszaki terület
A találmány általában az orvostudomány területére és különösen olyan módszerekre (eljárásokra) és készítményekre vonatkozik, amelyek a vaszkuláris (érrendszeri) permeabilitást (átjárhatóságot; röviden VP) módosítják, vagy gátolják.
Az érképzödés (angíogenézis) a szöveti érrendszer kialakulásának a folyamata, amely magában foglalja új, fejlődő véredények növekedését (szaporodását) egy szövet irányában, s amelyet neovaszkularizációnak (üj érrendszeri fejlődésnek) is neveznek. Ezt a folyamatot endoteliális sejtek és simaizomsejtek beszürődése közvetíti. Az a vélemény áll fenn, hogy ez a folyamat három út valamelyikén mehet végbe: a véredények előzőleg létező véredényekből növekedhetnek; a. de novo fejlődés prekurzor sejtekből eredhet (vaszkulogenéds); vagy már meglévő kis erek átmérője növekedhet (Blood és munkatársai: Biochem. Biophys. Acta 1032, 89-118 (1990)). Ahhoz, .hogy az angíogenézis megtörténjék, a belhámsejteknek (endoteliális sejteknek) először le kell épülniük, és keresztezniük a vérpálya alapmembránját hasonló módon, mint amelyet a daganatsejtek alkalmaznak támadásuk és áftételképzésük során. Az érzképződés általában netn lép fel kifejlődött vagy érett szövetekben, de lejátszódik a yógyulásban, valamint a corpus iuteum növekedési [lásd például: Moses és munkatársai: Sciences 248,
1408-1410 (1990)).
Jóllehet -az érképződés az újszülöttek növekedésének egyik lényeges folyamata, fontos szerepet játszik a sebgyógyulásban és számos klinikai, kóros állapot kórfejlődésében,. Ilyen klinikai kóros szöveti gyulladások, izületi gyulladás, retinabántalma, a retina neovaszkularizációja következtében beálló foltos degenerálődás, és ezekhez hasonló kóros állapotok. Ezeket a klinikai
meg az e :
angiogén betegségeknek nevezik [Folkman és munkatársai: Science 235, 442-447 (1987)1
Valószínűsítették, hogy az érképződés gátlása a daganatnövekedés korlátozása szempontjából hasznos terápia lehet. Az érképződés gátlását a kővetkező utakon javasolták.: (1|: az angiogén molekulák, így például bFGF (házisós fihroblaszt növekedési faktor) felszabadulásának a gátlásával; (2) angiogén molekulák közömbösítése, például aníi-fö bFGF antitestek alkalmazásával; (3) a vltronektin cuSs receptor gátlóinak a felhasználásával; és (4) az endoteliálís sejtek (beíhámsejtek) angiogén ingerlésre adott válaszának a gátlása útján. Ez az utóbbi stratégia felkeltette a figyelmet. Folkman és munkatársai [Cancer Biology 3, 89-96 (1992)] számos olyan anyagot írtak le, amelyek gátolják az endoteliálís sejtek válaszát, amilyenek például:
gyulladás 3 vitaminköllagenáz-gátlók; alapmembrán-metabolízmus-gátlók: angiosztatikus hatású szteroidok; gombákból ere trombocita 4 faktor, trombospondín, az izületi gyógyszerei, így a D-penicillamin és arany-tiomalát, analógok, alfa-interferon, és ezekhez hasonló anyagok, amelyek az érképződés gátlására alkalmazhatók. Az érképződés gátlására javasolt további vegyületek az alábbi irodalmi közleményekben találhatók: Blood és munkatársai: Bioch, Biophys. Acta,, 1032:89118 (1990), Moses és munkatársai: Science, 248:1408-1410 (1990), Ingber és munkatársai: Láb. Invest,, 59:44-51 (1988), és 5,092,885, 5,112,946, 5,192,744, 5,202,352, 5,753,230 és
5,766,591 sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmak. Azonban, a fenti irodalmi közleményekben leírt érképződé sgáflók egyike sem foglalja magában az Src proteineket.
Előzőleg közölték, hogy7 az érképződés vaszkuláris mtegrinek és extracelluláris (sejten kívüli) m&lrixproteinek. között végbemenő kölcsönhatástól függ (Brooks és munkatársai: Science 264, 569571 (1994)], Továbbá leírták, hogy angiogén. vaszkuláris sejtek programozott sejthalála (apoptosís) olyan kölcsönhatás sál indul meg. amely a vaszkuláris atiíh integrin. bizonyos antagcnistáival meggátolható (Brooks és munkatársai: Cell 79, 1157-1 Újabban közölték, hogy a mátrix metaIlöpröíeínáz-2 vitronektin receptorhoz (ariSs) való kapcsolódása av&3 alkalmazásával meggátolható, és ennek alapján a enzimes működése gátolható (Brooks és
hogy Ov integrínek fontos komponensek
683-693 (1996)' az angiogén v
az <us nőve ké «3 faktor által stimulált érképződésí utakat blokkolják, így például a vaszkuláris belhámseit-növekedési faktor (VEGF) által indukált érképződést integrál avfis antagonisták blokkolják, míg a bázisos fibroblaszt-novekedési faktor (bFGF) által indukált érképzödést az ανβ>3 antagonisták gátolják.
Az agy érhálózatát jellemzi egy erősen korlátozó vér-agy-gát, amely meggátolja az érből kilépd kis molekulák belépését a környező agyszövetbe. Az emlősökön fennálló vér-agy-gá.t természete különös érdeklődést váltott ki farmakológiai vizsgálatok során, mivel számos gyógyszernek az érhálózatból az agyszövetbe
a. vaszkuláris permeabílítás (VP) - a vérnek a véredényből való kiszivárgásával mérve - Src. vagy' Yes proteinekkel módosítható. .Ezen túlmenően, a vaszkuláris permeabilitást az érképződéssel és más patológiás folyamatokkal hoztuk kapcsolatba.
ans
A VEGF által indukált, azonban bFGF által nem angiogenézis egyik követelménye az Src tirozin-kináz aktivitása szempontiából azt mutatta, hogy lényeges különbségek állnak yzás és aktiválás szignáljai között ezen a két úton,
mind a csirkeembrios, mind az egérraodelleken [Elieeiri és munkatársai; Moiecular Cell 4, 915-924 (1999)],
A tumorsei fékből származó angiogén szignálói
az errer tették egy modell felállítását a rákkal kapcsolatos szígná!~utak vizsgálatára; azonban a sérülés, megbetegedés vagy más, a véredények károsodása vagy betegsége következtében fellépő
vaszkulárís per v az agyé <A.' más, az agyban vág vaszkulárís károsodás legtöbb-nyíre a 3 közös oka, és a s lényegesebb oka a szöveti károsodással szivárgás és ödéma legfontosabb oka, így váratlan meghibásodásával (CVA) vagy a geríncagyí szövetekben fellépő más.
jgiai meg ííge· forrása. Általában az agy vagy geríncszovet károsodása egy agyvérzésnek a területén érrendszeri (vaszkulárís) szivárgást és/vagy ödémát. ís jelent. Általában a CVA~í kísérheti eg agyi iszkémla által okozott károsodás; az agy irányában végbemenő normális véráramlás megszakadása; agyi elégtelenség a véráramlás átmeneti zavarai következtében; infarktus, a koponyán belüli, vagy koponyán kívüli artériák embóliája vagy trombózisa; hemorrágía (véromlés), továbbá artériás-vénás rendellenességek. Az iszkémiás sztrők és az agyi hemorrágía hírtelenűl kifejlődhet, és az esemeny az agy arányos [lásd: The Merek Manual, 16íh ed. Chp 123, (1992)].
A CVA fagy érrendszeri sérülés, agyvérzés) esetein kívül a.
központi idegrendszer (CN5) fertőzései vagy betegségei szintén érinthetik az· agy és a. gerincagy vérereit, és gyulladást és ödémát okozhatnak, például a baktériumos agyhártyagyulladásban, a vírusos agyhártyagyulladásban és agytályog képződése során [lásd The Merek Manual 16, kiadás, 125. fejezet (1992)], A szisztémás kóros állapotok szintén ingerelhetik a vérereket, és a vérerek szivárgását és veseoetegsegek, ateroszklerozis esetén.
Mindezek alapján a vaszkulárís szivárgás és ödéma kritikus patológiás történések, amelyek a ráktól különbözők és függetlenek, és amelyeket hatékony és különleges terápiás &
beavatkozással kell ellátni különféle károsodást traumás vagy
Felismertük, hogy az Src családhoz tartozó tirozm-kmáz aktivitásának szelektív gátlása csökkenti a VP növekedésével kapcsolatos károsodást vagy traumát a szövetekben, és a vérerek szivárgásával és/vagy ödémával járó patológiás folyamat, javulását vezi.
Az alábbiakban, a taláhnányt röviden összegezzük.
A találmány a vaszkuláris permeabilitás módosítására vonatkozik tirozín--kináz Src által, amelyet itt genetikusán Src-nek nevezünk; vagy tirozin-kináz Yes útján, amelyet itt generikusan Yes-nek nevezünk; vagy az Src család tírozin-kináz aktivitásának
a. szelektív gatlasa utján,.
Mindezek alapján a találmány egyik szempontját képezik gyógyászati, készítmények a YP módosítására egy emlősállat célszőveteiben. A találmány szerinti készítmények egy tírozin-kináz Src protein és Yes protein keverékének terápiás szempontból hatásos, VP-módosíto mennyiségét tartalmazzák gyógyászati szempontból elfogadható vívőanyagban.
Olyan készítményekben, amelyek aktív Src és Yes kináz proteineket tartalmaznak, a várt módosítás célszövetben lévő veredenyek vaszkuíans permeabmtasanak (errrendszen átjárhatóságának) a poteneírozása vagy növelése. Ha a kívánt Sre protein valamilyen aktív kináz, akkor az előnyös Src az Src-A<
.Egy másik előnyös, aktív Src protein olyan protein, amelyben aminosavmaradék lehet a tirozín, szerin vagy treonin kivételével. Az előnyös, aktív Yes protein rendelkezhet a vad típusú humán Yes kínáz aktivitásával., mint például a Yes-1 protein. Egy másik előnyös, aktív Yes, amelyben a kináz-inaktiváló foszforilezés helyét a Yes proteinben megváltoztatjuk (mutáljuk) az ínaktiválő foszforilezés megszűntetése vagy minimálissá tétele céljából, hasonlóképpen az 527-helyzetű aminosavmaradék mutációjához az Src proteinben; a mutáció bármilyen más aminosavra vonatkozhat, a tirozin, szerin vagy treonon kivételével.
Ha a készítmény Src és Yes proteint tartalmaz, amelyek inaktív kináz proteinek - akkor a várt módosulás a célszövetben lévő véredények vaszkuláris permeabilitásának a gátlása vagy
Ha a kívánt Src protein inaktív protein, akkor az előnyös Src az Src 2SÍ. Egy másik előnyös inaktív Src az Src K295M Egy előnyös inaktív Yes protein a vadtípusű proteinhez képest feltehetően csökkent kináz-aktivitást fog mutatni.
Az igényelt találmánynak egy további szempontja olyan gyógyászati készítmény, amely tartalmazza: alkalmas gyógyszervívoanyagban egy olyan nukleinsav terápiásán hatásos, VPmődosító mennyiségét, amely képes a tírozín-kmáz Src és Yes protein expressziőjára (kifejezésére), ha egy célsejtbe transzfektáljuk. Az expressziöra képes nukíeinsavak - , amelyek az Src vagy' Yes proteint kódolják - tartalmaz! nukleinsavszegmentumokat, amelyek a. Yes vagy Src teljesen vagy részben leírják. A célsejtbe való átvitel során a célsejt átírja és átfordítja a nukíeinsavszekvenciát, és kifejezi a kívánt proteint.
a módosítás a célsejtben lévő véredények vaszkuláris permeabilitásának a potencírozása, vagy növelése, akkor az Src-t kódoló nukleinsav az Src aktív formáit kódolja, és a Yes-t kódoló nukíeinsavak a Yes-kínáz proteinek aktív formáit kódolják. A célzott gazdasejtbe történő átvitel után a nukleinsavakat a gazdasejt kifejezi. Egy előnyös Src-kód.oló nukleinsav aktív Src A proteint kódol Egy további, előnyős Src-kódolö nukleinsav mutált, aktív Src-t kódol, amelyben az expresszált (kifejezett) Src protein 527-helyzetben lévő aminosavmaradéka bármely aminosavmaradék: lehet a tirozin, szerin vágj’ treonin kivételévek Egy' előnyős Yes-kődolö nukleinsav a vadtípusú proteint kódolhatja, vagy egy olyan, proteint, amely módosítva van a Yes protein inaktiválő foszforilezési helyének a megszüntetésére vagy gátlására hasonló módon, mint ahogyan azt az Src 527-helyzefének mutációjára vonatkozóan leírtuk.
Ha a kívánt módosítás a célszővethen lévő véredények vaszkuláris átjárhatóságának a gátlása vagy csökkentése, akkor egy előnyös inaktív Src-kódolő nukleinsav az Src 251 proteint kódolja. Egy további, előnyős, inaktív Src-kódolő nukleinsav az inaktív Src K295M proteint kódolja. Egy előnyős inaktív Yes-t kódoló nukleinsav olyan proteint fog kódolni, amelynek csökkent kinéz-aktivitása van.
Figyelembe kell vennünk, hogy a. találmány szerinti készítmények nukleínsavak keverékét tartalmazhatják. ahol mindegyik nukleinsav kifejezhető (expresszibilis) Src vagy Yes gént foglalhat magában, Ehhez járul, hogy figyelembe vehető, hogy egy egyedi nukleinsav mind Src proteint kódoló nukleínsavat, mind Yes proteint kódoló nukleínsavat tartalmazhat. Az érképződés és VP finomított módosításának céljából a célszövetekben, a találmány szerinti gyógyászati készítmények aktív vagy inaktív tírozin-kináz Src protein vagy firozln-kináz Yes protein keverékét tartalmazhatják. Hasonlóképpen a találmány szerinti gyógyászati készítmények olyan nukleínsavak keverékét tartalmazhatják, tív vagy inaktív tirozin-kináz Src tirozin-kináz Yes protein kifejezésére.
vsa
Egy első tirozin-kináz különböző mennyiségéinek az alkalmazásával, amelyet együtt adagolunk egy második tirozinkinéz második, magasabb mennyiségével, a találmány szerinti kitanításnak megfelelően a finomított módosítást követjük. Ebben a megvalósítási tormában dmereneiáhsan vagy más hasonló szabályzó elemek jezö, első tirozin-kináz tirozín-ki tirozin-kináz génnel a találmány szerinti 1 a megvalósítási formában az
c promöterek : egy első, kis gént együttesen kifejező, második értelmében, növ v
meí
iező. aktív
Src gént alkalmazunk egy második, erősen kifejező inaktív Yes génnel. Ez az együttes adagolás elérhető úgy, hogy különálló expressziós vektorokat, alkalmazunk, vagy elérhető egyetlen kombinált expressziós vektor megszerkesztésével Hasonlóképpen, az érkéződes csökkenése elérhető - miközben a VP-t megtartjuk, potencírozzuk vagy növeljük - úgy, hogy egy első, gyengén kifejező inaktív Src gént egy második, erősen kifejező aktív Yes génnel kombinálunk. A módosítás további fokozatai valósíthatok meg az erős/csekély és Src/Yes arányok különböző cseréivel, amelyet kombinálunk promótor elemek és indukálható promöterek aktivitásának a megválasztásával
Figyelembe vesszük, hogy az egyedi Src és Yes gének azonos vagy különböző, szabályzó nukleínsavszekvenciák kontrollja alatt vannak. így például (azonban korlátozás nélkül) különböző fokozó hatású, fékező hatású és promótor elemek hatása alatt vannak.
a
Ha két vagy több protein egyetlen, vektor útján terv szerint a független protein yzása és ellenőrzése azonos knpei kon· alatt lehet. Továbbá figyel működő szabályzó elem útján is elérhetjük. A szabályzó elemek a szakterületen ismertek, és szerkezetileg aktívak, vagy indukálható, növelő, promőter, fékező vagy ehhez hasonló hatású
Nézetünk szerint a találmány szerinti készítmények, állhatnak vitális és/vagy nemvirális géntranszfer vektorból, amely olyan nukleinsav-szegmentumot tartalmaz, amely az Src és/vagy Yes proteint kódolja. Az irodalomból ismertek retrovirális és nemvirális génátvívő és expresszíős vektorok; ezeket alább röviden
Egy előnyős nukleinsav az Src-A proteint Egy másik előnyős, aktív Src protein egy olyan protein, amelyben az S27~helyzetben lévő aminosavmaradék (az Src proteinben) bármilyen aminosavmaradék lehet, a tirozin, szerin és treonin. kivételével.
Nézetünk szerint az Src és Yes protein és/vagy ilyen proteint kódoló nukleinsav keveréke egyesítheti a protein aktív és inaktív formáit a kívánt módosítás szintjétől (mértékétől) függően, valamint egyesítheti a kívánt érképzödésre és VP-re kifejtett, koordinálható hatást a találmány szerinti kitanítás alapján .
Az Src vagy Yes proteint biztosító készítmény tartalmazhat tisztított proteint, természetes protein biológiailag hatásos fragmentumait, rekombinánsan előállított Src vagy Yes proteint vagy protein fragmentumokat vagy fúziós proteineket, vagy
II gén/nukleinsav expressziós vektorokat Src vagy Yes protein kifejezésére (expresszálására); vagy ezek keverékeit tartalmazhatja.
Ha az Src vagy Yes protein inaktiválódík, vagy gátoljuk, akkor a módosítás a VP gátlása. Ha az Src vagy Yes protein aktív vagy aktivált állapotban van, akkor a módosítás a VP
A találmány továbbá módszerekre vonatkozik emlősök szöveteinek a kezelésére olyan készítménnyé^ amely egy Src vagy Yes protein vagy ezek kombinációjának terápiás szempontból hatásos, VP-mödosító mennyiségét tartalmazza. A találmány szerinti eljárások során Src és Yes tírozin-kináz proteint vagy ilyen protein kifejezésére képes nukleinsav expressziás vektorokat adagolunk egy olyan kóros állapotban szenvedő szövet számára, amely állapot a VP módosítására választ ad.
Ha a terápiás szempontból hatásos, VP-mődosító kívánt hatás a VP növekedése vagy potencírozása, akkor fontolóra vehető (figyelembe vehető), hogy az Src protein és/vagy Yes protein akív formái adagolhatok. Hasonlóképpen a módszerek (eljárások) kifejezhető nukleínsavak adagolására ís vonatkoznak, amelyek az Src protein és/vagy Yes protein aktív vagy ínaktív alakjait kódolják,
A kezelendő szövet bármely szövet lehet, ahol a VP módosítása kívánatos, iá terápiás kezelést úgy valósítjuk meg, hogy a eéiszővetet a kívánt módosító készítmény hatásos mennyiségével érintkezésbe hozzuk, majd megfelelő érintkezési időt biztosítunk arra, hogy a készítmény protein- vagy nukleínsavkomponenseí a eélszövetbe lépjenek, A VP gátlása szempontjából célszerű annak a károsított (megbetegedett) szövetnek a kezelése, ahol a károsodást okozó vaszknláris szivárgás végbemegy. Ilyen szövetek például: a gyulladt szövet, a sztrók által érintett szövetek, a szivizomínfarktustól vagy a normális véráramlás blokkolása által érintett szövetek; a visszaszűkülés (resztenőzis) sújtotta szövetek és ezekhez hasonló más szövetek,
A potencírozás .szempontjából célszerű olyan betegek kezelése, akiknek végtagjai íszkémiásak, ahol tehát a keringés a végtagokban diabetikus vagy más körülmények következtében gyenge; továbbá célszerű olyan gyógyszerhatóanyagok adagolásának a potencírozása, amelyek a vér-agy-gáton át jutnak az agyba. Olyan betegek, akiknek 'krónikus sebei nem gyógyulnak, és ennek következtében az érrendszer sejtjeinek szaporodása és a neovaszkularizáció (újérképződés) növekedéséből előnyük származhat (a VP módosítása következtében), szintén kedvezően
A találmánynak egy további szempontját képezik olyan gyártott termékek., amelyek csomagolóanyagot, valamint a csomagolóanyagon belül gyógyászati készítményt tartalmaznak, a gyógyászati készítmény képes a vaszkuláris permeabilitás módosítására egy kóros állapotban lévő szövetben, ahol a csomagolóanyag egy címkét tartalmaz, amely feltünteti, hogy a a vaszkuláris permeabilitás módosításával; s a gyógyászati készítmény egy tirozín~kmáz Yes protein terápiás szempontból hatásos mennyiségét tartalmazza gyógyászati szempontból elfogadható vívőanyagban.
Ez a megvalósítási forma a Yes proteinnek mind aktív, mind inaktív alakjára vonatkozik, és vonatkozik továbbá az aktív vagy inaktív Yes proteint kódoló nukleínsavakra is. Mind a retrovirális, mind a nemvirális génátvívő/expressziós {kifejezési} vektorok tartalmazhatnak olyan nukleinsavszegmentumot, amely a Yes proteint kódolja, akár aktív, akár inaktív formában, akár mindkét formában. Ha egy protein-kináz génnek mind az aktív, mind inaktív alakjai jelen vannak, akkor nézetünk szerint a gének különálló, indukálható promőter-szabályzás alatt állnak, amely kívánalom szerint - az alternatív expressziót lehetővé teszi.
A találmánynak egy további szempontja olyan .gyártási termékekre vonatkozik, ahol a gyógyászati készítmény egy tirozinkináz Src és Yes protein terápiásán hatásos, VP-módosító mennyiségét egy gyógyászati szempontból elfogadható vívőanyagban tartalmazza. Ha a gyártott eszközt úgy csomagoljuk, hogy megjelöljük a potencírozó VP-módosító hatást, akkor az Src és Yes aktív formában van. Egy előnyös .aktív Src az Src-A protein.
Egy másik, előnyős aktív Src protein olyan protein, amelyben az Src protein. 527-hélyzetében lévő aminosavmaradék bármilyen amínosav maradéka lehet, a tirozin, szerin és treonon kivételével.
A találmánynak egy még további szempontját képezik olyan gyártási termékek, amelyek gyógyászati készítményt tartalmaznak, ahol a gyógyászati készítmény inaktív tirozin-kináz Src protein és Yes protein terápiásán hatásos VP-módosító mennyiségét tartalmazzák gyógyászati szempontból elfogadható vívőanyagban; ahol a kívánt módosítás a V.P inaktiválása vagy gátlása. Előnyös inaktív Src az Src 251 protein. Egy másik előnyös inaktív Src protein az Src K295M.
Hasonlóképpen, a találmánynak, egy további szempontját képezik olyan, .gyártási termékek, amelyekben a. gyógyászati készítmény olya» nukleinsavat tartalmaz, amely képes (alkalmas) a tirozin-kináz Src és Yes protein kifejezésére egy megfelelő
gyógyszerészeti vívőanyagban. Ennek a .gyártási terméknek a gyógyászati készítmények előnyösen olyan nukleínsavkomponens, amely aktív Src proteint kódol, ahol a kívánt módosítás a VP vagy aktiválása. Fontolóra veszünk aktív Yes iő nukíeinsavakat ís. Egy előnyös aktív Src az Src-A másik előnyös, aktív Src-kódoló nukleinsavban az Src 527-helyzetében lévő- amínosavmaradék bármilyen aminosav maradéka lehet a tirozín, szerin és treonon kivételével. Figyelembe vesszük továbbá, hogy egyetlen nukleinsav szerkeszthető,, amely mind Yes-t, mind Src-t, kifejezhet, akár függetlenül szabályozva, akár azonos promőter, fokozó, elnyomó (fékező) vagy más alkalmas szabályzó nnkleinsavszekvenda
Az érrendszeri szivárgás és/vagy ödémával kapcsolatos szöveti károsodás - amelyet a vaszkuláris permeábilitás ártalmas változásai kísérnek - Src családba tartozó tirozin-kínáz-gátlőkkal javíthatók. Erre a célra az Src családba tartozó ürozín-kináz-gáíló hatásos, vaszkuláris permeabilítást módosító mennyiségét egy ilyen kezelésre szoruló szövetbe adagoljuk. A vaszkuláris szivárgásnak vagy ödémának tulajdonítható szöveti károsodás ílven módon csökkenthető.
«>
Közelebbről, a találmány új eljárást nyújt a vaszkuláris a gátlást állapotban lévő szövetben, amely kóros állapot vaszkuláris szivárgással és/vagy ödémával társul; ez a módszer .(eljárás) abban áll, hogy a fenti szövetet érintkezésbe hozzuk egy Src családba tartozó tirozín-kináz-gátló terápiásán hatásos, vaszkuláris
gátló mennyiségével, és ezzel együtt gyógyászati a?
elfogadható vivőanyagával együtt. Egy előnyös megvalósítási forma szerint, a szövetbe Src-speeiSkus tirozín kináz-gátlót adagolunk.
által a vaszkuláris permeabilitást növeli, valamint szöveti károsodást okoz a vaszkuláris szivárgás vagy az ödéma következtében. Ilyen körfolyamatok (koros epizódok) jelenthetik a vérerek traumáját, például fizikai lekötés (ligácio), blokkolás, elkülönítés, elzáródás és hasonlók következtében.
Más szisztémás körfolyamatok, például az ateroszklerőzis, a diabetikus retinabántaknak, gyulladásos megbetegedések, mikróbafertözés következtében, valamint például izületi gyulladás szintén megfelelően kezelhetők a találmány szerinti eljárással.
A találmány szerinti módszerek felhasználhatok a cereforovaszkulárfo (agy-érrendszeri) trauma kezelésére annak a szöveti károsodásnak a javításával, amely a megnövekedett vaszkuláris szivárgás és/vagy ezzel kapcsolatos ödéma következménye. Konkrétabban, a találmány szerinti módszerek alkalmasak olyan szöveti károsodások javítására, amelyek a Vaszkuláris Endoteliális Növekedési Faktor (VEGE) által indukált, Src által közvetített vaszkuláris permeabilitás-növekedéssel kapcsolatosak. Ezzel szemben a találmány szerinti módszerek nem korlátozódnak a vaszkuláris permeabílítás VEGF által indukált növekedésére, hanem felhasználhatók továbbá az Src család tirozin-kínáz-közvetítette vaszkuláris permeafoilitás-növekedés módosítására is más szabályzó szignálokra adott válaszként.
Közelebbről, az Src tirozin-kináz gátlásával (amelyet leírásunkban generikusan Src-nek nevezünk), és a vele szoros rokonságban lévő tirozin-kináz Yes gátlásával (amelyet leírásunkban genetikusán Yes-nek is nevezünk) kezelt szövetek specifikusan módosíthatók úgy, hogy azokban a vaszkuláris permeahilitásnak sérüléssel vagy betegséggel kapcsolatos növekedését gátoljuk.
A találmány céljaira megfelelő, Src családba tartozó tirozinkináz gátló egy kémiai inhibitor, amelyet a PP1, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicol R 2146 és Geldanamycín anyagok csoportjából választunk. További, az Src családba. tartozó kémiai inhibitorok mint fírozin-kínázok - szintén megfelelőek a találmány szerinti módszerek alkalmazása, során.
A szövetben a vaszkuláris permeabilitás úgy is módosítható, hogy a szövetbe olyan, Src családhoz tartozó tirozin-kináz inhibitort adagolunk, amely proteíngátlo, például inaktív Src proteint (amilyen az Src K295M vagy Src 251), vagy valamilyen inaktív Yes proteint vagy aktív c-terminális Src kináz (CSK) proteint adagolunk.
A vaszkuláris permeafoilitás módosítására szövetben továbbá olyan nukieinsav is alkalmas, amely valamilyen, az Src családhoz tartozó tirozin-kináz gátló proteint, például Inaktív Src-t., inaktív Yes vagy aktív CSK proteint kódol. Az Src családhoz tartozó tirozin-kináz aktivitás ilyen nukleinsavas gátlói egy vagy több retrovirális kifejezési vektort, nemvirálás kifejezési vektort vagy ezekhez hasonló anyagokat tartalmazhatnak. Az ilyen nukleinsavas gátlók tartalmazhatják a megfelelő szabályzó szignálokat is, például a. nukieinsav, vagy bármely adott nukieinsav egy vagy több, kifejezhető szegmentumára vonatkozó promőtereket vagy fokozó hatású egységeket is.
A. találmánynak egy még további szempontja szerint a gyártott termékek csomagolóanyagot és a csomagolóanyagon belül gyógyászati készítményt tartalmaznak, amely gyógyászati
Koros tartalmaz a vaszkuláris permeabílítás módosítására egy lévő szövetben. A csomagolóanyag címkét is feltünteti, hogy a gyógyászati készítmény yan vaszkuláris szivárgás vagy ödéma és ezzel s állapot készítmény Src családhoz tartozó tirozin-kináz gátló terápiásán hatásos mennyiségét gyógyászati szempontból elfogadható vívőanyagban tartalmazza.
Bgy találmány szerinti gyártási termék a gyógyászati készítmény részeként. Sre családba tartozó tirozin-kináz gátlót tartalmazhat, amely kémiai inhibitor. Közelebbről előnyős kémiai, az Src családba tartozó tirozin-kináz gátló választható például a
PD 162531, Radicícol R 2146 és Geldanamycin, valamint hasonló, legelőnyösebb gátló a PPL
Egy találmány szerinti gyártott termék tartalmazhat továbbá olyan, gyógyászati készítményt, amely olyan Src protein családból származó tirozin-kináz gátlót foglal magában, amely inaktív Src proteint, amilyen például az Src K29SM vagy Src 251, vagy az inaktív Yes protein, vagy aktív CSK protein.
Alternatív módon a gyógyászati készítmény tartalmazhat egy olyan sukleinsavat, amely az Src családhoz tartozó tirozin-kináz inhibitort kódolja; a gyógyászati készítményben a tirozin-kináz gátló .gyógyászati· szempontból elfogadható vívőanyagban van jelen. Egy ilyen gyógyászati készítményben az a gátló, amelyet a fenti xmkleinsav kódol, inaktív Src protein, például Src X295M vagy Src 251, inaktív Yes protein vagy aktív CSK protein lehet.
A gyártási termékek egy vagy több gyógyászati készítményt tartalmazhatnak, amelyek terápiás hatású, Src családba tartozó tirozin-kináz inhibitorokat vagy a terápiásnál kisebb mennyiségű, egynél több Src családhoz tartozó tirozin-kináz terápiásnál kisebb mennyiségeit gyógyászati szempontból elfogadható vivöanyagban
A találmány szerinti gyártási termékek gyógyászati készítményei tartalmazhatják egy vagy több, egy Src családhoz tartozó tirozin-kináz inhibitornak szubterápiásan hatásos (a terápiásnál kisebb mennyiségben, hatásos) VP módosító mennyiségét, amelyek együttesén fejtik ki a VP-csökkentő hatást a kezelt szöveten. A gyártási termék gyógyászati készítménye a kívánt módosító hatástól lúggően változtatható, és a csomagolás címkéi ennek megfelelően szintén változtathatók.
A gyártási termek gyógyászati készítménye a kívánt módosító vagy gátló hatástól függően változtatható, és a csomagolás címkéje ennek megfelelően változtatható.
A rajzok rövid leírása
Á leírás egy részét képező ábrákban látható jelzések a
Az 1. ábra csirke (baromfi) c-Src cDNS szekvenciája, amely a teljes kódoló szekvencia az mtronok törlésével, amint ezt Takeya és munkatársai leírták (Célt 32, 881-890 (1983)]. Ez a szekvencia a GenBank J00844 listaszám útján hozzáférhető. A szekvencia 1759 nukleotidot tartalmaz a proteint kódoló szakasszal, amely a
A 2, ábrában látható az 1. ábrában bemutatott csirke c-Src kódolt amlnosavmaradék-szekvenciája (SEQ ID NO: 3).
A 3. ábra humán c-Src cDNS szekvenciája, amint ezt Braeuninger és munkatársai leírták [Proc. Nati. Acad. Sci,, USA 88, 10411-10415 (1991)], Ez a szekvencia a GenBank X59932 X71157 lístaszám útján hozzáférhető, Ez a szekvencia 2187 nukieotidot tartalmaz, a proteint kódoló szakasz a 34 nukleotid helyzettel kezdődik és az 1486 helyzettel végződik (SEQ ID NO: 4).
A 4. ábra a 3. ábrában bemutatott kódoló szekvencia humán c~ kódolt aminosavmaradék-szekvencíája (SEQ ID NO: 5).
Az 5. ábra szemléleti az endogén Src bFQF vagy VEGP általi a 4.
leírása szerint.
részé egy in vitrö kináz-méres eredményeit az endogén c-Src redőzéses aktiválásával bFQF vagy VEGE által. Az ábra alsó része egy kinázmérés biot elemzése egy anti-Src antitesttel szondázva, amely terheléses kontroll ekvivalens Src és IgG tartalom számára,
A 6. ábra szemlélteti a c-Src A retrovírus által közvetített génexpressziőjának a hatását az angiogenézisre a csirke CAM vizsgálatban a 4. példa leírása szerint. Kilenc napos csibék CAMjeit RCAS-Src A hatásának tettük ki (aktív, mutált c-Src) vagy kontroll RCAS-DF.F hatásának tettük ki (zöld, fluoreszkáló protein; fluoreszcens índukátor protein), vagy retrovírusokkal vagy pufferral szemben exponáltuk 72 órán át Az angiongenézis mértékét a 6A, ábrában bemutatott módon kvantífíkáltuk minden megfelelő kezelést sztereomikroszkőppal vettünk fel.
A 7, ábra szemlélteti a c-Src retroviráks expresszíóját a vaszkuláris MAP kináz foszforílezés aktiválásában.
A 7A, ábra 10 napos csirke CAM szövetkivonatait mutatja, amelyeket VEGF-nak vagy PAM-nak a hatása aha helyeztük (exponáltuk) 30 percig, vagy c-Src A reírovírussal fertőztünk 48 órán át. Az f!NT” jelzés jelentése: kezelés nélkül. Az Src-t immunpreclpitációval lecsaptuk teljes proteinkivonat egyenértékű mennyiségeiből, és in vitro immunkomplex-kináz mérést végeztünk FAK-GST fúziós protein, mint szubszírátum
A fenti teljes szöveti lízátumok alikvotfait szintén mértük az endogén ERK foszforilezés szempontjából immun-blot analízissel egy anti-foszfo-ERK antitest segítségével
A 7B. ábra 10 napos CAM-okat mutat, amelyeket vagy utánzóit RCAS-val vagy SRC Á-t tartalmazó RCAS-val fertőztünk. Két nap múlva a CAM-okat feldaraboltuk, fagyasztással OCT-ban tartósítottuk, és 4 pm vastagságú metszetekre daraboltuk. Ezeket a metszeteket antí-íoszforílezett ERK antitesttel immunfestettük (New England Bxolabs.), mostuk és egy kecske-anti-nyxil FITCképeket egy hüt.őtt~CCD kamerán vettük fel
A 8. ábra szemlélteti a szelektív követelményt az Src aktivitása számára a VEGE által indukált - azonban bFGE által nem indukált - angíogenezis során.
Kilenc napos csibék CAM-jeit exponáltuk RCAS-Src 251-vel vagy kontroll RCAS-GFP retrovírusokkal vagy puffénál szemben 20 órán áf, majd további 72 órán át inkubáltuk bFGE vagy VEGF jelenlétében, vagy távollétében. Az angíogenezis szintjét (mértékét), a 8A, ábra szerint kvantífikáltuk, mint fentebb leírtuk, és reprezentatív mikrofotográfiákat (6 x) vettünk fel egy sztereomikroszkóppal, amint ezt a 8B, ábra mutatja. A 8.C. ábra biot analízist mutat, amelyet egy antl-RSC antitesttel szondáztunk, hogy igazoljuk az Src 251 kifejeződését transzfektált sejtekben, utánzóit (üres) kezelésekkel összehasonlítva.
A 9. ábra szemlélteti az RCA-S-Src 251 humán daganatokon végbemenő retrovirális felszabadulásának eredményeit A 9A. ábra mikrofénykep, amely mutatja az RCAS-GFP (RCAS-zöldszínü fiuoreszcenclás protein! tehénével fertőzött humán medulloblasztőma tumor fragmentumot; amely kizárólag a daganat véredényeiben kialakuló GPP-t fejezi ki (a nyilak, hegye irányában), amint ezt optikai metszéssel egy Bio Rád lézer pásztázó mikroszkóppal kimutatható (az oszlop 500 gm méretű). A 9B. ábra feltünteti olyan tumorok adatait, amelyeket retrovírus helyi alkalmazásával kezeltünk, amelyeket 3 vagy 6 napig hagytunk növekedni, majd felkoncoltuk, és nedves tömegüket meghatároztuk. Az adatokat úgy fejeztük ki, mint a daganat tömegében mutatkozó átlagos változást (5Ö mg induló tömegű tumorból) (+/- SEM, két ismétlésben). A 9C. ábra reprezentatív mikrofényképeken mutat medulloblasztőma tumorokat, amelyeket sebészi úton távolítottunk el embriókból (az oszlop hossza 350
Az alsó képek minden egyes tumor nagy nagyítással készített képei, amelyek mutatják a tumorok erezetét részletekben (az oszlop mérete 350 pm). A nyílhegy a véredény töredezését, mutatja RCAS-Src 251 által kezelt daganatokban.
A 10. ábra diagramm, amely az RCASDP (RCAS) vektorszerkezet resztrikcíós térképét szemlélteti (SEQ ID NO: I).
A 11. ábra mutatja az emberi c~¥es proteint kódoló cDNS nukleinsav szekvenciáját. /SEQ ID No.8/,.
A 12. ábra mutatja a humán c-Yes proteint kódoló cDNS nukleinsav szekvenciáját.
Ez a szekvencia a GenBank Ml5990 listaszám útján, elérhető. A szekvencia 4517 nukleotidot tartalmaz proteint kódoló szakasszal, amely kezdődik a 208 nukleotid-poziciőval és végződik az 1839 pozícióval, majd transzláció következik a 11. ábrában
A 13. ábra az Src 251 és CSK retrovlrális átvitelének az eredményeit mutatja rágcsáló (egér) szubkután érképződési modelljén. A 13A. ábra szemlélteti az immun-blot analízis eredményeit az fik expresszíőjának a kimutatásában. A 13B. ábra egy mérésből származó immun-blot analízis eredményeit mutatja, a fik számára a VEGF és bFGF által stimulált körülmények kozott. A 13C. ábra grafikon, amely a CD34 pozitív véredények, számát három kísérletben megfigyelt random mezők átlaga (20 x) formájában a VEGF és bFGF által stimulált kezeléssel GFP, Src 251. vagy CSK. retrovírus jelenlétében ábrázolja.
A 14. ábra egy módosított Míles-mérés eredményeit mutatja a VEGF vagy VP vonatkozásában egerek bőrén, amelyek Src, fyn és Yes szempontjából hiányosak. A 14A. ábra kezelt fülek fényképsorozata. A 14B. ábra különböző, hiányos egerek stímulálási eredményeinek a -grafikonjait mutatja, A 14C. ábra mutatja a kezelés által élűéit Evans-kék festék mennyiségét.
A 15. ábra olyan grafikon, amely szemlélteti infarktus relatív méretét Src +/-, Sre vad típusú (WT), és PP1 kezelt vad típusú egereken. A PP1 kezelés 1,5 xng/kg-testtömeg mértéket jelent.
A 16, ábra kontroll- és PP1 -kezelt, egéragyak egymást követő MRI letapogatásának az eredményeit mutatja, és szemlélteti, hogy a PP 1-val kezelt állatnak (jobboldalon) kisebb méretű az agyinfarktusa, mint a kontrollállaté (baloldalon).
Az alábbiakban, a találmányt részletesen ismertetjük.
Aminosav, amely egv polipeptid kémiai elbontásánál, (hidrolízise során) alakul ki a polipeptid kapcsolatainak (peptidkőtésemek) a helyén. A leírásunkban szereplő aminosavmaradékok előnyösen az ”1/ izomer formában vannak; azonban a ”D” izomer alakú maradékok behelyettesíthetők bármelyik L-aminosavmaradék helyére mindaddig, amíg a kívánt funkciós tulajdonságait a polipeptid megtartja. Az egy polipeptid amino-végződésén jelenlévő, szabad aminocsoportra vonatkozik. COOH a polipeptid karboxil-végződésén jelenlévő, szabad karboxilcsoportra vonatkozik. Ennek során megtartottuk a standard polipeptid nevezéktant [leírása megtalálható a következő helyen; d. Bioi. Chem. 243, 3552-3559 (1969); és elfogadták a következő helyen: 37 CFR paragrafus 1, 822 (b) (2)].
Megjegyezzük, hogy a leírásunkban bemutatott valamennyi arnínosavmaradék-szekveneíát olyan képletek ábrázolják, amelyek bal.-, illetve jobb-irányú orientációja az amíno-végzödésnek a karhoz!!-végződéshez viszonyított, konvencionális irányában van. Megjegyezzük továbbá, hogy egy amino savmaradék-szekvencia kezdeténél vagy végénél lévő kötőjel peptidkötést jelez egy vagy több amino savmaradékból álló, további szekvencia irányában.
Aminosavmaradékok lineáris sorozatát jelenti, amelyek egymáshoz peptidkotésekket kapcsolódnak az alfa-amlnocsoport és a szomszédos aminosavmaradékok karboxilcsoportja között,
Peptid ζ4
Leírásunkban nem több, mint körülbelül 50 amin.osavmaradék lineáris sorozatát jelenti, amelyek egymással ugyanúgy kapcsolódnak, mint egy polípeptidben.
a megjelölés olyan v heteroatomos gyűrűszerkezettel rendel amidkötést tartalmaz, mint amilyen egy vonatkozik, amelyek , amely több olyan susos pepiidben van. A j-farok szerint eiklizált is peptíd N-végzödése amidkötést képezett egy lineáris peptíd C végződésén lévő karbímlcsoporital; vagy tartalmazhat egy gyűrűs szerkezetet, amelyben a polimer heterodetikus, és a gyűrű zárásához szükséges amidkötéseket és/'vagy más kötéseket tartalmaz; .ilyen, kötések például: a díszulfíd-hídak, tioészterek, tioamidok.
- es
Több, mint 50 ammosavmaradékböl álló lineáris sorozat, amelynek tagjai egymáshoz ugyanúgy kapcsolódnak, mint egy polípeptidben.
Fúziós protein
Olyan polípeptid, amely legalább két különböző polipeptidterűletei (polipeptidtartományt) tartalmaz, amelyeket műveletíleg kapcsolunk tipikus peptidkötéssel ('fuzionálunk”), s ahol a két tartomány olyan peptideknek felel meg, amely a természetben fuzionálva nem. található.
Szintetikus pepiid
Aminosavmaradékok kémiailag előállított lánca, amelynek tagjai pepíádkotésekkel kapcsolódnak egymáshoz, s amely
9^ és azok fragmentumaitól ö proteinektől mentes.
B. Általános megfontolások
A találmány átlalánosan vonatkozik a következőkre: (1) arra a felfedzésre (felismerésre), hogy a VEGF-índukálta. VP-t az Src és Yes tirozin-kináz proteinek specifikusan közvetítik, továbbá a VP mind aktív, mind inaktív Src vagy Yes proteinekkel (proteinek íználásával módosíthatók az érképződés potencírozása, illetve sói; (2) arra a további felfedezésre, hogy a vaszkuláris (érrendszeri) szivárgás és/vagy ödéma - amely a traumával együtt jár ·· a sérüléssel kapcsolatos vaszkuláris permeabilitás-nővekedés káros állapota specifikusan módosítható és javítható az Src család tirozin-kináz aktivitásának a gátlása útján; és (3) arra a felismerésre, hogy egy Src családhoz tartozó tirozin-kináz gátló csökkenti a vaszkuláris permeabilitás betegség vagy sérülés következtében kialakuló szöveti károsodását, amely a vaszkuláris permeabilitás növekedésével kapcsolatos, és amely nem áll
Ez a felismerés lényeges azon szerep miatt, amelyet a vaszkuláris permeabilitás látszik számos
ilyamalban, továbbá az él közelebbről üj vérerek kialakulásával kapcsolatban. egy k< állapottal kapcsolatban álló szövetek a szöveti szükséges érképződést igényeinek, akkor kívánatos az éi gátlása, valamint ezen az úton a megbetegedett szövet szaporodásának a gátlása. Az érképzödés hatékonyabban gátolható, ha egyidejűleg a VP-t. is gátoljuk. Ha a károsodott (sérült) szövet a szövet szaporodásához és gyógyulásához érképződést igényel, akkor kívánatos a VP potencírozása (potenciálása) és így az érképződés elősegítése, valamint ezáltal a szövet gyógyulásának és szaporodásának, az előmozdítása.
na az uj vérérén novekedese a beteg szövettel kapcsolatos körfolyamat oka vagy abban része van, akkor a VP gátlása, és ezáltal az érképződés gátlása csökkenteni fogja a betegség káros hatásait. Az érképződéssel együttjáró VP gátlásával a betegség menetébe avatkozhatunk, tüneteit javíthatjuk, és bizonyos esetekben a betegséget meggyógyíthatjuk.
Egyes esetekben a megnövekedett VP kívánatos a mgyszerhatőanyag célbajuttatása eredményességének a növelése szisztémás adagolás útján, A vér-agy-gá.t olyan fogalom, ennek alapján még kis molekulájú gyógyszerhatóanyagok is minimális mértékben lépnek a keringésből az agyba. Az a
lehetőség (képesség), hogy szelektíven és módosíthatjuk a vér-agy-gát permeabilitását a szereplő vérerek VP-értékének a módosítása útján, lehetővé teszi olyan gyógyszerhatóanyagok adagolását, amelyek egyébként nem ' “ mek képesek a keringés során az agyszövetekbe jutni, számos sztrök (agyérmegbetegedés) által indukált kórfolyamatos és károsodást vált ki a VP gyors növekedése, és ennek alapján a VP specifikus módosításának a új és hatásos kezeléseket tesz lehetővé sztrők káros Cí
A találmány szerinti módszerek részben azért, hatásosak,
biológiai folyamatokban nem hat.
A találmány részben arra a felismerésre vonatkozik, hogy a tirozín- kináz Src protein az érképződést közvetíti,- valamint, az érképződés módosítható akár aktív, akár inaktív Src proteinek alkalmazásával az érképződés potencírozása, illetve gátlása
Ez a felismerés lényeges, mivel az érképződés új vérerek kialakulásában, és különböző kóros folyamatok során.
szövetek a szövet Iára erkepzodést igényelnek, akkor kívánatos az érképződés gátlása, és ezáltal a megbetegedett szövet szövet a iván, dítása, és a gatiasa. Ha a kan növekedés és gyógyulás céljára kívánatos az érk· ezáltal a szövet gyógyulásának és szaporodásának az elő Ha az új vérerek növekedése a áros
részé van, a érképződés gátlása útján beavatkozhatunk a megbetegedésbe, javíthatjuk a tüneteit, és egyes esetekben a betegséget
Ilyen betegséggel és újraereződéssel. (neovaszkularizáciőval) kapcsolatos szövetek példái, amelyek jótékonyan alkalmazhatók az érképződés gátló módosításával, például: a reumatoid ízületi gyulladás, diabetikus reünabántalom, gyulladásos betegségek, visszaszűkulés (resztenőzis) és ezekhez hasonló kóros állapotok. Ha a kívánalom új vérerek növekedése a károsodott szövet gyarapodásának az elősegítése céljából, akkor az érk és e
hozzájárulhat a szövet tömegének a csökkentéséhez, amelynek fa a vérellátás követelményeEnnek példái lehetnek: tumorok növekedése, ahol a neovaszkularizáciő folytonos igény arra a célra, hogy a tumor vastagságában néhány milliméterrel megnőjön, továbbá szilárd daganatáttételek kialakulásának a kívánalma.
Ha fennáll az a vélemény, hogy az űj vérerek növekedése a szöveti .gyógyuláshoz- hozzájárni, akkor az érképződés poteneírozása segítségül szolgálhat a -gyógyulásban. Ilyen esetekre példák: betegek kezelése iszkémiás végtagjaikon, ahol a keringés a végtagokban diabetikus vagy más körülmények következtében •gyenge. Figyelembe vehetők továbbá krónikus sebekkel -sújtott betegek, akik nem -gyógyulnak, és ennél fogva a vaszkuláris sejtszaporodás erősödéséből és a neovaszkularízácíóböl előnyük
A találmány szerinti eljárások (módszerek) hatásosak: részben azért, mert a terápia az érképzödés szempontjából nagyon szelektív, más biológiai tolyamatok szempont] ahol azonban nem. Amint előzőleg közölték, az érképződés számos zamatot tartalmaz, amelyek közé tartozik egy szövet neovas ye a az ér képződését vagy az ér megnagyobbodását: valamennyi ilyen érképződési folyamatra hatást gyakorol az Src protein., A baleseti sebek gyógyulása, valamint a sárgatestképződés és embriogenézis kivételével nézetünk szerint az érképződési folyamatok többsége kóros folyamatokkal kapcsolatos, és ezáltal a találmány szerinti
nem v
A találmány egy része arra a felismerésre is vonatkozik, hogy a vaszkuláris szivárgás és/vagy ödéma - amely a. traumával, és a sérülés okozta. vaszkuláris permeabilifás-növekedésssel kapcsolatban áll ~ specifikusan módosítható és javítható az Src családhoz tartozó tírozin-kináz aktivitás gátlása útján. Közelebbről a találmány arra a felismerésre is vonatkozik, hogy egy Src családhoz tartozó tírozin-kináz. gátló in vívó· adagolása csökkenti azt a. szöveti károsodást, amely a vaszkuláris permeahilítás betegség- vagy sérülés-okozta növekedésének a következménye, és amely rákbetegséggel vagy érképződéssel nincsen kapcsolatban.
Míg egy Src családhoz tartozó tirozin-kínáz gátló adagolása módosítja a VEGF-kiváltotta VP-növekedést, addig az Src családhoz tartozó kináz aktivitásának specifikus gátlása javítja a vaszkuláris szivárgás által és/vagy ödéma által a környező szövetekben okozott károsodást; azonban az Src családhoz tartozó kináz szignálja aktiválódik.
játszik szerepet, amelyek az érképződés bármely számos sztrők által kiváltott es Károsodást idéz elő a VP hirtelen növekedése amely a véreret ért trauma következménye - és ennek, alapján a VP specifikus módosításának a képessége lehetővé teszi olyan új és hatásos kezelések kidolgozását, amelyek csökkentik a sztrők káros
Ilyen szövetekkel kapcsolatos körfolyamatok vagy sérülések által előidézett vaszkuláris szivárgás, és/vagy ödéma például a következők, amelyek egy Src családhoz tartozó kináz gátló alkalmazásával specifikus gátló módosítást alkalmazhatunk: a reumatoid izületi gyulladás. diabetikus os oeregsegeK, vísszaszúkűlés tresztenőzis) es ez«
Az agyvelot vagy gerincvelőt ért trauma és más, általában ózott cerebrovaszkuláris kórfolyamatok a neurológiai megbetegedések és kapcsolatos károsodások legtöbb okai. Az agyi ödéma vagy az ilyen sérülésekből származó vaszkuláris szivárgás életveszélyes körfolyamatok, amelyek szisztémás és szóródó károsodást váltanak ki az agyvelőben. és gerincvelőben (központi idegrendszer, röviden CMS), és az a képesség, hogy ilyen esetekben a vaszkuláris szivárgás és ödéma szövetkárosito hatásait specifikusan módosíthatjuk, rendkívül hasznos A CNS fertőzései, agy] éke olyan káros patológiás elő), mint például az ágid <
márnát kezelése kiegészíthető
&
£>' agyvelőgyulladás folyamatot eredményezhet ikus terápiával, amely a vaszkuláris szivárgás vagy ödéma csökkentésére irányul.
Közölték, hogy VEGE protein szisztémás közömbösítése, egy
VÉGF receptor IgG fúziós protein csökkenti az- agyi iszkémiát követő infarktus méretét; ezt a hatást a VEGE által közvetített vaszkuláris permeabílítás-csókkentésnek tulajdonsították (N, van Bruggen és munkatársai; J. Clin, Invest. 104, 1613-1620 (1999)), Azonban a VEGE a vaszkuláris permeabilitásnak nem kritikus jellegű közvetítője; felismertük, hogy az Src ez a kritikus jellegű közvetítő.
További betegségek és kóros állapotok - ahol a vaszkuláris permeabilitás Src által közvetített növekedése szerepet játszik, s amelyek ennek következtében alkalmas célpontok a találmány szerinti készítmények és kezelési eljárások számára - például a következek; agyi hemorrágia, agyi és gerincagyi trauma, hipoxia által előidézett agyi vagy gerincvelői károsodások; a CNS gyulladásos megbetegedései; vitális vagy bakteriális fertőzések (például agyhártyagyulladás, HÍV által előidézett agyvelőbántalmak), autoimmun megbetegedések (például a sclerosis multiplex): olyan betegségek, amelyek a vér-agy- gát permeabiiitásánák krónikus növekedésével járnak (például az Alzheimer-kőr); sebészi eljárások, ahol a perfűzió vagy a szövet oxigénezése átmeneti károsodást szenved (itt a találmány szerinti ágens védő hatású anyag); felnőttek légzési rendellenességeinek (légúti rendellenességeinek) a tünetcsoportja (röviden: ARDS); reumatoid izületi gyulladás; és a diabetikus retinahántalmak..
C.
Az Src családhoz tartozó tirozin-kináz proteinek A találmány szerinti alkalmazásra megfelelő· tirozín-1 protein alapvetően a célzott felhasználástól függ. Az Src protein vagy Src” elnevezéseket olyan értelemben használjuk, hogy azok a leírásban közölt, tirozin-kináz Src protein különböző formáira együttesen, vonatkoznak, továbbá ezek aktív vagy inaktív formáira is vonatkoznak, xá Yes protein vagy Yes” elnevezéseket olyan értelemben használjuk, ahogyan azok a leírásunkban közölt tirozin-kináz Yes protein különböző formáinak együttesen megfelelnek, és azok mind aktív, mind ínaktív formáira vonatkoznak. Továbbá, a leírással kapcsolatban hivatkozunk az Sre-t vagy Yes-t kódoló nukleinsav genetikai szekvenciájára vagy génjeire. Az Src család megjelölés a tírozin-kinázok olyan, csoportjára vonatkozik, amelyek funkciójuk és amino-
savszekvenciaj uk: alapjan az brc-vel vannak rokonságban Az aktív Src protein elnevezés az Src különböző vona , amelyek az erkepzödest vagy a v iilitást poteneirozzák. Az aktív Yes protein ss a protein különféle formáira vonatkozik, amelyek a VP-t potencírozzák. Leírásunkban mérési módszereket közlünk az ;s vagy vaszkul? értékelésére, ezek azonban nem tekinthetők korlátozó jellegűnek. Egy proteint akkor tekintünk aktívnak, ha az érképződés vagy VP legalább 10%-kal nagyobb, előnyösen 25%-kal magasabb, és még előnyösebben 50%-kal magasabb, mint egy olyan kontrollsziní, amelynek esetében a mérőrendszerhez nem adtunk proteint.
Az érképzödés potencírozásának mérésére előnyös módszer a im mérömódszer, amelynek során RCAS virusvektort amint ezt a példákban leírjuk, ahol az angiogén indexet elágazási pontok számlálásával számítottuk,
A VP po
-OS i a mérőmódszer, aminek során Evans-kék festéket alkalmazunk egereken, amint ezt a példákban közöljük, ahol a VP-t a vérerekből kiszivárgott Evans-kék festék mennyiségével mérjük.
Egy előnyös aktív Src vagy Yes protein tirozin-kináz aktivitást is mutat. Aktív Src és Yes proteineket közlünk a példákban; ezek közé tartozik az Src-A és Yes-1.
Az inaktív Src protein az Src protein bármilyen, különböző formáira vonatkozik, amelyek az érképződést vagy a vaszkuláris permeabilitást gátolják. Egy inaktív Yes protein elnevezés a Yes protein bármilyen formájára vonatkozik, amely a VP-t gt Leírásunkban mérőmődszereket írunk le a VP növel k mérésére, ezek az eljárások azonban nem Egy Src proteint akkor tekintünk inaktívnak, ha az ;s szintje legalább 10%-kal, előnyösen 25%-kal, még előnyösebben 50%-kal kisebb (alacsonyabb), mint az a
kontrollsz-int, amelynek esetében a mérőrendszerhez nem adtunk exogén SRC proteint.
Egy Src vagy Yes proteint akkor tekintünk inaktívnak, ha a VP szintje legalább azonos, vagy 10%-kaí alacsonyabb,
25%-kai alacsonyabb, és még előnyőse!
mint egy olyan kontrollszint, amelynek esetében a mérőrendszerhez exogén Src-t vagy Yes-t nem adtunk.
Az érképződés gátlásának mérésére előnyős módszer a CAM mérőmódszer, aminek során RCAS virális vektort alkalmazunk, amint ezt a példákban leírtuk, ahol elágazási po: számlálásával számítottuk ki az analógén meresere os ser a mer során egereken - amint ezt a példákban közöljük - aminek során a VP-1 a véredényből kiszivárgott Evans-kék festék mennyiségével méxjük.
Egy előnyös inaktív Src vagy Yes protein szintén csökkent tirozin-kináz aktivitást mutat. Inaktív Src proteineket a próbákban közlünk, ilyenek például az Sre-25! és Sre K295M.
A talál
Src különböző módszerekkel állítható elő, ilyen módszerek például: izolálása természetes forrásokból, így például szövetekből, előállítás rekombináns DNS expressziójával (kifejezésével); valamint tisztítás és ezekhez hasonló módszerek. Az Src és/vagy Yes protein ”in sítü' (helyben) is létrehozható olyan génterápiás rendszernek az
Src vagy Yes proteint kódoló gén többféle, irodalomból ismert módszerrel előállítható, és a találmány ebben a vonatkozásban nem tekinthető korlátozó jellegűnek. így például az Src eredetének
X vírusoktól és hasonló speciesektől származó homológokat tartalmaz; továbbá a gén könnyen klónozható cDNS-klónoző módszerekkel bármely szövetből, amely a proteint kifejezi (expresszálja).* A találmányban való alkalmazás szempontjából előnyös Src egy sejtprotein (cellulárís protein), például az emlősöktől vagy madaraktól származó homológok., amelyeket csrc-nek nevezünk. Különösen előnyös a humán c-src, A találmányban való alkalmazásra előnyös Yes egy humán amely all. ábrában bemutatott aminosavszekvenciát kódolja. A •11. ábrában látható Yes-1 proteint a. 12. ábrában bemutatott nukleinsavszekvencia egyik szegmentuma kódolja, és ezt mind. kódoló tartományú szegmentumot azonosítjuk (nevezzük).
D.
Az Src, illetve Yes protein expressziójára (kifejezésére) alkalmazható rekombináns DNS molekulák és expressziós (kifejezési) rendszerek
A találmányban számos nukleotíd szekvenciát írunk le, amelyek különösen kedvezően alkalmazhatók a találmányban.
Ezen szekvenciák között vannak olyanok, amelyek egy a 'találmánv’· szempontjából alkalmazható Src proteint kódolnak; és különböző DNS szegmentumok, rekombináns DNS (rDNS) molekulák és vektorok, amelyeket az Src fehérje expresszíójára szerkesztettünk. Ezek között a szekvenciák között továbbá olyanok vannak, amelyek a találmányban alkalmazható Yes proteint kódolnak, és különböző DNS szegmentumok, rekombináns DNS (rDNS) molekulák és vektorok, amelyeket a Yes protein
Ennek alapján a találmány szerinti DNS molekulák (szegmentumok) tartalmazhatnak olyan szekvenciákat, amelyek teljes szerkezeti géneket, szerkezeti gének töredékeit, gének kombinációját, vagy - alábbiakban leírt - transzkripciós egységeket tartalmazhatnak.
Előnyös DNS szegmentum egy olyan nukleotidszekvencta, amely Src vagy Yes proteint, vagy mind a kettőt, vagy ezek biológiailag aktív fragmentumát kódolja a leírásunkban adott definíció szerint.
Egy előnyős DNS szegmentum olyan amínosavmaradékszekvenciát kódol, amely lényegében ugyanaz - és előnyösen lényegében abból áll ·· mint egy ammosavmaradék-szekvencia. vagy annak szakaszai, amelyek leírásunkban közölt Src vágj? Yes proteinnek megfelelők. Reprezentatív és előnyös DNS szegmentumokat továbbá a példákban közlünk.
Egy protein vagy egy polípeptid amínosavmaradékszekvenciája közvetlen kapcsolatban áll a genetikai köd útján annak a szerkezeti génnek, a dezoxiríhonuklemsav (DNS) szekvenciájával, amely a proteint kódolja. .Ennek alapján egy szerkezeti gén vagy DNS szegmentum az amínosavrnaradékszekvencíával. azaz azzal a proteinnel vagy polípeptiddel definiálható, amelynek kódolásáért felelős (amelyet kódol),
A genetikai kőd jól ismert és fontos sajátsága a redundanciája. Ez annyit jelent, hogy a proteinek felépítésére alkalmazott legtöbb amínosavat egynél több kódoló nukleotidtripleft (kodon) kódolhatja vagy megjelölhet egv különleges amínosavmaradékot, Ennek következtében különböző nukleotld36 szekvenciák kódolhatnák egy adott aminosavmaradékszekvenciát. As ilyen nukleotidszekveneiákat funkcionális szempontból egyenértékűeknek tekinthetjük, mivel valamennyi szervezetben azonos aminosavmaradéksze'kvencia kialakulását eredményezik. Egyes esetekben egy adott nnkleofídszekveneiába egy purín vagy pirimídin metilezett változata beépíthető; azonban az ilyen metüezés a kódolási viszonylatokat semmi módon sem
Nukieinsav bármely polinukleotid vagy nukleinsavfragmentum, akár políríbonukleotid, akár poíidezoxínnkleotid. azaz RNS, vagy DNS, vagy ezek analógjai. Az előnyös megvalósítási az alakjában., azaz DNS szegmentum alakjában van jelen; jóllehet bizonyos molekuláris egyfonalas DNS vagy RNS (MTOiai « módszerek ms.
számos módszerrel, és az
- különösen, klónozással vagy polimeráz-láncreakcióval - (PCR) állíthatók elő. Olyan DNS szegmentumok, amelyek Src protein szakaszait (részeit) kódolják, kémiai módszerekkel könnyen szintetizálhatok, például Matteucci és munkatársai (J. Am, Chem. Soc, 103, 3185-3191 (1981}) foszfotríészteres módszerével vagy automatizált szintetikus módszerek segítségével. Továbbá nagyobb méretű DNS szegmentumok előállíthatok jól ismert módszerekkel, így oligonukleotidok olyan csoportjának a szintézisével, amelyek a DNS szegmentumot definiálják, majd ezt követő hibridizálással, és •az olÍgonukleotidok ligáciöjával (lefűzésével), aminek útján, komplett szegmentum alakul ki. Alternatív módszerek például: előnyös DNS szegmentum elkülönítése polimeráz-láncreakcióval primer oligonukleotídpárokkal, amelyeket cDNS könyvtár útján alkalmazunk, s amelyek vélhetően, olyan tagokat tartalmaznak, amelyek Src proteint kódolnak.
Nyilvánvaló kémiai szintézis útján bármilyen kívánt módosítás megtehető, egyszerűen úgy, hogy megfelelő bázisokat helyettesítünk azoknak a bázisoknak a helyére, amelyek a natív aminosavmaradékszekvenciát kódolják. Ez a módszer jól ismert, és könnyen alkalmazható a leírásunkban szereplő különböző módosított Src proteinek előállítására.
Továbbá olyan DNS szegmentumok, amelyek lényegében Src vagy Yes proteint kódoló szerkezeti, génekből állnak, ezt követően módosíthatók, részben célheíyre irányított, részben random (véletlenszerű) muíagenezissel, s így bármilyen kívánt helyettesítés megvalósítható (bevezethető).
1. Src vagy7 Yes gén klónozása
Egy találmány szerinti Src vagy Yes gén megfelelő DNS genom forrásból, vagy messenger RNS fmRNS) forrásból számos biokémiai módszerrel klónozható. Ezeknek a généknek, a klónozása a példákban leírt általános eljárások útján, valamint irodalomban ismert más módszerekkel végrehajtható.
A találmány szerinti eljárásokban alkalmazható Src vagy Yes gén klónozására alkalmas nukleinsavforrások például: a genomDNS vagy a messenger RNS egy cDNS könyvtár alakjában, olyan szövetből, amely vélhetően ezeket a proteineket kifejezi. Előnyös szövet a humán túdőszövet, jóllehet bármilyen más alkalmas szövet is használható.
Egy előnyős klónozása módszer abban áll, hogy standard módszerek alkalmazásával cDNS könyvtárat állítunk elő, és az Src-kődoló vagy Yes-ködoló nukleoíidszekvenciát polímeráz38 láncreakció útján, párosított oligonukleotid alkalmazásával, a leírásunkban megadott nukleotidszekveneiák
Egy más úton a kívánt cDNS klánok azonosíthatók és y cDNS vagy genom könyvtárból a szokásos nukleinsav-hibridizálási módszerekkel, a leírásunkban nukleinsavszekvencíákon alapuló hibridizációs szonda felhasználásával. Az izolálás további módszerei., valamint az- Srcvagy Yes-ködoló nukleinsavak célszerű klónozás! módszerei a jártas személy számára nyilvánvalók.
2. Génátvitel {transzfer) és/va,gv expressziós vektorok
A találmány figyelembe veszi rekombináns DNS molekula (rDNS) felhasználását, amely a leírásunkban közölt Src proteint vagy Yes proteint vagy mindkettőt kódoló DNS szegmentumot tartalmaz. Egy kifejezhető rDNS előállítható operatív úton úgy, hogy egy vektort kapcsolunk egy Src-t vagy Yes-t kódoló, találmány szerinti DNS-szegmentummal. Ennek következtében egy rekombináns DNS molekula olyan hibrid DNS molekula, amely legalább két nukleinsavat tartalmaz olyan nukleotidszekvenciákből, amely normális körülmények között a természetben együtt nem találhatok.
Annak a vektornak a kiválasztása, amelyhez a találmány szerinti DNS szegmentumot művelettel (operatíven) kapcsoljuk, mint jól Ismert az irodalomból - a kívánt funkcionális tulajdonságoktól, például a protein expressziójától és az átalakítani kívánt gazdasejttől függ. A rekombináns DNS molekulák szerkesztésére vonatkozóan általános megfontolások érvényesek. A találmány szempontjából figyelembe vett vektor legalább a replíkáciö irányítására, és előnyösen az expresszió és) irányítására is képes egy olyan szerkezeti gén esetében, amely a vektor-DNS szegmentumaiban foglaltatik, amelyhez operatív úton kapcsoltuk.
Ha egy expressziős vektor mind expresszionálís (kifejezhető) src, mind yes nuklemsavszekvenciát tartalmaz, akkor mindkét gén azonos szabályzó elemekkel szabályozható az szabályzó elemek áltál.
Mind prokarióta, mind eukariőfa expressziós vektorok ismeretesek a vektorszerkesztés területén tapasztalt személy számára; ezek leírása megtalálható a következő helyen: Ausebel és munkatársai: (Current Protocols ín Molecular Biology, Wiiey and Sons, New York (1993); és Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manuál, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)1. Ezek az irodalmi idézetek számos általános rekom bináris
DNS módszert írnak le, amelyekre leírásunkban, hivatkozunk.
Az egyik megvalósítási forma szerint, a találmányban figyelembe vett egyik vektor egy prokarióta repiikon, azaz olyan DNS szekvencia, amely képes a rekombínáns DNS molekula közvetlen autonóm replikációjára és fenntartására extraszóm an gazdasejtben, például baktérium-gazt transzformálva van.
ilyen replikonok az irodalomból jől ismertek. Továbbá, olyan, megvalósítási formák, amelyek prokarióta replikont tartalmaznak, egy olyan gént is magukban foglalnak, amelynek expressziója az általuk transzformált baktérium-gazdasejtnek győgyszerrezisztenciát (gyógyszerhatóanyagokkal szemben fennálló ellenállást) kölcsönöz.
Általában baktériumos gyógyszer-ellenállással rendelkeznek olyan gének, amelyek ampicíllinnel vagy tetraciklinnel szemben rezisztenciát kölcsönöznek.
Olyan vektorok, amelyek prokarióta replikán! tartalmaznak, továbbá prokarióta promótert is magukban foglalhatnak, amely képes az expresszié (transzkripció és transzláció) irányítására egy szerkezeti gén esetében egy baktérium-gazdasejtben, például
E.coli-ban, amellyel transzformálva van. A promőter egy expresszíős szabályzó elem, amelyet egy DNS szekvencia képez, amely lehetővé teszi az RNS polímeráz kötődésének és transzkripciójának a lejátszódását. A baktérium-gazdasejtekkel összeférhető (összeegyeztethető) promőter szekvenciák általában olyan piazmid vektorokban állnak rendelkezésre, amelyek megfelelő restrikciós helyeket tartalmaznak egy találmány szerinti DNS szegmentum: beillesztésére. Ilyen típusú vektorplazmidok: pVCS, pUC-9, pBR322 és pBR329, amelyek a Biorad Laboratories (Richmond, CA) cégtől beszerezhetők; a pRSET, amely az Invitrogen (San Diego, CA) cégtől beszerezhető; valamint a pPL és pKK223, .amely a Pharmacia, N. J. cégtől beszerezhető.
Az eukariőta sejtekkel, előnyösen gerincesek sejtjeivel összeegyeztethető expresszién vektorok szintén felhasználhatók a találmány szerinti rekombínáns DNS molekulák kialakítására. Az eukariőta sejtekkel összeegyeztethető expressziős vektorok az irodalomból jól ismertek, és több kereskedelmi forrásból beszerezhetők. Az ilyen vektorok általában célszerű restrikciós helyeket tartalmaznak a kívánt DNS szegmentum beillesztésére. Ilyen vektortípusok például: pSvL és pKSV-10 (Pharmacia), pBPVI/pML2d (International Bíotechnologies, Inc.), pTDTI (ATCC, # 31255), pRc/CMV (Invitrogen, Inc.), továbbá a példákban leírt előnyös vektor, és a fentiekhez hasonló eukariőta expressziős vektorok.
A találmány vonatkozásában különösen előnyös génexpresszios rendszer agy génszállító komponenst tartalmaz, amely képes a gén eljuttatására a célszóvetbe. Megfelelő vektorok a fertőző” vektorok, így például rekombináns DNS-vírusok, adenovírus vagy retrovírus vektorok, amelyeket géntechnológiai úton úgy alakítunk, hogy kifejezzék a kívánt proteint, és olyan sajátságokkal ruházunk fel, amelyek előre megválasztott célszövetek fertőzését lehetővé teszik.
Különösen. előnyös a replikáoiöban kompetens madárszarköma vírus (RCAS), amelyet a leírásunkban, közlünk.
Emlős sejtrendszerek, amelyek rekombináns vírusokat vagy víruselemekef hasznosítanak a dírekt expresszié céljára, géntechnológiai úton szintén kialakíthatók. így például, ha adenovírus-expresszÍGS vektorokat alkalmazunk, akkor egy pobpeptíd kódoló szekvenciáját, összekapcsolhatjuk egy adenovírus transzkripciós/transzlációs szabályzó komplexével, például a kései promótorek és három részes (tripartite) vezérszekvenciával. Ezt a kimer gént az adenovírus genomba ijeszthetjük in vitro, vagy in vivő rekombináció útján. A vírus genomjának nem-esszenciális tartományába (például az El vagy E3 tartományba) való beillesztés olyan rekombináns vírust fog eredményezni, amely életképes és a pobpeptíd expressziójára képes fertőzött gazdaállatokban [lásd például: Logan és munkatársai: Proc. Matt Acad. Sci., USA 81, 3655-3559 (1984)}. Alternatív módon a vaocinía vírus 7. 5K promőter alkalmazható lásd például: Mackett és munkatársai: Proc. Matt Acad. Sci., USA 79, 7415-7419 (1982);
munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sex., USA 79, 4927-4931 (1982)]
Különös érdekességnek a szarv vírusra
replikációjára [Sarver és
soman vext munkatársai: Mól, Cell. Biok X 486 (1981))
Röviddel ezen DNS célsejtekbe való belépése után, a plazmxd sejtenként körülbelül 100-200 másolatban replikálódik. A nem igényli a plazmid gazdasejt kromoszómájába, és az expresszió magas szintjét teszi lehetővé. Ezek a vektorok stabilis expressziőra alkalmasak egy szelektálható marker késével - így
Kíuaul a neogén beépítés
Alternatív módon a retrovirális genom módosítható a gs <an polípeptidet kódoló nukleotid szekvencia expressziójának bevezetésére és irányítására [Cone és munkatársai; Proc. Kati. Acad. Scí. USA 81, 6349-8353 (1934)). A magas színtű expresszíő elérhető továbbá indukálható promőterek alkalmazásával is, ezek között metallotíonin ΠΑ promóterrel és hősokk-promöterekkel is (ez azonban nem jelent korlátozást).
Újabban tanulmányozták a eytomegalovírus (CMV) promőter hosszú időtartamú túlélését a Rous szarkóma vírus (RSV) promóter-indukálta timídm-kináz (TK) génterápiával szemben csupasz egereken, amelyek emberi petefészekrákot hordoztak. Úgy találták, hogy az adenovírussal közvetített CMV promóterrel elősegített herpes simplex vírus TK génterápia 2-10-szer hatékonyabb, mint a Rous szarkóma vírus által [Tong és munkatársai;: Hybridoma 18, 93-9' továbbá kimer primóterek tervezését is génterápiás alkalmazások
céljára, amelyek alacsony szintű expressziot idéznek elő, amelyet követ az indukálható, magas szintű expresszié [Suzuki és munkatársai: Humán Gene Therapv 7, 1883-1893 (1996)].
A hosszú időtartamú rekombínáns proteinek magas hozamú termelése céljából a stabilis expressziő előnyös. Az expressziós vektorok alkalmazásánál, amelyek replikációja vírus eredetű, előnyösebb a gazdasejtek: transzformálása olyan cDNS-vél, amelyek megfelelő expressziós szabályzó elemekkel [például promöter és fokozó (erősítő) szekvenciákkal, transzkripciós termmátorokkal, poliadenilező helyekkel] kontrollálták, valamint válaszható markerrel vannak ellátva. Amint fentebb említettük, a szelektálható markét a rekombínáns plazmidban rezisztenciát kölcsönöz a szelekcióval szemben, és lehetővé teszi a sejtek stabilis integrálódását - a piazmid stabilis integrálódását - a sejtek kromoszómáiba és olyan középpontok szaporítására, amelyek sejttörzsekbe (sejtvonalakba) klónozhatok és kiterjeszthetők.
így például az idegen DNS bevezetését követően, a géntechnológiával alakított sejteket szaporodni hagyhatjuk 1~2 napon át dúsított táptalajon, és utána a sejteket egy szelektív közegbe visszük át. Többféle szelekciós rendszert alkalmazhatunk, ezek között a herpes simplex vírusból származó timidín-kmázf (ez azonban nem jelent korlátozást) [Wigler és munkatársai: Cell 11, 223 (1977)], hipoxantin-guanin-foszforíbozil-transzferázt [Szybalska és munkatársai; Proc. Natl. Acad. Sci., USA 48, 2026 (1962)], és az adenin-foszfoFihözil-transzferáz fbowv és munkatársai: Cell
A. .·'
22, 817 (1980)] géneket, amelyek a tk-, hgtrt vagy aprt· sejtekben alkalmazhatók, Továbbá, az antimetabolít-reziszteneiát kölcsönző gének felhasználhatok a szelekció alapjaként is; így például a dhfr számára lényeges gének - amelyek a metotrexát elleni rezisztenciát munkatársai; Proc. Nati. Acad Sci.,
3567 (1980); O'Hare és munkatársai: Proc. Kati. Acad. Sci., USA 78, 1527 (1981)]; gpt, amely a mikofenolsav elleni rezisztenciát biztosítja (Mullígan és munkatársai; Proc. Natl. Acad. Sci., USA 78, 2072 (1981)); neo, amely az amínoglikozid G-418 elleni rezisztenciát kölcsönzi [Colberre-Garapín és munkatársai: d. Mól. Bioi. 150, 1 (1981)]; és a hygro, amely a higromicínnel szemben való rezisztenciát biztosítja (Santerre és munkatársai: Gene 80, 147 (1984)]. Újabban további szelektálható géneket írtak le, nevezetesen a. trpB gént, amely lehetővé teszi, hogy a sejtek tríptofán helyett indölt hasznosítsanak; a hisD, amely képessé teszi a sejteket arra, hogy hiszíidín helyett hisztínolt hasznosítsanak (Hartman és munkatársai: Proc. Natl. Acad, Sci,, USA 85, 804 (1988)); és ODC (ornítin-dekarbo.xiláz), amely rezisztenciát kölcsönöz az ornitin-dekarboxiláz-gátlő hatású 2(dífluormetil)-DL-ornitinnel (röviden: DPMO) [McConlogue L.,: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory szer., (1987)].
A humán génterápia szempontjából figyelembe vehető fő vektorok retrovirálís eredetnek [Wilson, 1997, Clin.
Immunoi. l.ö7(Sup. .1):31 -32; Bank és munkatársai: 1996, Bioessavs 18(12):999-1007; Robbins és munkatársai: 1998,
Pharmacol. Theu_8ö( 1):35-47), A gén-transzfer és az antíszensz terápia gyógyászati potenciálja serkentette számos vektorrendszer kifejlesztését különböző szövetek kezelésének céljára [érrendszeri szempontok: Stephan és munkatársai: 1997, Pandám, din,
Pharmacol._11(2):97-110: Peldman és munkatársai: 1997,
Cardiovasc. Res.„35(3);391-404; Vassallí és munkatársai: 1997, Cardiovasc. Rés.„35(3):459~69; Baek és munkatársai: 1998, Círc.
Rés, 82(3):295-3GS; ktdney, Iáén és munkatársai: 1997, .Kidney Int, Suppl.... 61:885-8; liver, Ferry és munkatársai: 1998, Hűm Gene Ther._9(14): 1975-81; muscle, Marshall és munkatársai: 1998, Curr. Gpn. Génét. Dev, 8(3):360-5}. Ezeken a szöveteken a daganat, másrészt az ezzel kapcsolatban álló szövetek, szempontjából [Runnenbauxrp 1997, Antícancer Rés. 17(4B);28'87~90; Spear és munkatársai: 1998, J. Neurovírol. 4(2):133-47}.
Az alábbiakban specifikus példákat írunk le olyan, virális génterápiás vektorrendszerekre, amelyek a találmány szerinti módszerekben (eljárásokban) való alkalmazásra adaptálhatók (Federspiel és Hugres: Methods in Cell Bíol. 52, 179-213 (1993)], amely részletesen leírja a madarak leüközís vírusát (ALV), retrovirus családját (Federspiel és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci.. USA, 93:4931 (1.996); Federspiel és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci.. USA, 91:11241 (1994)]. Retrovirálís vektorokat többek között ALV-t és egér leukémia-vírusát (MLVj közli Swohoda (Gene 20ö. 153-163 (1998)}.
Módosított retrovirálís/adenovirális expressziós rendszerek könnyen adaptálhatók a találmány szerinti megvalósítására. így például az egér leukémia-vírus-rend.szereit közleményben foglalták össze Karavanas és munkatársai (Crit, Rév. in Oneoiogy/Hematology 23, 7~3ö (1998}]. Az adenovirus-expresszíős rendszereket áttekintette (Von Seggem és Nemerow in Gene Expression Systems (ed. Fernandez & Hoeffler, Academic Press, San Diego, CA, 1999, chapter 5,
112-157}
4ö
Kimutatták, hogy protein-expressziós rendszerek mind in vivő, mind in vitro körülmények között hatékonyan alkalmazhatók. így például leírtait [Carew és munkatársai; Am. J.
vírust felhasználtak géntranszferre az idegrendszerben [Goins és munkatársai; J. Heurovirol. 3, (1. kiég.) SSO (1997)], Szilárd tumorokon megvizsgáltak célzott, önpusztító vektorokat HSV-TK alkalmazásával [Smiley és munkatársai: 1997, Ham. Gene Ther. 8(8):965-77). Hibrid vektorokat dolgoztak ki a transzfektálás időtartamának megnyújtására, ezek között HSV/AAV (adenoasszociált vírus) hibridek céljára, májsejtek kezelésére [Fraefel és munkatársai: 1997, Mól. Med, 3(12):813-825)). A herpes símplex típusú vektort rák-génterápiára alkalmazták vastagbélkarcínöma sejtjein [Yoon és munkatársai: 1998, Ann. Surg. 228(3):366-74).
A vaccinia vírust széles genomja alapján fejlesztették ki humán génterápia céljára [Peplinski és munkatársai: 1998, Surg. Oncol, Clin. N. Ám. 7(3):575-88]. Leírták, hogy tímidin-kinázzal törölt vaccinia vírus, amely puxdn-nukleozid-piroíoszforilázt fejez ki, tumorra célzott génterápiás vektorként alkalmazható [Puhlman és munkatársai: 1999, Humán Gene Therapy 10:649657],
Közöltök, hogy az adeno-asszociált 2. vírus (AÁV) humán génterápiában alkalmazható., azonban az AAV segítő vírust igényei (például adenovírust vagy herpes vírust igényel) az optimális replikádé céljára és emlős sejtekben történő csomagolás számára
1997,
Nephrol 5(6):514-20: Rabinowitz és munkatársai: 1998, Curr. Opn. Biotechnot 9(5):470-5). Azonban leírták, hogy -egy fertőző rekombináns AAV in vitro csomagolása ezt a rendszert ígéretesebbé teszi [Ding és munkatársai: 1997, Gene Therapy 4:1167-11.72). Kimutatták, hogy az ekotróp retrovírus receptor cDNS AAV által közvetített átvitele lehetővé teszi kialakult és primer humán sejtek .retrovlrális ekotróp átvezetését [Qing és munkatársai; 1997, d. Viro-logy 71.(7):5663:5667). Kimutatták, hogy rák génterápiás alkalmazhatóságát humán vad típusú p53-f kifejező AAV vektort [Qazilbash és munkatársai: 1997, Gene Therapy 4:675-682]. Továbbá kimutatták a vaszkuláris sejtekre irányuló géntranszfert AAV vektorok alkalmazásával [Maeda és munkatársai: 1997, Cardiovasculai' Rés. 35:514-521].
Kimutatták, hogy az AAV megfelelő vektor a májra irányuló génterápia számára [Xiao és munkatársai: 1998, J. Vírol. 72(12):10222-6]. Igazolták, hogy AAV vektorok felhasználhatók agyszövéfek génterápiájában és a központi idegrendszer
ÍChamberün. és munkatársai: 1998, Braín.
793(1-2); 169-75; During és munkatársai: 1998, Gene Therapy '?]. Áz AAV vektorokat továbbá összehasonlították rektorokkal (ÁdV) a tüdő génterápiája szempontjából és humán cisztás fibrózis hámsejtjeire való átvitel szempontjából [Teramoto és munkatársai: 1998, d. Vírol. 7í
Kimer AdV/' retro virális génterápiás vektorrendszerek egyesítik minden egyes vírus hasznos sajátságait, és ezáltal egy nemintegratív AdV-t alkotnak, amely funkcionálisan kiegészítő jellegűvé válik a retrovlrális termelő sejt közbenső generációja által [Peng és munkatársai; 1997, Nat. Biotechnology 15(9):866Ό; Bilbao és munkatársai; 1997, FASEB d 11(8):624-34]. Ezt az
iyes uj génterápiás, vektorgenerációt adaptálták, célzott rákgénterápia céljára [Bilbao és munkatársai: 1998, Adv. Exp. Med. 451:365-74], Az ÁdV-t kifejező p53 egyszeri injekciója emberi prosztata ráksejtek szubkután tumorcsomóinak' a növekedését fAsgari és munkatársai: 1997, Int. 3. Cancer 71(3):377-82]. A vadtípusú p53 AdV által közvetített .génátvitelt leírták olyan betegek esetében, akik előrehaladott nem-kissejtes tüdőrákban szenvedtek [Sehuler és munkatársai: 1.998, Humán Gene Therapy 9:2075-2082], Ugyanez a rák volt a tárgya egy p53 génhelyettesítő, AdV vektorok által közvetített terápiának (Roth és munkatársai: 1998, Sémin. Oncol 25(3 Suppl 8):33-7]. A p53 AdV által közvetített génátvitele gátolja az endoteliális sejtdifferenciálódást és vérképződést in vivő körülmények között [Riccíoni és munkatársai: 1998, Gene Ther. 5-(6):747-54 Továbbá közölték a gp75 melanóma antigén adenovírus t közvetített expresszioját, mint immunterápiát áttételes melanóma esetében [Hirschowitz és munkatársai: 1998, Gene 5:975-983]. Az AdV megkönnyíti humán sejtek fertőzését valamint. megnöveli refrovirális fertőzés
hatékonyságát [Scott-Taylor és munkatársai: 1998, Gene 'Ther. 5(5):621-91. AdV vektorokat felhasználtak génátvitelre vaszknláris simaizomsejtekre [Li és munkatársai: 1997, Chín. Med. d. (Engl) 110(12):950-4, sqnamous cell carcinoma cells (Goebel és munkatársai: 1998, Otolarynol Head Neck Surg 119(4):331-6), esophageal cancer cells (Senmaru és munkatársai: 1998, Int, d. Cancer 78(3):366--71), mesangial cells (Nahman és munkatársai: 1998, J. Investig. Med. 46(5):204-9), glial cells (Chen és munkatársai: 1998, Cancer Rés. 58(16):3504-7), and Co the joints of animals (Ikeda és munkatársai: 1998, J. Rheumatol.
25(9):1666-73]
Újabban
perikardíálís génátvitel lehetőségét, amelyet AcV vektorok közvetítenek ]March és munkatársai: 1999, Clín. Cardiol. 22(1
Suppl 1):12.3-9]. Az AdV rendszernek megfelelő szabályzó genetikai elemekkel végzett manipulációja lehetővé teszi az AdV által közvetített, szabályozhatóan célzott génexpressziot in vivő körülmények között (Búréin és munkatársai; 1999, PNAS (USA) 96(2):355-60].
Kidolgoztak alfavírus vektorokat humán génterápiás alkalmazások céljára úgy, hogy transzformálásra alkalmas sejttörzseket csomagoltak expresszíós készletekbe (kazettákba), amelyek alkalmasak Sindbis vírussal és Semliki Forest vírusból származó vektorokkal együttes felhasználásra [Polo és munkatársai: 1999, Proc, Natl. Acad, Sci., USA, 96:4598-4603].
.Kidolgoztak továbbá nemcitopátiás fiavivírus replikon RNS-re alapozott rendszereket is (Varnavski és munkatársai, 1999, Virology 255(2):366-75]. Önpusztító HSV-TK gént tartalmazó sinbis vírus vektorokat alkalmaztak sejt-specifikusan végzett célzásra daganatsejtekbe [llijima és munkatársai: 1998, Int. J, Cancer 80(1):110-8].
szintén ígéreteseknek mutatkoznak génterápiás vektorok céljára [Trobridge és munkatársai: 1998, Humán Gene Therapy 9:25172525). Habzó vírus vektorait tervezték az önpusztító génnel végzett terápia céljára (Nestler és munkatársai, 1997, Gene Ther. 4(11): 1270-7], A rekombináns egér-cytomegalovirus és promóter rendszereket is felhasználták vektorokként magas szintű expresszié céljára [Mannixxg és munkatársai, 1.998, 3, Viroi
Meth. 73( 1):31-9; Tong és munkatársai, 1998, Hybridoma 18(1):93-7].
A nem-osztődő sejtekbe irányuló génátvitel lehetővé vált a Sendai vírusra alapozott vektorok képzésével ÍNakanishi és munkatársai; d. Controlled Release 54, 61-68 (1998)].
További törekvések során, amikor a nem-osztódé szomatikus sejtek transzformálására törekedtek, a lentivirális vektorokat vizsgálták. Á císztás fibrőzls génterápiáját írták le replíkációhíányos humán im.munhiány-vírusra (HÍV) alapozott vektor alkalmazásával [Goldman és munkatársai: Humán Gene Therapy 8, 2261-2268 (1997)]. Kimutatták továbbá a májba és izomzatba lentivirális vektorok által eljuttatott gének tartós expresszióját (Kafrí és munkatársai: Génét. 17, 314-317 (1997)]. Azonban a biztonsági szempontokat mindenképpen figyelembe kell venni, és a javított, vektornak a kifejlesztése gyorsan folyik (Kim és munkatársai, 1998, J. Viroi. 72(2):994-1004), A HÍV UTR és Tat vizsgálata fontos információt nyújt a genom szerveződéséről a vektorok, fejlesztésére [Sadaie és munkatársai, 1998, J. Med. Viroi. 54(2):118-28]. Ennek alapján egy effekfív HfV-alapú vektor genetikai követelményeit most már jobban értjük [Gasmi és munkatársai, 1999, J. Viroi. 73(3):1828-34]. Önmagukat inaktiváló vektorokat és kondicionálta! csomagolt sejttörzseket közöltek [így például: Zuffery és munkatársai, 1998, J. Viroi, 72(12):9873-80; Míyoshí és munkatársai, 1998, J. Viroi. 72(10):8150-7; Dűli és munkatársai, 1998, J. Viroi. 72(11):846371; és Kául és munkatársai, 1998, Vlrology 249(1):167-74]. Efficíent transduction of humán lymphocyt.es and CD34+ cells hy HÍV vectors has been shown. (Douglas és munkatársai, 1999, Hűm.. Gene. Ther. 10(6);935~45; Miyoshi és munkatársai, 1999,
Science 283 (5402):682-6]. Nemosztódo humán sejtek hatásos transzdukciöját a macskafélék immrmhíány-virusa által; olyan lentivirális vektorokat írtak le. amelyek minimálissá teszik a biztonsági veszélyeket, amelyek a HÍV alapú vektorok alkalmazásával járnak [Poeschla és munkatársai, 1998, Natúré Medícíne 4(3):354-357( Kimutatták továbbá az emberi vérben lévő agymagvú sejtek jó hozamú fertőzését F1V vektorok által [Johnston és munkatársai: 3. Virol, 78, 2491-2498 {1999)],
Jóllehet számos virális vektor kezelése nehéz, és a iránti kapacitása korlátozott, ezeknek a korlátozásoknak és hátrányoknak a kiküszöbölése megkezdődött.
azon. túlmenően, hogy egyszerűsítették a sejtvom vírusból szármázó xnmi-vir;
simplex 1 vírus típus (HSV-I) es Epstexn-Barr vírust (bíávj kifejlesztettek a genetikai anyag manipulációjának az egyszerűsítése és virális vektorok képzése céljából fWang. és munkatársai, 1996, 3. Virology 70.(12) :8422-8430]. Előzőleg igazolták, hogy adapter (adaptáló) piazmidok. egyszerűsítik az idegen DNS beillesztését, segítő sejtektől független retrovirális vektorokba [1987, 3. Víroíogy 61(10):3004-3012].
A virális vektorok nem. az egyedüli eszközök a génterápia számos nemvírális vektort is leírt
Kimutatták, hogy az epidermális szaporodási faktor/DNS poliplex (EGP/DNS) alkalmazására alapozott, célzott, nemvírális génszállító (génátvívő) vektor hatékony és specifikus génátviteli eredményez [Crístiano, 1998, Antícancer Rés. 18:3241-3246). Közölték az- érrendszer és CNS génterápiáját kationos üposzómák alkalmazásával [Yang és munkatársai, 1997, 3. Neurotrauma
14(5):281-97]. .Hasnyál-mirigygyulladás átmeneti génterápiáját szintén megvalósították katíonos liposzőmák felhasználásával [Denham és munkatársai, 1998, Ann. Surg. 227(6):812-20]. Kimutatták továbbá kitozán-alapú vektor/'DNS komplexek hatásosságát a génátvitelben [Brbacher és munkatársai, 1998, Pharm. Rés. 15(9):1332-9]. Egy terplex rendszerre alapozott, nernvírális DNS-szállííó vektort is leírtak (Kim és munkatársai, 1998, 53(1-3):175-82]. Továbbá vírusszemcsékkel bevont liposzómakomplexeket is felhasználtak génátvitel megvalósítására [Hiraí és munkatársai, 1997, Biochem. Biophys. Rés. Commun. 241(1):112-8).
Közölték timi din -kináz gént kódoló nem vitális T7 vektor közvetlenül daganatba adott injekciójával végzett génterápiát is (Chen és munkatársai, 1998, Humán Gene Therapy 9:729-7361A piazmid DNS előállítása a génátvítel közvetlen injekcióval végzett megvalósítása szempontjából lényeges (Horn és íiíuuitvcttcuam, ííuíu. ucuc iiící.
befecskendezés, céljára [Hartíkka és munkatársai, 1996, Hűm Gene Ther. 7(10):1205-17).
Jelenleg tehát a génátvitel/génterápiás vektorok és szerkezetek, (szerkesztett egységek) széles és változatos kőre ismert az irodalomban. Ezek' a vektorok könnyen adaptálhatók a találmány szerinti módszerekben való alkalmazásra. A megfelelő manipulációval, rekombináns DNS/molekuláris biológiai technológia (géntechnológia) alkalmazásával - amelynek útján operatívan kapcsolt Src vagy Yes, vagy mindkettő (akár aktív, akár inaktív formában) - számos egyenértékű vektor képezhető a találmány gyakorlati kivitelezése céljára.
Ε.,
Módszerek a vaszkuláris permeabilitás (VP) módosítására
A találmány módszert nyújt vérerek vaszkuláris permeabílításának a módosítására &gy szövetben, amely kapcsolatban áll egy körfolyamattal vagy kóros állapottal, és •ennek következtében olyan történéseket vált ki a szövetben, amelyek a VP-töl függenek. Általában ez a módszer abban áll, hogy a szövetbe, amely a kóros állapottal vagy körfolyamattal kapcsolatban áll, olyan, készítményt adagolunk, amely tartalmazza; egy Src vagy Yes protein, vagy ezek keverékének a VP'-mődosítő mennyiségét; vagy egy nukleinsav vektor VPmódosítö mennyiségét, amely aktív vagy inaktív Src-t. vagy Yes-t vagy mindkettőt kifejezi; vagy egy Src családba tartozó tirozinkináz-gátló, így például egy kémiai Src-gátló, egy Src protein-gátló vagy Src nukleínsav-gátlő VP-módosítö mennyiségét tartalmazza , a találmány szerinti módszereknek megfelelően.
Amint leírásunkban közöltük, bármilyen szövet vagy szervezett szövetekből álló szerv lehet a vaszkuláris permeabilitás helye kóros állapotokban, például az agyban, bőrben, izomzatban, kötőszövetben, Ízületekben, csontokban és hasonló szövetekben, amelyekben, vérerek vannak.
A találmány szerint kezelt beteg számos megvalósítási formában kívánt módon egy humán beteg, bár nyilvánvaló, hogy a találmány elvei azt mutatják, hogy a találmány az összes emlősökre is érvényes, amelyek a beteg fogalmába tartozhatnak. Ebben a vonatkozásban, emlősön bármely emlős egyedet értünk, amelyen erképződéssel járó betegségekkel kapcsolatos szövetek kezelése kívánatos; ilyenek különösen a mezőgazdasági és
Mindezek alapján a találmány szerinti módszer abban áll, hogy egy betegnek egy fiziológiai szempontból elviselhető olyan készítmény terápiásán hatásos mennyiségét adagoljuk, amely Src vagy Yes proteint vagy ezek keverékét, vagy egy DNS vektort Src vagy Yes protein vagy mindkettőnek a kifejezésére, vagy Src családba tartozó tírorin-kinsz-gátlőt, például egy kémiai Srcgátlót, Src-gátlő proteint vagy Src-gátlő nukleínsavat tartalmaz.
Az Src vagy Yes protein adagolásának dózistartományai a protein alakjától és hatékonyságától függenek - amint ezt a továbbiakban leírjuk ·· és elegendő nagy mennyiségben vannak jelen a kívánt, hatás kifejtésére, hogy' a VP és VP által közvetített kórtünetek javuljanak.
Az adagnak nem szabad olyan nagynak lennie, hogy káros hasonló tünetet okozzanak.
Általában az adag a beteg korától, állapotától, nemétől és a betegség súlyosságától függően változik, és ezt a szakterületen tapasztalt személy meghatározhatja.. Az adagot bármely szövődmény esetében a felelős orvos szintén beállíthatja.
Terápiásán hatásos VP-módosító mennyiség az Src vagy Yes protein vagy ezek keverékének, vagy Src vagy Yes proteint kódoló nukleínsavnak olyan mennyisége, amely elegendő a VP mérhető mődositásának kiváltására a kezelendő szövetben, azaz a VP módosítására alkalmas mennyiség.
A VP módosulása leírásunkban közölt módszerrel, vagy' bármilyen más módszerrel mérhető, amely a területen jártas személy számára ismert. A VP 'módosulása mérhető a Miller55 mérőmődszerrel - amelyet leírásunkban közlünk - vagy bármilyen más módszerrel, amely a területen jártas személy számára ismert.
Az Src vagy Yes protein, vagy az -Src vagy Yes proteint kifejező nukieinsav vektor, vagy .mindkettő adagolható parenterálisan, injekciós úton, vagy fokozatos infúzióval hosszabb időn. át. Joli ehet a kezelendő szövet általában a testben szi sztémás adagolás útján hozzáférhető, tehát leggyakrabban a terápiás készítmények intravénás -adagolásával kezelhető, más szöveteket és szállító (átvivő) eszközöket is figyelembe veszünk, amelyek esetében fennáll annak a valószínűsége, hogy a célzott szövet tartalmazza a célzott molekulát. Ennek alapján a találmány szerinti készítmények intravénásait, iníraperitoneálisan, ixitramuszkulárísan, szubkután úton, testüregbe, franszdermálisan (bőrön át) adagolhatok; valamint perisztaltikus eszközökkel szállíthatók (átvihetők).
Az Src vagy Yes proteint tartalmazó készítmények, vagy az Src vagy Yes proteint kifejező nukieinsav vektor általában intravénásán adagolhatok, például a dózisegység injekciója útján. Az adagolási egység fogalma a találmány szerinti gyógyászati készítménnyel kapcsolatban fizikailag különálló egységekre vonatkozik, amelyek egy -egyed számára egyetlen alkalmazható, és minden egységük a hatásos előre r anyag olyan mennyiségét tartalmazza, amely számítás alapján a kívánt terápiás hatást kiváltja, és kívánt hígítószerrel van összekeverve, például vívőanyagga! vagy vehikulummal kombinációban.
Egy előnyös megvalósítási forma szerint a készítményt intravénásán, egyszeri dózissal adagoljuk. A lokalizált (helyhez kötött) adagolás közvetlen befecskendezéssel történik, vagy
anatómiailag izolált testterületek előnyének a kihasználásával a célzott szervrendszerek mikrokeringésének elkülönítésével, egy keringő rendszerben vezetett reperfúzió útján, vagy katéterre alapozott a kóros szövetekkel kapcsolatos érrendszeri célterületek átmeneti elzárására alapozott katéter útján.
A készítményeket, az adagolási formával összeegyeztethető módon, terápiásán hatásos mennyiségben adagoljuk. Az adagolandó mennyiség és az időzítés a kezelendő egyedtől, valamint a kezelendő azon rendszerének kapacitásától, ahol a hatóanyagot hasznosítani kívánjuk, továbbá a kívánt terápiás hatás mértékétől függ.
Az adagolni kívánt hatásos komponens pontos mennyiségei a praktizáló orvos megítélésére vannak bízva, tehát minden egyén számára különbözők. Ezzel szemben a szisztémás alkalmazásra használható célszerű adagolási tartományokat leírásunkban közöljük, és ezek az adagolás űtjától függenek. Az adagolásra célszerűen alkalmazható tartományok is változhatnak, azonban típusként megadhatók egy kezdeti adagolással, amelyet egy vagy több órás intervallumban ismételt adagokkal, soron következő injekciók vagy más adagolás követ. Alternatív módon számításba vehető a folyamatos Intravénás infúzió is elegendő mennyiségekben a vérkoneentrácíók fenntartására az in vivő körülmények közötti terápiára specifikált tartományokban.
Számos különböző megbetegedés van, amelyek esetében fontosnak tartják az érképződés gátlását; ilyenek az angíogén megbetegedések, közöttük (azonban korlátozás nélkül) a gyulladásos megbetegedések, így az immun és nem-immun természetű gyulladás, a krónikus izületi reuma és a pszoriázis {pikkelysömör); az erek meg nem felelő, vagy kedvezőtlen behatolásával járó megbetegedések, amilyen például a diabetikus retinabántalom, neovaszkuláris glaukóma, resztenőzis (visszaszűkúlés), kapillárisok burjánzása atero szklerotikus
és csontritkulásban; valamint a rákkal tumorok, szilárd tumoráííételek, angiofíbrömák, retrolentális fibroplázia, hemangíómák, Kaposiszarkóma és ehhez hasonló rákbetegségek, amelyek a daganat növekedéséhez új erek képződését (neovaszkularízácíót) igénylik.
Hasonlóképpen, a vaszkuláris permeabilitás az érképződés fontos komponense, és jogosan hozzák kapcsolatba káros körfolyamatokkal. így például a sztrók által kiváltott vaszkuláris kapcsolatos károsodást permeabilításnak
.Mindezek alapján, olyan módszerek, amelyekkel gátolható a vaszkuláris permeabilitás egv kóros állapottal kapcsolatban álló szövetben, javítják a betegség tüneteit, és a betegségtől függően
OgV a megnetegeaes gyógyulásához. Az ej megvalósítási formájában a találmány lehetővé teszí önmagában véve a vaszkuláris permeabilitás gátlását egy kóros állapottal kapcsolatban álló szövetben. A vaszkuláris permeabilitás mértéke egy szövetben - és ennélfogva a találmány szerinti módszerekkel elért gátlás mértéke - többféle módszerrel kiértékelhető. Ennek alapján az egyik kivitelezési forma kezelendő szövet gyulladt szövet, és a gátolni kívánt v szerint a aszkuláris stimulálás
..as es közvetített következménye. Ebben a kategóriában a módszer a VF gátlását célozza izületi gyulladásos szövetekben, például krónikus ízületi reumában szenvedő betegben, immun- vagy nem-immun58 gyulladásos szövetekben, pszoriázisos szövetben, és hasonló
Egy másik megvalósítási forma szerint a kezelni kívánt szövet egy retina-betegségben szenvedő,, például diabetikus retínahántalomhan szenvedő beteg vagy makuláris degenerációban vagy neovaszkulárís zöldhályogban szenvedő beteg retinaszövete, és a gátolandó VP annak a retínaszövetnek a vaszkuláris permeabilitása, ahol a retinaszövet neovaszkularizációja végbemegy.
A találmány szerinti módszerek különösen hatékonyak áttételek kialakulásával szemben, mert: (1) kialakulásuk egy elsődleges tumor vaszkularizációját igényli úgy, hogy az áttételes ráksejtek kiléphetnek a primer daganatból, és (2) kialakulásuk egy másodlagos helyen neovaszkularízáeíot igényel az áttételek növekedésének az elősegítésére.
tumorok ellen, valamint áttételek kialakulásának a megszüntetése céljából. A VP-gátló hatóanyag adagolását általában kemoterápia alatt vagy után végezzük, jóllehet előnyös a VP gátlása egy kemoterápiás kezelési szakasz után olyan időpontokban, amidőn a tumorszövet válaszképessé válik a toxikus támadással szemben a VP kiváltásával, amely ismét meghozza a vér utánpótlását, és a daganatszövet számára szükséges tápanyagokat. Ezen túlmenően lehetséges a vaszkuláris permeabilitást gátló módszerek alkalmazása, műtét után, amidőn a szilárd tumorokat az áttételekkel szemben megelőzés céljából eltávolították.
Amennyiben a találmány' szerinti módszerek alkalmasak a sztázisokkal kapcsolatos vaszkuláris permeábilitás sára, akkor ezek a módszerek az áttételek kialakulásának gátlására, valamint a kialakult daganatok visszafejlesztésére (regressziójára) is alkalmazhatók.
A resztenőzis vándorlásának és szaporodásának a folyamata a szövet irányában a perkután transzluminális (az ér belsejét átszelő) koszorúérplasztika helyén, ami gátolja az angíoplasztíka sikerét. A simaizomsejtek vándorlása és szaporodása a vísszaszúkúlés során a VP olyan folyamatának tekinthető, amely a találmány szerinti módszerek segítségévei gátolható. Ennek alapján a találmány továbbá a resztenőzis gátlására is irányul a vaszkuláris permeábilitás gátlása útján a találmány szerinti módszerek szerint egy betegen, az angioplasztíka műtéti eljárása után. A resztenőzis gátlása céljából az in aktivált tírozin-kinázt általában az angíoplasztika műtéti eljárása után adagolják, mivel a koszorúér fala általában 2-28 napon át, még általánosabban körülbelül a műtéti eljárás utáni első 14 napon van legjobban veszélyeztetve a visszaszűkúlés által.
A találmány szerinti módszer a vaszkuláris permeábilitás gátlására alkalmazható egy szövetben, amely egy kóros állapottal áll kapcsolatban, és ennélfogva a vaszkuláris permeahílítással kapcsolatos megbetegedések kezelésére szolgáló módszerek gyakorlati megvalósítására alkalmas; ez a módszer (eljárás) abban áll, hogy egy szövetet - amelyben vaszkuláris permeábilitás jelentkezik, vagy a szövet ennek a veszélynek ki van téve érintkezésbe hozunk egy készítménnyel, amely egy inaktivált Src és/vagy Yes protein vagy a proteint kifejezd hatásos mennyiségét tartalmazza.
fan esetekben.
pötencírozása, akkor hasznos (alkalmazható) egy aktív Src és/vagy Yes protein adagolása a szövetbe. Az adagolás útja. és időzítése hasonló a fentebb gátlás esetére leírt eljárásokhoz.
így például a találmány célozza a vér-agy -gát permeabílitásának a manipulációját is abból a célból, hogy gyógyszerhatóanyag módosíthassuk. A az agy -gát va
növekedése lehetővé teszi, hogy olyan gyógyszerhatóanyagok, amelyek normális körülmények között nem jutnak át a gáton, bejuthassanak az agyszövetbe.
Kívánatos lehet az érképződés finom módosítása a. VP~vel kapcsolatban; és ezáltal az Src protein, Yes protein vagy az Src vagy Yes proteint kódoló expresszíbilis nukleinsavak adagolása,
Az érképződés gátlása vagy potencírozása nyilvánvalóan bekövetkezik 5-7 nappal a. példa szerinti gyógyászati, készítménnyel való első ériotkeztetés után.
Hasonlóképpen a VP módosulása is bekövetkezhet hasonló időhatárok között. A. hatások rövid idővel a gyógyászati készítmény adagolás után megnyilvánulhatnak. Az idökorlátozó faktorok közé tartoznak: a szövet abszorpciójának a sebessége, a sejtbe való felvétel, a protein áthelyeződése vagy a nukleinsav transzlációja (a terápiás anyagtól függően), valamint a protein célzása. Ennek alapján a VP-módosító hatások már az adagolás időpontjától számítva 1 órán belül felléphetnek.
További vagy meghosszabbított expozíció inaktív Src és/vagy Yes proteinnel szemben szintén végrehajtható a
alkalmazásával.
tei
nagy változatossága tervezhető.
A találmány szerinti eljárás továbbá azt is magában foglalja, hogy a kóros folyamattal kapcsolatos valamilyen szövetnek vagy sérült véredénynek, vagy traumás állapotban lévő véredénynek a számára egy Src családhoz tartozó tirozin-kináz gátló készítményt adagolunk. Az Src családhoz tartozó tirozin-kináz gátló kémiai Src-gátlő, Src-gátló protein vagy Src-gátlő nukleinsav lehet.
A célszerűen alkalmazható, kémiai Src családhoz tartozó tirozin-kináz gátlók közé tartóznák (de nincsenek arra korlátozva); PP1, P.P2, PD 173955, AGL1872, PD162531, Radíelcol R2146 és a Geldanamycm.
Ezeknek a vizsgálatoknak a céljára szintetikus Srcgátlóként a PPl-t alkalmaztuk (a Biomul cégtől Pfizer lícenc alapján). PP1 az Sre-gatlók pirazolopirimídín-családjának egy tagja.
További szintetikus Src-gátlók közé tartozik: a PP2 (a Calbiochem cégtök Pfizer lícenc alapján), amely szerkezeti
Src családba tartozó kináz-aktivitást blokkolja (Hanke és munkatársai, 1996, d. Biok Chem. 271(2):695-701). További specifikus Src-kináz-gátlő például a PD 173955 [Moasser és munkatársai, 1999, Cancer Rés. 59:6145-61.52; Parké Davis], amelynek a szerkezetét is közölték. A PD 152531 [Owens és munkatársai, 2000, Mól. Bioi. Cell 11:51-64) szintén egy specifikus Src kináz-gátló [Parké Davis), azonban szerkezete az irodalom alapján nem hozzáférhető. A Geldanamycín szintén Srckináz-gátlő, és a Life Technologies cégtől beszerezhető. A
Radidcolt, amely kereskedelmi forgalomban van, különböző cégek (például a Calbiochem, EBI, Sigma) ajánlják: gombaellenes makrociklusos laktonszerkezetú. antibiotikum, amely nemspecifikus protein-tirozin-kínáz gátlóként is hat, és kimutatták, hogy az Src-kináz-aktndtást gátolja. Előnyös kémiai gátlók a. P.P1 és PP2, és a PP1 a legkedvezőbb kémiai inhibitor.
A szakterületen ismert standard mérőm ődszerek alkalmazásával további, alkalmazható Src családhoz tartozó tirozin-kináz gátlók azonosíthatók és jellemezhetők. így például elvégezték kémiai vegyületek szűrővizsgálatát az erős és szelektív gátlás szempontjából az Src vagy más tírozin-kínázok vonatkozásában, és ennek eredményeként olyan kémiai egységeket azonosítottak, amely az Src családhoz tartozó tirozinkinázok hatásos gátlóiként alkalmazhatók.
így például igazolták, hogy’' a katechinek fontos kötőelemek számos, természetes eredetű termékből eredő tirozin-kináz gátlók számára és ezeket a kötőelemeket megtalálták olyan vegyületekben, amelyeket kombinatorikus, célzott szelektálással választottak ki a c-Src szelektív gátlóiként (Maly D. 3 és munkatársai: Rombínatórikus célzással talált ligandum-egység: a hatásos szubtipus szerinti c-Src gátlók azonosítása PNAS (VSA) 97(6): 2419-2424]. A gátló vegyületeknek jelölt anyagoknak kombinatorikus kémiára alapozott szűrővizsgálata olyan egységek alkalmazásával, amelyekről ismert, hogy az Src gátlása szempontjából fontosak, hatásos és hatékony eszközt jelent az Src családhoz tartozó tirozin-kinázok más, kémiai gátlóinak az izolálására és jellemzésére.
A polipeptídeken és nukleinsavakon lévő funkciós csoportok széles tartománya lehetőséget ad a kötőelemek (kötőegységek) gondos megválasztására, és ezen az úton kombinatorikus szűrővizsgálatot végezhetünk hatásos inhibitorok, irányában. így például erre a célra különösen alkalmasak az O-metiloxim könyvtárak, mivel egy ilyen könyvtár könnyen előállítható €>es a nagy rg« beszerezhető valamelyik aldehid kondenzációjával. Az Oalkiloxim-képzés a funkciós csoportok széles körű tartományával összeegyeztethető, amelyek fiziológiai p H-értéken stabilisak (lásd Malay és munkatársai idézett közleményét).
Mint fentebb leírtuk, a célszerű, Src családhoz tartozó kináz-gáílők közé tartoznak továbbá: egy inaktív Src vagy Yes protein (vagy azok keverékének) vagy egy inaktív Src-t vagy Yes-t, vagy mindegyiket kifejező nukleínsav-vektor VF-gátló mennyisége, a További,
célszerű szerinti eljárások értelmében.
Src családhoz tartozó kináz-gátlők például·. CSK vagy egy nukleinsav vektor, amely a CSK ínaktiváló mennyiségeit fejezi, ki. a találmány szerinti eljárások értelmében.
Amint leírásunkban közöljük a szövetek vagy a szervezett szövetekből összetevődő szervek bármelyik fajtája lehet a vaszkuláris permeabilitás helye olyan koros állapotokban, amelyek az agyvelő, bőr, izom, bél, kötőszövetek, ízületek, csontok és ezekhez hasonló szöv (vérerek) vannak jelen.
A találmány szerinti módszer kívánt módon kezelhető, bár ezt ügy veret segítségével egy humán kell érteni , h ogy a elvei arra utalnak, hogy a találmány szerinti (eljárások) valamennyi emlősre hatásosak. Ennek használjuk leírásunkban a beteg” fos vonatkozásban az emlős” fogalma magában foglal bármilyen
emlős fájt, amelyeken a vaszkuláris szivárgás vagy ödémával járó szövetkárosodás kezelése kívánatos; ez különösen a mezőgazdasági és házi emlösfajtákra érvényes,
A találmányt megvalósító egyik eljárás abban áll, hogy az emlős betegnek egy olyan, fiziológiai szempontból elviselhető készítmény terápiásán hatásos mennyiségét adjuk, .amely a találmány szerinti módszerek gyakorlati megvalósításában egy kémiailag Src családhoz tartozó tirozin-kináz gátlót, vagy inaktív Src vagy Yes proteint, aktív CSK proteint, egy ilyen proteint kódoló nukleinsavat vagy ezek keverékét tartalmazza.
A kémiai Src családhoz tartozó tirozin-kináz gátlók adagolási tartománya, - például a FF1 dózisa - körülbelül 0,1 mg/testtömeg-kg és 10 mg/testtömeg-kg közötti tartományban lehet; vagy a hatóanyag (aktív ágens) gyógyszerészeti vívőanyagban való oldhatóságának határértéke lehet.
Az általános adagok előnyösen 1 mg/ testtomeg-kg-tól körülbelül 9 mg/testtomeg-kg-lg terjednek. Alacsonyabb adagok, így például 0,1 mg/testtomeg-kg-től körülbelül 1 mg/testtömegkg-ig terjedő adagok optimalizálhatok többszörös adagolás esetére, krónikusan fennálló kóros állapotok kezelésére. Akut kóros állapotok kezelésére - ha ezek. nem nagyon súlyosak, könnyen hozzáférhetők, és az adagolás útja közvetlenebb - az adag körülbelül 1 mg/testtömeg-kg-tói körülbelül 3 mg/testtömeg-kg-ig terjedhet, A károsodás súlyosságától, a károsodás helyétől, vagy az adagolás útjátöl függően körülbelül 3 mg/testtomeg-kg-tól 10 mg/testtömeg-kg-ig (vagy a hatóanyag gyógyszerészeti vívőanyagban való oldhatóságának a határértékéig) terjedő adagok alkalmazhatók, ha a. sérülés súlyos.
helye nehezen hozzáférhető, vagy ha az adagolás csak közvetett szisztémás úton végezhető.
Akut károsodás vagy7 trauma, esetén leghelyesebb a kezelést a lehető legrövidebb időn belül az epizód bekövetkezése után megkezdeni. Ezzel szemben az Src családhoz tartozó ürozín-kináz gátlók hatásos adagolása végezhető a károsodás vagy trauma megtörténte után körülbelül 48 órán belül, akut epizódok esetében. Előnyös, ha az adagolás az epizód megtörténte után körülbelül 24 órán belül, még inkább 12 órán belül és legelőnyösebben 6 órán belül megtörténik. A kezdeti károsodás után 48 órán belül végzett adagolás alkalmas lehet a további vaszkuláris szivárgásnak vagy ödémának tulajdonítható további
Ha. profílaktikus (megelőző jellegű) adagolást vei sebészi eljárással kapcsolatos vaszkuláris szivárgás vagy megelőzésére, vagy ezt hajlamosító diagnosztikai kritériumok alapján végezzük, akkor az adagolást végezhetjük bármilyen aktuális VP-novekedés előtt, vagy VP~növekedést okozó epizód során. Olyan krónikus állapot kezelésére, amelyek a VP növekedését, okozzák, és vaszkuláris szivárgással vagy ödémával járnak, az aktív, Src családhoz tartozó tírozin-kináz gátlók adagolása folytonos adagolási renddel végezhető .
Inaktív Src vágj’ Yes protein, vagy' aktív CSK protein adagolásának a tartományai a protein alakjától, hatásosságától függenek ~ amint ezt a továbbiakban le:
méretezett mennyiségek a kívánt hatás elérésére, amelynek segítségével a VP és a VP által közvetített betegségi tünetek javulnak. Az adagnak nem. szabad olyan nagynak lennie, hogy káros mellékhatásokat - például hiperviszkozitási tüneteket, tüdőodémát, szívelégtelenséget és ehhez hasonló állapotokat · Idézzen elő,
A terápiásán hatásos YP-módositö mennyiség az aktív CSK vagy inaktív Src vagy Yes protein, vagy azok keverékének, vagy egy ilyen proteint kódoló nukleinsavnak olyan mennyisége, amely megfelelő a VP mérhető módosításának előidézésére a kezelendő szövetben, azaz VP-mődosító mennyiség. A VP módosítása a leírásunkban közölt méromődszerrel vagy más, a szakterületen tapasztalt személyek számára ismert módszerrel meghatározható. A VP módosítása a Míller-mődszerrel -- amint ezt leírásunkban közöljük - vagy más, a szákterületen tapasztalt egyén számára ismert módszerekkel mérhető.
Áz adag általában a beteg korától, állapotától, nemétől és a betegség súlyosságától függ, és a szakterületen tapasztalt személy által meghatározható. Az· adagolás továbbá a felügyelő orvos által is beállítható bármilyen szövődmény fellépése esetén.
A találmány szerinti gyógyászati készítmények parenterálísan injekcióval, vagy hosszabb időn át fartő fokozatos infúzióval adagolhatok. Jóllehet a kezelendő szövet általában a testben szisztémás adagolás szempontjából hozzáférhető, és ennek következtében a kezelést leggyakrabban a gyógyászati készítmények intravénás adagolásával végezzük, más szövetek és átvivő (szállító, célbajuttató) eszközöket is figyelembe vehetünk, ha fennáll annak a valószínűsége, hogy a célzott szövet tartalmazza a célzott molekulát. Ennek alapján a találmány szerinti készítmények intravénásán, íntraperitoneálísan, íntramuszkulárisan, szubkután úton, testüregbe, transzdermálisan adagolhatok, valamint perisztaltikus eszközök útján, célba
Az intravénás adagolást például adagolási egység befecskendezésével végezzük. Az adagolási egység fogalma a találmány szerinti gyógyászati készítmények vonatkozásában fizikailag különálló egységekre vonatkozik, amelyek a beteg számára célszerű adagolási, egységet tartalmaznak, és minden egyes egység a hatóanyag előre meghatározott olyan mennyiségét tartalmazza, amely a számítás alapján a kívánt terápiás hatást kiváltja; a hatóanyag a kívánt hígítószerrel, például vivő anyaggal vagy vehikulummal előállított keverékben van.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint az aktív ágenst egyszeri adagolásban intravénásán adjuk. Á lokalizált adagolás megvalósítható közvetlen injekcióval (befecskendezéssel) vagy az anatómiai szempontból különálló részek előnyének a kiaknázásával, a célzott szervrendszerek mikrocirkulácíöjának izolálásával, cirkulációs rendszerekben történő reperfúzióvaí,
vagy a megbetegedett szövetekkel kapcsolatos, célzott vaszkuians területek átmeneti elzárására
A készítményeket az
Összeegyeztethető módon, valamint terápiásán hatásos mennyiségben adagoljuk. Az adagolandó mennyiség és az időzítés a kezelendő egyéntől, az egyén szervezeti rendszerének a hatóanyag hasznosítására alkalmas kapacitásától, valamint a kívánt terápiás hatás mértékétől függ. Az adagolandó hatóanyag pontos mennyiségei a praktizáló orvos megítélésétől függenek, és minden betegre vonatkozóan speciálisak. Ezzel szemben a szisztémás adagolásra alkalmas adagolási tartományokat a b és ezek az adagolás útjától függe
Az adagolás célszerű rendje szintén, változó, azonban típusuk a következő-:, egy kezdeti adagolást, ismételt adagok követnek egy vagy több órás időközzel, egy soron következő injekcióval, vagy más adagolás útján. Alternatív módon figyelembe- vehetők olyan folytonos Intravénás infúzió adatai, amelyek megfelelőek a vérben olyan koncentrációtartományok fenntartására, amelyek specifikusan in vivő terápiák eseteire
A találmány szerinti módszerek - amelyek egy kóros állapottal, károsodással vagy traumával kapcsolatos vaszkuláris szivárgás vágy ödéma következtében beálló szöveti károsodást a betegség tüneteit javítják (enyhítik) , és a betegségtől a megbetegedés gyógyulásában ís részük lehet. Egy a vaszkuláris permeabilitás mértéke, és ennélfogva a
Imány szerinti eljárásokkal elért gátlás mértéke többféle módszerrel kiértékelhető. A találmány szerinti különösen célszerűen sztrók vagy más cerebro vaszkuláris
amelyek a. VP károsodás által előidézett növekedésének következtében, valamint az ezt követő vaszkuláris szivárgás és/vagy ödéma következményeként a kapcsolatos szövetekben lépnek fel.
A találmány egyik megvalósítási formájában a kezelendő szövet -gyulladt szövet, és a gátolni kívánt, vaszkuláris permeabilitás a V.E-GP által közvetített stimulálás következménye. Egy ilyen típusú bántalom esetére a. találmány szerinti eljárás a VP gátlását célozza az izületi gyulladásos- szövetekben, például egy olyan betegen, aki krónikus izületi reumában szenved;
valamint immun vágj’· nem-immun, gyulladt szövetekben, pszoriázisos és ezekhez hasonló szövetekben.
Egy másik megvalósítási mód értelmében a kezelendő szövet egy beteg retina szövete, aki refínabetegségben, például diabetikus retinapátiában, makuláris degenerálődásban vagy neovaszkulárís glaukómáhan szenved, és a gátolni kívánt VP a retinaszövet vaszkuláris permeabilitása, ahol a retinaszővet neovaszkulanzaciója megy vegbe.
A találmány szerinti módszer vasz isára irányul egy szövetben, amely jár együtt, es ennél fogva tov· eljárások gyakorlati megvalósítására as vagy os az
permeahiktással kapcsolatos betegségek kezelésében, Ez az eljárás abban áll, hogy egy szövetet - amelyben a vaszkuláris permeabilítás megnövekedett» vagy fennáll annak a veszélye, hogy ez megtörténik - érintkezésbe hozunk egy olyan készítménnyel, amely egy Src családhoz tartozó tirozin-kináz gátló terápiásán hatásos mennyiségét tartalmazza.
A VP módosítása, valamint a vaszkuláris szivárgásnak és ödémának tulajdonítható szöveti károsodás javulása rövid idővel a gyógyászati készítmény adagolása után bekövetkezhet, A legtöbb terápiás hatás az adagolás utáni 3 napon belül észlelhető akut károsodás vagy trauma esetén. A krónikus adagolás hatásai általában nem ennyire nyilvánvalók.
Az időt korlátozó tényezők közé tartoznak: a szöveti abszorpció sebessége, a sejtbe végbemenő felvétel.» a protein áthelyeződése vagy nukleinsav transzlációja (a terápiától függően)» valamint a protein célzása, Ennek következtében a szöveti károsodást módosító· hatások a gátló hatóanyag adagolásától számítva 1. óra alatt bekövetkezhetnek. Az Src családhoz tartozó tirozíH-kináz gátlókkal szemben végzett további vagy meghosszabbított expozíció szintén végezhető a megfelelő körülmények alkalmazásával. Ennek alapján az ilyen paraméterek módosítása által a kívánt terápiás időhatárok
F.
Gyógyászati készítmények (általános r amelyek alkalmasak a leírásunkban közölt terápiás módszerek gyakorlati megvalósítására. A találmány szerinti gyógyászati készítmények hatóanyagként fiziológiai szempontból elviselhető vívoanyagot tartalmaznak egy Src és Yes proteinnel, vagy egy olyan vektorral együtt, amely képes Src és/vagy Yes protein kifejezésére (amint ezt közöljük), vágj- egy Src családhoz tartozó tírozin-kináz gátlót (leírásunk szerint), így például egy kémiai Srcgátlót, Src gátló proteint vagy Src gátló nukleinsavat tartalmaznak a vivöanyagban oldott vagy ált áll «gnvuu Egy előnyös megvalósítási formában a gyógyászati készítménynek nincsen immunogén hatása, ha azt terápiás céllal egy emlősnek vagy humán betegnek adagoljuk.
Az Src és Yes protein lehet aktív, inaktív, vagy ennek a kettőnek a keveréke a kívánt módosítástól függően. Az Src és Yes előnyös alakjait a fentiekben leírtuk. A CSK protein az aktív formát tartalmazza.
Leírásunkban a gyógyászati szempontból elfogadható, ''fiziológiai szempontból elviselhető és ezeknek az elnevezéseknek a nyelvtani változatait - mivel készítményekre, vívőanyagokra, hígitószerekre és reagensekre vonatkoznak - felcserélhető módon és ez azt jelenti, hogy ezek az anyagok egy emlős számára nem kívánt fiziológiai hatások, például hányinger, szédülés, émelygés és hasonló .melléktünetek kiváltása nélkül
Gyógyászati készítmény előállítása - amely benne feloldott vagy diszpergált hatóanyagokat tartalmaz - az irodalomból jól ismert, és ezt a formulázás alapján nem kell korlátoznunk. Az ilyen készítményeket általában befecskendezhető formában, folyékony oldatok vagy szuszpenziók alakjában állítjuk elő, azonban az vagy s szamara a is célszerűek, amelyeket a felhasználás előtt viszünk a megfelelő formába. A készítmény líposzőmakészítmény is lehet.
A hatóanyag segédanya^ (gyógyászati) szem nelyek és
mennyiségben vannak így
terápiás eljárásokban v segédanyag a víz, konyhasóoldat, dextróz, , etanol és ezekhez hasonló anyagok, valamint kombinációik. Kívánt esetben ezeken kívül a készítmény kis mennyiségben olyan segédanyagokat is tartalmazhat, amilyenek például a nedvesítő- vagy emulgeáloszerek, a pH-t szabályzó (puffer-) anyagok, és ezekhez hasonló anyagok, amelyek a hatóanyag hatásosságát növelik.
A találmány szerinti .gyógyászati készítmény a benne foglalt komponensek gyógyászati szempontból elfogadható sóit is 'hatja. A gyógyászati szempontból elfogadható sók közé tartoznak a sávaddicios sok (amelyek a pohpepud szabad, aminocsoportjamak az útján alakíthatók ki), amelyeket szervetlen savakkal, például sósavval vagy foszfor-savval, vagy szerves
t sók szintén származtathatók szervetlen bázisokból, nátrium-, kálium-, ammónium-, kalcium- vagy vas(ni)hídroxidből; vagy olyan szerves bázisokból, mint az izopropilamin, trimetíl-amin, 2-etilamínoetanol, hisztidin, prokain és ezekhez hasonló bázisok.
Fiziológiai szempontból elviselhető vívőanyagok az irodalomból jól ismertek, Folyékony vívőanyagként például steril vizes oldatok alkalmazhatók, amelyek a hatóanyagon és vizen kívül más anyagot nem tartalmaznak, vagy tartalmaznak: egy puffért, így nátrium-foszfátot, fiziológiai pH-érték mellett, vagy fiziológiai konyhasőoldatot, vagy mindkettőt, így például foszfáttal pufféról! konyhasőoldatot is tartalmazhatnak. Továbbá a vizes vívőanyagok egynél több pufíersót, valamint sókként nátriumvágy kálium-klörídot, dextrőzf, polietílénglíkolt és más oldott anyagokat is tartalmazhatnak,
A folyékony készítmények továbbá cseppfolyós fázisokat is tartalmazhatnak a vizen kívül vagy a víz kizárásával, ilyen folyékony fázisok például: a glicerin, növényi olajok, például a gyapotmagolaj, valamint víz/olaj emulziók.
W)
A találmány szerinti, vaszkulárís permeabihtást módosító gyógyászati ké szítmények
A találmány szerinti egyik megvalósítási fonna szerint egy gyógyászati készítmény egy Src és/vagy Yes protein vaszkulárís permeabiiítást módosító mennyiségét tartalmazza; vagy megfelelő
VÖKÍC mz, amely Src és/vagy Yes protein hatásos mennyiségét fejezi ki - általában ügy formulázva, hogy az Src, illetve Yes protein mennyisége a gyógyászati készítmény összes tömegére vonatkoztatva legalább ö, 1 tömegszázalék. A tőmegszázalék az Src vagy Yes proteinnek a összes tömegéhez viszonyított tömegaránya. így
0/1 tömeg% azt jelenti, hogy 0,1 gramm Src vagy Yes protein 100 g összes tömegű készítményre vonatkoztatva. DNS expresszlós vektorok esetében az adagolt mennyiség az expressziös vektor tulajdonságaitól, a kezelendő szövettől és ezekhez hasonló megfontolásoktól függ.
A találmány szerinti, Src családhoz tartozó tirozin-kináz:
ke
A találmány szerinti kémiai terápiás készítmények fiziológiai szempontból elviselhető vivőanyagot tartalmaznák egy Src családhoz tartozó tirozin-kináz gátlóval együtt,. amely hatóanyagként a vívoanyagban oldott vagy diszpergált állapotban van.
A találmány szerinti gyógyászati proteinkészítmények fiziológiai szempontból elviselhető vivő-anyagot tartalmaznak, hatóanyagként egy inaktív Src-vei, inaktív Yes-vel vagy aktív CSK proteinnel együtt, amely a vívoanyagban Src családhoz tartozó tírozin-kínáz gátlóként oldott vagy diszpergált állapotban van.
A találmány szerinti nukleinsavas gyógyászati készítmények fiziológiai szempontból elviselhető vívőanyagot tartalmaznak olyan nukleinsawal együtt, amely egy inaktív Src-t, inaktív Yes-t vagy aktív SCK proteint kódol, amely Src családhoz tartozó tírozin-kináz gátlóként a vívőanyagban oldott vagy diszpergált
A megfelelő Src családhoz tartozó tírozin-kináz gátlók az Src családhoz tartozó tirozin-kinázok biológiai tirozin-kinázaktivitását specifikusan gátolják. Áz egyik legalkalmasabb, Src családhoz tartozó tírozm-kmáznak primer specificitása van a pp6ögrc protein aktivitásának a gátlására, és másodlagosan gátolja a szerkezeti szempontból szorosan rokon Src családhoz tartozó tirozin-kínázokat, így a Yes proteint. Az Src családhoz tartozó, különösen célszerű tirozin-kináz gátlók közé tartozik
PD173955, AGLI872, PD162531, Radicícol P2146 és a Geldanamycin, További, alkalmas, kémiai Src családhoz tartozó tírozin-kináz gátlók az irodalomból ismert standard, vizsgáló jellemezi és
Az Sre-ben jelentkező mutációkról kimutatták, hogy stimulálás helyett a VP-t gátolják, és ezeket inaktív Src mutációknak nevezzük. Olyan proteineket, amelyek egy ilyen inhibitorakíívitást kölcsönöznek, domináns negatív Src proteineknek nevezünk, amennyiben gátolják a VP-t, beleértve az
Src endogén aktivitásából í^ésíl
VP-t, valamint a szaporodási Src aktivitást.
Ennek következtében az osíípusú c~Src bizonyos mutációi negatív dominánsként is működhetnek, tekintettél arra a képességükre, a vérerek növekedését és VP-t blokkolni
- ennek: következtében
VP-t in vivő között csökkentik. Ennélfogva más, alkalmas, az Sro családhoz tartozó tirozin-kináz gátlók közé tartozhatnak az Src és Yes protein inaktív formái, amelyek az Src vagy Yes aktivitását antagomzálm képesek, ami a célszövetben a vérerek: vaszkuláris permeabilitásának gátlását vagy' csökkenését eredményezi. Előnyös inaktív Sre protein az Sre 251. Egy· másik előnyös inaktív Src protein az Src K295M. Egy előnyős inaktív Yes proteinnek a vad típusú proteinnel összehasonlítva csökkent kínáz-aktívitása
További, Src családhoz tartozó tirozin-kináz gátlók lehetnek az antíszensz nukleinsavak, nukleins&vanalőgok, vagy proteinnukleinsavak, amelyek a célzott sejtekben az Src vagy Yes gének expressziöját gátolják. Az antíszensz molekulák lehetnek: egy terápiásán hatásos VP-módosító mennyiség, ha a fenti antíszensz nukleinsav - amely képes az Src proteint vagy’ Yes proteint kódoló mRNS-val hibridizálni · képes egy ilyen mRNS-val hibridizálni, és ennek eredményeként meggátolni az Src vagy Yes tirozin-kináz protein sejtben végbemenő expresszióját, ha azt egy célsejtbe transzfektálj'uk. A készítményben az antíszensz nukleinsav vagy rógyászaü szempontból alkalmas vívöanyaggal alkotott
Amint fentebb leírtuk, egy előnyős gátló hatású c-Src protein magában foglalja az Src 251 -et, amelyben az Src-nek csak az- első 251 ammosavkomponense van kifejezve. Ebből a szerkezetből hiányzik a teljes kináz-tartomány, ezért kinázhiányos Src proteinnek nevezzük, Egy' másik szerkezet az Src (K295M) mutáció, amelyben a lizin aminosavmaradék (295-helyzetben) metioninra cserélődött. Ez a pontmutáció a kmáz-tartományban megakadályozza az A.TP kötődését, továbbá blokkolja a kínozfüggő, vaszkuláris sejt- és daganatsejt-jelző és szaporodási funkciókat., amelyek a kináz-függó Src funkciókkal kapcsolatosak.
A pontmutációkra való tekintettel a találmányban való felhasználás céljára bármilyen mutációt figyelembe veszünk, amely a kívánt gátló hatást eredményezi. Fontolóra vesszük továbbá a fúziós protein-szerkezeteket is, amelyek a kívánt Src proteint (vagy annak mutációját vagy fragmentumát) a kifejezett aminosav-végződésekkel együtt tartalmazzák; továbbá célozzuk az antigén epitőpokat, fluoreszcens proteint vagy más ilyen proteineket vagy peptídeket, mindaddig, amíg az Src protein kívánt módosító hatása érintetlen marad.
Hasonlóképpen Src protein aktivitását gátló exogén inhibitor hozzáadása, vagy ilyen inhibitor stimulálása vagy expressziója a célzott szöveteken belül, így például CSK (C-termínális Src Kináz) is egy lehetőség az Src aktivitás gátlására. A tirozint inaktiválő Src-foszforilezés egy további eszköz a C-terminális Sro kináz negatív szabályzására, amelyet CSK-nak nevezünk (Nada és munkatársai, 1991, Natúré 351: 69-72; Okada. és munkatársai, 1991, J> Bioi. Chem. 266(36): 24249-24252). Ha a CSK. a vad típusú. Src-ben az aa527-et foszfonlezi, akkor az Src protein hatástalanná válik. Ennek alapján a CSK az· Src aktivitás hasznos és erős inhibitora, A 450 aminosavból álló humán CSK. protein szekvenciáját a P41240 listaszámmal azonosítjuk, és megtalálható a Svájci Protein-Adatbázisban. Egy humán CSK, amely az mRNS nukleinsav szekvenciát kódolja, a GenBank adatbázisban MM
A találmány egyik kiviteli alakjában, a gyógyászati készítmény egy Src, Yes és/vagy CSK proteint tartalmaz; vagy elegendő expresszíós vektort tartalmaz egy inaktív Src, Yes vagy aktív CSK protein kifejezésére, amelyet általában úgy alakítunk ki, hogy a gyógyászati készítmény teljes tömegére vonatkoztatva legalább Ö,1 tömeg% proteint tartalmazzon: például 0,1 tőmeg% jelentése: 0,1 gramm protein 100 gramm összes készítményre vonatkoztatva. Expressziös vektorok vonatkozásában az adagolt mennyiség az expressziös vektor, a kezelendő szövet tulajdonságaitól és hasonló meggondolásoktól függ. Ennek megfelelően egy' Src családhoz tartozó tírozín-kináz-gáiló hatásos mennyisége egy gyógyászati, készítményben az a mennyiség, amely az Src által szabályzóit vaszkuláris permeabilitás terápiásán, hatásos módosulását eredményezi. Bármely gyógyászati készítmény terápiás mennyisége az a mennyiség, a ' a vaszkuláris szivárgás vagy az ödémával
Általános megfontolások; a gyártási termék A csomagoló anyag” fogalmát leírásunkban olyan anyagra vonatkoztatjuk, amilyen például az üveg, műanyag, papír, fólia és ezekhez hasonló anyagok, amelyek alkalmasak egy gyógyszerészeti (gyógyászati) hatóanyag megtartására egy rögzített termékben. így például a csomagolóanyag lehet műanyag vagy üvegampulla, lemezes burkolat és hasonló konténerek, amelyek felhasználhatók egy gyógyszerészeti (gyógyászati) ágenst magában foglaló gyógyászati készítmény eltartására.
Az előnyös kiviteli formákban a csomagolóanyagon egy címke van elhelyezve, azaz kézzelfogható magyarázat, amely leírja a és az ágens
G(h)
módosító gyógyászati
A találmány olyan gyártási termékre- is irányul, amely egy címkézett tartóedényt, tartalmaz Src protein és Yes- protein keveréke terápiásán hatásos mennyiségének az eltartására. Egy gyártási termék csomagolóanyagból és gyógyászati ágensból áll, amely a csomagoló anyagon belül van.
A gyártási termékben lévő gyógyászati ágens bármely találmány szerinti készítmény, amely alkalmas Src és Yes protein szolgáltatására, és amely gyógyszerészeti szempontból elfogadható formában, van kialakítva, amint ezt leírásunkban, a megadott indikációnak megfelelően közöljük.
Ennek alapján a készítmény egy Src és Yes proteint tartalmazhat; vagy egy DNS molekulát tartalmazhat, amely képes az Src protein kifejezésére; egy DNS molekulát, amely egv Yes proteint fejez ki; vagy olyan DNS-t tartalmazhat, amely mindkét proteint kifejezi.
A gyártási termék a gyógyászati ágensnek olyan mennyiséget tartalmazza, amely elegendő a megadott indikáció szerinti kóros állapot, kezelésére, akár egy, akár több adagot, tartalmazó formában.
Az Src vagy Yes protein lehet aktív vagy inaktív, vagy' ezek keveréke, a kívánt módosítási szinttől függően. Az aktív és inaktív Src és Yes előnyös formáit fentebb leírtuk.
abban tartalmazott gyógyászati ágens alkalmazását, például olyan kóros állapotok kezelésére, amelyeket elősegít a vaszkuláris permeabilitás gátlása vagy poteneírozása, valamint a közölt kóros állapotok enyhítése. A címke továbbá instrukciókat tartalmazhat a felhasználásra vonatkozóan, és ezzel kapcsolatos információt szolgáltathat, ha ez a kereskedelmi forgalom céljából szükséges, A
a. gyógyászati ara alkalmas
Az Src családhoz tartozó tirozin-kináz-gátló készítmény: a gyártási termék
A találmány olyan, gyártási terméket is céloz, amely felcímkézett tartőedény (.konténer) egy Src családhoz tartozó tírozín-kináz-gátló terápiásán hatásos mennyiségének a szolgáltatására. Az inhibitor lehet egy csomagolt vegyszer, protein vagy Src családhoz tartozó tirozin-kínáz-gátlő protein., vagy nukleínsav, vagy azoknak egynél több tagból álló kombinációja, vagy azok keveréke. Egy gyártási termék csomagolóanyagot, valamint a csomagolóanyagon, belül tartalmazott gyógyászati ágenst foglal magában. A gyártási termék továbbá, egy gyógyászati készítményt, két vagy több szubterápíásan hatásos· mennyiséget tartalmazhat egy gyógyászati készítményből, amelyek együttvéve színergetikus hatással eredményezik a vaszkuláris szivárgásnak vagy ödémának tulajdonítható szövetkárosodás javulását.
Egy gyártási termékben lévő gyógyászati ágens lehet a találmány szerinti készítmények bármelyike, amely alkalmas egy Src családhoz tartozó· tirozín-kináz-gátlő szolgáltatására, amely gyógyszerészeti szempontból elfogadható formában van kialakítva, leírásunk szerint a közölt indikációknak megfelelően. Ennélfogva a készítmény egy gátló vegyületet, például PP1, PP2, PD 173955, AGL1872, PD 162531, Radicicol. R2146 terméket, valamint Geldanamycint tartalmazhat; valamint egy proteingátlót,, például inaktív Sre, inaktív Yes, aktív CSK proteint vagy égj? nukleinsavmolekulát tartalmazhat, amely képes egy ilyen protein vagy proteinek kombinációjának a kifejezésére. A gyártási termék egy gyógyászati hatóanyag olyan mennyiségét tartalmazza, amely megfelelő az alkalmazásra a feltüntetett kóros álk egyszeri, akár több adag alakjában.
A csomagolóanyag címkét visel, amely feltünteti az a gyógyászati ágens alkalmazását, például olyan kóros c kezelésére, amelyet enyhít a vaszkuláris permeabílítás növek· közölt
enyhítése. A címke továbbá instrukciót tartalmaz az alkalmazásra vonatkozólag, és ezzel kapcsolatos információt tartalmazhat, amelyek a kereskedelmi, forgalom szempontjából szükségesek lehetnek. A csomagolóanyag egy vagy több tartőedényt tartalm azhat a gyógyászati ágens tárolására.
pokla és természetesen nem tekinthetők a ts korlátozásának. Ezen túlmenően a találmánynak ilyen variációit, amelyek jelenleg ismertek vagy amelyeket később fedeznek fel, és amelyek a szakterületen tapasztalt személy számára ismeretein belül vannak, úgy kell tekinteni, hogy az iák szerint igényelt találmány oltalmi korén belül esnek.
r-Srr vs.crv r-Y.«s ernn»ssaióa
A. VP és az érképződés módosításában alkalmazható expressziős szerkezetek a találmány szerinti módszerekkel (eljárásokkal)· történő előállítása a c-Src cDNS-t manipuláljuk, majd e.gy expressziős szerkezetbe, illetve expressziős vektorba illesztjük.
A vad típusú (azaz endogén) csirke e~ Sre-t kódoló cDNS szekvenciát az 1. ábra mutatja (SEQ ID NO: 2) a kódolt aminosavmaradék- szekvenciával, amelyet a 2. ábra szemléltet kódolt proteinszekvencia a cDNS nukleotid-112iől az 1713 helyzetbe helyeződik át; a humán c-Src eDNS
4) nukleinsav- szekvenciájának, megfelelő r vénei át. és a kódolt aminosavmarat humán proteínszekvenciákat kódoló szekvencia a cDNS 1.34nukleotid helyzetében kezdődik, és az 1486-helyzetig tart.
Mind a vad típusú, mind számos mutált c-Src cDNS-akat előállítottuk. A mutált c-Src szerkezeteket helyre irányított mutagenézissel állítottuk elő Káplán és munkatársai leírása szerint [BMBO J. 13, 4745-4756 (1994))..
A találmány szerinti eljárásokban alkalmazható, mutált Src proteinek kódolására alkalmas, mutált c-Sre szerkezeteket Káplán és munkatársai írták le (lásd a fenti idézetet). Káplán és munkatársai különböző mutált c-Src szerkezeteket közölnek, és a találmány gyakorlati megvalósítására, alkalmazható kódolt proteineket írnak le. így például Káplán és munkatársai az 1.
számos c-Src allélnek számos termékét mutatják he, közöttük az SrcA-t és Src25I.~et is.
A találmány a c-Src szerepének két kategóriáját közli, amelyek a VP-t módosítják. Amint előzőleg részleteztük, az egyik kategóriában vannak azok az Src molekulák, amelyek a VP-t növelik, és ezáltal aktív proteineknek tekinthetők. Amint kimutattuk, találmányunkban a vad típusú Src és különböző mutációi a VP-t indukálják. A vad típusú c~Src egyik mutációja ebben az összefüggésben úgy működik, hogy képes kiváltani a véredény növekedését és a VP növekedését; ez az Src A mutáns, amelynek pontmutációja van az 527-helyzetben lévő (aaj amínosavmaradék helyzetében, mivel az 527 helyzetű tirozint fenilalanin helyettesíti. Ez a hely normális körülmények között az c-Src kináz általi negatív szabályzás helye, és ennek a neve CSK kináz. Ha a CSK az aa.527-helyzetben a vad típusú Src-ben foszforhoz, akkor a protein hatástalanná válik, Azonban a mutált Src A-ban az aa527 helyzetben a szabályzó tirozint fenilalanin helyettesíti; és így a proteinre egy szerkezetileg (azaz permanensen) aktív proteint visz át, amely a foszforilezés által történő inaktiválásnak nem tárgya.
Más, bemutatott Src mutációk ellentétes módosító hatást fejtenek ki a VP-re, és a VP~t gátolják stimulálás helyett. Az ilyen mutációkat inaktív Src mutációknak nevezzük. Azokat a proteineket, amelyeknek mutációja ezt a gátló hatást átviszi (átruházza), domináns negatív Src protein eknek is nevezzük, mível a VF-t gátolják, továbbá az endogén Src aktivitás eredményeként, valamint a megnövekedett Src aktivitás eredményeként - amely a növekedési faktor stímulálásából ered. Ennek alapján a találmány szerinti, a vad típusú e-Src bizonyos mutációi domináns negatív módon is működhetnek, tekintettel arra a képességükre, hogy blokkolják a véredény növekedését és a VP~t, és ennél fogva ín vívó körülmények között a VP~t csökkentik.
Egy ilyen előnyös, gátló hatású e-Src protein tartalmazza az Src 251~et, amelyben az Src-nek csak az első 251 amíno savmarad éka fejeződik ki. Ebből a szerkezetből hiányzik a teljes kináz-tartomány, ennek következtében kinázhíányos” Src proteinnek nevezzük. Egy másik (második) szerkezet az Src (K295M) mutáció, amelyben a 295-helyzeíű lízín aminosavmaradék metioninra cserélődött. A kinás lévő ezen pontmutáoiö megakadályozza az ATF kötődését, tov:
blokkolja a vaszkuláris sejt- és daganatsejt-jelző és szaporodási működésével kapcsolatos kináz-függő Src funkciókat.
Tekintettel a pontmutácíókra, bármely mutáció, amely a kívánt gátló vagy stimuláló aktivitást eredményezi, figyelembe vehető a találmányban való alkalmazás Src proteint (vagy m kombináló fúziós amínosav-végződésekkeí, antigén vagy más, ilyen protein vagy mindaddig, amíg az Src protein kívánt marad.
szerkezetek a reszcens szintén célozhatok módosító hatása éi így például az Src aktiváló mutációja céljára az 527-helyzetű maradékon - mindaddig, amíg az eredő mutált amlnosavmaradék nem tirozín, szerin vagy treonin - a találmány fontolóra veszi, hogy egy alternatív aminosav a kívánt helyzetben olyan Src proteint eredményez, amely a kívánt, VP-elősegíto módosító aktivitással rendelkezik.
Az Src családhoz tartozó Yes kínázt előzőleg már leírták, azonban celluláris (sejten belüli) funkciójáról csak kevés vált ismeretessé [Burck és munkatársai, 1988, The Oncogenes, Springer-Veriag, New York, pp. 133-155; Marin és munkatársai, 1985, Cell, 43:393; Semba és munkatársai, 1986, PNAS (USA) 83:5459; Shibuya és munkatársai, 1982, J. Virol. 42:143; Yoshída és munkatársai, 1985, Jpn. J. Caneer Rés. 76:559],
Az előnyös aktív humán Yes proteint a Sugekawa és munkatársai közleményében leírt nukleinsav kódolja [Moh Cell. Biok 7, 41-47 (1987)], A humán Yes protein és a Yes-t kódoló nukleinsavak inaktíváló módosításai úgy valósíthatók meg, amint azt az Src-re vonatkozóan leírtuk.
ID NO: 1), Ez az expressziós vektor a r szarkóma vírusok replikáciős sorozatán es tokozott Brvan rendelkezik; oelv normál issal es is
specifikus az A. típusú burok-glikoproteínre, madár sej teken fejeződik ki [Reviewed ín Methods ín Cell Síologv, 52:179-214 (1997); Hughes és munkatársai, 1987, J. Vírol. 61:3004-3012; Fekete & Cepko, 1993, Mól. Cellular. Biok és munkatársai, 1996
122:291-300: és Stott és munkatársai, 1998, s
24:660-666]. Az RCASBPfA). teljes szekvenciája (SE ID NO: 1) a szekvencialistában adva van, és a 10. á ennek a szerkezetnek a restrikciós térképét; ezt a szerkezetet a leírásban RCA8 rovi klónozták, hogy
Az eredeti Sre 251 s szubklónozta a NJ.H Dr. Karold Röviden az Sre cDNS s:
r egy
Varmus az expresszié céljára úgy i I-SslBl-Nem I Az Src a 3' végződésnél «‘ivet t
különleges Cla I hellyel rendelkezik. Az Src251-nek BstBl-val és Cla 1-val végzett emésztése egy BstBI-Clal fragmentumot képezett, amelyet a következőkben a Cla I helyre kötöttünk az RCASBP(AJ-n. Egy BstBI nyúlvány lehetővé teszi a kötést egy Cla 1 nyúlvánnyal, amelyet a Cla I-vel hozunk érintkezésbe.
A találmány gyakorlati kivitelezésére alkalmazható Sre szerkezetek a fenti vektorban könnyen létesíthetők ügy, hogy először az Sre 251-et tartalmazó RCAS vektort Nem 1 és Cla í-t (egy DAMA háttérben) Nem I és Cla 1-t (DAM* háttérben)anyagokkal emésztjük, ami lehetővé teszí egy emésztett Src. cDNS beillesztését.
Ennek megfelelően ezt a kezdeti amely’ az Src 251-et tartalmazza - tovább alkalmaztuk v más Src szerkezet szubklőnozására, amint a fentiekben és K< és munkatársai közleményében közölték [The EMBO J. 13, 47454756 (1994)]; az RCASBP(A) termékbe egy olyan Nem 1-Cla I fragmentum útján, amelyet az Src 251 konstrukció útján alakítottunk ki azzal a céllal, hogy- a kívánt c-Src mutációkat a cDNS-ben kialakítsuk, standard, helyre célzott mutagenezis eljárásokkal alkalmaztunk, amelyek a szakterületen jártas személvek számára jól ismertek. Terveztünk továbbá PC'L a kívánt mutáció beépítésére olyan restrikciós amelyek a soron következő klónozó lépéseket megkönnyítik. Az Src-í kódoló nuldeinsavszekvencíák teljes
szegmentumait töröltük a íiuldéinsav-szerkezetekből PCR-t bővítő technológia útján, az ismert cDNS alapján (a csirke, humán és hasonló Src homológok), ismert cDNS szekvenciái alapján, és az új szerkezetek ezt követő kialakításával.
A találmány egyik 'kiviteli formája szerint a 3’ PCR primer amelyet Src nukleinsavak bővítésére alkalmaztunk - egy kereten belüli szekvenciát is kódol. Ennek a primemek az alkalmazása egy 9E10~mye epitóp végződést ad a soron következő Src szerkezet karboxil-végzödéséhez. A következő aminosavakat az Src 251belyzetú aminosavkomponeHsek után vittük be, azzal a céllal, hogy a 9E10-myc epitóp végződést tartalmazó vektorszerkezeteket képezzük: VDMEQKLIAEEDLM (SEQ ID NO; 6), Minden egyes szerkezet esetére két különálló PCR-t végeztünk, és hasonló eredményeket kaptunk. Valamennyi PCR által szerkesztett mutáns szerkezetet PCR-vel szekvenáltunk, hogy a kiónok előre megállapított DNS szekvenciáját bizonyítsuk. Á találmány szerinti expressziős rendszerekben alkalmazható vad típusú és mutált Src cDNS-ek szintén elérhetők az Upstate Biotech Laboratories, Laké Piacid, NY cégnél, amely madaraktól származó, valamint humán Src-t, továbbá számos kináz-hiányos és aktivált, mutált formát adenovirálís vektorok is, amelyeket közöltek a 4 797 368, 5 173 414, 5 436 146, 5 589 377 és 5 670 488 számú US
l Az Src vagy Yes ára (szállítására) alkalmas alternatív módszerek ául: Src vagy Yes cDNS átvitele nem-virális vek útján, amelyet az 5 675 954 számú US szabadalomban ki valamint a cDNS szállítása önmagában meztelen (csupasz) DNSként, amelynek leírása az 5 589 466 számú US szabadalomban található. Továbbá, a találmány szerinti szerkezetek, átvitele (célbajuttatása) nem korlátozódik a vírusvektor helyi alkalmazására (felvitelére), ahogyan ezt az alább következő CAN mérőrendszerben közöljük. így például vitális vektorkészítményeket intravénáson is befecskendezhetünk az érrendszerbe irányuk) szisztémás célbajuttatásra. Az ilyen vektorok továbbá megnővekedett neovaszkularizácíős helyekre is célozhatok, például úgy, hogy az injekciót lokalizáltan a daganatba
Figyelembe vettunk továbbá in vitro körülmények között proteineket azoknak szállítása céljából az expresszlő zés) után, valamint a szelektált Src protein tisztítását, a proteinek és polipeptídek szállítására alkalmazható módszerekkel. Egy ilyen módszer például a líposzomás átviteli rendszer, amelyet a 4 356 167, 5 580 575, 5 542 935 és 5 643 599 számú US szabadalmakban ismertetnek. A szakterületen jártas személv számára jól ismertek további, vektort és proteint szállító rendszerek, amelyek a találmány szerinti Src vagy Yes proteinek expressziőjában és/vagy szállításában alkalmazhatók.
2.
csibe-korioallantoin membrán (CAM)
A. CAM előállítása
Érképződés kiváltható a csibe korioallanfoís membránján (röviden CAM), ami normális embrionális érképződés után érett véredények kialakulását eredményezte. Kimutatták, hogy az érképződést válaszként váltják ki specifikus citokinek vagy daganatfragmentumok, Leíbovich és munkatársai közlése szerint [Natúré, 329:630 (1987) és Ausprunk és munkatársai, Am. d. Pathot, 79:597 (1975)]. A CAM készítményeket csibe-embriókból állítottuk elő az érképződés indukciójának és gátlásának kiváltására végzett vizsgálatokkal. A 10 napos csibeembriókat a Mclntyre Poultry (Lakeside, CA) cégtől szereztük be, és 37 °C
Á-os nedvesség mellett inkubáltuk. A t<
át a tojás méretű fúró an egy alkalmazásával (Dremel, Dívision of Emerson Electric IVí). Egy második lyukat, fúrtunk a tojás nagy óbbik olyan területen, ahol embrionális véredények nem voltak: ezt előzőleg a tojás átvilágításává! ti furatra (lyukra) negatív nyomást £
Határoztuk meg. Az amelynek egy hamis légzsákot létesítettünk a CAM felett. A héjon át a leesett CAM fölé egy 1,0 cm x 1,0 cm négyzetalakú ablakot vágtunk egy kis méretű őrlőkerék alkalmazásával. Ez a kis méretű ablak lehetővé tette az alatta elhelyezkedő CAM közvetlen kezelését.
Az- így kapott CAM készítményt vagy az embriogenézís (embrioképzödés) 6. napjánál alkalmaztuk (ezt az időpontot aktív neovaszkularizáciö jelzi) a CAM további kezelése nélkül, és ebben azt a modellt utánoztuk, amelyet az embrionális neovaszkularízációra kifejtett hatások kiértékelésére alkalmaztunk; vagy az embriógenézis 10. napjánál alkalmaztuk, amikor az angiogenézis csökkent. A találmányunk szerint, tehát az utóbbi preparátumot alkalmaztuk a megújuló érképzödés kiváltására (índnkálására), válaszként a citokínre vágj’ a daganattal való érintkezésre, amint ezt az alábbiakban közöljük.
3. A CAM érképződésének a mérése
A. A növekedési faktorok által előidézett érképződés
Kimutatták, hogy az érképződést cítokinek vagy növekedési faktorok előidézik (indukálják). Az érképződést, úgy indukáltuk, hogy egy 5 mm. x 5 mm méretű Whatman szűrőkorongot (Whatman Filter paper No. .1) korongot telítettünk Hanks-féle sóoldattal (röviden: HBSS, GIBCÖ, Grand
NY) vagy
-f, amely 2 ag/ml rekombínáns bázison fíbroblaszt növekedési faktort (bFGF) vagy vaszkuláris endoteliális sejtnövekedési faktort (sejtszaporodási faktort) (VEGF) (Génzyme, Cambridge, MA) helyeztünk 9 vagy lö napos csibeembrió CAMjára egy olyan területen, amely vérerektől mentes, és az ablakokat ragasztószalaggal lezártuk. Á vérerek növekedésének indukciójára a növekedési faktorok más koncentrációi is hatásosak. A mérések céljára ~ ahol az érképzödés gátlását antagonisták intravénás befecskendezésével értékeltük ki - az érképződést először 1-2 ug/ml bFGF-val vagy VBGF-vai indukáltuk a fíbroblaszt szaporítási közegében. Az érképzodést mikroszkópos fényképezéssel monitoroztuk 72 óra után.
Embrionális érképződés
Az embrionális neovaszkularizáció természetes kialakulásának érképződés-gátlói hatásának kiértékelésére alkalmas CAM preparátum a 6 napos embrionális csíbeembrio, amint ezt előzőleg leírtuk. A fejlődésnek ezen a fokán a véredények de novo növekedést kezdenek, és ennek alapján alkalmas rendszert nyújtanak az érképzödés módosítására a találmány szerinti Src proteinek által. A CAM rendszert a fenti leírás alapján állítjuk elő, azzal a kivétellel, hogy a mérést inkább a 6., mint a 9. vagy 10. embrionális napon végezzük.
4. Az érképződés· módosításának a. mérése
Az Src proteinek érképződésre kifejtett hatásának a kiértékelése céljából az alábbi méréseket végeztük 10 napos ősibe CAM preparátumokon. Őt pg RCAS szerkezetet (amelyet az 1. példában adott leírás szerint állítottunk elő) transzfektáltunk a csirke immortalizált fibroblaszt DF-1 törzsébe (Doug Foster adománya). Ez a sejttörzs, valamint a primer csibeembriő fibroblasztok képesek voltak vírus termelésére, azonban a DF-1 sejttörzs magasabb titert eredményezett. .Virális íelülűszőkat gyűjtöttünk az összefolyás állapota előtti DF-l-t termelő sejttörzsekből szérummentes CLM közegekben (összetétel: F-10 alapközeg kiegészítve DMSÖ-val, fölsawal, ^utaminsawal és MÉM vitamínoldattal). 35 ml virálís íelülűszót ultracentrifugálással 4 °C hőmérsékleten 2 órán át 22 ÖOÖ rpm fordulatszámmal töményítettünk. Ezeket a koncentrált víruspeiieteket ismét szuszpendáltunk az eredeti térfogat 1 /100 részében, szérummentes CLM közegben, majd abkvotokra osztottuk, és -80 °C hőmérsékleten tároltuk.
Á titert egy kontroll virális vektor sorozathígításával értékeltük ki, amely vektor olyan nukleotíd szekvenciával rendelkezett, amely a zöld fluoreszcens proteint (GFP) kódolja, és neve RCAS-GFP; fertőzés olyan primer csibeembrió fibroblasztokon, amelyeket 48-72 órán át inkubáltunk. Annak a virális törzsoldatnak a litere, amelyeket a töményítés után kaptunk, rutinszerűen meghaladta a 1Ö8 HE/ml értéket. A virális törzsoldatok alkalmazására megfelelő CAM mérés céljára 6 mm átmérőjű, kortizon-acetátt&l átitatott Whatman szurökorongokat állítottunk elő úgy, hogy azokat 30 percig 95%-os etanolban 3 mg/ml kortizon-acetáttal kezeltük. A lemezeket lamináris áramlásü fülkében szárítottuk, majd 10 percig lemezenként 20 pl virális törzsoldatban áztattuk.
a lemezeket 9 vagy 10 napos csíbeembrió fel, celofán szalaggal zártuk, majd 37 °C hőmérsékleten 1824 órán át .mkubáltuk. Ezt követően utánzó PBS-t vagy' szaporodási (növekedési) faktorokat adtunk hozzá a CAM-hoz 5 pg/ml koncentrációban a megfelelő vírus-törzsoldat 20 μ! térfogatában mintegy további erősítésként a vírusnak a CAM szövettel szemben, 72 óra után a CAM-okat begyűjtöttük, és megvizsgáltuk az angíogén (érképződés) indexüket, a CAM alapján elhelyezett lemezen található elágazási pontok számának kettős vak módon végzett számlálásával, Kináz-mérések céljára a lemez alatt lévő szövetet RIPA-ban összegyűjtöttük, motorizált berendezéssel homogenizáltuk, Src-vel immuncsí állítottunk elő az összes protein egyenértékű mennyiségeiből, és ezt alávetettük egy in vitro kínáz-mérésnek, szubsztrátumként FÁK-GST fúziós protein alkalmazásával. Az immunfluoreszcenciás vizsgálatok céljára a lemezek alatti CAM szövetet ÖCT-ban (fagyasztással működő tartósítószer) .fagyasztottuk, 4 pm méretű darabokra, vágtuk, acetonban 1 percig fixáltuk. 3%-os normál
kec ske szérummal 1 órán át inkubáltuk, maj d primer nyül-antifoszforílezett ERK antitesttel ínkubáltuk előzőleg leírtak szerint [Elmeire és munkatársai: 3. Célt Biot 140. 1255-1263 (1998)}» PBS-val mostuk, és egv szekunder fluoreszcens antitesttel
A. Endogén Src aktiválása bFGF-val vagy VEGF-vei Abból a célból, hogy a növekedési faktoroknak Srcaktivitásra kifejtett hatásait az érképződés módosításában kiértékeljük, csibék CAMhatásának i a xov vizsgálatokat hajtottuk végre, lö napos zetkívonatait bPGF vágj' VEGF Í2 pG/ml) órán át, majd lízáltuk. Endogén Sre~t , es
m vitro összes protein ekvivalens x kináz-mérésnek vetettünk alá in vitro szufosztrátumként FAK-GST fúziós protein alkalmazásával, majd elektroforézíst hajtottunk végre, és nitrocellulózra vittük át.
A vizsgálat eredményeit az- 5. ábrán mutatjuk be, ahol az Src aktivitásának a növekedése nyilvánvaló mind a bFGF-val, mind a
VEGF-val végzett kezeléssel kapott, megnövekedett gélsűrűségből, am az alapszintű Src aktivitást a CAM mérésben. Mind a bFGF, mind a VEGF megközelítőleg kétszeresére növelték a CAM-ban jelenlévő endogén Src aktivitást. A fenti kínáz-vizsgálati blofot egy anti-Src antitesttel is szondáztuk, amely terheléses kontrollként szolgált ekvivalens Src és IgG tartalom szempontjából.
B. .Az Src A retro vírus által közvetített génexpresszíójának
a hatása végbemenő érképződésre.
Az alábbi mérést végeztük azzal a céllal, hogy kiértékeljük mutált Src proteinek hatását a CAM preparátumban végbemenő érképződésre.. A mérés céljára 9 napos csibe-CAM-okat RCAS-Src A- vagy RCAS-GFPF-vel szemben exponáltuk (RCAS- Src A-t vagv
RCAS-GFP-t kifejező retrovírusok vagy puffer hatásának tettük ki) 72 órával a fentebb leírt protokoll, után..
Ennek a mérésnek az eredményeit a 6Á. ábrán szemléltetjük, ahol az érképződés szintjét mennyiségileg a fentebb leírt módon számítottuk ki.
Amint a 6B. ábra mutatja, reprezentatív mikrofényképeket ••szeres nagyításban) vettünk fel egy sztereomikroszköppal. Az ű endogén Src aktivitás angiogén (érképződési) indexe megközelítőleg 50, Szemben ezzel a retróvirális vektor által kifejezett RCAS-Src A-val - amelynek pontmntációja az 527helyzetben lévő aminosavmaradék mutációja tirozinrol fenilalaninra - azt eredményezte, hogy az érképződés angiogén )-re növekedett (indukció). Az Src A-val es-novekedés (fokozódás) a 6B. ábrán kböl is nyilvánvaló.
C. Az Src A retroviráhs expresszioja aktiválja a vs MAP-kináz fószfcrilezését továbbá Src A hatását a VEGE és nov írva a v<
foszforilezesére; a kiértékelést a fentebb és itt leírt mérési eljárások követésével végeztük. 1.0 napos csibe-CAM-ok szóvetkivonatait exponáltuk VEGF-val vagy PMA-val szemben (a PMA egy mitogén, hasonló koncentrációban) 30 percig, összehasonlítottuk olyan mintákkal, amelyeket 48 órán át Src A-t kifejező retrovírussal fertőztünk. Ezt követően az Src-t ímmunprecipítácíóba vittük ekvivalens mennyiségű protein kivonattal, és in vitro immunkomplex kináz-mérésnek. vetettük alá szubsztrátumként FÁK-GST fúziós protein, felhasználásával, majd ele'ktroforézist végeztünk, és nitrocellulózra vittük át.
Ennek a mérésnek az eredményeit a 7Á. ábrán sze ahol kezeletlen CAM-ok (NT) alapszintű, endogén Src közvetített vaszkuláris MAP-kináz fo&zforilezést váltanak ki. a VEGE, mind a PMA megközelítőleg kétszeres elő az alapszint felett. Ezzel ellentétben az Src A az aktivitást körülbelül 5-10-szeresre növelte a kezeletlen mintákban megfigyelt
A fenti teljes szövet lizátumainak alikvotjaít szintén mértük az endogén ERK foszforilezés szempontjából úgy, hogy immunblotolást képeztünk egy anti-foszío-FRK antitesttel, mint a 7B. ábrán látható. Ennek a kiértékelésnek a céljából 10 napos CAM-okat vagy utánzóit RCÁSval vagy olyan RCAS-val fertőztük, amely Src A-t kifejez. Két nap múlva a CAM-okat felkoncoltuk (szétvágtuk), OCT-ban fagyasztva tartósítottuk, és 4 pm méretre rágtuk. A darabokat immunfestéssel láttuk egy anti· foszforilezett ERK antitesttel (Γ anti-nyül FITC-vel kői detektáltuk.
A fluoreszcens képeket hűtött~CCD kamerán vettük fel. A mikrofénvképek mutatják az Src A-val kezelt gált szekunder kecske-antitesttel
B. Szelektív igény az Src aktivitás iránt VEGF során, ami azonban nem jelentkezik a bFGF által indukált
vág}’ Src
RCAS-Src
Azzal a céllal, hogy az Src módosító aktivitását kiértékeljük a növekedési faktor által indukált érképződésre, az alábbi vizsgálatokat végeztük. 9 napos csibe CAM-okat olyan retrovirális vektorpreparátummal szemben, domináns negatív Src mutációt, amelyet Src 251 K295M-nek neveztünk, mint ahogyan fentebb leír 251 vagy kontroll RCAS-GPP retrovírusokat vagy puffer-CAM-okat 20 órán kezeltünk, majd további 72 órán át inkuba VEGF jelenlétében, vagy azok hiányában .
bFGF vagy
Az érképződés mértékét ·· a fentiek szerint kvantifikálva - a 8A, ábrában szemléltetjük, A reprezentatív míkrofényképeket (hatszoros nagyítással) a 8B. ábrán mutatjuk be; ezeket amelyet egy anti-Sre antitesttel szondáztunk, hogy alátámasszuk az Sre 251 expressziőját transzfektált sejtekben az utánzott.
A fentebb leírt mérések eredményei arra utalnak, hogy mind a foFGF, mind a VEGF által kezelt CAM-ok RCAS-GFP jelenlétében szabályozza az indukált érképződést, amely túllépi az Src által közvetített, alapszintű érképződést, amelyet utánzott vagy kezeletlen CAM preparátumokon figyelhetünk meg. A kifejezett domináns negatív mutáns Src 251 hatása abban nyilvánult meg, hogy a VEGF-indukálta érképződést gátolta, és visszavitte az alapszintekre, viszont nem volt hatásos a b'FGF által közvetített érképződés gátlásában,
A 8B, ábrában, szemléltetett mikrofényfeépek látványosan megerősítik a SA. ábrában, bemutatott adatokat. Ennek alapján a retrovirálisan kifejezett Src 251 hatékony érképződés-gátló, ha az érképződést VEGF-vai indukáljuk.
A találmányunkban célba vesszük továbbá a találmány szerinti Sre proteinek alkalmazásait más érképzési modelleken, amint ezt az alábbi példákban közöljük.
5. A tumorszövetí növekedés regressziója Sre módosítók (modulátorok) hatására, in vivő körülmények között mérve nyűlszem-modellen
Src modulátorok növekedési faktor által indukált érképződése megfigyelhető természetesen átlátszó szerkezeteken, például a szem szaruhártyáján. Az új vérerek a szaruhártya szegélye felől növekednek, amelynek dús vérellátása van; a növekedés a szaruhártya középpontja felé irányul, amelynek normális körülmények között nincsen vérellátása. Az érképződés stímulálői ~ így például a bFGF - a szaruhártyára feMve új vérerek növekedését váltják ki a szaruhártya széle felől. Ha a szaruhártyára érképződés antagonistáít juttatjuk, akkor ezek új vérereknek a szaruhártya széle felől történő növekedését gátolják. Ennek következtében a sz^ruhártyán érképződés meg}7 végbe az endoteliális sejtek (bolhámsejtek) inváziója következtében a szaruhártya széléről a kollagén-bevonatú szaruhártya szövetbe, ami könnyen látható. A nyúlszem-modell alapján végzett mérés tehát in vivő modell érképződés stimulálásának és gátlásának a közvetlen megfigyelésére, közvetlenül a szem. szaruhártyájába ültetett vegyületek beültetése után.
Az in vivő körülmények közötti nyúlszem-modell mérés gazolja a növekedési íaktorok altat indukált erkepződest
Az in vivő körülmények közötti nyúlszemmérőmödszerében a bFGF vagy VEGF az érképződést indukálják; ezt az alábbiakban írjuk le,
A növekedési faktort tartalmazó Hydron polimer pelleteket D*Amato és munkatársai leírása szerint állítjuk elő ÍProc. Natl.
Acad. Sci USA 91, 4082-4085 (1994)). Az egyes pelletek 650 ng növekedési faktort tartalmaznak, amely elkülönítetten van kömé szukralfáthoz ÍCarafét, Marion, Merre! Dow Corporation) a növekedési faktor stabilizálására, és lassú felszabadulásának biztosítására, a környező szövetekbe. Ezen túlmenően Hydron pelleteket állítunk elő, amelyek egy kívánt Src-kifejező retrovírust tartalmaznak, amint fentebb leírtuk. A pelletek speciálisan előállított Teflon peckekbe vannak kíöntve, amelyeknek a felületén
2,5 mm méretű mag van befürva. Körülbelül 12 pl öntési anyagot helyezünk minden egyes peeekbe, és éjszakán át polimerizáljuk egy steril fülkében. Ezt követően a jelieteket ibolyántúli besugárzással sterilizáljuk, majd az Src proteinek hatásait előbbi leírásunk szerint kiértékeljük.
6. A tumorszövet' növekedésének regressziója Src modulátorok hatására in vivő körülmények között, a kimer egér: humán mérőmódszerrel mérve
In vivő kimer egér: humán modellt képezünk úgy, hogy egy SCID egérből egy bőrdarabot emberi újszülött előbőrével helyettesítünk. Az in vivő kimer ember: humán modellt lényegében véve Yan és munkatársai szerint állítottunk elő [J. Clín, Invest. 91, 986-996 {1993)].
Röviden: egy 2 cm2 méretű bőrterületet sebészi ütőn eltávolítottunk egy 6-8 hetes SCID egérről, és emberi előbőrrel helyettesítettük. Áz egeret érzéstelenítettük, és szőrét mindkét oldalán a laterális hasi körzetben borotválással eltávolítottuk.
Két köralakú ültetvényágyat 2 cm2 mérettel állítottunk elő úgy, hogy a bőrt teljes vastagságában egészen a bőnyéíg eltávolítottuk.
Teljes szélességű, azonos méretű, humán újszülött bőréből származó humán bőrültetvényeket helyeztünk az ágyakba, és a helyükre varrtuk. A beültetett bőrt egy Band-Áíd kötéssel fedtük, amelyet a bőrhöz varrtunk. A sebet mikropórusos szalagkötéssel rögzítettük.
Az M21-L humán melanóma sejttörzset vagy M'DA 23.1 emlőkar cinőma sejttörzzsel (ATCC HTB 26; o$3 negatív; a mÁb LM6Ö9~vaI megfigyelt szovetszekciós immunreaktivitás miatt alkalmazzuk a szolid humán tumorok kialakítására humán bőrültetvényeken az SCID egereken, 5 x 1ÖÖ M21-L vagy MDA 23,1 sejtekből álló, egysejtes sejtszuszpenzíót befecskendezünk intradermlísan a humán bőrültetvénybe. Ezt követően az egereket
a merhető
2-4 héten át.
növi
Mérhető tumor kialakulása után a találmány szerinti retrovírus preparátumokat vagy PBS-t fecskendezünk az egér íarokvénájába. Két-három hetes időszak után a daganatot kivágjuk, és tömegét és szövettanát, elemezzük. Ezt követően kiértékeljük a találmány szerinti Src daganatszövet növekedésének ín vitro regressziója Src modulátorok hatására a CAM
A tumor növekedése az érképződésíöl függ [Folkman, 1992, J, Biot Chem., 267:10931-10934; Weidner és munkatársai, 1991, N.E. 3. Med. 324:1-8; Brooks és munkatársai, 1994, Cell 79:1157-1164], Ténylegesen új közlemények valószínűsítik, hogy a daganat növekedése a VEGE receptorantagonisták hatásaival szemben érzékeny [kim és munkatársai: Natúré 362, 8451 (1993}}. Ennek alapján vizsgáltuk, hogy az érképződés kínáz-törolt Sre 251 szállításával történő elnyomása, befolyásolhatja-e az emberi medulloblasztoma (BAOY) növekedését, amely erősen érképző daganat, és ismeretes, hogy VEGF-t és nagyon kevés bFGF-termeh
A 3-napos és 6-napos DAGY medulloblasztoma tumor növekedésének vizsgálatát a csibe CAM-on végeztük, lényegében a fentebb leírtak szerint (Brooks és munkatársai idézett közleménye,.
V a/ *
1994]. 5 x lö6 DAOY sejtet tenyésztettünk RPMI 1640-ben, amely
10% borjűmagzatszérumot tartalmazott, utána mostuk, és 10 napos embrió CAM-jára oltottuk DAÖY daganat.iragment.umok képzése céljából. Hét nap múlva 50 m-gos tumorfragmentumokat vágtunk, és egy másik 10 napos embrióra ismét oltottuk, és további 3 vagy δ napon át inkubáltuk 25 ul kontroll RCAS-GFP retrovírussal, RCAS Src 251-vel vagy utánzó kezeléssel (a helyi alkalmazás térfogata 25· μΙ), Irányvonalként a teljes szöveti konfokális, fertőzött daganatok leképzésével képesek voltunk meghatározni, hogy ezzel a topíkus megközelítési móddal az RCAS szerkezetek expressziója jelentős volt a daganatfragmentum körül és azon belül. A daganat kímetszését és mérését kettős-vak. módon távolittuk el [Brooks és munkatársai idézett, közleménye, 1994}. A nedves daganattömegeket 3 vagy 6 nap után összehasonlítottuk a kezdeti tömeggel, és a. minden egyes csoportra meghatározott daganattömeg százalékos változásával.
Ezek a daganatok készségesen növekszenek a CAM-on, aktív érképzést produkálnak (9. ábra), és lehetővé teszik számunkra a madaraktól eredő daganat! érhálózat szelektív célzását egy madarakra specifikus RCAS retrovírus felhasználásával.
mutatják, az RCAS-Src 251 átvitelét a csibe CAM-ján növekedő humán tumorokra; ez megfordítja a tumor növekedését. A 9A. ábra olyan medulloblasztomákat mutat, amelyeket a fentebb leírtak szerint csiheemhriók CAM-ján növesztettünk. RCAS-GFP-t vagy RCAS-Src 251-et tartalmazó retrovírust topikusan adagoltunk 50 mg-nál nagyobb, előre kialakított tumorokra, A GFP-t kifejező RCS-GFP-vel fertőzött meduiiofolasztőma tumor reprezentatív míkrofényképe mutatja az exkluzív expressziét a
100 daganat vérereiben (a. nyíl hegyénél):, ahol a kimutatás optikai.
szekcionálással történt egy
- 500 pl).
A 9B. ábra mutatja eredményeinket a fentiek szerint tumorokkal, amelyeket növekedni hagytunk 3 vagy 6 napon át, majd felvágtuk, és nedves tömegüket meghatároztuk. Az adatokat a tumor tömegének átlagos változásával fejeztük ki (az 50 mg-os tumor induló tömegéből) +/- SEM 2 ismétléssel. Az RCAS-Src 251 jelentős befolyást gyakorolt a tumor növekedésére 3 nap után (*, P < 0,002) és 6 nap után (**P < 0,05).
A 9C. ábra reprezentatív sztereomikrofényképeket mutat olyan medullabl&sztöma tumorokról, amelyeket sebészi úton eltávolítottunk az embriókból egy Olympus sztereomikroszkóppal (rúd « 350 pm) (alsó panel); erős nagyítású mikrográfia készült minden, egyes tumorról, amely részleteiben mutatja valamennyi tumor érhálózatát (rúd ~ 350 pm). A nyílhegy mutatja, a véredény törését RCAS-Sre 251-vel kezelt tumorokban.
Irtása előre kialakított medullöblasztömákra szelektív virális expressziót eredményezett a daganattal kapcsolatban álló véredényekkel (9A« ábra), és ez végeredményben ezeknek a tumoroknak a regressziójához vezetett egy 6 napos· időszakén belül (9B. ábra). Lényeges, hogy az állatokban. lévő tumorral kapcsolatban álló véredények Src 251 et tartalmazó vírussal kezeit állatokban súlyosan széttöredeztek, és számszerűen kisebb volt a számuk kontrollállatokon lévő daganat! véredényekhez képest (9C. ábra). Az a tény, hogy az RCAS-GFP-vel fertőzött daganatok csak a daganat érhálózatában mutatták a GPP lokalizálódását, valószínűsíti, hogy retrovirálisan célba juttatott Src 251 esetében
101 megfigyelt daganatgátló hatások az anti-angiogén tulajdonságoknak köszönhetők.
8. Áz endoteliális sejt VE'GF által médiáit (közvetített) veteimenye
Űjabh bizonyítékok valószínűsítik, hogy a nőve receptorai [Choi és Ballermann, 1995, J. Biol.Chem.
faktor 270:2114421150; Satake és munkatársai, 1998, Biochem. Biophys. Rés. Comm. 244:642-646] és integrínek [Meredith és munkatársai, 1.993, Mól. Bioi. Cell 4:953-961; Brooks és munkatársai, 1994a,
Science elősegítik angíogén endíteliálís sejtek receptor szintén szabályozzák az Src aktivitását, siettette az Src szerepének kivizsgálását endoteliális sejt túlélésében érképződés során. bFGF-val vagy VEGF-val stimulált GAM-okát fertőztünk Src 251-et tartalmazó retrovirussal, és ezeknek a szöveteknek .kriosztaltal kapott metszeteit vizsgáltuk apoptótikus sejtek jelenléte szempontjából Röviden: CAM~ok fagyasztással kapott metszeteit, amelyeket RCAS-GFP-vel kezeltünk vagy bFGF-val vagy VFGF-val kezelt RCAS-Src 251-et elemeztünk apoptótikus sejtekre Apoptag Kit (Oncor, Gaithersburg, MD) alkalmazásával. A metszeteket továbbá immunfestékkel kezeltük egy ellenszinezéket alkalmaztunk 1 pg/ml DAPI-val. A fluoreszcens képeket hűtött CCD kamerával vettük fel, a fluoreszkáló képeket feldolgoztuk, és az expozíciót megosztottuk a kísérleti kezelések között, amint ezt előzőleg leírtuk (Bllcélri és munkatársa, idézett közlemény, 1998).
X
A retrovírussal fertőzött CAM szövetek apoptőtikus indexének a mérésére FITC~val konjugáit annexin V-t alkalmaztunk a seítszusznenziők festésével, maid a mosott •iával
CAM-okhól 0,1 tömeg/téri.% IV típusú kollagenázzal végzett emésztés útján RFMI 1640-ben vágott CAM szövetből, amelyet 1 órán át 37 °C hőmérsékleten ráztunk egy előző leírás szerint (Brooks és munkatársai, 1994), és egy 100 pM nyílásméretű nylon szűrőn szűrtük. A fluoreszecencíát áramlási citométerrel mértük sejt
A vWf festés mérése FAC-kel kollagenázzal emésztett CAM szöveti sejkkészítményekkel párhuzamosan történt, amelyek I,8%~ os paraformaldehíddei voltak fixálva, permeabilisek voltak 70% etanoiban, és anti-vWf antitesttel inkubálva, FíTC-val konjugáit szekunder antitesttel detektáltuk.
Src 251 átvitele az extenziv TŰNÉL festést elősegítette a Vlí.1 faktor-kapcsolatú antigén (von Willebrand faktor (vWíjj között, megfestve a pozitív véredényeket a VEGF által stimulált, azonban bFGF által nem. stimulált CAM-okban, Ténylegesen minimális apoptózist figyeltünk meg más sejttípusok között ezekben a CAMvalószínűsítvén egy endoteliális s követelményt az Src kináz aktivitás voi szempontjából a VFGF által aktíváit kisérletsorozatban VEGF-val vagy bFGF-val stimulált.
a sejt-túlélés Egy második retrovírussal fertőzött CAM-okat korlátozott kollagenázemésztésnek vetettünk alá egyetlen sejt szuszpenziójának az előállítására. Kimutattuk, hogy ezek a CAM-eredetü sejtek megközelítőleg 20-50% endoteliális sejtet (vWf-pozftiv)
103 tartalmaztak, és megelemeztük: apoptózásra vonatkozóan annexín V-pozítív sejtek áramlásos-cítometriás detektálásával, amely egy korai apoptózis-jelzö, A VEGF által stimulált, Src 251-vel fertőzött CAM-okbóI származó sejtek, amelyek Src. 251-vel fertőzve voltak, jelentős mértékben megnővekedett annexín V-t tartalmaztak, amely jelentősen festődött az utánzóit RCAS-GFP-vel fertőzött CAM-okbóI, .amelyeket YEGF-val kezeltünk. Ezzel ellentétben a. hamisan fertőzött CAM-okbőI származó sejtek vagy az RCAS-Src 251-vei fertőzött, és bFGF-val stimulált sejtek kevés vagy egyáltalán semmiféle annexín V festődést sem mutattak. Továbbá nem figyeltünk meg annexín V fe stődést a nem stimulált vagy bFGF által stimulált CAM-okbőí származó sejtek között. Ezek az adatok igazolják, hogy az endoteliális sejt VEGF alatti túlélése az Src kináz aktivitást szelektíven, igényli, azonban a bFGF által közvetített érképződést a CAM-ban nem igényli.
9, Az Src kináz aktivitás szelektív igénye az érképződés szubkuíán egérmodelljén
Az Src szerepének további elemzésére az érképződésben egy egérm.odellt alkalmaztunk.. Ebben az esetben az érképződést a növekedési faktor kiürítésével kapott Matriger [kiegészítve bFGFval (löö ng/ml) vagy VEGF-val (400 ng/ml)] atimiás érett egerekben 5 nap után elemeztünk (Passaniti és munkatársai kvantitásuk, a proteineket izoláltuk, és egy VEGF receptor antitesttel (fik~l) immunblokkoltuk (13A. ábra), amely endoteliális sejtekre nézve specifikus, Amint csibékben megfigyeltük, a kináztörölt (hiányos) Src 251 a cDNS blokkolta VEGF-indukálta érképződést blokkolta ebben az egérmodellben, míg nem volt
104 hatása a öFGP-indukálta érképződésre (13B. ábra). Az endogén Src ebben a modellben mutatott szerepének a megállapítására a szöveteket, olyan retrovírussal fertőztük, amely Cák-t fejet ki, amely gátolja az endogén Src aktivitást a C-termináiís szabályzó hely foszforílezéséveí [Nada és munkatársai: Natúré 361, 68-72' (199l)j. A Cak által blokkolt VEGF által indukált - azonban bFGF által nem indukált - érképződés (13. ábra) alátámasztotta az endogén Src aktivitás szerepét a VEGF által közvetített
Ezeknek a vírus által fertőzött VEGF által stimulált szöveteknek a neevaszkularizációját közvetlen immnnfluoreszcencíával erősítettük meg egy FITC-vel konjugált antí-DC34 antitesttel (13. ábra) vagy antí-ílk-l antitesttel, és kvantítálva a pozitív festődésü CD34 véredények megszámlálásával minden egyes fagyasztott metszeten (13C. ábra).
Röviden: az érképződést. Matrigertol mentesített, növekedési faktor szubkután. befecskendezésével indukáltuk, amely konyhasóoldatot vagy VEGF (400 ng/ml) 2 χ 1.06 ektrópíkus csomagoló sejtet tartalmazott, kifejezve a GFF retrovírust az atimiás wahl (nu/nu) egereken, és 5 napos inkubálás utáni elemzéssel A neovaszkularízációt immunblot képzésével kvantitáltuk egy VEGF receptor antitesttel (fi.k-1), amely endotelíális sejtekre nézve specifikus. A ISA. ábra szemlélteti az immunblot-analízis eredményeit. A kináz-törölt (kináz-deléciös) Src 251, CSK vagy GFP retro vírus VEGF által indukált érképzésére (400 n.g/m.l koncentrációban) vagy bFGF által indukált érképzödésre (400 ng/ml koncentrációban) elemeztük a szöveti lizátumok immunhlottolásával elemezve egy anti fik-1 antitesttel. Ezeknek az eredményeknek egy példáját szemlélteti a 15B. ábra. Az Src 251 és
105
CSK-kifejező retrovírusöknak a hatását a VEGF által indukált neovaszkularizáciőra kvantitásuk úgy, hogy a CD34 pozitív erek számát a szövet keresztmetszetében megszámláltuk indírekt immunfluoreszcenciával három párhuzamos random elrendezésben, húszszoros nagyításban, A dugaszoknak a fagyasztott metszeteit szintén immunfluoreszcens festődésnek vetettük alá egy anti-CD34 antitesttel vagy' anti-flk antitesttel szermt kvantitaituk a CAM erkepzödesi vizsg A teljes mennyiségű dírekt fluoreszcenciát az RCAS-GFP-vel fertőzött daganatfragmentum esetében úgy végeztük, hogy egy tumorfragmentumot elmetszettünk, és a nemfixált szövet leképzését közvetlenül egy lemezen lézer konfokálís mikroszkc
10. A VEGF íntradermális expressziöjának a hatása Src /· vagy Sre·*'/' egéríülön
A csirkével és egérrel összeállított érképzés! modellekkel kapott eredmények folytatása útján közvetlen genetikai megközelítést alkalmaztunk az íntradermális VEGF-indukálta érképződés vizsgálatára Src-/- egereken. Vizsgáltuk továbbá a vaszkuláris permeabilífásra kifejtett hatásokat is, mível ismeretes volt, hogy a. VEGF egyrészt inleiálja az új véredény növekedését, és elősegítheti a vaszkuláris permeahílításf [Senger és munkatársai, 1983 Science 218:983-985; Ferrera és Davis-Smyth, 1997, Endocr. Rév. 16:4-25],
Egy?' humán VEGF eDNS-t kifejező adenovírus ó injekcióit végeztük Src-/- és Src*/- egerek fülén, míg a galaktozidáz kontrollt kifejező adenovírust az egerek másik fülébe a
fecskendeztük. A VEGF-függö új véredény növekedését Src*/·
106 füleken, először 48 óránál detektáltuk, és a neovaszkulariz-ációt 5 nap után elemeztük.
fSoriano és
Röviden összefoglalva: pp6O-»rc, ; Ü129/8v/Ev x C57.B16/J)
Se-ves
K-m hiányos munkatársai: Cell 64. 693-702 (1991)].
További törzskészletet kaptunk a Yakson
es munkatársai: Microvasc. Rés. 19, 374-378 (1980)] 5 μί adenovírussal, amely vagy VEGF-t vagy β-galaktozidázt fejezett ki, majd a füleket 5 nap után sztereoszkóppal fotografáltuk.
Megfigyeltük, hogy azonos volt a. vírálís expressziós szint
Srcü--ban és Sre7-~ban az X-gal β-galakfozídáz-adenovírus X-gal festésével meghatározva. VEGF-val kezelt Src'ő· fülekben az érképződés nem csökkent jelentősen az elágazási pontok számlálásával, mérve (p < 0,05/ Azonban meglepő módon a legnyilvánvalóbb fenotípus ezekben az állatokban a vaszknláris szivárgás teljes blokádja volt összehasonlítva a VEGF-vei befecskendezett Src4·/- fülekkel VEGP-ve! injekciózott fülek vizsgálata megerősítette a vaszknláris szivárgás mértékét 8rcV~ i, amely lényegében hiányzik az SrcY- egereken. Ezekben aktivitás - amely in vivő körülmények között kapcsolatban áll az érképzödéssel (Dvorak és munkatársai: Am. J. Pathol, 148, 10291039 (199-5)], szelektíven megszűnhetett pp60f-'src hiányos eí agy
11.
Az
-gát, nem egyeztethető össze a vér-agysp6öc-src hiányos egerekben érrendszerét jellemzi egy erősen korlátozó jellegű vérkizárja kis molekulák kilépését az érből a körülvevő
107 agy-szövet irányába. Egy daganat növekedése az agyvelőn belül ezt a gátat összeegyeztethetővé teheti részben angiogén növekedési (szaporodási) faktorok, így a VEGF termelődése következtében. Ennek alapján a ver-agy-gát természetét vizsgáltuk Src*/-,. illetve Src-7' egereken. Ebben az esetben az agyveld jobb, illetve bal féltekéjébe sztereotaktikus úton VEGF-t vagy fiziológiás konyhasőoldatot fecskendeztünk. A VF aktivitás monitorozása céljából valamennyi egérnek szisztémásán Evans-kéket fecskendeztünk be.
Röviden: konyhasőoldatot vagy VEGF-t (200 ng-t 2 μΙ-ben) injekcióztunk sztereotaktikus módon a bal vagy jobb frontális lebenybe 92 mm-re a bal, illetve jobb oldalon középvonaltól számítva, a koponyatetötői illetve rosztrálísan 0,5 mm távolságra, a kemény agyburoktól (dura) 3 mm mélységben. Az állatok az Evans-kék festékoldatot az előbbi injekció- után 30 perccel intravénásán kapták, amint ezt fentebb leírtuk. További 30 perc múlva az egereknek perfűziót adtunk, és az agyvelejüket eltávolífottuk, Az Evans-kék festékoldat fluoreszcenciáját az agy friss, nem rögzített fagyasztott metszeteinek koníokális lézermikroszkőpiával figyeltük meg.
A vér vaszkuláris szivárgását lokalizáltuk Src*A egereken a VEGF-injekciót kapott bemiszférában; azonban Src-A egereken vaszkuláris szivárgás egyáltalán nem következett be. Ez volt az az eset egyszersmind, amikor a VF-f az Evans-kék festék akkumulációjával mértük az agyvelő fagyasztott metszeteinek az epífiuoreszcenoíás elemzése útján. Ennek alapján a VEGF összhangba hozza (egyezteti) a vér-agy-gátat egy olyan módon, amely aktív pp60c-src-töl függ.
108
12, A VEGF által közvetített VP függ, a gyulladással kapcsolatos VP nem függ a pp60í>sre-től
Azzal a céllal, hogy tovább elemezzük és mennyiségileg jellemezzük a VEGF, mint VP faktor hatását Src*/*, illetve Src*/* egerekre, a Mües-féle mérőmődszert (Miles and Miles, 1952) alkalmaztuk az állatok bőrében a vaszkuláris permeabílitás kvantitatív meghatározására. A VEGF-t bőrbe (intradermálísan) injekcióztuk Src*/' vagy Src-A egereken, amelyeknek előzőleg Evans-kék festékoldatot intravénásán szisztémásán adagoltunk. A VEGF befecskendezése után 15 percen belül Src*/* egereken a VP 3-szorosá.ra növekedett. Szemben ezzel Src*/* egereken VP aktivitás nem volt megfigyelhető.. Az· injekciózott bőrfoltok festékoldat tartalmának az eluálását mennyiségi módszerré fejlesztettük, és ί ίΛΛΑΠ ? ϊ rt 6*5 í 5 f í í í í S í S S A K kLínfctriirt.M«Mlirf»iíX i ? P 1 T F* — V «-< S 5 3 so 4 T ST' >.· W 5.
nem mutatott szignifikáns növekedést a VP értékében.
Röviden úgy jártunk el, hogy a Miles-mődszert (Miles és munkatársai, .1.962). egerek számára adaptáltuk ügy, hogy 10 pl (400 ng/ml) VEGF-t, valamint allil-izotiocíanátot (mustárolaj:, 20 tömeg/téti. %-os, ásványolajban), vagy konyhasőoldatot bőrön át fecskendeztük be olyan egereknek, amelyeket előzőleg Intravénásán 1.00 pl 0,5%-os .Evans-kék festékoldattal kezeltünk. 15 perc eltelte után a bőrfoltokat levágtuk (szétvágtuk), lefényképeztük, 58 öC hőmérsékleten formáimnál -eluáltuk, és spckt.rofotométerrel mennyiségileg mértük.
Ismert továbbá, hogy a vaszkuláris szivárgás/permeabílitás gyulladás során is bekövetkezhet, és ez lehetővé teszi szérummal kapcsolatban állő, tapadó protein felhalmozódását és gyulladásos sejtek halmozódását a szövetekben. Ténylegesen, a gyulladást
közvetítő hatóanyagok a vaszkuláris szivárgást közvetlenül 'özvetitők valójában közvetlenül szivárgást.
kében egy ilyen gyulladáskózvetító hatóanyag az allil-izotxocianát - , amelyet mustárolajnak is neveznek (Inoue és munkatársai, 1977. fentebb idézett i- /.
megvizss állatokon xnegfigyeltűnk termelésére. Eltérően attól, amit a VEGF által stimulált Sre-7 az allil-izotxocianát, mint zel a VF értéke nexn csökkent, a következtetést vonhatjuk le hogy az Src szelektív szerepet játszik a VEGF által indukált VP aktivitásban, és nem befolyásolja a. gyulladásos folyamattal kapcsolatban fellépő VF-t.
13. A VEGF által közvetített VP aktivitás függ az Src-tői és
Yes-től, azonban nem függ a Fyn-től A VP szempontjából igényelt Sre specifieitását úgy vizsgáltuk, hogy figyeltük a VEGF által indukált VP aktivitást fe
SFK-vaí, így például Fyn-val vagy Yes-vel kapcsolatban, az Src-hez hasonlóan, mint ismeretes, endotelíális kifejeződnek [Bull és munkatársai; FEBS LETTERS, 361, 41-44 (1994); Kiefer és munkatársai: Curr. Bioi. 4, 1ÖÖ-1Ö9 (1994)). Megerősítettük, hogy ez a három SFK egyenértékűen fejeződött ki vad típusú egerek, így például Sreá~ egereken, ezeknek az egereknek az aortáiban; ezek az állatok Yes-hiányosák, és a VEGF által előidézett VP-szem pontjából is hiányosak voltak.
Meglepő módon azonban a Fyn hiányos egerek nagy mértékű VP-t tartottak meg válaszként a VEGF-re, ami nem tért el szignifikánsan a kontrollállatoktóL A VEGF által előidézett VP csökkenése Src-/- vagy Yes /· egereken azt mutatja, hogy S£ közvetített azonban nem
SFK-k 3 jelzési okoz áz~aktivitá.sa esszenciális jellegű a VEGPepizódra, amely a VP aktivitásához vezet.
A VEGF vaszkuláris egerei
vagy Src /· egereken (14A. ábra, jobboldali panel) Src4/- egereken konyhasöoldat vagy VEGF injekcióval (400 ng) határoztuk meg olyan egereken, amelyeket intravénásán kezeltünk Evans-kék festékoldattal. 15 pere után a bőrfoltokat lefényképeztük (skálarúd 1 mm). A csillagok az injekciók helyeit mutatják. A VEGF, bFGF és konyhasóoldat injekcióinak a helyét körülvevő területeket kivágtuk, és a VP értékét mennyiségileg meghatároztuk úgy, hogy az Evans-kék festéket forrnamídban 58 °C hőmérsékleten 24 órán baloldali rész); A gyulladásközvetito anyag (allil-lzotiocianát) ismert képességét - hogy a gyulladással kapcsolatos VP-t okoz - Src*/-, illetve Src··/’ egereken teszteltük (14B. ábára, jobboldalon).
A VEGF azon képességét, hogy VP előidézésére képes, összehasonlítottuk Src7y fynVy illetve Yes-/- egereken a Milesmérőmódszerrel (14C. ábra). A Miles-vizsgálatok adatait három ismétlésben kapott átlag * SD alakban fejeztük ki. Az S-rc7és
Yes·/- VP hiányokat kontrollállatokkal összehasonlítva a hiányok statisztikusan szignifikánsak voltak (* p < 0,05, párosított Y próba), ezzel szemben sem a VEGF-val kezelt fyn-/- egereken, sem az allil-izotiocíanáttal kezelt Src4/- egereken nem volt megfigyelhető statisztikailag szignifikáns VP hiány (** p < 0,05).
14. Src családhoz tartozó tirozin-kínáz-gátlóval kezelt egerek és Src-/- egerek a traumával vagy vérerek
ΠΙ károsodásával kapcsolatosan enyhébb szovetkárosotíást mutatnak, mint a kezeletlen, vad típusú egerek
adagolása gátolja a kóros vaszkulárís szivárgást és permeabiiítást a vaszkulárís károsodások vagy' betegségek, így például sztrők során. A vaszkulárís endotélium (belhám) dinamikus sejttípus, amely számos utasításra válaszként szabályoz olyan folyamatokat, mint például az űj vérerek elágazása egy tumor érképződése során;
vagy az ér permeabilitásának a szabályzása a sztrők által
A vaszkulárís permeabilítás csökkentése két egér-sztrőkmodellen - az Src folyamatok gyógyszeres gátlása által elegendő ahhoz, hogy gátoljuk az agy károsodását az íszkémiával (rossz vérellátással) előidézett vaszkulárís szivárgás csökkentése útján, továbbá genetikai Src-híányos egereken ~ amelyek vaszkulárís szivárgása és permeabilitása csökkent értékű - az infarktus térfogata (terjedelme) is csökken,
A szintetikus Src-gátlő adatainak és az alátámasztó genetikai bizonyítéknak a kombinációja (csökkent vaszkulárís szivárgás sztrők során és további hasonló modelleken) mutatja ennek a megközelítésnek a fiziológiai fontosságát a sztrókot követő agykárosodás csökkentésében. Ezeknek a folyamatoknak a gátlása rendelkezésre álló, Src családhoz tartozó kináz-gátlők sorozatával
- amelyek ezeket a jelző kaszkádokat (szignálsorozatokat) gátolják
- a terápiás előnye abban áll, hogy a vaszkulárís permeabilitással kapcsolatos szóvelkárosodásből származó agykárosodást enyhítik.
Fokális agyi íszkémía kiváltására két különböző módszert alkalmaztunk. A fokális agyi íszkémía mindkét adatmodellje jól
112 megalapozott, és a sztrők-kutatásban széleskörűen alkalmazzák. Mindkét modellt már eddig is felhasználták agyi íszkémia kórélettanának a kutatására, valamint új, sztrők elleni
a) Egereket avertinnel elaltattunk, és testhőmérsékletüket állandó értéken tartottuk úgy, hogy az állatot egy melegítőpámára helyeztük. Az állatnak a jobb fülén és jobb szemén bemetszést tettünk. A halánték! izomzat visszahúzásával szabaddá tettük (exponáltuk) a koponyát, és egy kis lyukat fúrtunk a középső agyi artéria (MCA) fölötti helyen, Az agyburkokat eltávoiitottuk, és a jobboldali MCA-t fűtőeszköz alkalmazásával kiváltott koagulációval elzártuk. Az állatokat ezt követően hagytuk magukhoz térni, és ketreceikbe helyeztük vissza..
óra múlva az agyvelöket perfúzióval kezeltük, eltávoiitottuk, és 1 mm méretű keresztmetszetekre vágtuk, A metszeteket 2'%-os 2,3,5-trifeniltetrazófium-klorid-oldatha (TTCl mártottuk, és az infarktusos árterületet a festés nélküli (fehér)
Az infarktus térfogatát úgy definiáltuk, mint a. metszetek nem festett területeinek az összegét szorozva azok vastagságával.
Az Src-nek agyi iszkémiában játszott szerepének vizsgálatára Sre-hen hiányos (Src-/·) egereket alkalmaztunk. Az Src*/- egereket kontrollként alkalmaztuk. Megfigyeltük, hogy Src-/· egerekben az infarktus térfogata a kontrollállatokban 24 órával a műtét után 26+10 mm3~röl 16+4 mm3-re csökkent. A hatás még kifejezettebb volt, ha C57816 vad. típusú egereket kezeltünk intraperitoneálisan (i/p.) 1,5 mg/kg PPl-vei 30 perccel az ér elzárása után. Az infarktus mérete a kezeletlen csoportban kapott 31+12 mm3-ről 8+2 mm3-re csökkent a PP l-vel kezelt csoportban.
113
b) A fokáiis agyi iszkémia egy második modelljén az MCAt úgy zártuk el, hogy egy emboluszt helyeztünk az MCA eredő helyére. E'gy egyszeres, érintetlen (ép), fi.bri.nben dús, 24 őrás homológ dugaszt helyeztünk az MCA eredő helyére, módosított PESO katéter alkalmazásával. Az agya íszkémia kiváltását ügy bizonyítottuk, hogy az agyi véráramlás az azonos hemiszíérában az ellenkező oldali hemiszférával összehasonlítva csökkent. 24 óra az agyvelőket eltávolítottuk, .metszetsorozatokat , és ezeket hematoxilixi-
ínfarktusos térfogatokat (infarktusok térfogatait) ügy határoztuk meg, hogy a HE metszetek sorozatában az infarktusok területét szoroztuk a metszetek közötti távolsággal.
Ezen vizsgálatunkban az alkalmazott PPl adagját (1,5 mg/kg
i.p.) empirikusan választottuk. Ismert., hogy a VEGF az agyvelőben fellépő agyi iszkémia után körülbelül 3 órával nyilvánul meg, és maximumát 12-24 órán belül éri el. Ebben a vizsgálatunkban a PPl-et az infarktus bekövetkezése után 30 perccel adtuk, és így a VEGF által előidézett vaszkuláris permeabílitás-nóvekvést teljesen blokkoltuk. A tipikus VEGF kifejeződésének időbeli lefutása szerint az Src-gátlók adagolására egy potenciális terápiás ablak lehetséges a sztrók után 12 órával terjedő időben. Olyan betegségekben, amelyek a vaszkuláris permeabílítás tartós növekedésével járnak, az Src-gátlő hatóanyag krónikus adagolása helvénvaló.
A 15. ábra grafikon, amely átlagolt infarktustérfogatokat (mm3) hasonlít össze egerek agyán a károsodást követően, ahol az egerek: heterogén Src (Src*/-), domináns negatív Src mutánsok (Src-Ρ), vad típusú egerek (WT), vagy 1,5 mg/kg PP 1-vel kezelt, vad típusú egerek (PPl) voltak.
egymást követő MRl letapogatására a CNS károsodását kiváltó kezelés után, ahol a PPl-vel kezelt állatokban (jobboldalon) végzett hogy az infarktus mértéke kisebb, mint letapogatás előrehaladása (a bal oldalon).
A találmány szerinti módszerek különösen végzett által kiváltott szövetkárosodás specifikus megakadályozására, mivel az Src-családhoz tartozó tirozin-kínázra gyakorolt gátlás a hatások elleni válaszok nélkül, és ez jótékony hatású lehet a károsodás gyógyulása során. Szemben a VEGF protein közömbösítésével, az Src gátlása nem zavarja a VEGF kumulatív (összegezett) angiogén hatását, amely a betegségnek egy későbbi stádiumában kedvező lehet.
biztonságosabb, és könnyebben kézben tartható, mint nar
például VEGF receptorból és egér immunglobulin elhasználása esetleg ártalmas lehet, és - embereken za -- ismételt adagolása nem engedhető meg allergiás reakció pro vokálisának a veszélye miatt (humán egér-ellenes U rövl
Végül a VEGF a későbbiekben keletkező Src-nek nem az egyetlen aktivátora; más citokínek ís szerepet játszanak az agyi íszkémia patofíziolögiájában, melyek a vaszkuláris
:1 az IL-6 és a TNF. Ennek alapján sa nem teltétlenul gátol minden, bekövetkező sérülést st), amelyek az Src aktivitásával kapcsolatban állnak,
Claims (23)
- kifejezettebb, mintha ezt a VEGF antagonlzmus hozza létre, és ez arra mutat, hogy más folyamatok is aktiválhatják az Src kínázokat, ami a permeabilitás növekedését megkönnyíti..Az előbbiekben leírt specifikációt elegendőnek ítéljük, hogy a szakterületen jártas egyén a találmányt gyakorlatban megvalósítsa.. A találmány nem korlátozódik oltalmi körében bármilyen más, elhelyezett sejttörzs által, mivel bármely deponált megvalósítási mód a találmány valamelyik vonatkozásának csupán egyetlen illusztrálása, és bármilyen sejttörzs, amely funkcionálisan egyenértékű, a találmány oltalmi kórén belül van. Az anyagnak a deponálása nem jelent olyan hozzájárulást, hogy az írott leírás nem elégséges a találmány valamelyik jellemző vonásának gyakorlati megvalósítására, beleértve a találmány legjobb megvalósítási módját is. Továbbá nem igénypontok oltalmi köre korlátozásának, hogy illusztrálást jelent. Ténylegesen a bemutatottokon kívül a találmány különböző módosításai és az itt leírtak különböző módosításai a szakterületen jártas személy számára a fenti leírásból nyilvánvalókká válnak, és a csatolt igénypontok oltalmi rén116Sza feadalmi ige ay pontok;1/ Gyógyászati készítmény, amely tirozm-kináz Src protein kifejezésére képes nukleinsavat és tirozin-kináz Yes protein kifejezésére képes nukleinsavat és gyógyászatílag alkalmas hordozóanyagot tartalmaz.
- 2/ .Az 1. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amelyben a tirozinkináz Src protein és a tirozin-kináz Yes protein kifejezésére képes nukleinsav két különálló nukleinsav.
- 3/ Az. 1, igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amelyben a tirozínkináz Sre protein és tirozin-kináz Yes protein kifejezésére képes nukleinsav egyetlen nukleinsav.
- 4/ Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény, amelyben az Sre protein a Src-A, vagy az 527 aminosav-maradék bármely aminosav-maradék lehet, kivéve a tirozint szerint vagy treonint, vagy az Src protein inaktív.
- 5/ A 4. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amelyben az inaktív Src protein Src K295M vagy Src 251.
- 6/ Az 1-3 . igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény, amelyben, a Yes- protein egy inaktív Yes protein.117
- 7/ Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény, amely valamely vlrális gén transzfer vektort vagy valamely nem-vírusos gén transzfer vektort tartalmaz.
- 8/ Valamely inaktív tirozin-kináz Yes protein, vagy inaktív tirozin-kináz Src és Yes protein keverékének kifejezésére képes nukleinsav felhasználása valar állapo' készítmény előállítására; síroké a )k, tumor növekedés, miokardiális infarktus, arferiosclerosis, agyi ödéma, cerebrovaszkuláris betegség vagy trauma, rheumatoid arthritis, diabéteszes retinopátia, gyulladásos betegségek, restenosis, agyvérzés, agyi és gerinc trauma hipoxia által kiváltott agyi és gerinc sérülés, a központi idegrendszer gyulladásos rendellenességei, a központi idegrendszer vírusos vagy bakteriális fertőzései, autoimmun rendellenességek, a vér-agygát permeabilitás krónikus megnövekedésével kapcsolatos betegségek, és tt légzéses elzáródásos szindróma ZARDS/ a megcélzott szövetben a vaszKuians s gattasa utp
- 9/ A 8. igénypont szerinti felhasználás, amely ben az inaktív Sre protein Src K295M, Src 251 vagy ezek keveréke.1ÖZ Aktív tirozin-kináz Yes protein, vagy aktív tirozin-kináz Src és Yes proteinek keverékének kifejezésére képes nukíeinsavak felhasználása patológiai állapotok, éspedig iskémás végtagok és krónikus sebek kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények előállítására, amely készítmények hatásukat a cél szövetben a vaszkuláris permeabilitás potencirozása uijfe118
- 11/Α lő. igénypont szerinti felhasználás amelynél az aktív Src protein S -A vagy az 527 helyzetű aminosav-rnaradék bármely aminosav-maradék lehet, kivéve a tírozint, szerint vagy treonint
- 12/ Csomagolóanyagot és a csomagolóanyagban foglalt gyógyászati készítményt tartalmazó gyártási tennék, amelyben a gyógyászati készítmény képes a vaszkuláris permeabilitás módosítására egy kóros állapotban szenvedő szö vetben, amely csomagolóanyag egy címkét hordoz, amely feltünteti, hogy a gyógyászati készítmény kóros állapotok kezelésére alkalmazható a vaszkuláris, permeabilitás módosítása utján; s amely gyógyászati készítmény a tírozin-Kmáz Y es protein es nukleinsavat tartalmaz gyógyászati hordozóanyagban.
- 13/ A 12. igénypont szerinti gyártási termék, készítmény tírozin-kináz Src protein Kitej tartalmaz.A 13. igénypont szerinti gyártási tennék aktív vagy inaktív Src.mén a gy ógy ászati avat ís v oen az négy
- 15/ A Kigénypont szerinti gyártási termék amelyben az aktív Src protein Src -A, vagy az 527 helyzetű amínosav maradék bármely amínosav kivéve a tirozínt, szerint vagy treonint.
- 16/ A 14,igénypont szerinti gyártási termék, amelyben az inaktív Src Src K.295M. vagy Src 251.119
- 17/ A 12. vagy 13. igénypont szerinti gyártási tennék, amelyben a Yes protein aktív vagy inaktív.
- 18/ A 13.igénypont szerinti gyártási re és Yes proteineket Sre protein és Yes protein kifejezésére képes nukleinsavak keveréke kódolja.
- 19/ Gyógyászati készítmény, amely tlrozin kináz Sre és Yes pro gyógyászati í&a alkalmas hordozóanyagot tartalmaz.\v.* A* )/' A 19. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amelyben a SreSrc -A, vagy az 527 aminosav y aminosav maradék lehet, kivéve a tirozínt, szerint vagy treonint, vagy a Sre pix
- 21/ A 20. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amelyben az inaktív Sre protein Src K2295M vagy Src 251.
- 22/ A 19. igénypont szerinti gyógyászati kés protein egy inaktív Yes gvászati ?nv, amely egy z tnozin-kmaz Yes proteint, vagy inaktív tlrozin kináz Src és Yes proteinek keverékét tartalmazza, a valamely kóros állapotban szenvedő szövetekben a vaszkuláris permeabilitás módosítására történő felhasználásra, mimellett az említett szövetet a fenti gyógyászati készítmény gyógyászatílag hatásos VP módosító mennyiségével hozzak érintkezésbe, és a betegség valamely120 stroke által kiváltott károsodás, tumomövekedés, miokardiáüs infarktus, arteriosclerosis, agyi ödéma, eerebrovaszkuláris betegség vagy trauma, rheumatoid arhtritis, diabéteszes retinopátia, arthritis,, gyulladásos betegségek, krónikus artikuláris reuma és psoriasis, restenosis, cerebrális agyvérzés, agyi és gerinc trauma,, hipoxia által kiváltott agyi és gerinc sérülés, a központi idegrendszer gyulladásos rendellenességei, a központi idegrendszer vírusos vagy bakteriális fertőzései, a vér-agy-gát permeabilitás krónikus növekedése által kiváltott betegségek, felnőtt lészéses lásos· szindróma ZARDSZ és metasztázis képződés.' Gyógyászati készítmény, amely egy aktív tirozin-kináz Yes proteint vagy aktív tirozín kínáz Sre és Yes proteinek: keverékét tartalmazza, valamely kóros állapotban szenvedő szövetben a vaszkuláris permeabilitás módosítására történő felhasználásra oly módon, hogy a szövetet valamely fenti gyógyászati készítmény gyógyászatilag hatásos VP végtag vagy
- 25/ Gyártási tennék, amely csomagolóanyagot és a csomagoló; levő gyógyászati készítményt tartalmaz, amely gyógyászati készítmény valamely kóros állapotban szenvedő szövetben a vaszkuláris permeabilitás módosítására képes, amely csomagolóanyag egy címkét hordoz, amely feltünteti, hogy a gyógyászati készítmény a vaszkuláris permeabilitásVosítása által betegségállapotok kezelésére alkalmazható, mimellett a ti gyógyászati készítmény tirozin-kináz. Src proteint és Yes proteint tartalmaz, gyógyászatilag alkalmas hordozóanyaggal együtt.módosítása által betegségé
- 26/ Gyártási termék, amely csomagolóanyagot és e csomagoló: gyógyászati készítményt tartalmaz, mimellett a gyógyászati készítmény valamely kóros állapotban szenvedő szövetben a vaszkuláris permeabilitás módosítására képes, mimellett a csomagolóanyag egy címkét hordoz, amely feltünteti, hogy a gyógyászati készítmény vaszkuláris permeabilitás , a mimellett a gyógyászati készítmény tirozin-kináz Yes proteint tartalmaz, győgyászatilag alkalmas hordozóanyaggal együtt.
- 27/ Gyógyászati készítmény, amely az Src családba tartozó tirozin kináz inhibitort tartalmaz, vaszkuláris szi várgással vagy ödémával összefüggő szövetkárosodás javítására történő felhasználásra oly módon, hogy a fenti szövetet a fenti gyógyászati készítmény vaszkuláris permeabilitást módosító mennyiségével hozzuk érintkezésbe, mimellett az Src családba tartozó tirozin kináz inhibitor valamely inaktív Yes protein, valamely inaktív Src protein és inaktív Yes protein keveréke vagy valamely inaktív Yes protein és/vagy inaktív Src protein keveréke, egy PP1, PP2,PD 173955, AGL 1872,R2I46 vagy Gekianamvcin al es
- 28/ Gyártási termék, amely csomagolóanyagot és e csomagolóanyagban gyógyászati készítményt tartalmaz, melv gyógyászati készítmény valamely kóros állapotban szenvedő szövetben a vaszkuláris permeabilitás növekedés módosítására képes, mimellett a csomagolóanyag egy címkét hordoz, amely feltünteti, hogy a gyógyászati készítmény betegségállapotokkal összefüggő vaszkuláris szivárgás vagy ödéma kezelésére alkalmazható, mimellett a gyógyászati készítmény az Src családba tartozó tirozin kináz inhibitort és győgyászatilag alkalmas hordozóanyagot tartalmaz, mimellett az Src családba tartozó tirozin kináz inhibitor valamely inaktív Yes protein, valamely inaktív Sre protein és inaktív Yes protein keveréke vagy valamely inaktív Yes protein és/vagy inaktív Src protein keveréke, egy PP1, PP2, PD173955, ÁGL1872,PD162531, Radicicol R2146 vagy Geldanamycin kémiai inhibitorral együtt.Á meghatalmazott:
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/470,881 US6685938B1 (en) | 1998-05-29 | 1999-12-22 | Methods and compositions useful for modulation of angiogenesis and vascular permeability using SRC or Yes tyrosine kinases |
| US53824800A | 2000-03-29 | 2000-03-29 | |
| PCT/US2000/035396 WO2001045751A1 (en) | 1999-12-22 | 2000-12-22 | Angiogenesis and vascular permeability modulators and inhibitors |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0203957A2 HUP0203957A2 (hu) | 2003-03-28 |
| HUP0203957A3 HUP0203957A3 (en) | 2005-07-28 |
| HU229628B1 true HU229628B1 (en) | 2014-03-28 |
Family
ID=27043259
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0203957A HU229628B1 (en) | 1999-12-22 | 2000-12-22 | Angiogenesis and vascular permeability modulators and inhibitors |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP1250155B1 (hu) |
| JP (1) | JP2003518077A (hu) |
| KR (1) | KR100813818B1 (hu) |
| CN (1) | CN1434727A (hu) |
| AT (2) | ATE392215T1 (hu) |
| AU (1) | AU781444B2 (hu) |
| BR (1) | BR0016547A (hu) |
| CA (1) | CA2395136A1 (hu) |
| CZ (1) | CZ304320B6 (hu) |
| DE (1) | DE60038631T2 (hu) |
| DK (2) | DK1905457T3 (hu) |
| ES (2) | ES2383763T3 (hu) |
| HU (1) | HU229628B1 (hu) |
| NO (1) | NO20023036L (hu) |
| PL (1) | PL356815A1 (hu) |
| PT (2) | PT1905457E (hu) |
| RU (1) | RU2271216C2 (hu) |
| SK (1) | SK287575B6 (hu) |
| WO (1) | WO2001045751A1 (hu) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030130209A1 (en) * | 1999-12-22 | 2003-07-10 | Cheresh David A. | Method of treatment of myocardial infarction |
| WO2002016369A2 (en) | 2000-08-25 | 2002-02-28 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Novel macrocycles and uses thereof |
| AU2003220390A1 (en) * | 2002-03-18 | 2003-10-08 | Medtronic Ave Inc. | Medical devices for delivering anti-proliferative compositions to anatomical sites at risk for restenosis |
| WO2004006947A1 (en) * | 2002-07-12 | 2004-01-22 | Yihai Cao | A method for inhibiting vascular permeability and tissue edema |
| EP1413887A1 (en) * | 2002-10-22 | 2004-04-28 | Aventis Pharma S.A. | Inhibitors of Src kinase for use in Alzheimer's disease |
| WO2004056386A2 (en) * | 2002-12-19 | 2004-07-08 | To-Bbb Holding B.V. | Nucleic acids involved in blood-brain barrier control |
| GB0307333D0 (en) * | 2003-03-29 | 2003-05-07 | Astrazeneca Ab | Therapeutic agent |
| EP2260849A1 (en) * | 2004-01-21 | 2010-12-15 | Emory University | Compositions and methods of use for tyrosine kinase inhibitors to treat pathogenic infection |
| US20060094682A1 (en) | 2004-10-29 | 2006-05-04 | Odyssey Thera, Inc. | Kinase inhibitors for the treatment of diabetes and obesity |
| WO2007076454A1 (en) * | 2005-12-23 | 2007-07-05 | Alcon, Inc. | Pharmaceutical formulation for delivery of receptor tyrosine kinase inhibiting (rtki) compounds to the eye |
| BRPI0711901A2 (pt) * | 2006-05-22 | 2012-03-06 | The Regents Of The University Of California | Composições e métodos para a liberação de oxigênio |
| EP1862802B1 (en) * | 2006-06-01 | 2008-12-10 | Cellzome Ag | Methods for the identification of ZAP-70 interacting molecules and for the purification of ZAP-70 |
| DE102007037008B4 (de) * | 2007-08-06 | 2015-09-10 | Siemens Aktiengesellschaft | Diagnosesubstanz zur Anwendung in einem Verfahren zur Bestimmung der Aggressivität eines Prostatatumors |
| JP5701308B2 (ja) * | 2009-10-29 | 2015-04-15 | インダストリー−アカデミック コーポレーション ファウンデーション，ヨンセイ ユニバーシティ | 新規血管漏出遮断剤 |
| US8557513B2 (en) * | 2011-06-27 | 2013-10-15 | Biocrine Ab | Methods for treating and/or limiting development of diabetes |
| US10293023B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-05-21 | Children's Medical Center Corporation | Method of altering vascular permeability and uses thereof |
| CN105288654B (zh) * | 2015-01-23 | 2018-11-30 | 中国人民解放军第二军医大学 | 蛋白酪氨酸激酶fyn癌基因在防治肠道病毒71型感染中的应用 |
| CN105311645B (zh) * | 2015-01-23 | 2018-11-30 | 中国人民解放军第二军医大学 | 胚胎fyn相关底物efs在防治肠道病毒71型感染中的应用 |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4356167A (en) | 1978-01-27 | 1982-10-26 | Sandoz, Inc. | Liposome drug delivery systems |
| US5092885A (en) | 1987-02-12 | 1992-03-03 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Peptides with laminin activity |
| US5112946A (en) | 1989-07-06 | 1992-05-12 | Repligen Corporation | Modified pf4 compositions and methods of use |
| US5542935A (en) | 1989-12-22 | 1996-08-06 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Therapeutic delivery systems related applications |
| US5580575A (en) | 1989-12-22 | 1996-12-03 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Therapeutic drug delivery systems |
| US5192744A (en) | 1990-01-12 | 1993-03-09 | Northwestern University | Method of inhibiting angiogenesis of tumors |
| EP0513161B1 (en) * | 1990-01-26 | 1995-04-05 | Washington Research Foundation | Immune reactivity to expressed activated oncogenes for diagnosis and treatment of malignancy |
| DE69114782T2 (de) | 1990-08-08 | 1996-04-18 | Takeda Chemical Industries Ltd | Intravaskulär embolisierendes Mittel mit Gehalt an einem die Angiogenesis hemmenden Stoff. |
| US5753230A (en) | 1994-03-18 | 1998-05-19 | The Scripps Research Institute | Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis |
| US5643599A (en) | 1995-06-07 | 1997-07-01 | President And Fellows Of Harvard College | Intracellular delivery of macromolecules |
| US5922697A (en) * | 1996-10-02 | 1999-07-13 | Warner-Lambert Company | Compounds, compositions and methods for inhibiting the binding of proteins containing an SH2 domain to cognate phosphorylated proteins |
| US6093740A (en) * | 1997-04-30 | 2000-07-25 | Eli Lilly And Company | Therapeutic treatment for skin disorders |
| CA2289102A1 (en) * | 1997-05-07 | 1998-11-12 | Sugen, Inc. | 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity |
| US6723694B1 (en) * | 1997-05-21 | 2004-04-20 | The Children's Medical Center Corp. | Short peptides which selectively modulate intracellular signalling |
| US6420338B1 (en) * | 1997-06-13 | 2002-07-16 | New York University Medical Center | Inhibition of the Src kinase family pathway as a method of treating HBV infection and hepatocellular carcinoma |
| EP1021182A1 (en) * | 1997-10-06 | 2000-07-26 | Basf Aktiengesellschaft | Indeno[1,2-c] pyrazole derivatives for inhibiting tyrosine kinase activity |
| AU762955C (en) * | 1998-05-29 | 2005-03-24 | Government Of The United States Of America, The | Methods and compositions useful for modulation of angiogenesis using tyrosine kinase SRC |
| JP2002529421A (ja) * | 1998-11-06 | 2002-09-10 | ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト | 血管過浸透性の阻害方法 |
-
2000
- 2000-12-22 JP JP2001546690A patent/JP2003518077A/ja active Pending
- 2000-12-22 SK SK849-2002A patent/SK287575B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-12-22 DE DE60038631T patent/DE60038631T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-22 PT PT07020078T patent/PT1905457E/pt unknown
- 2000-12-22 KR KR1020027008102A patent/KR100813818B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-12-22 PT PT00990365T patent/PT1250155E/pt unknown
- 2000-12-22 AT AT00990365T patent/ATE392215T1/de active
- 2000-12-22 ES ES07020078T patent/ES2383763T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-22 CN CN00819151A patent/CN1434727A/zh active Pending
- 2000-12-22 PL PL00356815A patent/PL356815A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2000-12-22 EP EP00990365A patent/EP1250155B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-22 WO PCT/US2000/035396 patent/WO2001045751A1/en active Application Filing
- 2000-12-22 RU RU2002119399/15A patent/RU2271216C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-12-22 DK DK07020078.7T patent/DK1905457T3/da active
- 2000-12-22 AT AT07020078T patent/ATE553782T1/de active
- 2000-12-22 DK DK00990365T patent/DK1250155T3/da active
- 2000-12-22 CA CA002395136A patent/CA2395136A1/en not_active Abandoned
- 2000-12-22 HU HU0203957A patent/HU229628B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2000-12-22 BR BR0016547-6A patent/BR0016547A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-12-22 ES ES00990365T patent/ES2303514T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-22 EP EP07020078A patent/EP1905457B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-22 AU AU27400/01A patent/AU781444B2/en not_active Ceased
- 2000-12-22 CZ CZ2002-2156A patent/CZ304320B6/cs not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-06-21 NO NO20023036A patent/NO20023036L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1434727A (zh) | 2003-08-06 |
| ES2383763T3 (es) | 2012-06-26 |
| CZ304320B6 (cs) | 2014-03-05 |
| ATE392215T1 (de) | 2008-05-15 |
| DE60038631T2 (de) | 2009-06-10 |
| AU781444B2 (en) | 2005-05-26 |
| PT1250155E (pt) | 2008-06-06 |
| DK1250155T3 (da) | 2008-08-25 |
| ATE553782T1 (de) | 2012-05-15 |
| RU2271216C2 (ru) | 2006-03-10 |
| HUP0203957A3 (en) | 2005-07-28 |
| NO20023036L (no) | 2002-07-22 |
| DK1905457T3 (da) | 2012-05-29 |
| NO20023036D0 (no) | 2002-06-21 |
| WO2001045751A1 (en) | 2001-06-28 |
| EP1905457A1 (en) | 2008-04-02 |
| KR20020063259A (ko) | 2002-08-01 |
| EP1250155A4 (en) | 2003-08-20 |
| SK8492002A3 (en) | 2002-11-06 |
| EP1250155A1 (en) | 2002-10-23 |
| EP1250155B1 (en) | 2008-04-16 |
| PT1905457E (pt) | 2012-05-25 |
| BR0016547A (pt) | 2002-10-29 |
| DE60038631D1 (de) | 2008-05-29 |
| ES2303514T3 (es) | 2008-08-16 |
| EP1905457B1 (en) | 2012-04-18 |
| CA2395136A1 (en) | 2001-06-28 |
| PL356815A1 (en) | 2004-07-12 |
| RU2002119399A (ru) | 2004-02-27 |
| JP2003518077A (ja) | 2003-06-03 |
| AU2740001A (en) | 2001-07-03 |
| SK287575B6 (sk) | 2011-03-04 |
| HUP0203957A2 (hu) | 2003-03-28 |
| KR100813818B1 (ko) | 2008-03-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2232985C (en) | Methods for treating cancers and restenosis with p21 | |
| HU229628B1 (en) | Angiogenesis and vascular permeability modulators and inhibitors | |
| US7585841B2 (en) | Methods and compositions useful for modulation of angiogenesis using tyrosine kinase Src | |
| US20060040853A1 (en) | Methods and compositions useful for modulation of angiogenesis using protein kinase Raf and Ras | |
| JP2002528390A (ja) | 細胞の生存を増強するためのａｋｔ組成物 | |
| MXPA02006207A (en) | Angiogenesis and vascular permeability modulators and inhibitors | |
| ZA200201761B (en) | Methods and compositions useful for modulation of angiogenesis using protein kinase Raf and Ras. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |