DE60030850T2

DE60030850T2 - Verfahren zur behandlung von tumoren mittels antiangiogener substanzen

Info

Publication number: DE60030850T2
Application number: DE60030850T
Authority: DE
Inventors: K. Steven North Potomac LIBUTTI; Andrew Greenbelt FELDMAN
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1999-05-07
Filing date: 2000-05-05
Publication date: 2007-09-20
Anticipated expiration: 2020-05-06
Also published as: DE60030850D1; EP1179061A1; JP2003510015A; AU781134B2; EP1179061B1; CA2372699A1; AU4824900A; ATE340260T1; WO2000068379A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung umfasst im Allgemeinen antiangiogene Verbindungen und Zusammensetzungen und Verfahren zur Verwendung von antiangiogene Verbindungen und Zusammensetzungen. Im Speziellen umfasst die Erfindung Verfahren zur Herstellung von antiangiogenen Verbindungen, Verfahren zur Abgabe von antiangiogenen Verbindungen, Verfahren zur Behandlung unter Verwendung von antiangiogenen Verbindungen, und Verfahren zum Screening von antiangiogenen Verbindungen in Bezug auf Bioaktivität unter Verwendung eines Virusexpressionssystems.
Hintergrund der Erfindung
Die Angiogenese ist jetzt anerkannt als ein kritischer Prozess bei der Tumorprogression und ist erforderlich für ein starkes Wachstum solider Tumore. Der Übergang von einem nicht angiogenen zu einem angiogenen Phänotyp und die darauf folgende Tumorgefäßbildung betrifft positive und negative Regulatoren der Angiogenese (Gibaldi M. 1998. „Regulating angiogenesis: a new therapeutic strategy „J. Clinic. Pharmacol. 38: 898–903.). Die Weiche zur Angiogenese wird normalerweise dann durch eine Teilmenge der Tumorzellen in der in Situ-Läsion gestellt. Die neuen, rekrutierten Mikrogefäße bieten ein neovaskuläres Geflecht, das das Wachstum fördert und die Invasion und Metastasenbildung von sich schnell ausbreitender Tumormasse fördert (O'Reilly et al. 1994. „Angiostatin: A Circulating Endothelial Cell Inhibitor That Suppresses Angiogenesis and Tumor Groth." Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, LIX 471–482). Die Regulierung von Gefäßwachstum beinhaltet auch komplexe Wechselwirkungen von extrazellulären Matrixmolekülen, proteolytischen Enzymen und Zelladhäsionsmolekülen. Jeder Schritt im Angiogeneseprozess stellt einen potentiellen Angriffspunkt für die therapeutische Antikrebsstrategie dar.
Endostatin ist ein Protein, das durch Spaltung des Vorläufers Kollagen XVIII entsteht. Es ist ein endogener Inhibitor der Angiogenese und des Tumorwachstums, das die Angiogenese vollständig oder nahezu vollständig inhibieren kann und einen Ruhezustand oder eine Regression von großen Tumoren in Mäusen induzieren kann (Wu et al. 1997. „Suppression of Tumor Groth with Recombinant Murine Angiostatin" Biochem and Biophys. Res. Comm. 236: 651–654). Die systematische Verabreichung von Endostatin an tumortragende Tiere führt zur Regression von Blutgefäßen, was zur Regression der Tumoren führt. Darüber hinaus fördert Endostatin nicht die Wirkstoffresistenz, ein Problem, das mit der Chemotherapie oder anderen cytochemischen Therapien einhergeht (Boehm et al. 1997. „Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acguired drug restince „Nature 390: 404–407.). Die Schwierigkeiten bei der Herstellung von ausreichend rekombinantem Endostatin für die umfassende klinische Verwendung stellen jedoch ein signifikantes Hindernis bei der Entwicklung des Endostatin-Therapiemodells dar.
Virale Vektoren, die antiangiogene Proteine enthalten, werden im Stand der Technik offenbart, zum Beispiel in WO 98/49321. Hieraus ist eine fehlerhafte Replikation des Adenovirus-Vektors bekannt. Darüber hinaus berichten T. TANAKA et al. über eine gezielte antiangiogene Gentherapie mittels viraler Vektoren unter Verwendung von zu Angiostatin komplementärer DNA in Cancer Research Bd. 58, Nr. 15, Seiten 3362–3369 (1. August 1998). J. L. Bramson et al. publizierten einen Artikel mit dem Titel „Direct intratumoral injection of an adenovirus expressing Interleukin-12 induces regression and long-lasting immunity that is associated with highly localized expression of Interleukin-12" in HUMAN GENE THERAPY, Bd. 7, Seiten 1995–2002 (20. Oktober 1996). Über die Hemmung von Angiogenese und Tumorwachstum durch eine durch den viralen Vektor vermittelte Transduktion eines modifizierten Plättchen-Vektors von cDNA wurde von T. TANAKA et al. in NATURE MEDICINE, Bd. 3, Nr. 4, Seiten 437–442 (1997) berichtet.
Darüber hinaus wurden antiangiogene Vektoren in verschiedenen Dokumenten beschrieben, zum Beispiel bei M. Schwarz et al. in „EMAP II: A modulator of neovascularization in the developing lung" American Journal of Physiology, Bd. 20, Nr. 2, Seiten L365–L375 (Februar 1999); S. E. Pike et al. „Vasostatin, a calreticulin fragment, inhibits angiogenesis and suppresses tumor growth" Journal of Experimental Medicine, Bd. 188, Nr. 12, Seiten 2349–2356 (21. Dezember 1998); WO 97/34586 A; von C. A. Shuttleworth in „Type VIII collagen" International Journal of Biochemistry & Cell Biology, Bd. 29, Nr. 10 Seiten 1145–1148 (Oktober 1997); und in zwei Artikeln von R. Ramchandran et al. mit dem Titel: „Antiangiogenic activity of restin, NC 10 domain of human collagen XV: Comparison to endostatin" Biochemical and Biophysical Research Communications, Bd. 255, Nr. 3, Seiten 735–739 (24. Februar 1999); und „Cloning, expression of a novel antiangiogenic protein: Restatin" Proceedings of the American Association for Cancer Research, Bd. 40, Seite 620 (März 1999). Keines dieser Dokumente offenbart jedoch einen viralen Vektor, der eine Expression eines antiangiogenen Proteins in zirkulierenden Mengen erzielt, die ausreichen, um einen Tumor zu behandeln.
Die vorliegende Erfindung stellt ein verbessertes Verfahren zum Transport bzw. zur Abgabe von Endostatin in Zellen bereit, bei dem ein Adenovirusvektor, der ein Endostatingen trägt, verabreicht wird. Eine weitere einzigartige Besonderheit dieses adenoviralen Konstrukts ist eine adenovirale E3/19K-Signalsequenz mit 18 Aminosäuren, die die Ausscheidung von Endostatin aus Zellen erlaubt, die mit dem adenoviralen Vektor infiziert sind. Die hier beschriebenen Verfahren offenbaren ein System, das Virusvektoren bereitstellt, die eine Nucleinsäure, die Endostatin kodiert, enthält, um ein wirksames Mittel zum Gentransfer in eine Vielzahl von Zelltypen bereit zu stellen. Zusätzlich führt der virusvermittelte Gentransfer zu einem hohen Maß an Proteinexpression. Die Kombination aus einfachem Gentranfer und hochspezifischer Aktivität liefert ein schnelles Mittel zur Produktion signifikanter Mengen rekombinanter Moleküle, entweder zur anschließenden Verabreichung an einem Wirt oder zur Herstellung von Endostatin in einem Wirt. Die Fähigkeit zur Herstellung von sekretorischem Endostatin erlaubt die Herstellung von löslichem Endostatin an der Stelle der Adenovirusinfektion, das durch den Körper zirkulieren kann und eine effizientere Behandlungsstrategie erlaubt. Die vorliegenden Verfahren stellen somit auch benötigte verbesserte therapeutische Verfahren zur Behandlung von Tumoren bereit, die die nachteiligen Nebenwirkungen früherer Behandlungen vermeiden.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung, wie sie hier ausgeführt und breit geschrieben ist, liefert diese Erfindung in einem Aspekt eine Verbindung, die eine rekombinante Nukleinsäure enthält, die ein antiangiogenes Protein codiert, das operativ mit einer Adenovirus-E3/19K-Signalsequenz verbunden ist, die in eine virale Nukleinsäure insertiert ist, wobei die rekombinante Nukleinsäure in ein Viruspartikel verpackt sein kann und wobei die Expression der rekombinanten Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert, zur Produktion des antiangiogenen Proteins führt.
Die vorliegende Erfindung offenbart auch ein Verfahren zur Abgabe eines antiangionen Proteins an eine Zelle, das beinhaltet, dass der Zelle ein Virus verabreicht wird, der eine rekombinante Nukleinsäure enthält, die ein antiangiogenes Protein codiert, das in die virale Nukleinsäure insertiert ist, wobei die rekombinante Nukleinsäure in ein Virusteilchen verpackt sein kann und wobei die Expression der rekombinanten Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert, zur Produktion des antiangiogenen Proteins führt, wodurch das antiangiogene Protein der Zelle zugeführt wird.
Die Erfindung offenbart auch ein Verfahren zur Abgabe eines antiangiogenen Proteins an ein Individuum, das beinhaltet, dass dem Individuum ein Virus verabreicht wird, der eine rekombinante Nukleinsäure enthält, die ein antiangiogenes Protein codiert, das in die virale Nukleinsäure insertiert ist, wobei die rekombinante Nukleinsäure in ein Virusteilchen verpackt sein kann und wobei eine Zelle des Individuums die rekombinante Nukleinsäure exprimiert, die das antiangiogene Protein codiert, wodurch das antiangiogene Protein dem Individuum zugeführt wird.
Die vorliegende Erfindung offenbart auch ein Verfahren zur Behandlung eines Tumors in einem Individuum, das beinhaltet, dass dem Individuum ein Virus verabreicht wird, der eine rekombinante Nukleinsäure enthält, die ein antiangiogenes Protein codiert, das in die virale Nukleinsäure insertiert ist, wobei die rekombinante Nukleinsäure in ein Virusteilchen verpackt sein kann und wodurch eine Zelle in dem Individuum die rekombinante Nukleinsäure exprimiert, die das anti angiogene Protein codiert und das antiangiogene Protein erzeugt, wodurch der Tumor behandelt wird.
Bereit gestellt wird auch ein Verfahren, um ein antiangiogenes Protein zu erzeugen, das beinhaltet, dass an eine Zelle ein Virus verabreicht wird, der eine rekombinante Nukleinsäure enthält, die ein antiangiogenes Protein codiert, die in die virale Nukleinsäure insertiert ist, wobei die rekombinante Nukleinsäure in ein Virusteilchen verpackt sein kann und wobei die Expression der rekombinanten Nukleinsäure das antiangiogene Protein erzeugt.
Bereit gestellt wird auch ein Verfahren zum Screenen eines antiangiogenen Proteins auf biologische Aktivität, das beinhaltet, dass einer ersten Zelle ein Virus verabreicht wird, der eine rekombinante Nukleinsäure enthält, die das antiangiogene Protein codiert, wobei die erste Zelle die rekombinante Nukleinsäure exprimiert, die das antiangiogene Protein codiert und dadurch das antiangiogene Protein erzeugt, eine zweite Zelle mit dem antiangiogenen Protein in Kontakt gebracht wird und die zweite Zelle auf eine biologische Reaktion auf das antiangiogene Protein überwacht wird, wodurch das antiangiogene Protein auf biologische Aktivität gescreent wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt das SKL-35 Plasmid, das aus pSSmendo-6 (Maus-Endostatin mit Kozack und E19 Signalsequenz) und pAdCMV konstruiert wurde.
2 zeigt das SKL-22 Plasmid, das aus pkmendo-2 (Maus-Endostatin mit Kozack) und pAdCMV konstruiert wurde.
3 zeigt den Antitumoreffekt von AD-ssmEndo in vivo.
4 zeigt die Endostatin-Pegel im Überstand nach adenoviraler Infektion mit 293-Zellen.
5 zeigt die Endostatin-Pegel im Überstand nach adenoviraler Infektion von 293-Zellen.
6 zeigt die Hemmung von mikrovaskulären Lungenendothelzellen nach Inkubation mit dem viralen Überstand von Ad-ss-mEndo im Vergleich zu Ad-Luc.
7 zeigt Plasma-Endostatinpegel in Nacktmäusen 5 Tage nach intraperitonealer Injektion mit 10⁹ pfu Adenovirus.
8a ist eine schematische Darstellung eines adenoviralen Konstrukts, das ein ein Maus-Endostatingen enthält.
8b zeigt 293-Zellen, die mit Ad-ss-mEndo oder einer Adenoviruskontrolle (Ad-luc) infiziert sind, mit variierender Häufigkeit von Infektionen, was dosisabhängige Endostatinkonzentrationen im Überstand von 920 ± 33 ng/mL nach Ad-ssEndo-Infektion liefert.
8c zeigt einen Westernblot des Überstands von Zellen, wobei die Zellen, die mit Ad-ss-Endo (Bahn 7) nicht aber die mit Ad-luc (Bahn 6) infiziert waren, eine entsprechende 20 kD Bande zeigen. Die Bahnen 1–5 zeigen zweifache Verdünnung von rekombinantem Maus-Endostatin (1000 ng/mL bis 62,5 ng/mL).
9a zeigt, dass menschliche Melanom-Zellen, die mit Ad-ss-Endo infiziert sind, dosisabhängige Endostatinkonzentrationen im Überstand erzeugen.
9b zeigt, dass fünffache Verdünnung des Überstands die Proliferation von Rinderendothelzellen bis zu 61 ± 4% im Vergleich zu Überstand aus uninfizierten Zellen hemmten.
10 zeigt Plasmaendostatinpegel 2 bis 13 Tage nach einfacher intravenöser Injektion von Ad-ss-mEndo. Die Pegel waren 1770 ± 292 ng/ml nach 4 Tagen, und blieben signifikant höher als die Kontrolle am 13. Tag.
11a zeigt, dass Maus-Hepatocyten leicht durch Ad-β-gal infiziert wurden.
11b zeigt, dass MC38 Tumorzellen relativ resistent gegen adenovirale Infektion bei derselben Anzahl von Infektionen sind.
11c zeigt, das nach Ende eines zweiwöchigen Behandlungsexperiments, Tumore in Mäusen, die Ad-ss-mEndo erhalten haben, um 40% kleiner waren, als die Kontrolle.
12 zeigt, dass intravenöse Verabreichung von adenoviralen Vektoren, die Endostatingene tragen, zu hohen Endostatinpegeln (> 2000 ng/mL) führt.
13 zeigt, die retrovirale Transduktion von neoplastischen Maus-Hepatozyten mit Endostatingenen, die zur Sekretion von Endostatin führt, das ausreichend aktiv ist, um das Tumorwachstum zu hemmen.
DETAILIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist leicht durch die folgende detaillierte Beschreibung und die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung und die enthaltenen Beispiele zu verstehen.
Es wird darauf hingewiesen, dass die Singularformen „ein", „eine" und „der", „die", „das", die in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendet werden, auch die Pluralkomponenten mit einschließen, sofern der Kontext nicht dagegen spricht. Zum Beispiel kann eine Zelle, eine einzelne Zelle oder eine Population von Zellen bedeuten. Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbindung, die eine rekombinante Nukleinsäure enthält, die ein antiangiogenes Protein codiert, das operativ mit einer Adenovirus E3/K19-Signalsequenz verknüpft ist, die in eine virale Nukleinsäure insertiert ist, wobei die rekombinante Nukleinsäure in einem Viruspartikel verpackt sein kann und wobei die Expression der rekombinanten Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert zur Produktion von antiangiogenem Protein führt.
Somit betrifft die Erfindung in einer ihrer allgemeinsten Anwendungsformen einen rekombinanten Virus, der ein DNA Segment enthält, das eine Sequenz besitzt, die ein antiangiogenes Protein codiert. Die Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert, wird dann mit einem Teil einer viralen Nukleinsäure gekuppelt, der ausreichend ist, dass die Nukleinsäure in ein virales Partikel verpackt werden kann. Das antiangiogene Protein und deshalb die Nukleinsäure, die das antian giogene Protein dieser Erfindung codiert, kann eines von einer Vielzahl an solchen antiangiogenen Proteinen sein, wie sie im Stand der Technik bekannt sind. Eine beispielhafte Liste von bestimmten antiangiogenen Faktoren schließt Endostatin von Pigmentepithel stammenden Wachstumsfaktor (PEDF), endotheliales monozytisches aktivierendes Peptid II, Canstatin, interferoninduzierbares Protein-10, Tromospondin, EMAP-II, IP-10, Angiostatin, Vasostatin, Vasculostatin, IL-12, Thrombozytenfaktor 4, Spaltprodukte von Kollagen VIII, Spaltprodukte von Kollagen XV, wie Restin (Ramchandran et al. 1999 „Antiangiogenic activity of restin, NC 10 domain of human collagen XV: comparison to endostatin" Biochem. Biophys. Res. Commun. 24; 255 (3): 735–739), und Restatin ein, ohne darauf beschränkt zu sein.
Der Fachmann kann abschätzen, dass der Virusvektor, der in den beanspruchten Verfahren, und als Teil der Verbindungen, wie sie hier beansprucht werden, verwendet wird, auch jeden viralen Vektor umfasst, der antiangiogene Verbindungen produzieren kann oder einen, der dazu verwendet werden kann, eine antiangiogene Verbindung zu produzieren. Zum Beispiel kann der Virus rekombinante Adenovirusvektoren (Mitani et al. „Transduction of human bone marrow by adenoviral vector. „Human Gene Therapy 5: 941–948 (1994)), adenoassoziierte virale Vektoren (Goodman et al. "Recombinant adenoassociated virus-mediated gene transfer into hematopoietic progenitor cells." Blood 84: 1492–1500 (1994)), lentivirale Vektoren (Naidini et al. "In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector." Science 272: 263–267 (1996)), pseudotypische retrovirale Vektoren (Agrewal et al. "Cell-cycle kinetics and VSV-G pseudotyped retrovirus mediated gene transfer in blood-derived CD34⁺ cells." Exp. Hematol. 24: 738–747 (1996)), Vacciniavektoren enthalten und umfasst physikalische Transfektionstechniken (Schwarzenberger et al. "Targeted gene transfer in blood to human hematopoietic progenitor cell lines through the c-kit receptor." Blood 87: 472–478 (1996)). Diese Erfindung kann in Verbindung mit einer dieser oder anderer gängig verwendeter Gentransfermethoden verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält der spezifische Vektor zum Transport der Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert, einen Adenovirus- oder einen Retrovirusvektor. Der Retrovirus kann einer aus der Retrovirus-Unterfamilie der Oncovirinae sein, z. B. HTLV-1 oder HTLV-2 (menschlicher T-Zellen Leukämievirus Typ 1 bzw. Typ 2). Außerdem kann der Retrovirus einer aus der Retrovirus-Unterfamilie der Lentiviren sein, wie HIV-1, HIV-II, SIV, FIV, EIAV und CAEV (Humanimmunschwäche-Virus Typ 1, Humanimmunschwäche Virus Typ 2, Simian-Immunschwäche-Virus, Katzen-Immunschwäche-Virus, Infektiöser Pferd-Anämievirus, bzw. Ziegen-Arthritis-Encephalitis-Virus).
Die Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert, kann an jeder Stelle des Genoms des Virus positioniert werden, wobei das Virusgenom mit dieser Sequenz, die das antiangiogene Protein codiert, noch in einem Viruspartikel verpackt sein kann. Zum Beispiel haben Ghosh-Choudhury et al. angegeben, dass die maximale Menge an Nukleinsäure, die der Adenovirus in virale Capside packen kann, näherungsweise 2000 Basen mehr als das Wildtypgenom hat. (Ghosh-Choudhury et al., (1987) EMBO J. 6: 1733–1739). Es ist daher möglich, die antiangiogenes Protein kodierende Nukleinsäure innerhalb oder zum Beispiel im Austausch mit der E1-Region des Adenovirus zu positionieren, um z. B. das E1 Gen zu unterbrechen, und dadurch die zelluläre Transformationskapazität dieses adenoviralen Gens zu inaktivieren, so wie den rekombinanten Virus zu befähigen zu exprimieren und dadurch das gewünschte antiangiogene Protein zu produzieren. Die minimale Menge der adenoviralen Nukleinsäure in diesen Konstrukten ist die Menge, die es zulässt, die rekominante adenovirale antiangiogene Nukleinsäure zu verpacken. Außerdem wird die Insertionstelle der Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert, in das adenovirale Genom oder einen Teil davon, so ausgewählt, dass die fertige rekombinante Nukleinsäure, gepackt werden kann, so wie es dem Fachmann bekannt ist.
Der Ausdruck „adenovirales Genom" oder „Adenovirusgenom" wird hier für eine adenovirale Nukleinsäure verwendet, die in der Lage ist, in einen Adenoviruspartikel gepackt zu werden. Zu diesem Zweck kann die Nukleinsäure ein komplettes adenovirales Wildtyp-Genom oder Mutanten davon enthalten, oder ein Konstrukt, wobei die einzigen adenoviralen Sequenzen die anwesend sind, solche sind, die die Nukleinsäure befähigen in einen Adenoviruspartikel gepackt zu werden, oder jegliche Variation davon. Packbare Längen von Nukleinsäuren für spezifische antiangiogene Proteine sind im Stand der Technik bekannt. Das adenovirale Genom kann mit jedem gewünschten Nukleinsäure-Insert gekuppelt werden, z. B. einem antiangiogenen Protein, so dass das adenovirale Genom, wenn es in ein Adenoviruspartikel gepackt ist, auch das Nukleinsäureinsert einpackt. Dem Fachmann ist bekannt, dass das Nukleinsäureinsert, das mit der adenoviralen Nukleinsäure kombiniert ist, die komplette Nukleinsäurelänge umfasst, die erlaubt, die komplette Nukleinsäure in ein Adenoviruspartikel zu verpacken.
Unter dem Begriff „Verbindung enthaltend eine rekombinante Nukleinsäure" wird verstanden, dass die Nukleinsäure eine der gängig verwendeten Nukleinsäuren ist, aber diese Verbindung kann zum Beispiel auch ein Derivat einer typischen Nukleinsäure sein, z. B. eine Nukleinsäure, die so modifiziert ist, dass sie terminale oder interne Reportermoleküle enthält, oder solche Nukleinsäuren, die untypische Basen oder Zucker enthalten. Diese Reportermoleküle schließen Isotope und nicht isotopische Reportermoleküle ein, ohne darauf beschränkt zu sein. Beispiele für nichtisotopische Reportermoleküle schließen, ohne darauf beschränkt zu sein Biotin, LC-Biotin, Fluorescein, Acridin, Cholesterol, und Dinitrophenylmarker, die an ein 2-Aminobutyl-1,3-propandiol-Gerüst gebunden sein können, ein (Clontech, Palo Alto, CA).
Dem Fachmann ist bekannt, dass es zahlreiche Techniken gibt, durch die man Nukleinsäuresequenzen, die antiangiogene Proteine codieren, erhalten kann. Ein Beispiel für eine Methode, um eine Nukleinsäure zu erhalten, ist durch Konstruktion der Nukleinsäure durch Synthese eines rekombinanten DNA-Moleküls. Im Stand der Technik sind zum Beispiel Oligonukleotid-Syntheseverfahren Routine und Oligonukleotide, die ein bestimmtes Protein kodieren oder regulatorische Regionen codieren, können leicht mit automatischer DNA-Synthese erhalten werden. Eine Nukleinsäure für einen Strang eines doppelsträngigen Moleküls kann synthetisiert und mit dem komplementären Strang hybridisiert werden. Man kann diese Oligonukleotide so entwerfen, dass das resultierende Doppelstrangmolekül entweder interne Restriktionsstellen hat oder entsprechende Überlappungen am 5' oder 3'-Ende zum Klonieren in einen entsprechenden Vektor. Doppelsträngige Moleküle, die relativ große Proteine oder regulatorische Regionen codieren, können synthetisiert werden, indem zuerst einige unterschiedliche doppelsträngige Moleküle, die für spezielle Regionen des Proteins oder regulatorische Regionen codieren, konstruiert werden und dann diese DNA-Moleküle miteinander ligiert werden. Zum Beispiel haben Cunningham, et al., „Receptor and Antibody Epitopes in Human Growth Hormone Identified by Homolog- Scanning Mutagenesis" Science, Bd. 243, S. 1330–1336 (1989), ein synthetisches Gen konstruiert, das das menschliche Wachtumshormongen codiert, indem sie erst überlappende und komplementäre synthetische Oligonukleotide konstruierten und dann diese Fragmente ligierten. Siehe auch Ferretti, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 82: 599–603 (1986), worin die Synthese eines synthetischen Rinder-Rhodopsingens aus 1057 Basenpaaren mit synthetischen Oligonukleotiden offenbart ist. Ist die entsprechende DNA synthetisiert, kann sie stromabwärts eines entsprechenden Promoters kloniert werden. Die Techniken entsprechen der allgemeinen Routine und sind im Stand der Technik bestens beschrieben.
Ein weiteres Beispiel für ein Verfahren, um eine Sequenz zu erhalten, die ein antiangiogenes Protein codiert, ist es, traditionelle rekombinante Techniken zu verwenden, um die Sequenz aus den nativen Quellen der einzelnen Komponenten zu erzeugen. Man kann die entsprechende Wildtyp-Nukleinsäure für einen Teil des antiangiogenen Proteins oder das gesamte antiangiogene Protein aus dem Organismus isolieren, in dem es zu finden ist, und es in einem geeigneten Vektor klonieren. Z. B. kann eine DNA- oder cDNA-Bibliothek konstruiert werden und auf die Gegenwart der interessierenden Nukleinsäure gescreent werden. Verfahren, um solche Bibliotheken zu konstruieren und zu screenen sind im Stand der Technik wohl bekannt und Kits zur Durchführung der Konstruktions- und Screeningschritte sind im Handel erhältlich (z. B. Strategene Cloning Systems, La Jolla, CA). Die Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert, kann, sobald sie isoliert ist, in einen geeigneten Vektor kloniert werden, oder, falls notwendig, modifiziert werden, um die nachfolgenden Klonierungsschritte zu erleichtern. Solche Modifikationsstufen sind Routine und ein Beispiel ist die Anfügung von Oligonukleotidlinkern, die an den Enden der Nukleinsäure Restriktionsstellen enthalten. Solche Modifikationsstufen können verwendet werden, um die Insertion der Sequenz, die ein antiangiogenes Protein codiert, in ein virales Genom zu erleichtern, z. B. ein adenovirales Genom oder retrovirales Genom. Allgemeine Methoden für diese und andere Klonierungsverfahren sind ausgeführt in Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Die Sequenz, die das antiangiogene Protein codiert, kann, sobald sie isoliert ist, auch für andere Zwecke modifiziert werden, z. B. erhöhte Expression, indem spezifische Codons geändert werden, oder für eine verbesserte Bindung an einen Rezeptor oder Liganden.
Ein weiteres Beispiel für ein Verfahren, um eine Sequenz zu erhalten, die ein antiangiogenes Protein codiert, besteht darin, die entsprechende Wildtyp-Nukleinsäure aus den Nukleinsäuren zu amplifizieren, die sich in einem Wirtsorganismus finden, der die Wildtyp-Nukleinsäure enthält, und die amplifizierte Nukleinsäure in einem geeigneten Vektor zu klonieren. Der Fachmann auf diesem Gebiet erkennt, dass die Amplifikationsstufe mit einer Mutationsstufe, falls erwünscht, kombiniert werden kann unter Verwendung von Primern, die nicht mit der Zielnukleinsäure vollständig homolog sind, z. B. um gleichzeitig die Nukleinsäure zu amplifizieren und spezifische Positionen der Nukleinsäure zu verändern.
Die Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert, kann, falls sie nicht bereits im Kontext eines viralen Genoms erhalten wurde, in das ausgewählte virale Genom insertiert werden. Sobald die Sequenz, die ein antiangiogenes Protein codiert, in das virale Genom oder einen Teil des viralen Genoms kloniert worden ist, kann diese Nukleinsäure allgemein so konstruiert werden, dass die Sequenz, die das antiangiogene Protein codiert, benachbart zu und unter der Kontrolle eines wirksamen Promotors angeordnet ist. Der Promotor kann ausgewählt werden basierend auf der letzten Zelle, in der die Expression erwünscht. In bestimmten Fällen kann der Promotor einen prokaryotischen Promotor umfassen, wobei die Sequenz, die das antiangiogene Protein codiert, für die Expression in einem prokaryotischen Wirt ebenso wie in einem eukaryotischen Vektor angepasst ist. Die Sequenz, die das antiangiogene Protein codiert, kann z. B. in einem prokaryotischen Wirt unter der Steuerung eines Promotors exprimiert werden, während die gleiche Sequenz, die das antiangiogene Protein codiert, in einem eukaryotischen Wirt unter der Steuerung eines eukaryotischen Promotors im gleichen Konstrukt exprimiert werden kann. In anderen Fällen kann der Promotor nur einen eukaryotischen Promotor umfassen, wobei der Vektor spezifisch zur Expression in einem eukaryotischen Wirt ausgebildet ist. Promotoren von spezieller Nützlichkeit in den Vektoren der vorliegenden Erfindung umfassen Cytomegalovirus-Promotoren und adenovirale Promotoren. Weiterhin kann ein induzierbarer Promotor, z. B. ein Hitzeschockpromotor, ein Metallothioneinpromotor, ein Lac-induzierbarer Promotor, ein Tetracyclin-induzierbarer Promotor oder ein reprimierbarer Promotor verwendet werden. Unabhängig von der genauen Art der Promotoren des antiangiogenen Proteins wird der rekombinante Virus der vorlie genden Erfindung ein Nukleinsäuresegment enthalten, das ein antiangiogenes Protein codiert, wie hier beschrieben.
Die Sequenz, die das antiangiogene Protein codiert, die in das virale Genom insertiert ist, kann so angeordnet werden, dass ein Viruspromotor operativ mit dem antiangiogenen Proteininsert verbunden ist, so dass der virale Promotor dann die Transkription der Sequenz, die das antiangiogene Protein codiert, steuert oder die Sequenz, die das antiangiogene Protein codiert, kann ihren eigenen Promotor enthalten. In gleicher Weise kann die Sequenz, die das antiangiogene Protein codiert, angeordnet sein, wobei die Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert, andere virale regulatorische Regionen oder Stellen, z. B. Spleiß-Verbindungen und Polyadenylierungssignale und/oder Stellen verwerten kann. Alternativ kann die Nukleinsäure, die ein antiangiogenes Protein codiert, einen anderen Promotor oder andere regulatorische Sequenzen enthalten, wie Spleiß-Stellen und Polyadenylierungssequenzen, wobei die Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert, solche Sequenzen enthalten kann, die für die Expression der Sequenz, die das antiangiogene Protein codiert, notwendig sind und nicht teilweise oder vollständig diese regulatorischen Regionen und/oder Stellen des Virusgenoms erfordern. Diese regulatorischen Stellen können auch aus einer anderen Quelle abgeleitet sein, z. B. einem anderen Virus als Adenovirus oder Retrovirus. Z. B. kann, wie hier auch beschrieben, ein Polyadenylierungssignal von SV40 verwendet werden statt eines Polyadenylierungssignals aus Adenovirus, Mensch oder Maus. Die Sequenz, die das antiangiogene Protein codiert, kann alternativ einige Sequenzen enthalten, die zur Expression des antiangiogenen Proteins notwendig sind und aus anderen Sequenzen abgeleitet sind, die für die Expression des antiangiogenen Proteins aus dem Virusgenom notwendig sind oder sogar von dem Wirt, in den der rekombinante Virus eingeführt wird.
Wie oben angegeben, wird angenommen, dass falls erwünscht, Modifikationen und Veränderungen in der Struktur des antiangiogenen Proteins vorgenommen werden können und immer noch ein Molekül erhalten wird mit gleichen oder in anderer Weise wünschenswerten Eigenschaften. Solche Veränderungen können in natürlichen Isolaten auftreten oder können synthetisch eingeführt werden unter Verwendung von punktgerichteter Mutagenese, für die Verfahren, z. B. Mismatch-PCR, im Stand der Technik wohl bekannt sind.
Bestimmte Aminosäuren in einer antiangiogenen Proteinstruktur können z. B. durch andere Aminosäuren ersetzt werden ohne merklichen Verlust der interaktiven Bindungskapazität mit Strukturen, wie Antigen bindenden Regionen von Antikörpern (oder z. B. Bindungsstellen von Substrat- oder Rezeptormolekülen). Da die interaktive Kapazität und Art eines Proteins die biologisch funktionelle Aktivität des Proteins definiert, können bestimmte Aminosäuresequenzsubstitutionen in einer antiangiogenen Proteinsequenz gemacht werden (oder natürlich der entsprechenden Nukleinsäuresequenz) und trotzdem ein antiangiogenes Protein erhalten werden mit gleichen oder sogar gegenläufigen Eigenschaften (z. B. antagonistisch gegenüber agonistisch). Es wird daher von den Erfindern in Betracht gezogen, dass verschiedene Veränderungen in der Sequenz des antiangiogenen Proteins (oder der entsprechenden Nukleinsäure) gemacht werden können ohne erheblichen Verlust der biologischen Nützlichkeit oder Aktivität und möglicherweise mit einer Erhöhung der Nützlichkeit oder Aktivität.
Die Nukleinsäure, die ein antiangiogenes Protein codiert, oder ein Vektor, können auch einen selektierbaren Marker enthalten, der verwendet werden kann, um solche Zellen zu screenen, die die Nukleinsäure oder den Vektor enthalten und den selektierbaren Marker exprimieren. Auf diese Art und Weise kann man leicht solche Zellen, die die Nukleinsäure oder den Vektor enthalten und den selektierbaren Marker exprimieren, von solchen Zellen trennen, die entweder die Nukleinsäure oder den Vektor enthalten, aber den selektierbaren Marker nicht exprimieren, und von solchen Zellen, die die Nukleinsäure oder den Vektor nicht enthalten. Der spezifische selektierbare Marker, der verwendet wird, kann natürlich jeder selektierbare Marker sein, der verwendet werden kann, um gegenüber eukaryotischen Zellen, die den selektierbaren Marker nicht enthalten und exprimieren, zu selektieren. Die Selektion kann auf dem Tod von Zellen, die den selektierbaren Marker nicht enthalten und exprimieren, basieren, z. B. wenn der selektierbare Marker ein Gen ist, das ein Wirkstoffresistenzprotein codiert. Ein Beispiel für ein solches Wirkstoffresistenzgen für eukaryotische Zellen ist ein Neomycinresistenzgen. Zellen, die ein Neomycinresistenzgen exprimieren, können in Gegenwart des Antibiotikums G418 oder Geneticin^® überleben, wohingegen gegen solche eukaryotischen Zellen, die das Neomycinresistenzgen nicht enthalten oder nicht exprimieren, selektiert wird bei Gegenwart von G418. Der Fachmann auf diesem Gebiet erkennt, dass es weitere Beispiele für selektierbare Marker gibt, z. B. das hph-Gen, das selektiert werden kann mit dem Antibiotikum Hygromycin B, oder das E. coli-Ecogpt-Gen, das selektiert werden kann mit dem Antibiotikum Mycophenolsäure. Der spezifische verwendete selektierbare Marker ist daher variabel.
Der selektierbare Marker kann auch ein Marker sein, der verwendet werden kann, um solche Zellen, die das selektierbare Markergen enthalten und exprimieren, von solchen, die das selektierbare Markergen nicht enthalten und/oder nicht exprimieren, zu isolieren mithilfe einer anderen Fähigkeit als der, in Gegenwart eines Antibiotikums zu wachsen. Z. B. kann der selektierbare Marker ein Protein codieren, das dann, wenn es exprimiert wird, zulässt, dass solche Zellen, die den selektierbaren Marker, der den Marker codiert, exprimieren, gefunden werden können. Z. B. kann der selektierbare Marker ein lumineszierendes Protein codieren, z. B. ein Luciferaseprotein oder ein grün fluoreszierendes Protein, und die Zellen, die den selektierbaren Marker exprimieren, der das lumineszierende Protein codiert, können von solchen Zellen, die den selektierbaren Marker, der ein lumineszierendes Protein codiert, nicht enthalten oder nicht exprimieren, unterschieden werden. Alternativ kann der selektierbare Marker eine Sequenz sein, die ein Protein codiert, wie Chloramphenicolacetyltransferase (CAT). Mit im Stand der Technik wohl bekannten Verfahren können solche Zellen, die CAT erzeugen, leicht gefunden werden und unterschieden werden von solchen Zellen, die nicht CAT produzieren.
Die Nukleinsäure, die ein antiangiogenes Protein codiert, kann eine DNA, RNA oder irgendeine Kombination davon sein, unabhängig davon, ob sie nur solche Basen enthält, die typischerweise gefunden werden oder modifizierte Basen enthält. Diese modifizierten Nukleotide sind im Stand der Technik wohl bekannt und schließen thiomodifizierte Desoxynukleotidtriphosphate und boranmodifizierte Desoxynukleotidtriphosphate ein, ohne darauf beschränkt zu sein (Eckstein und Gish, Trends in Biochem. Sci., 14: 97–100 (1989) und Porter: Nucleic Acids Research, 25: 1611–1617 (1997)).
Alternativ kann die Nukleinsäure eine andere Art von Signalligand und/oder Rezeptor codieren, so dass dann, wenn der Ligand und/oder Rezeptor in die Zelle eingeführt wird und die Zelle die Nukleinsäure exprimiert, dadurch der Ligand und/oder Rezeptor erzeugt wird, eine Wechselwirkung des Liganden und/oder Rezeptors eine Tumorzelle dazu bringt, die Apoptose zu durchlaufen, wodurch die Tumorzelle behandelt wird und gleichzeitig eine Nukleinsäuresequenz, die das antiangiogene Protein codiert, exprimiert wird. Ein Beispiel für weitere Signalmoleküle, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließt, ohne darauf beschränkt zu sein, Bax, Bad, Bak und Bik ein. (Adams et al. "Control of cell death" WEH1 Annual Report 1996/1997).
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert, auch ein weiteres Protein codieren, z. B. ein regulatorisches Protein, das verwendet werden kann, um die Expression des antiangiogenen Proteins zu steuern. Z. B. kann das regulatorische Protein die gewebespezifische Lokalisierung des antiangiogenen Proteins auf der Zellmembran verursachen oder alternativ den vorzeitigen Umsatz des antiangiogenen Proteins in Nichtzielzellen verursachen oder die Expression des antiangiogenen Proteins über eine Regulierung der Transkription und/oder Translation verursachen.
Das regulatorische Protein kann auch von einer weiteren Nukleinsäure codiert werden, die der Zelle zugeführt wird, entweder unabhängig oder aufeinander folgend. In dieser Ausführungsform können die beiden Nukleinsäuren unterschiedliche Sequenzen haben, z. B. unterschiedliche Promotoren, so dass sie unabhängig reguliert werden können, z. B. durch Verabreichung eines Wirkstoffs, der selektiv die Expression eines oder beider Promotoren steuert, z. B. durch Verwendung eines Steroidhormons, z. B. eines Glucocorticoidhormons, das einen Promotor steuern kann, der durch das Hormon induzierbar ist.
Die Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert, kann auch ein Fusionsprotein aufweisen. Der Fachmann auf diesem Gebiet erkennt, dass Fusionsproteine routinemäßig verwendet werden für solche Zwecke wie Lokalisierung des Proteins, Aktivierung oder Deaktivierung des Proteins, Überwachung des Orts des Proteins, Isolierung des Proteins und quantitative Auswertung der Menge des Proteins. In einer Ausführungsform umfasst das Fusionsprotein ein antiangiogenes Protein und ein grün fluoreszierendes Protein. Weitere Beispiele für Fusionsproteine, die das antiangiogene Protein enthalten, schließen das CAT-Gen, neo-Gen, Hygromycin-Gen usw. ein.
Die Nukleinsäure, die ein antiangiogenes Protein codiert, kann auch eine Sequenz enthalten, die die Expression des antiangiogenen Proteins steuern kann. Z. B. kann die Nukleinsäure ein glucocorticoidregulatorisches Element (GRE) enthalten, so dass Glucocorticoidhormone verwendet werden können, um die Expression des antiangiogenen Proteins zu steuern. Ein weiteres Beispiel für eine regulatorische Sequenz, die die Expression eines benachbarten Gens steuern kann, ist die Klonierung eines RNA-Aptamers, z. B. H10 und H19, in die Promotorregion, wodurch die Verabreichung eines Wirkstoffs, wie Hoechst Farbstoff 33258, die Expression des Gens in vivo blockieren kann (Werstuck et al. "Controlling gene expression in living cells through small molecule-RNA interactions", Science 282: 296–298 (1998)). In weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst die regulatorische Sequenz das Tet-Operon oder lac-Operon oder irgendein anderes Operon, das als regulatorische Sequenz in einer eukaryotischen Zelle wirken kann.
Die hier beschriebenen Verfahren umfassen, dass eine Nukleinsäure, die ein antiangiogenes Protein codiert, in eine Zelle eingeführt wird. Der Fachmann auf diesem Gebiet erkennt, dass dieser Aspekt Verfahren umfassen kann, bei denen ein Nukleinsäurekonstrukt entweder stabil oder vorübergehend in eine Zelle eingeführt wird. Außerdem kann die stabil oder vorübergehend eingeführte Nukleinsäure in das Genom des Wirts integriert werden oder nicht. Der Fachmann auf diesem Gebiet erkennt auch, dass das genaue Verfahren zur Einführung der Nukleinsäure in die Zelle natürlich variieren kann und abhängig ist von der spezifischen Art und Identität der Zelle. Beispiele für Verfahren zur Einführung einer Nukleinsäure in eine Zelle schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, Elektroporation, Zellfusion, durch DEAE-Dextran vermittelte Transfektion, durch Calciumphosphat vermittelte Transfektion, Infektion mit einem viralen Vektor, Mikroinjektion, durch Lipofectin vermittelte Transfektion, Liposomenabgabe und Teilchenbombardierungstechniken, wie die Genabgabe auf Goldteilchen, einschließlich verschiedener Verfahren für die Abgabe von "nackter DNA" ein.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Promotor ein gewebespezifischer Promotor, von dem der Fachmann auf diesem Gebiet weiß, dass er Gewebespezifität für die Expression der Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert, beiträgt. Z. B. kann der gewebespezifische Promotor ein prostata spezifischer, brustgewebespezifischer, darmgewebespezifischer, hirnspezifischer, nierenspezifischer, leberspezifischer, blasenspezifischer, lungenspezifischer, schilddrüsenspezifischer oder magenspezifischer, eierstockspezifischer oder gebärmutterhalsspezifischer Promotor sein. Wenn der gewebespezifische Promotor ein prostataspezifischer Promotor ist, schließt der Promotor PSA-Promotor, ΔPSA-Promotor, ARR2PB-Promotor und PB-Promotor ein, ohne darauf beschränkt zu sein.
Die Gewebespezifität kann auch erreicht werden, indem ein Vektor ausgewählt wird, der einen hohen Grad an Gewebespezifität hat. Z. B. kann ein Vektor, der selektiv Schleimhautzellen infiziert, z. B. solche, die mit Darmkrebs verbunden sind, ausgewählt werden und dann gegebenenfalls in Kombination mit einem spezifischen Abgabemittel, z. B. durch Verwendung eines Zäpfchens, selektiv die Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert, an die gewünschten Zellen abgeben.
Die verschiedenen Vektoren und Wirte, die verwendet werden, um die Nukleinsäure, die ein antiangiogenes Protein codiert, zu exprimieren, können verwendet werden, um die Nukleinsäuren in Kultur oder in vitro zu exprimieren. Z. B. kann ein Vektor, der eine Nukleinsäure enthält, die ein antiangiogenes Protein codiert, in eine Gewebekulturzelllinie eingeführt werden, z. B. COS-Zellen, und exprimiert werden, wodurch die Nukleinsäure in Kultur exprimiert wird. Auf diese Art und Weise kann der Fachmann auf diesem Gebiet einen Zelltyp auswählen, der eine beschränkte Lebensdauer im Wirtsorganismus hat, so dass der Wirt effektiv die Zelle, die das antiangiogene Protein exprimiert, in einem solchen Zeitraum ausscheiden kann, dass jegliche möglichen schädlichen Wirkungen für Nichtzielzellen in der Umgebung oder für Gewebe minimiert werden. Alternativ können die Zellen aus einem Patienten entnommen werden, die Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert, verabreicht werden und die Zellen dann in den Patienten zurückgeführt werden. Bei diesem ex-vivo-Behandlungsverfahren können die Zellen manipuliert werden, um die Aufnahme der Nukleinsäure, die ein antiangiogenes Protein codiert, ohne unnötige negative Wirkungen auf den Patienten, zu erleichtern.
Alternativ können verschiedene Vektoren und Wirte verwendet werden, um die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung zu exprimieren, um die Nukleinsäuren in vivo zu exprimieren. Z. B. kann ein Vektor, der eine Nukleinsäure enthält, die ein antiangiogenes Protein codiert, in Zellen eines eukaryotischen Wirts eingeführt werden, bevorzugt Tumorzellen, um die Tumorzellen in situ zu behandeln. Wie oben kurz diskutiert, erkennt der Fachmann auf diesem Gebiet, dass spezifische Gewebe behandelt werden können, indem der Vektor selektiv dem Wirt verabreicht wird. Z. B. kann durch Verabreichung eines Adenovirusvektors über ein Aerosol, z. B. durch Verwendung eines Inhalators, der Vektor selektiv den Lungen verabreicht werden. Alternativ kann die Verwendung eines Zäpfchen verwendet werden, um den Vektor selektiv an Zellen des Darms zu verabreichen. Alternativ kann die Abgabe des Vektors topisch, z. B. in einer Creme, selektiv den Vektor oder die Nukleinsäure an die Hautzellen oder den Gebärmutterhals abgeben. Der Fachmann auf diesem Gebiet erkennt die verschiedenen Verfahren, die routinemäßig verwendet werden können, um selektiv den Vektor oder alternativ die Nukleinsäure, die antiangiogenes Protein codiert, an spezifische Organe oder Zellen abzugeben.
Der Fachmann auf diesem Gebiet erkennt auch, dass die Abgabe manuell erleichtert werden kann durch solche Methoden, wie Injektion des Vektors oder der Nukleinsäure an der ausgewählten Stelle. Z. B. kann eine direkte Injektion verwendet werden, um den Vektor oder die Nukleinsäure an einen spezifischen Ort im Gehirn und/oder der Brust abzugeben.
Es wird davon ausgegangen, dass unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren eine Nukleinsäure, die ein antiangiogenes Protein codiert, an eine Zelle oder einen Patienten abgegeben werden kann, am meisten bevorzugt an Menschen, um Krankheitszustände zu behandeln, bevorzugt solche, die die Tumorentwicklung betreffen. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können auch verwendet werden, um irgendeine Krankheit oder einen Prozess, der durch Angiogenese vermittelt wird, zu behandeln, einschließlich Leukämie, Metastasenbildung, Rheumaerkrankungen, diabetische Neugefäßbildung, Hämatopoiese und Wundheilung, ohne darauf beschränkt zu sein. Die vorliegende Nukleinsäure kann entweder allein oder in Kombination mit einer weiteren Verbindung oder Zusammensetzung oder als Teil eines auf einem Vektor basierenden Abgabe systems parenteral (z. B. intravenös), durch intramuskuläre Injektion, durch intraperitoneale Injektion, topisch, transdermal oder dgl. verabreicht werden, obwohl die topische Verabreichung typischerweise bevorzugt ist. Die genaue Menge solcher Nukleinsäuren, Zusammensetzungen, Vektoren etc., die erforderlich ist, variiert von Patient zu Patient, abhängig von der Art, dem Alter, Gewicht und Allgemeinzustand des Patienten, dem Schweregrad der Krankheit oder dem zu behandelnden Zustand, der jeweiligen verwendeten Verbindung oder Zusammensetzung, der Verabreichungsart und dgl. Somit ist es nicht möglich oder notwendig, eine genaue Menge anzugeben. Eine geeignete Menge kann jedoch von einem Fachmann auf diesem Gebiet unter Verwendung von im Stand der Technik wohl bekannten Methoden bestimmt werden (siehe z. B. Martin et al., 1989).
Für die topische Verabreichung können der Virus oder die Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert, Zusammensetzungen davon und/oder Vektoren, die die Nukleinsäure enthalten, in pharmazeutischen Zusammensetzungen in Form von festen, halbfesten oder flüssigen Dosierungsformen sein, z. B. in Form von Pulvern, Flüssigkeiten, Suspension, Lotionen, Cremes, Gels oder dgl., bevorzugt in einer Einheitsdosierungsform, die für eine einfache Verabreichung einer genauen Dosierung geeignet ist. Die Zusammensetzungen können typischerweise eine wirksame Menge der ausgewählten Nukleinsäure, Zusammensetzung oder des Vektors in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthalten und können zusätzlich weitere medizinische Mittel, pharmazeutische Mittel, Träger, Adjuvantien, Verdünnungsmittel etc. enthalten. Unter "pharmazeutisch annehmbar" wird ein Material verstanden, das nicht in biologischer oder anderer Weise unerwünscht ist, d. h. das Material kann an ein Individuum verabreicht werden zusammen mit der ausgewählten Nukleinsäure, der Zusammensetzung davon oder einem Vektor, ohne unerwünschte biologische Wirkungen zu verursachen oder in schädlicher Weise mit irgendeiner der anderen Komponenten der pharmazeutischen Zusammensetzung, in der es enthalten ist, eine Wechselwirkung einzugehen.
Alternativ oder zusätzlich ist eine parenterale Verabreichung, wenn sie verwendet wird, allgemein durch Injektion gekennzeichnet, z. B. durch intravenöse Injektion einschließlich einer regionalen Perfusion durch ein Blutgefäß, das das Gewebe/die Gewebe oder das Organ/die Organe mit den Zielzellen versorgt. Inji zierbare Präparate können in üblichen Formen hergestellt werden, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, feste Formen, die zur Lösung oder Suspension in einer Flüssigkeit vor der Injektion geeignet sind, oder als Emulsionen. Für die parenterale Verabreichung kann auch ein langsam freisetzendes oder verzögert freisetzendes System verwendet werden, z. B. so, dass ein konstanter Pegel an Dosierung aufrechterhalten wird (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 3 710 795). Die Verbindung kann direkt an die Stelle von Zellen oder Geweben, die einen Tumor aufweisen, injiziert werden oder sie kann so injiziert werden, dass sie an die Stelle der Tumorzellen diffundiert oder zirkuliert.
Die Dosierungen hängen ab von der Art der Verabreichung, der zu behandelnden Krankheit oder dem zu behandelnden Zustand und dem Zustand des einzelnen Patienten. Dosierungen hängen auch ab von dem zu verabreichenden Material, z. B. einer Nukleinsäure, einem Vektor, der eine Nukleinsäure enthält, oder einer anderen Art von Verbindung oder Zusammensetzung. Solche Dosierungen sind im Stand der Technik bekannt. Weiterhin kann die Dosierung je nach der typischen Dosierung für die spezifische Krankheit oder den Zustand, der/die behandelt werden soll, eingestellt werden. Weiterhin können Kulturzellen des Zielzelltyps verwendet werden, um die Dosierung für die Zielzellen in vivo zu optimieren und die Transformation aus verschiedenen Dosierungen, die in Kulturzellen der gleichen Art wie der Zielzelltyp erreicht werden, kann überwacht werden. Häufig kann eine einzelne Dosis ausreichend sein; die Dosis kann jedoch, falls erwünscht, wiederholt werden. Die Dosierung sollte nicht so hoch sein, dass schädliche Nebenwirkungen verursacht werden. Allgemein variiert die Dosierung mit dem Alter, dem Zustand, dem Geschlecht des Patienten und Ausmaß der Krankheit bei dem Patienten und kann von einem Fachmann auf diesem Gebiet bestimmt werden. Die Dosierung kann auch vom jeweiligen Arzt im Fall irgendeiner Komplikation eingestellt werden.
Für die Verabreichung an eine Zelle in einem Patienten wird für die Verbindung oder Zusammensetzung, sobald sie in dem Patienten ist, natürlich die Temperatur auf die Körpertemperatur eingestellt werden. Für die ex-vivo-Verabreichung kann die Verbindung oder Zusammensetzung mit irgendwelchen Standardmethoden verabreicht werden, die die Lebensfähigkeit der Zellen erhalten, z. B. indem sie einem Kulturmedium zugefügt werden (geeignet für die Zielzellen) und dieses Medium direkt den Zellen zugefügt wird. Wie es im Stand der Technik bekannt ist, kann jegliches bei dieser Methode verwendete Medium wässrig und nichttoxisch sein, damit die Zellen nicht unlebensfähig werden. Außerdem kann es Standardnährmittel zur Erhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen, nach Wunsch, enthalten. Für die in-vivo-Verabreichung kann der Komplex z. B. einer Blutprobe oder einer Gewebeprobe aus einem Patienten oder einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, z. B. Kochsalzlösung und gepufferter Kochsalzlösung, zugefügt werden und mit einer Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Mitteln verabreicht werden. Andere Beispiele der Verabreichung schließen die Inhalation eines Aerosols, subcutane oder intramuskuläre Injektion, direkte Transfektion einer Nukleinsäuresequenz, die die Verbindung codiert, wobei die Verbindung eine Nukleinsäure oder ein Protein ist, z. B. in Knochenmarkszellen, die zur Transplantation und nachfolgenden Transplantation in den Patienten präpariert wurden, und direkte Transfektion in ein Organ, das nachfolgend in den Patienten transplantiert wird, ein. Weitere Verabreichungsmethoden schließen orale Verabreichung, insbesondere wenn die Zusammensetzung verkapselt ist, oder rektale Verabreichung, insbesondere wenn die Zusammensetzung in Zäpfchenform ist, ein. Ein pharmazeutisch annehmbarer Träger schließt jedes Material ein, das nicht biologisch oder in anderer Weise unerwünscht ist, d. h. das Material kann an ein Individuum zusammen mit dem ausgewählten Komplex verabreicht werden, ohne irgendwelche unerwünschten biologischen Wirkungen zu erzielen oder in schädlicher Weise mit irgendeiner der anderen Komponenten der pharmazeutischen Zusammensetzung, in der es enthalten ist, eine Wechselwirkung einzugehen.
Spezifisch können, wenn eine spezielle Zellart in vivo angesteuert werden soll, z. B. durch regionale Perfusion eines Organs oder Tumors, Zellen aus dem Zielgewebe durch Biopsie entnommen werden und optimale Dosierungen zum Import des Komplexes in das Gewebe in vitro bestimmt werden, wie hier beschrieben und im Stand der Technik bekannt, um die in-vivo-Dosierung zu optimieren, einschließlich der Konzentration und Zeitdauer. Alternativ können Kulturzellen der gleichen Zellart auch verwendet werden, um die Dosierung für die Zielzellen in vivo zu optimieren. Z. B. können die Mengen für die intratumorale Injektion und die Injektionsrate kontrolliert werden unter Verwendung einer kontrollierbaren Pumpe, z. B. einer durch einen Computer kontrollierten Pumpe oder einer mikro thermalen Pumpe, um die Rate und Verteilung der Nukleinsäure oder des Vektors in Tumor oder Gewebe zu kontrollieren.
Für ex vivo, in vivo, in vitro oder Verwendung in Kultur können die Nukleinsäure, der Vektor oder die Zusammensetzung in jeder wirksamen Konzentration verabreicht werden. Eine wirksame Konzentration ist die Menge, die zu einer teilweisen oder vollständigen Abtötung, Reduktion der Größe, dem Verschwinden, Wachstumshemmung, Hemmung der Gefäßbildung, Hemmung der Zellproliferation, einer Induktion der Dormanz oder einer scheinbaren Induktion von Dormanz oder einer verminderten Metastasenbildung eines Tumors oder einer Tumorzelle führt. Diese Wirkungsmechanismen sind nur beispielhaft für die Wege, auf denen ein antiangiogenes Protein einen Tumor behandeln kann und der primäre Einfluss scheint über eine Abnahme der Gefäßbildung in einem Tumor zu erfolgen.
Die Nukleinsäure oder der Vektor können in einer Zusammensetzung verabreicht werden. Z. B. kann die Zusammensetzung weitere medizinische Mittel, pharmazeutische Mittel, Träger, Adjuvantien, Verdünnungsmittel etc. enthalten. Weiterhin kann die Zusammensetzung zusätzlich zu der Nukleinsäure oder dem Vektor Lipide, wie Liposomen, z. B. kationische Liposomen (z. B. DOTMA, DOPE, DC-Cholesterol) oder anionische Liposomen enthalten. Liposomen können weiterhin Proteine enthalten, um die Zielführung zu einer speziellen Zelle, falls erwünscht, zu erleichtern. Die Verabreichung einer Zusammensetzung, die eine Nukleinsäure oder einen Vektor und ein kationisches Liposom enthält, kann in das Blut, das zu einem Zielorgan hinführt, verabreicht werden oder in den Respirationstrakt inhaliert werden für Zielzellen des Respirationstraktes. In Bezug auf Liposomen siehe z. B. Brigham et al., Am. J. Resp. Cell. Mol. Biol. 1: 95–100 (1989); Felgner et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 7413–7417 (1987); U.S.-Patent Nr. 4 897 355. Weiterhin können die Nukleinsäure oder ein Vektor als Komponente einer Mikrokapsel verabreicht werden, die zu den spezifischen Zelltypen, z. B. Makrophagen, geführt werden kann, oder bei der die Diffusion der Verbindung oder Abgabe der Verbindung aus der Mikrokapsel für eine spezifische Rate oder Dosierung entwickelt wurde.
Jede Zelle, bevorzugt eine Zelle nahe einem Tumor oder in einem Tumor, kann induziert werden unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren. In dieser Ausführungsform kann diesen Zellen selektiv eine Nukleinsäure verabreicht werden, die ein antiangiogenes Protein codiert und exprimiert, wodurch ein Tumor behandelt wird, mit irgendeinem oder mehreren der oben aufgeführten Mechanismen. In einer Ausführungsform kann der Tumor ein fester Tumor sein und dem Tumor oder dem benachbarten Gewebe wird ein rekombinanter Virus injiziert, der die Zellen infizieren kann und dadurch verursacht, dass sie ein antiangiogenes Protein exprimieren, wodurch die Gegenwart eines antiangiogenen Proteins den Tumor behandelt. Die Zellen, die durch das antiangiogene Protein beeinflusst werden, sind typischerweise Zellen, die den antiangiogenes Protein exprimierenden Zellen benachbart sind, da bevorzugt das antiangiogene Protein von den Zellen ausgeschieden wird, die die Nukleinsäure exprimieren, die das antiangiogene Protein codiert. Die betroffene Zelle kann jedoch aus der direkten Umgebung der antiangiogenes Protein exprimierenden Zelle entnommen werden, z. B. wenn die antiangiogenes Protein exprimierende Zelle mobilisiert wurde und/oder wenn die antiangiogenes Protein exprimierende Zelle lösliches antiangiogenes Protein erzeugt, das zirkuliert. Die antiangiogenes Protein exprimierenden Zellen können auch ihren eigenen Tod verursachen, da antiangiogenes Protein auch diese Zellen beeinflussen kann. In diesem Ansatz können die Verfahren der vorliegenden Erfindung verursachen, dass Zellen, die ein antiangiogenes Protein exprimieren, absterben, aber benachbarte Tumorzellen auch absterben, wodurch solche Tumorzellen eliminiert werden, die ansonsten eine Regression des Tumors verursachen könnten.
Die vorliegende Erfindung liefert auch einen Adenovirus, der eine rekombinante Nukleinsäure enthält, die ein antiangiogenes Protein codiert, das in eine adenovirale Nukleinsäure insertiert wurde, wobei die rekombinante Nukleinsäure in ein Adenovirusteilchen verpackt werden kann und wobei die Expression der Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert, zur Produktion des antiangiogenen Proteins führt. Verschiedene Adenoviren können für die Verbindungen und Methoden, die hier beschrieben werden, verwendet werden. Z. B. und wie in dem hier enthaltenen Beispiel beschrieben, kann eine Nukleinsäure, die ein antiangiogenes Protein codiert, in das Genom von Adenovirus Typ 5 insertiert werden. In gleicher Weise können andere Arten von Adenoviren verwendet werden, z. B. Typ 1, Typ 2, Typ 3 etc. Für eine beispielhafte Liste der Adenoviren, von denen bekannt ist, dass sie menschliche Zellen infizieren können und die daher für die vorliegende Erfindung verwendet werden können, siehe Fields et al. (1990), Virology, Raven Press, New York). Weiterhin wird in Betracht gezogen, dass eine rekombinante Nukleinsäure, die eine adenovirale Nukleinsäure aus einer Art von Adenovirus enthält, verpackt werden kann unter Verwendung von Capsidproteinen aus einer anderen Art von Adenovirus.
Der Virus kann einer sein, dessen Replikation defizient ist, abhängig von der spezifischen Anwendung der hier beschriebenen Verbindungen und Methoden. Methoden, um eine Virusreplikation defizient zu machen, sind im Stand der Technik wohl bekannt. Z. B. können Mutationen, wie Punktmutationen, Deletionen und Insertionen und Kombinationen davon auf ein spezifisches adenovirales Gen oder auf adenovirale Gene gerichtet werden, z. B. das E1-Gen. Für ein spezifisches Beispiel zur Erzeugung eines Adenovirus mit defizienter Replikation zur Verwendung in der Gentherapie siehe WO 94/28938 (Adenovirus Vectors for Gene Therapy Sponsorship).
Bei allen hier beschriebenen Konstruktionen oder Verbindungen kann das antiangiogene Protein funktionell mit einem spezifischen Leader-Peptid verbunden sein, das für die Sekretion des Proteins spezifisch sein kann. Z. B., und wie im Beispiel unten beschrieben, kann das antiangiogene Protein eine Signalsequenz haben, z. B. die Adenovirus-E3/K19-Signalsequenz, die zur Sekretion des antiangiogenen Proteins aus der Zelle führen kann, die die Sequenz exprimiert, die das antiangiogene Protein codiert. Ein spezifisches Beispiel einer Adenovirus-E3/K19-Signalsequenz umfasst die Aminosäuresequenz MRYMILGLLALAAVCSAA.
Eine funktionelle Bindung ist typischerweise eine Peptidbindung, ohne darauf beschränkt zu sein. Andere zusätzliche Sequenzen können auch an das antiangiogene Protein gebunden werden, entweder durch Zufügung einer Nukleinsäure, die die zusätzliche Sequenz codiert, oder durch Zufügung eines Peptids an das antiangiogene Protein. In gleicher Weise können spezifische antiangiogene Proteine der vorliegenden Erfindung nicht nur durch Expression einer Nukleinsäure erhalten werden, sondern auch durch Synthese eines Polypeptids. Der Fachmann auf diesem Gebiet erkennt, dass verschiedene Nukleinsäuresequen zen das gleiche Polypeptid codieren können und daher die exakte Sequenz der Nukleinsäure, die die Signalsequenz codiert, variieren kann.
Ein Verfahren, um Proteine herzustellen, die die antiangiogenen Proteine der vorliegenden Erfindung enthalten, besteht darin, zwei oder mehr Peptide oder Polypeptide miteinander zu verbinden mit Techniken der Proteinchemie. Z. B. können Peptide oder Polypeptide chemisch synthetisiert werden unter Verwendung von derzeit verfügbaren Laborinstrumenten unter Verwendung entweder von Fmoc-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)- oder Boc-(tert.-Butyloxycarbonyl)-Chemie. (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Der Fachmann auf diesem Gebiet kann leicht feststellen, dass ein Peptid oder Polypeptid, das Endostatin entspricht, z. B. synthetisiert werden kann mit Reaktionen der Standardchemie. Z. B. kann ein Peptid oder Polypeptid synthetisiert werden und nicht von dem Syntheseharz gespalten werden, wohingegen das andere Fragment eines antiangiogenen Proteins synthetisiert werden kann und anschließend von dem Harz gespalten werden kann, wodurch eine endständige Gruppe freigelegt wird, die funktionell an dem anderen Fragment blockiert ist. Durch Peptidkondensationsreaktionen können diese zwei Fragmente über eine Peptidbindung an ihrem Carboxyl- bzw. Aminoende kovalent verbunden werden, um ein antiangiogenes Protein zu bilden. (G. A. Grant, "Synthetic Peptides: A User Guide", W. H. Freeman u. Co., N.Y. (1992) und M. Bodansky und B. Trost, Herausgeber, "Principles of Peptide Synthesis", Springer-Verlag Inc., N.Y. (1993)). Alternativ kann das Peptid oder Polypeptid unabhängig in vivo synthetisiert werden, wie oben beschrieben. Sobald sie isoliert sind, können diese unabhängigen Peptide oder Polypeptide verbunden werden, um ein antiangiogenes Protein zu bilden über die gleichen Peptidkondensationsreaktionen.
Z. B. können durch enzymatische Ligierung von klonierten oder synthetischen Peptidsegmenten relativ kurze Peptidfragmente miteinander verbunden werden, um größere Peptidfragmente, Polypeptide, oder ganze Proteindomänen zu erzeugen (L. Abrahmsen et al., Biochemistry, 30: 4151 (1991)). Alternativ kann eine native chemische Ligierung von synthetischen Peptiden verwendet werden, um große Peptide oder Polypeptide aus kürzeren Peptidfragmenten synthetisch zu konstruieren. Diese Methode besteht aus einer zweistufigen chemischen Reaktion (Dawson et al., "Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation", Science, 266: 776–779 (1994)). Die erste Stufe ist die chemoselektive Reaktion eines ungeschützten synthetischen Peptid-%-Thioesters mit einem weiteren ungeschützten Peptidsegment, das einen aminoterminalen Cys-Rest enthält, was ein über einen Thioester verbundenes Zwischenprodukt als kovalentes Anfangsprodukt ergibt. Ohne eine Veränderung der Reaktionsbedingungen unterliegt dieses Zwischenprodukt einer spontanen schnellen intramolekularen Reaktion unter Bildung einer nativen Peptidbindung an der Ligierungsstelle. Die Anwendung dieser nativen chemischen Ligierungsmethode für die Gesamtsynthese eines Proteinmoleküls wird erläutert für die Herstellung von Human-Interleukin 8 (IL-8) (I. Clark-Lewis et al., FEBS Lett., 307: 97 (1987), I. Clark-Lewis et al., J. Biol. Chem., 269: 16075 (1994), I. Clark-Lewis et al., Biochemistry, 30: 3128 (1991) und K. Rajarathnam et al., Biochemistry, 29: 1689 (1994)).
Alternativ können ungeschützte Peptidsegmente chemisch verbunden werden, wobei die Bindung, die zwischen den Peptidsegmenten gebildet wird, als Ergebnis der chemischen Ligierung eine unnatürliche (Nichtpeptid)-Bindung ist (M. Schnolzer et al., Science, 256: 221 (1992)). Diese Technik wurde verwendet, um Analoga von Proteindomänen ebenso wie große Mengen von relativ reinen Proteinen mit voller biologischer Aktivität zu synthetisieren (R. C. Milton deLisle et al., "Techniques in Protein Chemistry IV", Academic Press, New York, S. 257–267 (1992)).
Die Erfindung offenbart auch Fragmente von antiangiogenen Proteinen, die biologische Aktivität haben. Die Polypeptidfragmente der vorliegenden Erfindung können rekombinante Proteine sein, die durch Klonierung von Nukleinsäuren erhalten werden, die das Polypeptid in einem Expressionssystem codieren, das die Polypeptidfragmente daraus erzeugen kann, z. B. das oben beschriebene Adenovirussystem. Z. B. kann man die aktive Domäne von Endostatin bestimmen, die eine biologische Wirkung, die mit Endostatin assoziiert ist, verursachen kann. In einem Beispiel können Aminosäuren, von denen festgestellt wurde, dass sie nicht zur Aktivität oder Bindungsspezifität oder Affinität des Endostatins beitragen, deletiert werden ohne Verlust der jeweiligen Aktivität.
Z. B. können Amino- oder carboxyterminale Aminosäuren aufeinander folgend von einem antiangiogenen Proteinmolekül entfernt werden und die jeweilige Akti vität in einem von vielen verfügbaren Tests bestimmt werden. In einem weiteren Beispiel kann ein Fragment eines antiangiogenen Proteins ein modifiziertes Endostatin umfassen, wobei mindestens eine Aminosäure die natürlich vorkommende Aminosäure an ihrer spezifischen Position ersetzt und ein Teil entweder der aminoterminalen oder carboxyterminalen Aminosäuren oder sogar ein innerer Bereich des Endostatins durch ein Polypeptidfragment oder eine andere Einheit ersetzt wurde, z. B. Biotin, was die Reinigung des modifizierten antiangiogenen Proteins erleichtern kann. Z. B. kann ein modifiziertes antiangiogenes Protein an ein Maltose bindendes Protein fusioniert werden, entweder über Peptidchemie oder durch Klonierung der jeweiligen Nukleinsäuren, die die zwei Polypeptidfragmente codieren, in einen Expressionsvektor, so dass die Expression der codierenden Region zu einem Hybridpolypeptid führt. Das Hybridpolypeptid kann mit Affinität gereinigt werden, indem es über eine Amyloseaffinitätssäule geleitet wird und der modifizierte antiangiogene Proteinrezeptor kann dann von der Maltosebindungsregion getrennt werden, indem das Hybridpolypeptid mit dem spezifischen Proteasefaktor Xa gespalten wird. (Siehe z. B. New England Biolabs Product Catalog, 1996, S. 164). Ähnliche Reinigungsverfahren sind auch verfügbar zur Isolierung von Hybridproteinen aus eukaryotischen Zellen.
Aktive Fragmente eines antiangiogenen Proteins können auch direkt synthetisiert werden oder durch chemische oder mechanische Zerstörung eines größeren antiangiogenen Proteins erhalten werden. Ein aktives Fragment wird definiert als eine Aminosäuresequenz mit mindestens 5 aufeinander folgenden Aminosäuren, die aus der natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz stammen, die die relevante Aktivität haben, z. B. Bindungs- oder regulatorische Aktivität.
Die Fragmente, ob sie an weitere Sequenzen gebunden sind oder nicht, können auch Insertionen, Deletionen, Substitutionen oder andere ausgewählte Modifikationen spezieller Bereiche oder spezifische Aminosäurereste aufweisen, vorausgesetzt, die Aktivität des Peptids wird nicht wesentlich verändert oder gestört im Vergleich zu dem nicht modifizierten antiangiogenen Protein oder antiangiogenen Proteinfragment. Diese Modifikationen können für einige zusätzliche Eigenschaften sorgen, z. B. indem Aminosäuren, die zur Disulfidbindung fähig sind, entfernt oder zugefügt werden, um die biologische Lebensdauer zu erhöhen, die sekretorischen Eigenschaften zu verändern etc. In jedem Fall muss das Peptid eine bio logische Aktivität besitzen, z. B. eine Bindungsaktivität, Regulierung der Bindung an die Bindungsdomäne etc. Funktionelle oder aktive Regionen des antiangiogenen Proteins können durch Mutagenese eines spezifischen Bereichs des Proteins und anschließende Expression und Testen des exprimierten Polypeptids gefunden werden. Solche Methoden sind einem erfahrenen Praktiker auf diesem Gebiet leicht bekannt und können punktspezifische Mutagenese der Nukleinsäure, die den Rezeptor codiert, einschließen (M. J. Zoller et al.).
Die vorliegende Erfindung offenbart auch ein Verfahren zur Abgabe eines antiangiogenen Proteins an eine Zelle, das beinhaltet, dass der Zelle ein Virus verabreicht wird, der eine rekombinante Nukleinsäure enthält, die ein antiangiogenes Protein codiert, das in die virale Nukleinsäure insertiert wurde, wobei die rekombinante Nukleinsäure in ein Virusteilchen verpackt sein kann und wobei die Expression der rekombinanten Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert, zur Produktion des antiangiogenen Proteins führt, wodurch das antiangiogene Protein der Zelle zugeführt wird. Eine solche Verabreichung kann zu einer höchst erfolgreichen Zuführung der Nukleinsäure zu Zellen führen und somit zu einem relativ hohen Ausmaß an Expression der Sequenz, die das antiangiogene Protein codiert.
Es ist im Stand der Technik wohl bekannt, dass ein Adenovirus eine große Vielzahl von Zellen infizieren kann und dadurch die Nukleinsäure an die Wirtszelle abgeben kann, die wiederum die Nukleinsäure exprimieren kann, wodurch die Proteine, die von der adenoviralen Nukleinsäure codiert werden, erzeugt werden. Z. B. kann Adenovirus verschiedene Stellen des Respirationstrakts, Augen, Muskelzellen, Zellen des Gastrointestinaltrakts und Zellen der Blase infizieren. Wie oben diskutiert, kann die Zelle, an die der Adenovirus, der eine Nukleinsäure enthält, die ein antiangiogenes Protein codiert, verabreicht wird, eine Zelle ex vivo umfassen, z. B. eine Zelle, die aus einem Individuum entnommen wurde, dem der Adenovirus verabreicht wurde, und die anschließend wieder in das Individuum zurückgebracht wird. Alternativ kann die Zelle eine Zelle in vivo aufweisen, so dass die Abgabe des Adenovirus, der die rekombinante Nukleinsäure enthält, die ein antiangiogenes Protein codiert, an eine Zelle in oder auf einem Individuum erfolgt. Alternativ kann die Zelle eine Zelle in Kultur sein, z. B. indem ein Adenovi rus, der eine Sequenz enthält, die das antiangiogene Protein codiert, an Gewebekulturzellen verabreicht wird.
Diese Methode kann daher verwendet werden, um ein antiangiogenes Protein an eine spezifische Zelle oder eine Gruppe von Zellen oder alternativ an ein spezielles Gewebe oder Organ abzugeben. Sobald ein Adenovirus, der eine Sequenz enthält, die das antiangiogene Protein codiert, oder eine rekombinante Nukleinsäure enthält, die ein antiangiogenes Protein codiert, an eine Zelle verabreicht worden ist, kann diese Zelle die rekombinante Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert, exprimieren und dadurch das antiangiogene Protein erzeugen, das eine biologische Antwort aus den Zellen oder anderen Zellen, die mit dem antiangiogenen Protein in Kontakt kommen und in sonstiger Weise durch das antiangiogene Protein beeinflusst werden, erzeugen kann.
Die Erfindung offenbart auch ein Verfahren zur Abgabe eines antiangiogenen Proteins an ein Individuum, das beinhaltet, dass dem Individuum ein Virus verabreicht wird, der eine rekombinante Nukleinsäure enthält, die ein antiangiogenes Protein codiert, das in die virale Nukleinsäure insertiert wurde, wobei die rekombinante Nukleinsäure in ein Virusteilchen verpackt sein kann und wobei eine Zelle des Individuums die rekombinante Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert, exprimiert, wodurch das antiangiogene Protein an das Individuum abgegeben wird.
Eine Verbindung, die ein Adenovirus enthält, das eine Nukleinsäure enthält, die ein antiangiogenes Protein codiert, eine rekombinante Nukleinsäure, die ein antiangiogenes Protein codiert oder ein Virus, das eine Nukleinsäure enthält, die ein antiangiogenes Protein dieser Erfindung codiert, kann an ein Individuum, das dies benötigt, verabreicht werden mit üblicherweise angewendeten Methoden zur Verabreichung von Verbindungen auf eine solche Art und Weise, dass der Adenovirus und/oder das antiangiogene Protein mit dem zu behandelnden Gewebe oder der zu behandelnden Zelle in Kontakt gebracht werden. Solche Methoden schließen orale Verabreichung, parenterale Injektion (IP), subcutane Injektion (SC – insbesondere Depot mit kontrollierter Abgabe), intravenöse Injektion (IV), intramuskulär (IM), intranasal (IN), intraokular (IO), extraokular (EO), sublingual (SL) oder oral z. B. durch orale Inhalation (OI) ein. Allgemein ist eine therapeu tisch wirksame Menge die Menge, die notwendig ist, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen, so dass der in Betracht gezogene Krankheitszustand erfolgreich behandelt wird. Artikel von George Hiller, Advanced Drug-Delivery Reviews, 10: 163–204 (1993) [Elsevier Science Publishers B. V.] und Lorraine L. Wearley, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 8(4): 331–394 (1991) sind nützliche Diskussionen dieser Arten von Verabreichungen. Diese Artikel werden hier durch Bezugnahme miteingeschlossen.
Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann kombiniert werden mit anderen Therapien, wie Chirurgie, Chemotherapie, Radiotherapie, Immuntherapie oder irgendeine Kombination davon. Beispiele für chemotherapeutische Mittel schließen Cisplatin, 5-Fluoruracil und S-1 ein. Immunotherapeutische Verfahren schließen die Verabreichung von Interleukin-2 und Interferon-α ein.
Die Dosierungsbereiche für die Verabreichung einer Verbindung oder von Zusammensetzungen der Erfindung können abhängen von der Potenz, wie hier weiter beschrieben, und sind Mengen, die groß genug sind, um die gewünschte Wirkung zu erzielen, bei der der zu behandelnde Zustand behandelt wird, z. B. messbar verhütet, gehemmt oder verringert wird. Die Dosierung sollte nicht so groß sein, dass sie negative Nebenwirkungen verursacht. Allgemein variiert die Dosierung mit dem Alter, Zustand, Geschlecht und Zustand des Individuums und kann von einem Fachmann auf diesem Gebiet bestimmt werden. Die Dosierung kann auch von dem einzelnen Arzt im Fall irgendwelcher Komplikationen eingestellt werden. Die Dosierung kann die Menge sein, die typisch ist für verwandte Adenovirusverabreichungen, z. B. etwa 1 × 10² bis etwa 1 × 10¹² Plaque bildende Einheiten Adenovirus und kann z. B. 1 × 10² pfu, 1 × 10³ pfu, 1 × 10⁴ pfu, 1 × 10⁵ pfu, 1 × 10⁶ pfu, 1 × 10⁷ pfu, 1 × 10⁸ pfu, 1 × 10⁹ pfu, 1 × 10¹⁰ pfu, 1 × 10¹¹ pfu, 1 × 10¹² pfu sein. Für die Verabreichung von rekombinantem Virus, der eine Nukleinsäure enthält, die ein antiangiogenes Protein codiert, kann die Dosis in einem Bereich von etwa 0,001 bis etwa 10 mg/kg sein und kann z. B. etwa 0,01 bis etwa 10 mg/kg; etwa 0,1 bis etwa 10 mg/kg; etwa 1,0 bis etwa 10 mg/kg; etwa 0,001 bis etwa 1 mg/kg; etwa 0,001 bis etwa 0,1 mg/kg und etwa 0,01 bis etwa 1,0 mg/kg sein. Bei einem Versuch war die verwendete Dosis bis zu 1 mg/kg (siehe Hodges et al. "Phase 1 Study of Recombinant Human CD4-Immunoglobulin G Therapy of Patients with AIDS and AIDS-related Complex" Antimicrob. Agents Chemother. 35: 2580–6 (1991).
Die therapeutischen Verbindungen oder Zusammensetzungen dieser Erfindung werden in üblicher Weise verabreicht, durch IP, IM, IV, IN, IO, EO, SubCu etc. als Einheitsdosis. Der Ausdruck "Einheitsdosis" bedeutet, wenn er in Zusammenhang mit einer therapeutischen Verbindung oder Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, physikalisch diskrete Einheiten, die als einzelne Dosierung für das Individuum geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge aktives Material enthält, das so berechnet ist, dass es die gewünschte therapeutische Wirkung zusammen mit dem erforderlichen Verdünnungsmittel, d. h. Träger oder Vehikel, erzeugt.
Die Verbindungen oder Zusammensetzungen werden in einer Art und Weise verabreicht, die mit der Dosierungsformulierung kompatibel ist und in einer therapeutisch wirksamen Menge. Die zu verabreichende Menge hängt von dem zu behandelnden Individuum, der Kapazität des Systems des Individuums, den aktiven Inhaltsstoff zu verwerten, und dem gewünschten Ausmaß der therapeutischen Wirkung ab. Genaue Mengen des aktiven Inhaltsstoffs, die verabreicht werden müssen, hängen von der Beurteilung des Praktikers ab und sind spezifisch für jedes Individuum. Geeignete Dosierungsbereiche für systemische Anwendung können jedoch vom Verabreichungsweg abhängen. Geeignete Pläne zur Verabreichung sind auch variabel, erfolgen aber typischerweise durch eine Anfangsverabreichung gefolgt von wiederholten Dosen in Intervallen von einer oder mehr Stunden durch nachfolgende Injektion oder andere Verabreichung. Alternativ wird eine kontinuierliche intravenöse Infusion, die ausreicht, um Konzentrationen im Blut in einem Bereich aufrechtzuerhalten, der für in-vivo-Therapien spezifisch angegeben ist, in Betracht gezogen.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist eine pharmazeutisch annehmbare therapeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Virus oder eines antiangiogenen Proteins der Erfindung in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff enthält. Die Zusammensetzung soll das Verfahren zur Verabreichung eines Virus oder eines antiangiogenen Proteins der Erfindung in wirksamer Weise erleichtern. Allgemein weist eine Zusammen setzung der Erfindung einen Virus oder ein antiangiogenes Protein gelöst oder dispergiert in dem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff auf.
Die Ausdrücke "pharmazeutisch annehmbar", "physiologisch tolerierbar" und grammatikalische Variationen davon werden, wenn sie sich auf Zusammensetzungen, Hilfsstoffe (einschließlich Träger, Verdünnungsmittel, Stabilisatoren, Gleitmittel, Reagenzien und dgl.) beziehen, so wie sie hier verwendet werden, austauschbar verwendet und bedeuten, dass die Materialien verabreicht werden können an ein Individuum ohne Toxizität und bevorzugt ohne die Erzeugung von unerwünschten physiologischen Wirkungen, wie Erbrechen, Schwindel, Magenverstimmung und dgl.
Verbindungen oder Zusammensetzungen der Erfindung können an ein Individuum in einer Vielzahl von Formen verabreicht werden abhängig von der Verabreichungsmethode. Die Methode der Verabreichung kann als "invasiv" (z. B. IV, IM, IP oder SC) oder "nicht invasiv" (z. B. okular, bukkal, oral, transdermal, rektal, NI, OI [Lunge] und dgl.) angesehen werden. Allgemein wird eine Zusammensetzung, die auf einem invasiven Weg abgegeben wird, allgemein von professionellem Pflegepersonal verabreicht, während eine Zusammensetzung, die auf nicht invasivem Weg abgegeben wird, von dem Patienten selbst verabreicht werden kann.
Bei Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen oder Zusammensetzungen durch nicht invasive Methoden gibt es verschiedene allgemeine Methoden, die verwendet werden können, um die Abgabe einer Verbindung, die ein Adenovirus enthält, das eine Nukleinsäure enthält, die ein antiangiogenes Protein codiert, eine Nukleinsäure, die ein Adenovirus codiert, das ein antiangiogenes Protein codiert, oder ein antiangiogenes Protein enthält, zu verbessern. Die erste Methode besteht darin, die Absorption der Verbindung zu erhöhen. Dies kann erfolgen durch Verwendung einer Prodrug, einer chemischen Modifikation der primären Struktur der Verbindung, Einarbeitung der Verbindung in Liposomen oder anderes verkapselndes Material, gleichzeitige Verabreichung mit die Penetration verbessernden Mitteln, die Verwendung von physikalischen Methoden, wie Iontophorese und Phonophorese und die Zielführung zu spezifischen Geweben. Eine weitere Methode zur Verbesserung der Abgabe besteht darin, den Metabo lismus der Verbindung zu minimieren. Dies würde chemische Modifikationen der primären Struktur, kovalente Bindung an ein Polymer, Einarbeitung in ein Liposom oder anderes verkapselndes Material, gleichzeitige Verabreichung mit einem Enzyminhibitor und Zielführung zu spezifischen Geweben einschließen. Die dritte allgemeine Methode zur Verbesserung der Abgabe der Verbindung schließt eine Verlängerung der Halbwertszeit der Verbindung ein, indem sie mit Polymeren oder Liposomen geschützt wird, die Verwendung eines bioadhäsiven Materials oder die Zielführung der Zusammensetzung zu einem spezifischen Gewebe.
Wenn es erwünscht ist, die Absorption der Verbindungen der Erfindung zu erhöhen durch okulare, bukkale, transdermale oder rektale Verabreichung oder durch nasale Inhalation oder orale Inhalation kann man allgemein bestimmte die Penetration verbessernde Mittel anwenden. Diese verbessernden Mittel können Chelatbildner einschließen, wie EDTA, Citronensäure, N-Acylderivate von Collagen, Enamine (N-Amino-N-acylderivate von Diketonen). Tenside können auch verwendet werden, um die Penetration zu verbessern. Dies schließt Natriumlaurylsulfat, Polyoxyethylen-9-laurylether und Polyoxyethylen-20-cetylether ein. Gallensalze und Derivate sind auch bekannt dafür, dass sie die Penetration der Verbindung verbessern und diese schließen Natriumdesoxycholat, Natriumglycocholat, Natriumtaurocholat, Natriumtaurodihydrofusidat und Natriumglycodihydrofusidat ein. Eine weitere Art eines die Penetration verbessernden Mittels, das für die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung nützlich ist, schließt Keratinfettsäuren und Derivate, wie Ölsäure, Caprylsäure, Caprinsäure, Acylcarnitine, Acylcholin und Mono- und Diglyceride ein. Nicht oberflächenaktive Mittel sind auch nützlich als die Penetration verbessernde Mittel. Die die Penetration verbessernden Mittel können in Lösung mit den Verbindungen der Erfindung verwendet werden, wenn die Verbindung und die die Penetration verbessernden Mittel in pharmazeutisch annehmbarer steriler Lösung sind, die z. B. durch okulare Verabreichung verabreicht werden kann. Alternativ können die die Penetration verbessernden Mittel in einer pulverförmigen Formulierung enthalten sein, die als Aerosol verabreicht werden kann, indem das teilchenförmige Material in einem Luftstrom suspendiert wird. Solche pulverförmigen Formulierungen können durch einen Trockenpulverinhalator abgegeben werden, wofür beispielhaft ein Ventolin Rotohaler (Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina, USA) und Spinhaler (Fisons Corporation, Bedford, MA) genannt werden können.
Zusammensetzungen, die in Form von festen mikronisierten Teilchen mit einer Teilchengröße von etwa 0,5 bis 10 μm mittlerem Durchmesser sind, können gemäß der Lehre der internationalen PCT-Anmeldungen Nr. WO91/16038 und WO93/00951 hergestellt werden. Pulver können gemäß der Lehre von Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage, Mack Publishing Co., Kapitel 88: 1645–1648 hergestellt werden. Diese Lehren werden hier durch Bezugnahme miteingeschlossen.
Die aktive Verbindung kann oral, z. B. mit einem inerten Verdünnungsmittel oder mit einem assimilierbaren essbaren Träger verabreicht werden oder kann in harte oder weiche Gelatinekapseln eingeschlossen sein oder kann zu Tabletten gepresst sein oder kann direkt mit dem Essen in die Nahrung eingearbeitet werden. Für die orale therapeutische Verabreichung kann die aktive Verbindung mit Hilfsstoff eingearbeitet werden und in Form von einnehmbaren Tabletten, Bukkaltabletten, Pastillen, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirupen, Scheiben und dgl. verwendet werden. Solche Zusammensetzungen und Präparate sollten mindestens 0,1% aktive Verbindung enthalten. Zur Herstellung von oralen Formulierungen muss man sich der Probleme des Abbaus im Mund und oberen GI-Trakt bewusst sein. So kann es bevorzugt sein, einen Enzyminhibitor in Kombination mit der Verbindung anzuwenden oder ein die Penetration verbesserndes Mittel zu verwenden oder ein schützendes Polymer oder eine Mikrokapsel zu verwenden. Der Prozentanteil der Zusammensetzungen und Präparate kann natürlich variiert werden und kann geeigneterweise bis zu etwa 20 Gew.-% der Verbindung in einer Dosierungseinheit sein. Die Menge an aktiver Verbindung in solchen therapeutisch nützlichen Zusammensetzungen ist so, dass eine geeignete Dosierung erhalten wird.
Die Tabletten, Pastillen, Pillen, Kapseln und dgl. können auch Hilfsstoffe wie die folgenden enthalten: ein Bindemittel, wie Polyvinylpyrrolidon, Traganth, Gummi arabicum, Saccharose, Maisstärke, Gelatine, Calciumphosphat, Natriumcitrat und Calciumcarbonat; ein Sprengmittel, wie Maisstärke, Kartoffelstärke, Tapiokastärke, bestimmte komplexe Silicate, Alginsäure und dgl.; ein Gleitmittel, wie Natriumlaurylsulfat, Talk und Magnesiumstearat, ein Süßstoff, wie Saccharose, Lactose oder Saccharin oder ein Aromastoff, wie Pfefferminz, Gaultheriaöl oder Kirscharoma. Feste Zusammensetzungen gleicher Art werden auch als Füllstoffe für weich- und hartgefüllte Gelatinekapseln angewendet; Materialien in diesem Zusammenhang schließen Lactose oder Milchzucker ebenso wie Polyethylenglycole mit hohem Molekulargewicht ein. Wenn die Dosierungseinheitsform eine Kapsel ist, kann sie zusätzlich zu Materialien des obigen Typs einen flüssigen Träger enthalten. Verschiedene andere Materialien können als Beschichtungen vorhanden sein, um in anderer Weise die physikalische Form der Dosierungseinheit zu modifizieren. Z. B. können Tabletten, Pillen oder Kapseln mit Schellack, Zucker oder beidem beschichtet sein. Ein Sirup oder Elixier kann die aktive Verbindung, Saccharose als Süßstoff, Methyl- und Propylparabene als Konservierungsmittel, einen Farbstoff, einen Aromastoff, wie Kirsch- oder Orangenaroma, emulgierende Mittel und/oder suspendierende Mittel ebenso wie Verdünnungsmittel, wie Wasser, Ethanol, Propylenglycol, Glycerin und verschiedene Kombinationen davon enthalten. Natürlich sollte jedes Material, das zur Herstellung irgendeiner Dosierungseinheitsform verwendet wird, pharmazeutisch rein und in den angewendeten Mengen im Wesentlichen nicht toxisch sein. Zusätzlich kann die aktive Verbindung in Depotpräparate und Formulierungen eingearbeitet werden. Weitere Komponenten sind für den Fachmann auf diesem Gebiet selbstverständlich.
Für die Zwecke der IP-Verabreichung können Lösungen in Sesam- oder Erdnussöl oder in wässrigem Propylenglycol angewendet werden ebenso wie sterilwässrige Lösungen der entsprechenden wasserlöslichen, Alkali- oder Erdalkalisalze. Solche wässrigen Lösungen sollten in geeigneter Weise gepuffert werden und das flüssige Verdünnungsmittel sollte mit ausreichend Kochsalzlösung oder Glucose isotonisch gemacht werden. Lösungen der aktiven Verbindung als freie Base oder als pharmakologisch annehmbares Salz können in Wasser hergestellt werden, geeigneterweise vermischt z. B. mit Hydroxypropylcellulose. Eine Dispersion kann auch in Glycerin, flüssigen Polyethylenglycolen und Mischungen davon und in Ölen hergestellt werden. Unter üblichen Bedingungen der Lagerung und Verwendung enthalten diese Präparate ein Konservierungsmittel, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern. Diese speziellen wässrigen Lösungen sind besonders geeignet für IV, IM, SC und IP. In diesem Zusammenhang sind sterile wässrige Medien, die angewendet werden, leicht mit Standardtechniken, die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannt sind, erhältlich.
Die pharmazeutischen Formen, die für injizierbare Mittel geeignet sind, schließen sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver für die unvorbereitete Herstellung von steril injizierbaren Lösungen oder Dispersionen ein. In allen Fällen muss die Form steril sein und muss in einem solchen Ausmaß fließfähig sein, dass eine leichte Spritzfähigkeit besteht. Sie muss unter den Bedingungen der Herstellung und Lagerung stabil sein und muss gegen die kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilzen, konserviert werden. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder Dispersionsmedium sein, das z. B. Wasser, Ethanol, Polyol (z. B. Glycerin, Propylenglycol, flüssiges Polyethylenglycol und dgl.), geeignete Mischungen davon und pflanzliche Öle enthält. Die richtige Fließfähigkeit kann z. B. erhalten werden durch Verwendung einer Beschichtung, wie Lecithin, durch Aufrechterhaltung der erforderlichen Teilchengröße im Fall einer Dispersion und durch die Verwendung von Tensiden. Die Verhinderung der Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und Antipilzmittel erfolgen, z. B. Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal und dgl. In vielen Fällen ist es bevorzugt, isotonische Mittel zuzufügen, z. B. Zucker und Natriumchlorid. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann erfolgen durch Verwendung von Mitteln, die die Absorption verzögern, z. B. Aluminiummonostearat und Gelatine.
Sterile injizierbare Lösungen werden hergestellt, indem die aktive Verbindung in der erforderlichen Menge in das geeignete Lösungsmittel mit verschiedenen der weiteren oben aufgezählten Inhaltsstoffe eingearbeitet wird und nach Bedarf und Eignung anschließend steril filtriert wird. Im Allgemeinen werden Dispersionen hergestellt, indem der stabilisierte aktive Inhaltsstoff in ein steriles Vehikel eingearbeitet wird, das das Grunddispersionsmedium enthält und die erforderlichen weiteren Inhaltsstoffe aus den oben aufgezählten zugefügt werden. Im Fall von sterilen Pulvern zur Herstellung von steril injizierbaren Lösungen sind die bevorzugten Herstellungsmethoden Vakuumtrocknung und Gefriertrocknungstechnik, was ein Pulver des aktiven Inhaltsstoffs liefert plus irgendwelcher zusätzlicher gewünschter Inhaltsstoffe aus der vorher steril filtrierten Lösung davon.
Für die IP-Formulierungen, die Depotformulierungen sind, kann eine Verbindung der Erfindung mit einem Polymer kombiniert werden, das die Freisetzung der Verbindung steuert und es vor Abbau schützt. Allgemein kann ein solches Poly mer biologisch abbaubar oder nicht biologisch abbaubar sein und kann weiterhin hydrophil oder hydrophob sein. Geeignete hydrophile nicht abbaubare Polymere zur Verwendung in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung schließen Hydrogele, wie Acrylamid oder Vinylpyrrolidon vernetzt mit N,N'-Methylenbisacrylamid ein. Geeignete nicht abbaubare hydrophobe Polymere schließen Ethylen/Vinylacetat-Copolymere, Siliconelastomere, Polydimethylsiloxan und dgl. ein. Abbaubare hydrophile Polymere, die für die Erfindung geeignet sind, schließen N-Vinylpyrrolidon oder Acrylamid vernetzt mit weniger als 1% N,N'-Methylenbisacrylamid, Dextran, das mit Glycidylmethacrylat derivatisiert ist und mit N,N'-Methylenbisacrylamid vernetzt ist, wasserlösliche Polyester, die aus Fumarsäure und Poly(ethylenglycol) hergestellt wurden und mit N-Vinylpyrrolidon vernetzt sind, wasserlösliche Polyester und dgl. ein. Geeignete abbaubare hydrophobe Polymere, die für die erfindungsgemäße Zusammensetzung nützlich sind, schließen Lactid/Glycolid-Copolymere, Poly(orthoester) und Polyanhydride ein. Von diesen verschiedenen Polymeren sind Lactid/Glycolid-Copolymere bevorzugt. Eine detailliertere Beschreibung dieser Polymere für kontrollierte parenterale Abgabe findet sich in einem Artikel von George Heller, Advanced Drug-Delivery Reviews, 10: 163–204 (1993) (Elsevier Science Publishers BV). Der Artikel wird hier durch Bezugnahme miteingeschlossen.
Für die bevorzugte erfindungsgemäße Zusammensetzung mit kontrollierter Freisetzung können die Lactid/Glycolid-Copolymere ein Verhältnis von DL-Milchsäure zu DL-Glycolsäure von etwa 30:70 bis etwa 70:30, bevorzugt etwa 40:60 bis etwa 60:40 haben. Ein Verhältnis von etwa 44:56 ist repräsentativ. Ein Adenovirus oder ein antiangiogenes Protein der Erfindung kann in dem Copolymer mit im Stand der Technik bekannten Mitteln mikroverkapselt werden, um die Zusammensetzung zu bilden, siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 4 675 189, ausgegeben am 23. Juni 1987 an Sanders, Kent, Lewis und Tice.
Zur topischen Verabreichung werden verdünnte sterile wässrige Lösungen (gewöhnlich mit einer Konzentration von etwa 0,1 bis 5%), die ansonsten den obigen parenteralen Lösungen gleichen, in Behältern hergestellt, die geeignet sind für die tropfenweise Verabreichung in das Auge in geeigneten Trägern, wie Kochsalzlösung, mit geeigneten antimikrobiellen Mitteln, wie Natriumbenzoat und Thimerosal.
Die Dosierung der vorliegenden therapeutischen Mittel, die zur Prophylaxe oder Behandlung am geeignetsten ist, variiert je nach der Form der Verabreichung, der jeweils ausgewählten Verbindung und den physiologischen Eigenschaften des jeweiligen zu behandelnden Individuums. Allgemein können kleine Dosierungen anfangs verwendet werden und, falls notwendig, in kleinen Schritten erhöht werden, bis die optimale Wirkung unter den Umständen erreicht ist. Die orale Verabreichung kann höhere Dosierungen erfordern.
Die vorliegende Erfindung offenbart auch ein Verfahren zur Behandlung eines Tumors bei einem Individuum, das beinhaltet, dass dem Individuum ein Virus verabreicht wird, der eine rekombinante Nukleinsäure enthält, die ein antiangiogenes Protein codiert, die in die virale Nukleinsäure insertiert ist, wobei die rekombinante Nukleinsäure in einem Virusteilchen verpackt sein kann und wobei eine Zelle in dem Individuum die rekombinante Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert, exprimiert und das antiangiogene Protein erzeugt, wodurch der Tumor behandelt wird.
Wie vorher diskutiert, kann die rekombinante Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert, replikationskompentent oder replikationsdefizient sein. Diese Methode liefert daher ein Verfahren zur Behandlung eines Tumors bei einem Individuum, indem eine rekombinante Nukleinsäure, die ein antiangiogenes Protein codiert, dem Individuum verabreicht wird, wodurch das Individuum die rekombinante Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert, exprimiert, wodurch das antiangiogene Protein erzeugt wird, das den Tumor behandelt. Wie auch oben diskutiert, sind Verfahren zur Verabreichung der rekombinanten Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert, im Stand der Technik wohl bekannt und können die Verabreichung von "nackter DNA" ebenso wie die Verabreichung einer Nukleinsäure, die mit einem Träger verbunden ist, z. B. einem kationischen oder anionischen Liposom oder mit Polylysin, einschließen. (Siehe z. B. Brigham et al., Amer. J. Respir. Cell and Mol. Biol. 8: 209–213 (1993); Felgner et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84: 7413 und U.S.-Patent Nr. 4 897 355 (Eppstein et al.)).
Es wird auch ein Verfahren zur Herstellung eines antiangiogenen Proteins bereitgestellt, das beinhaltet, dass einer Zelle ein Virus verabreicht wird, der eine rekombinante Nukleinsäure enthält, die ein antiangiogenes Protein codiert, das in die virale Nukleinsäure insertiert ist, wobei die rekombinante Nukleinsäure in einem Virusteilchen verpackt sein kann und durch die Expression der rekombinanten Nukleinsäure das antiangiogene Protein erzeugt wird. Dieses Verfahren kann daher verwendet werden, um antiangiogene Proteine zu erzeugen, die extrazellulär ausgeschieden werden, bei denen das antiangiogene Protein aus dem extrazellulären Medium gewonnen werden kann ebenso wie solche antiangiogenen Proteine, die nicht aus der Zelle ausgeschieden werden, bei denen die Zelle aufgerissen werden muss, möglicherweise einschließlich eines zusätzlichen Aufreißens der Zellmembran. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die antiangiogenen Proteine leicht aus den Zellen ausgeschieden. Proteingewinnungsmethoden sind im Stand der Technik Standard und hier beispielhaft ausgeführt. Das antiangiogene Protein kann auf jeden gewünschten Reinheitsgrad gereinigt werden, wie es auch im Stand der Technik Standard ist.
Es wird auch ein Verfahren zum Screening eines antiangiogenen Proteins auf biologische Aktivität bereitgestellt, das beinhaltet, dass einer ersten Zelle ein Virus verabreicht wird, der eine rekombinante Nukleinsäure enthält, die das antiangiogene Protein codiert, wobei die erste Zelle die rekombinante Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert, exprimiert und dadurch das antiangiogene Protein erzeugt, eine zweite Zelle mit dem antiangiogenen Protein in Kontakt gebracht wird und die zweite Zelle auf ein biologisches Ansprechen auf das antiangiogene Protein überwacht wird, wodurch das antiangiogene Protein auf biologische Aktivität gescreent wird.
Dieses Verfahren kann daher spezielle antiangiogene Proteine auf eine spezielle biologische Aktivität, wie oben diskutiert, screenen, z. B. eine Reduktion der Tumormasse, Reduktion der Tumorgefäßbildung, Anstieg der Tumornekrose und Verminderung der zellulären Tumorproliferation.
Das Screeningverfahren kann umfassen, dass das antiangiogene Protein aus der ersten Zelle gewonnen wird, die das antiangiogene Protein erzeugt, bevor das antiangiogene Protein einer zweiten Zelle verabreicht wird, die dann auf eine biologische Antwort auf das antiangiogene Protein überwacht wird, oder das Verfahren kann umfassen, dass die erste Zelle, die das antiangiogene Protein er zeugt, mit der zweiten Zelle vermischt wird, die dann auf eine biologische Antwort auf das antiangiogene Protein überwacht wird. In gleicher Weise kann die erste Zelle, die das antiangiogene Protein erzeugt, von der gleichen Zellart sein wie die zweite Zelle, oder erste und zweite Zelle können verschiedene Zellarten sein.
Die vorliegende Erfindung offenbart auch ein Verfahren zum Screening eines antiangiogenen Proteins auf biologische Aktivität, das beinhaltet, dass einer Zelle ein Adenovirus verabreicht wird, der eine rekombinante Nukleinsäure enthält, die das antiangiogene Protein codiert, wobei die Zelle die rekombinante Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert, exprimiert und dadurch das antiangiogene Protein erzeugt und die Zelle auf eine biologische Reaktion auf das antiangiogene Protein überwacht wird, wodurch das antiangiogene Protein auf biologische Aktivität gescreent wird. Das Screening-Verfahren erfordert daher nicht eine zweite Zelle, die kein antiangiogenes Protein erzeugt, sondern es kann nur eine Zelle angewendet werden, die selbst ein antiangiogenes Protein erzeugt.
Die Screening-Tests der Erfindung können in geeigneter Weise das antiangiogene Protein direkt aus der Zelle, in der es erzeugt wird, anwenden. Dies wird am meisten bevorzugt erreicht, indem einfach das ausgewählte antiangiogene Protein innerhalb der Zelle exprimiert wird, typischerweise einer eukaryotischen Zelle, und anschließend eine Probe des Zellkulturmediums erzeugt wird, das das antiangiogene Protein enthält. Alternativ kann eine zusätzliche Reinigungsstufe des Kulturmediums, das das antiangiogene Protein enthält, erreicht werden, um eine gereinigte Menge an antiangiogenen Proteinmolekülen zu gewinnen. Die zusätzlichen Reinigungsstufen können eine spezifische Bindung des antiangiogenen Proteins an einen für das antiangiogene Protein spezifischen Liganden oder Rezeptor beinhalten.
Indem die Bindung des ausgewählten Effektors in Gegenwart oder Abwesenheit des Antiangiogenproteinkandidaten verglichen wird, kann man Information im Hinblick auf die Bindungseigenschaften des antiangiogenen Proteins erhalten. Es wird angenommen, dass es eine große Vielzahl von Ausführungsformen gibt, die angewendet werden können, um die Wirkung des antiangiogenen Proteins auf Zellen zu bestimmen, insbesondere Epithelzellen, und die Erfindung soll nicht auf irgendeine dieser Methoden beschränkt sein. Es ist jedoch allgemein wün schenswert, ein System anzuwenden, bei dem man die Fähigkeit des antiangiogenen Proteins, an einen Effektor zu binden oder von dem Effektor modifiziert zu werden, messen kann. Eine Methode, die angewendet werden kann, kann ein markiertes antiangiogenes Protein verwenden, das in einer solchen Art und Weise markiert worden ist, dass die Markierung quantitativ in dem entstehenden antiangiogenen Protein/Rezeptor-Komplex erhalten bleibt. Ein geeigneter Ansatz ist die Verwendung einer radioaktiven Markierung, z. B. ¹²⁵I, ¹⁴C oder ³H, die direkt quantitativ ausgewertet werden können sowohl bei dem antiangiogenen Protein als auch dem entstehenden Komplex. In bestimmten Tests wird die Mischung, die das antiangiogene Protein und einen Rezeptor enthält, über einen ausgewählten Zeitraum inkubiert und die entstehende inkubierte Mischung einem Trennmittel ausgesetzt, um ungebundenes antiangiogenes Protein, das in der Mischung verbleibt, von irgendwelchem so erzeugten Komplex aus antiangiogenem Protein/Rezeptor zu trennen. Dann kann man einfach die Menge jedes der beiden bestimmen, z. B. gegenüber einer Kontrolle, der kein Kandidat für ein antiangiogenes Protein zugefügt wurde. Diese Messung kann zu verschiedenen Zeitpunkten erfolgen, wenn Geschwindigkeitsdaten erwünscht sind. Daraus kann man die Fähigkeit des antiangiogenen Proteins, die Funktion des Rezeptors zu verändern oder zu modifizieren, bestimmen. Zahlreiche Techniken sind bekannt, die zur Trennung des antiangiogenen Proteins von einem antiangiogenen Protein/Rezeptor-Komplex angewendet werden können und all diese Methoden sollen im Schutzbereich der Erfindung liegen, z. B. die Verwendung von Dünnschichtchromatographiemethoden (DC), HPLC, spektrophotometrischen, gaschromatographischen/massenspektrometrischen oder NMR-Analysen. Weitere spezifischere Methoden der Reinigung, die bereits erwähnt wurden (Affinitätsbindung oder Immunfällung) können auch verwendet werden. Es wird davon ausgegangen, dass jede Technik angewendet werden kann, solange sie zwischen dem antiangiogenen Protein und dem Komplex differenzieren kann und verwendet werden kann, um eine enzymatische Funktion zu bestimmen, z. B. indem Substrat und Produkt identifiziert oder quantitativ ausgewertet werden. Der Komplex aus antiangiogenem Protein und Rezeptor kann auch Gegenstand von Techniken wie Röntgenkristallographie sein.
Die hier beschriebenen Screening-Methoden können auch verwendet werden, um ein antiangiogenes Protein auf biologische Aktivität zu screenen, wobei einer ersten Zelle eine virale Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert, verabreicht wird, wobei die erste Zelle die virale Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert, exprimiert und dadurch das antiangiogene Protein erzeugt, eine zweite Zelle mit dem antiangiogenen Protein in Kontakt gebracht wird und die zweite Zelle auf eine biologische Antwort auf das antiangiogene Protein überwacht wird, wodurch das antiangiogene Protein auf biologische Aktivität gescreent wird.
In gleicher Weise können die hier beschriebenen Screening-Verfahren verwendet werden, um ein antiangiogenes Protein auf biologische Aktivität zu screenen, wobei einer Zelle eine virale Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert, verabreicht wird, wobei die Zelle die virale Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein codiert, exprimiert und dadurch das antiangiogene Protein erzeugt und die Zelle auf eine biologische Reaktion auf das antiangiogene Protein überwacht wird, wodurch das antiangiogene Protein auf biologische Aktivität gescreent wird.
Die Beschreibung und das Beispiel sollen nur beispielhaft sein, wobei der wahre Schutzbereich und Geist der Erfindung durch die beigefügten Ansprüche angegeben wird.
Es wurden Anstrengungen unternommen, um die Genauigkeit sicherzustellen im Hinblick auf Zahlen (z. B. Mengen, Temperatur etc.), aber Fehler und Abweichungen sind möglich. Wenn nicht anders angegeben, sind Teile Gewichtsteile, die Temperatur ist in °C und der Druck ist atmosphärischer Druck oder in etwa atmosphärischer Druck.
Beispiel 1
Klonierung von Maus-Endostatin. Maus-Endostatin wurde kloniert, indem RNA aus den Lebern von 3 Wochen alten Mäusen isoliert wurde und die RNA in cDNA umgewandelt wurde unter Verwendung einer reversen Transkriptasereaktion. Vorwärts-(gatctctagaccaccatgcatactcatcaggactttcag)- und Rückwärts-(gatcatcgatctatttggagaaagaggtca)-Primer wurden verwendet mit dieser cDNA-Matrize, um die Maus-Endostatin-cDNA in ein Sequenzierungsplasmid (pkmendo-2) zu klonieren. Die PCR wurde durchgeführt unter Verwendung von pfu-Enzym mit Glycerol und DMSO als Additiven. Die PCR-Bedingungen waren: 45 s bei 94°C, 45 s bei 50°C, 25 Zyklen 2 min bei 70°C. Die Sequenz wurde bestätigt unter Verwendung eines Sequenzautomaten.
Klonierung von menschlichem Endostatin. Menschliches Endostatin wurde kloniert, indem RNA aus einem menschlichen Hämangioendotheliom isoliert wurde. Diese RNA wurde in cDNA umgewandelt unter Verwendung einer reversen Transkriptasereaktion und als Matrize für die PCR unter den gleichen Bedingungen, wie oben beschrieben, verwendet. Der Vorwärtsprimer war gatctctagaccaccatggttgcgctcaacagccccctgt. Der Rückwärtsprimer war gatcatcgatctactacttggaggcagtcatgaagct. Das PCR-Produkt wurde in ein Sequenzierungsplasmid (pkhendo-2) kloniert und die Sequenz wurde bestätigt unter Verwendung eines Sequenzautomaten.
Erzeugung von Signalsequenz-Endostatin (ss-endo). Die E3/19K-Adenovirus-Signalsequenz wurde den Maus- und Humanendostatinkonstrukten mit PCR zugefügt. Ein einzelner Vorwärtsprimer, der die Signalsequenz enthielt, ebenso wie eine Sequenz, die dem 5'-Ende der Endostatin-cDNA homolog war, wurde erzeugt.
Mausprimer:
Humanprimer:
Für das Mauskonstrukt wurde pkmendo-2 als Matrize verwendet unter den gleichen PCR-Bedingungen und dem Rückwärtsprimer, wie oben beschrieben, um ein PCR-Produkt zu erzeugen, das die Signalsequenz 5' für die cDNA für das Maus-Endostatin trug. Dies wurde in ein Sequenzierungsplasmid ligiert, was zu pssmendo-6 führte. Die Sequenz wurde mit einem Sequenzautomaten bestätigt.
Für das Humankonstrukt wurde pkhendo-2 als Matrize verwendet unter den gleichen PCR-Bedingungen, wie oben beschrieben. Das PCR-Produkt wurde in ein Sequenzierungsplasmid ligiert, um psshendo zu erzeugen.
Erzeugung von adenoviralen Shuttle-Plasmiden. Zwei adenovirale Shuttle-Plasmide wurden erzeugt, eins mit dem Signalsequenz-Maus-Endostatin (pSKL-35) (1) und eins mit Maus-Endostatin ohne die Signalsequenz (pSKL-22) (2) unter Verwendung des Plasmids pAd/CMV.1 als Gerüst. Die Plasmide wurden erzeugt, indem die DNA, die Endostatin codierte, aus dem geeigneten Stammplasmid (pkmendo oder pssmendo) unter Verwendung von Eco R1 ausgeschnitten wurde (mit oder ohne die Signalsequenz). Dieses Eco-R1-Fragment wurde in den Shuttle-Vektor ligiert und die Orientierung durch Restriktionsverdau bestätigt. Rekombinanter Adenovirus wurde dann unter Verwendung von Standardtechniken erzeugt.
Antitumorwirkung von Ad-ss-mEndo in vivo. 6 bis 8 Wochen alten Nacktmäusen wurden subcutan 10⁶ Lewis-Lungenkarzinomzellen in 200 ml PBS am Tag –4 injiziert. Die Mäuse wurden intraperitoneal mit 1 × 10⁹ Plaque bildenden Einheiten (pfu) von Adenovirus, das Endostatin codierte (Endo, n = 8), Adenovirus, das Luciferase codierte (Luc, n = 6) oder keinem Adenovirus (PBS, n = 5) in 2 ml PBS an den Tagen 0, 7 und 14 behandelt. Tumoren wurden ungefähr alle 3 Tage von einem Forscher gemessen, der den Behandlungsplan der einzelnen Tiere nicht kannte und das Tumorvolumen wurde berechnet unter Verwendung der Formel: Volumen = Breite² × Länge × 0,52. Tiere, die mit Endostatin behandelt worden waren, hatten signifikant kleinere Tumoren als Kontrolltiere ab dem Tag 12 bis zum Ende des Versuchs am Tag 19 (3) (p < 0,02, Kruskal-Wallis).
Endostatinpegel im Überstand nach Infektion mit Adenovirus. 1 × 10⁷ 293-(E1-transformierte Humanembryonieren)-Zellen wurden in 10-cm-Kulturschalen in DMEM, das 10% FCS, Glutamin, Penicillin, Streptomycin, Gentamycin und Fungizone enthielt, ausplattiert und über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden dann mit 10⁹ pfu (MOI = 100) Wildtyp-Adenovirus (null), Adenovirus, der das Maus-Endostatingen enthielt, Adenovirus, der das Signalsequenz-Endostatinkonstrukt enthielt oder keinem Adenovirus in 10 ml des gleichen Mediums infiziert und 24 Stunden lang inkubiert. Die Überstände wurden dann gewonnen und mit 5000 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert, um Zellbruchstücke zu entfernen. Jede Infektion wurde dreifach durchgeführt und die Überstand-Endostatinkonzentrationen wurden für jede Infektion doppelt bestimmt unter Verwendung eines kompetitiven Immunoassays (Cytimmune, College Park, MD). Endostatin war in den Überständen von den Platten null, Endostatin oder nicht infiziert nicht nachweisbar, war aber in einer Konzentration von 68,5 ± 2,8 ng/ml (Durchschnittswert ± SD) in den Überständen von mit Signalsequenz-Endostatin infizierten Platten vorhanden (4).
Überstand-Endostatinpegel nach Infektion mit Adenovirus. Der Versuchsaufbau war identisch mit dem vorherigen Versuch mit den folgenden Ausnahmen: 10⁶ Zellen pro Napf wurden in 6-Napf-Zellen plattiert und wurden infiziert mit 10⁸ pfu (MOI = 100) von Adenovirus in 1,0 ml Medium.
Die Endostatinkonzentrationen, die in den mit Ad-Kontrolle oder Ad-mEndo-infizierten Näpfen nachgewiesen wurden, waren geringer als in den konditionierten Medien von nicht infizierten 293-Zellen (16,3 ± 1,3 ng/ml). Die Endostatinkonzentration war 705,7 ± 191,4 in den mit Ad-ss-mEndo-infizierten Näpfen (5) (Konzentrationen ausgedrückt als Mittelwert ± SD). Die Immunreaktivität in den Kontrollnäpfen war ähnlich der von 10% FCS alleine, was auf die Gegenwart eines Proteins in Rinderserum hindeutet, das mit polyklonalen Antimaus-Endostatin-Antikörpern kreuzreagiert.
Hemmung der mikrovaskulären Endothelzellproliferation unter Verwendung von Ad-ss-mEndo. Um die in-vitro-Funktion von adenoviral erzeugtem Endostatin zu prüfen, wurde die Proliferation von mikrovaskulären menschlichen Lungen-Endothelzellen (MVEC) in Gegenwart des Überstands aus Zellen, die mit Ad-ss-mEndo infiziert waren, die wie im vorherigen Versuch beschrieben, hergestellt worden waren, untersucht. Am Tag –1 wurden 1 × 10⁵ MVEC in jeden Napf von 12-Napf-Platten in EGM-2-Endothelzellwachstumsmedium plattiert. Am Tag 0 und wieder am Tag 4 wurden die Zellen mit Überständen aus Zellen, die mit Ad-ss-mEndo infiziert worden waren, einem Kontrolladenovirus oder keinem Adenovirus (konzentrierter oder unkonzentrierter Überstand) versetzt. Zusätzlich wurde rekombinantes Endostatin, das von Calbiochem (CBC) oder Cytimmune Sciences (CI) erhalten worden war, getestet. Alle Näpfe enthielten ein Gesamtvo lumen von 0,5 ml und 10 ng/ml basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) als Stimulans. In den Ad-ss-mEndo-Näpfen war die mittlere Zellzahl 333 und zwei Näpfe zeigten eine vollständige Abwesenheit von MVEC (6). Negative Kontrollnäpfe, einschließlich EGM-2 oder konzentriertes oder unkonzentriertes konditioniertes Medium enthielten mittlere Zellzahlen im Bereich von 23.000 bis 28.000. Näpfe, die mit rekombinantem Endostatin behandelt worden waren, lieferten mittlere Zellzahlen im Bereich von 7.000 bis 10.000. Näpfe, die mit Kontrollvirus behandelt worden waren, lieferten eine mittlere Zellzahl von 12.000, was auf eine gewisse nicht spezifische adenovirale Wirkung auf die MVEC-Proliferation hindeutet, aber nicht den fast vollständigen Effekt, der mit dem Endostatinkonstrukt zu sehen ist.
Ad-ss-mEndo erhöht Plasma-Endostatinpegel bei Mäusen. Um die Fähigkeit von Ad-ss-mEndo, Endostatin in vivo zu erzeugen, auszuwerten, wurde Nacktmäusen intraperitoneal 10⁹ pfu Ad-ss-mEndo, ein Kontrolladenovirus (Ad-null) oder kein Virus in 2,0 ml Kochsalzlösung (PBS) injiziert. Fünf Tage später wurden Plasmaproben auf die Endostatinkonzentration mit ELISA untersucht. Plasmapegel in den mit Ad-ss-mEndo behandelten Tieren waren 106 ± 28,0 ng/ml gegenüber 37 ± 19,1 ng/ml und 34 ± 8,5 ng/ml in den Ad-null- und PBS-Gruppen (Mittelwert ± S. D.) (7).
Beispiel II
Klonierung des Maus-Endostatingens. Maus-cDNA wurde erhalten, indem RNA (RNeasy Mini Kit, Qiagen, Valencia, CA) aus schockgefrorener Leber einer 2 Wochen alten C57BL/6-Maus (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) isoliert wurde und mit reverser Transkriptase aus Moloney-Maus-Leukämievirus (Life Technologies, Gaithersburg, MD) behandelt wurde. Das Maus-Endostatingen wurde in den TA-Klonierungsvektor (Invitrogen, Carlsbad, CA) mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) kloniert unter Verwendung des Sense-Primers:
und des Antisense-Primers
Die 18-Aminosäure E3/19K-Signalsequenz (MRYMILGLLALAAVCSAA) wurde mit PCR stromaufwärts der Endostatinsequenz insertiert unter Verwendung der Sense-Primer:
und Antisense: wie oben. Plasmid-DNA wurde in DH5a-Zellen (Life Technologies) amplifiziert und die Signalsequenz-Maus-Endostatin-(ss-mEndo)-Sequenz bestätigt (ABI Prism 3 10 Autosequencer, PE Applied Biosystems, Foster City, CA).
Synthese von adenoviralen Vektoren. Das ss-mEndo-Konstrukt wurde mit EcoRI verdaut und durch Blunt-end-Ligierung in die multiple Klonierungsstelle des adenoviralen Shuttle-Plasmids pAd/CMV.1 kloniert. Das entstehende Plasmid wurde mit Typ 5 EI A/B-deletiertem Adenovirus, wie früher beschrieben (6.7) rekombiniert, und verwendet, um 293-Zellen (American Type Culture Collection, Manassas, VA) infiziert. Plaque-DNA wurde extrahiert unter Verwendung eines Verdaus mit Proteinase K, Phenolextraktion und Ethanolausfällung und auf ss-mEndo mit PCR gescreent. Der entstehende Virus, Ad-ss-mEndo, wurde in 293-Zellen amplifiziert. Eine ähnliche Strategie wurde verwendet, um rekombinante Viren, die die Gene für P-Galactosidase (Ad-p-gal) und Luciferase aus Glühwürmchen (Ad-luc) enthielten, zu kontrollieren. Bei den Viren wurde der Titer bestimmt unter Verwendung eines Standardtests für Plaque bildende Einheiten in 293-Zellen.
In-vitro-Infektion mit rekombinantem Adenovirus. Zellen wurden in komplettem Medium gezüchtet, das aus DMEM mit 10% fötalem Kälberserum, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 50 μg/ml Gentamicin, 0,5 ~μg/ml Fungizone und 4 mM Glutamin (Biofluids, Rockville, MD) bestand. Die Zellen wurden mit einer Mehrzahl von Infektionen (MOIs) im Bereich von 0,1 bis 100 (105 bis 108 Plaque bildende Einheiten [pfu] pro 106 Zellen in 1,0 ml kompletten Medien) mit Ad-ss-mEndo, Ad-luc oder keinem Virus infiziert und 24 h bei 37°C inkubiert. Die Überstände wurden mit 2 × g 5 min lang zentrifugiert und auf Endostatin untersucht unter Verwendung eines kompetitiven Enzymimmunoassays (EIA) (Cytimmune Sciences, College Park, MD) nach der Anleitung des Herstellers. Zellüberstände von 293-Zellen wurden zehnfach in Cellulosesäulen eingeengt (Centricon YM-10, Millipore, Bedford, MA) und mit Western Blot (NuPAGE, Novex, Sand Diego, CA) analysiert unter Verwendung von 570 ng/ml polyklonalen Kaninchen-Antimaus-Endostatin-IgG-Antikörpern (Geschenk von Cytimmune Sciences). Der EIA-Maus-Endostatinstandard wurde als positive Kontrolle verwendet. Die Empfänglichkeit der Mausdarm-Adenocarcinomazelllinie MC38 (entwickelt in der Chirurgischen Abteilung, National Cancer Institute) für eine adenovirale Infektion wurde getestet, indem Zellen mit Ad-βgal, wie oben beschrieben, infiziert wurden und 24 h später auf βgal getestet wurden unter Verwendung eines Anfärbungskits (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Die Empfänglichkeit der Maus-Hepatozytenlinie NMuLi (American Type Culture Collection) für eine Ad-β-gal-Infektion wurde als positive Kontrolle verwendet.
Funktioneller Test für viral erzeugtes Endostatin. Die menschliche Melanomzelllinie 501 Mel (Z.-H. Wang, National Cancer Institute) wurde wie oben infiziert mit variierenden MOIs von Ad-ss-mEndo oder Ad-luc. Die Überstände wurden 24 h später gewonnen und wie oben zentrifugiert. Die Überstände wurden auf ihre Fähigkeit, die Endothelzellproliferation zu hemmen, wie vorher beschrieben (8), mit geringen Modifikationen analysiert. Kurz gesagt, wurden 1000 Rinderkapillar-Endothelzellen (EJG, American Type Culture Collection) in komplettem Medium in jedem Napf von mit Collagen 1 beschichteten 96-Napf-Platten (Biocoat, Becton Dickinson, Bedford, MA) plattiert. Nach Über-Nacht-Inkubation bei 37°C wurde das Medium abgesaugt und durch ungefähr 20 tl der zu testenden Überstandsprobe ersetzt. 8 Proben jedes Überstands wurden getestet. Nach 20 Minuten Inkubation bei 37°C wurden ungefähr 80 IL-modifiziertes komplettes Medium, das 5% fötales Kälberserum und 1 ng/ml basischen Fibroblastwachstumsfaktor (R&D Systems, Minneapolis, MN) enthielt, zugegeben. Nach 72 Stunden Inkubation bei 37°C wurde die Proliferation mit WST-I-Assay (Boehringer Mannheim) nach den Anleitungen des Herstellers untersucht. Die Hemmung der Proliferation in jeder Probe wurde nach der folgenden Formel berechnet: Hemmung (%) = (Durchschnittswert A450(Kontrolle) – A450(Probe)/Durchschnittswert A450(Kontrolle) × 100, wobei A₄₅₀ die Extinktion bei 450 nm gemessen in einem Multiskan MCC/340-Plattenlesegerät (Titertek, Huntsville, AL) ist und die Kontrolle einen nicht infizierten Zellüberstand bedeutet.
In-vivo-Erzeugung von Endostatin. Tierversuche wurden durchgeführt nach den vom National Institutes of Health Animal Care and Use Committee zugelassenen Protokollen. 8 Wochen alte weibliche Nacktmäuse (Charles River Laboratories) erhielten intravenös in die seitliche Schwanzvene 10⁹ oder 10¹⁰ pfu Ad-ss-mEndo oder keinen Virus in 100 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (n = 5 Tiere pro Gruppe) injiziert, um Dosisansprechvermögen und Toxizität zu untersuchen. Das Wohlbefinden der Tiere wurde 6 Tage lang überwacht und überlebende Mäuse wurden getötet und eine Autopsie durchgeführt. Um die Dauer und Menge der Endostatinexpression zu testen, wurden den Mäusen 10⁹ pfu Ad-ss-mEndo oder Ad-luc oder kein Virus injiziert, wie oben am Tag 0. An den Tagen 2, 4, 8 und 13 wurden Mäuse mit Kohlendioxid getötet und Blutproben durch Herzpunktion (n = 6 Tiere pro Behandlungsgruppe pro Zeitpunkt) erhalten. Die Proben wurden in EDTA-haltigen Röhrchen zentrifugiert (Microtainer, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) und die Plasma-Endostatinpegel wurden mit EIA bestimmt.
In-vivo-Aktivität von Endostatin. In einem Behandlungsversuch wurden Mäusen subcutan 106 MC38-Zellen in 200 ViL PBS injiziert. Zwei Tage später (Behandlungstag 0) und wieder 1 Woche später (Behandlungstag 7) erhielten die Mäuse 109 pfu Ad-ss-mEndo oder Ad-luc oder keinen Virus, wie oben beschrieben (n = 10 Tiere pro Behandlungsgruppe) injiziert. Die Tumoren wurden in zwei Dimensionen unter Verwendung von Schublehren an den Tagen 0, 2, 5, 7, 9, 11 und 13 gemessen von einem Forscher, der für die Behandlungsgruppen "blind" war. Das Tumorvolumen wurde gemäß der folgenden Formel berechnet: Volumen = Breite2 × Länge × 0,52.
Statistische Analyse. Die Daten werden angegeben als Mittelwert ± S. E. Vergleiche zwischen Gruppen wurden durchgeführt unter Verwendung des Mann-Whitney-U-Tests (Instat 2.01, GraphPad Software) und zweiseitige (two-tailed) p-Werte von weniger als 0,05 wurden als signifikant angesehen.
Wie oben angegeben, wurde das Maus-Endostatingen mit der vorangehenden E3/19K-Signalsequenz (14) in ein adenovirales Shuttle-Plasmid kloniert und rekombinantes Ad-ss-mEndo wurde erzeugt (8a). Die Infektion von 293-Zellen (in denen EI-deletierter Adenovirus replizieren kann) lieferten eine dosisabhängige Erhöhung der Endostatinkonzentrationen im Überstand, bis zu 920 ± 33 ng/ml bei einer MOI von 100 (8b). Ein Western Blot des Zellüberstands von mit Ad-ss-mEndo infizierten Zellen ergab eine einzige Bande mit einer Mobilität, die identisch war mit der von rekombinantem Maus-Endostatin (8c). Menschliche Melanomzellen (in denen EI-deletierter Adenovirus nicht replizieren kann) wurden dann mit Ad-ss-mEndo oder Ad-luc infiziert. Die Endostatinpegel im Überstand (9a) und die Fähigkeit der Überstandsproben, die Endothelzellproliferation zu hemmen (9b) wurden ausgewertet. Eine dosisabhängige Steigerung der Hemmung wurde beobachtet, bis zu 61 ± 4% (gegenüber 25 ± 4% im Überstand von mit Ad-luc infizierten Zellen, p = 0,0006).
Die Fähigkeit von Ad-ss-mEndo, Endostatin in vivo zu erzeugen, wurde dann untersucht. Mäuse, die 10⁹ pfu Ad-ss-mEndo erhalten hatten, zeigten 100% Überleben und erschienen gesund. Die Autopsie zeigte nur eine milde Hepatomegalie. Nachdem sie 10¹⁰ pfu erhalten hatten, starben 60% der Mäuse. Überlebende Mäuse waren bemerkenswert lethargisch und eine Autopsie zeigte eine massive Hepatomegalie mit erheblichen makronodularen Veränderungen und Gallenaszites. Andere Organe zeigten keine Zeichen von Toxizität. Diese Erkenntnisse stimmen überein mit der bekannten Hepatotoxizität von Adenovirus in hoher Dosis (15). Daher wurden zirkulierende Endostatinpegel untersucht nach einer Dosis von 10⁹ pfu (10). Die Plasma-Endostatinpegel der Grundlinie waren zu allen Zeitpunkten ähnlich zwischen mit Ad-luc und mit Kochsalzlösung behandelten Tieren (Mittelwert zu allen Zeitpunkten 55 ng/ml bzw. 57 ng/ml). Die Spitzenexpression nach Ad-ss-mEndo-Infektion wurde 4 Tage nach Injektion beobachtet, zu welchem Zeitpunkt die Plasmakonzentrationen 1770 ± 292 ng/ml waren (Bereich 1180 ng/ml bis 3137 ng/ml). Am Tag 13 blieben die Plasmapegel signifikant erhöht (18.739 ng/ml gegenüber 56 ± 12 ng/ml bei mit Ad-luc behandelten Tieren; p = 0,041). Die Spitzenwerte für den zirkulierenden Pegel, die erreicht wurden, waren 50- bis 200-fach höher als die, die vorher unter Verwendung von nichtviralen Vektoren berichtet wurden.
Um das Prinzip der systemischen statt tumorgerichteten antiangiogenen Gentherapie am besten auszuwerten, wurde eine Maus-Tumorzelllinie ausgewählt, die relativ resistent ist gegenüber adenoviraler Infektion und Genexpression. Während Maus-Hepatozyten leicht mit Ad-β-gal bei einer MOI von 100 (11a) infiziert wurden, zeigten nur einige MC38-Adenocarcinomazellen eine blaue Färbung (11b). Bei einem zweiwöchigen in-vivo-Behandlungsmodell wurden zwei wöchentliche Behandlungen gegeben basierend auf dem Zeitverlauf der oben dargestellten Endostatinexpression. Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Tumorgröße zwischen mit Ad-luc und mit Kochsalzlösung behandelten Tieren zu jedem Zeitpunkt (11c). Die mittlere Tumorgröße der mit Ad-ss-mEndo behandelten Tiere war kleiner als die jeder Kontrollgruppe vom Tag 5 an. Dieser Unterschied war am bemerkenswertesten am Schluss des Versuchs (Tag 13), zu welchem Zeitpunkt 40% Tumorwachstumshemmung im Vergleich zu mit Kochsalz behandelten Tieren beobachtet wurde (p = 0,012). Es wurde keine Toxizität bei irgendeinem der Tiere beobachtet.
Diese Untersuchung zeigt den ersten in-vivo-Report für eine Endostatin-Gentherapie unter Verwendung eines adenoviralen Vektors, da die Hemmung des Tumorwachstums, die mit hohen zirkulierenden Endostatinpegeln verbunden ist, in einem Tumormodell gezeigt wurde, das relativ resistent ist gegen einen tumorgerichteten Gentransfer.
Beispiel III
Arten der Verabreichung. Um die Pegel an zirkulierendem Endostatin zu optimieren, wurden vier Verabreichungswege eines adenoviralen Vektors, der das Maus-Endostatingen trug (Ad-Endo) verglichen. C57BL/6-Mäuse (n = 5 bis 6 pro Gruppe zu jedem Zeitpunkt) wurden mit 10⁹ Plaque bildenden Einheiten von Ad-Endo oder einem Kontrolladenovirus durch intravenöse (IV), intraperitoneale (IP), Intramilz-(IS über Laparotomie) oder intranasale (IN) Verabreichung behandelt. Die Plasma-Endostatinpegel wurden unter Verwendung eines kompetitiven Immunoassays 2, 4, 8 und 12 Tage nach Injektion bestimmt. Basisplasmapegel in Kontrollmäusen waren ähnlich bei allen Verabreichungswegen (Durchschnittswert 47 ng/ml). IV-Virus lieferte die höchsten Endostatinpegel (> 2000 ng/ml), die signifikant erhöht blieben bis zum Tag 12 (321 gegenüber 48 ng/ml, p = 0,002, Mann-Whitney-U-Test) (12). IS-Injektion lieferte Endostatinpegel, die höher waren als die Kontrolle, aber geringer als die, die mit IV-Injektion erzielt wurden. IP- und IN-Injektion hatten minimale oder keine Wirkung auf die Endostatinpegel. Daher kann ein rekombinanter Adenovirus, der ein Maus-Endostatintransgen trägt, anhaltend zu potenziell therapeutischen zirkulierenden Pegeln an Endostatin bei Mäusen führen, wobei die höchsten Pegel nach IV-Verabreichung auftreten.
Beispiel IV
Retrovirale Transduktion von neoplastischen Maus-Hepatozyten mit Endostatin. Die neoplastische Maus-Hepatozytenzelllinie, NmuLi wurde mit dem Maus-Endostatingen transduziert, um die Fähigkeit eines antiangiogenen Gentransfers zur Hemmung des Tumorwachstums zu testen. Für die Replikation inkompetente Retroviren wurden erzeugt unter Verwendung des pEF-null-Plasmids. Das Endostatingen wurde aus Mausleber kloniert und in pEF-null kloniert, um pEF-Endo zu erzeugen. NmuLi-Zellen wurden mit pEF-null oder von pEF-Endo abgeleitetem Retrovirus transduziert und in G418 selektiert. Vier Endostatin-transduzierte Klone wurden amplifiziert und das Endostatin im Überstand mit Western Blot und kompetitivem Enzymimmunoassay getestet. Athymische Nacktmäuse (n = 8 pro Gruppe) erhielten S. Q. mit 5 × 10⁵ NmuLi-Zellen, pEF-null-transduzierte Zellen (NEF-null) oder Klone, die variable Mengen an Endostatin exprimierten (NEF-Endo 1 bis 4) injiziert. Die Tumorvolumina wurden berechnet mit der Formel v = w² × 1 × π/6. NEF-Endo-Klone lieferten Endostatinpegel im Überstand von bis zu 223 ng/ml (gegenüber 20 ng/ml in NEF-null-Überstand) (13). 26 Tage nach der Injektion waren die NEF-null-Tumoren signifikant größer als Tumoren, die aus NEF-Endo-Klonen stammten (p < 0/0001, Kruskal-Wallis-Test). Die retrovirale Transduktion von neoplastischen Maus-Hepatozyten mit dem Endostatingen führt zur Sekretion von funktionellem Endostatin, das ausreichend aktiv ist, um das Tumorwachstum zu hemmen.
Literaturstellen

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verbindung enthaltend eine rekombinante Nukleinsäure, die ein antiangiogenes Protein kodiert, das operativ mit einer Adenovirus-E3/19K-Signalsequenz verbunden ist, die in eine virale Nukleinsäure insertiert ist, wobei die rekombinante Nukleinsäure in ein Viruspartikel verpackt sein kann und wobei die Expression der rekombinanten Nukleinsäure, die das antiangiogene Protein kodiert, zur Produktion des antiangiogenen Proteins führt.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei die virale Nukleinsäure eine Adenovirus-Nukleinsäure enthält.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei die virale Nukleinsäure eine retrovirale Nukleinsäure enthält.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei das antiangiogene Protein Endostatin enthält.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei das antiangiogene Protein Thrombospondin enthält.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei das antiangiogene Protein EMAP-II enthält.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei das antiangiogene Protein IP-10 enthält.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei das antiangiogene Protein Angiostatin enthält.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei das antiangiogene Protein Vasostatin enthält.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei das antiangiogene Protein Vaskulostatin enthält.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei das antiangiogene Protein IL-12 enthält.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei das antiangiogene Protein Thrombozytenfaktor 4 enthält.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei das antiangiogene Protein Spaltprodukte von Kollagen VIII enthält.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei das antiangiogene Protein Spaltprodukte von Kollagen XV enthält.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei das antiangiogene Protein Restatin enthält.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei die rekombinante Nukleinsäure replikationsdefizient ist.
Verbindung nach Anspruch 3, wobei die rekombinante Nukleinsäure replikationsdefizient ist.
Adenovirus enthaltend die Verbindung von Anspruch 2.
Retrovirus enthaltend die Verbindung von Anspruch 3.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Signalsequenz eine Aminosäuresequenz kodiert, die die Aminosäuresequenz MRYMILGLLALAAVCSAA enthält.
Verwendung eines viralen Vektors, der eine rekombinante Nukleinsäure enthält, die ein antiangiogenes Protein kodiert, das operativ mit einer adenoviralen E3/19K-Signalsequenz verbunden ist, um eine Formulierung für die systemische Verabreichung eines antiangiogenen Proteins an ein Individuum herzustellen.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei der virale Vektor ein adenoviraler Vektor ist.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei der virale Vektor ein retroviraler Vektor ist.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei das antiangiogene Protein Endostatin enthält.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei die Signalsequenz eine Aminosäuresequenz kodiert, die die Aminosäuresequenz MRYMILGLLALAAVCSAA enthält.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei die Formulierung für die intravenöse Verabreichung vorgesehen ist.
Verwendung eines viralen Vektors, der eine rekombinante Nukleinsäure enthält, die ein antiangiogenes Protein kodiert, das operativ mit einer Adenovirus-E3/19K-Signalsequenz verbunden ist, zur Herstellung einer Formulierung zur systemischen Verabreichung, um bei einem Individuum einen Tumor zu behandeln.
Verwendung nach Anspruch 27, wobei der virale Vektor ein adenoviraler Vektor ist.
Verwendung nach Anspruch 27, wobei der virale Vektor ein retrovirale Vektor ist.
Verwendung nach Anspruch 27, wobei das antiangiogene Protein Endostatin enthält.
Verwendung nach Anspruch 27, wobei die Sequenz eine Aminosäuresequenz kodiert, die die Aminosäuresequnez MRYMILGLLALAAVCSAA enthält.
Verwendung nach Anspruch 29, wobei die Formulierung zur intravenösen Abgabe vorgesehen ist.