DE60215626T2

DE60215626T2 - Antagonist für die multimerisierung von hiv-1 vif-protein

Info

Publication number: DE60215626T2
Application number: DE60215626T
Authority: DE
Inventors: Hui Philadelphia ZHANG; Roger Chalfont POMERANTZ; Bin Bala Cynwyd YANG
Original assignee: Thomas Jefferson University
Current assignee: Thomas Jefferson University
Priority date: 2001-04-06
Filing date: 2002-04-08
Publication date: 2007-08-30
Anticipated expiration: 2022-04-09
Also published as: CA2442909C; EP1373308B1; AU2002307229B2; US20080167199A1; CA2442909A1; US6653443B2; ATE343591T1; US20040146522A1; US7498138B2; US20040086512A1; JP4234999B2; US20030013844A1; US7226741B2; WO2002081504A2; WO2002081504A3; JP2005516885A; DE60215626D1; EP1373308A2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf die Gebiete der Molekularbiologie und der Virologie und auf die Verwendung von Verbindungen bei der Zubereitung eines Medikaments zur Behandlung von Individuen, die dem humanen Immunschwächevirus Typ 1 (HIV-1) ausgesetzt oder mit diesem infiziert wurden, und insbesondere auf Zusammensetzungen, die die replikativen und andere essenzielle Funktionen des HIV-1-Virus-Infektiositäts-Faktor-Proteins (Vif) durch das interaktive Blockieren der Vif-Multimerisations-Domäne inhibieren oder verhindern.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Ein Ansatz zur Behandlung von Individuen, die mit HIV-1 infiziert sind, besteht darin, solchen Individuen Verbindungen zu verabreichen, die direkt mit dem Mechanismus, durch den sich das HIV-1 in menschlichen Zellen repliziert, intervenieren und ihn stören. Lentiviren wie HIV-1 codieren eine Anzahl von akzessorischen Genen zusätzlich zu den strukturellen gag-, pol- und env-Genen, die von allen replikationskompetenten Retroviren exprimiert werden. Eines dieser akzessorischen Gene, vif (Virus-Infektiositäts-Faktor), wird von allen bekannten Lentiviren außer dem equinen infektiösen Anämie-Virus exprimiert. Das Vif-Protein des HIV-1 ist ein hoch basisches 23-kDa-Protein, das aus 192 Aminosäuren zusammengesetzt ist. Aus der Sequenzanalyse der viralen DNA von mit HIV-1 infizierten Individuen hat sich ergeben, dass der offene Leserahmen des Vif intakt bleibt. (Sova, P., et al., J. Virol. 69: 2557-2564,1995; Wieland, U., et al., Virology 203: 43-51, 1994; Wieland, U., et al., J. Gen. Virol. 78: 393-400, 1997). Die Deletion des vif-Gens senkt die Replikation des Affen-Immundefektvirus (SIV) bei Makaken und die HIV-1-Replikation bei SCID-hu-Mäusen dramatisch (Aldrovandi, G.M. und Zack, J.A., J. Virol. 70: 1505-1511, 1996; Desrosiers, R.C., et al., J. Virol. 72: 1431-1437, 1998), was darauf hinweist, dass das vif-Gen für die pathogene Replikation von Lentiviren in vivo essenziell ist.
In Zellkultursystemen ist das an vif mangelnde (vif^–) HIV-1 nicht dazu im Stande, in gewissen Zellen, wie etwa H9-T-Zellen, peripheren mononukleären Blutzellen und von Monozyten hergeleiteten Makrophagen Infektion zu etablieren. Dies hat dazu geführt, dass diese Zellen als nicht permissiv klassifiziert wurden. Bei manchen Zellen, wie etwa C8166-, Jurkat-, SupT1- und HeLa-T4-Zellen, ist das vif-Gen nicht erforderlich; diese Zellen wurden als permissiv klassifiziert. (Gabuzda, D.H., et al., J. Virol. 66(11): 6489-6495, 1992; von Schwedler, U., et al., J. Virol. 67(8): 4945-4955, 1993; Gabuzda, D.H., et al., J. AIDS7(9): 908-915, 1994).
Da Vif von nicht permissiven, aber nicht von permissiven Zellen zur HIV-1-Replikation erforderlich ist, sind zwei Möglichkeiten vorhanden. In permissiven Zellen kann ein zelluläres Vif-Homolog vorhanden sein, das die Vif-Funktion in den Virus produzierenden Zellen ersetzen kann; als Alternative dazu kann/können in nicht permissiven Zellen ein Inhibitor/Inhibitoren viraler Replikation vorhanden sein, der voraussetzt/die voraussetzen, dass das Vif seiner/ihrer Wirkung entgegenwirkt. (Trono, D., Cell82: 189-192, 1995). Vor kurzem wurde vorgeschlagen, dass das Vif-Protein zur Gegenwirkung eines unbekannten endogenen Inhibitors/unbekannter endogener Inhibitoren in den Virus produzierenden Zellen erforderlich ist. (Madani, N., und Kabat, D., J. Virol. 72: 10251-10255, 1998; Simon, J. N., et al., Nat. Med. 4: 1397-1400, 1998). Das HIV-1-Vif kann die Funktion von HIV-1-Vif und SIV_AGM-Vif in humanen nicht permissiven Zellen komplementieren, wohingegen es die Funktion von HIV-1- und SIV_AGM-Vif in Affenzellen nicht komplementieren kann. SIV_AGM Vif kann jedoch die Funktion von HIV-1-Vif und SIV_AGM-Vif in Affenzellen komplementieren, nicht aber die Funktion von HIV-1- und SIV_AGM-Vif in menschlichen Zellen, was darauf hinweist, dass ein zellulärer Cofaktor/zelluläre Cofaktoren an der Wirkung des Vif-Proteins involviert ist/sind. (Simon, J. N., et al., EMBO J. 17: 1259-1267, 1998). Im Gegensatz dazu kann, da eine Vif-Mutante (Vif von HIV-1_F12) die Replikation von Wildtyp-HIV-1 in permissiven Zellen inhibieren kann, in den permissiven Zellen ein Vif-Homolog vorhanden sein. (D'Aloja, P., et al., J. Virol. 72: 4308-4319, 1998).
Es wurde vorgeschlagen, dass Vif in den Virus produzierenden Zellen oder den zellfreien Virionen funktioniert und den viralen Zusammenbau beeinträchtigt. (Blanc, D., et al., Virology 193: 186-192, 1993; Gabuzda, D. H., et al., J. Virol. 66: 6489-6495, 1992; von Schwedler, U., et al., J. Virol. 67: 4945-4955, 1993). Defekte des vif-Gens haben keine erfassbaren Auswirkungen auf die virale Transkription und Translation oder auf die Virion-Produktion. HIV-1-Abarten mit einem defekten vif-Gen können an Zielzellen binden und diese durchdringen, können aber die intrazelluläre reverse Transkription und die endogene reverse Transkription (ERT) in zellfreien Virionen nicht vervollständigen. (Courcoul, M., et al., J. Virol. 69: 2068-2074, 1995; Goncalves, J., et al., J. Virol. 70: 8701-8709, 1996; Sova, P., und Volsky, D. J., J. Virol. 67: 6322-6326, 1993; von Schwedler, U., et al., J. Virol. 67: 4945-4955, 1993). Wenn die ERT durch das Hinzufügen von Desoxyribonucleosidtriphosphaten (dNTP) in hohen Konzentrationen angetrieben wird, können gewisse Grade an viralen Plus-Strang-DNA vervollständigt werden. Des Weiteren können, wenn vif^–-Viren, die aus nicht permissiven Zellen erzeugt wurden und größere Mengen an durch die ERT erzeugter viraler DNA beherbergen, permissive Zellen infizieren dürfen, sie den Block an der intrazellulären reversen Transkription, den vif^–-Viren ohne eine Desoxyribonucleosidtriphosphat-Behandlung nicht durchlaufen können, teilweise umgehen. Infolgedessen kann die Virus-Infektiosität teilweise aus dem vif^–-Phänotypen gerettet werden. (Dornadula, G., et al., J. Virol. 74: 2594-2602, 2000).
Die Expression von viralen Komponenten, einschließlich viraler Proteine und Nukleinsäuren, ändert sich in den aus nichtpremissiven Zellen produzierten Virionen nicht. (Fouchier, R. A., et al., J. Virol. 70: 8263-8269, 1996; Gabuzda, D. H., et al., J. Virol. 66: 6489-6495, 1992; von Schwedler, U., et al., J. Virol. 67: 4945-4955, 1993).
Die Deletion des vif-Gens resultiert jedoch in Änderungen der Morphologie des Virions. (Borman, A. M., et al., J. Virol. 69: 2058-2067, 1995; Bouyac, M., et al., J. Virol. 71: 2473-2477, 1997; Hoglund, S., et al., Virology 201: 349-355, 1994). Die Menge an Vif-Protein in den HIV-1-Virionen, die aus chronisch infizierten Zellen erzeugt werden, beträgt ungefähr 7 bis 28 Moleküle pro Virion. (Camaur, D., und Trono, D., J. Virol. 70: 6106-6111, 1996; Fouchier, R. A., et al., J. Virol. 70: 8263-8269, 1996; Simon, J. N., et al., Virology 248: 182-187, 1998). Da die mit dem Virion assoziierten Vif-Proteine nicht von der Expression viraler Komponenten und der Menge an Vif in den Virus produzierenden Zellen abhängt, scheint es, dass Vif-Proteine nicht spezifisch in die Virionen inkorporiert sind. (Camaur, D., und Trono, D., J. Virol. 70: 6106-6111, 1996; Simon, J. H., et al., Virology 248: 182-187, 1998).
Obgleich es so scheint, dass Vif nicht spezifisch in Virionen inkorporiert ist, ist Vif dazu im Stande, durch seinen positiv geladenen, mit Aminosäuren angereicherten C-Terminus an die NCp7-Domäne von p55-Gag-Präkursoren zu binden. (Bouyac, M., et al., J. Virol. 71: 9358-9365, 1997; Huvent, I., et al., J. Gen. Virol. 79: 1069-1081, 1998). Es hat sich herausgestellt, dass das Vif-Protein mit Gag-Präkursoren in dem Zytoplasma von mit HIV-1 infizierten Zellen colokalisiert. (Simon, J. H., et al., J. Virol. 71: 5259-5267, 1997). Das Molverhältnis von Vif zu Gag-Präkursoren in infizierten Zellen beträgt 1:1,7, was nahelegt, dass Vif eher eine strukturelle als eine steuernde Rolle in Virus produzierenden Zellen spielt. (Goncalves, J.; et al., J. Virol. 68: 704-712, 1994; Simon, J. N., et al., Virology 248: 182-187, 1998).
Es hat sich gezeigt, dass Vif ein RNA bindendes Protein und eine integrale Komponente eines Boten-Ribonukleoprotein-Komplexes (mRNP-Komplex) viraler RNA in dem Zytoplasma von mit HIV-1 infizierten Zellen ist. Die Expression von Vif in infizierten Zellen ist ziemlich hoch und der Hauptanteil von Vif in Virus produzierenden Zellen liegt in der zytoplasmatischen Fraktion; einiges davon ist mit der zellulären Membran assoziiert. Das Vif-Protein in diesem mRNP-Komplex kann die virale RNA vor verschiedenen endogenen Inhibitoren schützen und könnte die Interaktion der viralen RNA mit den HIV-1-Gag-Präkursoren vermitteln und könnte somit mit dem Falten und Verpacken der genomischen RNA involviert sein. So spielt die Wechselwirkung zwischen dem Vif und der HIV-1-RNA eine wichtige Rolle in den späteren Ereignissen des HIV-1-Lebenszyklus.
In Anbetracht der direkten oder indirekten Beteiligung des Vif-Proteins an dem viralen Zusammenbauprozess ist es ein ideales Ziel für die Anti-HIV-1-Therapeutik.
Es hat sich gezeigt, dass viele HIV-1-Proteine, einschließlich Gag, Protease, reverse Transkriptase, Integrase, Glykoprotein 41 (gp41), Tat, Rev, Vpr und Nef, in vitro und in vivo Dimere oder Multimere bilden. Es hat sich erwiesen, dass die Bildung von Dimeren oder Multimeren für ihre Funktionen in dem lentiviralen Lebenszyklus wichtig ist. (Frankel, A. D. und Young, J. A., Ann. Rev. Biochem. 67: 1-25, 1998; Vaishnav, Y. N. und Wong-Staal, F., Annu Rev Biochem 60: 577-630, 1991; Zhao, L. J., et al., J Biol Chem 269(51): 32131-32137, 1994; Liu, L., et al., J.Virol. 74: 5310-5319, 2000). Die vorliegende Erfindung liefert Anzeichen dafür, dass das Vif-Protein eine starke Neigung zur Selbstassoziation besitzt und dass die Multimerisation des Vif-Proteins für die Vif-Funktion in dem viralen Lebenszyklus wichtig ist. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines ein PXP-Motiv enthaltendes Peptids, das die Aminosäuresequenz SEQ ID NR. 11 beinhaltet, bei der Zubereitung eines Medikaments zur Behandlung von Individuen, die HIV-1 ausgesetzt oder mit ihm infiziert wurden, indem eine Zusammensetzung verabreicht wird, welche die replikativen oder andere essenzielle Funktionen von Vif inhibiert oder verhindert, indem sie an die Multimerisationsdomäne des Vif bindet oder sich anderweitig mit ihr assoziiert, wodurch die Multimerisation von Vif und infolgedessen die HIV-1-Replikation verhindert wird.
Die europäische Patentanmeldung EP 0330359 offenbart die ein PXP-Motiv enthaltenden Peptide AALITPKKIKPPLPS und PPLPSVTKLTEDRWN zur Verwendung bei der Behandlung der Infizierung mit HIV-1.
ABKÜRZUNGEN

„HIV-1" bedeutet „humanes Immunschwäche Virus Typ I".
„Vif" bedeutet „Virion-Infektiosität-Faktor".
„GST" bedeutet „"Glutathion-S-Transferase".
„CAT" bedeutet „Chloramphenicol-Acetyltransferase".
„IP" bedeutet „Immunpräzipitation".
„WB" bedeutet „Western Blotting".

BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Alle Figuren dienen lediglich zu Darstellungszwecken.
1. Vif-Selbstassoziation in einem zellfreien System

A. Ein Autoradiogramm, das darstellt, dass das GST-Vif (Bahn 2), aber nicht die GST (Bahn 3) an das in vitro translatierte ³⁵S-markierte HIV-1_NL4-3-Vif-Protein binden kann. ³⁵S-markierte HIV-1_NL4-3-Vif-Proteine durften an GST-Vif konjugierte Perlen binden. Nach dem Binden wurde das mit den Perlen assoziierte ³⁵S-markierte Vif über SDS-PAGE und direkte Autoradiographie analysiert.
B. Ein Autoradiogramm, das zeigt, dass unter nativen oder relativ nativen Bedingungen ³⁵S-markierte HIV-1_NL4-3-Vif-Proteine Monomere, Dimere, Trimere oder Tetramere bilden. In vitro translatierte ³⁵S-markierte HIV-1_NL4-3-Vif-Proteine wurden mit nativem Auftragspuffer [62,5 mM Tris-HCl (pH-Wert 6,8) und 20 Glycerol] plus SDS mit verschiedenen Konzentrationen direkt auf ein 4-20% Tris-HCl-Gel (SDS-frei) geladen. Eine Elektrophorese wurde mit einem 0,05% SDS enthaltenden Tris-Glycin-Laufpuffer durchgeführt, gefolgt von einer Autoradiographie.

2. Die Auswirkung von Vif-Mutanten auf Vif-Vif-Wechselwirkungen

A. Eine schematische Darstellung, die eine Reihe von Deletionen entlang dem Vif-Protein zeigt, die unter Verwendung einer auf PCR basierten Mutagenese und einer In-vitro-Translation erzeugt wurden. Das in vitro translatierte ³⁵S-markierte HIV-1_NL4-3-Vif-Protein und seine Mutanten durften an das GST-Vif, das auf Agarose-Perlen konjugiert wurde, binden. Das mit den Perlen assoziierte ³⁵S-markierte Vif-Protein und seine Mutanten wurden einer SDS-PAGE unterzogen und durch direkte Autoradiographie visualisiert. Das Verhältnis des gebundenen Vif zu der Eingabe wurde unter Verwendung des Verhältnisses des GST-Vif gebundenen ³⁵S-markierten Wildtyp-Vif-Proteins zu der ³⁵S-markierten Wildtyp-Vif-Eingabe als 100% (mit Standard-Abweichungen) berechnet. Die Werte wurden durch (Quantifizierung mit Densitometrie der Autoradiographie erhalten. In den meisten Fällen spiegeln die Daten zumindest fünf unabhängige Experimente wider.
B. Ein Autoradiogramm, das darstellt, dass in der Anwesenheit von 0,1% SDS die ³⁵S-markierten HIV-1_NL4-3-Vif-Protein-Mutanten Δ151-192 und Δ151-164 keine Multimere bilden können, während andere Mutanten dazu im Stande sind. In vitro translatierte ³⁵S-markierte HIV-1_NL4-3-Vif-Proteine und ihre Mutanten (50 000 cpm Impuls für jeden) wurden direkt mit einem Auftragspuffer [62,5 mM Tris-HCl (pH-Wert 6,8) und 20 Glycerol] plus 0,1% SDS auf ein 4-20% Tris-HCl Gel (SDS-frei) geladen. Eine Elektrophorese wurde mit einem 0,05% SDS enthaltenden Tris-Glycin-Laufpuffer durchgeführt, gefolgt von einer Autoradiographie.

3. Ko-Immunpräzipitationsverfahren zur Studie von Vif-Vif-Wechselwirkungen innerhalb von Zellen
Western Blots (obere zwei Tafeln) zeigen, dass die Expression des Vif-Proteins, das an seinem C-Terminus in transfizierten COS-1-Zellen mit einem c-Myc-Tag oder einem Flag-Epitop-Tag versehen ist, unter Verwendung des polyklonalen A14-Anti-c-Myc-Antikörpers beziehungsweise monoklonalen M2-Anti-Flag-Antikörpers erfasst werden können. COS-1-Zellen wurde mit Vektoren transfiziert, die ein mit Flag- oder c-Myc-Tags versehenes Vif beherbergt. Nach 54 Stunden Inkubation bei 5% CO₂, 37°C, wurden 20 μg totale Zelllysate mittels 15% Tris-HCl-Gel aufgelöst. Ein dritter Western Blot stellt dar, dass das mit einem Flag-Tag versehene Vif mit dem mit einem Myc-Tag versehenen Vif ko-präzipitiert wurde, wenn die Zelllysate mit polyklonalen A14-Anti-c-Myc-Antikörpern immunpräzipitiert wurden. Zur Ko-Immunpräzipitation wurden die gesamten Zelllysate aus demselben Ansatz einer Immunpräzipitation mit einem polyklonalen A14-Anti-c-Myc-Antikörper unterzogen. Die Immunpräzipitate werden am 15% Tris-HCl-Gel aufgelöst und auf eine Membran transferiert und dann unter Verwendung eines M2-Anti-Flag-Antikörpers erfasst.
4. Säugetier-Zwei-Hybrid-System zur Studie von Vif-Vif-Wechselwirkungen

A. Eine schematische Abbildung, die die in den Experimenten benutzten Plasmide zeigt: pVif-VP, pGAL-Vif und pSG5GaIVP.
B. Ein Gel, das die CAT-Aktivität von COS-1-Zellen, die mit mit verschiedenen Vektoren kombinierten Plasmiden transfiziert sind, darstellt. Nach 48 Stunden wurden die Zelllysate geerntet und CAT-Analysen unterzogen.

5. Virus-Infektiosität, die durch Vif oder Vif-Mutanten betroffen ist
Ein Diagramm, das die CAT-Aktivität der HelaCD4-CAT-Zellen, die mit rekombinanten Viren infiziert sind, bildlich darstellt. Die pCI-Neo-Konstruktionen, die das Wildtyp-vif-Gen oder seine Mutanten, pNL4-3ΔenvΔvif-Plasmid und pMD.G (das VSV env enthält) enthalten, wurden in H9-Zellen kotransfiziert, um die Pseudotyp-Viruspartikel zu erzeugen. Nach der Konzentration über die Ultrazentrifuge wurden die viralen Partikel durch das HIV-1-p24-Antigen normalisiert. In der Anwesenheit von Polybren (8 μg/ml) wurden die Viren verwendet, um HelaCD4-CAT-Zellen zu infizieren. Nach 48 Stunden wurden die Zelllysate gesammelt und CAT-Analysen unterzogen. Bahn 1) pNL4-3; Bahn 2) pNL4-3ΔenvΔvif, VSV env plus Wildtyp-vif Bahn 3) pNL4-3ΔenvΔvif, VSV env, plus vifΔ 151-164; Bahn 4) pNL4-3ΔenvΔvif, VSV env, plus vifΔ 144-150; Bahn 5) pNL4-3ΔenvΔvif, VSV env, plus nur pCI-Neo-Vektor. Der Wert der Wildtyp-vif-Komplementierung wurde als 100% gesetzt. Die relativen Werte der anderen Proben wurden demgemäß berechnet. Die Figur stellt drei unabhängige Experimente dar. Die Werte sind Mittelwerte ± Standard-Abweichungen.
6. Der Vergleich der relativen Affinität zwischen den ein PXP-Motiv enthaltenden Peptiden
Das GST-Vif-Protein, die Vif-Mutante (Deletion von Aminosäuren 151-192) und nur die GST wurden auf die Platte gegeben. Die Phagen-Klone, die durch die Vif enthaltende Säule isoliert wurden, wurden seriell verdünnt und zugegeben. Nach der Inkubation, um das Phage-Vif-Binden zu ermöglichen, wurden die überschüssigen Phagen weggewaschen. Der mit HRP konjugierte Anti-M13-Phagen-Antikörper wurde zugegeben, um die Phagen, die durch das Vif eingefangen worden waren, zu binden. Nach dem Waschen wurde das Substrat zugegeben und es wurde eine Farbentwicklung ermöglicht. Die durch das Vif eingefangenen Phagen wurden halbquantifiziert. OD bei 405 nm gleich oder größer als 0,15 wurde als positiv angesehen. Die Phagen-Probennummer (VMI) war dieselbe wie in Tabelle 1 gezeigt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das Vif-Protein des HIV-1 ist für die virale Replikation in vivo und die produktive Infektion der peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC), Makrophagen und H9-T-Zellen essenziell. Der molekulare Mechanismus/die molekularen Mechanismen von Vif bleiben unbekannt und muss/müssen weiter bestimmt werden. Die vorliegende Erfindung veranschaulicht, dass Vif-Proteine, wie viele andere Proteine, die von dem HIV-1 codiert sind, eine starke Neigung zur Selbstassoziation aufweisen. Unter relativ nativen Bedingungen bilden die Vif-Proteine Multimere in vitro, einschließlich Dimeren, Trimeren oder Tetrameren. In vivo bindende Assays, wie etwa Ko-Immunpräzipitation und ein Säugetier-Zwei-Hybrid-System, veranschaulichen, dass Vif-Proteine innerhalb einer Zelle miteinander wechselwirken, was darauf hinweist, dass die Multimerisation von Vif-Proteinen nicht nur auf zufällige Aggregation zurückzuführen ist.
Die vorliegende Erfindung liefert weitere Anzeichen, dass die Domäne, die die Vif-Selbstassoziation beeinflusst, an dem C-Terminus dieses Proteins befindlich ist, besonders in der Prolin angereicherten 151-164-Region. Die Sequenz dieser Domäne ist AALIKPKQIKPPLP (SEQ ID NR. 1). Studien veranschaulichen, dass eine Vif-Mutante mit einer Deletion an den Aminosäurenpositionen 151-164 nicht dazu im Stande ist, die Infektiosität von vif-defekten Viren, die aus H9-T-Zellen erzeugt wurden, zu retten, was impliziert, dass die Multimerisation von Vif-Proteinen für die Vif-Funktion in dem viralen Lebenszyklus wichtig ist.
Verfahren
Plasmidkonstruktionen
Mit dem infektiösen Klon pNL4-3 als Vorlage wurden die Deletionsmutanten von HIV-1-Vif durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vermittelte und ortsgerichtete Mutagenese erzeugt. (Zhang, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(22): 12519-12524, 1996). Das PCR erzeugte Wildtyp-vif-Gen und seine Mutanten wurden in einen pCITE- 4a-Vektor (Novagen, Madison, WI) zur in-vitro-Translation eingeführt. Das vif-Gen wurde auch in den pGEX-Vektor zur in-vitro-Expression und -Isolation des GST-Vif-Fusionsproteins eingeführt. Zur Studie der intrazellulären Vif-Vif-Wechselwirkung wurden vif-Gene über PCR mit Tag-Sequenzen, die das Flag-Epitop (DYKDDDDK) (SEQ ID NR. 2) bzw. c-Myc-Epitop (EQKLISEEDL) (SEQ ID NR. 3) codieren, an dem 3'-Terminus versehen. Diese mit einem Tag versehenen vif-Gene wurden dann in den Vektor pCI-Neo eingeführt, der unmittelbar stromabwärts des CMV-Enhancers und umgehenden frühen Promotors (Promega, Madison, WI) ein chimäres Intron enthält. Die resultierenden Plasmide wurden pCI-vif-c-myc bzw. pCI-vif-flag genannt. Zur Säugetier-Zwei-Hybrid-Analyse wurde entweder pGal-Vif oder pGal-VifΔ151-164 konstruiert, indem das Hind-III-BamH-1-Fragment (das das vp-Gen enthält) von pSG5GaIVP mit einem PCR verstärkten vollständigen vif-Gen oder seiner Mutante Δ151-164 ersetzt wurde. Das pVif-VP oder pVifΔ151-164-VP wurde konstruiert, indem das EcoRI-BgIII Fragment (das das gal4-Gen enthält) von pSG5GaIVP mit einem PCR verstärkten vollständigen vif-Gen bzw. seiner Mutante Δ151-164 ersetzt wurde. (Shimano, R., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm 242(2): 313-316, 1998). Die Integrität aller Konstruktionen wurde durch die DNA-Sequenzierung bestätigt.
Proteinexpression und in-vitro bindende Assays
Der Vektor pGEX, mit oder ohne das vif-Gen, wurde in BL21-kompetente Zellen transformiert (Novagen, Madison, WI). Nach dem Züchten bei 37°C auf ungefähr 0,6 OD, wurde die Expression von GST- oder GST-Vif-Proteinen durch 0,4 mM Isopropylthio-β-D-Galactosid (IPTG) induziert. Die bakteriellen Zellen wurden lysiert, indem ein Lysis-Puffer (1% Triton-X-100, 0,1 mg/ml Lysozym, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 2 ug/ml Leupeptin und 1 μg/ml Aprotinin), gefolgt von Sonikation, hinzugegeben wurde. Die Probe wurde bei 4°C 10 Minuten lang bei 12 000 g pelletiert und die überstehende Flüssigkeit wurde auf eine Säule von mit Glutathion konjugierten Agaroseperlen (Sigma, St. Louis, MO) aufgetragen. Nach dem Batch-Binding wurde die Matrix dreimal gewaschen, jedes Mal durch das Hinzufügen von 10 Bettvolumen Phosphor gepufferter Salzlösung (PBS). Die mit GST oder GST-Vif konjugierten Agaroseperlen wurden dann aliquotiert und bei –20°C gelagert. Umgekehrt wurden die ³⁵S-markierten Vif- oder ihre mutanten Proteine unter Benutzung von SPT3-Kits (Novagen, Madison, WI) synthetisiert. Es wurde das von dem Hersteller gelieferte Protokoll befolgt. Nach der In-vitro-Translation wurde RNase A (0,2 mg/ml) hinzugefügt, um die Reaktion einzustellen und die tRNAs und die in vitro transkribierte mRNA zu entfernen. Die in Trichloressigsäure (TCA) unlöslichen radioaktiven Aminosäuren wurden in der Anwesenheit eines Szintillationscocktails quantisiert.
Für GST-Pulldown-Assays wurde eine mit GST oder GST-Vif konjugierte Perlen-Aufschwemmung mit dem ³⁵S-markierten Vif oder seinen Mutanten (50 000 cpm) in einem Bindungspuffer [150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 0,1% Triton-X-100] gemischt. Nach dem Binden über 1 Stunde bei 4°C wurde die Mischung 1 Minute lang bei 3 000 g zentrifugiert, und die Perlen wurden dreimal mit dem Bindungspuffer gewaschen. Die ³⁵S-markierten Vif-Proteine wurden durch das Hinzufügen eines SDS enthaltenden Auftragspuffers und das Erhitzen über 5 Minuten bei 95°C von den Perlen dissoziiert. Dann wurden die Proben in SDS-PAGE-Gelen elektrophoresiert (15% Tris-HCl-Ready-Gel, hergestellt von Bio-Rad, Hercules, CA). Nach der Behandlung mit dem Fixierpuffer (10 Essigsäure, 10% Methanol) und dann dem Amplify (Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ) wurden die Gele getrocknet und Röntgenfilm ausgesetzt oder unter Benutzung eines Phosphorbilds (Molecular Dynamics, Sunnyview, CA) quantitativ analysiert.
Ein Vif-Vif-Bindungsassay ähnelte den GST-Pulldown-Assays, mit der Ausnahme, dass die mit GST oder GST-Vif konjugierte Perlen-Aufschwemmung mit ³⁵S-markiertem Vif und den Testpeptiden oder – molekülen in dem Bindungspuffer gemischt wurde. Die Ergebnisse wurden mit jenen von dem GST-Pulldown-Assay verglichen, der als 100% bezeichnet wurde.
Des Weiteren wurde das in vitro translatierte ³⁵S-markierte Vif (50 000 cpm) ebenfalls über einen 10% Glycerol enthaltenden Auftragspuffer, mit SDS in verschiedenen Konzentrationen, direkt auf ein 4-20 Tris-Glycin-Gel (SDS-frei) geladen und mit einem SDS-freien Tris-Glycin-Laufpuffer elektrophoresiert: Nach dem Fixieren und Trocknen wurde das Gel direkt einer Autoradiographie unterzogen.
Western Blotting und Ko-Immunpräzipitation
Die COS-1- oder 293T-Zellen wurden unter Verwendung des Kalziumphosphat-Präzipitationsverfahrens mit 5 μg pCI-vif-c-myc und pCI-vif-Flag transfiziert. (Zhang, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(22): 12519-12524, 1996; Zhang, H., et al., J. Virol. 69(6): 3929-3932, 1995). Nach 48 Stunden wurden die Zellen in einem Zell-Lysis-Puffer [150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 5 mM EDTA, 1 Triton-X-100, 10% Glycerol, 1 mM PMSF, 2 μg/ml Aprotinin, 2 μg/ml Leupeptin und 2 μg/ml Pepstatin A] lysiert. Zum direkten Western Blotting wurden die gesamten Zelllysate mit Aceton gemischt (1:3).
Die Mischung wurde auf Eis 20 Minuten lang inkubiert, gefolgt von einer Zentrifugation bei 12 000 g über 10 Minuten. Dann wurden die Pellets an der Luft getrocknet und in dem SDS enthaltenden Probenpuffer resuspendiert. Die Proben wurden in SDS-PAGE-Gelen elektrophoresiert und dann elektronisch auf eine Nylon/Nitrozellulosemembran transferiert. Die primären Antikörper, Ziege-Anti-c-Myc-Antikörper (A14) (Research Antibodies, Santa Cruz, CA) bzw. Maus-Anti-Flag-Antikörper (M2) (Stratagene, La Jolla, CA) wurden verwendet, um die Proben zu binden. Der Meerrettichperoxidase (HPR) konjugierte Anti-Ziege-IgG-Antikörper oder der Anti-Maus-IgG-Antikörper (Research Antibodies, Santa Cruz, CA) wurden als die sekundären Antikörper verwendet. Ein auf Chemilumineszenz basierendes System (ESL, Amersham-Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) wurde verwendet, um die Antigen-Antikörper-Bindung zu visualisieren.
Zur Ko-Immunpräzipitation wurden Zelllysate von COS-1- oder 293T-Zellen, die Vif-Flag und/oder Vif-c-Myc exprimiert, mit dem A14-Antic-Myc-Antikörper (Research Antibodies, Santa Cruz, CA) (1 μg/ml) durch Mischen während 12 Stunden bei 4°C inkubiert, gefolgt von der Inkubation mit Protein A konjugierter Sepharose CL-4B (Amersham-Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) über zusätzliche 2 Stunden. Das Pellet wurde dreimal mit einem Zell-Lysis-Puffer gewaschen und dann in dem SDS enthaltenden Puffer resuspendiert, bei 95°C erwärmt und bei 12 000 g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde dann SDS-PAGE unterzogen. Nach dem Transfer auf die Nylon-/Nitrozellulosemembran wurden die Proben mit einem Maus-M2-Anti-Flag-Antikörper erfasst. Ein Mit HRP konjugiertes Anti-Maus-IgG (Research Antibodies, Santa Cruz, CA) wurde als ein sekundärer Antikörper verwendet.
Säugetier-Zwei-Hybrid-System-Assay
Ein Säugetier-Zwei-Hybrid-System, das von dem auf GAL4 basierten Hefe-Zwei-Hybrid-Assay modifiziert wurde, wurde zur Studie der Selbstassoziation von HIV-1-Vif-Proteinen in vivo verwendet. (Shimano, R., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 242(2): 313-316, 1998; Bogerd, H., und Greene, W. C., J. Virol. 67(5): 2496-2502, 1993). Die Vorgehensweise wurde mit einigen Abwandlungen in Shimano, R., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 242(2): 313-316, 1998 und Bogerd, H., und Greene, W. C., J. Virol. 67(5): 2496-2502, 1993, beschrieben. Kurz gesagt wurden 5 μg pGal-Vif und pVif-VP unter Verwendung des Superfect-Transfektionsreagens (Qiagen, Valencia, CA) mit pG5BCAT in COS-1-Zellen kotransferiert. Achtundvierzig Stunden post-Transfektion wurden die Zellen in einem Reporter-Lysis-Puffer (Promega, Madison, WI) lysiert und einem wie vorher von Zhang, H., et al. in J.Virol. 69(6): 3929-3932, 1995 beschriebenen Chloramphenicol-Acetyltransferase-(CAT-)Assay unterzogen.
Virus-Infektiosität-Assays im Einfachdurchlauf
Die biologische Aktivität von Vif-Mutanten wurde unter Verwendung eines Virus-Infektiosität-Assays im Einfachdurchlauf, wie von Dornadula, G., et al., J. Virol. 74(6): 2594-2602, 2000 beschrieben, mit einigen Abwandlungen, evaluiert. Zur Erzeugung von rekombinanten HIV-1-Viren wurden H9-Zellen mit 5 μg pNL4-3ΔvifΔenv, pMD.G [eine VSV-Hülle (VSV = aphthöser Stomatitisvirus) enthaltend] und dem Wildtyp-vif-Gen oder seinen Mutanten (in der pCI-Neo-Konstruktion) durch Elektroporation transfiziert. (Dornadula, G., et al., J. Virol. 74(6): 2594-2602, 2000; Naldini, L., et al., Proc Natl Acad Sci USA 93(21): 11382-11388, 1996). Die Elektroporation (350 V, 250 μF, 5,1-6,3 ms) wurde mittels einer Gen-Impulsgebervorrichtung und Kapazitanz durchgeführt (Bio-Rad, Hercules, CA). Anschließend wurde ein konditioniertes Medium (RPMI 1640 plus 10% fötales Kälberserum) verwendet, um die transfizierten H9-Zellen zu unterhalten. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die viralen Partikel in der überstehenden Flüssigkeit gesammelt und mittels Ultrazentrifugation pelletiert. (Dornadula, G., et al., J. Virol. 74(6): 2594-2602, 2000). Nach der Normalisierung durch das HIV-1-p24-Antigen-Niveau, das über Enzyme-linked-immunosorbent-Assay (ELISA, Kits von DuPont) erfasst wurde, wurden die Viren verwendet, um 5 × 10⁵ HeLa-CD4-CAT-Zellen zu infizieren. (Ciminale, V., et al., AIDS Res. Hum. Retro. 6(11): 1281-1287, 1990). Achtundvierzig Stunden post-Infizierung wurden die Zellen in dem Reporter-Lysis-Puffer (Promega, Madison, WI) lysiert und CAT-Assays unterzogen.
Phagen-Display-Peptid-Screening
Vif bindende Peptide, die auf M13-Phagen angezeigt werden, wurden unter Verwendung des Ph.D.-12^TM Phage Display Peptide Library Kit (New England Biolabs, Beverly, MA) gescreent. Die Phagen-Selektionsprozess-(Panning-)Verfahrensweise wurde gemäß dem Kitprotokoll mit einigen Abwandlungen durchgeführt. Das GST-Vif-Fusionsprotein, das mit dem Glutathion-Agaroseperlen (Sigma, St. Louis, MO) verbunden war, wurde als Ziel für den Phage-Selektionsprozess verwendet. Für jede Runde des Selektionsprozesses wurden in einem endgültigen Volumen von 6 ml in TBS-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 150 mM NaCl) 10¹¹ Phagen den 10 mg GST hinzugegeben, die mit 3 ml Glutathion-Agarosegel verbunden waren, und 1 Std. lang bei Raumtemperatur mit Schütteln inkubiert. Die Bindungslösung wurde mittels Zentrifugierung bei 500 g über 10 Min. getrennt und die überstehende Flüssigkeit wurde dann 10 mg GST-Vif, das mit 3 ml Glutathion-Agaroseperlen verbunden war, hinzugegeben. Die Mischung wurde 1 Std. lang bei Raumtemperatur inkubiert und dann 6 Mal mit TBST [50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 500 mM NaCl, 0,5% Tween-20] gewaschen. Die GST-Vif bindenden Phagen wurden durch das Hinzufügen von 3 ml von 5 mM reduziertem Glutathion in TBS eluiert. Die eluierten Phagen wurden durch das Hinzufügen von 2,5 ml der Elution zu 20 ml einer E.-co1i-ER2738-Kultur (OD bei 0,6) amplifiziert und bei 37°C mit kräftigem Schütteln über 4,5 Std. inkubiert. Nach der Zentrifuge wurden die Phagen in der überstehenden Flüssigkeit durch PEG/NaCl präzipitiert. Nach dem Waschen wurden die Phagen in 200 μl TBS suspendiert. Die Titration der eluierten oder amplifizierten Phagen wurde wie in dem Kitprotokoll beschrieben bestimmt. Nach Selektionsprozess mit 3 Durchläufen wurden einzelne Phagelöcher aus den GST- oder GST-Vif-Elutionstiterplatten zur jeweiligen Amplifikation ausgewählt. Die Phage-DNA wurde gereinigt und sequenziert.
Bestimmung der Bindungsaffinität durch ELISA
Es wurde ein Phagen-Enzyme-linked-immunosorbent-Assay (ELISA) durchgeführt, um die relative Bindungsaffinität von Phagen mit GST, GST-Vif oder GST-Vif ohne die Aminosäuren 151-192 zu messen. Einhundertundfünfzig μl von 100 μg/ml GST und GST-Vif in 0,1 M NaHCO₃ (pH-Wert 8,6) wurden auf jeweils 96-Loch-Mikrotiterplatten aufgetragen und bei 4°C über Nacht inkubiert. Die Platten wurden mit einem Blockierungs-Puffer (0,1 M NaHCO₃, pH-Wert 8,6, 5 mg/ml BSA) 2 Std. lang bei Raumtemperatur blockiert. Die einzelnen Phagenklone in 200 μl TBST wurden 4-fach seriell verdünnt (von 10¹¹ auf 10⁵) und den mit GST, GST-Vif oder GST-Vif ohne die Aminosäuren 151-192 überzogenen Löchern hinzugefügt und 2 Std. lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wurde der Mit HRP konjugierte Anti-Ml3-Antikörper hinzugefügt, um die Phagen zu binden. Nach dem Waschen wurde das Substrat hinzugegeben und es wurde eine Farbentwicklung durchgeführt. Die durch das Vif eingefangenen Phagen wurden halbquantifiziert. OD bei 405 nm gleich oder größer als 0,15 wurde als positiv angesehen.
Ein PXP-Motiv enthaltende Peptide
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Peptide von SEQ ID NR. 11, die PXP-Motive enthalten. Es werden auch Moleküle, die die ein PXP-Motiv enthaltenden Peptide der Erfindung beinhalten, bereitgestellt.
Die ein PXP-Motiv enthaltenden Peptide können bis zu 20 Aminosäuren lang sein.
Die Produktion und Verwendung von ein PXP-Motiv enthaltenden Peptiden liegen in dem Bereich der vorliegenden Erfindung. In einer bestimmten Ausführungsform sind die ein PXP-Motiv enthaltenden Peptide Antagonisten, die dazu im Stande sind, interaktiv an die Multimerisationsdomäne des Vif-Proteins zu binden und die Vif-Protein-Multimerisation zu inhibieren.
Die ein PXP-Motiv enthaltenden Peptide der Erfindung können mittels verschiedener, auf dem Gebiet bekannter Verfahren produziert werden. Zum Beispiel können ein PXP-Motiv enthaltende Peptide durch die Verwendung eines Peptidsynthetisators chemisch synthetisiert werden.
In einer bestimmten Ausführungsform ist ein ein PXP-Motiv enthaltendes Peptid der Erfindung ein Chimär- oder Fusionsprotein, das ein ein PXP-Motiv enthaltendes Peptid beinhaltet, welches an seinem Amino- oder Carboxyterminus über eine Peptidbindung mit einer Aminosäuresequenz eines anderen Proteins verknüpft ist. In einer Ausführungsform wird ein derartiges Chimärprotein durch die rekombinante Expression einer das Protein codierenden Nukleinsäure produziert (die eine codierende Sequenz für das ein PXP-Motiv enthaltende Peptid beinhaltet, die in-frame mit einer codierenden Sequenz für ein anderes Protein verknüpft ist). Ein derartiges Chimärprodukt kann durch das Aneinander-Ligieren der entsprechenden Nukleinsäuresequenzen, die die erwünschten Aminosäuresequenzen codieren, mittels auf dem Gebiet bekannter Verfahren in dem richtigen codierenden Frame und Exprimieren des Chimärproduktes mittels auf dem Gebiet wohl bekannter Verfahren hergestellt werden. Als Alternative dazu kann ein derartiges Chimärprodukt durch synthetische Proteintechniken, z. B. durch die Verwendung eines Peptidsynthetisators, hergestellt werden. Es können Chimärgene konstruiert werden, die die codierende Sequenz für ein PXP-Motiv enthaltende Peptide, mit beliebigen, heterologen Protein codierenden Sequenzen verschmolzen, beinhalten.
Therapeutische Anwendungen
Die Erfindung stellt ein Peptid, das die SEQ ID NR. 11 beinhaltet, zur Behandlung oder Prävention von verschiedenen Krankheiten, Störungen und Beschwerden bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Störungen, welche die Lentivirus-Infektion involvieren, behandelt oder verhindert, indem ein Therapeutikum, das die Vif-Funktion inhibiert, vorzugsweise einem menschlichen Patienten verabreicht wird.
In bestimmten Ausführungsformen werden Therapeutika der vorliegenden Erfindung, welche die Vif-Funktion inhibieren, für Folgendes therapeutisch (inklusive phrophylaktisch) verabreicht: (1) bei Krankheiten, Störungen oder Beschwerden, die Lentiviren, insbesondere HIV-1, involvieren, oder (2) bei Krankheiten, Störungen oder Beschwerden, bei denen in-vitro-Assays (oder In-vivo-Assays) auf die Nützlichkeit der Verabreichung des Vif-Antagonisten hinweisen. Die Anwesenheit von HIV-1 kann leicht durch ein beliebiges, auf dem Gebiet standardmäßiges Mittel erfasst werden, z. B. durch das Erlangen einer Blutprobe eines Patienten und das Analysieren dieser in vitro auf die Anwesenheit von HIV-1.
Therapteutische/prophylaktische Verfahren
Die Erfindung stellt die Verwendung einer Verbindung für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung und Prophylaxe durch die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Therapeutikums an ein Versuchsobjekt bereit. In einem bevorzugten Aspekt wird das Therapeutikum im Wesentlichen gereinigt. Das Versuchsobjekt ist vorzugsweise ein Tier, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Tiere wie etwa Kühe, Schweine, Hühner usw., und ist vorzugsweise ein Säugetier und am besten ein Mensch.
Es sind verschiedene Abgabesysteme bekannt und werden dazu verwendet, ein Therapeutikum der Erfindung zu verabreichen, z. B. die Einkapselung in Liposome, Mikropartikel, Mikrokapseln, die Expression durch rekombinante Zellen, Rezeptor vermittelte Endozytose (siehe z. B. Wu und Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432, 1987), die Konstruktion einer therapeutischen Nukleinsäure als Teil eines Retrovirus- oder anderen Vektors. Einführungsverfahren umfassen, beschränken sich aber nicht auf intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkunate, intranasale und orale Wege. Die Verbindungen werden über einen beliebigen angemessenen Weg verabreicht, z. B. durch Infusion oder Bolusinjektion, durch Absorption, durch epitheliale oder mukokutane Auskleidungen (z. B. Mundschleimhaut, und Rektal- und Darmschleimhaut usw.) und können zusammen mit anderen biologisch aktiven Stoffen verabreicht werden. Die Verabreichung kann systemisch oder lokal sein. Des Weiteren kann es wünschenswert sein, die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung über einen beliebigen geeigneten Weg in das zentrale Nervensystem einzuführen, einschließlich intraventrikulärer und intrathekaler Injektion; die intraventrikuläre Injektion kann durch einen intraventrikulären Katheter erleichtert werden, der zum Beispiel mit einem Reservoir wie etwa einem Ommaya-Reservoir verbunden ist.
In einer bestimmten Ausführungsform kann es wünschenswert sein, die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung lokal an der Stelle, die Behandlung erfordert, zu verabreichen; dies kann durch zum Beispiel, und nicht als Einschränkung, lokale Infusion während des chirurgischen Eingriffs, örtliche Anwendung, z. B. im Zusammenhang mit einem Wundverband nach dem chirurgischen Eingriff, durch Injektion, mittels eines Katheters, mittels eines Suppositoriums oder mittels eines Implantats erfolgen, wobei das Implantat aus einem porösen, nicht porösen oder gallertartigen Material, einschließlich Membranen wie etwa Silastic-Membranen oder Fasern, ist. In einer Ausführungsform geschieht die Verabreichung durch direkte Injektion an der Stelle (oder früheren Stelle) eines malignen Tumors oder neoplastischen oder präneoplastischen Gewebes.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die vorliegende Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit. Derartige Zusammensetzungen beinhalten eine therapeutisch wirksame Menge eines Therapeutikums und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder ein pharmazeutisch akzeptables Vehikel. Ein derartiger Träger umfasst, beschränkt sich aber nicht auf Salzlösungen, gepufferte Salzlösungen, Dextrose, Wasser, Glycerol, Ethanol und Kombinationen daraus. Der Träger sowie die Zusammensetzung kann steril sein. Die Formulierung wird mit der Art der Verabreichung übereinstimmen.
Die Zusammensetzung kann auf Wunsch auch geringfügige Mengen an Netzmitteln und Emulgatoren oder pH-Puffersubstanzen enthalten. Die Zusammensetzung kann eine flüssige Lösung, Suspension, Emulsion, Tablette, Pille, Kapsel, Depot-Formulierung oder ein Pulver sein. Die Zusammensetzung kann als ein Suppositorium mit traditionellen Bindemitteln und Trägern wie etwa Triglyceriden formuliert sein. Die orale Formulierung kann standardmäßige Träger wie etwa pharmazeutische Grade an Mannitol, Laktose, Stärke, Magnesiumstearat, Kristallose, Zellulose, Magnesiumcarbonat usw. umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zusammensetzung gemäß routinemäßigen Verfahrensweisen als pharmazeutische Zusammensetzung formuliert, die zur intravenösen Verabreichung an Menschen ausgeführt ist. Typischerweise sind die Zusammensetzungen zur intravenösen Verabreichung Lösungen in einem sterilen, isotonischen, wässrigen Puffer. Falls erforderlich, umfasst die Zusammensetzung auch einen Lösungsvermittler und ein Lokalanästhetikum wie etwa Lidocain, um den Schmerz an der Stelle der Injektion zu lindern. Im Allgemeinen sind die Inhaltsstoffe entweder separat oder zusammengemischt in Einheitsdosierungsform erhältlich, zum Beispiel als trockenes lyophilisiertes Pulver oder wasserfreies Konzentrat in einem hermetisch abgedichteten Behälter wie etwa einer Ampulle oder einem Päckchen, welche die Menge des aktiven Stoffes angibt. Wenn die Zusammensetzung mittels Infusion verabreicht werden soll, wird sie mit einer Infusionsflasche, die steriles Wasser oder sterile Salzlösung von pharmazeutischem Grad enthält, abgegeben. Wenn die Zusammensetzung mittels Injektion verabreicht wird, wird eine Ampulle sterilen Wassers zur Injektion oder Salzlösung bereitgestellt, so dass die Inhaltsstoffe vor der Verabreichung vermischt werden.
Die Therapeutika der Erfindung sind als neutrale oder Salzformen formuliert. Pharmazeutisch akzeptable Salze umfassen jene, die mit freien Aminogruppen gebildet werden, wie etwa jene, die aus Chlorwasserstoffsäuren, Phosphorsäuren, Essigsäuren, Oxalsäuren, Weinsäuren usw. hergeleitet werden und jene, die mit freien Carboxylgruppen gebildet werden, wie etwa jene, die aus Natrium, Kalium, Ammonium, Kalzium, Eisen(III)-oxidhydraten, Isopropylamin, Triethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain usw. hergeleitet werden.
Die Menge des Therapeutikums der Erfindung, die bei der Behandlung einer bestimmten Störung oder bestimmter Beschwerden wirksam sein wird, hängt von der Eigenschaft der Störung oder Beschwerden ab und wird mittels standardmäßigen klinischen Techniken bestimmt. Des Weiteren können In-vitro-Assays optional eingesetzt werden, um dabei behilflich zu sein, optimale Dosierungsbereiche zu identifizieren. Die genaue in der Formulierung einzusetzende Dosis wird auch von dem Verabreichungsweg und der Ernsthaftigkeit der Krankheit, der Störung oder der Beschwerden abhängen und wird gemäß der Beurteilung des praktischen Arztes und der Umstände jedes Patienten entschieden. Geeignete Dosierungsbereiche für die intravenöse Verabreichung liegen jedoch im Allgemeinen bei ungefähr 20-500 Mikrogramm aktiver Verbindung pro Kilogramm Körpergewicht. Geeignete Dosierungsbereiche für die intranasale Verabreichung liegen im Allgemeinen bei ungefähr 0,01 pg/kg Körpergewicht bis 1 mg/kg Körpergewicht. Wirksame Dosen können aus Dosis-Wirkungs-Kurven, die aus in-vitro- oder Tiermodelltestsystemen abgeleitet sind, extrapoliert werden.
Suppositoria enthalten im Allgemeinen einen Wirkstoff in dem Bereich von 0,5 bis 10 Gew.-%; orale Formulierungen enthalten vorzugsweise 10% bis 95% Wirkstoff.
Die Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Packung oder ein Kit bereit, die/das einen oder mehrere Behälter beinhaltet, die mit einem oder mehreren Inhaltsstoffen der pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung gefüllt sind. Optional ist mit einem derartigen Behälter/mit derartigen Behältern ein Hinweis assoziiert, der von einer staatlichen Behörde vorgeschrieben wird, welche die Herstellung, Verwendung oder den Verkauf von Pharmazeutika oder biologischen Produkten regelt, wobei der Hinweis die Genehmigung der Behörde zur Herstellung, Verwendung oder den Verkauf zur Verabreichung an den Menschen wiedergibt.
Ergebnisse
Vif-Proteine können in vitro Multimere bilden
Zur Untersuchung, ob die Vif-Proteine zur Selbstassoziation neigen, wurde das GST-Vif in bakteriellen BL-21-Zellen exprimiert und auf Glutathion konjugierte Agaroseperlen isoliert. Die GST-Vif konjugierten Perlen wurden dann mit in vitro translatierten, ³⁵S-markierten Vif-Proteinen inkubiert. Nach dem Binden wurde das Perlen assoziierte ³⁵S-markierte Vif mittels SDS-PAGE, gefolgt von direkter Autoradiographie, analysiert. Das Autoradiogramm des gebundenen ³⁵S-markierten Vif stellt dar, dass GST-Vif (Bahn 2), nicht aber GST (Bahn 3) an das ³⁵S-markierte, in vitro translatierte Vif-Protein bindet, was auf eine Vif-Vif-Wechselbeziehung hinweist (1A).
Um die Neigung von Vif-Proteinen zur Selbstassoziation weiter zu evaluieren, wurden in vitro translatierte ³⁵S-markierte HIV-1-Vif-Proteine direkt auf ein natives Tris-Glycin-Gel (SDS frei) mit Auftragspuffern, die nur 10% Glycerol oder SDS in unterschiedlichen Konzentrationen enthielten, geladen. Die mit einem 4-15% Tris-Glycin-Laufpuffer durchgeführte Elektrophorese zeigt, dass die ³⁵S-markierten Vif-Proteine in nativen oder relativ nativen Bedingungen als Monomere (23 Kd), Dimere (46 Kd), Trimere (69 Kd) oder Tetramere (92 Kd) (1B) migrieren. Mit der Erhöhung von Konzentrationen von SDS in dem Auftragspuffer wird die Hauptform von Vif schließlich ein Monomer (23 Kd). Wenn die Probe bei 95°C 5 Minuten lang erhitzt wurde, verschwanden alle Multimere von Vif-Proteinen, was impliziert, dass die Vif-Vif-Bindung nicht kovalent ist. Da vor dem Auftragen der Probe das ³⁵S-markierte, in vitro translatierte HIV-1-Vif-Protein mit RNase A behandelt wurde, um eine mögliche RNA-Kontamination zu beseitigen, war die Vif-Vif-Bindung RNA unabhängig.
Die Bindungsstelle für die Vif-Multimerisation befindet sich an dem C-Terminus
Zur Bestimmung der Bindungsstellen für die Vif-Multimerisation wird durch PCR basierte Mutagenese eine Reihe von Deletionen in dem Vif-Protein erzeugt, gefolgt von In-vitro-Translation in der Anwesenheit von ³⁵S-Methionin. Dann wurde ermöglicht, dass diese Vif-Mutanten an das GST-Vif Fusionsprotein, das auf Agaroseperlen konjugiert ist, binden. Nach dem Binden wurden das Perlen assoziierte, ³⁵S-markierte Vif-Protein und seine Mutanten einer SDS-PAGE unterzogen und durch direkte Autoradiographie visualisiert. 2A stellt die Ergebnisse dar. Das Vif-Protein verliert die Vif-Vif-Bindungsaktivität mit der Deletion des C-Terminus stark, während die Deletion bei den Aminosäurenpositionen 151-164 die Bindungsfähigkeit bedeutend herabsetzt (2A). Dieses Ergebnis wird durch den nativen Multimerbildungsassay bestätigt. In der Anwesenheit von 0,1% SDS waren die Vif-Mutanten Δ151-192 und Δ151-164 nicht dazu im Stande, Multimere zu bilden, während andere Mutanten ihre Fähigkeit zur Multimerisation beibehielten (2B).
Es sei zu bemerken, dass sich in dem Fragment 151-164 mehrere positiv geladene Aminosäuren befinden. Die Mutanten, welche diese positiv geladenen Aminosäuren, wie von Goncalves et al. (Goncalves, J., et al., J. Virol. 69(11): 7196-7204, 1995) erzeugt, substituieren, sind auf diese Vif-Vif Bindung untersucht worden. Alle diese Mutanten enthalten jedoch immer noch die Vif-Vif-Bindungsfähigkeit (Daten nicht gezeigt). Es sei auch bemerkt, dass sich in diesem Fragment mehrere Proline befinden (P156, P161, P162, P164). Unter diesen Prolinen ist P161 in verschiedenen Stämmen von HIV-1 oder SIV hoch konserviert. Weitere Untersuchungen veranschaulichen, dass die Deletion von ¹⁶¹PPLP¹⁶⁴ (AS 161-164 im Vif-Protein, SEQ ID NR. 25) die Fähigkeit von Vif-Proteinen, mit anderen wechselzuwirken, bedeutend beeinträchtigt. Außerdem liegt ein hoch konserviertes Motiv, SLQYLAL (SEQ ID NR. 4) (Aminosäurepositionen 144-150 für HIV-1_NL4-3) nahe bei dieser Domäne.
Die Domäne für die Vif-Multimerisation befindet sich daher bei dem C-Terminus, insbesondere bei den Aminosäurepositionen 144-171 des HIV_NL4-3-Vif-Proteins und weist die Aminosäuresequenz SEQ ID NR. 26 auf.
Vif-Vif-Wechselwirkungen innerhalb einer Zelle
Zur Untersuchung, ob die Vif-Selbstassoziation auch intrazellulär auftritt, wurde ein Ko-Immunpräzipitationsverfahren benutzt. Das Vif-Protein wurde mit entweder einem c-Myc-Epitop-Tag (SEQ ID NR. 3) oder einem Flag-Epitop-Tag (SEQ ID NR. 2) an seinem C-Terminus versehen und in COS-1-Zellen exprimiert. Die Expression eines mit einem c-Myc-Tag versehenen Vifs und eines mit einem Flag-Tag versehenen Vifs wurde mittels Western Blotting mit einem Maus-Anti-c-Myc-Epitop-Antikörper bzw. Ziege-Anti-Flag-Epitop-Antikörper (3, obere zwei Tafeln) erfasst. Zur Studie der Vif-Vif-Wechselwirkung wurden die Zelllysate mit Anti-Myc-Antikörper immunpräzipitiert und dann SDS-PAGE unterzogen, gefolgt von Western Blotting. Der Ziege-Anti-Flag-Antikörper wurde verwendet, um das mit einem Flag-Tag versehene Vif zu erfassen. Die Ergebnisse sind in 3, untere Tafel, gezeigt. Das mit einem Flag-Tag versehene Vif wird mit dem mit einem Myc-Tag versehenen Vif kopräzipitiert, wenn der Maus-Anti-Myc-Antikörper zur Immunpräzipitation benutzt wurde, was eine Vif-Vif-Wechselwirkung innerhalb einer Zelle (3, untere Tafel) impliziert.
Als Alternative dazu wurde die In-vivo-Vif-Vif-Wechselwirkung durch das Säugetier-Zwei-Hybrid-System untersucht. Ein Fusionsprotein, das aus VP16 und Gal4 zusammengesetzt ist, kann den Gal4-Antwortelement enthaltenden E1b-Promotor aktivieren. Gal4 wirkt als DNA bindende Domäne, während VP16 als DNA-Aktivierungsdomäne wirkt. Dem HIV-1-Vif-Protein wird es ermöglicht, die VP16- bzw. Gal4-Domäne zu ersetzen (4A). Wenn die Wechselwirkung zwischen Vif-Proteinen stattfindet, werden die VP16- und Gal4-Domänen zusammengebracht und die in dem E1b-Promotor enthaltende Gal4 bindende Sequenz wird aktiviert. Die CAT-Analyse ergab, dass das Vif in dem Vif-VP16-Fusionsprotein wie in Rev-Rev-Wechselwirkungen an das Vif in dem Gal4-Vif-Fusionsprotein bindet und die Expression von CAT aktiviert (Bahn 6) (4B). Als Kontrollen waren pGal-Vif oder pVif-VP alleine nicht dazu im Stande, die CAT-Expression zu aktivieren (Bahnen 3 und 4, 4B). 4B zeigt auch, dass die Vif-Mutante Δ151-164, die nicht die Fähigkeit besitzt, mit dem Vif-Protein in anderen Systemen wechselzuwirken, mit dem Vif in diesem System (Bahn 7) nicht wechselwirkt.
Die Deletion der Vif-Vif-Bindungsdomäne setzt die Vif-Funktion in dem viralen Lebenszyklus stark herab.
Wie eingangs erwähnt, wirkt Vif in den späteren Stadien des HIV-1-Lebenszyklus und wird von „nicht permissiven" Zellen, wie etwa PBMC, Makrophagen und H9-T-Zellen, für die HIV-1-Replikation verlangt. (Gabuzda, D.H., et al., J. Virol. 66(11): 6489-6495, 1992; Blanc, D., et al., Virology 193(1): 186-192, 1993; von Schwedler, U., et al., J. Virol. 67(8): 4945-4955, 1993). Zur Untersuchung der physiologischen Bedeutung der Vif-Multimerisation wurde die Fähigkeit der Vif-Mutante Δ151-164, die Vif-Funktion in dem viralen Lebenszyklus zu komplementieren, untersucht. Die Vif-Mutante Δ151-164 wurde verwendet, weil sie nicht dazu im Stande ist, in zellfreien Systemen und innerhalb von Zellen Multimere zu bilden. Zu diesem Zweck wurde ein Virus-Infektiosität-Assay im Einfachdurchlauf ausgeführt. Das Wildtyp-Vif oder seine Mutanten wurden in den „nicht permissiven" H9-T-Zellen exprimiert. Zur gleichen Zeit wurden Pseudotyp-HIV-1-Viren (mit einer VSV-Hülle) ohne vif und env in ihrem Genom aus diesen Zellen erzeugt. Nach der Ultrazentrifugierung zur Anreicherung wurde es den rekombinanten Viren ermöglicht, die Zielzellen (Hela CD4-CAT), welche eine das durch den HIV-1-LTR-Promotor angetriebene CAT-Gen enthaltende Expressionskassette beherbergen. Die Virus-Infektiosität wurde am Grad der CAT-Gen-Expression in den Zielzellen, die durch das von den neu synthetisierten Proviren exprimierte HIV-1-Tat-Protein angetrieben wird, gemessen. 5 veranschaulicht, dass, wenn das Wildtyp-vif-Gen in den den vif-defekten HIV-1-Virus produzierenden „nicht permissiven" H9-T-Zellen exprimiert wird, die Virus-Infektiosität ein hohes Niveau (Bahn 2) erreicht. Wenn jedoch Vif Δ151-164 in den den vif-defekten HIV-1-Virus produzierenden „nicht permissiven" H9-T-Zellen exprimiert wird, bleibt die Virus-Infektiosität unverändert (Bahn 3) im Vergleich mit den vif-defekten HIV-1-Viren (Bahn 4) (5). Diese Daten weisen darauf hin, dass die 151-164-Deletion die Funktion des Vif-Proteins stark herabsetzt und es dadurch nicht dazu im Stande ist, die Infektiosität der vif-defekten HIV-1-Viren, die aus „nicht permissiven" T-Zellen erzeugt wurden, zu retten. Die Ergebnisse veranschaulichen, dass für die Vif-Funktion die Multimerisation von Vif-Proteinen erforderlich ist.
Ein PXP-Motiv enthaltende Peptide inhibieren die Vif-Vif-Wechselwirkung durch das Binden an die PPLP-Domäne Zur weiteren Identifizierung von Peptiden, die an die Vif-Protein-Multimerisationsdomäne binden und dadurch die Vif-Vif-Wechselwirkung und die Virus-Infektiosität des HIV-1-Virus inhibieren, wurde ein Satz von 12-mer Peptiden, die ein PXP-Motiv enthalten (Tabelle 1, SEQ ID NR. 5-20) konstruiert, wobei diese Struktur von der ¹⁶¹PPLP¹⁶⁴-Domäne (SEQ ID NR. 25) des Vif-Proteins geteilt wird. Durch das Phagen-Peptid-Display-Verfahren wurde veranschaulicht, dass diese Peptide mit hoher Affinität an das gereinigte HIV-1-Vif-Protein binden (6). Einige dieser Peptide wurden synthetisiert und dem Reaktionssystem für die Vif-Vif-Bindung hinzugefügt. Wie in Tabelle 1 gezeigt, kann das Peptid SNQGGSPLPRSV (VM17, SEQ ID NR. 11), welches das PXP-Motiv enthält, die Vif-Vif-Wechselwirkung bedeutend inhibieren. Die SEQ ID NR. 5-10 und 12-20 sind lediglich zum Vergleich aufgeführt.
Weitere Experimente veranschaulichten, dass die ein PXP-Motiv enthaltenden Peptide nicht dazu im Stande waren, an das ¹⁶¹PPLP¹⁶⁴-Domäne deletierte VIF-Protein zu binden, wodurch Anzeichen geliefert werden, dass die ¹⁶¹PPLP¹⁶⁴-Domäne eine Schlüsselrolle bei der Vif-Multimerisation spielt und dass die ein PXP-Motiv enthaltenden Peptide die Multimerisation von Vif durch Bindung an die ¹⁶¹PPLP¹⁶⁴-Domäne des Vif-Proteins blockieren.
Ein Satz von synthetisierten Vif-Peptiden, Vif155-166 (SEQ ID NR. 21), Vif157-171 (SEQ ID NR. 23), Vif161-175 (SEQ ID NR. 22) und Vif117-131 (SEQ ID NR. 24) wurde auf ihre Fähigkeit, die Vif-Vif-Wechselwirkung in vitro zu blockieren, gescreent. Wie in Tabelle 1 gezeigt, waren drei Peptide, Vif155-166 (SEQ ID NR. 21), Vif157-171 (SEQ ID NR. 23) und Vif161-175 (SEQ ID NR. 22), welche die ¹⁶¹PPLP¹⁶⁴-Domäne enthalten, dazu im Stande, die Vif-Vif-Wechselwirkung zu inhibieren, was die Tatsache, dass die ¹⁶¹PPLP¹⁶⁴-Domäne für die Vif-Multimerisation verantwortlich ist, weiter unterstützt. Diese Vif-Peptide sind nur zum Zwecke des Vergleichs aufgeführt. Tabelle 1. Inhibitorische Wirkung von ein PXP-Motiv enthaltenden Peptiden auf die Vif-Vif-Wechselwirkung
Die SEQ ID NR. 5-10 und 12-24 sind lediglich zur Veranschaulichung aufgeführt.
Diskussion
Es hat sich gezeigt, dass die Bildung von Dimeren oder Multimeren durch viele HIV-1-Proteine, z. B. Gag, Protease, reverse Transkriptase, Integrase, Glykoprotein 41 (gp41), Tat, Rev, Vpr und Nef, für ihre Funktionen in dem lentiviralen Lebenszyklus wichtig ist. (Frankel, A. D. und Young, J. A., Ann. Rev. Biochem. 67: 1-25, 1998; Vaishnav, Y. N. und Wong-Staal, F., Annu Rev Biochem 60: 577-630, 1991; Zhao, L. J., et al., J Biol Chem 269(51): 32131-32137, 1994; Liu, L., et al., J. Virol. 74: 5310-5319, 2000). Des Weiteren ist die Multimerisation entscheidend für die biologische Aktivität vieler prokariontischer und eukaryontischer Proteine, und sie ist ein üblicher Mechanismus für die funktionelle Aktivierung/Inaktivierung von Proteinen. Die vorliegende Erfindung veranschaulicht, dass die HIV-1-Proteine Dimere oder Multimere bilden und dass eine derartige Multimerisation für die Vif-Funktion in dem viralen Lebenszyklus essenziell ist. Die Anzeichen machen deutlich, dass die in vitro translatierten ³⁵S-markierten Vif-Proteine dazu im Stande sind, Multimere in der nativen Umgebung zu bilden. Umgekehrt sind eher GST-Vif-Fusionsproteine als GST-Proteine, die aus einem bakteriellen Expressionssystem erzeugt wurden, dazu im Stande, an die in vitro translatierten ³⁵S-markierten Vif-Proteine zu binden. Des Weiteren veranschaulichen die Ergebnisse der Ko-Immunpräzipitation und eines Säugetier-Zwei-Hybrid-Systems eine intrazelluläre Vif-Vif-Wechselwirkung. Diese in-vitro- und in-vivo-Daten implizieren stark, dass die Vif-Proteine dazu im Stande sind, Multimere zu bilden. Die Deletion der für die Vif-Vif-Bindung essenziellen Domäne setzt die Funktion von Vif in den „nicht permissiven" Zellen stark herab, was weiter Anzeichen dafür liefert, dass die Multimerisation von Vif für seine Funktion in dem HIV-1-Lebenszyklus wichtig ist.
Die Domäne für die Vif-Multimerisation befindet sich in einem mit positiv geladenen Aminosäuren und Prolin angereicherten Fragment (Aminosäurepositionen 144-171) und hat die Aminosäuresequenz SEQ ID NR. 26. (2). Die positiv geladenen Aminosäuren in diesem Bereich sind nicht für die Vif-Vif-Wechselwirkung verantwortlich. Die Proline, genauer die ¹⁶¹PPLP¹⁶⁴ Domäne, sind/ist jedoch für die Vif-Multimerisation (6 und Tabelle 1) verantwortlich. Auf diesem basierend werden ein Satz von ein PXP-Motiv enthaltenden Peptiden als Inhibitoren der Vif-Protein-Multimerisation identifiziert. Es sei bemerkt, dass ein hoch konserviertes Motiv, SLQYLAL (SEQ ID NR. 4) (Aminosäurepositionen 144-150 für HIV-1_NL4-3) nahe bei dieser Domäne liegt. Es hat sich auch gezeigt, dass das Serin 165 durch die Mitogen aktivierte Proteinkinase (p44/42) des Vifs phosphoryliert wird und dass diese Phosphorylierung für die Vif-Funktion wichtig ist. (Yang, X., und Gabuzda., D., J. Bio. Chem. 273(45): 29879-29887, 1998). Da diese Reste nahe bei der Domäne für die Multimerisation liegen, ist es möglich, dass die Multimerisation von Vif-Proteinen durch Phosphorylierung in den Virus produzierenden Zellen reguliert wird.
Interessanterweise sind die positiv geladenen Aminosäuren (in B4- und B7-Mutanten ersetzt) in dem C-Terminus von Vif für die Vif-NCp7-Bindung in vitro verantwortlich. (Bouyae, M., et al., J. Virol. 71(12): 9358-9365, 1997). Neue Studien veranschaulichen nicht nur, dass das HIV-1-Vif ein RNA bindendes Protein und eine integrale Komponente eines mRNP-Komplexes viraler RNA in dem Zytoplasma ist, sondern auch, dass es in dem viralen RNA-Verpackungsvorgang involviert sein könnte. (Zhang, H., et al., J. Virol. 74: 8252-8261, 2000). Im Gegensatz zu den Wechselwirkungen mit NCp7 über seinen C-Terminus bindet Vif an die RNA über seinen N-Terminus. Wenn die RNA mit Vif oder Gag getrennt gemischt wird, bindet mehr RNA an Vif als an Gag; im Gegensatz dazu bindet die RNA, wenn das Vif-Protein mit RNA und NCp7 vermischt wird, nur an Gag. (Zhang, H., et al., J. Virol. 74: 8252-8261, 2000). Diese „Versetzung" kann auf verschiedene Mechanismen zurückzuführen sein; da jedoch die Domänen für die Vif-Multimerisation und für die Vif-NCp7-Bindung nahe beieinander liegen oder möglicherweise überlappen, ist es möglich, dass die Wechselwirkung zwischen Vif und Gag sowie die Wechselwirkungen zwischen Vif, RNA und Gag durch die Vif-Multimerisation reguliert werden.
Zusammengefasst besitzen die Vif-Proteine eine starke Neigung zur Selbstassoziation, wobei sie Dimere und Multimere bilden. Die die Selbstassoziation bewirkende Domäne befindet sich an dem C-Terminus des Proteins, genauer der ¹⁶¹PPLP¹⁶⁴-Domäne. Die ein PXP-Motiv enthaltenden Peptide blockieren die Multimerisation von Vif durch das Binden an die ¹⁶¹PPLP¹⁶⁴-Domäne des Vif-Proteins. Die Anzeichen machen deutlich, dass ein Vif-Mutant mit einer Deletion an den Aminosäurepositionen 151-164 nicht dazu im Stande ist, die Infektiosität von vif-defekten Viren, die aus H9-T-Zellen erzeugt wurden, zu retten, was impliziert, dass die Multimerisation von Vif-Proteinen für die Vif-Funktion in dem lentiviralen Lebenszyklus wichtig ist. 8321-82PC SEQUENCE LISTING

Claims

Ein Peptid, das die Aminosäuresequenz SNQGGSPLPRSV (SEQ ID NR. 11) beinhaltet.
Peptid gemäß Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz SEQ ID NR. 11 an ihrem Amino- oder Carboxyterminus mittels einer Peptidbindung an eine andere Aminosäuresequenz gebunden ist.
Peptid gemäß Anspruch 1, wobei das Peptid aus der Aminosäuresequenz SEQ ID NR. 11 besteht.
Peptid gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Peptid bis zu 20 Aminosäuren beinhaltet.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens ein Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger beinhaltet.
Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Verwendung als Medikament.
Peptid gemäß Anspruch 5, wobei das Medikament zur Verwendung bei der Inhibierung der lentiviralen Infektiosität ist.
Peptid gemäß Anspruch 6, wobei die lentivirale Infektiosität HIV-Infektiosität ist.
Die Verwendung eines Peptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der lentiviralen Infektiosität.
Verwendung eines Peptids gemäß Anspruch 9, wobei die lentivirale Infektiosität HIV-Infektiosität ist.