DE60128445T2

DE60128445T2 - Mutiertes cyclin g1 protein

Info

Publication number: DE60128445T2
Application number: DE60128445T
Authority: DE
Inventors: Erlinda Maria Glendale GORDON; Frederick L. Glendale HALL
Original assignee: University of Southern California USC
Current assignee: University of Southern California USC
Priority date: 2000-03-02
Filing date: 2001-03-01
Publication date: 2008-01-10
Anticipated expiration: 2021-03-02
Also published as: EP1259605A2; JP2011160815A; WO2001064870A3; IL151527A0; EP1259605B1; IL151527A; AU2008221564A1; AU3402501A; NZ521070A; CA2401545A1; WO2001064870A2; DE60128445D1; AU2001234025B2; ES2287098T3; CA2401545C; ATE362535T1; JP2003525607A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft mutiertes Cyclin G1 mit einem dominant-negativen Phänotyp, das zur Behandlung von pathologischen Zuständen und Erkrankungen nützlich ist, die abnormale Zellvermehrungen, wie beispielsweise Tumoren, Krebs, Restenose, Hyperplasien, Hornhauttrübung und Katarakte, umfassen, wodurch die Funktion des natürlichen Cyclin G1-Proteins gehemmt wird. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Expressionsvehikel, wie beispielsweise einen retroviralen Vektor oder einen adenoviralen Vektor, der ein Polynukleotid umfasst, das für mutiertes Cyclin G1-Protein kodiert.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gene, die für eine neue Klasse von Proteinen kodieren, die als Cycline bekannt sind, sind als neue Klasse von Protoonkogenen ermittelt worden, und von Cyclin abhängige Kinase (oder Cdk) Inhibitoren sind als Tumorsuppressoren identifiziert worden, wodurch die molekularen Mechanismen der Zelltransformation und Tumorgenese mit der die Enzymologie regelnden Zellzykluskontrolle verbunden wurden. (Hall u.a., Curr. Opin. Cell Biol., Bd. 3, Seiten 176-184 (1991); Hunter u.a., Cell, Bd. 79; Seiten 573-582 (1994); Elledge u.a., Curr. Opin. Cell Biol., Bd. 6, Seiten 874-878 (1994); Peter u.a., Cell, Bd. 79, Seiten 181-184 (1994)). Die sequenzielle Expression von speziellen Cyclinen und die wesentlichen Funktionen von speziellen Cdk Komplexen sind bestimmt worden (Wu u.a., Int. J. Oncol., Bd. 3, Seiten 859-867 (1993); Pines u.a., New Biologist, Bd. 2, Seiten 389-401 (1990); Pines, Cell Growth and Differentiation, Bd. 2, Seiten 305-310 (1991); Reed, Ann. Rev. Cell Biol., Bd. 8, Seiten 529-561 (1992); Sherr, Cell, Bd. 79, Seiten 551-555 (1994), wodurch direkte Verbindungen zu den grundlegenden Mechanismen der DNA Replikation, Transkription, Reparatur, genetischen Instabilität und Apoptose zur Verfügung gestellt werden. (D'Urso u.a., Science, Bd. 250, Seiten 786-791 (1990); Wu u.a., Oncogene, Bd. 9, Seiten 2089-2096 (1994); Roy, Cell, Bd. 79, Seiten 1093-1101 (1994); Meikrantz u.a., Proc. Nat. Acad. Sci, Bd. 91, Seiten 3754-3758 (1994)).
Ein metastatisches Karzinom ist ein wichtiges Ziel für die Gentherapie, da die Krankheit schlechte Resultate erzielt. Kolorektalkrebs beispielsweise ist in den Vereinigten Staaten die zweihäufigste Todesursache bei Krebs nach Lungenkrebs und ihm folgen Brustkrebs und Bauchspeichseldrüsenkrebs (Silberberg u.a., Cancer Clin., Bd. 40, Seiten 9-26 (1990)). Von diesen Karzinomen hat der Bauchspeicheldrüsenkrebs die schlechteste Prognose. Die mittlere Überlebenszeit von Patienten mit metastatischem Bauchspeicheldrüsenkrebs beträgt drei bis sechs Monate und innerhalb eines Jahrs sind praktisch alle Patienten tot (Merrick u.a., Gastroenterol. Clin. N. Amer., Bd. 19, Seiten 935-962 (1990)). Etwa 40 % der Patienten leiden zur Zeit der Diagnose entweder an einer metastatischen Erkrankung der Leber oder der Peritonealhöhle oder von beidem. Die Chemotherapie für eine metastatische Erkrankung ist trotz einer multimodalen Therapie unwirksam. Daher sind alternative Ansätze für das metastatische Karzinom wünschenswert.
Wu u.a. (Oncol. Reports, Bd. 1, Seiten 705-711 (1994)) offenbart die abgeleitete Aminosäuresequenz und cDNA Sequenz für humanes Cyclin G1-Protein. Wu u.a. offenbart auch, dass höhere Niveaus an Cyclin G1-Expression in Osteosarkomzellen und in Ewing-Sarkomzellen gefunden wurden als in normalen diploiden humanen Fibroblasten. Obwohl Wu u.a. der Meinung sind, dass die Überexpression von Cyclin G1-Protein in humanen Osteosarkomzellen eine potentielle Verbindung zu Krebs liefert, offenbaren Wu u.a. nicht die Krebsbehandlung durch Störung oder Hemmung der Funktion von Cyclin G1-Protein in Krebszellen.
Atherosklerose, eine Hauptursache sowohl für den Myokard- als auch den Hirninfarkt, ist für ~50 % der gesamten Mortalität in den Vereinigten Staaten und Europa verantwortlich (Ross, Nature, Bd. 362, Seiten 801-809 (1993); Murray und Lopez, The Global Burden of Disease, Harvard University Press, Cambridge, MA (1996)). Zusätzlich zur Bypasseinpflanzung und Endarterektomie ist die perkutane transluminale Koronarangioplastie (PTCA) zur Standardbehandlung für eine vaskuläre Stenose geworden (Fitz Gibbon u.a., Can. J. Cardiol., Bd. 12, Seiten 893-900 (1996)). Obwohl die Erfolgsrate der ersten PTCA auf gut über 90 % angestiegen ist, wird die langfristige Wirksamkeit des Verfahrens durch die letztendliche Entwicklung einer neointimalen Hyperplasie und Restenose bei ~30 bis 50 % der Patienten eingeschränkt (Glagov, Circulation, Bd. 89, Seiten 2888-2891 (1994); Schwartz u.a., Am. Coll. Cardiol., Bd. 17, Seiten 1284-1293 (1992); Myers u.a., Wound Healing Responses in Cardiovascular Disease, Weber, Hrsg., Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY, Seiten 137-150 (1995); Chef u.a., J. Clin. Invest., Bd. 99, Seiten 2334-2341 (1997)), und zwar oft in einem solchen Umfang, das eine zweite PTCA notwendig wird (Kirchengast u.a., Cardiovasc. Res., Bd. 39, Seiten 550-555 (1998)). Bis jetzt gibt es keine ausreichend wirksame pharmakologische Strategie, um ihre breite Anwendung zu rechtfertigen (Herrman u.a., Drugs, Bd. 46, Seiten 18-52 (1993); De Meyer und Bult, Vascul. Med., Bd. 2, Seiten 179-189 (1997)). Daher stellt die Kontrolle der Neointimabildung ein Hauptziel der heutigen Forschung in der Vaskularbiologie (Schwartz u.a., The Intima. Circulation Res., Bd. 77, Seiten 445-465 (1995)) und ein Modellsystem für die Entwicklung von neuen molekularen Arzneimitteln dar (Gibbons u.a., Science, Bd. 272, Seiten 689-693 (1996)).
Die starke Komplexität und Redundanz bei den Wachstumsfaktorsignalwegen hat die Prüfung von konservierten Zellzykluskontrolle-Pathways bei der Ausgestaltung von neuen cytostatischen Therapien veranlasst (Barr und Leiden, Trends Cardiovasc. Med., Bd. 4, Seite 57 (1994); Andres, Int. J. Molecular Med., Bd. 2, Seiten 81-84 (1998); Braun-Dullaeus u.a., Circulation, Bd. 98, Seiten 82-89 (1998)). Demgemäß konzentrieren sich eine Anzahl von neuen Gentherapieansätzen zum Hemmen der SMC Proliferation und Neointimabildung auf spezifische Zellzykluskontrollelemente, einschließlich Oligodesoxynukleotide, die Antisense-Konstrukte von Cyclin abhängigen Proteinkinase (CDK) Untereinheiten darstellen (Morishita u.a., Proc. Nat. Acad. Sci, Bd. 90, Seiten 8474-8478 (1993), Morishita u.a., J. Clin. Invest., Bd. 93, Seiten 1458-1464 (1994); Abe, 1994), adenovirale Vektoren, die Cdk Inhibitoren tragen (Chang u.a., Science, Bd. 267, Seiten 518-522 (1995); Chef u.a., 1997) oder Vektoren, die grundlegend aktive Formen des Rb Proteins tragen (Chang u.a., J. Clin. Invest., Bd. 96, Seiten 2260-2268 (1995); Smith u.a., Exp. Cell Res., Bd. 230, Seiten 61-68 (1997)). Andere Studien verwenden die molekularen „Köder"-Oligodesoxynukleotid-Strategien, die gegen den Transkriptionsfaktor E2F gerichtet sind (Morishita u.a., Proc. Nat. Acad. Sci., Bd. 92, Seiten 5855-5859 (1995), der die Induktion von multiplen Zellzykluskontrollgenen reguliert. Die berichtete Wirksamkeit dieser Versuchsansätze stützt das Konzept, dass Zellzykluskontrollelemente, die in Neointimaläsionen selektiv hochreguliert werden, strategische therapeutische Ziele darstellen.
Neuere Studien haben die Hochregulation von Cyclin G1, einem induzierbaren Zellzykluskontrollelement (Tamura u.a., Oncogene, Bd. 8, Seiten 2113-2118 (1993); Wu u.a., 1994; Horne u.a., J. Biol. Chem., Bd. 271, Seiten 6050-6061 (1996); Morishita u.a., 1995), im Anschluss an eine Ballonkatheterverletzung bei Nagetieren (Zhu u.a., 2000; eingereicht) und nicht humanen Primaten (Kaijin Wu u.a., 1999; eingereicht) beschrieben. Die erzwungene Expression von Cyclin G1 in transfizierten Zellen in vitro beschleunigt den Zellzyklus und fördert die klonale Expansion (Smith u.a., Exp. Cell Res., Bd. 230, Seiten 61-68 (1997), während die Blockade der Cyclin G1-Expression durch Antisense-Strategien eine Zytostase und Zytolyse hervorruft (Skotzko u.a., Cancer Res., Bd. 55, Seiten 61-68 (1995); Chef u.a., Hum. Gene Ther., Bd. 8, Seiten 1667-1674 (1997); Hung u.a., Int. J. Pediatr. Hematol. Oncol., Bd. 4, Seiten 317-325 (1997).) Im Rahmen der SMC Proliferation ist gezeigt worden, (i) dass ein Antisense-Cyclin G1-retroviraler Vektor, der auf einen ausreichend hohen Titer (10⁸ cfu/ml) konzentriert wurde, das Überleben und die Proliferation von vaskulären SMCs in transduzierten Ratten (Zhu u.a., Circulation, Bd. 46, Seiten 628-635 (1997)) und Primaten (nicht veröffentlichte Beobachtungen) hemmte und (ii) dass die intraluminale Abgabe dieses konzentrierten Antisense-Cyclin G1-Vektors in durch einen Ballon verletzte Halsschlagadern von Ratten eine signifikante Verringerung der Neointimabildung in vivo erzeugte (Zhu u.a., 1997). Skotzko u.a., Cancer Research, American Association for Cancer Research, Baltimore, Bd. 55, Nr. 23, 1995, Seiten 5493-5498 offenbart, dass die Proliferation von Sarkomzellen durch die Antisense-Hemmung von Cyclin G1 gehemmt werden kann. Diehl und Sherr, Molecular and Cellular Biology, Bd. 17, Nr. 12, 1997, Seiten 7362-7374 beschreiben eine dominant-negative Cyclin D1-Mutante, die den nukleären Import von cyclinabhängiger Kinase 4 (CDK4) und deren Phosphorylierung durch CDK aktivierende Kinase verhindert. Daher scheint Cyclin G1 sowohl ein passender als auch vorteilhafter Bereich für die therapeutische Intervention zur Handhabung einer vaskulären Restenose zu sein.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Anmelder haben festgestellt, dass es durch das Stören und/oder Hemmen der Funktion von Cyclin G1-Protein in Krebszellen möglich ist, das Wachstum und/oder das Überleben solcher Krebszellen zu hemmen, zu verhindern oder zu unterbinden. Daher betrifft die vorliegende Erfindung pathologische Zustände und Krankheiten, die abnormale zelluläre Proliferationen beinhalten, indem die Funktion von Cyclin G1-Protein durch das Verabreichen von mutiertem Cyclin G1-Proteinen an solche proliferierenden Zellen in einem Tier gehemmt wird. Zu solchen pathologischen Zuständen und Krankheiten gehören, aber sind nicht darauf beschränkt, Krebs, Tumore, Hyperplasien, Restenose, Hornhauttrübung und Katarakte. In bevorzugten Ausführungsformen wird das mutante oder abweichende Cyclin G1-Protein an das betroffene Tier durch die Gabe von Expressionsvehikeln, die mutierte Cyclin G1-Proteine kodierende Polynukleotide umfassen, verabreicht. Solche Expressionsvehikel umfassen Virusvektoren, wie beispielsweise retrovirale Vektoren und adenovirale Vektoren und synthetische Vektoren, sind aber nicht darauf beschränkt. Tiere, die durch den Gegenstand der Erfindung vorteilhaft behandelt werden können, umfassen Säugetiere, einschließlich Menschen und nicht humane Primaten, Hunde, Katzen, Pferde, Rinder und Schafe, sind aber nicht darauf beschränkt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die Erfindung wird nun mit Bezug auf die Zeichnungen beschrieben, worin
1(A) Transduktionseffizienz von auf die Matrix ausgerichteten retroviralen Vektoren in MiaPaca2 Zellen. β-Galactosidase exprimierende Zellen sind mit blau gefärbten Kernen gezeigt. (B) Zytostatische Wirkungen von auf die Matrix ausgerichteten retroviralen Vektoren mit einem mutanten Cyclin G1-Konstrukt in MiaPaca Krebszellen. Die Anzahl der Zellen pro Vertiefung, aufgetragen auf der vertikalen Achse, wird als Funktion der Zeit (Tage nach der Transduktion), aufgetragen auf der Horizontalachse, ausgedrückt. D10 Medium-Kontrolle; Nullvektor, der nur das neo' Gen trägt: AS 587 und AS 693 Vektoren, die Antisense-Cyclin G1-Konstrukte tragen; DNT 41 bis 249 oder dnG1 Vektor, der eine Deletion im N-Terminus von humanem Cyclin G1 trägt, (C) Western Analyse einer humanen Cyclin G1-Proteinexpression in mit dnG1-Vektor transduzierten Krebszellen im Vergleich zu mit Nullvektor transduzierten Krebszellen ohne G418 Selektion. Immunreaktives dnG1 (Cyclin G1 DN41) wird als leicht gefärbte Bande im Bereich von 20 kDa (Spur 2) festgestellt, während das endogene Cyclin G1-Protein als intensiv gefärbte Bande im Bereich von ~30 kDa zu sehen ist (Spuren 1 bis 3).
2 Expression von humanem Cyclin G1-Protein in metastatischen Tumorherden. Hochgradige Expression von humanem Cyclin G1-Protein in Tumorherden (A; t) von mit PBS behandelten Tieren und in Rest-Tumorherden von Tieren, die mit niedrig dosiertem dnG1 Vektor behandelt wurden (B; Pfeil), wie durch intensives Färben von immunreaktivem Cyclin G1 mit einem anti-human Cyclin G1-Antikörper nachgewiesen (braun färbendes Material).
3 Hämatoxylin-Eosin-Färbung von Gewebeschnitten der Leber zeigt die Tumorherde der PBS Kontrollgruppe (A & C; 40X und 100X) und der mit dnG1 Vektor behandelten Tiere (B & D; 40X und 100X). Apoptose in Tumorherden der PBS Kontrollgruppe (E; 100X) und der mit dnG1 Vektor behandelten Tiere (F & H: 100X und 200X; Pfeile) wird als rötlichbraunes immungefärbtes Material in einem ApopTagPlus Peroxidase in situ Apoptoseassay gezeigt. (G) Die negative Färbekontrolle ohne das terminale Desoxynukleotidyltransferase TdT Enzym; t = Tumorherde; h = Hepatozyten im Leberparenchym.
4 Die humane Cyclin G1-Sequenz ist im Vergleich zu denen von humanem Cyclin I, humanem Cyclin A und S. Pom Cig1 gezeigt. Konservierte Regionen sind durch graue Kästchen angegeben.
5 Klonieren von humaner Cyclin G1 cDNA in den retroviralen pREX Expressionsvektor. Die Darstellung zeigt die schrittweise Klonierung von punktmutantem Cyclin G1(PM 61) in pG1PM61_A/REX.
6 Schematische Darstellungen von pREX, Antisense und mutanten Cyclin G1-Konstrukten. (A) Karten- und Restriktionsklonierungsstellen des retroviralen pREX Expressionsvektors (B) schematische Darstellung von Antisense Cyclin G1 Fragmenten (C) schematische Darstellung von mutanten Cyclin G1 Fragmenten.
7 In vitro Studien bezüglich der Plasmid DNA Transfektion, Transduktionseffizienz und Transduktion von Ratten A10 und Affen SMCs mit auf die Matrix gerichteten retroviralen Vektoren, die Markergene und mutante Cyclin G1-Konstrukte tragen. (A) Proliferation von Ratten A10 SMCs, transfiziert mit mutanten Cyclin G1-Plasmid DNA Konstrukten. Die Zellzahlen, aufgetragen auf die Vertikalachse, sind als Funktion der Zeit, Tage nach der Transduktion, aufgetragen auf die Horizontalachse, ausgedrückt; (B) Transduktionseffizienz in Ratten A10 Zellkulturen im Anschluss an eine einzelne zweistündige Transduktion mittels auf die Matrix gerichteter VSVG pseudotypisierter retroviraler Vektoren, die ein auf den Kern gerichtetes β-Galactosidase-Gen tragen. Die Transduktionseffizienz % ist ausgedrückt als Funktion der Multiplizität einer Infektion (_log MOI); (C) Proliferation von humanen MiaPaca Zellen, die mit mutanten Cyclin G1 Retrovirusvektoren transduziert sind; (D) Proliferation von Affen SMCs, die mit mutanten Cyclin G1 Retrovirusvektoren transduziert sind.
8 Transientes Transfektionsschema und Virioneinbau von Antisense und mutanten Cyclin G1-Vektoren, die ein auf die Matrix ausgerichtetes Motiv und ein VSVG Protein in dualer Hüllkonfiguration zeigen. (A) Retrovirale Stammkulturen („stock") wurden mittels eines transienten vier Plasmid-Kotransfektionssystems erzeugt (Soneoka u.a., 1995), bei dem die Verpackungskomponenten gag-pol, das auf die Matrix gerichtete (CBD) env, das fusogene VSVG env und ein retroviraler Vektor, der ein Cyclin G1 Konstrukt trägt, die jeweils vom CMV Promotor exprimiert wurden, auf separaten Plasmiden angeordnet wurden, die jeweils den SV40 Replikationsursprung enthielten. (B) Die Western Analyse zeigt das MLV-basierende gp70 env Protein als immunreaktive Bande, die zur Region von ~70 kDa wandert, das VSVG Protein bei ~64 kDa und die virale gag (CA) Proteinkontrolle zwischen 36 und 50 kDa. Pseudo („mock) = keine Hüllkontrolle; CAE 109 Kontrolle = nicht gerichteter Nullvektor mit WT MLV env; Hs2 + VSVG 109 Kontrolle = auf die Matrix gerichteter Nullvektor mit einem MLV env, das ein Kollagenbindungsmotiv und VSVG Protein in dualer env Konfiguration zeigt; CAE 587 = nicht gerichteter Antisense Cyclin G1-587 Vektor mit WT env; Hs2 + VSVG 587 = auf die Matrix gerichtetes VSVG pseudotypisiertes Antisense Cyclin G1-587; CAE 693 = nicht gerichteter Antisense Cyclin GI-693 Vektor mit WT env; Hs2 + VSVG 693 = auf die Matrix gerichtetes VSVG pseudotypisiertes Antisense Cyclin G1-693; CAE D/N (41-249) = nicht gerichteter mutanter D/N (41-249) Vektor mit WT env; Hs2 + VSVG D/N (41-249) = auf die Matrix gerichteter VSVG pseudotpyisierter mutanter D/N (41-249) Vektor.
9 Synzytienbildung in Ratten A10 Zellkulturen nach der Transduktion mit Antisense und mutanten Cyclin G1 Retrovirusvektoren. Die Mikroaufnahmen zeigen das morphologische Auftreten von Ratten A10 Zellen transduziert mit Nullvektor (A & B); (C&D) Antisense Cyclin G1-693 Vektor, (D&E) mutantem Cyclin G1 (dnG1) Vektor. Die Synzytien sind durch Pfeile gekennzeichnet.
10 Western Blot Analyse der Cyclin G1 Expression in Affen und Ratten A10 Zellen, transduziert mit mutanten Cyclin G1 Vektoren. Zellproteine von transduzierten Zellen wurden 12, 24 und 48 Stunden nach der Transduktion mit den Zellen verglichen, die mit dem Nullkontrollvektor transduziert waren. (A) Verringerte Expression von immunreaktivem humanem Cyclin G1 Protein in Affen SMC Kulturen, transduziert mit einem Antisense Cyclin G1-693 retroviralen Vektor im Vergleich zum Nullvektor (Vektor) (B) Auftreten von immunreaktivem mutantem humanem Cyclin G1 (p20 Mutante) bei 20 kDa in Ratten A10 Zellkulturen 24 und 48 Stunden nach der Transduktion mit dem dnG1 retroviralen Vektor, der in Zellen fehlte, die mit dem Kontrollvektor (Vektor) transduziert waren.
11 Immunhistochemisches Färben von Ratten Cyclin G1 Protein in mit einem Ballon verletzten Rattenarterien. Eine erhöhte Cyclin G1 nukleäre Immunreaktivität (angegeben durch rötlichbraune Kernfärbung) in neointimalen Zellen der (A) mit Nullvektor (B) PBS und (D) dnG1 Vektor behandelten arteriellen Segmenten. Verminderte Intensität der Cyclin G1 Immunreaktivität in den (C) mit Antisense Cyclin G1-693 behandelten arteriellen Segmenten. Verminderte Intensität der Cyclin G1 Immunreaktivität in den (C) Antisense Cyclin G1-693 behandelten arteriellen Segmenten.
12 Einmonatige in vivo Wirksamkeitsstudien mittels auf die Matrix ausgerichteter VSVG pseudotypisierter dnG1 Vektoren. Mit Elastin gefärbte Gewebeschnitte von Rattenkarotisarterien, die einen Monat nach der Ballonverletzung und intraluminaler Instillation einer (A) PBS Kontrolle (B) Kochsalzlösung, (C) einem Nullvektor und (D) dnG1 Vektor geerntet wurden.
13 Anhalten des Tumorwachstums mit einem (7-tägigen) Behandlungszyklus des Mx- dnG1 Vektors. Der zellzerstörende („cytocidal") Vektor wurde täglich für insgesamt 7 Tage direkt in die Schwanzvene injiziert. Die Tiere wurden am 8. Tag nach den Messungen der mit einer Schieblehre erhaltenen Tumorvolumina getötet. Es ist zu beachten, dass die Tumorvolumina am Anfang der Behandlung der Tiere in der 13A beträchtlich größer als die in der 13B waren. Allerdings wurden bei beiden Experimenten mit dem Mx-dnG1 Vektor deutliche Verringerungen der Tumorgröße am 4. Behandlungstag beobachtet (n = 6), während ein fortschreitender Anstieg der Tumorgröße bei Tieren festgestellt wurde, die mit dem Kontroll Mx-nBg Vektor behandelt wurden (n = 4). Das Tumorvolumen (mm³; aufgetragen auf der Vertikalachse) wurde als Funktion der Zeit (Tage; aufgetragen auf der Horizontalachse) ausgedrückt.
14(A) Langfristige Wirksamkeitsstudien mit dem Mx-dnG1 Vektor. Mäuse, die angewachsene Tumor-Xenotransplantate tragen (Tumorvolumen ~50 mm³), wurden randomisiert, um entweder Placebo (PBS; n = 3), einen nicht gerichteten CAE-dnG1 Vektor (n = 4) oder einen auf die Matrix gerichteten Mx-dnG1 Vektor (n = 4) aufzunehmen. 200 μl Vektor (Vektordosis: 8 × 10⁶ cfu) oder ein äquivalentes Volumen an Placebo wurde direkt in eine periphere Vene (dorsale Schwanzvene) täglich oder jeden zweiten Tag für 10 Dosen (ein Behandlungszyklus) (Placebogruppe) oder für zwei Behandlungszyklen (CAE-dnG1 oder Mx-dnG2 Gruppen) mit einem zwischenzeitlichen Ruhezeitraum von 2 Wochen injiziert. Das Tumorvolumen (mm³; aufgetragen auf der Vertikalachse) wird als Funktion der Zeit (Tage; aufgetragen auf der Horizontalachse) ausgedrückt. (B) Kaplan-Meier Überlebenszeitstudien bei mit Mx-dnG1 Vektor behandelten Mäusen. Es wird die Kaplan-Meier Überlebenszeitkurve (die die Zeit bis zur Tumorvervierfachung als Endpunkt darstellt) der Tiere in (A) gezeigt. Die Placebogruppe wird durch eine kontinuierliche Linie dargestellt; die CAE-dnG1 Gruppe durch eine kurze gestrichelte Linie; die MxdnG1 Gruppe durch eine lange gestrichelte Linie. Der überlebende Anteil (der Tiere mit Tumoren darstellt, die sich nicht vervierfacht haben; aufgetragen auf der Vertikalachse) ist als Funktion der Zeit (Tage; aufgetragen auf der Horizontalachse) ausgedrückt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Behandlung eines Tiers, das unter einem pathologischen Zustand oder einer Krankheit leidet, die eine abnormale Zellproliferation beinhaltet. Solche Zustände und Krankheiten umfassen Tumore, Krebs, Hyperplasien, Restenose, Hornhauttrübung und Katarakte. Die Behandlung umfasst die Verabreichung eines mutierten Cyclin G1-Proteins an das Tier oder die erkrankte Zelle, das erkrankte Gewebe oder Organ im Tier. Das mutierte Cyclin G1-Protein wird in einer Menge verabreicht, die dahingehend wirksam ist, dass sie die abnormale zelluläre Proliferation reduziert oder hemmt oder den Zustand oder die Krankheit verbessert, heilt oder verhindert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung auf die Behandlung von Tumoren und Krebs gerichtet.
Der Begriff „Behandlung eines Tumors oder Krebs", wie er hier verwendet wird, bedeutet, dass die Hemmung, Verhinderung oder Zerstörung des Wachstums der Tumor- oder Krebszellen vorgesehen wird. Tumoren und Krebs, die mit den Verfahren der Erfindung vorteilhaft behandelt werden können, umfassen Lymphome, Leukämien, Sarkome und Karzinome, sind aber nicht darauf beschränkt.
Der Begriff „Hyperplasie", wie er hier verwendet wird, bedeutet einen nicht tumorhaften pathologischen Zustand oder eine solche Krankheit, die eine abnormale Zellproliferation in einem Gewebe oder Organ beinhaltet. Hyperplasien, die vorteilhaft durch die Verfahren der Erfindung behandelt werden können, umfassen die angiofollikuläre mediastinale Lymphknotenhyperplasie, Kimura-Krankheit, angiolymphoide Hyperplasie, atypische melanozytische Hyperplasie, Basalzellenhyperplasie, Castleman-Krankheit, Hyperzementose, kongenitale adrenale Hyperplasie, kongenitale Talgdrüsenhyperplasie, kongenitale virilisierende adrenale Hyperplasie, zystische Hyperplasie, fibromuskuläre Hyperplasie, Heck-Krankheit, intravaskuläre papilläre endotheliale Hyperplasie, neuronale Hyperplasie, squamöse Hyperplasie und warzige Hyperplasie.
Der Begriff „mutiertes Cyclin G1-Protein", wie er hier verwendet wird, bedeutet das native Cyclin G1-Protein aus einem eukaryontischen Organismus, aber mit einer oder mehreren Aminosäure-Deletionen, Substitutionen, Additionen und/oder Kombinationen davon. Bei bestimmten Ausführungsformen stammt das mutierte Cyclin G1-Protein von einem Tier. In bevorzugten Ausführungsformen stammt das Cyclin G1-Protein von einer Tierart, die mit dem behandelten Tier eng verwandt ist (z.B. ein mutiertes Schimpansen Cyclin G1-Protein, das zur Behandlung eines Menschen verwendet wird). In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform stammt das mutierte Cyclin G1-Protein von derselben Tierart wie das behandelte Tier.
Die Aminosäuresequenz von humanem Cyclin G1-Protein ist in der 4 gezeigt. In einer Ausführungsform umfasst das mutierte Cyclin G1-Protein ein am Aminoterminus verkürztes Cyclin G1-Protein. In einer Ausführungsform können die ersten bis zu 117 Aminosäureresten am N-Terminus des Cyclin G1-Proteins deletiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das mutierte Cyclin G1-Protein ein Cyclin G1-Protein, das eine N-terminale Deletion bis zu und einschließlich Aminosäurerest 40 umfasst. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist das mutierte Cyclin G1-Protein ein humanes Cyclin G1-Protein, das eine N-terminale Deletion der Aminosäurereste 1 bis 40 umfasst. In einer speziellen Ausführungsform besteht das mutierte Cyclin G1-Protein aus den Aminosäureresten 41 bis 249 von humanem Cyclin G1-Protein.
In anderen Ausführungsformen ist das mutierte Cyclin G1-Protein ein verkürztes Cyclin G1-Protein oder eins voller Länge, umfassend eine Aminosäuresubstitution am Aminosäurerest, der dem Rest 61 des humanen Cyclin G1-Proteins entspricht. In bevorzugten Ausführungsformen hat das mutierte Cyclin G1-Protein eine Alaninsubstitution an diesem Rest. In speziellen Ausführungsformen ist das mutierte Cyclin G1-Protein ein humanes Cyclin G1-Protein voller Länge oder ein verkürztes mit einer Lysin- oder Alaninsubstitution am Rest 61.
Das mutierte Cyclin G1-Protein kann durch Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Zum Beispiel kann das mutierte Cyclin G1-Protein mit einem automatisierten Peptid- oder Proteinsynthesizer hergestellt werden. Alternativ kann das mutierte Cyclin G1-Protein durch gentechnische Verfahren hergestellt werden.
In einer Ausführungsform wird das mutierte Cyclin G1-Protein dem Tier oder direkt den Zellen, dem Gewebe oder Organ verabreicht, die bzw. das den pathologischen Zustand oder die Krankheit zeigt, und zwar durch Gabe eines Polynukleotids, das ein Genkonstrukt umfasst, das das mutierte Cyclin G1-Protein kodiert. Vorzugsweise umfasst das Polynukleotid ein geeignetes Expressionsvehikel.
Der Begriff „Polynukleotid", wie er hier verwendet wird, bedeutet eine polymere Nukleotidform jeder Länge, einschließlich Ribonukleotide und Desoxyribonukleotide. Ein solcher Begriff umfasst auch einzelsträngige und doppelsträngige DNA sowie einzelsträngige und doppelsträngige RNA. Der Begriff umfasst auch modifizierte Polynukleotide, wie beispielsweise methylierte oder „capped" Polynukleotide.
Das Genkonstrukt, das das mutierte Cyclin G1-Protein kodiert, umfasst eine Sequenz, die das mutierte Cyclin G1-Protein kodiert, das funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden ist. Gemäß der Erfindung kann ein geeigneter Promotor jeder sein, der beim behandelten Tier aktiv ist. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Promoter einer, der hochaktiv in den abnormal proliferierenden Zellen und/oder spezifisch dafür ist. Es ist allerdings davon auszugehen, dass der Umfang der vorliegenden Erfindung nicht auf bestimmte Promotoren zu beschränken ist. In einer speziellen Ausführungsform ist der Promotor ein Cyclin G1-Promotor. Die Sequenz, die das mutierte Cyclin G1-Protein kodiert, kann eine native Cyclin G1-Gensequenz mit der/den gewünschten Mutation(en) oder eine synthetische Sequenz, die das mutierte Cyclin G1-Protein kodiert, umfassen.
Das Polynukleotid, das das mutierte Cyclin G1-Genkonstrukt umfasst, ist in einer bevorzugten Ausführungsform in einem geeigneten Expressionsvehikel enthalten, das in die abnormal proliferierende Zelle transduziert wird. Solche Expressionsvehikel umfassen Plasmide, eukaryontische Vektoren, prokaryontische Vektoren (wie beispielsweise bakterielle Vektoren) und virale Vektoren, sind aber nicht darauf beschränkt.
In einer Ausführungsform ist der Vektor ein Virusvektor bzw. viraler Vektor. Virusvektoren, die verwendet werden können, umfassen RNA Virusvektoren (wie beispielsweise retrovirale Vektoren) und DNA Virusvektoren (wie beispielsweise adenovirale Vektoren, adenoassoziierte Virusvektoren, Herpes-Virusvektoren und Vaccinia-Virusvektoren). Wenn ein RNA Virusvektor verwendet wird, liegt bei der Konstruktion des Vektors das Polynukleotid, das das mutierte Cyclin G1-Genkonstrukt umfasst, in der Form einer RNA vor. Wenn ein DNA Vi rusvektor verwendet wird, liegt bei der Konstruktion des Vektors das Polynukleotid, das das mutierte Cyclin G1 Genkonstrukt umfasst, in Form der DNA vor.
In einer Ausführungsform ist der Virusvektor ein retroviraler Vektor. Beispiele für retrovirale Vektoren, die verwendet werden können, umfassen Moloney Maus Leukämievirus, Milznekrosevirus und Vektoren, die von Retroviren, wie beispielsweise Rous Sarkomvirus, Harvey Sarkomvirus, Vogelleukosevirus, myeloproliferatives Sarkomvirus und Brusttumorvirus, stammen, sind aber nicht darauf beschränkt. Der Vektor ist generell ein nicht zur Replikation fähiges Retroviruspartikel. Ein retroviraler Vektor im Sinn der Erfindung umfasst einen lentiviralen Vektor, wie beispielsweise einen Vektor auf der Grundlage des HIV Virus, oder Tier-Lentiviren, wie beispielsweise BIV-bezogenen Vektoren. Die Konstruktion der lentiviralen Vektoren ist unter anderem in den US-Patenten 5,665,5777 ; 5,994,136 und 6,013,516 offenbart.
In einer Ausführungsform kann der retrovirale Vektor von einem retroviralen Plasmidvektor erzeugt werden, der vom Moloney Mausleukämievirus stammt, und kommt von der IN Vektorenreihe, die weiter in Bender u.a., J. Virol., Bd. 61, Seiten 1639-1649 (1987) und Miller u.a., Biotechniques, Bd. 7, Seiten 980-990 (1989) beschrieben sind. Solche Vektoren haben einen Abschnitt des Verpackungssignals von einem Maussarkomvirus und ein mutiertes gag Initiationskodon. Der Begriff „mutiert", wie er hier verwendet wird, bedeutet, dass das gag Initiationskodon deletiert oder so geändert wurde, dass das gag Protein oder Fragmente oder Verkürzungen davon nicht exprimiert sind.
In einer anderen Ausführungsform kann der retrovirale Plasmidvektor mindestens vier Klonierungs- oder Restriktionsenzymerkennungsstellen umfassen, wobei mindestens zwei der Stellen eine durchschnittliche Auftrittshäufigkeit in eukaryontischen Genen von unter einmal in 10.000 Basenpaaren hat; d.h. das Restriktionsprodukt hat eine durchschnittliche DNA Größe von mindestens 10.000 Basenpaaren. Bevorzugte Klonierungsstellen werden aus der Gruppe bestehend aus NotI, SnaBI, SalI und XhoI ausgewählt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der retrovirale Plasmidvektor jede dieser Klonierungsstellen. Solche Vektoren sind weiter im US-Patent 5,672,510 beschrieben.
Wenn ein retroviraler Plasmidvektor, der solche Klonierungsstellen aufweist, verwendet wird, kann auch ein Shuttle-Klonierungsvektor vorgesehen werden, der mindestens zwei Klonierungsstellen hat, die mit mindestens zwei Klonierungsstellen kompatibel sind, die aus der Gruppe bestehend aus NotI, SnaBI, SalI und XhoI, die sich auf dem retroviralen Plasmidvektor befinden, ausgewählt sind. Der Shuttle-Klonierungsvektor weist auch ein Polynukleotid auf, das das mutante Cyclin G1-Protein kodiert, das vom Shuttle-Klonierungsvektor auf den retroviralen Plasmidvektor übertragen werden kann.
Der Shuttle-Klonierungsvektor kann aus einem Basis-„Backbone" Vektor oder Fragment, an das ein oder mehr Linker ligiert sind, die Klonierungs- oder Restriktionsenzymerkennungsstellen aufweisen, konstruiert sein. Die Klonierungsstellen umfassen die kompatiblen oder komplementären, oben beschriebenen Klonierungsstellen. Ein Polynukleotid, das ein mutiertes Cyclin G1-Protein und/oder einen Promotor kodiert, die Enden aufweisen, die den Restriktionsstellen des Shuttle-Vektors entsprechen, können über auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren in den Shuttle-Vektor ligiert werden.
Der Shuttle-Klonierungsvektor kann verwendet werden, um DNA Sequenzen in prokaryontischen Systemen zu amplifizieren. Der Shuttle-Klonierungsvektor kann aus Plasmiden hergestellt werden, die allgemein in prokaryontischen Systemen und insbesondere in Bakterien verwendet werden. Daher kann zum Beispiel der Shuttle-Klonierungsvektor von Plasmiden, wie beispielsweise pBR322; pUC18; usw. stammen.
Der retrovirale Plasmidvektor kann einen Promotor zur Expression einer mutierten Cyclin G1-Protein Kodierungssequenz umfassen. Geeignete Promotoren, die verwendet werden können, umfassen retrovirales LTR; den SV40 Promotor; und den humanen Cytomegalovirus (CMV) Promotor, beschrieben in Miller u.a., Biotechniques, Bd. 7, Nr. 9, 980-990 (1989), oder jeden anderen Promotor (z.B. zelluläre Promotoren, wie beispielsweise eukaryontische zelluläre Promotoren, einschließlich-aber nicht ausschließlich-Histon-, pol III-, Cyclin G1- und β-Actinpromotoren), sind aber nicht darauf beschränkt. Andere virale Promotoren, die verwendet werden können, umfassen Adenoviruspromotoren, TK Promotoren und B19 Parvoviruspromotoren, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Auswahl eines geeigneten Promotors ist dem Fachmann aus den hier enthaltenen Informationen bekannt.
Der retrovirale Plasmidvektor mit dem Polynukleotid, das das mutierte Cyclin G1-Genkonstrukt umfasst, wird in eine Verpackungszelllinie mit Nukleinsäuresequenzen transduziert, die die gag, pol und env retroviralen Proteine kodieren. Beispiele für solche Verpackungszelllinien umfassen die PE501, PA317 (ATCC Nr. CRL 9078), Ψ-2, Ψ-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, ΨCRE, ΨCRIP, GP+E-86, GP-engvAm12 und DAN Zelllinien, wie in Miller, Human Gene Therapy, Bd. 1, Seiten 5-14 (1990) beschrieben, oder die 293T Zelllinie ( US-Patent Nr. 5,952,225 ), sind aber nicht darauf beschränkt. Der Vektor kann die Verpackungszellen durch jedes auf dem Fachgebiet bekannte Mittel transduzieren. Solche Mittel umfassen die Elektroporation, die Verwendung von Liposomen und die CaPO₄ Präzipitation, sind aber nicht darauf beschränkt. Solche Erzeugerzellen erzeugen infektiöse retrovirale Vektorpartikel, die das Polynukleotid aufweisen, das das mutierte Cyclin G1-Genkonstrukt umfasst.
Alternativ kann ein retrovirales Vektorpartikel erzeugt werden, das aufweist: das Polynukleotid, das das mutierte Cyclin G1-Genkonstrukt umfasst, ein erstes retrovirales Hüllprotein, das frei von nicht retroviralen Peptiden ist (das in einer Ausführungsform ein retrovirales Hüllprotein vom Wildtyp sein kann) und ein modifiziertes retrovirales HÜllprotein oder „Eskort" Protein, bei dem Aminosäurereste des retroviralen Hüllproteins vom Wildtyp entfernt und durch auf ein Ziel gerichtetes Protein oder -Peptid ersetzt wurden, das an ein gewünschtes Molekül bindet, wie beispielsweise einen zellulären Rezeptor oder eine extrazelluläre Komponente, wie beispielsweise eine extrazelluläre Matrixkomponente. Beispiele für extrazelluläre Matrixkomponenten, an die das auf das Ziel gerichtete Protein oder Polypeptid binden kann, umfassen Kollagen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Ein solches retrovirales Vektorpartikel kann erzeugt werden durch Transduktion einer Verpackungszelle, wie beispielsweise der oben beschriebenen, mit dem retroviralen Plasmidvektor, der das Polynukleotid umfasst, das das mutierte Cyclin G1-Protein kodiert, und mit einem geeigneten Expressionsvehikel, wie beispielsweise ein Plasmid, das ein Polynukleotid aufweist, das das modifizierte retrovirale Hüllpeptid kodiert. Die sich ergebende Erzeugerzelle erzeugt dann infektiöse retrovirale Vektorpartikel, die das erste retrovirale Hüllprotein frei von nicht retroviralen Peptiden, das modifizierte retrovirale Hüllprotein und das das Polypeptid kodierend für mutiertes Cyclin G1-Protein enthält.
In einer weiteren Alternative wird der retrovirale Plasmidvektor mit dem Polynukleotid, umfassend das mutierte Cyclin G1-Genkonstrukt, in eine Verpackungszelle transduziert, die Polynukleotide, die die gag und pol retroviralen Proteine kodieren, ein Polynukleotid, das ein ers tes retrovirales Hüllprotein frei von nicht retroviralen Peptiden kodiert, und ein Polynukleotid, das das modifizierte retrovirale Hüllprotein kodiert, aufweist. Die sich ergebende Erzeugerzelle erzeugt retrovirale Vektorpartikel, die das Polynukleotid aufweisen, das das mutierte Cyclin G1-Genkonstrukt, ein erstes retrovirales Hüllprotein frei von nicht retroviralen Peptiden und das modifizierte retrovirale Hüllprotein umfassen.
Die retroviralen Vektorpartikel werden an ein befallenes Tier in einer Menge verabreicht, die dahingehend wirksam ist, dass sie die abnormal proliferierenden Zellen hemmt, verhindert oder zerstört. Obwohl der Umfang der vorliegenden Erfindung nicht auf theoretische Schlussfolgerungen beschränkt sein soll, wird davon ausgegangen, dass das mutierte Cyclin G1-Protein mit nativem Cyclin G1-Protein um seinen cyclinabhängigen Kinasebindungspartner konkurriert, wodurch die Funktion von nativem Cyclin G1-Protein bei der Förderung der Zellteilung unterdrückt wird. Die Verabreichung der retroviralen Vektorpartikel kann durch systemische Verabreichung erfolgen, wie beispielsweise durch intravenöse, intraarterielle oder intraperitoneale Verabreichung, oder durch direkte Injektion der retroviralen Vektoren in den Tumor. Im Allgemeinen werden die retroviralen Vektoren in einer Menge von mindestens 10⁶ cfu/ml verabreicht und im Allgemeinen übersteigt eine solche Menge nicht 10¹¹ cfu/ml. Vorzugsweise werden die retroviralen Vektoren in einer Menge von etwa 10⁸ cfu/ml bis etwa 10⁹ cfu/ml verabreicht. Die genaue zu verabreichende Dosis hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, einschließlich dem Alter, Gewicht und Geschlecht des zu behandelnden Tiers oder Patienten und der Größe und Schwere des behandelten, erkrankten Gewebes (Tumor oder Organ).
Die retroviralen Vektoren können auch zusammen mit einem verträglichen pharmazeutischen Träger, wie beispielsweise Kochsalzlösung, Protaminsulfat (Elkins-Sinn, Inc., Cherry Hill, N.J.), Wasser, wässrigen Puffern, wie beispielsweise Phosphatpuffern und Tris Puffern, oder Polybren (Sigma Chemical, St. Louis, MO) verabreicht werden. Die Auswahl eines geeigneten pharmazeutischen Trägers soll für den Fachmann mit den hier erhaltenen Informationen als offensichtlich angesehen werden.
Demgemäß sieht die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines mutierten Cyclin G1-Proteins in der Medizin, die Verwendung eines Genkonstrukts, das ein mutiertes Cyclin G1-Protein kodiert, und die Verwendung eines Expressionsvehikels, umfassend ein solches Genkonstrukt der Erfindung und insbesondere die Behandlung von Tumoren und Krebs vor.
Weiterhin wird die Verwendung eines mutierten Cyclin G1-Proteins, die Verwendung eines Genkonstrukts, das ein mutiertes Cyclin G1-Protein kodiert, und die Verwendung eines Expressionsvehikels, das ein solches Genkonstrukt der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Krankheit, wie beispielsweise Tumoren und Krebs, umfasst, durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt.
In einer anderen Alternative können die oben beschriebenen retroviralen Vektoren oder ein Polynukleotid, das ein mutiertes G1-Protein kodiert, in Liposomen verkapselt werden. Die Liposomen, die die retroviralen Vektoren oder ein Polynukleotid, das ein mutiertes Cyclin G1-Protein kodiert, einkapseln, können einem Wirt zusammen mit einem pharmazeutischen Träger, wie oben beschrieben, verabreicht werden.
In einer anderen Alternative können retrovirale Erzeugerzellen, wie beispielsweise die von den oben beschriebenen Verpackungszelllinien stammenden, die ein Polynukleotid aufweisen, das das mutierte Cyclin G1-Genkonstrukt umfasst, einem Tier verabreicht werden. Solche Er zeugerzellen können in einer Ausführungsform systemisch (z.B. intravenös oder intraarteriell) an einer Stelle in nächster Nähe zum erkrankten Gewebe oder Organ verabreicht werden, oder die Erzeugerzellen können direkt dem erkrankten Gewebe oder Organ verabreicht werden. Die Erzeugerzelllinie erzeugt dann in-vivo retrovirale Vektoren, aufweisend ein Polynukleotid, das das mutierte Cyclin G1-Genkonstrukt umfasst, wodurch solche retroviralen Vektoren dann die abnormal proliferierenden Zellen des erkrankten Gewebes oder Organs transduzieren.
Pathologische Zustände und Krankheiten, die gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, umfassen nicht maligne sowie maligne oder kanzeröse Tumoren. Kanzeröse Tumoren, die behandelt werden können, umfassen osteogenes Sarkom und Ewing-Sarkom und andere neoplastische Störungen, bei denen Cyclin G1 exprimiert wird, wie beispielsweise Glioblastom, Neuroblastom, Brustkrebs, Prostatakrebs, Leukämien, Lymphome (einschließlich Hodgkin- und Non-Hodgkin-Lymphom), Fibrosarkom, Rhabdomyosarkom, Kolonkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Leberkrebs, wie beispielsweise hepatozelluläres Karzinom und Adenokarzinome, sind aber nicht darauf beschränkt.
Die obigen Tumorbehandlungen können auch in Kombination mit anderen Tumorbehandlungen verwendet werden, wie beispielsweise (i) Bestrahlung; (ii) Chemotherapie; oder (iii) der Transduktion von Tumorzellen mit einem Polynukleotid, das einen negativen selektiven Marker, wie beispielsweise ein virales Thimidinkinasegen, kodiert und anschließend durch die Verabreichung eines Interaktionsmittels, wie beispielsweise Ganciclovir, das die Zellen tötet, die mit dem den negativen selektiven Marker kodierenden Polynukleotid transduziert sind.
In einer Ausführungsform wird ein mutiertes Cyclin G1-Protein einem Wirt gemäß einem der oben beschriebenen Verfahren verabreicht. Das Wachstum von allen Tumorzellen, die das Agens enthalten, wird gehemmt, verhindert oder zerstört. Darüber hinaus werden die Tumorzellen mit einem Polynukleotid transduziert, das einen negativen selektiven Marker oder „Suizid"-Gen kodiert. Das den negativen selektiven Marker kodierende Polynukleotid kann in einem Expressionsvehikel, wie beispielsweise den oben beschriebenen, enthalten sein. Sobald Tumorzellen mit dem Polynukleotid transduziert sind, das den negativen selektiven Marker kodiert, wird dem Wirt ein Interaktionsmittel verabreicht, wodurch das Interaktionsmittel mit dem negativen selektiven Marker in Wechselwirkung steht, um das Wachstum der Tumorzellen zu hemmen, zu verhindern und zu zerstören.
Negative selektive Marker, die verwendet werden können, umfassen Thymidinkinase, wie beispielsweise Herpes Simplex Virus Thymidinkinase, Cytomegalovirus Thymidinkinase und Varicella Zoster Virus Thymidinkinase; und Cytosindeaminase, sind aber nicht darauf beschränkt.
In einer Ausführungsform ist der negative selektive Marker eine virale Thymidinkinase, die aus der Gruppe bestehend aus Herpes Simplex Virus Thymidinkinase, Cytomegalovirus Thymidinkinase und Varicella Zoster Virus Thymidinkinase ausgewählt ist. Wenn solche viralen Thymidinkinasen verwendet werden, ist das Interaktionsmittel oder das chemotherapeutische Agens vorzugsweise ein Nukleosidanalog, zum Beispiel eines, das aus der Gruppe bestehend aus Ganciclovir, Acyclovir und 1-2-Desoxy-2-fluor-β-D-arabinofuranosil-5-ioduracil (FIAU) ausgewählt ist. Solche Interaktionsmittel werden wirksam durch die viralen Thymidinkinasen als Substrate verwendet, und solche Interaktionsmittel werden daher letal in die DNA der Tumorzellen, die die vi ralen Thymidinkinasen exprimieren, eingebaut, was zum Tod der Tumorzellen führt.
In einer anderen Ausführungsform ist der negative selektive Marker Cytosindeaminase. Wenn Cytosindeaminase der negative selektive Marker ist, ist ein bevorzugtes Interaktionsmittel 5-Fluorcytosin. Cytosindeaminase wandelt 5-Fluorcytosin in 5-Fluoruracil um, das stark zytotoxisch ist. Daher wandeln die Tumorzellen, die das Cytosindeaminase-Gen exprimieren, das 5-Fluorocytosin in 5-Fluoruracil um und werden getötet.
Das Interaktionsmittel wird in einer Menge verabreicht, die dahingehend wirksam ist, dass sie das Wachstum der transduzierten Tumorzellen behindert, hemmt oder zerstört. Zum Beispiel kann das Interaktionsmittel einem Patienten in einer Menge von 5 mg bis 10 mg/kg Körpergewicht, abhängig von der Gesamttoxizität, verabreicht werden. Das Interaktionsmittel wird vorzugsweise systemisch verabreicht, wie beispielsweise durch intravenöse Verabreichung, durch parenterale Verabreichung, durch intraperitoneale Verabreichung oder durch intramuskuläre Verabreichung.
Wenn ein Expressionsvehikel, wie beispielsweise die oben beschriebenen, das einen negativen selektiven Marker aufweist, Tumorzellen verabreicht wird, kann es zu einem „bystander"-Effekt kommen, d.h. Tumorzellen, die nicht ursprünglich mit der Nukleinsäuresequenz transduziert wurden, die den negativen selektiven Marker kodieren, können nach Verabreichen des Interaktionsmittels getötet werden. Obwohl die Anmelder nicht auf theoretische Schlussfolgerungen beschränkt werden wollen, können die transduzierten Tumorzellen eine diffundierbare Form des negativen selektiven Markers erzeugen, der entweder extrazellulär auf das Interaktionsmittel wirkt oder von benachbarten, nicht transduzierten Tumorzellen aufgenommen wird, die dann für die Wirkung des Interaktionsmittel empfänglich werden. Es ist auch möglich, dass sowohl negativer selektiver Marker als auch das Interaktionsmittel zwischen Tumorzellen miteinander korrespondieren.
Das mutierte Cyclin G1-Protein kann auch verwendet werden, um nach invasiven vaskulären Verfahren, wie beispielsweise Angioplastie, vaskulärer Transplantation, wie beispielsweise arterieller Transplantation, oder koronarer Bypass-Chirurgie, eine vaskuläre Restenose zu verhindern. Daher wird ein Verfahren zum Hemmen einer Restenose zur Verfügung gestellt, das das Verabreichen von mutiertem Cyclin G1-Protein an ein Tier oder an die Stelle eines invasiven vaskulären Eingriffs oder einer vaskulären Läsion umfasst. Das mutierte Cyclin G1-Protein wird in einer Menge verabreicht, die dahingehend wirksam ist, dass eine Restenose beim Tier verhindert wird. Das mutierte Cyclin G1-Protein kann während oder nach dem invasiven vaskulären Verfahren verabreicht werden. Der Begriff „invasives vaskuläres Verfahren bzw. invasiver vaskulärer Eingriff", wie er hier verwendet wird, bedeutet jedes Verfahren, das die Reparatur, Entfernung, den Ersatz und/oder die Neuausrichtung (z.B. Bypass oder Abzweig) eines Abschnitts des vaskulären Systems beinhaltet, einschließlich – aber nicht ausschließlich – Arterien und Venen. Solche Verfahren umfassen Angioplastie, vaskuläre Implantate, wie beispielsweise arterielle Implantate, das Entfernen von Blutgerinnseln, das Entfernen von Arterien- oder Venenabschnitten und die koronare Bypass-Chirurgie, sind aber nicht darauf beschränkt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das mutierte Cyclin G1-Protein einem Tier durch Transduktion von vaskulären Zellen an der Stelle eines invasiven vaskulären Eingriffs oder einer vaskulären Läsion mit einem Polynukleotid, das ein mutiertes Cyclin G1-Genkonstrukt umfasst, verabreicht. Ein solches Polynukleotid kann in einem geeigneten Expressionsvehikel, wie oben beschrieben, enthalten sein, das an der Stelle eines invasiven vaskulären Eingriffs oder einer vaskulären Läsion in die Zellen transduziert wird. In einer Ausführungsform ist das Expressionsvehikel ein Virusvektor, wie beispielsweise die oben beschriebenen. In einer Ausführungsform ist der Virusvektor ein retroviraler Vektor, der wie oben beschrieben sein kann.
Wenn ein retroviraler Vektor verwendet wird, wird ein solcher retroviraler Vektor in einer oben beschriebenen Menge verabreicht und wird intravaskulär verabreicht. In einer Ausführungsform wird der retrovirale Vektor an der Stelle des invasiven vaskulären Eingriffs oder der vaskulären Läsion verabreicht. Die Vektoren transduzieren die vaskulären Zellen an der Stelle des invasiven vaskulären Eingriffs oder der vaskulären Läsion, wodurch das mutierte Cyclin G1-Protein in solchen Zellen erzeugt wird, um so die Funktion des nativen Cyclin G1-Proteins zu hemmen und somit die Restenose durch Hemmung der Proliferation von solchen Zellen zu verhindern.
Dieses Verfahren wird auf die Verhinderung und Behandlung einer Restenose und die Hemmung oder Behandlung von vaskulären Läsionen im Anschluss an eine Vielzahl von invasiven vaskulären Verfahren anwendbar, einschließlich – aber nicht ausschließlich – kardiovaskuläre Angioplastie, arterielle Implantate und koronare Bypass-Chirurgie. Dieses Verfahren wird auch auf die Hemmung und Behandlung von vaskulären Läsionen angewendet, einschließlich-aber nicht ausschließlich- Läsionen der femoralen Arterien, Karotis oder Nierenarterien, insbesondere der Nierenarterien in Verbindung mit Nierendialysefisteln.
Mutiertes Cyclin G1-Protein kann auch bei der Hemmung und/oder Behandlung von Hornhauttrübung oder Hornhautopazität verwendet werden, die in vielen Fällen durch Keratozytenproliferation bewirkt wird, sowie bei der Behandlung und/oder Hemmung von Katarakten. Daher wird ein Verfahren zum Hemmen oder Behandeln von Horn hauttrübung und/oder Katarakten zur Verfügung gestellt, das das Verabreichen eines mutierten Cyclin G1-Proteins an das betroffene Tier oder direkt an das betroffenen Auge umfasst. Das mutierte Cyclin G1 Protein wird in einer Menge verabreicht, die dahingehend wirksam ist, dass eine Hornhauttrübung oder Katarakte in einem Tier gehemmt oder behandelt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das mutierte Cyclin G1-Protein dem Tier durch Transduktion von Augenzellen („ocular cells) mit einem Polynukleotid, das das mutierte Cyclin G1-Genkonstrukt umfasst, verabreicht. Ein solches Polynukleotid kann in einem geeigneten Expressionsvehikel, wie oben beschrieben, enthalten sein. Das Expressionsvehikel wird in Augenzellen transduziert. In einer Ausführungsform ist das Expressionsvehikel ein Virusvektor, wie oben beschrieben. In einer Ausführungsform ist der Virusvektor ein retroviraler Vektor, der wie hier beschrieben sein kann.
Wenn ein retroviraler Vektor verwendet wird, kann ein solcher retroviraler Vektor systemisch (intravenös oder intraarteriell) in einer Menge von etwa 10 % des Blutvolumens oder von etwa 500 ml bis etwa 1.000 ml pro Dosis für Erwachsene mit einem Gewicht von 70 kg oder mehr verabreicht werden. Der retrovirale Vektor kann dem Auge auch topisch, wie beispielsweise in Form von Augentropfen, verabreicht werden. Der retrovirale Vektor kann auch intraokular verabreicht werden. Die Vektoren transduzieren Augenzellen, wie beispielsweise Keratozyten und/oder Linsenepithelzellen, wodurch die Funktion von nativem Cyclin G1-Protein gehemmt wird und so eine Hornhauttrübung oder Katarakte durch Hemmung der Proliferation von Keratozyten oder Linsenepithelzellen verhindert oder behandelt wird.
BEISPIELE
Die Erfindung wird nun im Hinblick auf die Beispiele beschrieben; allerdings soll der Umfang der vorliegenden Erfindung nicht dadurch eingeschränkt sein.
Beispiel 1:
Zellzerstörende und zytostatische Wirkungen eines mutierten Cyclin G1-Proteins in Krebszellen.
Materialien und Verfahren
Zellen, Zellkulturbedingungen, Plasmide und Vektoren, die Marker und Zellzykluskontrollgene tragen.
NIH3T3, 293T und MiaPaca2 humane Bauchspeicheldrüsenkrebs-Zellen wurden von ATCC bereitgestellt. NIH 3T3 und 293T Zellen wurden in Dulbecco Modifiziertes Eagle Medium gehalten, das mit 10 % fötalem Rinderserum ergänzt war (D10; Biowhittaker). Die Plasmide pcgp, die die viralen gag pol Gene enthielten, und ein retroviraler Vektor, pcnBg, der ein nukleär ausgerichtetes β-Galactosidasekonstrukt exprimierte, wurden freundlicherweise von Dr. Paula Cannon bzw. Dr. Ling Li zur Verfügung gestellt (USC Gene Therapy Laborstories, Los Angeles, CA). Das Plasmid mit dem vesikulären Stomatitisvirus G (VSVG) env Protein wurde freundlicherweise von Dr. Theodore Friedmann (University of California, San Diego, CA) zur Verfügung gestellt. Ein verkürztes (Aminosäuren 41-249) Cyclin G1 (dnG1) Konstrukt wurde in den retroviralen Expressionsvektor pREX kloniert.
Herstellung von auf die Matrix gerichteten retroviralen Vektoren, die mutante Cyclin G1 Konstrukte tragen.
Vektoren mit hohen Titern wurden mittels eines transienten, drei oder vier Plasmid-Kotransfektionssystems erzeugt (Soneoka u.a., Nucl. Acids Res., Seiten 628-633 (1995)), bei dem die Verpackungskomponenten gag-pol und ein chimäres, auf MLV basierendes env, das ein von einem von Willebrand- Faktor stammendes kollagenbindendes (auf die Matrix ge richtetes) Motiv trägt, das vom CMV Promotor exprimiert wurde, auf getrennten Plasmiden angeordnet wurden, die jeweils den SV40 Replikationsursprung enthielten. Die Vektoren, die ohne WT env exprimiert wurden, wurden mit Bv1 oder Hs2 bezeichnet (Bv = von Rinder vWF stammend; Hs = von humanem vWF stammend; LF oder 1 = Linker, die von natürlichen vWF Sequenzen stammten; LS oder 2 = Standard-Linker). Um den Virustiter weiter zu erhöhen, wurde ein fusogenes VSVG env Protein (Yee u.a., Methods Cell Biol., Bd. 43, Seiten 99-112 (1994)) mit Bv1 oder Hs2 env Proteinen in einem 4 Plasmid-Kotransfektionsprotokoll co-exprimiert.
Virustiter
Virustiter in NIH3T3 Mauszellen wurden wie zuvor beschrieben bestimmt, und zwar bezogen auf die Expression des β-Galactosidase- oder Neomycinphosphotransferaseresistenz-, neo^r, Gens (Skotzko u.a., Cancer Res., Bd. 55, Seite 5493-5498 (1995)). Der Virustiter wurde als Zahl der G418-resistenten Koloniebildungseinheiten (cfu)/ml exprimiert und lag im Bereich von 10⁶ bis 10⁸ cfu/ml, je nach der Beschaffenheit und Menge der Plasmid DNA, die im Transfektionsprotokoll verwendet wurde.
In vitro Wirksamkeitsstudien bzw. Effizienzstudien.
Um die zellzerstörenden/zytostatischen Wirkungen des dnG1 Vektors zu bewerten, wurden die transduzierten Zellen auf ihr proliferatives Potential hin durch Zählen der Anzahl an lebensfähigen Zellen in jeder Kultur in fortlaufenden Intervallen (bis zu 4 Tage) nach der Transduktion ohne G418 Selektion bestimmt. Eine Western Analyse einer endogenen und mutanten Cyclin G1-Proteinexpression wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Skotzko u.a., 1995).
In vivo Wirksamkeitsstudien bzw. Effizienzstudien
In vivo Wirksamkeitsstudien bzw. Effizienzstudien wurden in Übereinstimmung mit einem Protokoll durchgeführt, das durch das University of Southern California Institution Animal Care and Use Com mittee freigegeben war. Um die Wirksamkeit bzw. Effizienz einer gezielten Genabgabe auf der Grundlage der Antitumorwirkungen einer dnG1 Vektorbehandlung in vivo zu bewerten, wurde ein Lebermetastasemodell, das den Verbreitungsweg von humanem Kolonkrebs simulierte, in Nacktmäusen eingerichtet. Kurz gesagt, wurden 7 × 10⁵ Tumorzellen langsam in die Pfortader über einen Dauerkatheter infundiert, der 14 Tage an Ort und Stelle verblieb. Intrakatheterinfusionen von dnG1 Vektor entweder mit niedriger Dosis oder mit hoher Dosis (Titer: 3 × 10⁶ oder 9 × 10⁸ cfu/ml bei 200 μl/Tag) oder ein äquivalentes Volumen an phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) wurden drei Tage später begonnen und über insgesamt 9 Tage fortgeführt. Die Mäuse wurden durch zervikale Dislokation einen Tag nach dem Abschluss der Behandlung getötet.
Histologische und morphometrische Analyse.
Die Leberlappen wurden operativ entfernt, in 10 % Formalin fixiert, mit „A" für den rechten Lappen und den Lobus caudatus, mit „B" für den linken Lappen und „C" für den Lobus medianus markiert, getrennt aufbereitet und in Paraffinblöcke eingebettet. Die Antitumorwirksamkeit der dnG1 Vektorbehandlung wurde wie folgt bewertet: H & E gefärbte Gewebeschnitte wurden mit Lichtmikroskopie geprüft, und die Oberflächenbereiche von repräsentativen Leberschnitten und Tumorherden der Lappen A, B und C wurden durch morphometrische Analyse mit einem Optimas Bildanalysesystem gemessen. Die Bewertung der retroviralen Sicherheit beinhaltete die Bewertung der Unversehrtheit des Leberaufbaus, die Prüfung auf das Vorhandensein einer hepatozellulären Schwellung oder Nekrose, entzündliche Infiltrate, Cholestase und/oder Thrombose. Die Gewebeschnitte wurden auch auf Cytokeratin, humanes Cyclin G1, Apoptose, PAS, Vimentin und CD68 hin immungefärbt.
Statistische Analyse.
Für die in vivo Wirksamkeitsstudie wurden drei Behandlungsgruppen verglichen: Bv1/dnG1 niedriger Dosis (Titer: 3 × 10⁶ cfu/ml), Hs2/VSVG/dnG1 hoher Dosis (Titer: 9,5 × 10⁸ cfu/ml) und PBS Kontrolle. Aufgrund des Fehlens einer zellzerstörenden Aktivität in vitro und da ein Nullvektor abschließend in klinischen Versuchen nicht benutzt werden würde, wurde der Nullvektor nicht für in vivo Studien verwendet. Anfänglich wurden acht Mäuse untersucht; vier wurden mit einem dnG1 Vektor hoher Dosis behandelt und vier mit PBS. Anschließend wurden vier weitere Mäuse mit einem dnG1 Vektor niedriger Dosis behandelt. Die Reaktionsvariablen, die Gesamtfläche (S.A.) der Leber, die Gesamtfläche des Tumors, das Verhältnis der Gesamtfläche des Tumor zur Gesamtfläche der Leber und die mittleren Flächen der Tumorherde wurden vor der formalen Analyse log-transformiert. Eine wiederholte Messanalyse mit Lappen als wiederholtem Messfaktor wurde verwendet, um festzulegen, ob die Behandlung eine Wirkung auf jede der Reaktionsvariablen hatte oder nicht. Es wurde auch ein paarweiser Vergleich im Hinblick auf die sich ergebenden Variablen mit den gesamten p-Werten < 0,05 zwischen den Gruppen durchgeführt.
Ergebnisse
Ein mutantes humanes Cyclin G1 (dnG1) wurde mit einer Deletion in der Cyclin-Box erzeugt, einer konservierten Region unter den Cyclinen, die teilweise die Cyclin-Cdk Verbindung, die die Cdk Aktivierung hervorruft, bestimmt. In vorläufigen Studien wurde festgestellt, dass dnG1 anti-proliferative Eigenschaften in vaskulären glatten Muskelzellen zeigt. Diese Befunde legen nahe, dass dnG1 dahingehend wirken kann, dass es die Funktion von Wildtyp Cyclin G1 hemmt oder mit Cdk Zielmolekülen inaktive Komplexe bildet. Daher wurde die Leistung einer Reihe von zellzerstörenden mutanten Cyclin G1-Konstrukten in vitro getestet, um das optimale Konstrukt für weitere in vivo Studien zu bestimmen.
Eine humane undifferenzierte Krebszelllinie mit Bauchspeicheldrüsenursprung wurde als Prototyp eines metastatischen gastrointestinalen Krebs ausgewählt. Die retrovirale Transduktionseffizienz in diesen Krebszellen war ausgezeichnet und lag im Bereich von 26 % bis 85 %, je nach der Multiplizität der Infektion (4 bzw. 250; 1A). Für die Auswahl eines optimalen therapeutischen Gens wurden Zellproliferationsstudien in transduzierten Zellen mittels Vektoren durchgeführt, die verschiedene Cyclin G1-Konstrukte trugen. Die 1B zeigt die zellzerstörenden/zytostatischen Wirkungen von mutanten und Antisense Cyclin G1-Retrovirusvektoren in transduzierten Krebszellen. Unter Standardbedingungen zeigte der dnG1 Vektor durchweg die größte antiproliferative Wirkung zusammen mit dem Auftreten von immunreaktivem Cyclin G1 im Bereich von 20 kDa, was das dnG1 Protein darstellt (1C). Bezogen auf diese Ergebnisse wurde der dnG1 Vektor für anschließende in vivo Wirksamkeitsstudien ausgewählt.
Die histologische und immunzytochemische Bewertung von metastatischen Tumorherden von Mäusen, die entweder mit PBS oder dem dnG1 Vektor niedriger Dosis behandelt wurden, wurde durchgeführt und mit einem Optimas Bildsystem bewertet. Die 2 zeigt, dass das humane Cyclin G1-Protein in metastatischen Tumorherden stark exprimiert ist, wie durch die erhöhte Cyclin G1 nukleäre Immunreaktivität (braun färbendes Material) in den mit BPS behandelten Tieren (2A) nachgewiesen, und in den restlichen Tumorherden (2B) von Tieren, die mit dnG1 Vektor behandelt wurden. Die histologische Untersuchung von Leberschnitten von Kontrolltieren zeigte beträchtliche Tumorherde mit dazugehörigen Bereichen einer Angiogenese und Stromabildung (3A & C); die Epithelkomponenten färbten positiv auf Cytokeratin und damit verbundene tumorstromale/endotheliale Zellen färbten positiv auf Vimentin und den FLK Rezeptor (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu wurde die mittlere Größe von Tumorherden in den Tieren, die mit dnG1 niedriger Dosis behandelt wurden, im Vergleich zu den PBS Kontrollen signifikant verringert (3B & D, angegeben durch Pfeile; p = 0,001), was gleichzeitig eine fokale Erhöhung der Dichte von apoptotischen Kernen (3F & H; angegeben durch Pfeile) im Vergleich zur PBS Kontrollgruppe ( 3E) zeigt. Weiter wurde die Infiltration durch PAS +, CD68+ und mit Hämosiderin beladene Makrophagen (3D, angegeben durch Pfeil) in den restlichen Tumorherden von mit dnG1 Vektor behandelten Tieren beobachtet, was die aktive Beseitigung von degenerierenden Tumorzellen und Tumortrümmern durch das hepatische retikuloendotheliale System nahelegt.
Die morphometrische Analyse von Tumorherden bestätigte, dass die Zielstrategie für die therapeutische Genabgabe insofern effektiv war, als Pfortaderinfusionen (über Dauerkatheter) von auf die Matrix gerichteten dnG1 Vektoren hoher Dosis tiefgreifende Verringerungen der Tumorherdgröße im Vergleich zu den Kontrolltieren in Bezug auf alle Reaktionsvariablen (p < 0,005; Tabelle I) hervorrief. Beim paarweisen Vergleich für die drei sich ergebenden Variablen war eine dosisabhängige Tumorreaktion auf die Behandlung mit dnG1 Vektor offensichtlich, und es werden gegenwärtig zusätzliche Studien durchgeführt, um eine bessere Tumorreaktion auf verschiedene Vektordosen in Form von Tumorschrumpfung gegenüber dem vollständigen Verschwinden von Tumorherden zu bestimmen und um die minimal wirksame Vektordosis vorherzusagen, mit der die gewünschte Tumorreaktion in Gentherapieversuchen der Phase I/II erzielt werden kann. Es ist wichtig, dass kein Nachweis eines hepatozellulären Schadens, einer Nekrose, Thrombose oder Cholestase in Gewebeschnitten von mit dnG1 Vektor behandelten Tieren festgestellt wurde, was zeigt, dass der auf die Matrix gerichtete dnG1 Vektor (kumulative Dosis: 10⁶ bis 10⁹ cfu) eine große Sicherheitsmarge aufweisen kann.
Diskussion
Die in vivo Wirksamkeits- und Sicherheitsstudien wurden in einem einmaligen Nacktmäusemodell von Lebermetastasen durchgeführt und lieferten den prinzipiellen Beweis, dass (i) die therapeutische Genabgabe durch wiederholte Pfortaderinfusionen (über einen Dauerkatheter) von auf die Matrix gerichteten retroviralen Vektoren, die ein zellzerstörendes mutantes Cyclin G1-Konstrukt tragen, erzielt werden kann, wie durch statistisch signifikante Verringerungen der Tumorherdgrößen in mit dnG1 Vektor behandelten Mäusen im Vergleich zu denen von Kontrolltieren nachgewiesen, und (ii) auf die Matrix gerichtete dnG1 Vektoren systemisch mit einer großen Sicherheitsmarge verabreicht werden können, wie durch das Fehlen einer zugehörigen Hepatozytennekrose, Thrombose oder Cholestase angegeben. Zusammen genommen stellen diese Befunde einen entschiedenen Fortschritt in Richtung auf die Entwicklung von gezielten injizierbaren Gentherapievektoren für metastatischen Krebs dar.
Beispiel 2
Langfristige Hemmung der Neointimabildung in mit einem Ballon verletzten Rattenarterien durch intraluminale Instillation von auf die Matrix gerichteten retroviralen Vektoren, die ein zellzerstörendes Cyclin G1-Konstrukt tragen.
Dieses Beispiel zeigt die Hemmung einer Neointimabildung durch ein mutiertes Cyclin G1-Protein in einem vaskulären Restenosemodell der Ratte.
Materialien und Verfahren
Zellen und Zellkulturbedingungen.
A10 Zellen der glatten Muskulatur von Rattenaorta (ATCC CRL1476) wurden als subkonfluente Monoschichten in Dulbecco Modifiziertes Eagle Medium (DMEM) (Gibco BRL) gehalten, das mit 20 % fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt war.
Embryonale NIH 3T3 Mauszellen (ATC CRL 1658), humane 293T Zellen embryonale 293 Nierenzellen (freundlicherweise von Dr. Michele Galos, Stanford University, Palo Alto, CA zur Verfügung gestellt), transformiert mit SV40 großem T-Antigen, und humane Bauchspeicheldrüsentumorzellen MiaPaca2 (ATCC CRL 1420) wurden auf ähnliche Weise in DMEM, das mit 10 % FBS, Penicillin und Streptomycin ergänzt war, gehalten. Primäre Affenzellen der glatten Muskeln wurden aus geernteten gewöhnlichen Halsschlagadern (Karotisarterien) 7 Tage nach einer Verletzung durch einen Ballon durch Kultivieren von 2 mm arteriellen Segmenten in Williams E Medium (Gibco BRL), das mit 30 % FBS ergänzt war, hergestellt. Die arteriellen Segmente wurden nach der Wanderung der Zellen und deren Wachsen als anhaftende Monoschichtzellen an der Gewebekulturschale entfernt und die Zellen wurden weiter in Williams E Medium –20 % FBS gehalten. Nach dem Immunfärben mit einem monoklonalen Maus antihumanen glattmuskulären alpha-Aktin (DAKO) waren 95 % der von der Primärkultur geernteten Zellen positiv auf glattmuskuläres alpha-Aktin, was deren Ursprung anzeigt.
Plasmidkonstruktion.
Mutante Cyclin G1-Konstrukte (siehe 5), umfassend das 630 bp C-terminale Fragment (Nukleotide 121 bis 750) von Cyclin G1 cDNA, die die Aminosäuren 41 bis 249 kodiert (Wu u.a., 1994), wurden mittels PCR erzeugt, in den TA Vektor kloniert (Invitrogen), durch Sequenzierung bestätigt und in den retroviralen pG1XSvNa Vektor re-kloniert (Skotzko u.a., 1995). Das KpnI Fragment wurde durch Verdau des sich ergebenden Konstrukts erhalten, das die retrovirale Verpackungskomponentensequenz von pG1XSvNa plus die insertierte Cyclin G1 cDNA enthielt, und wurde in pRV109 kloniert (Soneoka u.a., 1995), um das retrovirale Expressionsplasmid, pG1DNT41bis249/REX, zu ergeben, das einen SV40 Replikationsursprung (ori) und den CMV Promotor enthält.
Expressionsplasmide von gag, pol, env und b-Galactosidaseproteinen
Expressionsplasmide von gag, pol, env und b-Galactosidaseproteinen – pcgp ist ein CMV gesteuertes Plasmid, das MLV gag und pol exprimiert. pcnBg ist ein Expressionskonstrukt von β-gal im retroviralen pREX Vektor, erzeugt durch schrittweisen Aufbau in pG1XSvNa und anschließend pRV109, wie beschrieben (Han u.a., J. Virol., Bd. 71, Seiten 8103-8108 (1997)). Sowohl pcgp als auch pcnBg wurden freundlicherweise von Dr. Paula Cannon (USC Gene Therapy Laborstories, Los Angeles, CA) zur Verfügung gestellt. Das Plasmid pCVG ist ein CMV gesteuertes Plasmid, das ein vesikuläres Stomatitisvirus G-Glycoprotein (VSV-G) exprimiert, das durch den Austausch des EcoRI Fragments von pCEE+ (MacKrell u.a., J.Virol., Bd. 70, Seiten 1768-1779 (1996)) durch das EcoRI Fragment von pHCMV-G (ein Geschenk von Theodore Friedman, U.C. San Diego), enthaltend die cDNA kodierend für VSV-G (Yee u.a., 1994), erzeugt wurde. CAEP ist ein CMV gesteuertes Plasmid, welches das amphotropische 4070A (CAE) MLV gp70 exprimiert, das ein auf die Matrix gerichtetes (d.h. Kollagenbindungsdomäne, CBD) Motiv enthält. CAEP wurde durch Einführen einer minimalen Kollagenbindungsdomäne (WREPGR[M]ELN), die vom humanen von Willebrand Faktor stammt (Takagi u.a., J. Biol. Chem., Bd. 266, Seiten 5575-5579 (1991)), in das retrovirale Hüllprotein an einer einzelnen PstI Kionierungsstelle, die in die n-terminale Domäne des reifen Proteins eingeführt wurde, erzeugt. Ein Methioninrest (M) wurde konservativ anstelle des Wildtyp Cysteinrests (C) in das minimale CBD eingeführt, was ansonsten die geeignete Bildung von intramolekularen Disulfidbindungen im chimären Hüllprotein stören würde (nicht veröffentlichte Daten).
Retrovirale Vektorherstellung.
Humane 293T Zellen wurden auf 10 cm Zellkulturschalen mit einer Dichte von 3 × 10⁶ Zellen pro Schale einen Tag vor der Transfektion ausplattiert. Transiente Kotransfektionen, die 15 mg pcgp, 10 mg pCVG, 5 mg CAEP und 15 mg entweder pcnBg oder pG1DNT41bis249/REX verwendeten, wurden mit dem Calciumphosphat/DNA Kopräzipitationsverfahren durchgeführt (Soneoka u.a., 1995). Die transfizierten Zellen wurden bei 37°C 16 Stunden lang inkubiert und durch 6 ml Medium, enthaltend 10 mM Natriumbutyrat, ersetzt, um die Herstellung von viralen Partikeln zu fördern. Ungefähr 10 bis 12 Stunden später wurde das Erzeugerzellkulturmedium durch 8,5 ml frisches Medium ersetzt und für weitere 24 Stunden Vektorproduktion inkubiert. Die sich ergebenden retroviralen Überstände wurden geerntet, durch 0,45 mM Filter filtriert, aliquotiert und vor der Verwendung bei 70°C gelagert.
Bestimmung von retroviralen Vektortitern.
NIH 3T3 Zellen wurden einen Tag vor der Transduktion auf 6-er Kulturplatten mit einer Dichte von 2,5 × 10⁴ Zellen pro Loch ausplattiert. Für die Zelltransduktion wurden seriell verdünnte retrovirale Überstände, enthaltend 8 μg/ml Polybren, den Zellkulturen zugesetzt und danach 2 Stunden bei 37°C inkubiert und anschließend wurde 2 ml frisches Medium zugegeben. 24 Stunden später wurden die Zellen durch frisches Medium, enthaltend 800 μg/ml G418, ersetzt und das Medium wurde alle 3 Tage ausgetauscht. Die G418 resistenten Kolonien wurden 10 Tage nach der Transduktion durch Fixieren in 10 % Formalin und Färben mit 1 % Methylenblau in 100 % Methanol gezählt. Die retroviralen Vektortiter wurden durch Multiplikation der Gesamtzahl von lebensfähigen Kolonien mit den Verdünnungsstufen der retroviralen Überstände, die auf die jeweiligen Zellkulturen angewendet wurden, bestimmt.
Bestimmung der Transduktionseffizienz in A10 Rattenzellen.
A10 SMCs wurden auf 6-er Kulturplatten mit einer Dichte von 3 × 10⁴ _Zellen pro Loch einen Tag vor der Transduktion ausplattiert. Seriell verdünnte retrovirale Überstände, enthaltend das β-gal Expressionskonstrukt, und 8 mg/ml Polybren wurden den Zellen zugesetzt. 72 Stunden später wurden die Zellen in 2 % Formaldehyd, 0,2 % Gluta raldehyd fixiert und mit 4 mM Kaliumferricyanid, 4 mM Ferrocyanid, 2 mM MgCl₂ und 400 mg/ml X-gal gefärbt. Die Transduktionseffizienzen wurden durch die prozentualen Anteile von Zellen bestimmt, die blau färbende Kerne zeigen.
Zellproliferationsassays in Vektor transduzierten Zellkulturen.
A10 Zellen wurden auf 12-er Kulturplatten mit einer Dichte von 1,4 × 10⁴ Zellen pro Loch ausplattiert. Nach der Anlagerung und Inkubation über Nacht wurden die Zellen in 0,5 ml der jeweiligen retroviralen Überstände, enthaltend 8 μg/ml Polybren, bei 37°C 2 Stunden lang inkubiert und anschließend 1 ml frisches Medium zugegeben. Die Zahl der lebensfähigen Zellen in jeder Behandlungsgruppe (dreifach hergestellt) wurde an aufeinander folgenden Tagen nach der Zelltransduktion bestimmt. Affen SMCs und MiaPaca2 Zellen wurden in ähnlicher Weise auf 24-Loch Zellkulturplatten mit einer Dichte con 3 × 10³ Zellen pro Loch ausplattiert. Wie oben beschrieben, wurden die Zellen mit 0,2 ml des retroviralen Überstands, enthaltend 8 μg/ml Polybren inkubiert, 0,5 ml frisches Medium wurde nach 2 Stunden zugesetzt und die Zahlen der lebensfähigen Zellen wurde durch Ernten der Zellkulturen an aufeinander folgenden Tagen bestimmt.
Antikörperproduktion und Reinigung
Um spezifische anti-Cyclin G1 Antikörper zu erzeugen, wurde ein synthetisches Peptid ([C]KHSYYRITHLPTIPEMVP), das 18 Reste am äußersten C-Terminus von humanem Cyclin G1 darstellt, synthetisiert, an Keyhole Limpet Hämocyanin (KLH) konjugiert und als Immunogen verwendet, um die polyklonalen Antikörper in Kaninchen zu erzeugen. Ein Cysteinrest [C] wurde dem N-Terminus des Peptids zugegeben, um die Einzelstellenkonjugation an KLH zu erleichtern. Die weitere Reinigung von polyklonalen anti-Cyclin G1-Antikörpern von Kaninchenimmunserum wurde durch Affinitätschromatographie wie folgt durchgeführt: Filtriertes Kaninchenserum wurde auf eine Affi-Gel 10 Säule geladen (Bio-Rad), die mit dem Cyclin G1 immunisierenden Peptid kovalent gekoppelt war. Nach ausgiebigem Waschen wurden gebundene Antikörper in Elutionspuffer (0,1 mM Glycin, pH 2,7) gesammelt und durch 1:10 Verdünnung mit 1 M TrisHCL (pH 8,0) in PBS neutralisiert. Spitzenfraktionen, enthaltend affinitätsgereinigte anti-Cyclin G1-Antikörper wurden gepoolt und vor der Verwendung bei –70°C gelagert.
Western Blot Analyse.
Ungefähr 15 mg lösliches Protein, erhalten als Detergenslysate von transduzierten Zellen wurde durch SDS-PAGE aufgetrennt. Das Gel wurde dann bei Raumtemperatur auf eine Membran aus Polyvinylidenfluorid (PVDF) (Millipore) bei 120 mA für 1,5 Stunden mittels eines Tris-Glycinpuffersystems (25 mM TrisHCl, pH 8,3, 192 mM Glycin, 15 % Methanol) übertragen. Die Membran wurde in 3 % Rinderalbumin in PBS für 1 Stunde vor der Inkubation mit dem primären Antikörper, verdünnt in Western Blotting Puffer (1 % BSA, 0,05 % Tween-20 in PBS, pH 7,4) für 30 Minuten blockiert. Die Membranen wurden mit PBS dreimal gewaschen und dann mit Alkaliphosphatase konjugierten sekundären Antikörpern für 30 Minuten inkubiert. Nach drei zusätzlichen Waschschritten mit PBS, wurde ein unlösliches Reaktionsprodukt in Gegenwart von 0,25 mg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP) und 0,5 mg/ml Nitroblautetrazolium (NBT) in Substratpuffer (100 mM TrisHCl, pH 9,5, 100 mM NaCl, und 5 mM MgCl₂) entwickelt.
Durch Retrovirus vermittelter Transfer des mutanten Cyclin G1 Konstrukts in einem vaskulären Restenosemodell bei Karotidverletzung der Ratte.
Gemäß einem Gentherapieprotokoll, das vom USC Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) unter allgemeiner Anästhesie (Ketamin 100 mg/kg, Rompun 10 mg/kg) freigegeben wurde, wurde ein 2F Intimax arterieller Embolektomiekatheter (Applied Medical Resources Corp) verwendet, um das Halsschlagaderendothel von 350 bis 450 g schweren Wistar Ratten freizulegen. Der Katheter wurde in die Halsschlagader eingeführt, die distal ligiert wurde, und in die große Halsschlagader eingeschoben. Der Ballon wurde auf einen Durchmesser von ~7 Einheiten aufgeblasen (französische Katheterskala) aufgeblasen und dreimal entlang der Halsschlagader geschoben. Nach einer Verletzung durch den Ballon wurde der Embolektomiekatheter entfernt und die Halsschlagader wurde transient abgeklemmt und 30 Minuten lang den retroviralen Vektoren ausgesetzt. Die Rattengruppen erhielten entweder eine Infusion von ~30 ml Kochsalzlösung (n = 6), retrovirale Vektoren mit mutantem Cyclin G1-Konstrukt (n = 9) oder Kontrollvektor (n = 8), wobei eine zusätzliche Gruppe von nicht behandelten Ratten als experimentelle Kontrollen (n = 7) dienten. Die Ratten wurden genau 4 Wochen später durch eine Überdosis Natriumpentobarbital (120 mg/kg IM) getötet. In Formalin fixierte Schnitte sowohl von nicht behandelten als auch mit Vektor behandelten Halsschlagadern wurden mit Verhoeff Elastinfärbung gefärbt, histologische Schnitte wurden mittels Lichtmikroskopie untersucht und die morphometrische Bewertung der Neointima- gegenüber der Medienoberflächengebiete wurde mittels eines Optimas Bildanalysesystems vorgenommen. Das Ausmaß der intimalen Hyperplasie wird als I:M Verhältnis ausgedrückt. Die Bedeutung der Unterschiede zwischen den I:M Verhältnisse von nicht behandelten, mit PBS behandelten und mit Vektor behandelten Arterien wurde durch einen paarweisen t-Test bestimmt.
Ergebnisse
Aufbau und Konstruktion von Cyclin G1-Konstrukten.
Es wurden mehrere Antisense Fragmente, die von humanen Cyclin G1-Sequenzen stammen (4), die hinsichtlich der Gesamtlänge und/oder Einarbeitung der stromaufwärtigen („upstream") Sequenzen variieren, konstruiert (5). Darüber hinaus wurde eine Reihe von mutierten Cyclin G1 Expressionskonstrukten konstruiert und auf ihr Potential für das Funktionieren in einer dominant-negativen Weise bewertet. Wie schematisch in der 5C gezeigt, wurden diese Expressionskonstrukte entweder mutiert oder verkürzt in Regionen, die die konservierte „Cyclin-Bo" Domäne umfassen, die bei der Bindung der Cycline an CDKs beteiligt ist (Lees und Harlow, Mol. Cell Biol., Bd. 13, Seiten 1194-1201 (1993)). Die zwei Punktmutanten, die als PM 61K/A bzw. PM 92E/A bezeichnet werden, stellen Modifikationen von Resten dar, die kritisch für den Kontakt mit Cyclin A-CDK2 sein sollen (Brown u.a., J. Biol. Chef., Bd. 267, Seiten 4625-4630 (1992); Jeffrey u.a., Nature, Bd. 376, Seiten 313-320 (1995)) und in humanem Cyclin G1 konserviert werden (Wu u.a., 1994).
Mittels einer komplexen (acht Stufen) Klonierungsstrategie (siehe 6) wurden verschiedene Antisense und mutante Cyclin G1-Konstrukte, die als (NotI/SalI flankierte) PCR Produkte hergestellt wurden, in die NotI/SalI Stellen von pBSKII (Stratagene) kloniert, um pG1/BSKII Konstrukte zu erzeugen, die anschließend herausgeschnitten und an diesen Klonierungsstellen in einen linearisierten retroviralen pG1XSvNa Vektor (Genetic Therapy, Inc.) ligiert wurden, um pG1G1SvNa Konstrukte zu erzeugen. Diese pG1G1SvNa Expressionsplasmide wurden (an zwei Stellen) mit KpnI verdaut und das sich ergebende Segment von pG1G1SvNa, einschließlich des experimentellen Cyclin G1 Konstrukts, flankiert durch LTR Promotor und Psi Verkapselungssequenzen, wurde in den retroviralen pRV109 Vektor (Soneoka u.a., 1995) ligiert, um die zusammengesetzten retroviralen Expressionsvektoren pG1/REX zu erzeugen. Die sich ergebenden pG1/REX Vektoren enthalten einen leistungsfährigen Hybrid 5' CMV/LTR Promotor, der das therapeutische Gen steuert, zusätzlich zu den SV40 ori Sequenzen und antibiotischen Resistenzgenen, die die Vektorproduktion erleichtern. Die Klonierung einer repräsentativen Cyclin G1-Punktmutante, PM61 K/A, in pREX ist in der 6 gezeigt.
Vergleichende zytostatische Wirksamkeit der Cyclin G1 Konstrukte.
Um die vergleichenden Wirkungen der verschiedenen Antisense und mutanten Cyclin G1-Konstrukte auf das Zellwachstum der glatten Muskeln zu untersuchen, wurde jedes der jeweiligen DNA Fragmente in geeigneter Ausrichtung in den retroviralen pREX Expressionsvektor kloniert (siehe oben), der anfänglich als transfizierbares Plasmid für die Screening Studien verwendet wurde. Calciumphosphattransfektionsexperimente wurden dreifach in A10 Zellkulturen von glatten Muskeln der Ratte durchgeführt, um die optimalen Cyclin G1 Knock-out Konstrukte für die anschließende Verwendung in Tierstudien zu bestimmen. Bei diesen Experimenten zeigten die Antisensekonstrukte mäßiger Länge, die als AS587 und AS693 bezeichnet wurden (siehe 7A), eine größere zellzerstörende Aktivität als das kürzere AS423 Konstrukt. Frühere Studien (mit pG1aG1SvNa Plasmiden) zeigten, dass die volle Kodiersequenz von humanem Cyclin G1 in Antisenserichtung relativ unwirksam war (Daten nicht gezeigt). Bezogen auf die Vergleichsbewertungen, wurde AS693, ein Konstrukt, das dieselben Kodierregionen wie AS587 (das zuvor in Tierstudien verwendet wurden: Skotzko u.a., 1995, Zhu u.a., Circulation, Bd. 96, Seiten 628-635 (1997)) umspannte und doch zusätzliche 5' Sequenzen aufweist, als wirksamster Antisense Aufbau angesehen. Unter den getesteten mutanten Cyclin G1-Konstrukten wurde festgestellt, dass ein bestimmtes mutantes Konstrukt DNT41bis249 und ein Punktmutantenkonstrukt, PM 61K/A, zumindest genauso wirksam wie die Antisense Konstrukte bei der Hemmung des Zellwachstums der glatten Muskulatur war. Die Wirksamkeit der Punktmutante PM 61K/A ist insofern interessant, als sie nahelegt, dass diese Aminosäure, Lys-61, kritisch für die physikalische Verbindung mit einer mutmaßlichen Cyclin G1-verbundenen Kinase (Smith u.a., Exp. Cell Res., Bd. 230, Seiten 61-68 (1997)) sein kann. Bezogen auf diese vergleichenden Screeningstudien, wurden DNT41-249 und PM 61K/A auch für die weitere Studie ausgewählt.
Charakterisierung von auf die Matrix gerichteten retroviralen Vektoren, die ausgewählte Cyclin G1 Konstrukte tragen.
Retrovirale Stammkulturen wurden von humanen 293T Zellüberständen mittels eines transienten vier Plasmid-Kotransfektionssystems erzeugt (angepasst von Soneoka u.a., 1995), wobei die Verpackungskomponenten gag-pol, das auf die Matrix gerichtete (CBD) env, das fusogene VSVG env und ein retroviraler, das gewünschte Cyclin G1 Konstrukt tragender Vektor, jeweils durch den CMV Promotor gesteuert, auf getrennten Plasmiden angeordnet wurden (8A). Die Western Analyse zeigte die gleichförmige Expression der zwei Hüllproteine in den retroviralen Erzeugerzellen und den stabilen Einbau in virale Partikel (8B), wie durch das Auftreten von MLV gp70 env und VSV-G Proteinimmunreaktivität angegeben, standardisiert im Hinblick auf das retrovirale gag Protein in gereinigten Vektorpräparaten.
Unter Verwendung dieser Hüllkonfiguration wurden infektiöse Titer von 10⁷ routinemäßig erzielt, wie durch die Expression der Neomycinresistenz (Cyclin G1-Konstrukte) oder ein β-Galactosidasemarkergen bestimmt. Um die Transduktionseffizienz der auf die Matrix gerichteten, VSVG pseudotypisierten retroviralen Vektoren in A10 SMCs von Ratten zu bestimmen, wurden die Zellen bei verschiedenen MOIs (im Bereich von 0,005 bis 500) transduziert, was eine tiefgreifende Konzentrationsabhängigkeit zeigt (siehe 8B) und was zeigt, dass 75 % bis 96 % der SMCs durch MOIs von 50 (Titer = 3 × 10⁶ cfu/ml) bis 500 (Titer = 3 × 10 cfu/ml) mit diesen auf die Matrix gerichteten Vektoren transduziert wurden.
Zytotoxizität und Wirkmechanismen der Cyclin G1 Konstrukte.
Frühere Studien der retroviral vermittelten Antisense Cyclin G1 Zytotoxizität (d.h. AS587) haben die Synzytienbildung in transduzierten Zellen (Zhu u.a., 1997) zusätzlich zum Zellzyklusarrest (Chef u.a., Hum. Gene Ther., Bd. 8, Seiten 1667-1674 (1997)) und zur offenkundigen Apoptose (Zhu u.a., 1997) beschrieben. Bemerkenswerterweise wurden die zytostatischen Wirkungen des mutanten Cyclin G1-Konstrukts auch von der Synzytienbildung bei A10 Zellkulturen von Ratten begleitet, die bei t = 48 Stunden nach der Transduktion mit dem pG1DNT41-249/REX Vektor (9) beobachtet wurde, was große multinukleierte Zellen zeigt, die morphologisch den mit den Antisense (AS587 und AS693) Konstrukten beobachteten ähnlich waren. Im Gegensatz dazu induzierten weder die Kontrolltransduktionsverfahren noch der Nullvektor (pREX) die Synzytienbildung in A10 Rattenzellen (9A-B), was nahe legt, dass die mutanten und Antisense Konstrukte die Lebensfähigkeit der Zellen auf ähnliche Weise beeinflussen. Die antiproliferativen Wirkungen der Cyclin G1 Knock-out-Konstrukte wurden in menschlichen Bauchspeicheldrüsenkrebszellen (8C) und in Affen SMCs (8D) bestätigt, in denen die vergleichende Wirksamkeit der DNT41-249 Expressionsmutante, wie festgestellt wurde, wieder größer als die potentesten Antisense-Konstrukte waren.
Um die Wirkmechanismen der jeweiligen Cyclin G1 Konstrukte zu begründen, wurde die Runterregulation der Cyclin G1-Proteinexpression durch Western Analyse von Zellen der glatten Muskulatur gezeigt, die mit dem AS693/REX Antisense Vektor transduziert waren. Wie in der 10A gezeigt, wird die Runterregulation der Cyclin G1 Expression in Affen SMC Kulturen beobachtet, die mit dem Antisense Vektor im Vergleich zu einem Kontrollvektor transduziert wurden, wobei eine maximale Hemmung bei t = 48 Stunden nach der Transduktion beobachtet wurde. Umgekehrt wurde die erzwungene Expression des Cyclin G1 Mutantenkonstrukts in A10 Zellen verifiziert, die mit dem Vektor transduziert wurden (10B), wie durch das Auftreten einer immunreaktiven Bande geeigneterweise bei ~20 kDa in transduzierten Zellkulturen gezeigt, die 24 und 48 Stunden nach der Transduktion mit dem mutanten Expressionsvektor beobachtet wurde. Obwohl die Demonstration der Vektorleistung bezogen auf das Ausrichten der Proteinexpression aussagekräftig ist, kann das Verhältnis von Zellen, die den vorhergesagten (zytotoxischen) Phänotyp zu einer bestimmten Zeit (vor dem Zelltod) transient exprimieren, klein sein. In Akut-Untersuchungen von durch einen Ballon verletzten Arterien in vivo wird eine Hochregulation der Cyclin G1 Proteinexpression in neointimalen SMCs beobachtet. Diese charakteristische Hochregulation der Cyclin G1-Expression wurde in den durch einen Ballon verletzten Arterien, die entweder mit dem Nullvektor (11A), der PBS Kontrolle (11B) oder dem mutanten Expressionsvektor (8D) behandelt wurden, nicht verringert. Im Gegensatz dazu war die deutliche Runterregulation der Cyclin G1-Expression in den mit Antisense Cyclin G1 (AS693/REX) Vektor behandelten Arterien offensichtlich. Zusammen genommen zeigen diese Daten, dass die zellzerstörenden Wirkungen der Cyclin G1 Konstrukte von der direkten Modulation der Cyclin G1- Expression in transduzierten Zellen herrühren.
Bewertung von pDNTG1/REX in einem Rattenmodell von vaskulärer Restenose.

Schließlich hemmte in zwei kontrollierten einmonatigen in vivo Wirksamkeitsstudien die intraluminale Instillation eines auf die Matrix gerichteten VSVG pseudotypisierten Vektors, der die N-terminale Deletionsmutante von Cyclin G1 (DNT41-249/REX) trug, in durch einen Ballon verletzten Rattenarterien die Neointimaläsionsbildung im Vergleich zum Nullvektor, zur Kochsalzlösungskontrolle und zur verletzten/unbehandelten Gruppe (12). Anders als die zytotoxische HStk Vektor (plus Ganciclovir) Strategie, die eine massive Narbenbildung und Deformierung des Gefäßes (nicht veröffentliche Beobachtungen) erzeugte, gab es keinen Beweis für eine Nekrose, Fibrose oder Deformation der Arterienwand in den mit DNT41-249/REX Vektor behandelten Arterien, wodurch die relative Sicherheit dieses Ansatzes bestätigt wird. Darüber hinaus zeigen die langfristigen (30 Tage) Wirksamkeitsdaten (Tabellen 1 und 2), dass sich wenig bis kein „Nachholert" des SMC Wachstums in den neointimalen Läsionen in den mit DNT41-249/REX Vektor behandelten Tieren entwickelte, was nahe legt, dass die gezielte Transduktion und Expression eines zellzerstörenden Cyclin G1 Mutantenproteins in aktivierten SMC einen erheblichen Einfluss auf die zelluläre Dynamik haben kann, die für die krankhaften Spätschäden der vaskulären Restenose verantwortlich ist. Tabelle 1 Hemmung der Neointimaläsionsbildung mittels eines auf die Matrix gerichteten retroviralen Vektors, der ein zellzerstörendes mutantes Cyclin G1-Konstrukt trägt, in einer einmonatigen Wirksamkeitsstudie

Behandlungsgruppe	Mittleres Intima:Medien-Verhältnis	KonfidenzIntervall	% Hemmung
Nur Verletzung	1,41	1,10-1,71
Kochsalzlösung	1,24	0,92-1,56
Nullvektor	1,25	0,92-1,57
dnG1 Vektor	0,62 p = 0,002 gegenüber nur Verletzung p = 0,012 gegenüber Kochsalzlösungskontrolle p = 0,011 gegenüber Null-vektor	0,28-0,96	56 % gegenüber Verletzung 50 % gegenüber Kochsalzlösung 50 % gegenüber Null

¹ Die Intima:Medien-Verhältnisse der Kontrollgruppen (nur Verletzung, Kochsalzlösung und Nullvektor) waren nicht deutlich anders.
² Die mit dnG1 Vektor behandelte Gruppe wurde mit drei Kontrollgruppen verglichen. Paarweise Vergleiche wurden für die sich ergebenden Variablen durchgeführt (Initma:Medien-Verhältnis).

Behandlungsgruppe	Mittleres Intima:Medien-Verhältnis	Standardabweichung	% Hemmung
Nur Verletzung	1,44	0,07
Kochsalzlösung	1,39	0,15
Nullvektor	1,50	0,17
dnG1 Vektor	0,96 p = 0,001 gegenüber nur Ver-letzung p = 0,020 gegenüber Kochsalz-lösungskontrolle p = 0,010 gegenüber Nullvektor	0,11	33 % gegenüber Verletzung 31 % gegenüber Kochsalzlösung 36 % gegenüber Null

¹ Die Intima:Medien-Verhältnisse der Kontrollgruppen (nur Verletzung, Kochsalzlösung und Nullvektor) waren nicht deutlich anders.
² Die mit dem dnG1 Vektor behandelte Gruppe wurde mit drei Kontrollgruppen verglichen. Paarweise Vergleiche wurden für die sich ergebende Variable durchgeführt (Initma:Medien-Verhältnis).

Diskussion
Die vorliegende Offenbarung zeigt die Nützlichkeit für die Verwendung eines mutanten Cyclin G1-Proteins, um die Funktion des normalen „Ebenbilds" dominant zu hemmen. Eine solche Anwendung eines mutierten Proteins hat den doppelten Vorteil, dass die Funktion der nahe ver wandten (redundanten) Elemente blockiert und ein feststellbares Genprodukt erzeugt wird (siehe 10). Hier zeigten eine Deletionsmutante und eine Punktmutante von Cyclin G1 demonstrierbare antiproliferative Eigenschaften, die mindestens so wirksam wie die meisten potenten Antisense Cyclin G1 Konstrukte waren. Die auf die Matrix ausgerichteten retroviralen Vektoren, die ein ausgewähltes mutantes Cyclin G1 Konstrukt trugen (DNT 41-249), wurden anfänglich in vitro getestet, wo eine tief greifende Hemmung des Zellwachstums beobachtet wurde. In vergleichbarer Weise zu den Antisense Cyclin G1 Konstrukten (Zhu u.a., 1997) erzeugte das dominant-negative Cyclin G1 Konstrukt eine Synzytienbildung und ungeplante Apoptose in transduzierten SMCs, was eine mechanistische Ähnlichkeit nahe legt.
Zusätzlich zu den therapeutischen Genkonstrukten wurden wesentliche Verbesserungen der Effizienz der retroviral vermittelten Genabgabe an verletzte Arterien durch die Einarbeitung von Matrixzieltechnologie in die viralen Partikel ermöglicht (siehe unten), die zur Erhöhung der Vektor-Bioverfügbarkeit diente. Neuere Fortschritte bei der retroviralen Vektorzieltechnologie haben gezeigt, dass die physiologische Überwachungsfunktion, die der primären Struktur des von Willebrand Faktors inhärent ist (Montgomery u.a., Hemophilia and von Willebrand Disease, Kapitel 44, Seiten 1631-1675, W.B. Saunders Co., Philadelphia (1998); Ginsburg, D., u.a., Proc. Nat. Asal. Sci., Bd. 86, Seiten 3723-3727 (1989); Ruggeri & Zimmerman, Blood, Bd. 70, Seiten 895-904 (1987)) an die Entwicklung der auf die Matrix gerichteten retroviralen Vektoren angepasst werden kann (Hall u.a., Human Gene Therapy, Bd. 8, Seiten 2183-2192 (1997); Anderson, Nature, Bd. 392 (Ergänz.), Seiten 25-30 (1998)). Die Konstruktion und Einführung eines von vWF stammenden Matrixziel- (d.h. Kollagenbindungs-) Motivs in die retrovirale Hülle erhöht die Genabgabe in vivo durch Ausstatten des auf MLV basierenden Vektors mit einem günstigen Funktionszuwachs-Phänotyp, d.h. Hochaffinitätsbindung an die extrazellulären Matrixkomponenten, die durch die Ballonkatheterverletzung freigelegt sind. Die auf die Matrix gerichteten amphotropischen Hüllen, die in diesen Studien verwendet wurden (siehe Hall u.a., 2000) ersetzen die ursprünglichen ekotropischen (nagetierspezifischen) Vektoren, die, wie zuvor gezeigt wurde, sich an Stellen der vaskulären Verletzung (Hall u.a., 1997) ansammeln und die wirksame Transduktion der residenten SMCs in zweiwöchigen Wirksamkeitsstudien von Antisense Cyclin G1 ermöglichen (Zhu u.a., 2000; eingereicht). Insofern als die Aktivierung und Proliferation von medialen SMCs innerhalb von Stunden nach der Verletzung beginnt, tritt die Wanderung in das Neointima am Tag 4 auf (Clowes u.a., Lab. Invest., Bd. 49, Seiten 327-373 (1983), Clowes u.a., Circ. Res., Bd. 56, Seiten 139-145 (1985)) und wird die Replikation über die nächsten 2 Wochen deutlich erhöht (Schwartz u.a., 1995; DeMeyer und Blut, 1997). Die Vektorpenetration und zelluläre Transduktion wurde weiter durch intraluminale Instillation der auf die Matrix gerichteten amphotropischen Vektoren (i) zur Zeit der Ballonverletzung (Zhu u.a., 1997) und (ii) sieben Tage nach der Angioplastie (Hall u.a., 2000) optimiert, wenn die SMC Wanderung und Proliferation in der Neointima maximal ist.
In der vorliegenden Offenbarung wurde ein transientes Transfektionssystem, das von Soneoka u.a., 1995 angepasst wurde, verwendet, um retrovirale Vektoren mit hohem Titer zu erzeugen, wobei die Expression der Verpackungskomponenten sowie das therapeutische Gen durch den starken CMV Promotor gesteuert werden; und jedes der Konstrukte enthält einen SV40 Replikationsursprung (ori), der zur Erleichterung der Plasmidexpression in humanen 293T Erzeugerzellen dient. Virale Titer im Bereich von 3 × 10⁶ - 3 × 10⁸ cfu/ml wurden routinemäßig mit diesen Reagenzien erzielt. Darüber hinaus verbesserte die Koexpression des fusogenen VSVG env Proteins (Iida u.a., J. Virol., Bd. 70, Seiten 6054-6059 (1996); Laitinen u.a., Hum. Gene Ther., Bd. 8, Seiten 1645-1659 (1997), Yu u.a., Gene Therapy, Bd. 6, Seiten 1876-1883 (1999)) weiter die viralen Titer (bis 9 × 10⁸ cfu/ml) ohne zusätzliche Vektorkonzentration, um so die Vektorproduktion und Charakterisierung der potenziellen therapeutischen Konstrukte zu erleichtern.
Zusammen ermöglichten diese Verbesserungen des Aufbaus, der Konstruktion und des Einsatzes des retroviralen Vektors die Entwicklung eines optimierten Gentherapieprotokolls und die Leistung der langfristigen Wirksamkeit bei der Verhinderung der Neointimabildung im Rattenmodell der Ballonangioplastie (siehe Tabelle 1). In zwei kontrollierten einmonatigen Wirksamkeitsstudien, führte die intraluminale Abgabe eines auf die Matrix gerichteten dnG1 retroviralen Vektors an die durch einen Ballon verletzte Rattenhalsschlagader zu einer ~50 % Hemmung der Neointimaläsionsbildung, ohne irritierendes „Aufholen" des SMC Wachstums, einer Reaktionsgröße, die nur durch ein anderes Medikament, einen Proteinkinase C Inhibitor (Prescott u.a., Ann. N.Y. Acad. Sci., Bd. 878, Seiten 179-190 (1999)) und einen adenoviralen Vektor, der ein salpetersaures Oxidsynthasekonstrukt trug (Shears u.a., J. Am. Coll. Surg., Bd. 187, Seiten 295-306 (1999)), hervorgerufen wurde. Anders als die HStk Vektoren (gefolgt von einer Ganciclovir-Verabreichung), die eine unpassende Verzerrung der arteriellen Histologie erzeugen (Nabel, Nature, Bd. 362, Seiten 844-846 (1993)), bestätigt das offensichtliche Fehlen einer Nekrose, Fibrose und Deformation der Arterienwand in mit dnG1 Vektor behandelten Arterien (siehe 12) die Sicherheit dieses Ansatzes für die klinische in vivo Anwendung. Zusammenfassend kombiniert diese Studie die signifikanten Verbesserungen der therapeutischen Cyclin G1 Konstrukte mit den Fortschritten in der Matrixzieltechnologie, der Vektorproduktionsmethodik und den Instillationsprotokollen, um die Nützlichkeit der zellzerstörenden Gentherapie auf die Behandlung einer vaskulären Restenose auszudehnen.
Beispiel 3 Systemische Verabreichung eines auf die Matrix gerichteten retroviralen Vektors ist für die Krebsgentherapie in Mäusen wirksam
Materialien und Verfahren
Zellen, Zellkulturbedingungen, Plasmide und Vektoren, die Marker und Zellzykluskontrollgene tragen.
NIH3T3, 293T und humane MiaPaca2 Bauchspeicheldrüsenkrebszellen wurden von der ATCC geliefert. NIH 3T3 und 293T Zellen wurden in Dulbecco Modifiziertes Eagle Medium gehalten, das mit 10 % fötalem Rinderserum ergänzt war (D10; Biowhittaker, Walkersville, MD, USA). Die Plasmide pcgp mit den viralen gag pol Genen und ein retroviraler Vektor, pcnGb, die ein auf den Kern gerichtetes b-Galactosidasekonstrukt exprimieren, wurden freundlicherweise von Dr. Paula Cannon bzw. Dr. Ling Li zur Verfügung gestellt (USC Gene Therapy Laborstories, Los Angeles, CA). Ein verkürztes (Aminosäuren 41-249) Cyclin G1 (dnG1) Konstrukt wurde in den retroviralen Expressionsvektor pREX kloniert, der aus pHIT109 (Soneoka u.a., Nucl. Acid Res. 23, 628-633, 1995) modifiziert wurde, um die retrovirale Verpackungskomponentensequenz von G1XSvNa zu enthalten (ein Geschenk von Genetic Therapy, Inc., Gaithersburg, MD, USA).
Herstellung von auf die Matrix gerichteten retroviralen Vektoren, die mutante Cyclin G1 Konstrukte tragen.
Vektoren mit hohem Titer wurden unter Verwendung eines transienten drei oder vier Plasmid-Kotransfektionssystems erzeugt (Soneoka u.a., Nucl. Acid Res. 23, 628-633, 1995), in dem die Verpackungskomponenten gag-pol und ein chimäres amphotropisches Moloney Mausleukämievirus (MuLV) basiertes env mit einem von einem von Willebrand Faktor stammenden Kollagenbindungs- (auf die Matrix gerichtetes) Motiv, das vom CMV Promotor exprimiert wurde, und ein retroviraler Vektor auf getrennten Plasmiden angeordnet wurden, die jeweils den SV40 Repli kationsursprung enthielten. Die Vektoren werden als Mx-nBg, Mx-dnG1 und CAE-dnG1 bezeichnet, um die spezifische verwendete Hülle und das in jedem Vektor eingearbeitete Genexpressionskonstrukt anzugeben. Mx-nBg stellt einen modifizierten MuLV bezogenen Vektor dar, der ein Matrixzielmotiv in der Hülle trägt, und ein auf den Kern gerichtetes b-Galactosidasegen. Mx-dnG1 ist ein auf die Matrix gerichteter zellzerstörender Vektor, der das N-terminale Deletionsmutanten Cyclin G1 Konstrukt trägt (Gordon u.a., Cancer Res. 60, 3343-3347, 2000). CAE-dnG1 ist ein nicht gerichteter Vektor, der eine auf amphotropischem Wildtyp-MuLV beruhende Hülle trägt (Morgan u.a., J. Virol. 67, 4712-4721, 1993) sowie dasselbe zellzerstörende Cyclin G1 Konstrukt wie in MxdnG1.
Virale Titer
Virale Titer in NIH3T3 Mauszellen wurden wie zuvor beschrieben bestimmt, und zwar basierend auf der Expression des β-Galactosidase oder Neomycinphosphotransferase Resistenz-, neo^r, Gens (Skotzko u.a., Cancer Res. 55, 5493-5498, 1995). Der virale Titer wurde als Zahl der G418-resistenten Koloniebildungseinheiten (cfu)/ml exprimiert und lag im Bereich von 10⁷ bis 10⁸ cfu/ml.
In vivo Wirksamkeitsstudien.
Diese Studien wurden gemäß einem Protokoll durchgeführt, das vom University of Southern California Institution Animal Care and Use Committee genehmigt war. Um die Wirksamkeit der gezielten Genabgabe bezogen auf die Antitumorwirkungen der Mx-dnG1 Vektorbehandlung in vivo zu bewerten, wurden subkutane Tumorxenotransplantate in athymischen nu/nu Mäusen durch subkutane Implantation von 1-9 × 10⁷ humanen MiaPaca2 Krebszellen vorgenommen. Wenn die Tumore eine Größe von ~50 mm³ erreichten, wurde 200 μl entweder des Mx-dnG1 Vektors (Titer: 8 × 10⁶ cfu/25 gm Maus), des Mx-nBg Kontrollvektors mit ähnlichem Titer, eines nicht-gerichteten CAE-dnG1-Vektors oder einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) Placebokontrolle täglich ü ber 7-10 Tage (ein Behandlungszyklus) direkt in die Schwanzvene injiziert. Die Tumorgröße wurde alle 2-4 Tage mit einer Schieblehre mittels der Formel zur Berechnung des Volumens von ellipsoiden Gegenständen gemessen: Tumorvolumen, mm³ = 4/3 p r₁ r₂ r₃. Die Mäuse wurden durch zervikale Dislokation einen Tag oder eine Woche nach der Vollendung von einem bzw. zwei Behandlungszyklen getötet.
Apoptoseassay.
Gewebeschnitte von Tumorknoten wurden hinsichtlich der Induktion der Apoptose mittels des Apoptag Kits (Intergen, Purchase, NY, USA) bewertet. Schnell gefrorene Tumorknoten wurden mit Paraformaldehyd fixiert und ihre Membranen mit Ethanol und Essigsäure permeabilisiert. Das TdT Enzym wurde zugesetzt und anschließend ein Anti-Didoxygeninperoxidasekonjugat zugegeben. Die Gewebeschnitte wurden dann mit Peroxidasesubstrat gefärbt und mit Methylgrün gegengefärbt.
Statistische Analyse.
(i) Um die Änderung des Tumorgewebes im Verlauf der Zeit zusammenzufassen (Tumorwachstumsrate), wurde eine gerade Linie der kleinsten Quadrate an die log-transformierten Werte angepasst; d.h. für jede Maus wurde die Steigung mittels der ersten 5 Messungen im Verlauf der Zeit beurteilt. Diese berechneten Steigungen wurden zurück in die ursprüngliche Skala mit dem Antilogarithmus transformiert und stellen die Durchschnittsrate des Tumorwachstums (%) pro Tag dar. Um die unterschiedlichen Vektoren in jedem der drei Experimente zu vergleichen, wurde eine gewichtete Varianzanalyse mit den beurteilten Steigungen als abhängige Variable verwendet. Für jede Maus war das Gewicht reziprok zur Summe des Standardfehlers der beurteilten Steigung (wie in der ersten Analyse der geraden Linie der kleinsten Quadrate) plus einer Beurteilung der Steigung-Steigung-Varianz bezogen auf alle drei Experimente. Für die Experimente I und II wurde der F-Test basierend auf der Varianzanalyse verwendet, um die Mx-nBg und Mx-dnG1 Vektoren zu verglei chen, und für das Experiment III wurde der F-Test und danach die geringste signifikante Differenzmethode der mehrfachen Vergleiche verwendet, um den Mx-dnG1 mit dem CAE-dnG1 Vektor und Placebobehandlungen zu vergleichen. Die kombinierten Ergebnisse der analysierten Daten sind in der Tabelle 3 gezeigt. (ii) Das Kaplan Meier Produktbegrenzungsverfahren (Kaplan & Meier J. Amer. Statist. Assoc. 53, 457, 1958) wurde verwendet, um die Wahrscheinlichkeit der Tumorvervierfachung als Funktion der Zeit (Tage) zu beurteilen. (iii) Der Tarone Trendtest (bezogen auf den logrank-Test; Tarone, Biometrika 62, 679, 1975) wurde verwendet, um die Vervierfachungszeiten der mit Placebo (PBS) behandelten Gruppe, der Gruppe, die mit nicht-gerichtetem CAE-dnG1 Vektor behandelt wurde, und der Gruppe, die mit auf die Matrix gerichteten Mx-dnG1 Vektor behandelt wurde, zu vergleichen.
Ergebnisse
In kurzfristigen Wirksamkeitsstudien fingen intravenöse Infusionen entweder von dem Mx-nBg Vektor, dem nicht-gerichteten CAE-dnG1 Vektor oder dem zellzerstörenden Mx-dnG1 Vektor (jeder Vektor = ~8 × 10⁶ cfu/Dosis) oder einem äquivalenten Volumen an PBS Placebo sechs Tage nach der Implantation von 1-9 × 10⁷ humanen MiaPaca2 Bauchspeicheldrüsenkrebszellen an und wurden täglich bei einem Teil der Mäuse für insgesamt 7 Vektorinfusionen fortgeführt. Das progressive Wachstum der Tumorgröße wurde in Mäusen beobachtet, die mit dem Mx-nBg Vektor (13), dem nicht-gerichteten CAE-dnG1 Vektor und Placebo PBS (Tabelle 3) behandelt wurden. Im Gegensatz dazu wurde die Tumorregression in Tieren beobachtet, die mit dem Mx-dnG1 Vektor behandelt wurden (13; Tabelle 3). Das immunhistochemische Färben zeigte eine intensive nukleäre Immunreaktivität für das humane Cyclin G1 Protein, das in den großen Tumoren der mit Kontrollvektor behandelten Mäuse exprimiert wurde, während eine Schwächung der Cyclin G1 Expression in den Rest-Tumoren von mit Mx-dnG1 Vektor behandelten Tiere beobachtet wurde.
Um die Wirksamkeit der Genabgabe in solide Tumore durch auf die Matrix gerichtete retrovirale Vektoren zu bewerten, wurden zwei Untergruppen der Tiere getötet, nachdem sieben Vektordosen verabreicht worden waren (13). Die histopathologische Untersuchung von mit Hämatoxylin & Eosin gefärbten Tumorgewebeschnitten von Tieren, die mit dem Mx-nBg Kontrollvektor behandelt wurden, zeigte Tumorknoten, die aus einer heterogenen Population von Tumor und tumorassoziierten Zellen bestanden, d.h. einem Hauptanteil an malignen epitheloiden Zellen mit einer relativ hohen mitotischen Rate mit intervenierenden Bereichen von aktiver Angiogenese, die von einer dünnen Bindegewebekapsel umgeben waren. Im Gegensatz dazu bewiesen die Tumorknoten von den mit Mx-dnG1 Vektor behandelten Tieren eine massive Tumorzerstörung, ein hohes Auftreten an Apoptose in den verbleibenden Tumorzellen und eine reaktive stromale Hyperplasie. Eine Zahl von Tumorknoten zeigte große zentrale Nekrosebereiche, eine Zwischenzone an aktivem Tumor und eine Randzone, die eine Fülle von apoptotischen Zellen enthielt. Andere sich auflösende Tumorknoten wurden fast vollständig von dichtem Bindegewebe umgeben, was einen beträchtlichen Anteil der Rest-Tumoren erklärte, die kleine Regionen der offenkundig apoptotischen Zellen und verschiedene Grade an akuter und chronischer Entzündung zeigten.
Die Transduktionseffizienz wurde durch immunhistochemische Anfärbung der Tumorknoten mittels eines monoklonalen Mausantikörpers bestimmt, der gegen das b-Galactosidaseantigen gerichtet war (GAL-40, Sigma, St. Louis MO, USA), gefolgt von der Analyse mittels eines Optimas Bildsystems (Optimas Corporation, Bothell, Washington, USA). Die Transduktionseffizienz (ausgedrückt als %) wurde durch Zählen der Anzahl von b-Galactosidase positiven Zellen in drei hohen Kraftfeldern pro Tumorknoten geteilt durch die Gesamtzahl der Zellen × 100 bestimmt. Ein hohes Transduktionsniveau der Zellen (35,7 ± 1,4 %; Tabelle 4) wurde über die ganzen Tumorknoten in mit Mx-nBg Vektor behandelten Tieren beobachtet.
Um weiter die hohe Transduktionseffizienz zu untersuchen, die in den Tumorknoten beobachtet wurden, wurde eine Vektorverteilungsstudie durch intravenöse Injektion des Mx-nBg Vektors eine Stunde und 24 Stunden vor Tötung der Tiere durchgeführt. Immunhistochemische Anfärbung für das retrovirale Hüllprotein mittels des monoklonalen 83A24 Rattenantikörpers zeigte, dass die Ansammlung der Vektorpartikel bei 1 Stunde in angiogenen Bereichen ausgeprägt war, die über den Tumorknoten verflochten sind, während für die Vektorpartikel keine Immunreaktivität bei 24 Stunden beobachtet wurde, was zeigt, dass der virale Eintritt in den Tumor und die tumorassoziierten Zellen aufgetreten waren. Die Mason Trichromfärbung der Tumorknoten zeigte, dass die angiogenen vaskulären Betten unvollständig mit Endothelzellen ausgekleidet waren, wodurch extrazelluläre Matrixkomponenten den zirkulierenden Blutelementen ausgesetzt waren. Es ist denkbar, dass die Präsentation von Kollagen innerhalb des permeablen Tumorgefäßsystems die lokale Konzentration der auf die Matrix gerichteten retroviralen Partikel erhöhte, die, kombiniert mit dem hohen mitotischen, im Tumorknoten beobachteten Index, die wirksame Transduktion von Tumorzellen und zugehörigem Gefäßsystem erleichterten. Die Trichromfärbung nach Mason bestätigte, dass eine aktive Fibrose mit reichlicher Kollagenablagerung einen wichtigen Anteil des restlichen Knotens im Hinblick auf die eigentliche Tumormasse bildete.
Apoptose ist eine bekannte Folge der Cyclin G1 Blockade sowohl in neoplastischen Zellen (Skotzko u.a., Cancer Res. 55, 5493-5498, 1995) als auch hyperplastischen vaskulären Zellen (Zhu u.a., Circulation 96, 628-635, 1997). Demgemäß zeigte die immunhistochemische Färbung der mit dem Mx-dnG1 Vektor behandelten Tumoren eine deutlich erhöhte Häufigkeit der TUNEL-positiven apoptotischen Zellen im Vergleich zu denen der mit Kontrollvektor behandelten Tiere. Die Apoptose wurde in angiogenen Gefäßen der mit Kontrollvektor behandelten Mäuse nicht festgestellt. Im Gegensatz dazu wurde eine umfangreiche Apoptose von Endothelzellen (36 ± 5 %) in Angiogenesebereichen in den mit Mx-dnG1 Vektor behandelten Tieren sowie im stromalen Kompartment beobachtet. Vor allem wurde die erhöhte Apoptosehäufigkeit nicht nur auf die Randoberflächen der Tumorknoten beschränkt, sondern erstreckte sich auf viele Zellschichten tief in den Tumorknoten. Die Fähigkeit des Mx-dnG1 Vektors zum Durchdringen der Tumorknoten wurde offensichtlich durch Kollagenablagerung und/oder Freilegung sowie vaskuläre Permeabilität im Kern der soliden Tumoren erleichtert. In Übereinstimmung mit diesem Konzept sind die Ergebnisse der immunhistochemischen Studien, die zeigten, dass die Ansammlung von Vektorpartikeln in angiogenen Bereichen am ausgeprägtesten war. Weiter konnte die beobachtete Zerstörung der proliferativen Endothelzellen und Stromazellen selbst eine überproportionale Menge an Tumorzelltod durch Erschöpfen der vaskulären Versorgung (Folkman, Nature Med. 1, 27-3, 1995; Hanahan & Folkman, Cell 86, 353-364, 1996; Fidler, J. Natl. Cancer Inst: 87, 1588-1592, 1995) oder Wachstumsfaktorreize induzieren (Fukumura u.a., Cell 94, 715-725, 1998).
Die langfristigen Wirksamkeitsstudien, die aus den zwei (10 Tage) Behandlungszyklen mit dem Mx-dnG1 Vektor (Vektordosis: 1 × 10⁷ cfu), einer äquivalente Dosis eines nicht-gerichteten CAE-dnG1 Vektors oder einem gleichen Volumen an PBS Placebo mit einer dazwischen liegenden Ruhezeit bestanden, bestätigten, dass die therapeutische Wirksamkeit von dem Kolllagenzielpeptidmotiv abhängig war, das in die Primärstruktur des amphotropischen MLV Hüllproteins eingebaut war (14A & 14B). Ein schneller Anstieg der Tumorgröße wurde in den mit Placebo behandelten Mäusen festgestellt, während eine marginale Hemmung der Tumorgröße in den mit nicht-gerichtetem CAE-dnF1 Vektor behandelten Tieren im Vergleich zur PBS-Kontrolle beobachtet wurde (p = 0,10; Tabelle 3). Im Gegensatz dazu wurde das Tumorwachstum in den mit Mx-dnG1 Vektor behandelten Mäusen im Vergleich zu den mit nicht-gerichtetem CAE-dnG1 Vektor behandelten Mäusen (p = 0,014), den mit Mx-nBg Vektor behandelten Kontrollmäusen (p 0 0,004) und den mit PBS behandelten Mäusen (p = 0,001; Tabelle 3) deutlich gehemmt. Weiter blieb die Tumorwachstumsrate in den mit Mx-dnG1 Vektor behandelten Mäusen durchweg langsamer als die der mit nicht-gerichtetem CAE-dnG1 Vektor behandelten Tiere ( 14A) über den gesamten ~7 wöchigen Nachuntersuchungszeitraum.
Die Kaplan-Meier Überlebensstudien wurden bei Mäusen durchgeführt, die mit PBS Placebo, dem nicht-gerichteten CAE-dnG1 Vektor oder dem auf die Matrix gerichteten Mx-dnG1 Vektor behandelt worden waren (14B). Aus ethischen Gründen wurde anstelle der eigentlichen Tiermortalität die Zeit zur Tumorvervierfachung anstelle der eigentlichen Mortalität des Lebewesens als Überlebensendpunkt angenommen (aufgezeichnet als erste Zeit, in der die Tumorlast wie beobachtet viermal höher als die anfängliche Grundlinie war). Wenn das Tumorvolumen sich nicht innerhalb von 47 Tagen vervierfacht hatte, wurden das Tier getötet und die Vervierfachungszeit wurde an 47 Tagen kritisch geprüft. Das Kaplan-Meier Produktgrenzenverfahren (Kaplan & Meier J. Amer. Statist. Assoc. 53, 457, 1958) wurde verwendet, um die Möglichkeit der Tumorvervierfachung abhängig von der Zeit (Tage) zu bestimmen. Der Tarone Trendtest (bezogen auf den Logrank-Test; Tarone, Biometrika 62, 679, 1975) wurde verwendet, um die Vervierfachungszeiten der mit Placebo (PBS) behandelten Gruppe, der mit nicht-gerichtetem CAE-dnG1 Vektor behandelten Gruppe und der mit auf die Matrix gerichteten Mx-dnG1 Vektor behan delten Gruppe zu vergleichen. Mittels der logrank-Tests war der gesamte p-Wert zum Vergleich aller drei Gruppen gleichzeitig 0,003, mit einem wichtigen Trend zu einem Niveau von 0,004. Diese Daten zeigen, dass die Möglichkeit der langfristigen Kontrolle des Tumorwachstums mit dem auf die Matrix gerichteten Mx-dnG2 Vektor signifikant größer war als mit dem nicht-gerichteten CAE-dnG1 Vektor oder dem PBS Placebo.

Um die potentielle Toxizität des auf die Matrix gerichteten Vektors zu bewerten, wurden die Nichtzielorgane am Ende von einem oder zwei Behandlungszyklen entnommen (kumulative Vektordosis: 8 × 10⁷ bzw. 1,6 × 10⁸ cfu). Die Serumchemieprofile waren normal und die histologische Untersuchung des Knochenmarks, der Lunge, des Herzens, des Gehirns, der Leber, der Niere, der Hoden, des Kolons und der Haut zeigte keinen Beweis für einen Organschaden. Diese Ergebnisse stellen weiter eine Unterstützung für das Konzept zur Verfügung (Gordon u.a., Cancer Res. 60, 3343-3347, 2000), dass die intravenöse Injektion des retroviralen Mx-dnG1 Vektors eine breite Sicherheitsmarge zu haben scheint. Tabelle 3 Hemmung des Tumorwachstums in vivo durch Injektion des auf die Matrix gerichteten retroviralen Vektors mit einem zellzerstörenden Cyclin G1 Konstrukt in periphere Venen

Vektorname Anzahl der Tiere	Durchschnittsrate des Tumorwachstums pro Tag (95 Konfidenzintervall)	p-Wert
Mx-dnG1 N = 10	–6,1 % (–9,5 %, –2,5 %)
Mx-nBg N = 4	6,3 % (–0,3 %, 13,4 %)	0,004
CAE-dnG1 N = 4	4,1 % (–3,3 %, 12,1 %)	0,014
PBS (Placebo) N = 3	12,0 % (2,8 %, 21,9 %)	0,001

PBS gegenüber Mx-nBg: p = 0,37; PBS gegenüber CAE-dnG1: p = 0,10

Anmerkung: Die Ergebnisse von drei getrennten Experimenten wurden kombiniert. Um die unterschiedlichen Vektoren in jedem der drei Experimente zu vergleichen, wurde eine gewichtete Varianzanalyse mit den bestimmten Steigungen als abhängige Variable verwendet. Für die Experimente I und II wurde der F-Test basierend auf der Varianzanalyse verwendet, um die Mx-nBg und Mx-dnG1 Vektoren zu vergleichen, und für das Experiment III wurde der F-Test und danach die geringste signifikante Differenzmethode der mehrfachen Vergleiche verwendet, um den Mx-dnG1 Vektor mit dem CAE-dnG1 Vektor und den Placebo Behandlungen zu vergleichen. Die kombinierten Ergebnisse der analysierten Daten sind oben gezeigt. Tabelle 4 Wirksamkeit der Genabgabe in vivo durch Injektion eines retroviralen Matrixzielvektors in eine periphere Vene

Tier Nr.	Gesamtzahl der gezählten Zellen	Zahl der transduzierten Tumorzellen	Transduktionseffizienz, % Vektordosis: ~3 × 10⁶ cfu/gm
1	2901	993	34,4
2	3002	1129	37,6
3	2359	811	34,3
4	3230	1175	36,3
Mittelwert ± Standardabweichung	2873 ± 319	1027 ± 142	34,7 ± 1,4

Anmerkung: Die Wirksamkeit der Genabgabe in die soliden Tumoren durch den retroviralen Mx-nBg Vektor wurde in zwei Tiergruppen nach dem Verabreichen von sieben Vektordosen bewertet (siehe auch 13). Die Transduktionseffizienz wurde durch immunhistochemische Anfärbung der Tumorknoten mittels eines monoklonalen Mausantikörpers, der gegen das b-Galactosidaseantigen gerichtet war, und dann durch Analyse mittels eines Optimas Bildsystems bestimmt. Die Transduktionseffizienz (ausgedrückt als %) wurde durch Zählen der Anzahl von b-Galactosidase positiven Zellen in drei hohen Kraftfeldern pro Tumorknoten geteilt durch die Gesamtzahl der Zellen × 100 bestimmt.
Diskussion
Die Ergebnisse des Beispiels 3 zeigen, dass der auf die Matrix gerichtete retrovirale Vektor, eingeführt durch Injektion in das periphere Venen, (i) sich im angiogenen Tumorgefäßsystem in einer Stunde ansammelte, (ii) Tumorzellen mit hohem Wirkungsgrad transduzierte, und (iii) die Abgabe des therapeutischen Gens und langfristige Wirksamkeit erhöhte, ohne eine merkliche Toxizität auszulösen. Insgesamt stellen diese Ergebnisse den ersten definitiven prinzipiellen Nachweis zur Verfügung, dass ein auf die Matrix gerichteter retroviraler Vektor, der direkt in ein peripheres Blutgefäß injiziert wird, die Abgabe eines therapeutischen Gens in die soliden Tumore verbessert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines mutierten Cyclin G1 mit einem dominant-negativen Phänotyp, wie durch die Fähigkeit zur Hemmung von humanem Cyclin G1 definiert, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung oder Verhinderung eines pathologischen Zustands oder einer pathologischen Krankheit, der bzw. die eine abnormale Zellproliferation bei einem Tier verursacht, wobei der pathologische Zustand oder die pathologische Krankheit aus der Gruppe bestehend aus Tumoren, Krebs, Hyperplasien, Restenose, Hornhauttrübung und Katarakten ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das mutierte Cyclin G1-Protein dem Tier dadurch verabreicht wird, dass ein Expressionsvehikel, umfassend ein das mutierte Cyclin-G1-Protein kodierendes Genkonstrukt, an das Tier abgegeben wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das mutierte Cyclin G1-Protein dem Tier durch Transduktion von abnormal proliferierenden Zellen des Tiers mit einem Expressionsvehikel, umfassend ein das mutierte Cyclin G1-Protein kodierendes Genkonstrukt, verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Expressionsvehikel ein Retrovirusvektor ist.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei das Expressionsvehikel ein auf die Matrix ausgerichteter Retrovirusvektor ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei der auf die Matrix ausgerichtete Retrovirusvektor systematisch einem Tier verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Expressionsvehikel ein Adenovirusvektor ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das mutierte Cyclin G1-Protein ein am Aminoterminus verkürztes Cyclin G1-Protein umfasst.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das mutierte Cyclin G1-Protein Aminosäurereste eines Cyclin G1-Proteins entsprechend den Aminosäureresten 41 bis 249 eines humanen Cyclin G1-Proteins umfasst.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das mutierte Cyclin G1-Protein die Aminosäurereste 41 bis 249 eines humanen Cyclin G1-Proteins umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das mutierte Cyclin G1-Protein ein Cyclin G1-Protein mit mindestens einer Aminosäuresubstitution umfasst.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Substitution an einem Rest erfolgt, der dem Rest 61 eines humanen Cyclin G1-Proteins entspricht.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei das mutierte Cyclin G1-Protein ein humanes Cyclin G1-Protein ist.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Substitution Alanin ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der pathologische Zustand oder die pathologische Krankheit aus der Gruppe bestehend aus Tumoren und Krebs ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Tier ein Mensch ist.
Genkonstrukt, kodierend ein mutiertes Cyclin G1-Protein mit einem dominant-negativen Phänotyp, wie durch die Fähigkeit zur Hemmung von humanem Cyclin G1 definiert.
Genkonstrukt nach Anspruch 17, wobei das mutierte Cyclin G1 ein dominant-negativer Inhibitor von Wildtyp-Cyclin G1 ist.
Genkonstrukt nach Anspruch 17, wobei das mutierte Cyclin G1-Protein eine Deletion in der Cyclin-Box von Wildtyp Cyclin G1 umfasst.
Genkonstrukt nach Anspruch 17, wobei das mutierte Cyclin G1-Protein ein am Aminoterminus verkürztes Cyclin G1-Protein umfasst.
Genkonstrukt nach Anspruch 20, wobei das mutierte Cyclin G1-Protein Aminosäurereste eines Cyclin G1-Proteins entsprechend den Resten 41 bis 249 eines humanen Cyclin G1-Proteins umfasst.
Genkonstrukt nach Anspruch 21, wobei das mutierte Cyclin G1-Protein die Reste 41 bis 249 eines humanen Cyclin G1-Proteins umfasst.
Genkonstrukt nach Anspruch 17, wobei das mutierte Cyclin G1-Protein ein Cyclin G1-Protein mit mindestens einer Aminosäuresubstitution umfasst.
Genkonstrukt nach Anspruch 23, wobei die Substitution bei einem Rest erfolgt, der dem Rest 61 des humanen Cyclin G1-Proteins entspricht.
Genkonstrukt nach Anspruch 24, wobei das mutierte Cyclin G1-Protein ein humanes Cyclin G1-Protein ist.
Genkonstrukt nach Anspruch 25, wobei die Substitution Alanin ist.
Expressionsvehikel, umfassend das Genkonstrukt nach Anspruch 17.
Expressionsvehikel nach Anspruch 27, wobei das Expressionsvehikel ein Virusvektor ist.
Expressionsvehikel nach Anspruch 28, wobei der Virusvektor ein Retrovirusvektor ist.
Expressionsvehikel nach Anspruch 28, wobei der Virusvektor ein Adenovirusvektor ist.
Verwendung von mutiertem Cyclin G1 mit einem dominant-negativen Phänotyp, wie durch die Fähigkeit zur Hemmung von humanem Cyclin G1 definiert, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Verhindern einer Zellteilung in einer Zelle.
Verwendung nach Anspruch 31, wobei das mutierte Cyclin G1-Protein der Zelle durch Abgabe eines Expressionsvehikels, das ein das mutierte Cyclin G1-Protein kodierendes Genkonstrukt umfasst, an die Zelle verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 31, wobei das mutierte Cyclin G1-Protein der Zelle durch Transduktion der Zelle mit einem Expressionsvehikel, das ein das mutierte Cyclin G1-Protein kodierendes Genkonstrukt umfasst, verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 32, wobei das Expressionsvehikel ein Retrovirusvektor ist.
Verwendung nach Anspruch 32, wobei das Expressionvehikel ein Adenovirusvektor ist.
Verwendung nach Anspruch 31, wobei das mutierte Cyclin G1-Protein ein am Aminoterminus verkürztes Cyclin G1-Protein umfasst.
Verwendung nach Anspruch 36, wobei das mutierte Cyclin G1-Protein Aminosäurereste eines Cyclin G1-Proteins entsprechend den Resten 41 bis 249 eines humanen Cyclin G1-Proteins umfasst.
Verwendung nach Anspruch 37, wobei das mutierte Cyclin G1-Protein die Reste 41 bis 249 eines humanen Cyclin G1-Proteins umfasst.
Verwendung nach Anspruch 31, wobei das mutierte Cyclin G1-Protein ein Cyclin G1-Protein mit mindestens einer Aminosäuresubstitution umfasst.
Verwendung nach Anspruch 39, wobei die Substitution bei einem Rest erfolgt, der dem Rest 61 eines humanen Cyclin G1-Proteins entspricht.
Verwendung nach Anspruch 39, wobei das mutierte Cyclin G1-Protein ein humanes Cyclin G1-Protein ist.
Verwendung nach Anspruch 40, wobei die Substitution Alanin ist.
Mutiertes Cyclin G1 mit einem dominant-negativen Phänotyp, wie durch die Fähigkeit zur Hemmung von humanem Cyclin G1 definiert, zur Verwendung in einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
Genkonstrukt, das ein mutiertes Cyclin G1-Protein mit einem dominant-negativen Phänotyp kodiert, wie durch die Fähigkeit zur Hemmung von humanem Cyclin G1 definiert, zur Verwendung in einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
Expressionsvehikel, umfassend das Genkonstrukt nach Anspruch 44, zur Verwendung als pharmazeutisches Mittel.