ES2287098T3 - Proteina ciclina g1 mutada. - Google Patents

Abstract

Un uso de una ciclina G1 mutada que tiene un fenotipo negativo dominante como se define por la capacidad de inhibir ciclina G1 humana para preparar una composición farmacéutica para tratar o prevenir una afección patológica o enfermedad que implique proliferación celular anormal en un animal, en el que dicha afección patológica o enfermedad se selecciona del grupo compuesto por tumores, cánceres, hiperplasias, reestenosis, turbidez corneal y cataratas.

Description

Proteína ciclina G1 mutada.

Esta invención se refiere a ciclina G1 mutada que tiene un fenotipo negativo dominante útil para el tratamiento de afecciones patológicas y enfermedades que implican proliferaciones celulares anormales, tales como tumores, cánceres, reestenosis, hiperplasias, turbidez corneal y cataratas, inhibiendo por tanto la función de la proteína ciclina G1 nativa. Más particularmente, esta invención se refiere a un vehículo de expresión, tal como un vector retroviral o un vector adenoviral, que comprende un polinucleótido que codifica la proteína ciclina G1 mutada.

Antecedentes de la invención

Los genes que codifican una nueva clase de proteínas conocidas como ciclinas se han identificado como una nueva clase de protooncogenes, y se han identificado los inhibidores de la quinasa dependiente de ciclina (o Cdk) como supresores tumorales, uniendo por tanto los mecanismos moleculares de transformación celular y tumorigénesis con la enzimología que rige el control del ciclo celular. (Hall, et al., Curr. Opin. Cell Biol., Vol. 3, págs. 176-184 (1991); Hunter, et al., Cell, Vol. 79; págs. 573-582 (1994); Elledge, et al., Curr. Opin. Cell Biol., Vol 6, págs. 874-878 (1994); Peter, et al., Cell, Vol. 79, págs. 181-184 (1994)). La expresión secuencial de ciclinas específicas y las funciones esenciales de complejos de Cdk específicos se han definido (Wu, et al., Int. J. Oncol., Vol. 3, págs. 859-867 (1993); Pines, et al., New Biologist. Vol. 2, págs. 389-401 (1990); Pines, Cell Growth and Differentiation, Vol. 2, págs. 305-310 (1991); Reed, Ann. Rev. Cell Biol., Vol. 8, págs. 529-561 (1992); Sherr, Cell, Vol. 79, págs. 551-555 (1994)), proporcionado por tanto conexiones directas con los mecanismos fundamentales de la replicación, transcripción, reparación, inestabilidad genética del ADN, y la apoptosis. (D'Urso, et al., Science, Vol. 250, págs. 786-791 (1990); Wu, et al., Oncogene, Vol. 9, págs. 2089-2096 (1994); Roy, Cell, Vol. 79, págs. 1093-1101 (1994); Meikrantz, et al., Proc. Nat. Acad. Sci., Vol. 91, págs. 3754-3758 (1994)).

El carcinoma metastásico es una diana importante de la terapia génica, ya que la enfermedad se asocia a evolución mala. El cáncer colorrectal, por ejemplo, es la segunda causa principal de muerte por cáncer en los Estados Unidos después del cáncer pulmonar, seguido de cáncer de mama y pancreático (Silberberg et al., Cancer Clin., Vol. 40, págs. 9-26 (1990)). De estos carcinomas, el cáncer pancreático tiene el peor pronóstico. La supervivencia media de pacientes con cáncer pancreático metastásico es de entre tres y seis meses y prácticamente todos los pacientes mueren en el intervalo de un año (Merrick et al., Gastrenterol. Clin. N. Amer., Vol. 19, págs. 935-962 (1990)). Aproximadamente el 40% de los pacientes tendrán enfermedad metastásica en el hígado o la cavidad peritoneal o ambos en el momento del diagnóstico. La quimioterapia para la enfermedad metastásica es ineficaz a pesar de la terapia multimodal. Por lo tanto, son deseables enfoques alternativos para el carcinoma metastásico.

Wu, et al., (Oncol. Reports, Vol. 1, págs. 705-711 (1994)), describe la secuencia aminoacídica deducida y la secuencia de ADNc de la proteína ciclina G1 humana. Wu, et al. también describen que se observaron niveles más elevados de expresión de ciclina G1 en células de osteosarcoma y en células de sarcoma de Ewing que en fibroblastos diploides humanos normales. A pesar de que Wu, et al., afirman que la sobreexpresión de proteína ciclina G1 en células humanas de osteosarcoma proporciona una conexión potencial a cáncer, Wu, et al., no describen el tratamiento de cáncer mediante interferencia con o inhibiendo la función de la proteína ciclina G1 en células cancerosas.

La ateroesclerosis, una causa principal de infarto de miocardio y cerebral, es responsable de \sim50% de toda la mortalidad en los Estados Unidos y Europa (Ross, Nature, Vol. 362. págs. 801-809 (1993); Murray y Lopez, The Global Burden of Disease, Harvard University Press, Cambridge, MA (1996)). Además de revascularización por injerto y endarterectomía, la angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA) se ha convertido en el tratamiento convencional de estenosis vascular (Fitz Gibbon, et al., Can. J. Cardiol., Vol. 12, págs. 893-900 (1996)). Mientras que la tasa de éxito de la PTCA inicial ha aumentado hasta bastante por encima del 90%, la eficacia a largo plazo del procedimiento está limitada por el posible desarrollo de hiperplasia de la neoíntima y reestenosis en el 30-50% de los pacientes (Glagov, Circulation, Vol. 89 págs. 2888-2891 (1994); Schwartz et al., Am. Coll. Cardiol., Vol. 17, págs. 1284-1293 (1992); Myers et al., Wound Healing Responses in Cardiovascular Disease, Weber, ed, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY, págs. 137-150 (1995); Chen, et al., J. Clin, Invest., Vol 99, págs. 2334-2341 (1997)), a menudo hasta el punto de que se necesita una segunda PTCA (Kirchengast, et al., Cardiovasc. Res., Vol. 39, págs. 550-555 (1998)). Actualmente, ninguna estrategia farmacológica ha sido lo suficientemente eficaz para garantizar su uso extendido (Herrman et al., Drugs. Vol. 46, págs. 18-52 (1993); De Meyer y Bult, Vascul. Med. Vol. 2, págs. 179-189 (1997)). Por tanto, el control de la formación de neoíntima representa un objetivo principal de la investigación contemporánea en biología vascular (Schwartz, et al., The Intima. Circulation Res., Vol. 77, págs. 445-465 (1995)) y un sistema modelo del desarrollo de nuevas medicinas moleculares (Gibbons, et al., Science, Vol. 272, págs. 689-693 (1996)).

El elevado grado de complejidad y redundancia en vías de señalización del factor de crecimiento ha provocado el examen de las vías de control del ciclo celular conservadas en el diseño de nuevas terapias citostáticas (Barr y Leiden, Trends Cardiovasc. Med., Vol 4 pg. 57 (1994); Andres, Int. J. Molecular. Med., Vol. 2, págs. 81-84 (1998); Braun Dullaeus et al., Circulation, Vol. 98, págs. 82-89 (1998)). En consecuencia, varios nuevos enfoques de terapia génica para inhibir la proliferación de SMC y formación de neoíntima se ha centrado en elementos de control del ciclo celular específicos, incluyendo oligodesoxinucleótidos que representan construcciones antisentido de subunidades de proteinquinasa dependiente de ciclina (CDK) (Morishita et al., Proc. Nat. Acad. Sci., Vol. 90, págs. 8474-8478 (1993), Morishita, et al. J. Clin. Invest., Vol. 93. págs. 1458-1464 (1994); Abe, 1994), vectores adenovirales que llevan inhibidores de la Cdk (Chang et al., Science, Vol. 267, págs. 518-522 (1995); Chen et al., 1997;) o vectores que llevan formas constitutivamente activas de la proteína Rb (Chang et al., J. Clin. Invest., Vol. 96 págs., 2260-2268 (1995); Smith et al., Exp. Cell Res. Vol. 230, págs. 61-68 (1997)). Otros estudios han empleado estrategias moleculares de oligodesoxinucleótidos "señuelo" dirigidas contra el factor de transcripción E2F (Morishita, et al., Proc. Nat. Acad. Sci., Vol. 92, págs. 5855-5859 (1995)), que regula la inducción de múltiples genes de control del ciclo celular. La eficacia descrita de estos enfoques experimentales refuerzan el concepto de que los elementos de control del ciclo celular que se regulan positivamente selectivamente en lesiones de la neoíntima representan dianas terapéuticas estratégicas.

Estudios recientes han caracterizado la regulación positiva de la ciclina G1, un elemento inducible de control del ciclo celular (Tamura et al., Oncogene, Vol. 8, págs. 2113-2118 (1993); Wu, et al., 1994; Home, et al., J. Biol. Chem., Vol. 271, págs. 6050-6061 (1996); Morishita et al., 1995), después de la lesión con catéter balón en roedores (Zhu et al., 2000; presentado) y primates no humanos (Kaijin Wu et al., 1999; presentado). La expresión reforzada de la ciclina G1 en células transfectadas in vitro acelera el ciclo celular y promueve la expansión clonal (Smith et al, Exp. Cell, Res. Vol. 230, págs. 61-68 (1997),) mientras que el bloqueo de la expresión de ciclina G1 mediante estrategias antisentido induce citostasis y citolísis (Skotzko, et al, Cancer Res., Vol. 55 págs. 61-68 (1995); Chen, et al., Hum. Gene Ther., Vol. 8, págs. 1667-1674 (1997); Hung, et al., Int. J. Pediatr. Hematol. Oncol., Vol. 4, págs. 317-325 (1997).) En el contexto de la proliferación de SMC, se ha demostrado (i) que un vector retroviral de ciclina G1 antisentido concentrado a un título lo suficientemente elevado (10^{8} ufc/ml) inhibió la supervivencia y proliferación SMC vasculares transducidas de rata (Zhu, et al., Circulation, Vol. 46 págs., 628-635 (1997)) y de primate (observaciones no publicadas), y (ii) que el suministro intraluminal de este vector de ciclina G1 antisentido concentrado a arterias carótidas de rata lesionadas por balón produjo una disminución significativa de formación de neoíntima in vivo (Zhu, et al., 1997). Skotzko et al., Cancer Research, American Association for Cancer Research, Baltimore, Vol. 55, Nº 23, págs. 5493-5498 describen que la proliferación de células de sarcoma se puede inhibir mediante inhibición antisentido de la ciclina G1. Diehl y Sherr, Molecular and Cellular Biology, Vol. 17, Nº 12, 1997, págs. 7362-7374 describen una mutante de ciclina D1 dominante negativa que evita la importación nuclear de quinasa dependiente de ciclina 4 (CDK4) y su fosforilación por la quinasa de activación de la CDK. Por lo tanto, la ciclina G1 parece ser un sitio pertinente y ventajoso para la intervención terapéutica en el manejo de la reestenosis vascular.

Sumario de la invención

Los Solicitantes han descubierto que interfiriendo con y/o inhibiendo la función de la proteína ciclina G1 en células cancerosas, se puede inhibir, evitar, o destruir el crecimiento y/o supervivencia de tales células cancerosas. Por tanto, la presente invención se refiere a afecciones patológicas y enfermedades que implican proliferaciones celulares anormales inhibiendo la función de la proteína ciclina G1, mediante la administración de proteínas ciclina G1 mutantes a tales células en proliferación de un animal. Tales afecciones patológicas y enfermedades incluyen, aunque sin limitación, cánceres, tumores, hiperplasias, reestenosis, turbidez corneal, y cataratas. En realizaciones preferidas, la proteína ciclina G1 mutante o variante se administra al animal afectado mediante suministro de vehículos de expresión que comprenden polinucleótidos que codifican proteínas ciclina G1 mutadas. Tales vehículos de expresión incluyen, aunque sin limitación, vectores virales tales como vectores retrovirales y vectores adenovirales, y vectores sintéticos. Los animales que se pueden tratar de manera beneficiosa mediante la materia objeto de la invención incluyen, aunque sin limitación, mamíferos, incluyendo primates humanos y no humanos, perros, gatos, caballos, vacas, y ovejas.

Breve descripción de los dibujos

La invención se describirá a continuación respecto a los dibujos, en los que:

Fig. 1 (A) Eficacia de transducción de vectores retrovirales dirigidos a la matriz en células MiaPaca2. Se muestran células que expresan \beta-galactosidasa con núcleos teñidos de azul. (B) Efectos citostáticos de vectores retrovirales dirigidos a la matriz que llevan construcciones de ciclina G1 mutante en células cancerosas MiaPaca. El número de células por pocillo, representado en el eje vertical, se expresa como una función del tiempo (días después de la transducción), representado en el eje horizontal. medio D10 control; vector Null que lleva solamente el gen neo^{r}; vectores AS 587 y AS 693 que llevan construcciones de ciclina G1 antisentido; DNT 41 a 249, o vector dnG1 que lleva una deleción en el extremo N de ciclina G1 humana, (C) Análisis de Western de expresión de proteína ciclina G1 humana en vector dnG1 frente a células cancerosas transducidas con vector null sin selección de G418. La dnG1 inmunorreactiva (ciclina G1 DN41) se detecta como una débil banda de tinción en la región de 20 kDa (carril 2), mientras que la proteína ciclina G1 endógena se observa como una intensa banda de tinción en la región de \sim30 kDa (carriles 1-3).

Fig. 2 Expresión de Proteína Ciclina G1 Humana en Focos de Tumor Metastásico. Elevados niveles de expresión de proteína ciclina G1 humana en focos tumorales (A; t) de animales tratados con PBS y en focos tumorales residuales de animales tratados con baja dosis de vector dnG1 (B; flecha) como se evidencia por la intensa tinción de ciclina G1 inmunorreactiva con un anticuerpo anti-ciclina G1 humana (material con tinción marrón).

Fig. 3 La tinción hematoxilina-eosina de secciones de tejido de hígado pone de manifiesto los focos tumorales del grupo control PBS (A & C; 40X y 100X) y los animales tratados con el vector dnG1 (B & D; 40X y 100X). La apoptosis en focos tumorales del grupo control PBS (E; 100X), y los animales tratados con el vector dnG1 (F & H: 100X y 200X; flechas) se representa como material de inmunotinción rojiza-marrón en un ensayo de apoptosis in situ con peroxidasa ApopTagPlus. (G) Tinción control negativa sin la enzima desoxinucleotidil transferasa terminal TdT; t = focos tumorales; h = hepatocitos en parénquima del hígado.

Fig. 4 La secuencia de ciclina G1 humana se muestra en comparación con aquellas de ciclina I humana, ciclina A humana y Cig1 de S. Porn. Las regiones conservadas se indican mediante casillas grises.

Fig. 5 Clonación de ADNc de ciclina G1 humana en el vector de expresión retroviral pREX. El diagrama muestra la clonación por etapas de una ciclina G1 (PM 61) con mutación puntual en pGl PM61_{A}/REX.

Fig. 6 Diagramas esquemáticos de construcciones pREX, ciclina G1 antisentido y mutante. (A) Mapa y sitios de clonación por restricción del vector de expresión retroviral pREX (B) diagrama esquemático de fragmentos de ciclina G1 antisentido (C) Diagrama esquemático de fragmentos de ciclina G1 mutante.

Fig. 7 Estudios in vitro de transfección de ADN de plásmido, eficacia de transducción y transducción de A10 de rata y SMC de mono con vectores retrovirales dirigidos a la matriz que llevan genes marcadores y construcciones de ciclina G1 mutante. (A) Proliferación de SMC A10 de rata transfectadas con construcciones de ADN de plásmido de ciclina G1 mutante. El número de células, representado en el eje vertical, se expresan como una función del tiempo, los días post-transducción, representados en el eje horizontal; (B) Eficacia de transducción en cultivos celulares de A10 de rata después de una única transducción de dos horas usando vectores retrovirales pseudotipados con la VSVG dirigidos a la matriz que llevan un gen de \beta-galactosidasa dirigido al núcleo. El % de la eficacia de la transducción se expresa como una función de la multiplicidad de infección (_{log} MOI); (C) Proliferación de células MiaPaca humanas transducidas con vectores retrovirales de ciclina G1 mutante; (D) Proliferación de SMC de mono transducidas con vectores retrovirales de ciclina G1 mutante.

Fig. 8 Esquema de transfección transitorio e incorporación de virión de vectores de ciclina G1 antisentido y mutante mostrando un motivo dirigido a la matriz y una proteína VSVG en configuración de doble envuelta. (A) Se generaron cepas retrovirales usando un sistema de cotransfección transitorio de cuatro plásmidos (Soneoka et al., 1995) en el que los componentes de empaquetamiento gag-pol, la env dirigida a la matriz (CBD), la env de VSVG fusogénica, y un vector retroviral que lleva una construcción de ciclina G1, cada uno expresado por el promotor CMV se pusieron en plásmidos separados, conteniendo cada uno el origen de replicación SV40. (B) El análisis de Western muestra la proteína env gp70 basada en el MLV como una banda inmunorreactiva que migra a la región de \sim70 kDa, la proteína VSVG, a \sim64 kDa, y el control de la proteína viral gag (CA), entre 36 y 50 kDa. Mock = control sin envuelta; control CAE 109 = vector null no dirigido con WT MLV env; control Hs2 + VSVG 109 = vector null dirigido a la matriz con una env del MLV que muestra un motivo de unión de colágeno y proteína VSVG en configuración env doble; CAE 587 = vector 587 no dirigido de ciclina G1 antisentido con WT env; Hs2 + VSVG 587 = 587 dirigido a la matriz pseudotipado con VSVG de ciclina G1 antisentido; CAE 693 = vector 693 no dirigido de ciclina G1 antisentido con WT env; Hs2 + VSVG 693 = 693 dirigido a la matriz pseudotipado con VSVG de ciclina G1 antisentido; CAE D/N (41-249) = vector D/N (41-249) mutante no dirigido con WT env; Hs2 + VSVG D/N (41-249) = vector D/N (41-249) mutante dirigido a la matriz pseudotipado con VSVG.

Fig. 9 Formación de sincitios en cultivos celulares de A10 de rata después de la transducción con vectores retrovirales de ciclina G1 antisentido y mutante. Las microfotografías muestran el aspecto morfológico de células A10 de rata transducidas (A & B) vector null; (C & D) vector 693 de ciclina G1 antisentido; (D & E) vector de ciclina G1 (dnG1) mutante. Los sincitios se indican mediante flechas.

Fig. 10 Análisis de transferencia de Western de expresión de ciclina G1 en células A10 de mono y rata transducidas con vectores de ciclina G1 mutante. Las proteínas celulares de células transducidas 12, 24, y 48 horas después de la transducción se compararon con las células transducidas con el vector control null. (A) Expresión disminuida de proteína inmunorreactiva ciclina G1 humana en cultivos de SMC de mono transducidas con un vector retroviral 693 de ciclina G1 antisentido comparada con el vector null (Vector) (B) Aspecto de ciclina G1 humana mutante inmunorreactiva (mutante p20) a 20 kDa en cultivos celulares A10 de rata 24 y 48 horas después de la transducción con el vector retroviral dnG1, que estaba ausente en células transducidas con el vector control (Vector).

Fig. 11 Tinción inmunohistoquímica de proteína ciclina G1 de rata en arterias de rata lesionadas por balón. Inmunorreactividad nuclear potenciada de ciclina G1 (indicada mediante tinción nuclear rojiza-marrón) en células de la neoíntima de los segmentos arteriales tratados con el (A) vector null (B) PBS y (D) vector dnG1. Intensidad disminuida de inmunorreactividad de ciclina G1 en los segmentos arteriales tratados con (C) 693 de ciclina G1 antisentido.

Fig. 12 Estudios de eficacia in vivo de un mes usando vectores dnG1 pseudotipados con VSVG dirigidos a la matriz. Secciones de tejido teñidas con elastina de arterias carótidas de rata obtenidas un mes después de la lesión con balón y la instilación intraluminal de (A) PBS control; (B) Solución salina; (C) Vector null y (D) vector dnG1.

Fig. 13 Detención del crecimiento tumoral con un ciclo de tratamiento (7 días) del vector Mx-dnG1. El vector citocida se inyectó directamente en la vena de la cola diariamente durante un total de 7 días. Los animales se sacrificaron el 8º día después de que se obtuvieran las mediciones de los volúmenes del tumor usando un calibrador Vernier. Obsérvese que los volúmenes tumorales en el comienzo del tratamiento de los animales en la Fig. 13A eran considerablemente mayores que los de la Fig. 13B. Sin embargo, en ambos experimentos, se observaron disminuciones apreciables del tamaño tumoral el 4º día de tratamiento con el vector Mx-dnG1 (n = 6), mientras que se observó un aumento progresivo del tamaño tumoral en animales tratados con el vector control Mx-nBg (n = 4). El volumen tumoral (mm^{3}; representado en el eje vertical), se expresó como una función del tiempo (días; representado en el eje horizontal).

Fig. 14 (A) Estudios de eficacia a largo plazo usando el vector Mx-dnG1. Se aleatorizaron ratones que llevaban xenoinjertos de tumor establecidos (volumen tumoral \sim50 mm^{3}) para recibir placebo (PBS; n = 3), un vector CAE-dnG1 no dirigido (n = 4) o un vector Mx-dnG1 dirigido a la matriz (n = 4). 200 \mul de vector (dosis de vector: 8 x 10^{6} ufc) o un volumen equivalente de placebo se inyectaron directamente en una vena periférica (dorsal de la cola) diariamente o cada dos días durante 10 dosis (un ciclo de tratamiento) (grupo placebo) o durante dos ciclos de tratamiento (grupos CAE-dnG1 o Mx-dnG1), con un periodo de descanso provisional de 2 semanas. El volumen tumoral (mm^{3}; representado en el eje vertical), se expresa como una función del tiempo (días; representado en el eje horizontal). (B) Estudios de supervivencia Kaplan-Meier en ratones tratados con el vector Mx-dnG1. Se muestra la curva de supervivencia Kaplan-Meier (representando el tiempo hasta la cuadruplicación del tumor como el criterio de valoración) de animales en (A). El grupo placebo se representa mediante una línea continua; el grupo CAE-dnG1, mediante una línea de rayas cortas; el grupo Mx-dnG1, mediante una línea de rayas largas. La fracción superviviente (representando animales con tumores que no se han cuadruplicado; representada en el eje vertical) se expresa como una función del tiempo (días; representados en el eje horizontal).

Descripción detallada de la invención

Un aspecto de la presente invención se refiere a tratar un animal afectado por una afección patológica o enfermedad que implica una proliferación celular anormal. Tales afecciones y enfermedades incluyen tumores, cánceres, hiperplasias, reestenosis, turbidez corneal, y cataratas. El tratamiento comprende administrar al animal o a la célula, el tejido u órgano enfermo del animal una proteína ciclina G1 mutante. La proteína ciclina G1 mutada se administra en una cantidad eficaz para disminuir o inhibir la proliferación celular anormal, o para aliviar, curar, o evitar la afección o enfermedad. En una realización preferida, el método de la presente invención se refiere a tratar tumores y
cánceres.

La expresión "tratar un tumor o cáncer", como se usa en este documento, significa que se asegura la inhibición, prevención, o destrucción del crecimiento del tumor o células cancerosas. Los tumores y cánceres que se pueden tratar de manera beneficiosa mediante los métodos de la invención, incluyen, aunque sin limitación, linfomas, leucemias, sarcomas, y carcinomas.

El término,"hiperplasia", como se usa en este documento, significa una afección patológica o enfermedad no tumoral que implica proliferación anormal de células en un tejido u órgano. Las hiperplasias que se pueden tratar de manera beneficiosa mediante los métodos de la invención incluyen, aunque sin limitación, hiperplasia angiofolicular de nódulos linfáticos mediastínicos, enfermedad de Kimura, hiperplasia angiolinfoide, hiperplasia melanocítica atípica, hiperplasia de células basales, enfermedad de Castleman, hipercementosis, hiperplasia adrenal congénita, hiperplasia sebácea congénita, hiperplasia adrenal congénita virilizante, hiperplasia cística, hiperplasia fibromuscular, enfermedad de Heck, hiperplasia endotelial papilar intravascular, hiperplasia neuronal, hiperplasia escamosa, e hiperplasia verrucosa.

La expresión "proteína ciclina G1 mutada", como se usa en este documento, significa la proteína ciclina G1 nativa de un organismo eucariota, pero con una o más deleciones, sustituciones, adiciones aminoacídicas, y/o combinaciones de las mismas. En determinadas realizaciones, la proteína ciclina G1 mutada es de un animal. En realizaciones preferidas, la proteína ciclina G1 es de una especia animal estrechamente relacionada con el animal que se está tratando (por ejemplo, una proteína ciclina G1 mutada de chimpancé usada para tratar un ser humano). En una realización más preferida, la proteína ciclina G1 mutada es de la misma especie animal que el animal que está tratando.

La secuencia aminoacídica de la proteína ciclina G1 humana se muestra en la Figura 4. En una realización, la proteína ciclina G1 mutada comprende una proteína ciclina G1 truncada en el extremo amino. En una realización, se pueden delecionar hasta los primeros 117 residuos aminoacídicos en el extremo N de la proteína ciclina G1. En una realización preferida, la proteína ciclina G1 mutada es una proteína ciclina G1 que comprende una deleción N-terminal hasta el residuo aminoacídico 40, incluyendo. En una realización más preferida, la proteína ciclina G1 mutada es una proteína ciclina G1 humana que comprende una deleción N-terminal de los residuos aminoacídicos 1 hasta 40. En una realización específica, la proteína ciclina G1 mutada consiste en los residuos aminoacídicos 41 a 249 de la proteína ciclina G1 humana.

En otras realizaciones, la proteína ciclina G1 mutada es una proteína ciclina G1 de longitud completa o truncada que comprende una sustitución aminoacídica en el residuo aminoacídico que se corresponde al residuo 61 de la proteína ciclina G1 humana. En realizaciones preferidas, la proteína ciclina G1 mutada tiene una sustitución de alanina en ese residuo. En realizaciones específicas, la proteína ciclina G1 mutada es una proteína ciclina G1 de longitud completa o truncada que tiene una sustitución de lisina o alanina en el residuo 61.

La proteína ciclina G1 mutada se puede preparar mediante técnicas conocidas por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, la proteína ciclina G1 mutada se puede preparar mediante un sintetizador automático de péptidos o proteínas. Alternativamente, la proteína ciclina G1 mutada se puede preparar mediante técnicas de ingeniería genética.

En una realización, la proteína ciclina G1 mutada se administra al animal o directamente a las células, el tejido, u órgano que manifiesta la afección patológica o enfermedad mediante la administración de un polinucleótido que comprende una construcción génica que codifica la proteína ciclina G1 mutada. Preferiblemente, el polinucleótido comprende un vehículo de expresión apropiado.

El término "polinucleótido", como se usa en este documento, significa una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, e incluye ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos. Tal término también incluye ADN monocatenario y bicatenario, y ARN monocatenario y bicatenario. El término también incluye polinucleótidos modificados tales como polinucleótidos metilados o protegidos.

La construcción génica que codifica la proteína ciclina G1 mutada comprende una secuencia que codifica la proteína ciclina G1 mutada asociada de manera operativa a un promotor adecuado. De acuerdo con la invención, un promotor adecuado puede ser cualquiera que sea activo en el animal tratado. En realizaciones preferidas, el promotor es uno que es muy activo en y/o es específico de las células que proliferan de manera anormal. Sin embargo, se tiene que entender que el alcance de la presente invención no se limita a promotores específicos. En una realización específica, el promotor es un promotor de ciclina G1. La secuencia que codifica la proteína ciclina G1 mutada puede comprender una secuencia de genes de ciclina G1 nativa que tenga la o las mutación(es) deseadas o una secuencia sintética que codifique la proteína ciclina G1 mutada.

El polinucleótido que comprende la construcción génica de ciclina G1 mutada, en una realización preferida, está contenido un vehículo de expresión apropiado que se transduce al interior de la célula que prolifera de manera anormal. Tales vehículos de expresión incluyen, aunque sin limitación, plásmidos, vectores eucariotas, vectores eucariotas (tales como, por ejemplo, vectores bacterianos), y vectores virales.

En una realización, el vector es un vector viral. Los vectores virales que se pueden emplear incluyen vectores de virus ARN (tales como vectores retrovirales) y vectores de virus ADN (tales como vectores adenovirales, vectores de virus adenoasociados, vectores de Herpes Virus, y vectores de virus vaccinia). Cuando se emplea un vector de virus ARN, al construir el vector, el polinucleótido que comprende la construcción génica de la ciclina G1 mutada está en forma de ARN. Cuando es emplea un vector de virus ADN, al construir el vector, el polinucleótido que comprende la construcción génica de la ciclina G1 mutada está en forma de ADN.

En una realización, el vector viral es un vector retroviral. Los ejemplos de vectores retrovirales que se pueden emplear incluyen, aunque sin limitación, Virus de la Leucemia Murina de Moloney, virus de necrosis esplénica, y vectores derivados de retrovirus tales como Virus del Sarcoma de Rous, Virus del Sarcoma de Harvey, virus de la leucosis aviar, virus del sarcoma mieloproliferativo, y virus de tumor mamario. El vector generalmente es una partícula de retrovirus incapaz de replicación. Un vector retroviral incluido en los contenidos de la invención incluye un vector lentiviral, tal como, por ejemplo, un vector basado en el virus VIH o lentivirus animales, tales como, por ejemplo, vectores basados en BIV. La construcción de vectores lentivirales se describe inter alia en las Patentes de Estados Unidos números 5.665.5777; 5.994.136 y 6.013.516.

En una realización, el vector retroviral se puede generar a partir de un vector de plásmido retroviral que se deriva del virus de la Leucemia Murina de Moloney y pertenece a las series LN de vectores, que se describen adicionalmente en Bender, et al., J. Virol., Vol. 61, págs. 1639-1649 (1987) y Miller, et al., Biotechniques, Vol. 7, págs. 980-990 (1989). Tales vectores tienen una parte de la señal de empaquetamiento derivada de un virus de sarcoma de ratón, y un codón de iniciación gag mutado. El término "mutado" como se usa en este documento significa que el codón de iniciación gag se ha delecionado o alterado de manera que la proteína gag o los fragmentos o truncamientos de la misma, no se expresan.

En otra realización, el vector de plásmido retroviral puede incluir al menos cuatro sitios de clonación, o de reconocimiento de enzimas de restricción, en los que al menos dos los sitios tienen una frecuencia media de presentación en genes eucariotas de menos de uno por 10.000 pares de bases; es decir, el producto de restricción tiene un tamaño medio de ADN tamaño de al menos 10.000 pares de bases. Los sitios de clonación preferidos se seleccionan del grupo compuesto por NotI, SnaBI, SalI, y XhoI. En una realización preferida, el vector de plásmido retroviral incluye cada uno de estos sitios de clonación. Tales vectores se describen adicionalmente en la Patente de Estados Unidos Nº 5.672.510.

Cuando se emplea un vector de plásmido retroviral incluyendo tales sitios de clonación, también se puede proporcionar un vector lanzadera de clonación que incluya al menos dos sitios de clonación que sean compatibles con al menos dos sitios de clonación seleccionados del grupo compuesto por NotI, SnaBI, Sall, y XhoI localizados en el vector de plásmido retroviral. El vector lanzadera de clonación también incluye un polinucleótido que codifica la proteína ciclina G1 mutante que es capaz de ser transferida del vector lanzadera de clonación al vector de plásmido retroviral.

El vector lanzadera de clonación se puede construir a partir de un vector o fragmento "estructura" básico al que se unen uno o varios enlazadores que incluyen sitios de clonación o de reconocimiento de enzimas de restricción. En los sitios de clonación se incluyen los sitios de clonación compatibles, o complementarios, que se han descrito anteriormente en este documento. Un polinucleótido que codifica una proteína ciclina G1 mutada y/o un promotor que tiene extremos que se corresponden a los sitios de restricción del vector lanzadera se puede unir al vector lanzadera mediante técnicas conocidas en la técnica.

El vector lanzadera de clonación se puede emplear para amplificar secuencias de ADN en sistemas procariotas. El vector lanzadera de clonación se puede preparar a partir de plásmidos usados generalmente en sistemas procariotas y en particular en bacterias. Por tanto, por ejemplo, el vector lanzadera de clonación se puede derivar de plásmidos tales como pBR322; pUC 18; etc.

El vector de plásmido retroviral puede incluir un promotor para expresar una secuencia que codifica proteína ciclina G1 mutada. Los promotores adecuados que se pueden emplear incluyen, aunque sin limitación, el LTR retroviral; el promotor SV40; y el promotor del citomegalovirus humano (CMV) descrito en Miller, et al., Biotechniques, Vol. 7, Nº. 9, 980-990 (1989), o cualquier otro promotor (por ejemplo, promotores celulares tales como promotores celulares eucariotas incluyendo, pero sin limitación, los promotores de histona, pol III, ciclina G1, y \beta-actina). Otros promotores virales que se pueden emplear incluyen, aunque sin limitación, promotores de adenovirus, promotores de TK, y promotores de parvovirus B19. La selección de un promotor adecuado será evidente para los especialistas en la técnica a partir de los contenidos incluidos en este documento.

El vector de plásmido retroviral que incluye el polinucleótido que comprende la construcción génica de la ciclina G1 mutada se transduce a una línea celular de empaquetamiento incluyendo secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas retrovirales gag, pol, y env. Los ejemplos de tales líneas celulares de empaquetamiento incluyen, aunque sin limitación, las líneas celulares PE501, PA317 (ATCC Nº CRL 9078), \Psi-2, \Psi-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, \PsiCRE, \PsiCRIP, GP+E-86, GP+envAm12, y DAN como se describe en Miller, Human Gene Therapy, Vol. 1, págs. 5-14 (1990) o la línea celular 293T (Patente de Estados Unidos Nº 5.952.225). El vector puede transducir las células de empaquetamiento mediante cualquier medio conocido en la técnica. Tales medios incluyen, aunque sin limitación, electroporación, el uso de liposomas, y precipitación por CaPO_{4}. Tales células productoras generan partículas infecciosas de vector retroviral que incluyen el polinucleótido que comprende la construcción génica de la ciclina G1 mutada.

Alternativamente, se puede generar una partícula de vector retroviral que incluya el polinucleótido que comprende la construcción génica de la ciclina G1 mutada, una primera proteína de envuelta retroviral sin péptidos no retrovirales (que, en una realización, puede ser una proteína de envuelta retroviral de tipo silvestre), y una proteína de envuelta retroviral modificada, o proteína "escolta", en la que los residuos aminoacídicos de la proteína de envuelta retroviral de tipo silvestre se han retirado y sustituido por una proteína dirigida o un péptido dirigido que se une a una molécula deseada, tal como un receptor celular o componente extracelular, tal como, por ejemplo, un componente de la matriz extracelular. Los ejemplos de componentes de la matriz extracelular a los que se puede unir la proteína dirigida o el polipéptido dirigido incluyen, aunque sin limitación, colágeno.

Tal partícula de vector retroviral se puede generar transduciendo una célula de empaquetamiento, tal como aquellas que se han descrito anteriormente en este documento, con el vector de plásmido retroviral incluyendo el polinucleótido que codifica la proteína ciclina G1 mutada, y un vehículo de expresión apropiado, tal como un plásmido, incluyendo un polinucleótido que codifica el péptido de envuelta retroviral modificado. La célula productora resultante genera después partículas infecciosas de vector retroviral que incluyen la primera proteína de envuelta retroviral sin péptidos no retrovirales, la proteína de envuelta retroviral modificada, y el polinucleótido que codifica la proteína ciclina G1 mutada.

En otra alternativa, el vector de plásmido retroviral que incluye el polinucleótido que comprende la construcción génica de la ciclina G1 mutada se transduce a una célula de empaquetamiento que incluye polinucleótidos que codifican las proteínas retrovirales gag y pol, un polinucleótido que codifica una primera proteína de envuelta retroviral sin péptidos no retrovirales, y un polinucleótido que codifica la proteína de envuelta retroviral modificada. La célula productora resultante genera partículas de vector retroviral que incluyen el polinucleótido que comprende la construcción génica de la ciclina G1 mutada, una primera proteína de envuelta retroviral sin péptidos no retrovirales, y la proteína de envuelta retroviral modificada.

Las partículas de vector retroviral se administran a un animal afectado en una cantidad que es eficaz para inhibir, evitar, o destruir las células que proliferan de manera anormal. Aunque el alcance de la presente invención no se limita a ningún razonamiento teórico, se cree que la proteína ciclina G1 mutada compite con la proteína ciclina G1 nativa por el otro compuesto de unión de quinasa dependiente de ciclina, inhibiendo por tanto la función de la proteína ciclina G1 nativa de promover la división celular. La administración de las partículas de vector retroviral puede ser por administración sistémica, tal como por administración intravenosa, intraarterial, o intraperitoneal, o mediante inyección directa de los vectores retrovirales en el tumor. En general, los vectores retrovirales se administran en una cantidad de al menos 10^{6} ufc/ml, y en general, tal cantidad no sobrepasa las 10^{11} ufc/ml. Preferiblemente, los vectores retrovirales se administran en una cantidad de entre aproximadamente 10^{8} ufc/ml y aproximadamente 10^{9} ufc/ml. La dosificación exacta que se tiene que administrar depende de una variedad de factores incluyendo la edad, el peso, y el sexo del animal o paciente que se tiene que tratar, y el tamaño y gravedad del tejido enfermo (tumor u órgano) que se trata.

Los vectores retrovirales también se pueden administrar junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tales como, por ejemplo, solución salina, sulfato de protamina (Elkins Sinn, Inc., Cherry Hill, N. J.), agua, tampones acuosos, tales como tampones fosfato y tampones Tris, o polibreno (Sigma Chemical, St. Louis, MO). La selección de un vehículo farmacéuticamente aceptable se considera evidente para los especialistas en la técnica a partir de los contenidos incluidos en este documento.

En consecuencia, la presente invención también garantiza el uso en medicina de una proteína ciclina G1 mutada, el uso una construcción génica que codifica una proteína ciclina G1 mutada y el uso un vehículo de expresión que comprende tal construcción génica de la invención, y el tratamiento de tumores y cáncer en particular.

Además, el uso de una proteína ciclina G1 mutada, el uso de una construcción génica que codifica una proteína ciclina G1 mutada y el uso de un vehículo de expresión que comprende tal construcción génica de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedad, tales como, por ejemplo, tumores y cáncer, se proporciona por la presente invención.

En otra alternativa, los vectores retrovirales que se han descrito anteriormente en este documento, o un polinucleótido que codifica una proteína ciclina G1 mutada, se pueden encapsular en el interior de liposomas. Los liposomas, que encapsulan los vectores retrovirales o un polinucleótido que codifica una proteína ciclina G1 mutada, se pueden administrar a un hospedador junto con un vehículo farmacéutico como se ha descrito anteriormente en este
documento.

En otra alternativa, las células productoras retrovirales, tales como aquellas derivadas de las líneas celulares de empaquetamiento que se han descrito anteriormente en este documento, que incluyen un polinucleótido que comprende la construcción génica de ciclina G1 mutada, se pueden administrar a un animal. Tales células productoras, en una realización, se pueden administrar por vía sistémica (por ejemplo, por vía intravenosa o por vía intraarterial) en un punto muy próximo al tejido u órgano enfermo, o las células productoras se pueden administrar directamente al tejido u órgano enfermo. La línea celular productora produce después vectores retrovirales que incluyen un polinucleótido que comprende la construcción génica de G1 mutada, in vivo, por lo cual tales vectores retrovirales después transducen las células que proliferan de manera anormal del tejido u órgano enfermo.

Las afecciones patológicas y enfermedades que se pueden tratar de acuerdo con la presente invención incluyen tumores no malignos, así como malignos, o cancerosos. Los tumores cancerosos que se pueden tratar incluyen, aunque sin limitación, sarcoma osteogénico y sarcoma de Ewing y otros trastornos neoplásicos en los que se expresa ciclina G1, tales como glioblastoma, neuroblastoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, leucemias, linfomas (incluyendo linfoma de Hodgkin y no Hodgkin), fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, cáncer de colon, cáncer pancreático, cánceres de hígado tales como carcinoma hepatocelular, y adenocarcinomas.

Los anteriores tratamientos tumorales también se pueden emplear en combinación con otros tratamientos de tumores, tales como, por ejemplo, (i) radiación; (ii) quimioterapia; o (iii) la transducción de las células tumorales con un polinucleótido que codifica un marcador selectivo negativo, tal como, por ejemplo, un gen de timidinquinasa viral, seguido de la administración de un agente de interacción, tal como, por ejemplo, ganciclovir, que destruye las células transducidas con el polinucleótido que codifica el marcador selectivo negativo.

En una realización, una proteína ciclina G1 mutada se administra a un hospedador de acuerdo con uno de los métodos que se han descrito anteriormente en este documento. El crecimiento de cualquier célula tumoral que contenga el agente se inhibirá, evitará o destruirá. Además, las células tumorales se transducen con un polinucleótido que codifica un marcador selectivo negativo o gen "suicida". El polinucleótido que codifica el marcador selectivo negativo puede estar contenido en un vehículo de expresión tal como aquellos que se han descrito anteriormente en este documento. Una vez que las células tumorales se transducen con el polinucleótido que codifica el marcador selectivo negativo, se administra un agente de interacción al hospedador, por lo que el agente de interacción interactúa con el marcador selectivo negativo para evitar, inhibir, o destruir el crecimiento de las células tumorales.

Los marcadores selectivos negativos que se pueden emplear incluyen, aunque sin limitación, timidinquinasa, tal como timidinquinasa del Virus del Herpes Simplex, timidinquinasa de citomegalovirus, y timidinquinasa del virus de varicella-zoster; y citosina desaminasa.

En una realización, el marcador selectivo negativo es una timidinquinasa viral seleccionada del grupo compuesto por timidinquinasa del Virus del Herpes Simplex, timidinquinasa de citomegalovirus, y timidinquinasa del virus de varicella-zoster. Cuando se emplean tales timidinquinasas virales, el agente de interacción o quimioterapéutico es preferiblemente un análogo de nucleósido, por ejemplo, uno seleccionado del grupo compuesto por ganciclovir, aciclovir, y 1-2-desoxi-2-fluoro-\beta-D-arabinofuranosil-5-iodouracilo (FIAU). Tales agentes de interacción se utilizan de manera eficaz por las timidinquinasas virales como sustratos, y por tanto, tales agentes de interacción se incorporan de manera letal en el ADN de las células tumorales que expresan las timidinquinasas virales, dando por tanto como resultado la muerte de las células tumorales.

En otra realización, el marcador selectivo negativo es citosina desaminasa. Cuando la desaminasa es el marcador selectivo negativo, un agente de interacción preferido es 5-fluorocitosina. La citosina desaminasa convierte la 5-fluorocitosina en 5-fluorouracilo, que es altamente citotóxico. Por tanto, las células tumorales que expresan el gen de la citosina desaminasa convierten la 5-fluorocitosina en 5-fluorouracilo y son destruidas.

El agente de interacción se administra en una cantidad eficaz para inhibir, evitar, o destruir el crecimiento de las células tumorales transducidas. Por ejemplo, el agente de interacción se puede administrar en una cantidad de entre 5 mg y 10 mg/kg de peso corporal, dependiendo la toxicidad global en un paciente. El agente de interacción preferiblemente se administra por vía sistémica, tal como, por ejemplo, mediante administración intravenosa, mediante administración parenteral, mediante administración intraperitoneal, o mediante administración intramuscular.

Cuando un vehículo de expresión, tales como aquellos que se han descrito anteriormente en este documento, incluyendo un marcador selectivo negativo se administra a células tumorales, se puede producir un "efecto espectador", es decir, las células tumorales que originalmente no se transducen con la secuencia de ácido nucleico que codifica el marcador selectivo negativo se pueden destruir después de la administración del agente de interacción. A pesar de que los Solicitantes no pretenden limitarse a ningún razonamiento teórico, las células tumorales transducidas pueden producir una forma difusible del marcador selectivo negativo que actúa extracelularmente después del agente de interacción, o se capta por células tumorales adyacentes no transducidas, que después se convertirán en susceptibles a la acción del agente de interacción. También es posible que uno o ambos del marcador selectivo negativo y el agente de interacción se comunican entre células tumorales.

La proteína ciclina G1 mutada también se puede usar para evitar la reestenosis vascular después de procedimientos vasculares invasivos tales como angioplastia, injertos vasculares, tales como injertos arteriales, o cirugía de derivación coronaria. Por tanto, se proporciona un método para evitar la reestenosis que comprende administrar a un animal, o al sitio de un procedimiento vascular invasivo o lesión vascular, proteína ciclina G1 mutada. La proteína ciclina G1 mutada se administra en una cantidad eficaz para evitar la reestenosis en un animal. La proteína ciclina G1 mutada se puede administrar durante o después del procedimiento vascular invasivo. La expresión "procedimiento vascular invasivo" como se usa en este documento significa cualquier procedimiento que implique reparación, retirada, sustitución y/o redirección (por ejemplo, derivación o shunt) de un parte del sistema vascular incluyendo, aunque sin limitación, arterias y venas. Tales procedimientos incluyen, aunque sin limitación, angioplastia, injertos vasculares tales como injertos arteriales, retiradas de coágulos de sangre, retiradas de porciones de arterias o venas, y cirugía de derivación coronaria.

En una realización preferida, la proteína ciclina G1 mutada se administra a un animal transduciendo células vasculares en el sitio de un procedimiento vascular invasivo o una lesión vascular con un polinucleótido que comprende una construcción génica de ciclina G1 mutada.

Tales polinucleótidos pueden estar contenidos en un vehículo de expresión adecuado como se ha descrito anteriormente en este documento, que se transduce a las células del sitio de un procedimiento vascular invasivo o lesión vascular. En una realización, el vehículo de expresión es un vector viral tales como aquellos que se han descrito anteriormente en este documento. En una realización, el vector viral es un vector retroviral, que puede ser como se ha descrito anteriormente en este documento.

Cuando se emplea un vector retroviral, tal vector retroviral se administra en una cantidad que se ha descrito anteriormente en este documento, y se administra por vía intravascular. En una realización, el vector retroviral se administra al sitio del procedimiento vascular invasivo o la lesión vascular. Los vectores transducen las células vasculares en el sitio del procedimiento vascular invasivo o lesión vascular, por lo que la proteína de ciclina G1 mutada se produce en tales células, inhibiendo por tanto la función de la proteína ciclina G1 nativa y por tanto evitando la reestenosis evitando la proliferación de tales células.

Este método se puede aplicar para la prevención y tratamiento de reestenosis y la prevención o tratamiento de lesiones vasculares después de una diversidad de procedimientos vasculares invasivos, incluyendo, pero sin limitación, angioplastia cardiovascular, injertos arteriales, y cirugía de derivación coronaria. Este método también se aplica en la prevención y tratamiento de lesiones vasculares, incluyendo, pero sin limitación, lesiones de las arterias femoral, carótida o renal, particularmente arterias renales asociadas a fístulas por diálisis renal.

La proteína ciclina G1 mutada también se puede emplear en la prevención y/o tratamiento de turbidez corneal u opacidad corneal, que en muchos casos está provocada por proliferación de queratocitos, y en el tratamiento y/o prevención de cataratas. Por tanto, se proporciona un método para evitar o tratar turbidez corneal y/o cataratas que comprende administrar la proteína ciclina G1 mutada al animal afectado, o directamente en el ojo afectado. La proteína ciclina G1 mutada se administra en una cantidad eficaz para evitar o tratar turbidez corneal o cataratas en un animal.

En una realización preferida, la proteína ciclina G1 mutada se administra al animal transduciendo células oculares con un polinucleótido que comprende la construcción génica de ciclina G1 mutada. Tal polinucleótido puede estar contenido en un vehículo de expresión adecuado como se ha descrito anteriormente en este documento. El vehículo de expresión se transduce a células oculares. En una realización, el vehículo de expresión es un vector viral como se ha descrito anteriormente en este documento. En una realización, el vector viral es un vector retroviral, que puede ser como se ha descrito anteriormente en este documento.

Cuando se emplea un vector retroviral, tal vector retroviral se puede administrar por vía sistémica (por vía intravenosa o por vía intraarterial) en una cantidad de aproximadamente un 10% de volumen sanguíneo, o de entre aproximadamente 500 ml y aproximadamente 1.000 ml por dosis para adultos que pesen 70 kg o más. El vector retroviral también se puede administrar al ojo por vía tópica tal como en forma de gotas oculares. El vector retroviral también se puede administrar por vía intraocular. Los vectores transducen células oculares, tal como queratocitos y/o células epiteliales del cristalino, inhibiendo por tanto la función de la proteína ciclina G1 nativa y evitando o tratando de ese modo la turbidez corneal o cataratas evitando la proliferación de queratocitos o células epiteliales del
cristalino.

Ejemplos

La invención se describirá a continuación respecto a los ejemplos; sin embargo, el alcance de la presente invención no se pretende limitar por los mismos.

Ejemplo 1 Efectos citocidas y citostáticos de una proteína ciclina G1 mutada en células cancerosas Materiales y Métodos

Células, condiciones del cultivo celular, plásmidos y vectores que llevan genes marcadores y de control del ciclo celular. Las células NIH3T3, 293T y MiaPaca2 de cáncer pancreático humanas se suministraron por la ATCC. Las células NIH 3T3 y 293T se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con suero fetal bovino al 10% (D10; Biowhittaker). Los plásmidos pcgp que contenían los genes virales gag pol, y un vector retroviral, pcnBg, que expresa una construcción de \beta-galactosidasa dirigida al núcleo se proporcionaron amablemente por los Drs. Paula Cannon y Ling Li respectivamente (Laboratorios de Terapia Génica de la USC, Los Ángeles, CA). El plásmido que contiene la proteína env de la G del virus de la estomatitis vesicular (VSVG) se proporcionó amablemente por el Dr. Theodore Friedmann, (Universidad de California, San Diego, CA). Una construcción truncada (a.a. 41-249) de ciclina G1 (dnG1) se clonó al vector de expresión retroviral pREX.

Producción de vectores retrovirales dirigidos a la matriz que llevan construcciones de ciclina G1 mutante. Se generaron elevados títulos de vectores utilizando un sistema de contransfección transitorio de tres o cuatro plásmidos, (Soneoka, et al., Nucl. Acids Res., págs. 628-633 (1995)) en el que los componentes de empaquetamiento gag-pol, y una env quimérica basada en MLV que lleva un motivo de unión a colágeno (dirigido a la matriz) derivado del factor von Willebrand expresado por el promotor CMV se pusieron en plásmidos separados, conteniendo cada uno el origen de replicación SV40. Los vectores que se expresaron sin WT env se denominaron Bv1 o Hs2 (Bv = derivado de vWF bovino; Hs = derivado de vWF humano; LF o 1 = enlazadores derivados de secuencias vWF naturales; LS o 2 = enlazadores convencionales). Para aumentar adicionalmente el título viral, una proteína env VSVG fusogénica (Yee, et al., Methods Cell Biol., Vol. 43, págs. 99-112 (1994)) se coexpresó con proteínas env Bvl o Hs2 en un protocolo de co-transfección de 4 plásmidos.

Los títulos virales en células NIH3T3 de ratón se determinaron como se ha descrito previamente, basándose en la expresión de los genes de la \beta-galactosidasa o de resistencia neomicina fosfotransferasa, neo^{r} (Skotzko, et al., Cancer Res., Vol. 55, págs. 5493-5498 (1995)). El título viral se expresó como el número de unidades formadoras de colonias (ufc)/ml resistentes a G418, y en el intervalo de entre 10^{6} y 10^{8} ufc/ml, dependiendo de la naturaleza y cantidad de ADN de plásmido usado en el protocolo de transfección.

Estudios de eficacia in vitro . Para evaluar los efectos citocidas/citostáticos del dnG1, las células transducidas se evaluaron en su potencial proliferativo contando el número de células viables en cada cultivo en intervalos seriados (hasta 4 días) después de la transducción sin selección por G418. El análisis de Western de la expresión de la proteína ciclina G1 endógena y mutante se realizó como se ha descrito previamente (Skotzko, et al., 1995).

Los estudios de eficacia in vivo se realizaron de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales (Institution Animal Care and Use Committee) de la Universidad de California del Sur. Para evaluar la eficacia del suministro génico dirigido basado en los efectos antitumorales del tratamiento con el vector de dnG1 in vivo, se estableció un modelo de metástasis de hígado simulando la vía de diseminación del cáncer de colon humano en ratones desnudos. Brevemente, se infundieron 7 x10^{5} células tumorales lentamente en la vena portal mediante un catéter permanente que se mantuvo en su sitio durante 14 días. Se comenzaron infusiones intracatéter de dosis bajas o elevadas de vector dnG1 (títulos: 3 x 10^{6} o 9 x 10^{8} ufc/ml a 200 \mul/día) o un volumen equivalente de solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) tres días después y continuaron durante un total de 9 días. Los ratones se sacrificaron mediante dislocación cervical un día después de terminar el tratamiento.

Análisis histológico y morfométrico. Se extirparon los lóbulos hepáticos, se fijaron en formalina al 10%, se marcaron con A para los lóbulos derecho y caudado, B para el lóbulo izquierdo y C para el lóbulo medio, se procesaron de manera separada y se incluyeron en bloques de parafina. La eficacia antitumoral del tratamiento con vector dnG1 se evaluó del siguiente modo: Se examinaron secciones de tejido teñidas con H & E mediante microscopía óptica, y las áreas superficiales de secciones representativas de hígado y focos tumorales de los lóbulos A, B y C se midieron mediante análisis morfométrico usando un sistema de análisis de imágenes Optimas. La evaluación de la seguridad retroviral incluyó la evaluación de la integridad de la arquitectura del hígado, el examen de la presencia de inflamación o necrosis hepatocelular, infiltrados inflamatorios, colestasis y/o trombosis. Las secciones tisulares también se sometieron a inmunotinción para citoqueratina, ciclina G1 humana, apoptosis, PAS, vimentina y CD68.

Análisis estadístico. Para el estudio de eficacia in vivo, se compararon tres grupos de tratamiento: dosis baja de Bv1/dnG1 (título: 3 x10^{6} ufc/ml), elevada dosis de Hs2/VSVG/dnG1 (título: 9,5 x10^{8} ufc/ml) y control PBS. El vector null no se usó en los estudios in vivo basándose en la ausencia de actividad citocida in vitro, y ya que un vector null no se usaría en última instancia en ensayos clínicos. Inicialmente se estudiaron ocho ratones; cuatro se trataron con una elevada dosis de vector dnG1, y cuatro con PBS. Posteriormente, se trataron cuatro ratones adicionales con una dosis baja de vector dnG1. Las variables de respuesta, área superficial total (A. S.) del hígado, A. S. total del tumor, proporción de A. S. del tumor a A. S. del hígado, y A. S. medias de los focos tumorales, se transformaron por logaritmos antes de un análisis formal. Se usó un análisis de mediciones repetidas con el lóbulo como el factor de mediciones repetidas para determinar si el tratamiento tiene o no un efecto en cada una de las variables de respuesta. También se realizaron comparaciones por pares para las variables resultantes con valores globales de p < 0,05 entre grupos.

Resultados

Se ha creado una ciclina G1 (dnG1) humana mutante con una deleción en la caja de ciclina, una región conservada entre las ciclinas que en parte determina la asociación ciclina-Cdk que induce la activación de la Cdk. Los estudios preliminares demostraron que dnG1 muestra propiedades antiproliferativas en células de músculo liso vascular. Estos descubrimientos sugieren que dnG1 puede actuar para inhibir la función de la ciclina G1 de tipo silvestre o formar complejos inactivos con moléculas Cdk diana. Por lo tanto, el rendimiento de una serie de construcciones citocidas de ciclina G1 mutante se ensayó in vitro para determinar la construcción óptima para posteriores estudios
in vivo.

Una línea celular de cáncer indiferenciada humana de origen pancreático se seleccionó como el prototipo de un cáncer gastrointestinal metastásico. La eficacia de transducción retroviral en estas células cancerosas fue excelente, en el intervalo de entre el 26% y el 85%, dependiendo de la multiplicidad de infección (4 y 250 respectivamente; Fig.1A). Para la selección de un gen terapéutico óptimo, se realizaron estudios de proliferación celular en células transducidas usando vectores que llevan diversas construcciones de ciclina G1. La Figura 1B muestra los efectos citocidas/citostáticos de vectores retrovirales de ciclina G1 mutante y antisentido en células cancerosas transducidas. En condiciones convencionales, el vector dnG1 mostró sistemáticamente el mayor efecto anti-proliferativo, concomitante con la presencia de ciclina G1 inmunorreactiva en la región de 20 kDa, representando la proteína dnG1 (Figura 1C). Basándose en estos resultados, el vector dnG1 se seleccionó para posteriores estudios de eficacia
in vivo.

Se realizó la evaluación histológica e inmunocitoquímica de focos tumorales metastásicos de ratones tratados con PBS o el vector dnG1 a baja dosis y se evaluó con un sistema de formación de imágenes Optimas. La Figura 2 muestra que la proteína ciclina G1 humana se expresa mucho en focos tumorales metastásicos, como se evidencia por la inmunorreactividad nuclear potenciada de la ciclina G1 (material teñido de marrón) en los animales tratados con PBS (Figura 2A), y en los focos tumorales residuales (Figura 2B) de animales tratados con el vector dnG1. El examen histológico de secciones de hígado de los animales control mostró sustanciales focos tumorales con consiguientes áreas de angiogénesis y formación de estroma (Figura 3A & C); los componentes epiteliales se tiñeron positivas para citoqueratina y células estromales/endoteliales asociadas a tumor se tiñeron positivas para vimentina y receptor FLK (datos no mostrados). Por el contrario, el tamaño medio de focos tumorales en los animales tratados con vector dnG1 a baja dosis disminuyó de forma significativa en comparación con los controles PBS (Figura 3B & D, indicado por flechas; p = 0,001), mostrando simultáneamente un aumento focal en la densidad de núcleos apoptóticos (Figura 3F & H; indicado por flechas) en comparación con el grupo control PBS (Figura 3E). Además, se observó infiltración por macrófagos PAS+, CD68+ y cargados de hemosiderina (Figura 3D; indicada por flecha) en los focos tumorales residuales de animales tratados con el vector dnG1, sugiriendo un aclaramiento activo de células tumorales en degeneración y restos tumorales por el sistema reticuloendotelial hepático.

El análisis morfométrico de los focos tumorales confirmó que la estrategia dirigida de suministro de genes terapéutico fue eficaz ya que infusiones en la vena portal (mediante catéter permanente) de elevadas dosis de vectores dnG1 dirigidos a la matriz indujeron disminuciones drásticas de los tamaños de los focos tumorales cuando se comparó con los animales control basadas en todas las variables de respuesta (p < 0,005; Tabla I). En comparaciones por pares de las tres variables resultantes, se presentó una respuesta del tumor dosis-dependiente al tratamiento con el vector dnG1, y actualmente están en proceso estudios adicionales para determinar una mejor respuesta del tumor a diversas dosis de vector en términos de encogimiento del tumor frente a la desaparición completa de los focos tumorales y para predecir la dosis mínima eficaz de vector que puede conseguir la respuesta deseada del tumor en ensayos de terapia génica de Fase I/II. Es importante que no se detectó evidencia de daño hepatocelular, necrosis, trombosis o colestasis en secciones de tejido de animales tratados con el vector dnG1, indicando que el vector dnG1 dirigido a la matriz (dosis acumulativa: 10^{6} a 10^{9} ufc) puede tener un amplio margen de seguridad.

Discusión

Se realizaron estudios de eficacia y seguridad in vivo en un único modelo de metástasis hepática en ratón desnudo, y se estableció la comprobación del principio de que (i) el suministro génico terapéutico se puede conseguir mediante repetidas infusiones en la vena portal (mediante un catéter permanente) de vectores retrovirales dirigidos a la matriz que llevan una estructura citocida de ciclina G1 mutante, como se evidencia mediante disminuciones estadísticamente significativas de los tamaños de focos tumorales en ratones tratados con el vector dnG1 en comparación con aquellos de animales control, y (ii) los vectores dnG1 dirigidos a la matriz se pueden administrar por vía sistémica con un amplio margen de seguridad, como se indica mediante la ausencia de necrosis de hepatocitos asociada , trombosis o colestasis. Tomados en conjunto, estos hallazgos representan un avance definitivo hacia el desarrollo de vectores de terapia génica dirigida inyectables para cáncer metastásico.

Ejemplo 2

Inhibición a Largo Plazo de Formación de Neoíntima en Arterias de Rata Lesionadas con Balón mediante Instilación Intraluminal de Vectores Retrovirales Dirigidos a la Matriz que llevan una Construcción Citocida de Ciclina G1.

Este ejemplo demuestra la inhibición de la formación de neoíntima mediante una proteína ciclina G1 mutada en un modelo de reestenosis vascular en rata.

Materiales y Métodos

Células y Condiciones de Cultivo Celular. Se mantuvieron células A10 de músculo liso aórtico de rata (ATCC CRL1476) como monocapas subconfluyentes en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco BRL) suplementado con suero fetal bovino al 20% (FBS). Se mantuvieron células NIH 3T3 embrionarias de ratón (ATC CRL 1658), células 293T humanas células 293 de riñón embrionarias (suministradas amablemente por el Dr. Michele Galos, Universidad de Stanford, Palo Alto, CA) transformadas con el antígeno T grande del SV40, y células MiaPaca2 humanas de tumor pancreático (ATCC CRL 1420) de forma similar en DMEM suplementado con FBS al 10%, penicilina, y estreptomicina. Se prepararon células primarias de músculo liso de mono de arterias carótidas comunes izquierdas obtenidas 7 días después de la lesión con balón, mediante el cultivo de 2 mm de segmentos arteriales en medio Williams E (Gibco BRL) suplementado con FBS al 30%. Los segmentos arteriales se retiraron después de que las células hubieran migrado y crecido como células de monocapa adherente en la placa de cultivo tisular, y las células se mantuvieron adicionalmente en medio Williams E - FBS al 20%. Después de la inmunotinción con una alfa-actina de músculo liso monoclonal de ratón anti ser humano (DAKO), un 95% de células obtenidas del cultivo primario fueron positivas para alfa actina de músculo liso, indicando su origen.

Construcción de Plásmido. Se generaron construcciones de ciclina G1 mutante (véase Figura 5), incluyendo el fragmento del extremo C de 630 pb (nucleótidos 121 a 750) de ADNc de ciclina G1 que codifica los aminoácidos 41 a 249 (Wu et al., 1994) por PCR, se clonaron en vector TA (Invitrogen), se confirmaron mediante secuenciación, y se volvieron a clonar en el vector retroviral pG1XSvNa (Skotzko et al., 1995). El fragmento KpnI se obtuvo mediante digestión de la construcción resultante, conteniendo la secuencia del componente de empaquetamiento retroviral de pG1XSvNa y el ADNc insertado de ciclina G1, y se clonó en pRV109 (Soneoka, et al. 1995) para obtener el plásmido de expresión retroviral, pG1DNT41a249/REX, que contiene un origen de replicación (ori) SV40 y promotor
CMV.

Plásmidos de expresión de gag, pol, env, y proteínas b-galactosidasa -pcgp es un plásmido dirigido por CMV que expresa gag y pol de MLV. pcnBg es una construcción de expresión de \beta-gal en vector retroviral pREX, generado por la construcción por etapas en pG1XSvNa y posterior pRV109 como se ha descrito (Han, et al., J. Virol., Vol. 71, págs. 8103-8108 (1997)). Ambos, pcgp y pcnBg, se suministraron amablemente por la Dra. Paula Cannon (Laboratorios de Terapia Génica de la USC, Los Ángeles CA). El plásmido pCVG es un plásmido dirigido por CMV que expresa la glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G) generado por sustitución del fragmento EcoRI de pCEE+ (MacKrell, et al., J. Virol., Vol. 70, págs. 1768-1779 (1996)) por el fragmento EcoRI de pHCMV-G (un obsequio de Theodore Friedman, U. C. San Diego) que contiene el ADNc que codifica la VSV-G (Yee, et al., 1994). CAEP es un plásmido dirigido por CMV que expresa la gp70 de MLV 4070A (CAE) anfotrópico que contiene un motivo dirigido a la matriz (es decir, dominio de unión a colágeno, CBD). El CAEP se generó insertando un dominio de unión a colágeno mínimo (WREPGR[M]ELN) derivado del Factor von Willebrand humano (Takagi, et al., J. Biol. Chem., Vol. 266, págs., 5575-5579 (1991)) en la proteína de envuelta retroviral en un único sitio de clonación PstI introducido en el dominio N-terminal de la proteína madura. Un residuo metionina (M) se insertó de manera conservativa en lugar del residuo cisteína (C) de tipo silvestre dentro del CBD mínimo, que de otro modo interferiría con la formación apropiada de uniones disulfuro intramoleculares en la proteína de envuelta quimérica (datos no
publicados).

Producción de vector retroviral. Se sembraron células 293T humanas en placas de cultivo celular de 10 cm con una densidad de 3 x 10^{6} células por placa un día antes de la transfección. Las cotransfecciones transitorias, utilizando 15 mg de pcgp, 10 mg de pCVG, 5 mg de CAEP, y 15 mg de pcnBg o pG1DNT41a249/REX se realizaron mediante el método de coprecipitación de fosfato cálcico/ADN (Soneoka, et al., 1995). Las células transfectadas se incubaron a 37ºC durante 16 horas y se resembraron en 6 ml de medio que contenía 10 mM de butirato de sodio para reforzar la producción de partículas virales. Aproximadamente 10-12 horas después, el medio de cultivo de células productoras se sustituyó por 8,5 ml de medio nuevo y se incubó durante 24 horas adicionales de producción de vector. Los sobrenadantes retrovirales resultantes se recuperaron, se filtraron a través de filtros de 0,45 mM, se alicuotaron, y se almacenaron a 70ºC antes de su uso.

Determinación de títulos de vector retroviral. Se colocaron células NIH 3T3 en placas de cultivo de 6 pocillos con una densidad de 2,5 x 10^{4} células por pocillo un día antes de la transducción. Para la transducción celular, se añadieron sobrenadantes retrovirales diluidos de forma seriada que contenían 8 \mug/ml de polibreno a los cultivos celulares, seguido de incubación durante 2 horas a 37ºC y posterior adición de 2 ml de medio nuevo. 24 horas después, las células se resembraron con medio fresco que contenía 800 \mug/ml de G418 y el medio se sustituyó cada 3 días. Las colonias resistentes a G418 se contaron 10 días post-transducción por fijación en formalina al 10% y tinción con azul de metileno al 10% en metanol al 100%. Se determinaron los títulos de vector retroviral multiplicando el número total de colonias viables por el factor de dilución de los sobrenadantes retrovirales que se aplicó a los respectivos cultivos celulares.

Determinación de eficacia de transducción en células A10 de rata. Se colocaron SMC A10 en placas de cultivo de 6 pocillos con una densidad de 3 x 10^{4} células por pocillo un día antes de la transducción. Se añadieron a las células los sobrenadantes retrovirales diluidos de forma seriada que contenían la construcción de expresión de \beta-gal y 8 mg/ml de polibreno. 72 horas después, las células se fijaron en formaldehído al 2%, glutaraldehído al 0,2% y se tiñeron con ferrocianuro de potasio 4 mM, ferrocianuro 4 mM, MgCl_{2} 2 mM, y 400 mg/ml de X-gal. Se determinaron las eficacias de transducción por los porcentajes de células que presentaban núcleos teñidos de azul.

Ensayos de proliferación celular en cultivos celulares transducidos con vector. Se sembraron células A10 en placas de cultivo de 12 pocillos con una densidad de 1,4 por 10^{4} células por pocillo. Después de la unión e incubación durante una noche, las células se incubaron en 0,5 ml de los respectivos sobrenadantes retrovirales que contenían 8 \mug/ml de polibreno a 37ºC durante 2 horas, seguido de la adición de 1 ml de medio nuevo. El número de células viables en cada grupo de tratamiento (preparado por triplicado) se determinó en los días posteriores a la transducción celular. Se sembraron SMC de mono y células MiaPaca2 de forma similar en placas de cultivo de 24 pocillos con una densidad de 3 x 10^{3} células por pocillo. Como se ha descrito anteriormente, las células se incubaron con 0,2 ml del sobrenadante retroviral que contenía 8 \mug/ml de polibreno, se añadieron 0,5 ml de medio fresco después de 2 horas, y el número de células viables se determinó obteniendo los cultivos celulares en días sucesivos.

Producción y purificación de anticuerpos-Para generar anticuerpos específicos anti-ciclina G1, se sintetizó un péptido sintético ([C]KHSYYRTTHLPTIPEMVP) que representaba 18 residuos en el extremo C-terminal de ciclina G1 humana, se conjugó a hemocianina de lapa californiana (KLH), y se usó como un inmunógeno para obtener anticuerpos policlonales en conejos. Se añadió un residuo cisteína [C] al extremo N del péptido para facilitar la conjugación de sitio único a KLH. Se realizó la purificación posterior de anticuerpos policlonales anti-ciclina G1 de suero inmune de conejo mediante cromatografía de afinidad del siguiente modo: Se cargó suero de conejo filtrado en una columna Affi-Gel 10 (Bio-Rad) unida de forma covalente al péptido de inmunización de la ciclina G1. Después de un lavado a fondo, se recuperaron los anticuerpos unidos en tampón de elución (glicina 0,1 mM, pH 2,7) y se neutralizó mediante dilución 1:10 con Tris HCI 1 M (pH 8,0) en PBS. Las fracciones de pico que contenían los anticuerpos anti-ciclina G1 purificados por afinidad se combinaron y almacenaron a -70ºC antes de su uso.

Análisis de transferencia de Western. Aproximadamente 15 mg de proteína soluble obtenida como lisado de detergente de células transducidas se resolvieron por SDS-PAGE. El gel después se transfirió a temperatura ambiente a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore) a 120 mA durante 1,5 horas, usando un sistema tampón Tris-glicina (Tris HCI 25 mM, pH 8,3, glicina 192 mM, metanol al 15%). La membrana se bloqueó en albúmina bovina al 3% en PBS durante 1 hora antes de la incubación con el anticuerpo primario diluido en tampón de transferencia de Western (BSA al 1%, Tween-20 al 0,05% en PBS, pH 7,4) durante 30 minutos. Las membranas se lavaron con PBS tres veces seguido de la incubación con anticuerpos secundarios conjugados con fosfatasa alcalina durante 30 minutos. Después de tres lavados adicionales con PBS, se desarrolló un producto de reacción insoluble en presencia de 0,25 mg/ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) y 0,5 mg/ml de nitroazul de tetrazolio (NBT) en tampón sustrato (Tris HCI 100 mM pH 9,5, NaCl 100 mM, y MgCl_{2} 5 mM).

Transferencia mediada por retrovirus de la construcción de ciclina G1 mutante en un modelo de lesión en carótida de rata de reestenosis vascular. De acuerdo con un protocolo de terapia génica aprobado por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales (Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)) de la USC con anestesia general (ketamina 100 mg/Kg, Rompún 10 mg/Kg), se usó un catéter de embolectomía arterial 2F Intimax (Applied Medical Resources Corp) para exponer el endotelio arterial de la carótida de entre 350 y 450 g de ratas Wistar. El catéter se insertó en la arteria carótida, que se ligó distalmente, y se pasó al interior de la arteria carótida común. El balón se infló hasta un diámetro de 7 unidades (escala francesa de catéter) y se pasó tres veces a lo largo de la arteria carótida. Después de la lesión por balón, el catéter de embolectomía se retiró, y la arteria carótida se pinzó de forma transitoria y se expuso a los vectores retrovirales durante 30 minutos. Los grupos de ratas recibieron una infusión de 30 ml de solución salina (n = 6), vectores retrovirales que llevaban construcción de ciclina G1 mutante (n = 9), o un vector control (n = 8), con un grupo adicional de ratas no tratadas que sirvieron como controles experimentales (n = 7). Las ratas se sacrificaron de forma precisa 4 semanas después mediante una sobredosis de pentobarbital sódico (120 mg/Kg IM). Se tiñeron las secciones fijadas con formalina de arterias carótidas no tratadas y tratadas con vector con tinción de elastina de Verhoeff, las secciones histológicas se observaron mediante microscopía óptica, y se realizó una evaluación morfométrica de las áreas superficiales de la neoíntima frente a la media usando un sistema de análisis de imágenes Optimas. La extensión de la hiperplasia de la íntima se expresa como proporciones I:M. La significancia de las diferentes entre las proporciones I:M de arterias no tratadas, tratadas con PBS y tratadas con vector se determinó mediante un ensayo t por pares.

Resultados

Diseño y producción mediante ingeniería genética de construcciones de ciclina G1. Varios fragmentos antisentido obtenidos a partir de secuencias de ciclina G1 humana (Figura 4), que varían en longitud global y/o incorporación de secuencias aguas arriba, se construyeron (Figura 5). Además, se produjeron por ingeniería genética una serie de construcciones de expresión de ciclina G1 mutada y se evaluaron para su potencial para actuar de un modo negativo dominante. Como se muestra mediante un diagrama en la Figura 5C, estas construcciones de expresión estaban mutadas o truncadas en regiones que abarcaban el dominio conservado "caja de ciclina", que está implicado en la unión de ciclinas a CDK (Lees y Harlow, Mol. Cell Biol., Vol. 13, págs. 1194-1201 (1993)). Las dos mutaciones puntuales denominadas PM 61K/A y PM92E/A respectivamente, representan modificaciones de residuos que se predijeron críticas para el contacto ciclina A-CDK2 (Brown et al., J. Biol. Chen., Vol. 267, págs. 4625-4630 (1992); Jeffrey et al., Nature, Vol. 376, págs. 313-320 (1995)) y se conservan en ciclina G1 humana (Wu et al., 1994).

Usando una estrategia de clonación compleja (ocho etapas) (véase Figura 6), diversas construcciones de ciclina G1 antisentido y mutante preparadas como (flanqueadas por NotI/SaII) productos PCR se clonaron en los sitios NotI/SalI de las construcciones pBSKII (Stratagene) para generar construcciones pGl/BSKII, que posteriormente se extirparon y ligaron en estos sitios de clonación en un vector retroviral pG1XSvNa linearizado (Genetic Therapy, Inc.) para generar construcciones pG1G1SvNa. Estos plásmidos de expresión pG1G1SvNa se digirieron (en dos sitios) con KpnI, y el segmento resultante de pG1G1SvNa, incluyendo la construcción experimental de ciclina G1 flanqueada por el promotor LTR y secuencias de encapsidación Psi, se ligó en el vector retroviral pRV109 (Soneoka et al., 1995) para generar los vectores de expresión retroviral compuestos pGl/REX. Los vectores resultantes pG1/REX contienen un potente promotor híbrido 5' CMV/LTR que dirige el gen terapéutico, además de secuencias SV40 ori y genes de resistencia a antibióticos, que facilitan la producción de vector. La clonación de una mutación puntual de ciclina G1 representativa, PM61 K/A en pREX, se muestra en la Figura 6.

Eficacia citostática comparativa de construcciones de ciclina G1. Para investigar los efectos comparativos de las diversas construcciones de ciclina G1 antisentido y mutante en el crecimiento de células de músculo liso, cada uno de los respectivos fragmentos de ADN se clonó en la orientación apropiada en el vector de expresión retroviral pREX (véase anteriormente), que inicialmente se empleó como un plásmido transfectable para estudios de exploración. Se realizaron experimentos de transfección de fosfato de calcio por triplicado en cultivos celulares de músculo liso A10 de rata para determinar las construcciones óptimas knock-out de ciclina G1 para su posterior uso en estudios animales. En estos experimentos, las construcciones antisentido de longitud moderada denominadas AS587 y AS693 (véase Figura 7A) mostraron mayor actividad citocida que la construcción más corta AS423. Estudios previos (con plásmidos pG1aG1SvNa) indicaron que toda la secuencia codificante de ciclina G1 humana en orientación antisentido era relativamente ineficaz (datos no mostrados). Basándose en estas evaluaciones comparativas, AS693, una construcción que abarca las mismas regiones codificantes que AS587 (que se empleó previamente en estudios animales: Skotzko et al., 1995, Zhu et al., Circulation, Vol. 96, págs. 628-635 (1997)) incluyendo secuencias 5' adicionales, se consideró el diseño antisentido más eficaz. Entre las construcciones de ciclina G1 mutante ensayadas, una construcción DNT41 a 249 mutante particular, y una construcción de mutación puntual, PM 61K/A, se observaron como al menos tan eficaces como las construcciones antisentido para inhibir el crecimiento celular de músculo liso. La eficacia de la mutación puntual PM 61K/A es interesante ya que sugiere que este aminoácido, Lys-61, puede ser crítico para la asociación física con una quinasa asociada a ciclina G1 presuntiva (Smith et al., Exp. Cell Res. Vol. 230, págs. 61-68 (1997)). Basándose en estos estudios de exploración comparativos, DNT41-249 y PM 61K/A también se seleccionaron para estudios posteriores.

Caracterización de vectores retrovirales dirigidos a la matriz que llevan construcciones seleccionadas de ciclina G1. Se generaron cepas retrovirales a partir de sobrenadantes de células 293T humanas, usando un sistema transitorio de co-transfección de cuatro plásmidos (adaptado de Soneoka et al., 1995) en el que los componentes de empaquetamiento gag-pol, la env (CBD) dirigida a la matriz, la env fusogénica de VSVG, y un vector retroviral que lleva la construcción designada de ciclina G1, cada uno dirigido por el promotor CMV, se pusieron en plásmidos separados (Fig. 8A). El análisis de Western demostró la expresión uniforme de las dos proteínas de envuelta en las células productoras retrovirales y la incorporación estable en partículas virales (Fig. 8B), como se indica mediante la presencia de inmunorreactividad de MLV gp70 env y proteína VSV-G, normalizada a la proteína gag retroviral en preparaciones de vector purificadas.

Utilizando esta configuración de envuelta, se consiguieron de manera rutinaria títulos infecciosos de 10^{7}, como se determina por la expresión de resistencia a neomicina (construcciones de ciclina G1) o un gen marcador de \beta-galactosidasa. Para determinar la eficacia de transducción de los vectores retrovirales dirigidos a la matriz, pseudotipados con VSVG en SMC A10 de rata, las células se transdujeron a diversas MOI (en el intervalo de entre 0,005- 500), mostrando una profunda dependencia de la concentración (véase Figura 8B), e indicando que entre el 75% y el 96% de las SMC se transdujeron por MOI de entre 50 (título = 3 x 10^{6} ufc/ml) y 500 (título = 3 x 10^{7} ufc/ml), respectivamente, con estos vectores dirigidos a la matriz.

Citotoxicidad y mecanismos de acción de las construcciones de ciclina G1. Estudios previos de citotoxicidad de ciclina G1 antisentido mediada por retrovirus (es decir, AS587) describieron la formación de sincitios en células transducidas (Zhu et al., 1997), además de la detención del ciclo celular (Chen, et al., Hum. Gene Ther., Vol. 8, págs. 1667-1674 (1997)) y apoptosis manifiesta (Zhu, et al., 1997). Extraordinariamente, los efectos citostáticos de la construcción de ciclina G1 mutante también se acompañaban por formación de sincitios en cultivos celulares de A10 de rata observados en t = 48 horas después de la transducción con el vector pG1DNT41-249/REX (Figura 9), mostrando grandes células multinucleadas morfológicamente similares a las observadas con las construcciones antisentido (AS587 y AS693). Por el contrario, ni los procedimientos de transducción control ni el vector null (pREX) indujeron formación de sincitios en células A10 de rata (Fig. 9A-B), sugiriendo que las construcciones mutantes y antisentido afectan a la viabilidad celular de manera similar. Los efectos antiproliferativos de las construcciones knock-out de ciclina G1 se confirmaron en células de cáncer de páncreas humanas (Fig. 8C) y en SMC de mono (Fig. 8D) en las que la eficacia comparativa del mutante de expresión DNT41-249 de nuevo era mayor que las construcciones antisentido más potentes.

Para comprobar los mecanismos de acción de las respectivas construcciones de ciclina G1, la regulación negativa de la proteína de expresión ciclina G1 se demostró por análisis de Western de células de músculo liso transducidas con el vector antisentido AS693/REX. Como se muestra en la Figura 10A, se observa la regulación negativa de la expresión de la ciclina G1 en cultivos de SMC de transducidas con el vector antisentido en comparación con un vector control, con inhibición máxima observada en t = 48 horas después de la transducción. A la inversa, la expresión reforzada de la construcción de ciclina G1 mutante se verificó en células A10 transducidas con el vector (Figura 10B), como se muestra por la presencia de una banda inmunorreactiva de forma apropiada en - 20 kDa en cultivos celulares transducidos observados 24 y 48 horas después de la transducción con el vector de expresión mutante. Mientras que la demostración de la realización de vector en términos de dirigir la expresión de proteína es significativa, la proporción de células que expresan de forma transitoria el fenotipo predicho (citotóxico) en un momento determinado (antes de la muerte celular) puede ser pequeña. En estudios agudos de arterias lesionadas por balón in vivo, se observa la regulación positiva de la expresión de la proteína ciclina G1 en SMC de la neoíntima. Esta regulación positiva característica de la expresión de ciclina G1 no disminuyó en arterias lesionadas por balón tratadas con el vector null (Figura. 11 A), el control PBS (Fig. 11B), o el vector de expresión mutante (Fig. 8D). Por el contrario, fue evidente la marcada regulación negativa de la expresión de la ciclina G1 en las arterias tratadas con el vector de ciclina G1 antisentido (AS693/REX). Tomados en conjunto, estos datos indican que los efectos citocidas de las construcciones de ciclina G1 eran resultado de la modulación directa de la expresión de ciclina G1 en células transducidas.

Evaluación de pDNTG1/REX en un modelo de rata de reestenosis vascular. Finalmente; en dos estudios de eficacia controlados un mes in vivo, la instilación intraluminal de un vector dirigido a la matriz pseudotipado con VSVG que lleva el mutante de deleción N-terminal de ciclina G1 (DNT41-249/REX) en arterias de rata lesionadas con balón inhibió la formación de lesión en la neoíntima en comparación con el vector null, la solución salina control, y el grupo lesionado/no tratado (Fig. 12). A diferencia de la estrategia de vector citotóxico HStk (más ganciclovir), que produjo cicatrización masiva y deformidad del vaso (observaciones no publicadas), no había evidencia de necrosis, fibrosis, o deformación de la pared arterial en las arterias tratadas con el vector DNT41-249/REX, avalando la relativa seguridad de este enfoque. Además, los datos de eficacia a largo plazo (30 días) (Tablas 1 y 2) indican que se desarrolló poca o ninguna "puesta a nivel" de crecimiento de SMC en las lesiones de la neoíntima en los animales tratados con el vector DNT41-249/REX, sugiriendo que la transducción dirigida y expresión de una proteína ciclina G1 mutante citocida en SMC activadas puede tener un impacto significativo en la dinámica celular responsable de la secuela mórbida de reestenosis vascular.

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(Tabla pasa a página siguietne)

TABLA 1

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TABLA 2

2

3

Discusión

La presente descripción demuestra la utilidad de usar una proteína ciclina G1 mutante para inhibir la función de su homólogo normal de un modo dominante. Tal aplicación de una proteína mutada tiene la doble ventaja de bloquear el funcionamiento de elementos estrechamente relacionados (redundantes) y de producir un producto génico detectable (véase Figura 10). En este documento, un mutante de deleción y un mutante puntual de ciclina G1 mostraron propiedades antiproliferativas demostrables, que eran al menos tan eficaces como las construcciones de ciclina G1 antisentido más potentes. Los vectores retrovirales dirigidos a la matriz que llevan una construcción seleccionada de ciclina G1 mutante (DNT 41-249) se ensayaron inicialmente in vitro, donde se observó una gran inhibición del crecimiento celular. De manera comparable a las construcciones de ciclina G1 antisentido (Zhu et al., 1997), la construcción de ciclina G1 negativa dominante produjo formación de sincitios y apoptosis no prevista en SMC transducidas, sugiriendo una similitud en el mecanismo.

Además de las construcciones génicas terapéuticas, se consiguieron mejoras significativas en la eficacia del suministro de genes mediado por retrovirus a arterias lesionadas por la incorporación de tecnología dirigida a la matriz en las partículas virales (véase a continuación), que sirvieron para potenciar la biodisponibilidad del vector. Avances recientes en la tecnología dirigida de vectores retrovirales han demostrado que la función de supervivencia fisiológica inherente a la construcción primaria del factor von Willebrand (Montgomery et al., Hemophilia and von Willebrand Disease, Capítulo 44, págs. 1631-1675, W. B. Saunders Co., Philadelphia (1998); Ginsburg, D, et al., Proc. Nat. Asal. Sci. Vol. 86, págs. 3723-3727 (1989); Ruggeri & Zimmerman, Blood, Vol. 70, págs. 895-904 (1987)) se puede adaptar al desarrollo de vectores retrovirales dirigidos a la matriz (Hall, et al. Human Gene Therapy, Vol. 8, págs. 2183-2192 (1997); Anderson, Nature, Vol. 392 (Supl.), págs. 25-30 (1998)). La producción por ingeniería genética e inserción de un motivo derivado de vWF dirigido a la matriz (es decir, de unión a colágeno) en la envuelta retroviral potencia el suministro de genes in vivo por otorgando al vector basado en MLV un fenotipo propicio de ganancia de función, es decir, unión de alta afinidad a componentes de la matriz extracelular expuestos por lesión por catéter balón. Las envueltas anfotrópicas dirigidas a la matriz empleadas en estos estudios (véase Hall et al., 2000) suplantan los vectores originales ecotrópicos (específicos de roedores), que previamente se ha observado que se acumulan en sitios de lesión vascular (Hall et al., 1997) y que permiten la transducción eficaz de SMC adyacentes en estudios de eficacia de dos semanas de ciclina G1 antisentido (Zhu et al., 2000; presentado). Puesto que la activación y la proliferación de SMC mediales comienza en las horas después de la lesión, la migración a la neoíntima sucede el día 4 (Clowes et al. Lab. Invest., Vol. 49, págs. 327-373 (1983), Clowes et al., Circ Res., Vol. 56, págs. 139-145 (1985)), y la replicación aumenta notablemente durante las siguientes 2 semanas (Schwartz et al., 1995; DeMeyer y Blut, 1997), la penetración del vector y la transducción celular se optimizó adicionalmente mediante instilación intraluminal de los vectores anfotrópicos dirigidos a la matriz (i) en el momento de la lesión por balón (Zhu et al., 1997) y (ii) siete días después de la angioplastia (Hall et al., 2000), cuando la migración y proliferación de SMC en la neoíntima es máxima.

En la presente descripción, se usó un sistema de transfección transitorio adaptado de Soneoka et al., 1995 para producir elevados títulos de vectores retrovirales, en el que la expresión de los componentes de empaquetamiento, así como el gen terapéutico, se dirige por el potente promotor CMV; y cada una de las construcciones contiene un origen de replicación SV40 (ori), que sirve para facilitar la expresión de plásmido en células productoras 293T humanas. Los títulos virales en el intervalo de entre 3 x 10^{6}-3 x 10^{8} ufc/ml se consiguieron de forma rutinaria con estos reactivos. Además, la coexpresión de la proteína env VSVG fusogénica (Iida, et al., J. Virol., Vol. 70, págs. 6054-6059 (1996); Laitinen, et al., Hum. Gene Ther., Vol. 8, págs. 1645-1659 (1997); Yu, et al., Gene Therapy, Vol. 6, págs. 1876-1883 (1999)) mejoró adicionalmente los títulos virales (hasta 9 x10^{8} ufc/ml) sin concentración de vector adicional, facilitando por tanto la producción del vector y la caracterización de las construcciones terapéuticas prospectivas.

Conjuntamente, estas mejoras en el diseño, la producción por ingeniería genética y desarrollo del vector retroviral permitió el desarrollo de un protocolo de terapia génica optimizado y la consecución de eficacia a largo plazo para evitar la formación de neoíntima en el modelo de rata de angioplastia de balón (véase Tabla I). En dos estudios de eficacia controlados de un mes, el suministro intraluminal de un vector retroviral dnG1 dirigido a la matriz a la arteria carótida de rata lesionada por balón dio como resultado un - 50% de inhibición de formación de lesión en neoíntima con evidente "puesta a nivel" de crecimiento de SMC, una magnitud de respuesta inducida por solamente un fármaco adicional, un inhibidor de proteinquinasa C (Prescott, et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., Vol. 878, págs. 179-190 (1999)) y un vector adenoviral que lleva una construcción de sintasa de óxido nítrico (Shears, et al., J. Am. Coll. Sure., Vol. 187, págs. 295-306 (1999)). A diferencia de los vectores HStk (seguido de la administración de ganciclovir), que produce distorsión adversa de la histología arterial (Nabel, Nature, Vol. 362, págs. 844-846 (1993)), la aparente ausencia de necrosis, fibrosis y deformación de pared arterial en las arterias tratadas con el vector dnG1 (véase Figura 12) avala a la seguridad de este enfoque para uso clínico in vivo. En conclusión, este estudio combina importantes mejoras en las construcciones terapéuticas de ciclina G1 con avances en la tecnología dirigida a la matriz, metodologías de producción de vector, y protocolos de instilación para extender la utilidad de la terapia génica citocida para el tratamiento de reestenosis vascular.

Ejemplo 3 La Administración Sistémica de un Vector Retroviral Dirigido a la Matriz es Eficaz para la Terapia Génica de Cáncer en Ratones Materiales y Métodos

Células, condiciones de los cultivos celulares, plásmidos y vectores que llevan genes marcadores y de control del ciclo celular. Se suministraron células NIH3T3, 293T y MiaPaca2 humanas de cáncer pancreático por la ATCC. Las células NIH 3T3 y 293T células se mantuvieron en medio Eagle modificado por Dulbecco suplementado con suero fetal bovino al 10% (D10; Biowhittaker, Walkersville, MD, USA). Los plásmidos pcgp que contienen los genes gag pol virales, y un vector retroviral, pcnBg, que expresa una construcción de b-galactosidasa dirigida al núcleo se suministraron amablemente por los Drs. Paula Cannon y Ling Li respectivamente (Laboratorios de Terapia Génica de la USC, Los Angeles, CA). Una construcción de ciclina G1 (dnG1) truncada (a.a. 41-249) se clonó al vector de expresión vector retroviral pREX que se modificó de pHTT109 (Soneoka et al., Nucl. Acid Res. 23, 628-633.1995) para contener la secuencia del componente de empaquetamiento retroviral de G1XSvNa (un obsequio de Genetic Therapy, Inc., Gaithersburg, MD, USA).

Producción de vectores retrovirales dirigidos a la matriz que llevan construcciones de ciclina G1 mutante. Se generaron elevados títulos de vectores utilizando un sistema de co-transfección transitorio de tres o cuatro plásmidos (Soneoka et al., Nucl. Acid Res. 23, 628-633.1995) en el que los componentes de empaquetamiento gag-pol, y una env quimérica anfotrópica basada en el virus de la leucemia murina de Moloney (MuLV) que lleva un motivo de unión a colágeno (dirigido a la matriz) derivado del factor von Willebrand expresado por el promotor CMV, y un vector retroviral se pusieron en plásmidos separados, conteniendo cada uno el origen de replicación SV40. Los vectores se denominan Mx-nBg, Mx-dnG1 y CAE-dnG1, para indicar la envuelta específica usada y la construcción de expresión de genes incorporada en cada vector. El Mx-nBg representa un vector basado en MuLV modificado que lleva un motivo dirigido a la matriz en su envuelta, y un gen de b-galactosidasa dirigido al núcleo. El Mx-dnG1 es un vector citocida dirigido a la matriz que lleva una construcción de ciclina G1 mutante con deleción N-terminal (Gordon et al., Cancer Res. 60, 3343-3347.2000). El CAE-dnG1 es un vector no dirigido que lleva una envuelta de tipo silvestre anfotrópica basada en el MuLV (Morgan et al., J. Virol. 67, 4712-4721.1993) y la misma construcción citocida de ciclina G1 que en Mx-dnG1.

Los títulos virales en células NIH3T3 de ratón se determinaron como se ha descrito previamente, basándose en la expresión de los genes de B galactosidasa o de resistencia neomicina fosfotransferasa, neo^{r} (Skotzko et al., Cancer Res. 55, 5493-5498.1995). El título viral se expresó como el número de unidades formadoras de colonias (ufc)/ml resistentes a G418, y estaba en el intervalo de entre 10^{7} y 10^{8} ufc/ml.

Estudios de eficacia in vivo . Estos estudios se realizaron de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales (Institution Animal Care and Use Committee) de la Universidad de California del Sur. Para evaluar la eficacia del suministro de genes dirigido basado en los efectos antitumorales del tratamiento con el vector Mx-dnG1 in vivo, se establecieron xenoinjertos subcutáneos de tumor en ratones nu/nu atímicos mediante implante subcutáneo de 1-9 x 10^{7} células cancerosas MiaPaca2 humanas. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño de \sim50 mm^{3}, 200 \mula del vector Mx-dnG1 (título: 8 x 10^{6} ufc/25 g de ratón), el vector control Mx-nBg de título similar, un vector CAE-dnG1 no dirigido, o control placebo de solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) se inyectó directamente en la vena de la cola diariamente durante 7-10 días (un ciclo de tratamiento). El tamaño del tumor se midió cada 2-4 días con un calibrador Vernier, usando la fórmula para calcular el volumen de objetos elipsoides: Volumen Tumoral, mm^{3} = 4/3 p r_{1} r_{2} r_{3}. Los ratones se sacrificaron mediante dislocación cervical un día o una semana después de terminar uno o dos ciclos de tratamiento, respectivamente.

Ensayo de apoptosis. Se evaluaron secciones tisulares de nódulos tumorales para la inducción de apoptosis usando el kit Apoptag (Intergen, Purchase, NY, USA). Se fijaron nódulos tumorales ultracongelados con paraformaldehído y se permeabilizaron sus membranas con etanol y ácido acético. Se añadió enzima TdT seguido de un conjugado de peroxidasa anti-didoxigenina. Las secciones de tejido después se tiñeron con un sustrato de peroxidasa y tiñeron con el colorante de contraste verde metilo.

Análisis estadístico. (i) Para resumir el cambio de volumen tumoral a lo largo del tiempo (velocidad de crecimiento tumoral), una línea recta de ajuste por mínimos cuadrados se adaptó a los valores transformados por logaritmo, es decir, para cada ratón, se estimó la pendiente usando las primeras 5 mediciones a lo largo del tiempo. Estas pendientes calculadas se volvieron a transformar a la escala original tomando el antilogaritmo, y representan la tasa media de crecimiento tumoral (%) por día. Para comparar los diferentes vectores en cada uno de los tres experimentos, se usó un análisis de varianza ponderado con las pendientes estimadas como la variable dependiente. Para cada ratón, el peso era el recíproco de la suma del error típico de la pendiente estimada (como se ha calculado en el análisis inicial de línea recta de ajuste por mínimos cuadrados) más una estimación de la varianza entre pendientes basada en los tres experimentos. Para los experimentos I y II, se usó el ensayo F basado en el análisis de varianza para comparar los vectores Mx-nBg y Mx-dnG1, y para el experimento III, se usó el ensayo de F seguido del método de la diferencia menos significativa de comparaciones múltiples para comparar los tratamientos con el vector Mx-dnG1 con el CAE-dnG1 y placebo. Los resultados combinados de los datos analizados se muestran en la Tabla 3. (ii) El método del producto límite de Kaplan-Meier (Kaplan & Meier J. Amer. Statist. Assoc. 53, 457, 1958) se usó para estimar la probabilidad de la cuadruplicación del tumor como una función del tiempo (días). (iii) El ensayo de Tarone de tendencia (basado en el ensayo del logaritmo del rango; Tarone, Biometrika 62, 679, 1975) se usó para comparar el tiempo de cuadruplicación de los grupos tratados con el placebo (PBS), tratados con el vector CAE-dnG1 no dirigido, y el vector Mx-dnG1 dirigido a la matriz.

Resultados

En estudios de eficacia a corto plazo, se comenzaron las infusiones intravenosas del vector control Mx-nBg, el vector CAE-dnG1 no dirigido o el vector Mx-dnG1 citocida (cada vector= \sim8 x 10^{6} ufc/dosis) o un volumen equivalente de placebo de PBS, seis días después del implante de 1-9 x 10^{7} células MiaPaca2 cancerosas pancreáticas humanas, y se continuaron diariamente en un subconjunto de ratones durante un total de 7 infusiones de vector. Se observó un crecimiento progresivo del tamaño del tumor en ratones tratados con el vector Mx-nBg (Fig. 13), el vector CAE-dnG1 no dirigido y el placebo de PBS (Tabla 3). Por el contrario, se observó regresión del tumor en animales que se trataron con el vector Mx-dnG1 (Fig. 13; Tabla 3). La tinción inmunohistoquímica puso de manifiesto intensa inmunorreactividad nuclear para la proteína ciclina G1 humana expresada en los grandes tumores de los ratones tratados con el vector control, mientras que se observó atenuación de la expresión de ciclina G1 en los tumores residuales de animales tratados con el vector Mx-dnG1.

Para evaluar la eficacia del suministro de genes en tumores sólidos mediante vectores retrovirales dirigidos a la matriz, se sacrificaron dos subconjuntos de animales después de que se hubieran administrado siete dosis de vector (Fig. 13). El examen histopatológico de secciones tisulares de tumor teñidas con hematoxilina & eosina de animales tratados con el vector control Mx-nBg puso de manifiesto nódulos tumorales que consistían en una población heterogénea de células tumorales y asociadas al tumor, es decir, una proporción predominante de células epiteliodes malignas con una velocidad mitótica relativamente elevada con áreas intermedias de angiogénesis activa rodeadas de una delgada cápsula de tejido conectivo. Por el contrario, los nódulos tumorales de los animales tratados con el vector Mx-dnG1 mostraron evidencia de destrucción tumoral masiva, una elevada incidencia de apoptosis en las células tumorales restantes, e hiperplasia estromal reactiva. Un número de nódulos tumorales presentaron grandes áreas de necrosis central, una zona intermedia de tumor activo, y una zona periférica que contenía una abundancia de células apoptóticas. Otros nódulos tumorales en resolución estaban casi completamente rodeados de tejido conectivo denso, que representaban una proporción considerable de los tumores residuales que mostraban pequeñas regiones de células abiertamente apoptóticas y grados variables de inflamación aguda y crónica.

La eficacia de la transducción se determinó mediante tinción inmunohistoquímica de los nódulos tumorales, usando un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra el antígeno b-galactosidasa (GAL-40, Sigma, St. Louis MO, USA) seguido por análisis usando un sistema de formación de imágenes Optimas (Optimas Corporation, Bothell, Washington, EEUU). La eficacia de la transducción (expresada como %) se determinó contando el número de células positivas a b-galactosidasa en tres campos de gran aumento por nódulo tumoral, dividido por el número total de células x 100. Se observó un elevado nivel de transducción de células (35,7 \pm 1,4%; Tabla 4) en todos los nódulos tumorales de animales tratados con el vector Mx-nBg.

Para investigar adicionalmente la elevada eficacia de transducción observada en los nódulos tumorales, se realizó un estudio de distribución de vector mediante inyección intravenosa del vector MxnBg una hora y 24 h antes del sacrificio. La tinción inmunohistoquímica de la proteína de envuelta retroviral, usando el anticuerpo monoclonal de rata 83A25, mostró que la acumulación de partículas de vector en 1 h era pronunciada en áreas angiogénicas entrelazadas por todos los nódulos tumorales, mientras que no se observó inmunorreactividad para partículas de vector a las 24 h, indicando que la entrada viral en las células tumorales y asociadas al tumor ha tenido lugar. La tinción tricrómica de Mason de los nódulos tumorales puso de manifiesto que los lechos vasculares angiogénicos estaban revestidos de forma incompleta por células endoteliales, exponiendo por tanto componentes de la matriz extracelular a elementos sanguíneos circulantes. Posiblemente, la exposición del colágeno dentro de la vasculatura tumoral permeable potenció la concentración local de las partículas retrovirales dirigidas a la matriz, lo que, combinado con el alto índice mitótico observado en el nódulo tumoral, facilitó la transducción eficaz de células tumorales y vasculatura asociada. La tinción tricrómica de Mason confirmó que la fibrosis activa con abundante deposición de colágeno constituyó una proporción significativa del nódulo residual en relación a la actual masa tumoral.

La apoptosis es una consecuencia conocida del bloqueo de la ciclina G1 en células neoplásicas (Skotzko et al., Cancer Res. 55, 5493-5498, 1995) y células vasculares hiperplásicas (Zhu et al., Circulation 96, 628-635.1997). En consecuencia, la tinción inmunohistoquímica de los tumores tratados con el vector Mx-dnG1 puso de manifiesto un marcado aumento de la incidencia de células apoptóticas positivas a TUNEL, cuando se compararon con las de los animales tratados con el vector control. La apoptosis no se detectó en vasos angiogénicos de ratones tratados con el vector control. Por el contrario, la extensa apoptosis de células endoteliales (36 \pm 5%) en áreas de angiogénesis se observó en los animales tratados con el vector Mx-dnG1, así como en el compartimento estromal. En particular, la incidencia aumentada de apoptosis no se restringió solamente a las superficies periféricas de los nódulos tumorales, sino que se extendió a muchas capas celulares profundas en los nódulos tumorales. La capacidad del vector Mx-dnG1 para penetrar en los nódulos tumorales aparentemente se facilitó por la deposición de colágeno y/o exposición así como la permeabilidad vascular en el núcleo de los tumores sólidos. Los resultados de estudios inmunohistoquímicos que demostraron que la acumulación de partículas de vector era más pronunciada en áreas angiogénicas concordaban con este concepto. Además, la destrucción observada de células proliferativas endoteliales y células estromales, puede por sí misma inducir una cantidad desproporcionada de muerte celular tumoral por depleción del suministro vascular (Folkman, Nature Med. 1, 27-3.1995; Hanahan & Folkman, Cell 86, 353-364.1996; Fidler, J. Natl. Cancer Inst. 87, 1588-1592.1995) o estímulos del factor de crecimiento (Fukumura et al., Cell 94, 715-725.1998).

Los estudios de eficacia a largo plazo consistentes en dos ciclos (10 días) de tratamiento con el vector Mx-dnG1 (dosis del vector: 1 x 10^{7} ufc), una dosis equivalente de un vector CAE-dnG1 no dirigido, o un volumen igual de placebo de PBS, con un periodo de descanso intermedio, confirmaron que la eficacia terapéutica era dependiente del motivo peptídico dirigido a colágeno incorporado en la estructura primaria de la proteína de envuelta anfotrófica MLV (Fig. 14A & 14B). Se observó un rápido aumento del tamaño tumoral en ratones tratados con placebo, mientras que se observó una inhibición marginal del crecimiento tumoral en los animales tratados con el vector CAE-dnG1 no dirigido cuando se compararon con el control de PBS (p = 0,10; Tabla 3). Por el contrario, el crecimiento tumoral se inhibió de forma significativa en ratones tratados con el vector Mx-dnG1 en comparación con los ratones tratados con el vector CAE-dnG1 no dirigido (p = 0,014), los ratones tratados con el vector control Mx-nBg dirigido (p = 0,004), y los ratones tratados con PBS (p = 0,001; Tabla 3). Además, la velocidad de crecimiento tumoral en los ratones tratados con el vector Mx-dnG1 se mantuvo sistemáticamente menor que la de los animales tratados con el vector CAE-dnG1 no dirigido (Fig. 14A) a lo largo del periodo de seguimiento de 7 semanas.

Se realizaron estudios de supervivencia Kaplan-Meier en ratones tratados con placebo de PBS, el vector CAE-dnG1 no dirigido o el vector Mx-dnG1 dirigido a la matriz (Fig. 14B). Por razones éticas, en vez de la propia mortalidad animal, el criterio de valoración de supervivencia se estableció como el tiempo hasta la cuadruplicación del tumor en vez de la propia mortalidad de sujetos (registrado como el primer momento en el que se observó que la carga tumoral era cuatro veces mayor que la línea basal inicial). Si el volumen tumoral no se cuadriplicó en 47 días, el animal se sacrificó y el tiempo de cuadruplicación se limita en 47 días. El método del producto límite de Kaplan-Meier (Kaplan & Meier J. Amer. Statist. Assoc. 53, 457, 1958) se usó para estimar la probabilidad de la cuadruplicación del tumor como una función del tiempo (días). El ensayo de Tarone de tendencia (basado en el ensayo del logaritmo del rango; Tarone, Biometrika 62, 679, 1975) se usó para comparar los tiempos de cuadruplicación de los grupos tratados con placebo (PBS), los tratados con el vector CAE-dnG1 no dirigido, y los tratados con el vector Mx-dnG1 dirigido a la matriz. Usando el ensayo del logaritmo del rango, el valor p global para comparar los tres grupos simultáneamente fue 0,003, con una tendencia que era significativa hasta un nivel de 0,004. Estos datos indican que la probabilidad de control a largo plazo del crecimiento tumoral era significativamente mayor con el vector MxdnG1 dirigido a la matriz que con el vector CAE-dnG1 no dirigido o el placebo de PBS.

Para evaluar la toxicidad potencial del vector dirigido a la matriz, se recuperaron los órganos no dirigidos al final de uno o dos ciclos de tratamiento (dosis de vector acumulativa: 8 x 10^{7} ó 1,6 x 10^{8} ufc, respectivamente). Los perfiles químicos séricos eran normales y el examen histológico de médula ósea, pulmón, corazón, cerebro, hígado, riñón, testículos, colon y piel no pusieron de manifiesto evidencia de daño en órganos. Estos resultados proporcionan un refuerzo adicional del concepto (Gordon et al., Cancer Res. 60, 3343-3347, 2000) de que parece ser que la inyección intravenosa del vector retroviral Mx-dnG1 tiene un amplio margen de seguridad.

TABLA 3

4

TABLA 4

6

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Discusión

Los resultados del ejemplo 3 demuestran que el vector retroviral dirigido a la matriz, aplicado por inyección en vena periférica (i) se acumuló en la vasculatura tumoral angiogénica en una hora, (ii) transdujo células tumorales con un elevado nivel de eficacia, y (iii) potenció el suministro de genes terapéutico y eficacia a largo plazo sin provocar toxicidad apreciable. Tomados en conjunto, estos resultados proporcionan la primera prueba definitiva del principio de que un vector retroviral dirigido a la matriz inyectado directamente en una vena periférica mejora el suministro de genes terapéutico en tumores sólidos.

<110> Universidad de California del Sur

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<120> Proteína ciclina G1 mutada

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<130> 4-31342A/USC

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<160> 5

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<170> PatentIn versión 3.0

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<210> 1

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<211> 19

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<121> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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\sa{Cys Lys His Ser Tyr Tyr Arg Ile Thr His Leu Pro Thr Ile Pro Glu}

\sac{Met Val Pro}

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<210> 2

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<211> 251

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<121> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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7

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<210> 3

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<211> 254

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<121> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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8

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<210> 4

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<211> 226

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<121> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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9

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<210> 5

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<211> 223

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<121> PRT

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<213> S. pombe

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<400> 5

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Claims (45)

1. Un uso de una ciclina G1 mutada que tiene un fenotipo negativo dominante como se define por la capacidad de inhibir ciclina G1 humana para preparar una composición farmacéutica para tratar o prevenir una afección patológica o enfermedad que implique proliferación celular anormal en un animal, en el que dicha afección patológica o enfermedad se selecciona del grupo compuesto por tumores, cánceres, hiperplasias, reestenosis, turbidez corneal y cataratas.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que dicha proteína ciclina G1 mutada se administra a dicho animal suministrando a dicho animal un vehículo de expresión que comprende una construcción génica que codifica dicha proteína ciclina G1 mutada.

3. El uso de la reivindicación 1 en el que dicha proteína ciclina G1 mutada se administra a dicho animal transduciendo células que proliferan de forma anormal de dicho animal con un vehículo de expresión que comprende una construcción génica que codifica dicha proteína ciclina G1 mutada.

4. El uso de la reivindicación 2 en el que dicho vehículo de expresión es un vector retroviral.

5. El uso de la reivindicación 4 en el que dicho vehículo de expresión es un vector retroviral dirigido a la matriz.

6. El uso de la reivindicación 5 en el que dicho vector retroviral dirigido a la matriz se administra por vía sistémica a un animal.

7. El uso de la reivindicación 2 en el que dicho vehículo de expresión es un vector adenoviral.

8. El uso de la reivindicación 1 en el que dicha proteína ciclina G1 mutada comprende una proteína ciclina G1 truncada en el extremo amino.

9. El uso de la reivindicación 8 en el que dicha proteína ciclina G1 mutada comprende residuos aminoacídicos de una proteína ciclina G1 correspondientes a los residuos aminoacídicos 41 a 249 de una proteína ciclina G1 humana.

10. El uso de la reivindicación 9 en el que dicha proteína ciclina G1 mutada comprende residuos aminoacídicos 41 a 249 de una proteína ciclina G1 humana.

11. El uso de la reivindicación 1 en el que dicha proteína ciclina G1 mutada comprende una proteína ciclina G1 que tiene al menos una sustitución aminoacídica.

12. El uso de la reivindicación 11 en el que dicha sustitución es en un residuo que se corresponde al residuo 61 de una proteína ciclina G1 humana.

13. El uso de la reivindicación 11 en el que dicha proteína ciclina G1 mutada es una proteína ciclina G1 humana.

14. El uso de la reivindicación 12 en el que dicha sustitución es alanina.

15. El uso de la reivindicación 1 en el que dicha afección patológica o enfermedad se selecciona del grupo compuesto por tumores y cánceres.

16. El uso de la reivindicación 1 en el que dicho animal es un ser humano.

17. Una construcción génica que codifica una proteína ciclina G1 mutada que tiene un fenotipo negativo dominante como se define por la capacidad de inhibir ciclina G1 humana.

18. La construcción génica de la reivindicación 17 en la que dicha ciclina G1 mutada es un inhibidor negativo dominante de la ciclina G1 de tipo silvestre.

19. La construcción génica de la reivindicación 17 en la que dicha proteína ciclina G1 mutada comprende una deleción en la caja de ciclina de la ciclina G1 de tipo silvestre.

20. La construcción génica de la reivindicación 17 en la que dicha proteína ciclina G1 mutada comprende una proteína ciclina G1 truncada en el extremo amino.

21. La construcción génica de la reivindicación 20 en la que dicha proteína ciclina G1 mutada comprende residuos aminoacídicos de una proteína ciclina G1 correspondientes a los residuos 41 a 249 de una proteína ciclina G1 humana.

22. La construcción génica de la reivindicación 21 en la que dicha proteína ciclina G1 mutada comprende residuos 41 a 249 de una proteína ciclina G1 humana.

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23. La construcción génica de la reivindicación 17 en la que dicha proteína ciclina G1 mutada comprende una proteína ciclina G1 que tiene al menos una sustitución aminoacídica.

24. La construcción génica de la reivindicación 23 en la que dicha sustitución es en un residuo que se corresponde al residuo 61 de la proteína ciclina G1 humana.

25. La construcción génica de la reivindicación 24 en la que dicha proteína ciclina G1 mutada es una proteína ciclina G1 humana.

26. La construcción génica de la reivindicación 25 en la que dicha sustitución es alanina.

27. Un vehículo de expresión que comprende la construcción génica de la reivindicación 17.

28. El vehículo de expresión de la reivindicación 27 en el que dicho vehículo de expresión es un vector viral.

29. El vehículo de expresión de la reivindicación 28 en el que dicho vector viral es un vector retroviral.

30. El vehículo de expresión de la reivindicación 28 en el que dicho vector viral es un vector adenoviral.

31. Un uso de ciclina G1 mutada que tiene un fenotipo negativo dominante como se define por la capacidad de inhibir ciclina G1 humana para preparar una composición farmacéutica para evitar la división celular en una célula.

32. El uso de la reivindicación 31 en el que dicha proteína ciclina G1 mutada se administra a dicha célula suministrando a dicha célula un vehículo de expresión que comprende una construcción génica que codifica dicha proteína ciclina G1 mutada.

33. El uso de la reivindicación 31 en el que dicha proteína ciclina G1 mutada se administra a dicha célula transduciendo dicha célula con un vehículo de expresión que comprende una construcción génica que codifica dicha proteína ciclina G1 mutada.

34. El uso de la reivindicación 32 en el que dicho vehículo de expresión es un vector retroviral.

35. El uso de la reivindicación 32 en el que dicho vehículo de expresión es un vector adenoviral.

36. El uso de la reivindicación 31 en el que dicha proteína ciclina G1 mutada comprende una proteína ciclina G1 truncada en el extremo amino.

37. El uso de la reivindicación 36 en el que dicha proteína ciclina G1 mutada comprende residuos aminoacídicos de una proteína ciclina G1 que se corresponde a los residuos 41 a 249 de una proteína ciclina G1 humana.

38. El uso de la reivindicación 37 en el que dicha proteína ciclina G1 mutada comprende residuos 41 a 249 de una proteína ciclina G1 humana.

39. El uso de la reivindicación 31 en el que dicha proteína ciclina G1 mutada comprende una proteína ciclina G1 que tiene al menos una sustitución aminoacídica.

40. El uso de la reivindicación 39 en el que dicha sustitución es en un residuo que se corresponde al residuo 61 de una proteína ciclina G1 humana.

41. El uso de la reivindicación 39 en el que dicha proteína ciclina G1 mutada es una proteína ciclina G1 humana.

42. El uso de la reivindicación 40 en el que dicha sustitución es alanina.

43. Una ciclina G1 mutada que tiene un fenotipo negativo dominante como se define por la capacidad de inhibir ciclina G1 humana para su uso en una composición farmacéutica.

44. Una construcción génica que codifica una proteína ciclina G1 mutada que tiene un fenotipo negativo dominante como se define por la capacidad de inhibir ciclina G1 humana para su uso en una composición farmacéutica.

45. Un vehículo de expresión que comprende la construcción génica de la reivindicación 44 para su uso como agente farmacéutico.