JP2003512074A - 腫瘍血管の細胞に結合する修飾ウイルス表面タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 腫瘍血管ターゲティングモチーフ、あるいはＴＶＴＭ、ペプチドを含むように修飾されている表面タンパク質を有するベクター粒子。そのようなペプチドにより、ベクター粒子は内皮細胞、特に腫瘍の血管の内皮細胞にターゲティングすることが可能となり、これにより、そのような細胞の成長を阻害、防止、または破壊する物質をその細胞に送達し、それにより腫瘍への血液供給を終了させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、修飾ウイルス表面タンパク質または修飾ウイルス誘導性表面タンパ
ク質、例えば、修飾レトロウイルスエンベロープポリペプチド、修飾アデノウイ
ルスヘキソンタンパク質、修飾アデノウイルスファイバータンパク質、アデノ随
伴ウイルス裸タンパク質コート、または修飾ヘルペスウイルスエンベロープタン
パク質である、タンパク質またはポリペプチドに関する。本発明は、「ターゲテ
ィング性」（targeted）ウイルスまたは非ウイルスベクター粒子（レトロウイル
スベクター粒子、アデノウイルスベクター粒子、アデノ随伴ウイルスベクター粒
子、ヘルペスウイルスベクター粒子、および偽型ウイルスを含む）に、および非
ウイルスベクターであってビロソームまたは他のプロテオリポソーム遺伝子移入
ベクターの一部としてウイルスタンパク質を含むものにさらに関する。

【０００２】 特に、本発明は、ウイルスおよび非ウイルスベクター粒子（レトロウイルスベ
クター粒子、アデノウイルスベクター粒子、アデノ随伴ウイルスベクター粒子、
ヘルペスウイルスベクター粒子、偽型ウイルス、および非ウイルスベクターであ
って修飾、またはキメラウイルス表面タンパク質、例えば、キメラウイルスエン
ベロープポリペプチドを有するものを含む）に関し、ここで、そのような修飾ウ
イルス表面タンパク質、例えば、修飾ウイルスエンベロープポリペプチドは、腫
瘍血管（tumor vasculature）ターゲティング（targeting）モチーフまたはＴＶ
ＴＭであるペプチドを含む。ＴＶＴＭペプチドは、ウイルス表面タンパク質の２
つの連続アミノ酸残基の間に位置し、またはウイルス表面タンパク質から除去さ
れたアミノ酸残基を置換し得る。ここで使用する用語「ポリペプチド」は、アミ
ノ酸のポリマーを意味し、そして何らの特定の長さのポリマーを意味しない。そ
のような用語は、また、翻訳後修飾ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、グ
リコシル化、アセチル化、ホスホリル化等）を含む。

【０００３】 発明の背景 充実性腫瘍内の新生物細胞は、非新生物組織（血管内皮細胞、間質細胞、およ
び細胞外マトリクスを含む）と緊密で複雑な関連性を示す（１）。すべてのヒト
の癌の９０％より多くをなしている、充実性腫瘍のこれらの組織学的特徴は、腫
瘍成長および転移を伴う血管形成のメカニズムを明らかにすることとあわせて（
１、２）、これらは、必然的な治療戦略としての腫瘍血管系のターゲティングの
概念を促進した。それに応じて、腫瘍床に補給する微小血管内皮細胞に対して指
向する抗血管形成遺伝子治療が開発され（５）そしてかなり首尾よく（８）使用
された（６、７）。

【０００４】 血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、選択的内皮細胞細胞分裂促進（９−１１）
および血管透過因子（１２、１３）であり、それは充実性腫瘍の成長駆動、転移
、および血管形成（１４、１５）における重要な因子である。腫瘍微小環境内で
、腫瘍血管内皮のＶＥＧＦとその対応する（cognate）レセプター（複数含む）
の両方の上方調節が報告されている（１６）。ほとんどの充実性腫瘍に見出され
る腫瘍形成トランスフォーメーションと低酸素状態の両方は、共同的に作用しＶ
ＥＧＦ発現を調節する（１７、１８）。さらに、腫瘍細胞に対する腫瘍間質のＶ
ＥＧＦ発現の最近の研究は、またＶＥＧＦのソース、それゆえに、腫瘍血管形成
の貢献者としての間質繊維芽細胞の重要性に焦点をおく（１９）。さらに、ＦＧ
Ｆ曝露（２０）と低酸素（２１、２２）の両方は、内皮細胞上のＶＥＧＦレセプ
ター（複数含む）の発現を上方調節するために役立つ。したがって、ＶＥＧＦ／
レセプター複合体は、腫瘍血管のターゲティングおよび／またはイメージ化（１
６）のために利用することができる、腫瘍内皮細胞の高度に特異的なマーカー（
２３、２４）である。

【０００５】 血管成長因子の発現に加えて、充実性腫瘍の活性化微小血管内の内皮細胞は、
α_Ｖインテグリン（それは確立された血管の細胞には実質的に不存在である）を
発現する（２５−２７）。実際、血管形成の誘導可能インテグリンレセプターお
よび細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質の基本的な役割は、よく確認されて
いる（２８）。例えば、インテグリンα_Ｖβ_３は、血管形成の増殖性および侵襲
性相の間の血管細胞に優先的に発現され、そして多くのＥＧＭタンパク質であっ
て典型的には仮マトリクス（provisional matrix）（コラーゲン、フィブロネク
チン、ビトロネクチン、およびフィブリノーゲンを含む）を構成し、そして細胞
増殖を促進すると報告されているもの（２９、３０）に結合する多機能接着レセ
プターとして作用する。

【０００６】 通常は、静止血管に検出されないが、α_Ｖβ_３は血管成長因子または腫瘍細胞
上清（２５）によって刺激すると高度に発現されるようになる。逆に、特異的抗
体またはペプチドアンタゴニストによるα_Ｖβ_３機能の遮断は、増殖している内
皮細胞の予定されないアポトーシスを生じ（２５）、これはα_Ｖβ_３レセプター
システムが、血管細胞増殖を促進する重要な生存シグナルを提供することを示唆
している（２８）。内皮細胞アポトーシスは、ｐ５３に仲介され、そして細胞周
期インヒビターｐ２１^{ＷＡＦ１／ＣＩＰ１}の誘導を伴うようである（２８）。し
たがって誘導可能α_Ｖβ_３接着レセプターと仮のＥＣＭの間の相互作用は、成長
停止シグナルを直接的に調節し、そして内皮細胞生存を促進する（２８）。

【０００７】 活性化内皮細胞の表面上に選択的に発現されている成長因子および／または接
着レセプターは、血管形成組織へのターゲティング薬物および遺伝子治療ベクタ
ーのために有利な場所（locus）を提供する。高い親和性のターゲティングモチ
ーフのための分子スクリーニングは、ｍＡＢｓの命名されたパネル（３１）およ
びランダムファージディスプレイペプチドライブラリー（３２）を使用して開発
された。ランダムファージディスプレイ技術（(i)インビトロのインテグリンα
_Ｖβ_１（３３、３４）またはα_Ｖβ_３（３５）を結合するペプチドのパンニング
により、または(ii)インビボの腫瘍血管へのホーミング特異性を有するペプチド
を単離すること（３６）による）によって単離された多くのペプチドリガンドは
、フィブロネクチンの一次構造内の同定可能リガンド−レセプター接触点に対応
する配列を示す。

【０００８】 特に、インビトロおよびインビボで同定されるＡｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＮＧ
Ｒ）を含む配列は、第９のフィブロネクチンのＩＩＩ型リピートと顕著な類似性
を有し、一方、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列は、第１０のフィブロネ
クチンのＩＩＩ型リピートと緊密に対応する（３３、３４、３６）。これらの腫
瘍血管ターゲティングモチーフ（ＴＶＴＭ）を区別する観点から、ＮＧＲモチー
フは、定義されたインテグリンについてのディファレンシャルな親和性およびペ
プチド競合動態力学に加えて、対応するＲＧＤモチーフよりもより大きいホーミ
ング率（腫瘍／コントロール臓器）を示し、このことは、ＮＧＲおよびＲＧＤペ
プチドが異なる細胞性レセプターへ結合することを示唆している（３６）。

【０００９】 本発明のある実施態様では、出願人は、モロニー（マウス）白血病ウイルス（
ＭＬＶ）エンベロープ「エスコート」タンパク質のコンテクスト（context）内
にディスプレイされる、多くのＮＧＲを有するペプチド同類（cogener）を構築
し、一連のキメラレトロウイルスベクターにこれらの修飾エンベロープタンパク
質を取りこませ、そして活性化内細胞をターゲティングし、そして形質導入する
ことにおけるこれらのベクターの成績を試験した。

【００１０】 発明の要約 本発明はウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイル
スベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、および
偽型ウイルス、および合成ベクター、例えば、ビロソームまたはプロテオリポソ
ームおよび他の非ウイルスベクターであって修飾表面タンパク質を有するものを
含むベクター粒子を指向し、ここで、表面タンパク質、例えば、ウイルスエンベ
ロープポリペプチドは、内皮細胞のレセプターに、および特に腫瘍の血管の細胞
のレセプターに結合するＴＶＴＭペプチドを含む。 ここで使用する用語「ベクター粒子」は、細胞にポリヌクレオチドを送達する
粒子を意味する。そのような粒子は、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、
および合成ベクター、例えば、前記のようなものを含むがこれらに限定されない
。

【００１１】 本発明は、また、ＴＶＴＭペプチドを含むように修飾されている、エンベロー
プポリペプチドを有するレトロウイルスベクター粒子を生成するためのプロデュ
ーサー細胞を指向する。 本発明は、また、ある種の新規ＴＶＴＭペプチドを、およびそのようなＴＶＴ
Ｍペプチドをコードしているポリヌクレオチドを指向する。 本発明は、また、本発明のベクター粒子を使用する宿主の腫瘍を処置する方法
、医薬としてのそのベクター粒子の使用、およびその腫瘍処置のための医薬の製
造におけるそのベクター粒子の使用を指向する。

【００１２】 図面の簡単な説明 ここで本発明を図面について説明する。 図１ レトロウイルスエスコートタンパク質の腫瘍血管ターゲティングモチー
フ（ＴＶＴＭ）シリーズの概略図。ＴＶＴＭは、腫瘍血管へレトロウイルスベク
ターをターゲティングさせるように設計した。ＴＶＴＭ−１、ＴＶＴＭ−２およ
びＴＶＴＭ−３はインビトロパンニングアッセイで上方調節インテグリンに選択
的に結合し、そしてインビボで腫瘍血管で選択的に蓄積することが示された。Ｔ
ＶＴＭ−４、ＴＶＴＭ−５およびＴＶＴＭ−６は新規ペプチドである。

【００１３】 図２ 修飾エンベロープタンパク質の発現および腫瘍血管ターゲティングモチ
ーフをディスプレイするレトロウイルスベクターへの取り込み。Ａ、Ｃ）２９３
Ｔ細胞ライセートのＷＴ ＣＥＥ、ＷＴ ＣＡＥ、ＴＶＴＭ単独、ＷＴ ＣＥＥ
＋ＴＶＴＭおよびＷＴ ＣＡＥ＋ＴＶＴＭのｅｎｖタンパク質発現レベルの比較
。Ｂ、Ｄ）ＷＴ ＣＥＥ、ＷＴ ＣＡＥ、ＴＶＴＭ単独、ＷＴ ＣＥＥ＋ＴＶＴ
Ｍ、およびＷＴ ＣＡＥ＋ＴＶＴＭを有するレトロウイルスベクターのビリオン
取り込みのレベルの比較。ｇｐ７０およびｇａｇタンパク質のウェスタン分析を
、ｇｐ７０ｅｎｖのＣ末端に対して、ラットモノクローナル抗体である８３Ａ２
５、およびｐ３０に対してポリクローナル抗体を使用して実施した。

【００１４】 図３ 自己向性（ＣＥＥ）エンベロープタンパク質と共発現されるＴＶＴＭエ
スコートタンパク質を有するレトロウイルスベクターのＫＳＹ１細胞結合親和性
。ＴＶＴＭをディスプレイするベクターに対してＷＴｅｎｖ（ＣＥＥ＊またはＣ
ＡＥ＋）を有するベクターの結合親和性の比較を、ＥＬＩＳＡウェル（Ａ）の暗
黒化の程度の変化として示し、次いで、Rainbow Spectra ELISAリーダー(B)のＯ
ＤＡ６５０の読みとして表現する。＊＝ｐ＜．０５；＊＊＊＝ｐ＜．００１；＋
＝ｐ＜．０５。

【００１５】 図４ ＫＳＹ１細胞のＴＶＴＭレセプターの密度依存性ＶＥＧＦ誘導性下方調
節。ＶＥＧＦによる処置に続き、低または高密度ＫＳＹ１細胞に対する、ＴＶＴ
Ｍをディスプレイするベクターに対するＷＴｅｎｖを有するベクターの結合親和
性の比較を、ＥＬＩＳＡウェル（Ａ）の暗黒化の程度の変化として示し、次いで
、Rainbow Spectra ELISAリーダー(Ｂ)のＯＤＡ６５０の読みとして表現する。
ＶＥＧＦによる処置に続き、低または高密度ＨＵＶＥ細胞に対する、ＴＶＴＭを
ディスプレイするベクターに対するＷＴｅｎｖを有するベクターの結合親和性の
比較を、ＥＬＩＳＡウェル（Ｃ）の暗黒化の程度の変化として示し、次いで、Ra
inbow Spectra ELISAリーダー(Ｄ)のＯＤＡ６５０の読みとして表現する。＊ｐ
＜．０５、ＶＥＧＦの不存在と比較；＊＊＊ｐ＜．００１、ＶＥＧＦの不存在と
比較。

【００１６】 発明の詳細な記載 本発明のある側面に従い、ベクター粒子を内皮細胞、例えば、腫瘍の血管の細
胞へターゲティングさせるための、修飾ウイルス表面タンパク質、例えば、修飾
ウイルスエンベロープポリペプチドを有するベクター粒子を提供する。該ウイル
ス表面タンパク質は、ＴＶＴＭペプチドを含むよう修飾される。

【００１７】 ＴＶＴＭペプチドの代表例は、ＴＶＴＭ−１、ＴＶＴＭ−２、ＴＶＴＭ−３、
ＴＶＴＭ−４、ＴＶＴＭ−５、およびＴＶＴＭ−６を含むがこれらに限定されず
、それらは、以下の配列を有する；

【００１８】

【表１】

【００１９】 そのようなペプチドおよびそのようなペプチドをコードしているポリペプチド
を図１に示す。

【００２０】 そのようなペプチドＴＶＴＭ−４、ＴＶＴＭ−５、およびＴＶＴＭ−６および
そのようなペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、新規であり、そして
出願人は、腫瘍血管の細胞に結合するそのようなペプチドを発見し、すなわち、
そのようなペプチドは、腫瘍に見出される血管の細胞に結合する。

【００２１】 ＴＶＴＭペプチドを含む修飾表面タンパク質を有するベクター粒子は、インビ
ボ、エキソビボ、またはインビトロの細胞への遺伝子移入のため、または遺伝子
治療のためのに使用され得る、任意のウイルスまたは非ウイルスベクター粒子を
含む。そのよなベクター粒子は、レトロウイルスベクター粒子、アデノウイルス
ベクター粒子、アデノ随伴ウイルス粒子、ヘルペスウイルス粒子、偽型ウイルス
、および非ウイルスベクターを含むがこれらに限定されない。ＴＶＴＭペプチド
は、任意のウイルス表面タンパク質の任意の領域に位置し得る。ある実施態様で
は、ＴＶＴＭペプチドは、ウイルス表面タンパク質の２つの連続アミノ酸残基の
間に位置し得る。あるいは、ウイルス表面タンパク質のアミノ酸残基は除去され
、そしてＴＶＴＭペプチドで置換される。

【００２２】 修飾され得るウイルス表面タンパク質は、レトロウイルスエンベロープタンパ
ク質、アデノウイルスヘキソンタンパク質、アデノウイルスファイバータンパク
質、アデノウイルスペントン、アデノ随伴ウイルスキャプシドタンパク質および
ヘルペスウイルスエンベロープタンパク質を含むがこれらに限定されない。しか
し、本発明の範囲は特定の修飾ウイルス表面タンパク質に限定されないべきであ
ることが理解されるべきである。

【００２３】 ある実施態様では、ベクター粒子は、ウイルスベクター粒子であり、そしてあ
る実施態様では、ウイルスベクター粒子は、レトロウイルスベクター粒子である
。レトロウイルスエンベロープの任意の部分が、ターゲティング性ポリペプチド
を含むように修飾され得る。ある実施態様では、レトロウイルスエンベロープの
レセプター結合領域を、ＴＶＴＭペプチドを含むように修飾する。ある好ましい
実施態様では、ＴＶＴＭペプチドは、ＴＶＴＭ６である。さらなる好ましい実施
態様では、１コピーのＴＶＴＭペプチドが、ウイルス表面タンパク質に含まれる
。

【００２４】 ある実施態様では、ＴＶＴＭペプチドを、レトロウイルスエンベロープのネイ
ティブ（すなわち非修飾）レセプター結合領域の２つの連続的に数を付されたア
ミノ酸残基の間に挿入する。ある好ましい実施態様では、ウイルス表面タンパク
質は、ウイルス表面タンパク質のＮ末端付近にＴＶＴＭペプチドを含む。好まし
くは、ＴＶＴＭペプチドが挿入される部位は、レトロウイルスエンベロープのＮ
末端から２０アミノ酸を超えない、好ましくは１０アミノ酸を超えない位置に、
そして最も好ましくはレトロウイルスエンベロープのＮ末端からアミノ酸第６と
７の間の位置する。ＴＶＴＭペプチドは、リンカーの側方に有り得、好ましくは
グリシンリンカーの側方にあり得る。 ある好ましい実施態様では、レトロウイルスエンベロープタンパク質は、両種
向性エンベロープタンパク質である。 別の実施態様では、レセプター結合領域のアミノ酸残基を除去し、そしてＴＶ
ＴＭペプチドで置換し得る。

【００２５】 本発明の修飾表面タンパク質を、野生型エンベロープタンパク質に加えて、（
「デュアルエンベロープコンフィギュレーション（dual envelope configuratio
n）」例えば、実施例１参照）、または「シングルエンベロープコンフィギュレ
ーション(single envelope configuration)」すなわち野生型エンベロープタン
パク質の不存在で（実施例２参照）ベクター粒子に取り込ませ得る。デュアルエ
ンベロープコンフィギュレーションを選択するならば、例えば、ベクター粒子の
表面上に存在するエンベロープタンパク質の間の立体障害（stearic hindrances
）を避けるために、野生型エンベロープタンパク質のレセプター結合ドメインの
一部または全部を、ＴＶＴＭペプチド（「エンベロープエスコートタンパク質」
実施例１参照）で置換することが有利であり得る。

【００２６】 したがって、ある実施態様では、第１のレトロウイルスエンベロープタンパク
質および少なくとも１つの修飾レトロウイルスエンベロープタンパク質を含む、
レトロウイルスベクターを提供する。第１のレトロウイルスエンベロープタンパ
ク質は、表面タンパク質を含む。その表面タンパク質は、(i)レセプター結合領
域；(ii)超可変ポリプロリン、または「ヒンジ」領域、および(iii)ボディ部分
を含む。その修飾レトロウイルスエンベロープタンパク質は、修飾前は、(i)レ
セプター結合領域；(ii)超可変ポリプロリン、または「ヒンジ」領域；および(i
ii)ボディ部分を含む、表面タンパク質を含む。その修飾レトロウイルスエンベ
ロープタンパク質は修飾されることができ、その結果、修飾レトロウイルスエン
ベロープタンパク質の表面タンパク質のレセプター結合領域の少なくとも９０％
のアミノ酸残基が除去され、そしてＴＶＴＭペプチドで置換される。

【００２７】 ある実施態様では、修飾レトロウイルスエンベロープタンパク質の表面タンパ
ク質のレセプター結合領域の少なくとも９２％のアミノ酸残基を除去し、そして
ＴＶＴＭペプチドで置換した。別の実施態様では、修飾レトロウイルスエンベロ
ープタンパク質の表面タンパク質のレセプター結合領域のすべてのアミノ酸残基
を除去し、そしてＴＶＴＭペプチドで置換した。

【００２８】 なお別の実施態様では、修飾レトロウイルスエンベロープタンパク質の表面タ
ンパク質のレセプター結合領域の少なくとも９０％アミノ酸残基を除去し、そし
てＴＶＴＭペプチドで置換し、そして修飾レトロウイルスエンベロープタンパク
質の表面タンパク質の超可変ポリプロリン領域の少なくとも一部のアミノ酸残基
を除去し、そしてＴＶＴＭペプチドで置換した。ある実施態様では、修飾レトロ
ウイルスエンベロープタンパク質の超可変ポリプロリン領域のすべてのアミノ酸
残基を除去した。

【００２９】 さらなる実施態様では、修飾レトロウイルスエンベロープタンパク質（複数含
む）のレセプター結合領域（複数含む）は、その修飾の前に、配列（配列番号７
）を有する。修飾レトロウイルスエンベロープタンパク質（複数含む）では、（
配列番号７）のアミノ酸残基１９ないし２２９を除去し、そして非レトロウイウ
ルスタンパク質またはペプチドで置換した。ある実施態様では、（配列番号７）
のアミノ酸残基１９ないし２２９および修飾レトロウイルスエンベロープタンパ
ク質（複数含む）の表面タンパク質の超可変ポリプロリン領域のアミノ酸残基の
少なくとも一部を除去し、そしてＴＶＴＭペプチドで置換した。

【００３０】 一般に、レトロウイルスエンベロープタンパク質（複数含む）は、表面（ＳＵ
）ドメインまたは表面タンパク質、および膜貫通（ＴＭ）ドメインまたはタンパ
ク質を含む。一般に、表面タンパク質は、Ｎ末端ないしＣ末端の方向で以下の領
域を含む：(i)レセプター結合領域；(ii)超可変ポリプロリン領域；および(iii)
ボディ部分、これは、膜貫通ドメインと会合する。

【００３１】 第１のレトロウイルスエンベロープタンパク質は、表面ドメインおよび膜貫通
ドメインを含む。一般にそのようなエンベロープタンパク質は、非レトロウイル
スペプチド・フリーである。第１のレトロウイルスエンベロープタンパク質は、
ある実施態様では、異なる向性の領域を含み得る。例えば、ある実施態様では、
第１のレトロウイルスエンベロープタンパク質は表面タンパク質であって(i)自
己向性レセプター結合領域；(ii)両種向性超可変ポリプロリン領域；および(iii
)自己向性ボディ部分を含むものを含み得る。

【００３２】 前記の様に、修飾レトロウイルスエンベロープタンパク質は、表面タンパク質
のレセプター結合領域の少なくとも９０％のアミノ酸残基が除去され、そしてＴ
ＶＴＭで置換されるように修飾されているレトロウイルスエンベロープタンパク
質であってよい。モロニー（マウス）白血病ウイルスの自己向性エンベロープの
レセプター結合領域を（配列番号７）に示す。ＴＶＴＭペプチドは、１または２
以上のさらなる機能、例えば、腫瘍の血管に見出される細胞上の望まれる標的分
子へレトロウイルスベクターを「ターゲティング」させるような機能を、レトロ
ウイルスベクターに提供する「エスコート」タンパク質として働き得る。そのよ
うなレトロウイルスベクターは、そのような付加的な機能を保有しつつ、野生型
レトロウイルスの感染性を保持する。

【００３３】 ある実施態様では、修飾レトロウイルスエンベロープタンパク質（複数含む）
は、ＴＶＴＭペプチドを含むように少なくともレセプター結合領域を修飾する前
に、異なる向性の領域を含むエンベロープであり得る。例えば、修飾レトロウイ
ルスエンベロープタンパク質（複数含む）は、自己向性部分および両種向性部分
および／または異種向性部分を有する表面タンパク質（またｇｐ７０タンパク質
として知られる）を含むモロニー（マウス）白血病ウイルスエンベロープタンパ
ク質（複数含む）であってよい。

【００３４】 さらなる実施態様では、修飾レトロウイルスエンベロープタンパク質は、修飾
の前に、ｇｐ７０タンパク質を有し、それは、以下のものを含む：(i)自己向性
レセプター結合領域、すなわち（配列番号７）；(ii)両種向性超可変ポリプロリ
ン領域、（配列番号８）；および(iii)自己向性ボディ部分。自己向性レセプタ
ー結合領域（配列番号７）の少なくとも９０％のアミノ酸を除去し、そして前記
の様にＴＶＴＭペプチドで置換した。さらなる実施態様では、両種向性超可変ポ
リプロリン領域（配列番号８）の少なくとも一部をなお除去した。ある実施態様
では、（配列番号８）のアミノ酸残基１ないし３５を除去した。さらなる実施態
様では、（配列番号８）のアミノ酸残基１ないし４８を除去した。なおさらなる
実施態様では、（配列番号８）のすべての６０のアミノ酸残基を除去した。

【００３５】 本発明のさらなる側面に従って、修飾レトロウイルスエンベロープポリペプチ
ド（すなわち修飾レトロウイルスエンベロープまたは「エスコート」タンパク質
、これらは前記した）をコードしている修飾ポリヌクレオチドを提供する。レト
ロウイルスエンベロープポリペプチドはレセプター結合領域を含む。修飾ポリヌ
クレオチドでは、レセプター結合領域の少なくとも９０％のアミノ酸残基をコー
ドしているポリヌクレオチドが前記の様に除去され、そしてＴＶＴＭペプチドを
コードしているポリヌクレオチドで置換されている。

【００３６】 ある好ましい実施態様では、ＴＶＴＭペプチドをコードしているポリヌクレオ
チドは、ＴＶＴＭ６をコードしているポリヌクレオチドである。さらなる好まし
い実施態様では、ＴＶＴＭペプチドをコードしている１コピーのポリヌクレオチ
ドが、ウイルス表面タンパク質をコードしている修飾ポリヌクレオチドに含まれ
る。さらなる好ましい実施態様では、ウイルス表面タンパク質をコードしている
修飾ポリヌクレオチドは、５’末端付近にＴＶＴＭペプチドをコードしているポ
リヌクレオチドを含む。好ましくは、ＴＶＴＭペプチドをコードしているポリヌ
クレオチドが挿入される部位は、レトロウイルスエンベロープのＮ末端から２０
コドンを超えない、好ましくは１０コドンを超えない位置に、そして最も好まし
くはレトロウイルスエンベロープをコードしているポリヌクレオチドの５’末端
から第６と第７コドンの間に位置する。

【００３７】 ある実施態様では、修飾の前に、レセプター結合領域をコードしているポリヌ
クレオチドは、（配列番号７）の配列をコードしている。修飾ポリヌクレオチド
では、（配列番号７）のアミノ酸残基１９ないし２２９をコードしているコドン
を含むポリヌクレオチドを除去し、そしてＴＶＴＭペプチドをコードしているポ
リヌクレオチドで置換した。さらなる実施態様では、超可変ポリプロリン領域の
少なくとも一部をコードしているポリヌクレオチドを、また、なお除去した。あ
る実施態様では、超可変ポリプロリン領域は、配列（配列番号８）を有する。配
列（配列番号７）を有するレセプター結合領域は、（配列番号９）またはその縮
重性（degenerative）誘導体またはアナログを有するポリヌクレオチドによって
コードされている。配列（配列番号８）を有する超可変ポリプロリン領域は、（
配列番号１０）またはその縮重性誘導体またはアナログを有するポリヌクレオチ
ドによってコードされている。

【００３８】 ここで使用する用語「その誘導体またはアナログ」は、ポリペプチド（配列番
号７）および（配列番号８）をコードしているポリヌクレオチドがポリヌクレオ
チド（配列番号９）および（配列番号１０）と異なる配列を有し、なお同じポリ
ペプチドをコードし得ることを意味する。ポリヌクレオチド配列のそのような相
違は、例えば、遺伝コードの縮重のためであり得る。（配列番号８）または（配
列番号１０）をＴＶＴＭペプチドをコードしているポリヌクレオチドで修飾する
前に、（配列番号８）または（配列番号１０）を、１または２以上のコドンが非
修飾配列と異なるアミノ酸残基をコードするように修飾し得ることが、また本発
明の範囲内であることを意図する。そのような修飾は、リガンドをコードしてい
るポリヌクレオチドの挿入を容易化し得る。

【００３９】 前記ポリヌクレオチドを、当業者に既知の遺伝子工学技術によって構築し得る
。例えば、第１発現プラスミドを、非修飾エンベロープタンパク質をコードして
いるポリヌクレオチドを含むように構築し得る。次いで、プラスミドを、レセプ
ター結合領域の少なくとも９０％のアミノ酸残基をコードしているポリヌクレオ
チド（そしてある実施態様では、また、超可変ポリプロリン領域の少なくとも一
部をコードし得る）を除去し、それによって、そのようなポリヌクレオチドを、
ＴＶＴＭペプチドをコードしているポリヌクレオチドで置換するように改変する
。

【００４０】 ＴＶＴＭペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、第２発現プラスミド
に含まれ得、または裸ポリヌクレオチド配列として存在し得る。ＴＶＴＭペプチ
ドをコードしているポリヌクレオチドまたはそのようなポリヌクレオチドを含む
プラスミドを適当な制限酵素部位で切断し、そしてまた適当な制限酵素部位で切
断された第１発現プラスミドにクローニングする。こうして、得られる発現プラ
スミドは、修飾レトロウイルスエンベロープタンパク質を含むポリヌクレオチド
を含む。そのようなプラスミドは、また、レトロウイルスエンベロープタンパク
質の最小シグナルペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む。

【００４１】 ここで使用するように用語「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのヌクレオチ
ドの重合性形態を意味し、そしてリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオ
チドを含む。そのような用語は、また、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、ならびに一
本鎖および二本鎖ＲＮＡを含む。該用語は、また、修飾ポリヌクレオチド、例え
ば、メチル化またはキャップされたポリヌクレオチドを含む。

【００４２】 好ましい実施態様では、本発明に従う第１エンベロープタンパク質および修飾
エンベロープタンパク質を有するレトロウイルスベクター粒子は、腫瘍の血管の
細胞の阻害、防止、または破壊をもたらすことのできる物質をコードしているポ
リヌクレオチドを含む。

【００４３】 しかし、本発明の範囲は、何らの特定の物質に限定されるべきでないことが理
解されるべきである。 該物質をコードしているポリヌクレオチドは、適当なプロモーターの制御下に
ある。しかし、本発明の範囲は特異的外来性遺伝子またはプロモーターに限定さ
れるべきではないことが理解されるべきである。 該物質をコードしているポリヌクレオチドを、当業者に既知の遺伝子工学技術
によって適当なレトロウイルスプラスミドベクターに置き得る。

【００４４】 ある実施態様では、レトロウイルスプラスミドベクターは、モリネー（マウス
）白血病ウイルスに由来し得、そしてＬＮシリーズのベクターのものであり、そ
れらは、Bender, et al., J. Virol., Vol. 61, pgs. 1639-1649(1987) and Mil
ler, et al., Biotechniques, Vol. 7, pgs 980-990 (1989)にさらに記載されて
いる。そのようなベクターは、マウス肉腫ウイルスに由来するパッケージングシ
グナルの一部、および突然変異性ｇａｇ開始コドンを有する。ここで使用する用
語「突然変異性」は、ｇａｇ開始コドンが削除され、または変化させられ、その
結果ｇａｇタンパク質またはそのフラグメントまたはトランケーションが、発現
されないことを意味する。

【００４５】 さらなる実施態様では、レトロウイルスプラスミドベクターは、少なくとも４
つのクローニング、または制限酵素認識部位を含み得、ここで、少なくとも２つ
の部位が、１００００塩基対に１回より少ない、真核細胞遺伝子での出現の平均
頻度を有し；すなわち、制限産物は、少なくとも１００００塩基対の平均ＤＮＡ
サイズを有する。好ましいクローニング部位は、ＮｏｔＩ、ＳｎａＢＩ、Ｓａｌ
Ｉ、およびＸｈｏＩからなる群より選択される。好ましい実施態様では、レトロ
ウイルスプラスミドベクターは、これらのクローニング部位のそれぞれを含む。
そのようなベクターは、米国特許番号５６７２５１０にさらに記載され、それを
引用によりその全体をここに含ませる。

【００４６】 そのようなクローニング部位を含むレトロウイルスプラスミドベクターを使用
するとき、レトロウイルスプラスミドベクターに位置するＮｏｔＩ、ＳｎａＢＩ
、ＳａｌＩ、およびＸｈｏＩからなる群より選択される少なくとも２つのクロー
ニング部位と両立する、少なくとも２つのクローニング部位を含む、シャトルク
ローニングベクターをまた提供し得る。シャトルクローニングベクターは、シャ
トルクローニングベクターからレトロウイルスプラスミドベクターへ移入される
ことのできる物質をコードしている少なくとも１つの望まれるポリヌクレオチド
をまた含む。

【００４７】 シャトルクローニングベクターを、クローニングまたは制限酵素認識部位を含
む１または２以上のリンカーにライゲートされているベーシック「バックボーン
」ベクターまたはフラグメントから構築し得る。クローニング部位には、両立す
る、または前記の相補的クローニング部位が含まれる。シャトルベクターの制限
部位に対応する末端を有する遺伝子および／またはプロモーターを、当業界で既
知の技術によってシャトルベクターにライゲートし得る。

【００４８】 シャトルクローニングベクターを使用して、原核生物系のＤＡＮ配列を増幅す
ることができる。シャトルクローニングベクターは、原核細胞系、そして特に細
菌で一般に使用されるプラスミドから調製し得る。このように、例えば、シャト
ルクローニングベクターを、プラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２；ｐＵＣ１８等
から誘導し得る。

【００４９】 レトロウイルスプラスミドベクターは、ベクターに含まれる遺伝子のための１
または２以上のプロモーターを含む。使用され得る適当なプロモーターは、レト
ロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびMiller, et al., Biotechniq
ues, Vol. 7, No. 9, 980-990 (1989)に記載されているヒトサイトメガロウイル
ス（ＣＭＶ）プロモーター、または任意の他のプロモーター（例えば、細胞性プ
ロモーター、例えば、真核細胞性プロモーターであってヒストン、ｐｏｌＩＩＩ
、およびβアクチンプロモーターを含むがこれらに限定されないもの）を含むが
これらに限定されない。使用され得る他のウイルスプロモーターは、アデノウイ
ルスプロモーター、ＴＫプロモーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモータ
ーを含むがこれらに限定されない。適当なプロモーターの選択は、ここで含まれ
る技術から当業者に自明である。

【００５０】 ある実施態様では、修飾レトロウイルスエンベロープタンパク質をコードして
いるポリヌクレオチドは、別の発現媒体、例えば発現プラスミドに含まれる。あ
るいは、修飾レトロウイルスエンベロープタンパク質をコードしているポリヌク
レオチドは、プロデユーサー細胞株における修飾レトロウイルスエンベロープタ
ンパク質の形質導入および発現のためのレトロウイルスプラスミドベクターに含
まれ得る。

【００５１】 ある実施態様では、物質をコードしているポリヌクレオチドを含むレトロウイ
ルスプラスミドベクター、および本発明に従う修飾レトロウイルスエンベロープ
タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを含む発現媒体を、ｇａｇ、ｐｏ
ｌ、および野生型（すなわち非修飾）ｅｎｖレトロウイルスタンパク質をコード
している核酸配列を含むパッケージング細胞株に形質導入する。そのようなパッ
ケージング細胞株の例は、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ９
０７８）、Ψ−２、Ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−
Ｈ２、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＣＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、および
Miller, Human Gene Therapy, Vol. 1, pgs. 5-14(1990)（引用によってここに
そのすべてを含ませる）に記載されるＤＮＡ細胞株、または２９３Ｔ細胞株（米
国特許番号５９５２２２５）を含むがこれらに限定されない。

【００５２】 ベクターは、当業者に既知の任意の手段によってパッケージング細胞に形質導
入し得る。そのような手段は、エレクトロポレーション、およびリポソームの使
用、例えば、前記のようなもの、およびＣａＰＯ_４沈降を含むがこれらに限定さ
れない。そのようなプロデューサー細胞は、第１、または非修飾野生型レトロウ
イルスエンベロープタンパク質、修飾レトロウイルスエンベロープタンパク質、
および物質をコードしているポリヌクレオチドを含む感染性レトロウイルスベク
ター粒子を生成する。

【００５３】 さらなる実施態様では、ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードしているポリ
ヌクレオチド、非レトロウイルスペプチド・フリーの第１レトロウイルスエンベ
ロープタンパク質（ある実施態様では、野生型レトロウイルスエンベロープタン
パク質であってよい）をコードしているポリヌクレオチド、および修飾レトロウ
イルスエンベロープタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを含むパーケ
ージング細胞を提供する。第１および修飾エンベロープタンパク質を含むレトロ
ウイルスベクター粒子を生成するためのプロデューサー細胞を、そのようなパッ
ケージング細胞に、レトロウイルスベクター粒子またはレトロウイルスプラスミ
ドベクターのいずれかであって、それぞれの場合に、物質をコードしているポリ
ヌクレオチドを含むものを導入することによって生成する。こうして、プロデュ
ーサー細胞株は第１レトロウイルスエンベロープタンパク質および修飾レトロウ
イルスエンベロープタンパク質および物質をコードしているポリヌクレオチドを
含む感染性レトロウイルスベクター粒子を生成する。

【００５４】 第１レトロウイルスエンベロープタンパク質および修飾レトロウイルスエンベ
ロープタンパク質、および物質をコードしているポリヌクレオチドを含む、レト
ロウイルスベクター粒子を、宿主で物質を発現させるために宿主に投与し得る。
ある実施態様では、レトロウイルスベクター粒子を、腫瘍の血管の細胞の成長を
阻害、防止、または破壊するのに有効な量で宿主に投与する。宿主は、ヒトまた
は非ヒト霊長類宿主であってよい、哺乳動物宿主であってよい。

【００５５】 レトロウイルスベクター粒子は、宿主に投与すると、腫瘍の血管の細胞に移行
し、そして形質導入し、それによって、形質導入された細胞はインビボで物質を
発現する。投与され得るレトロウイルスベクター粒子の正確な用量は、患者の年
齢、性別、および体重、形質導入されるべき細胞、投与されるべき物質、および
処置されるべき腫瘍の型およびサイズを含む種々の要因に依存する。

【００５６】 したがって、本発明のある側面では、本発明のベクター粒子の医薬としての使
用を意図する。特に、本発明のベクター粒子の腫瘍の処置のための医薬の製造に
おける使用を提供する。さらに、腫瘍の血管の細胞の成長の阻害、防止、または
破壊に有用である、医薬の製造における本発明のベクター粒子の使用を提供する
。

【００５７】 レトロウイルスベクター粒子を、例えば、静脈内および動脈内投与を含む、血
管内投与によって全身的に投与し得る。

【００５８】 本発明のレトロウイルスベクター粒子で形質導入され得る細胞は、腫瘍の血管
内に見出される血管細胞を含むがこれに限定されない。そのような細胞は、腫瘍
の血管に見出される内皮細胞を含むがこれに限定されない。

【００５９】 加えて、前記修飾レトロウイルスエンベロープタンパク質を含むレトロウイル
スベクター粒子を、悪性および非悪性腫瘍を含む、腫瘍の処置で使用し、ここで
該修飾レトロウイルスエンベロープタンパク質はＴＶＴＭペプチドを含む。腫瘍
の血管へレトロウイルスベクター粒子細胞をターゲティングさせることによって
、レトロウイルスベクター粒子は、そのような細胞に感染する。腫瘍は、すべて
の充実性腫瘍であって、癌腫；肉腫（カポジ肉腫、骨肉腫、および軟組織肉腫を
含む）；結腸癌、卵巣癌、肺癌、脳腫瘍、血管腫、内皮腫、血管肉腫、および肝
細胞癌を含むものを含むがこれらに限定されない。

【００６０】 例えば、レトロウイルスベクター粒子であって、前記のような修飾レトロウイ
ルスエンベロープタンパク質を含み、そしてＴＶＴＭペプチド、およびネガティ
ブな選択的マーカーまたは「自殺」遺伝子、例えば、ヘルペスシンプレックスウ
イルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、またはシトシンデアミナーゼ遺伝子を
コードしているポリヌクレオチドを含むものを、患者に投与し得、これによって
レトロウイルスベクター粒子を腫瘍血管の細胞に形質導入させる。細胞のレトロ
ウイルスベクター粒子による形質導入の後、相互作用物質またはプロドラッグ、
例えば、ガンシクロビルまたはアシクロビルを患者に投与し、これによって腫瘍
の血管の形質導入された細胞を殺す。こうして、腫瘍への血液供給を終了させ、
そして腫瘍の成長を阻害、防止、または破壊する。しかし、本発明の範囲は、何
らの特定の腫瘍の処置に限定されるべきでないことが理解されるべきである。

【００６１】 レトロウイルスベクターを、また、使用して、虚血の処置のための治療物質を
コードしているポリヌクレオチドを送達し得、これによってレトロウイルスベク
ターは虚血性細胞に形質導入する。処置され得る虚血は、心筋虚血、腎臓虚血、
壊死性小腸結腸炎、および発作を含むがこれらに限定されない。しかし、本発明
の範囲は、何らの特定の虚血の処置に限定されるべきではないことが理解される
べきである。

【００６２】 レトロウイルスベクターを使用し、活性血管形成の部位へ抗血管形成物質をコ
ードしているポリヌクレオチドを送達し得る。こうして、そのようなベクターを
例えば、糖尿病性網膜症および角膜血管新生の処置に使用し得る。

【００６３】 前記の第１レトロウイルスエンベロープタンパク質および修飾レトロウイルス
エンベロープタンパク質および物質をコードしているポリヌクレオチドを含む、
レトロウイルスベクター粒子を、遺伝子治療処置の有効性の研究のための動物モ
デルの一部としてインビボで動物に投与し得る。レトロウイルスベクター粒子を
同じ種の異なる動物に種々の用量で投与し得、これによりレトロウイルスベクタ
ー粒子は動物の腫瘍の血管の望まれる細胞に、または虚血または活性血管形成の
部位に位置する細胞に形質導入する。次いで、動物を動物のインビボでの望まれ
る物質の発現について評価する。そのような評価から取得したデータから、ヒト
患者に投与されるべきレトロウイルスベクター粒子の量を決定し得る。

【００６４】 加えて、修飾レトロウイルスエンベロープタンパク質を形成する「エスコート
」タンパク質を使用し、プロテオリポソームを形成し得る；すなわち、「エスコ
ート」タンパク質は、リポソーム壁の一部を形成する。そのようのプロテオリポ
ソームを、腫瘍の血管の望まれる細胞への、または虚血または活性血管形成の部
位への遺伝子移入のために、または薬物送達のために使用し得る。

【００６５】 あるいは、修飾レトロウイルスベクターは、ＴＶＴＭペプチド（「シングルエ
ンベロープコンフィグレーション」）を含む修飾エンベロープタンパク質のみを
含み得る。そのような修飾エンベロープを前記し、そして実施例２にさらに例示
するように構築し得る。一般に、唯一のエンベロープタンパク質としてそのよう
な修飾エンベロープタンパク質を含むレトロウイルスベクターを、前記のような
プレパッケージングおよびパッケージング細胞から当業者に既知である技術によ
って生成し得る。ＴＶＴＭペプチドは、レトロウイルスベクターに１または２以
上のさらなる機能、例えば、レトロウイルスベクターを腫瘍の血管に見出される
細胞上の望まれる標的分子に「ターゲティング」させる機能を提供する。そのよ
うなレトロウイルスベクターは、そのようなさらなる機能を保有しつつ、野生型
レトロウイルスに匹敵する感染性を保持する。

【００６６】 ＴＶＴＭペプチドを、また、腫瘍の血管の細胞、例えばそのような血管の内皮
細胞の成長を阻害、防止、または破壊する物質にコンジュゲートし得る。次いで
、ＴＶＴＭペプチド−物質コンジュゲートを、哺乳動物、宿主であって、ヒトお
よび非ヒト霊長類宿主を含むものを含む、動物宿主へ全身的に投与し得る。コン
ジュゲートは腫瘍の血管の細胞へ移行し、これによってＴＶＴＭペプチドは細胞
に結合し、そして細胞に物質を送達する。ＴＶＴＭペプチドは、また、抗虚血物
質または抗血管形成物質にコンジュゲートし得る。次いで、コンジュゲートを宿
主に全身的に投与し得、これによって、ＴＶＴＭペプチドは虚血性部位または血
管形成部位に移行し、これによってＴＶＴＭペプチドはそのような部位の細胞に
結合し、抗虚血物質または抗血管形成物質をそのような部位に送達する。

【００６７】 さらなる実施態様では、ＴＶＴＭペプチドは、アデノウイルスベクターの一部
とし含まれ得、ここでアデノウイルスベクターのファイバータンパク質は修飾さ
れ、ＴＶＴＭペプチドを含む。そのようなアデノウイルスベクターの例は、米国
特許番号５５４３３２８および５７５６０８６に記載されている。

【００６８】 実施例１ ここで本発明を以下の実施例について説明する。しかし、本発明の範囲はこれ
によって限定されるべきであると意図されていないことが理解されるべきである
。

【００６９】 材料および方法 腫瘍血管ターゲティングモチーフをディスプレイしているＭＬＶに基づくエスコ
ートタンパク質の分子クローニング（図１参照）。粘着末端を有するＴＶＴＭイ
ンサートを、ＣＥＥ＋（自己向性）−デルタヒンジエンベロープ（ｅｎｖ）構築
物（３７）であって、ＣＥＥＣと命名され、両種向性プロリンリッチヒンジ領域
（ＰＲＲ）の置換によってＣＥＥ＋から修飾されたものにクローニングし、ここ
で３つの独特な制限部位（ＡｖｒＩＩ、ＰｓｔＩ、ＳｔｕＩ）およびＮｇｏＭＩ
制限部位を含む（３７）。ＭＬＶに基づくｅｎｖ構築物をＢｓｔＥＩＩおよびＡ
ｖｒＩＩによって切断し、そして直鎖状ｅｎｖプラスミドをアガロースゲル上の
制限分析によって確認し、そしてGene Clean方法（Bio 101, Vista, CA）によっ
て精製し、次いでそれぞれのＴＶＴＭインサートおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ne
w England Biolabs, Beverly, MA）でＲＴで３時間または４℃で終夜のいずれか
でライゲートした。

【００７０】 得られる「エスコート」構築物において、グリシンリンカーの側方のＴＶＴＭ
ペプチドは、アミノ末端のＢｓｔＥＩＩ部位と膜貫通（ＴＭ）ドメインに隣接し
て位置するＡｖｒＩＩ部位の間で、ＭＬＶ自己向性ｅｎｖ表面（ＳＵ）タンパク
質の全レセプター結合領域を置換した。ライゲーションの後、プラスミドＤＮＡ
の種々の構築物をE. coliのＸＬ１ Blue株に形質転換し、そしてアンピシリン
選択下、ＬＢアガープレート上で成長させた。プラスミドＤＮＡを、ＱＩＡprep
Miniprep Kits(Qiagen, Valencia, CA)を使用して選択された形質転換クローン
から抽出した。それぞれの構築物を、それぞれのインサートの酵素消化および分
析、次いでT7 Sequenase配列決定キット（Amersham Life Science, Inc., Cleve
land, Ohio）を使用する直接的ＤＮＡ配列分析によって確認した。

【００７１】 レトロウイルスベクターストックの作成。ＷＴｅｎｖを有するレトロウイルスベ
クターおよび／またはＴＶＴＭを有する「エスコート」タンパク質構築物を、野
生型（ＷＴ）両種向性または自己向性ｅｎｖタンパク質を共発現した、３または
４つのプラスミド一過性トランスフェクションシステム（３８）を使用してアセ
ンブルした。パッケージングコンポーネントｇａｇ−ｐｏｌ、ＷＴｅｎｖ、キメ
ラｅｎｖ、およびＣＭＶプロモーターから発現される核ターゲティング性βガラ
クトシダーゼ発現構築物を有するレトロウイルスベクターを、それぞれがＳＶ４
０複製開始点を含む、別個のプラスミド上に置いた。１０μｇのそれぞれのプラ
スミド（ｐｃｇｐ、ｐＣＡＥ、ｐＣＥＥ＋またはｐＣＥＥＣのいずれか、ｐＥＳ
ＣＯＲＴおよび、ｐｃｎＢｇ）を、カルシウムフォスフェート方法によって、Ｓ
Ｖ４０ラージＴ抗原を発現している、２９３Ｔ細胞（米国特許番号５９５２２２
５）に共トランスフェクションさせた。プロデューサー細胞をその後、１０ｍＭ
のナトリウムブチレートで８ないし１２時間処理し、ビリオン生成を容易化し、
次いでレトロウイルス上清をトランスフェクション後ｔ＝４８時間に収集した。

【００７２】 ウイルスプロセッシングおよびキメラｅｎｖタンパク質のレトロウイルスベクタ
ーへの取り込み。２９３Ｔ細胞ライセート中の発生しようとしているＷＴｅｎｖ
タンパク質ｇｐ７０および／またはキメラｅｎｖ「エスコート」タンパク質の発
現レベルを、以前記載の様に（３９）、ｇｐ７０のＳＵドメインのＣ末端に対す
るラットモノクローナル８３Ａ２５抗体を使用する、ウェスタン分析によって評
価した。ビリオンへのｅｎｖ取り込みを評価するために、ウイルス粒子を可溶性
タンパク質および細胞残骸から２０％スクロース勾配（ＰＢＳにおける）で精製
し、そしてビリオン会合性タンパク質を、抗ｇｐ７０および抗ｐ３０抗体を使用
するウェスタン分析に付した（３９）。

【００７３】 ウイルス力価の決定。テストレトロウイルス上清の感染性力価を標準化し、そし
て核ターゲティング性βガラクトシダーゼレポーター遺伝子（４０）の発現にも
とづいて定量し、これは偏向顕微鏡によって決定された。簡単には、ＤＭＥＭ−
１０％ ＦＢＳ（Ｄ１０）中の２．５×１０^４のＮＩＨ３Ｔ３細胞を、形質導入
の１日前に６ウェルのプレートのそれぞれのウェルに置いた。１ｍｌの新鮮Ｄ１
０培地を培養物に添加した後、培地を、２時間、８μｇ／ｍｌポリブレンを有す
るそれぞれのレトロウイルス上清の１ｍｌの連続希釈物で置換し、これを５％Ｃ
Ｏ_２で３７℃で終夜維持した。次いで、それぞれの培養物をＸ−Ｇａｌ組織化学
的染色剤によって形質導入の４８時間後に染色し、形質導入細胞（青緑色の核を
有する細胞）における核ターゲティング性βガラクトシダーゼの存在を検出した
。ウイルス力価を、ベクター上清のｍｌあたりのβガラクトシダーゼポジティブ
コロニー形成単位の数として表現した（ｃｆｕ／ｍｌ）。

【００７４】 ヒト内皮細胞へのウイルス結合。ＫＳＹ１ヒトカポジ肉腫細胞（ＣＲＬ−１１４
４８）およびＨＵＶＥヒト臍静脈内皮細胞（ＣＣ−２５１７）を、それぞれAmer
ican Type Cell Culture COllection(ATCC, Bethesda Md)およびClonetics(San
Diego, CA)から入手した。ウイルス結合の定量のために、１×１０^６ＫＳＹ１ま
たはＨＵＶＥ細胞を微量遠心管中のＤ１０に懸濁し、そして１ｍｌのテストベク
ター上清を添加した（ウイルス力価を１×１０^６ｃｆｕ／ｍｌで標準化した）後
、１５秒間スピンダウンした。混合物をＲＴで３０分間穏やかに振とうしながら
インキュベーションした。細胞をＤ１０で２回洗浄し、それからｇｐ７０ＭＬＶ
ｅｎｖタンパク質のＣ末端に対して指向されたラットモノクローナル８３Ａ２５
Ａｂの存在下で３００μｌ中で再懸濁し（４１）、そしてＲＴで１時間インキュ
ベーションした。細胞を再びＤ１０培地で２回洗浄し、それから５００μｌの１
：２５００ＨＲＰ−ヤギ抗ラットＩｇＧ（Zymed Laboratories Inc.）中でＲＴ
で３０分間インキュベーションした。

【００７５】 洗浄後、細胞を５００μｌの１：１０００ラットペルオキシダーゼ抗ペルオキ
シダーゼ抗体（Sternberger Monoclonals, Inc）中でＲＴで３０分インキュベー
ションした。洗浄後、細胞を１００μｌのＴＭＢシングル溶液（Zymed Laborato
ries Inc.）中に再懸濁し、そして９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに移し、ここ
で呈色反応（青）の強度をRainbow Spectra ELISAリーダー（TECAN, Inc., NC）
でＯＤ６５０ｎｍで読んだ。

【００７６】 ヒト内皮細胞の形質導入。ＫＳＹ１またはＨＵＶＥ細胞を、１％ゼラチンコート
皿上で、ＫＳＹ１培地（２％のＦＣＳ、１％のピルビン酸ナトリウム、１％の必
須アミノ酸、１％の非必須アミノ酸、１ｍＭのグルタミン、および１％のペニシ
リン−ストレプトマイシンからなる）、またはＨＵＶＥ培地（Iscove's修飾Dulb
eccos's／Ham F-12培地からなり、１５％のＦＣＳ、１％のペニシリン／ストレ
プトマイシン、４５μｇ／ｍｌのヘパリンおよび１０μｇ／ｍｌのＥＣＧＳで補
足した）のいずれかで補足したＰＲＭＩ１６４０中で培養した。形質導入実験の
ために、３ｍｌのＫＳＹ１培地またはＨＵＶＥ培地における０．５ないし１．０
×１０^５のＫＳＹ１またはＨＵＶＥ細胞を６ウェルプレートのそれぞれのゼラチ
ンコートウェルに置き、そして３７℃で終夜付着させた。続く朝、培地を１ｍｌ
の新鮮ＫＳＹ１またはＨＵＶＥ培地と置換した。培養物をウイルス力価を等価と
するため標準化した１ｍｌのそれぞれのテストベクター上清で、３７℃で３０分
間ポリブレン（８μｇ／ｍｌ）の存在下で形質導入させた。

【００７７】 その後、２．５ｍｌの新鮮培地を培養物に添加し、次いでそれを３７℃で終夜
インキュベーションした。次いで培地を新鮮培地と置換し、そして培養物をさら
に３７℃で４８時間インキュベーションした。次いで細胞をＸ−Ｇａｌ染色剤で
染色し、核ターゲティング性βガラクトシダーゼ活性の存在を偏向顕微鏡下で視
覚化した。得られる形質導入効率を定量するために、ＫＳＹ１細胞についてそれ
ぞれのテスト群の５低力（１０×）フィールドを（〜１５００細胞／フィールド
）、そしてＨＵＶＥ細胞について１０低力フィールド（〜５００細胞／フィール
ド）を写真撮影した。形質導入効率を、ポジティブ細胞（青色染色核を有する細
胞）の数を、低力フィールドあたりの細胞の総数で割って１００をかけることに
よって％として表現した。

【００７８】 結果 ６種のＮＧＲを有するＴＶＴＭモチーフを比較評価のために選択した（図１）
。２種の推定環状ペプチド（ＴＶＴＭ−１およびＴＶＴＭ−２）および１種の線
状ペプチド（ＴＶＴＭ−３）は、以前、線状ファージ（filamentous phage）の
表面上に発現されたとき、インビボで腫瘍血管について選択性を示した（３６）
。残りの３種のＴＶＴＭ（ＴＶＴＭ−４、ＴＶＴＭ−５、およびＴＶＴＭ−６）
は新規ペプチドである。ＴＶＴＭ−４は、コアＮＧＲモチーフに疎水性残基（Ｌ
ｅｕ）Ｎ末端および極性残基（Ｓｅｒ）Ｃ末端を含ませるようなＴＶＴＭ−３の
特異的修飾を導入する。ＴＶＴＭ−５およびＴＶＴＭ−６は、第９のフィブロネ
クチンIII型リピートに存在する、隣接Ｃ末端残基（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−
Ｐｒｏ）の影響を試験するために設計された、ＮＧＲモチーフの同類（cogener
）を構成する（４２）。

【００７９】 グリシン残基は二次構造に柔軟性を付加し、そしてキメラレトロウイルスエン
ベロープタンパク質の折り畳みを容易化させるための努力中に、それぞれのＴＶ
ＴＭの側方のリンカーとして含まれた。それぞれの６種のＴＶＴＭをｃＤＮＡ配
列中にコード化し、二本鎖オリゴヌクレオチドとして調製し、そして修飾ＣＥＥ
Ｃベクターにクローニングし（材料および方法参照）、ここに独特のクローニン
グ部位（特異的にＡｖｒＩＩ）をｇｐ７０表面タンパク質のプロリンリッチヒン
ジ領域付近に付加した。それぞれのターゲティング自己向性ｅｎｖであって「エ
スコート」タンパク質と称され、ＷＴｅｎｖを伴うように特別に設計したものを
、ＴＶＴＭインサートをＢｓｔＥＩＩおよびＡｖｒＩＩクローニング部位にライ
ゲートすることによって調製し、こうして自己向性ｅｎｖタンパク質の全レセプ
ター結合ドメインをそれぞれのＴＶＴＭ／リンカー構築物で置換した。ＣＥＥ＋
ベクター内の特定されたクローニング部位の一次構造は、フィブロネクチン内に
見出される、第９および第１０のＩＩＩ型リピートの、コア細胞結合モチーフ（
ＮＧＲおよびＲＧＤ）の側方の一次構造に大雑把に近似していることが注目され
る（図１参照）。

【００８０】 一過性トランスフェクションすると、すべての６種のＴＶＴＭｅｎｖタンパク
質をヒト２９３Ｔレトロウイルスベクタープロデューサー細胞で発現させ、それ
ぞれは、〜６６ｋＤａの明かな分子量を示した。図２に見られるように（パネル
ＡおよびＣ）、６種のｅｎｖ「エスコート」タンパク質の発現は、ＷＴｅｎｖタ
ンパク質（これはベクター向性および感染性（すなわち、自己向性、ＣＥＥまた
は両種向性、ＣＡＥ）を付与する）の共発現によって障害を受けなかった。それ
ぞれのＴＶＴＭ「エスコート」タンパク質は、精製ウイルス粒子で検出されない
かもしれない；しかし、取り込み効率の顕著な相違は観察されなかった（図２、
パネルＢおよびＤ参照）。６種のうち５種のＴＶＴＭタンパク質は、ＷＴ ＣＥ
ＥまたはＣＡＥｅｎｖの不存在下でウイルス粒子に安定的に取り込まれ、例外は
ＴＶＴＭ２であり、これは取り込み効率の点で一貫してより低い。

【００８１】 ＴＶＴＭ３およびＴＶＴＭ６の場合は、野生型エンベロープの共発現が、修飾
「エスコート」タンパク質の取り込みを促進することとが観察され、これはおそ
らく四次構造の構造的相補性のためである（４３、４４）。線状ペプチド配列（
ＴＶＴＭ３−６）のみがＷＴｅｎｖによって化学量論的に取り込まれることが注
目され、これは、適当なアセンブリー、プロセッシング、およびウイルス粒子へ
の安定的取り込みを示している。ＮＩＨ ３Ｔ３細胞における対応するウイルス
力価の試験によって（これは零（ＴＶＴＭｅｎｖ単独について）からＴＶＴＭ２
＋ＷＴ ＣＥＥベクターについての１．６×１０^８までの範囲である（表１参照
））、観察される融合および感染性は、野生型（ＣＥＥまたはＣＡＥ）エンベロ
ープパートナーの共発現および融合誘導特性のみによってもたらされることが確
認される。

【００８２】 ＴＶＴＭを有するレトロウイウルスベクターのインビトロでの活性化内皮細胞
への結合を試験するために、我々は、ヒトカポジ肉腫内皮細胞（ＫＳＹ１、ＡＴ
ＣＣ）を利用した。これは、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦレセプターの両方の一貫性
のある（自己分泌性の）発現を示している（４５）。テストベクターを自己向性
ＣＥＥ（齧歯動物特異的）エンベロープパートナーと共発現させた。これは、ヒ
ト細胞を認識／感染しない。図３Ａおよび３Ｂは、ＷＴ ＣＥＥｅｎｖを有する
ベクターと比較して、ＴＶＴＭ２、４、５および６を有するウイルス粒子の、Ｋ
ＳＹ１細胞への高い親和性の結合を示しており（ｐ＜０．０５）、これはＣＡＥ
（自己向性）エンベロープを有する（ポジティブコントロール）ベクターのそれ
と同じかより大きかった（ＴＶＴＭ６＋ＣＥＥについて、ｐ＜．０５）。これに
対して、ＴＶＴＭ１およびＴＶＴＭ３を有するベクターの細胞結合親和性は、Ｔ
ＶＴＭ２、４、５または６を有するベクターよりも実質的により低いことが注目
された。最小の結合を、ＷＴ ＣＥＥ（自己向性）ｅｎｖのみを有するベクター
で観察した。

【００８３】 次に、我々は、ＶＥＧＦによる予備処理の前および後の通常のヒト内皮（ＨＵ
ＶＥ）細胞上でのＴＶＴＭを有するレトロウイルスベクターの細胞結合特性を試
験した。以前の結合研究におけるように、ＷＴ ＣＥＥｅｎｖを、ＷＴ ＣＡＥ
ｅｎｖのかわりにＴＶＴＭエスコートタンパク質と共発現させ、ベクター融合お
よび侵入（これは、結果の解釈を混乱させている）を防止した。細胞結合の顕著
な増加が、ＷＴ ＣＥＥｅｎｖ単独と比較して、選択されたＴＶＴＭ５エスコー
トタンパク質の共発現によってもたらされた（ｐ＜．０１）；しかし、細胞結合
の観察される増加は、４８時間のＨＵＶＥ細胞へのＶＥＧＦの曝露によって有意
に減少した（ｐ＜．０１）。さらなる研究を細胞密度、ならびにＶＥＧＦ予備処
理が、ヒト内皮細胞におけるＴＶＴＭレセプター発現に及ぼす影響について試験
するために計画した。

【００８４】 これらの研究の結果は（図４Ａ−４Ｂ参照）、低密度条件下で培養されたとき
のＶＥＧＦへ曝露されたＫＳＹ１細胞上でのＴＶＴＭレセプター発現の有意な下
方調節（ｐ＜．０５）、および高密度で培養された細胞におけるより低い程度を
表した。ＨＵＶＥ細胞で取得された、同様の結果により（図４Ｃおよび４Ｄ参照
）、ＴＶＴＭレセプター発現および／またはＴＶＴＭ６をディスプレイしている
ベクターへの結合は、低密度条件下で成長した細胞で最高であったことが示され
、これはＶＥＧＦによる予備処理によって再び減少した（ｐ＜０．００１）。

【００８５】 前記の細胞結合の研究でのように、テストベクター上清を細胞性形質導入の研
究のために調製し、例外として、ヒト細胞の形質導入を可能とするために両種向
性ｅｎｖパートナー（ＷＴ ＣＡＥ）を利用した。得られるベクターを次いで、
ＮＩＨ ３Ｔ３細胞の形質導入に基づいて（表１参照）、力価の等価性のために
標準化した（１×１０^６ｃｆｕ／ｍｌ）。これらの比較条件下で、ＴＶＴＭエス
コートタンパク質をディスプレイしているベクターは、ＷＴ ＣＡＥベクター単
独についておよそ１２．２±ＳＥＭ１．４％からＷＴ ＣＡＥ＋ＴＶＴＭ５ベク
ターについて３７．４±１．７％（ｐ＜０．００１）、およびＷＴ ＣＡＥ＋Ｔ
ＶＴＭ６ベクターについて３１．０±２．５％（ｐ＜０．００１）に形質導入効
率を有意に増強した。さらに、形質導入効率の１０倍の増加をＨＵＶＥ細胞で観
察した（ＷＴ ＣＡＥベクター単独について０．４％、ＷＴ ＣＡＥ＋ＴＶＴＭ
−６ベクターについて４．２％まで；ｐ＜０．００１；表２）。これらの結果は
、ＴＶＴＭについて、なお同定されない活発な内皮細胞レセプターへのウイルス
結合の増強による、細胞特異的ターゲティングおよび形質導入を示している。

【００８６】 考察 血漿並びに細胞外マトリクス（ＥＣＭ）に比較的高濃度で見出される遍在する
接着性糖タンパク質であるフィブロネクチンは、発育、傷治癒、および止血のと
きの細胞とＥＣＭ相互作用を仲介するように機能する。可溶性フィブロネクチン
は一般に、１対のジスルフィド結合によって共有的に連結された、２つの同一で
はない（あるいはスプライシングされた）サブユニトから構成されるダイマーで
あり、一方、フィブロネクチンの不溶性マトリクス形態は、オリゴマーおよびフ
ィブリルとして配列される（４６）。フィブロネクチン分子の一次構造はモザイ
ク性であり、ＥＣＭコンポーネントまたは細胞膜レセプターのいずれかと相互作
用する一連の構造的に明瞭なドメインからなり、そして柔軟性のあるペプチドセ
グメントによって連結されている（４２、４６）。接着性細胞のインテグリンレ
セプターによって認識される、中央の細胞結合ドメインが特に興味深い（４７、
４８）。

【００８７】 これらのドメイン内で同定された活性部位（４９）には、第１０のＩＩＩ型リ
ピート（５０、５１）のＲＧＤモチーフおよび第９のＩＩＩ型リピート（３３−
３５）のＮＧＲモチーフが含まれる。α_Ｖβ_１およびα_Ｖβ_３インテグリンのＲ
ＧＤを有するタンパク質への結合が決定的に示されたが（３３−３５、５２）、
ＮＧＲ細胞結合モチーフについて選択性である細胞性レセプター（複数含む）が
、いまだ同定されなかった（３６）。フィブロネクチンの徹底的な欠失研究によ
って、第１０のＩＩＩ型リピート内のＲＧＤ細胞結合ドメインの重要性が示され
た（５３）；しかし、さらなるドメインが全体的結合親和性に寄与しており、そ
して特に隣接するＩＩＩ型リピートとの共働的相互作用が報告されている（５４
、５５）。

【００８８】 線状ファージ（filamentous phage）がディスプレイしているＮＧＲモチーフ
は、ＲＧＤモチーフと比較して非類似のインテグリン結合親和性および置換力学
を示し、このことは、ＮＧＲモチーフについての細胞性レセプター（複数含む）
がＲＧＤのそれと同一ではないことを示している（３５、３６）。さらに、イン
ビボでの通常血管に対する腫瘍会合性血管への接着性の観点から、ＮＧＲを有す
るファージの腫瘍ホーミング比率は、ＲＧＤを有するファージよりも数倍大きく
（３６）、したがって、ＲＧＤとＮＧＲ細胞結合モチーフは実際、機能的に明瞭
に区別できることが確認される。

【００８９】 この研究では、腫瘍血管ターゲティングモチーフ（ＴＶＴＭ）と称する、一連
のＮＧＲを有するペプチド同類（congener）の成績を、腫瘍血管および／または
転移性癌を追跡するばあいに散開しているレトロウイルスベクターのプレリュー
トとして試験した。ＴＶＴＭを、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ｅｎ
ｖ「エスコート」タンパク質のコンテクスト（context）内にディスプレイし、
これはコンポジットベクターに機能を獲得している表現型（gain-in-function-p
henotype）をもたらすための感染性ＷＴｅｎｖを伴う非感染性ｅｎｖタンパク質
として定義される。類似モチーフを可溶性ペプチド（５６−５８）または線状フ
ァージの表面タンパク質（５９、３３−３５）のいずれかのコンテクスト内でデ
ィスプレイしたとき、環状コンフィギュレーションが有利であると見出されたの
に対して、環状ＮＧＲ同類（ＴＶＴＭ１およびＴＶＴＭ２）をヒトプロデューサ
ー細胞で容易に発現させたが（図２Ａ）、ビリオンにほとんど取りこまれず（Ｔ
ＶＴＭ２、図２Ｂ参照）、予測された高親和性結合特性を示すことはなかった（
ＴＶＴＭ１、図３参照）。

【００９０】 例えば、ＴＶＴＭ５に非常に類似しているコアＮＧＲモチーフの側方の配列を
示す、環状ＴＶＴＭ２は、ウイルス粒子にほとんど取りこまれなかったが（図２
Ｂ参照）、標的細胞に比較的よく結合した（図３Ａおよび図３Ｂ）。これに対し
、線状ＴＶＴＭはウイルス粒子により容易に取りこまれ（図２Ｂおよび２Ｄ）、
そして遊離ペプチドまたは線状ファージと異なり、線状ＴＶＴＭ設計を有するキ
メラベクターの内皮細胞結合特性は優れていた（図３）。タンパク質折り畳みに
よる環状モチーフ、ジスルフィド結合形成、および修飾エンベロープタンパク質
の分泌を生ずる、付加的なシステイン残基の一般的な妨害を除くことはできない
が、ＭＬＶエンベロープタンパク質の二次および三次構造は線状ファージまたは
遊離ペプチドよりもより抑制されているようである。いずれかの事象で、レトロ
ウイルスエンベロープタンパク質のウイルス粒子への取り込みがレトロウイルス
ベクター生成の重要な特徴であるから、線状ペプチドモチーフはこの目的のため
により好ましいと考えられる。

【００９１】 この研究の結果は、コアＮＧＲモチーフの側方のアミノ酸残基の付加および置
換の両方が、標的細胞結合へ深遠な影響を有することを示している。ＴＶＴＭ４
の細胞結合親和性はＴＶＴＭ３のそれよりも有意により大きく、これにより、第
１にＮＧＲモチーフへのＣ末端に近いＳｅｒ残基の付加、そして第２にＮ末端の
近くのＬｅｕ残基の付加が注目される。興味深いことに、Ｃ末端Ｓｅｒ残基はフ
ィブロネクチンの第９のＩＩＩ型リピート（ＮＧＲ）上に存在せず、これはさら
に、第１０のＩＩＩ型リピートのランダムな変化から明白であり（３４、３５）
、そしてフィブロネクチンのＲＧＤ細胞付着促進性配列に類似する配列を有する
、広いスペクトルのタンパク質に保存されている（５０）。

【００９２】 ＴＶＴＭ４、並びにＴＶＴＭ５およびＴＶＴＭ６のＮＧＲモチーフの側方のＮ
末端Ｌｅｕ残基が、ネイティブフィブロネクチンの第９のＩＩＩ型リピートに（
図１）、そして再びランダムファージディスプレイライブラリーのスクリーンに
見出される（３４）。ＴＶＴＭ５およびＴＶＴＭ６は、レトロウイルス粒子への
安定的取り込みおよび比較的大きい細胞結合形質を示す。これらの構築物は、側
方残基がフィブロネクチンの第９のＩＩＩ型リピートに緊密に近似している線状
ペプチドを表し、(i)Ｎ末端Ａｌａ−Ｌｅｕリーダー配列、(ii)コアＮＧＲモチ
ーフのＣ末端側の１つ（ＴＶＴＭ５）または２つ（ＴＶＴＭ６）の負に荷電した
Ｇｌｕ残基；次いで(iii)ネイティブフィブロネクチンの第９および第１０のＩ
ＩＩ型リピートの両方に存在する、Ｉ型βターンであるようであるものを構成し
ている、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ配列（６０）を含む。

【００９３】 フィブロネクチン細胞結合ドメインの構造および機能を考察すると（４８、３
４）、ランダムファージディスプレイライブラリーから確認される（３６）、よ
り大きいホーミング比率（腫瘍／コントロール臓器）の原因となる、活性部位と
してのＣ−ＮＧＲ−Ｃモチーフ（ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣファージ内）の同
定が注目される。概念的には、腫瘍微小環境の影響下では、非悪性であるが活性
化されている内皮細胞が、静止内皮細胞上で高度に発現されていない、接着性分
子および／またはレセプター複合体を発現し、そしてこのレセプターが、保存さ
れそして天然選択によって高親和性相互作用へ導かれているフィブロネクチンの
特異的モチーフ（すなわちＮＧＲ）を認識することがもっともらしい。

【００９４】 実際、もし機能し得る選択性が、未定義の「ＴＶＴＭレセプター」の発現によ
るものであり、そして結合ペプチド（それは遍在フィブロネクチン分子の一次構
造内に固有である）の精密な配列選択性によらないものならば、そのときはフィ
ブロネクチン様配列それ自体を利用することが、ＴＶＴＭ５およびＴＶＴＭ６に
おけるように有利であるかもしれない。実際、ＴＶＴＭ４、５および６は、レト
ロウイルスベクター生成、レトロウイルス粒子の膜タンパク質の安定性、および
得られるＴＶＴＭを有するビリオンの、増殖中の内皮細胞およびトランスフォー
メーションしたＫＳＹ１細胞への結合相互作用の観点から最も好適であるべきだ
と決定される。推定ＴＮＴＭレセプターに関して、培養における通常およびＫＳ
Ｙ１内皮細胞の両方のＴＮＴＭ結合特性が、低密度条件で成長した細胞で最高で
あり、そして長時間（４８時間）のＶＥＧＦでの予備処理によって有意に減少し
たように、ＴＶＴＭを有するベクターの細胞結合特性の薬理学的調節が、また、
これらの研究で観察されたことが注目されるのが妥当である。ＶＥＧＦ、並びに
高い細胞密度による、観察された、ＴＶＴＭが標的細胞へ結合することの下方調
節は、他の成長調節分子が推定ＴＶＴＭ細胞性レセプターの生理学的上方調節に
おいて企図され得ることを示唆している。

【００９５】 レトロウイルスベクターターゲティングおよび将来の遺伝子治療の観点から、
好適な親和性、選択性、およびインビボ適用への安定性を示す、ターゲティング
性注射可能ベクターの開発が、重要な目的として残っている（６１）。ターゲテ
ィングレトロウイルスベクターのための多くの創造的システムが設計されたが(
６２）、今日のほとんどの成功したアプローチは、ＥＣＭコンポーネントをＭＬ
Ｖ表面（ＳＵ）タンパク質の一部と認識し、ベクターを標的細胞の付近のＥＣＭ
に集中させる、リガンドの挿入に関係する（６３）。同様に、レトロウイルス粒
子および標的細胞の特異的フィブロネクチンフラグメント上での共局在化が、イ
ンビトロの培養細胞の形質導入を増加させることが示された（６４）。

【００９６】 腫瘍血管へ特異的にホーミングする、ランダムファージディスプレイ技術によ
り決定される最小／最適ペプチド配列を利用して、ターゲティング性抗がん薬物
−ペプチドコンジュゲートを開発し、それはヒト乳癌異種移植片を有するヌード
マウスの循環へ注射したとき、高い効験および低い毒性を示す（３６）。本研究
はこれらの腫瘍血管ターゲティングモチーフ（ＴＶＴＭ）そしてこれらのコグネ
イトレセプターの我々の理解を広げ、そしてターゲティング性レトロウイルスベ
クターを含むＴＶＴＭの定義されたサブセットの可能性のある利用性を拡大する
。

【００９７】 要するに、フィブロネクチンの第９のＩＩＩ型リピートに近似する一連の線状
ペプチドを含む、設計された一連のＮＧＲを有するペプチド同類の成績を試験す
るための改変アプローチを利用し、そして戦略的リンカーおよびクローニング部
位を含む、ＭＬＶｅｎｖ「エスコート」タンパク質のコンテクストに提示される
、３種の新規設計物（ＴＶＴＭ４、ＴＶＴＭ５およびＴＶＴＭ６）が、タンパク
質発現、レトロウイルスベクター生成、および細胞結合親和性の観点から、最も
好適であることを決定した。これらの最適化されたＴＶＴＭを有するｅｎｖ「エ
スコート」タンパク質は、ヒト内皮細胞でのレトロウイルス細胞結合親和性およ
び形質導入効率を増加させるのに役立つターゲティングエレメントとして機能す
ることがさらに示され、このことは、治療血管形成および／または抗血管形成／
抗癌戦略での遺伝子送達を改良するための可能性のある有用性を示している。

【００９８】 表１ レトロウイルスベクターのウイルス力価 腫瘍血管ターゲティングモチーフをディスプレイする

【表２】 ＣＥＥ＝野生型エンベロープを有する、自己向性レトロウイルスベクター ＣＥＥ＋ＴＶＴＭ（１−６）＝エスコートｅｎｖタンパク質としてＴＶＴＭ（１
−６）をディスプレイする、自己向性レトロウイルスベクター ＣＡＥ＝野生型エンベロープを有する、両種向性レトロウイルスベクター ＣＡＥ−＋ＴＶＴＭ（１−６）＝エスコートｅｎｖタンパク質としてＴＶＴＭを
ディスプレイする、両種向性レトロウイルスベクター 表の結果を２反復測定の算術平均として表す。

【００９９】 表２ レトロウイルスベクターの形質導入効率 腫瘍血管ターゲティングモチーフをディスプレイする

【表３】 ＣＡＥ＝野生型エンベロープを有する、両種向性レトロウイルスベクター ＣＡＥ＋ＴＶＴＭ５＝エスコートｅｎｖタンパク質としてＴＶＴＭ−５をディス
プレイする、両種向性レトロウイルスベクター ＣＡＥ＋ＴＶＴＭ６＝エスコートｅｎｖタンパク質としてＴＶＴＭ−６をディス
プレイする、両種向性レトロウイルスベクター 表の結果を算術平均±ＳＥＭとして表す。 ＮＤ＝検出せず ｐ値＝ＣＡＥ（野生型エンベロープを有するベクター）と比較したときの有意水
準

【０１００】 実施例２ 本実施例では、我々は選択したＴＶＴＭを、シングル両種向性エンベロープコ
ンフィグレーションで取り込ませ、そして得られるベクターを活性化微小血管内
皮細胞への結合親和性について評価した。最適のＴＶＴＭを有するベクターを、
次の癌の動物モデルのインビボでの使用のために、インビトロの形質導入アッセ
イでさらに試験した。

【０１０１】 材料および方法 細胞株、細胞培養条件およびプラスミド。マウスラス活性化微小血管内皮細胞（
ＳＶＲ）をClonetics(San Diego, CA, USA)から入手した。マウスＮＩＨ３Ｔ３
（ＣＲＬ １６５８）およびヒト臍静脈内皮（ＨＵＶＥ）細胞（ＣＲＬ１１２６
８）は、American Type Cluture Collection(Rockville, MD, USA)によって供給
された。ＳＶ４０ラージＴ抗原（２９３Ｔ）でトランスフォーメーションされた
、ヒト胚性腎臓細胞株は、Dr. Michele Calos, Stanforf University, Palo Alt
o, CAの好意により提供された。ＮＩＨ３Ｔ３、２９３ＴおよびＳＶＲ細胞を、
１０％胎児ウシ血清で補足したDulbecco's修飾Eagle's培地（Ｄ１０；Gibco BRL
, Gaithersburg, MD, USA）で維持した。

【０１０２】 ＨＵＶＥ細胞を１％ゼラチンコート皿上で、１０％の胎児ウシ血清、１％のピ
ルビン酸ナトリウム、１％の必須アミノ酸、１％の非必須アミノ酸、１ｍＭのグ
ルタミン、および１％のペニシリン−ストレプトマイシンで補足した、ＲＰＭＩ
１６４０で培養した。ウイルスｇａｇ ｐｏｌ遺伝子を含むプラスミドｐｃｇｐ
、および核ターゲティング性βガラクトシダーゼ構築物を発現している、ｐｃｎ
Ｂｇである、レトロウイルスベクターは、それぞれDrs. Paula CannonおよびLin
g Li（USC Gene THerapy Laboratories, Los Angeles, CA）の好意によって提供
された。ｇｐ７０ｅｎｖタンパク質のＣ末端に対して指向される、８３Ａ２５と
いうラットモノクローナル抗体は、Dr. Leonard Evans(Rocky Mountain Laborat
ories, MT)によって提供された。

【０１０３】 腫瘍血管ターゲティングモチーフをディスプレイしている、ＭＬＶに基づく両種
向性エンベロープタンパク質の分子クローニング。粘着末端を有するＴＶＴＭイ
ンサートを、引用文献のHall et al., 2000(66)に記載のように、Ｎ末端付近に
独特なｐｓｔ１制限部位を含むように改変された修飾エンベロープ構築物（ＣＡ
Ｅ−Ｐ）にクローニングした。簡単には、ＭＬＶに基づくｅｎｖ構築物をＰｓｔ
−１で切断し、直鎖状ｅｎｖプラスミドをアガロースゲル上で制限分析によって
確認し、そしてGene Clean 方法（Bio 101, Vista, CA）によって精製し、次い
で室温３時間または４℃終夜のいずれかでそれぞれのＴＶＴＭインサートおよび
Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA)でライゲートし
た。

【０１０４】 得られる構築物では、グリシンリンカーの側方のＴＶＴＭペプチドを、ＣＡＥ
−Ｐエンベロープ糖タンパク質のａ．ａ．６と７の間の改変Ｐｓｔ−１部位に挿
入した。ライゲーションの後、種々のプラスミドＤＮＡの構築物を、E. coliの
ＫＬ１ Ｂｌｕｅ株に形質転換させ、そしてアンピシリン選択下でＬＢアガープ
レート上で成長させた。プラスミドＤＮＡを、QIAprep Miniprep Kits(Qiagen,
Valencia, CA)を使用して選択された形質転換クローンから抽出した。それぞれ
の構築物を、それぞれのインサートの酵素消化および分析、次いで直接的ＤＮＡ
配列分析によって確認した。

【０１０５】 レトロウイルスベクターストックの作成。ＷＴｅｎｖを有するレトロウイルスベ
クターおよび／またはＴＶＴＭを有する構築物を、３種のプラスミド一過性トラ
ンスフェクションシステム（３８）を使用してアセンブルした。パッケージング
コンポーネントｇａｇ−ｐｏｌ、ＷＴｅｎｖまたはキメラｅｎｖ、およびＣＭＶ
プロモーターから発現される核ターゲティング性βガラクトシダーゼ発現構築物
を有するレトロウイルスベクターを、別のプラスミドであってそれぞれがＳＶ４
０複製開始点を含むものに置いた。１０μｇのそれぞれのプラスミド（ｐＣｇｐ
、ｐＣＡＥ、ｐＴＶＴＭ−４、ｐＴＶＴＭ−５またはｐＴＶＴＭ−６、およびｐ
ＣｎＢｇ）を、カルシウムフォスフェート方法によって、ＳＶ４０ラージＴ抗原
を発現する２９３Ｔ細胞に共トランスフェクションさせた。プロデューサー細胞
を、次に、１０ｍＭのナトリウムブチレートで８ないし１２時間処理し、ビリオ
ン生成を促進し、そしてレトロウイルス上清をトランスフェクション後ｔ＝２４
時間で収集した。

【０１０６】 ウイルスプロセッシングおよびキメラｅｎｖタンパク質のレトロウイルスベクタ
ーへの取り込み。２９３Ｔ細胞ライセートでの発生期のＷＴｅｎｖタンパク質ｇ
ｐ７０および／またはキメラｅｎｖタンパク質の発現レベルを、以前記載のよう
に（３９）、ｇｐ７０のＳＵドメインのＣ末端に対するラットモノクローナル８
３Ａ２５抗体を使用して、ウェスタン分析によって評価した。ビリオンへのｅｎ
ｖ取り込みを評価するために、ウイルス粒子を可溶性タンパク質および細胞残骸
から２０％スクロース勾配（ＰＢＳにおける）で精製し、そしてビリオン会合性
タンパク質を抗ｇｐ７０および抗ｐ３０抗体（３９）を使用するウェスタン分析
に付した。

【０１０７】 ウイルス力価の決定。マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞でのウイルス力価を、βガラクト
シダーゼ導入遺伝子の発現に基づいて、以前記載のように決定した（４０）。ウ
イルス力価を、βガラクトシダーゼポジティブコロニー形成単位、（ｃｆｕ）／
ｍｌ培地の数として表した（表３）。

【０１０８】 表３ レトロウイルスベクターの形質導入効率 腫瘍血管ターゲティングモチーフをディスプレイする

【表４】 ＣＡＥ＝野生型エンベロープを有する両種向性レトロウイルスベクター ＣＡＥ＋ＴＶＴＭ−５＝ＴＶＴＭ−５をディスプレイする、両種向性レトロウイ
ルスベクター ＣＡＥ＋ＴＶＴＭ−６＝ＴＶＴＭ−６をディスプレイする、両種向性レトロウイ
ルスベクター 表の結果は算術平均＋ＳＥＭとして表す ＮＤ＝検出せず ｐ値＝ＣＡＥ（野生型エンベロープを有するベクター）と比較したときの有意水
準

【０１０９】 ヒト内皮細胞へのウイルスの結合。ウイルスの結合の定量のために、５×１０^６ ＨＵＶＥ細胞を微小遠心管中のＲＰＭＩ１６４０に懸濁し、そして１ｍｌのテス
トベクター上清を添加した後（ウイルス力価を〜１×１０^６ｃｆｕ／ｍｌに標準
化した）、１５秒間スピンダウンした。混合物を室温で３０分間穏やかに振とう
しながらインキュベーションした。細胞をＤ１０（ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ）培
地で２回洗浄し、それからｇｐ７０ＭＬＶｅｎｖタンパク質（４１）のＣ末端に
対して指向されるラットモノクローナル８３Ａ２５Ａｂの存在下で３００μｌに
再懸濁し、そして室温で１時間インキュベーションした。細胞をＤ１０で再び２
回洗浄し、それから５００μｌの１：２５００ＨＲＰ−ヤギ抗ラットＩｇＧ（Zy
med Laboratories Inc.）中で室温で３０分インキュベーションした。洗浄後、
細胞を５００μｌの１：１０００ラットペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ抗
体（Sternberger Monoclonals, Inc.）で室温で３０分間インキュベーションし
た。洗浄後、細胞を１００μｌのＴＭＢシングル溶液（Zymed Laboratories Inc
.）中に懸濁し、そして９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに移し、ここで、呈色反
応（青色）の強度を、Rainbow Spectra ELISA リーダー（TECAN US, Inc., NC）
によって読んだ。

【０１１０】 活性化微小血管内皮（ＳＶＲ）およびＨＵＶＥ細胞の形質導入。形質導入実験の
ために、３ｍｌのＤ１０中の５×１０^４のＳＶＲ細胞を、それぞれの未コートの
プラスチックウェルに置き、そして３ｍｌのＲＰＭＩ−２％（ＲＰＭＩ １６４
０中の２％ＦＢＳ）中の２．５×１０^５のＨＵＶＥ細胞を、６ウェルプレートの
それぞれのゼラチンコートウェルに置き、そして終夜３７℃で付着させた。培養
物を、ポリブレン（８μｇ／ｍｌ）の存在下、ウイルス力価の等価性のために標
準化した１ｍｌのそれぞれのテストベクター上清で、３７℃３０分間形質導入さ
せた（Liu et al., 2000）。その後、２．５ｍｌのそれぞれの新鮮な培地を培養
物に添加し、次いで４８−７２時間３７℃でインキュベーションした。次いで、
細胞をＸ−Ｇａｌ染色剤で染色し、偏向顕微鏡下で核ターゲティング性βガラク
トシダーゼ活性の存在を検出した。３反復の実験で、βガラクトシダーゼポジテ
ィブ細胞（青色染色核を有する細胞）の数を各テスト群の３ないし４低力（１０
Ｘ）フィールドでカウントし（〜１０００総ＳＶＲ細胞／フィールド；〜５００
ＨＵＶＥ細胞／フィールド）、そして形質導入効率を％βガラクトシダーゼ発現
細胞として表した。

【０１１１】 結果 ３種のＮＧＲを有するＴＶＴＭモチーフを、比較評価のために選択した。ＴＶ
ＴＭ−４は、コアＮＧＲモチーフに疎水性残基（Ｌｅｕ）Ｎ末端および極性残基
（Ｓｅｒ）Ｃ末端を含む、ＴＶＴＭ−３の特異的修飾を導入する（６５）。ＴＶ
ＴＭ−５およびＴＶＴＭ−６は、第９のフィブロネクチンＩＩＩ型リピートに存
在する、隣接Ｃ末端残基（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）の影響を試験する
ために設計されるＮＧＲモチーフの同類を構成する（４２；６５）。グリシン残
基は、二次構造の柔軟性を付加し、そしてキメラレトロウイルスエンベロープタ
ンパク質の折り畳みを促進する努力中に、ＴＶＴＭのそれぞれの側方のリンカー
としての構築物に含まれた。３または５つの連続性ＴＶＴＭ−６を組みこんでい
るさらなる構築物を、これらの比較研究のために調製した。

【０１１２】 我々は、２９３Ｔ細胞のライセート（lysate）におけるＷＴ ＣＡＥおよびＴ
ＶＴＭｅｎｖタンパク質のｅｎｖタンパク質発現レベルの比較評価をした。本実
施例の材料および方法に記載のように、レトロウイルス上清を２０％スクロース
勾配で精製し、そしてウイルスペレットを抗ｇｐ７０および抗ｐ３０抗体を使用
してウェスタン分析に付した。一過性トランスフェクションすると、すべての３
種のＴＶＴＭエンベロープタンパク質が発現され、そしてヒト２９３Ｔレトロウ
イルスベクタープロデューサー細胞で正確にプロセッシングされ、それぞれは、
ウェスタン分析によって確認されるように、明かに分子量〜６０ｋＤａを示した
。３種の修飾エンベロープタンパク質の発現は、ＷＴｅｎｖタンパク質の不存在
によって障害を受けず、そしてＷＴ ＣＡＥまたはキメラＴＶＴＭｅｎｖタンパ
ク質を有するレトロウイルスベクターのビリオン取り込みのレベルは、比較的で
ある。しかし、ＴＶＴＭ−４のウイルス粒子への取り込みは、ＴＶＴＭ−５また
はＴＶＴＭ−６より相当に小さかった。ＴＶＴＭ−５およびＴＶＴＭ−６をディ
スプレイしているベクターのウイルス力価は、１０６ないし１０８の範囲であっ
た。このことは、効率的なアセンブリー、プロセッシング、およびウイルス粒子
への安定的な取り込みを指摘している。複数のＴＶＴＭは、また、有意な力価の
喪失なくビリオンへ組込まれた。

【０１１３】 ＴＶＴＭを有するレトロウイルスベクターのインビトロでの活性化内皮細胞へ
の結合を試験するために、我々は、増殖性ヒト臍静脈内皮ＨＵＶＥ細胞を利用し
た。これらの結合研究の結果は、ＴＶＴＭ−５およびＴＶＴＭ−６を有するウイ
ルス粒子のＨＵＶＥ細胞への高い親和性結合を実証し、これらはＷＴエンベロー
プを有する（ＣＡＥ）ベクターのそれよりも有意に大きかった。これに対して、
３つのＴＶＴＭ−６および５つのＴＶＴＭ−６を有するベクターの細胞結合親和
性は、実質的により低く、このことは、複数のＴＶＴＭインサートの付与（pres
entation）は、基本的なターゲティングモチーフの成績を向上させないことを指
摘している。

【０１１４】 前記の細胞結合研究のように、テストベクター上清を細胞性形質導入研究のた
めに調製し、そしてＮＩＨ３Ｔ３細胞の形質導入に基づいて力価を等価とするた
めに標準化した。 これらの比較条件下で、ＴＶＴＭをディスプレイしているベクターは、ＷＴｅ
ｎｖを有するベクターと比較して、ＳＶＲ細胞での形質導入効率を有意に向上さ
せた。形質導入効率の平行的な増加が、また、ＨＵＶＥ細胞で観察された（表２
）。これらの結果は、なお未同定の力学的内皮細胞レセプターに対する補助的な
ウイルス結合の向上によって、細胞特異的にターゲティングし、そして形質導入
することを実証している。

【０１１５】 実施例２で我々は、シングルエンベロープコンフィグレーションでＴＶＴＭを
取りこんでいる一連の修飾４０７０Ａ両種向性レトロウイルスベクターを構築し
、そして最適な構築物が、インビボの腫瘍微小環境をシミュレーションする条件
下で、高いウイルスと細胞の結合および活性化微小血管内皮細胞の８倍の高い形
質導入（すなわち、短いインキュベーション時間および希薄非濃縮ベクターの使
用）を示すことを実証した。両種向性ｅｎｖのＮ末端付近に取りこまれた１コピ
ーのＴＶＴＭ−６は、レトロウイウルスベクター生成、レトロウイルス粒子のエ
ンベロープ安定性、および結合相互作用並びに活性化微小血管内皮細胞の形質導
入の観点から、最適なターゲティングモチーフであるべきであることが、決定さ
れた。

【０１１６】 要するに、我々は、最適な腫瘍血管ターゲティングモチーフをディスプレイす
るレトロウイルスベクターであって、ＷＴｅｎｖの共発現なくＷＴ感染性を示し
、優先的に内皮細胞に結合し、そしてインビトロの活性化微小血管内皮細胞にお
いて高い形質導入効率を示すものを生成した。あわせて、本ベクターは、ターゲ
ティング性注射可能ベクターとしてのインビボでのさらなる使用のための大きな
可能性を示す。

【０１１７】 ここで同定した、特許、刊行物（公開された特許出願を含む）、データベース
入力物、および寄託アクセッションナンバーのすべての開示は、あたかもそれぞ
れのそのような特許、刊行物、データベース入力物、および寄託アクセッション
ナンバーが引用により特別に、そして個々にここに取りこまれているかのように
、引用によりここに含まれる。 しかし、本発明の範囲は、前記の特定の実施態様に限定されるべきではないこ
とが、理解されるべきである。本発明は、特に記載の他にも実施され、そしてな
お添付クレームの範囲内であり得る。

【０１１８】 引用文献

【表５】

【０１１９】

【表６】

【０１２０】

【表７】

【０１２１】

【表８】

【０１２２】

【表９】

【０１２３】

【表１０】

【０１２４】

【表１１】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 レトロウイルスエスコートタンパク質の腫瘍血管ターゲティング
モチーフ（ＴＶＴＭ）シリーズの概略図。ＴＶＴＭは、腫瘍血管へレトロウイル
スベクターをターゲティングさせるように設計した。ＴＶＴＭ−１、ＴＶＴＭ−
２およびＴＶＴＭ−３はインビトロパンニングアッセイで上方調節インテグリン
に選択的に結合し、そしてインビボで腫瘍血管で選択的に蓄積することが示され
た。ＴＶＴＭ−４、ＴＶＴＭ−５およびＴＶＴＭ−６は新規ペプチドである。

【図２】 修飾エンベロープタンパク質の発現および腫瘍血管ターゲティン
グモチーフをディスプレイするレトロウイルスベクターへの取り込み。Ａ、Ｃ）
２９３Ｔ細胞ライセートのＷＴ ＣＥＥ、ＷＴ ＣＡＥ、ＴＶＴＭ単独、ＷＴ
ＣＥＥ＋ＴＶＴＭおよびＷＴ ＣＡＥ＋ＴＶＴＭのｅｎｖタンパク質発現レベル
の比較。Ｂ、Ｄ）ＷＴ ＣＥＥ、ＷＴ ＣＡＥ、ＴＶＴＭ単独、ＷＴ ＣＥＥ＋
ＴＶＴＭ、およびＷＴ ＣＡＥ＋ＴＶＴＭを有するレトロウイルスベクターのビ
リオン取り込みのレベルの比較。ｇｐ７０およびｇａｇタンパク質のウェスタン
分析を、ｇｐ７０ｅｎｖのＣ末端に対して、ラットモノクローナル抗体である８
３Ａ２５、およびｐ３０に対してポリクローナル抗体を使用して実施した。

【図３】 自己向性（ＣＥＥ）エンベロープタンパク質と共発現されるＴＶ
ＴＭエスコートタンパク質を有するレトロウイルスベクターのＫＳＹ１細胞結合
親和性。ＴＶＴＭをディスプレイするベクターに対してＷＴｅｎｖ（ＣＥＥ＊ま
たはＣＡＥ＋）を有するベクターの結合親和性の比較を、ＥＬＩＳＡウェル（Ａ
）の暗黒化の程度の変化として示し、次いで、Rainbow Spectra ELISAリーダー(
B)のＯＤＡ６５０の読みとして表現する。＊＝ｐ＜．０５；＊＊＊＝ｐ＜．００
１；＋＝ｐ＜．０５。

【図４Ａ】 ＫＳＹ１細胞のＴＶＴＭレセプターの密度依存性ＶＥＧＦ誘導
性下方調節。ＶＥＧＦによる処置に続き、低または高密度ＫＳＹ１細胞に対する
、ＴＶＴＭをディスプレイするベクターに対するＷＴｅｎｖを有するベクターの
結合親和性の比較を、ＥＬＩＳＡウェル（Ａ）の暗黒化の程度の変化として示す
。

【図４Ｂ】 次いで、Rainbow Spectra ELISAリーダー(Ｂ)のＯＤＡ６５０
の読みとして表現する。

【図４Ｃ】 ＶＥＧＦによる処置に続き、低または高密度ＨＵＶＥ細胞に対
する、ＴＶＴＭをディスプレイするベクターに対するＷＴｅｎｖを有するベクタ
ーの結合親和性の比較を、ＥＬＩＳＡウェル（Ｃ）の暗黒化の程度の変化として
示す。

【図４Ｄ】 次いで、Rainbow Spectra ELISAリーダー(Ｄ)のＯＤＡ６５０
の読みとして表現する。＊ｐ＜．０５、ＶＥＧＦの不存在と比較；＊＊＊ｐ＜．
００１、ＶＥＧＦの不存在と比較。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/15 Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｃ１２Ｎ 1/15 14/15 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 15/00 ＺＮＡＡ 1/21 5/00 Ａ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 アーリンダ・マリア・ゴードン アメリカ合衆国91203カリフォルニア州グ レンデイル、パイオニア・ドライブ345番、 スウィート1803ダブリュー (72)発明者 ダブリュー・フレンチ・アンダーソン アメリカ合衆国91108カリフォルニア州サ ン・マリーノ、オックスフォード・ロード 960番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 EA02 EA04 FA02 FA20 GA11 HA17 4B065 AA90X AA97Y AB01 BA01 CA44 4C084 AA02 AA13 BA44 CA53 NA14 ZA362 ZB212 ZB262 4C087 AA02 BC83 NA14 ZA36 ZB21 ZB26 4H045 AA10 AA30 BA15 BA54 CA01 DA50 EA20 FA72 FA74

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ウイルス表面タンパク質を有するベクター粒子であって、当
   該ウイルス表面タンパク質がＴＶＴＭペプチドを含む、ベクター粒子。
2. 【請求項２】 当該ベクター粒子がレトロウイルスベクター粒子であり、そ
   して該修飾ウイルス表面タンパク質が修飾レトロウイルスエンベロープである、
   請求項１に記載のベクター粒子。
3. 【請求項３】 当該レトロウイルスエンベロープがレセプター結合領域を含
   み、当該レセプター結合領域が修飾され、ＴＶＴＭペプチドを含むものである、
   請求項２に記載のレトロウイルスベクター粒子。
4. 【請求項４】 当該ＴＶＴＭペプチドがＴＶＴＭ６である、請求項１ないし
   ３のいずれかに記載のベクター粒子。
5. 【請求項５】 １コピーのＴＶＴＭペプチドがウイルス表面タンパク質に含
   まれるものである、請求項１ないし４のいずれかに記載のベクター粒子。
6. 【請求項６】 ウイルス表面タンパク質が、ウイルス表面タンパク質のＮ末
   端付近にＴＶＴＭペプチドを含むものである、請求項１ないし５のいずれかに記
   載のベクター粒子。
7. 【請求項７】 修飾ポリヌクレオチドがＴＶＴＭペプチドをコードしている
   ポリヌクレオチドを含むものである、修飾ウイルス表面タンパク質をコードして
   いる修飾ポリヌクレオチド。
8. 【請求項８】 当該修飾ポリヌクレオチドが、修飾レトロウイルスエンベロ
   ープポリペプチドをコードするものである、請求項７に記載の修飾ポリヌクレオ
   チド。
9. 【請求項９】 当該レトロウイウルスエンベロープポリペプチドがレセプタ
   ー結合領域を含み、ここで修飾ポリヌクレオチド中で、レセプター結合領域をコ
   ードしているポリヌクレオチドが修飾され、ＴＶＴＭペプチドをコードしている
   ポリヌクレオチドを含むものである、請求項８に記載の修飾ポリヌクレオチド。
10. 【請求項１０】 ＴＶＴＭペプチドをコードしているポリヌクレオチドがＴ
    ＶＴＭ６をコードしているポリヌクレオチドである、請求項７ないし９のいずれ
    かに記載の修飾ポリヌクレオチド。
11. 【請求項１１】 ＴＶＴＭペプチドをコードしている１コピーのポリヌクレ
    オチドが、ウイルス表面タンパク質をコードしている修飾ポリヌクレオチドに含
    まれるものである、請求項７ないし１０のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチ
    ド。
12. 【請求項１２】 ウイルス表面タンパク質をコードしている修飾ポリヌクレ
    オチドが、５’末端付近にＴＶＴＭペプチドをコードしているポリヌクレオチド
    含むものである、請求項７ないし１１のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド
    。
13. 【請求項１３】 修飾エンベロープポリペプチドを有するレトロウイルスベ
    クター粒子を生成するためのプロデューサー細胞であって、当該プロデューサー
    細胞が請求項７ないし１２のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチドを含むもの
    である、プロデューサー細胞。
14. 【請求項１４】 Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｈｉ
    ｓ Ａｌａ； Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ ；および Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ：
    からなる群より選択されるペプチド。
15. 【請求項１５】 請求項１４に記載のペプチドをコードしているポリヌクレ
    オチド。
16. 【請求項１６】 壁を含むプロテオリポソームであって、当該プロテオリポ
    ソームの当該壁がＴＶＴＭペプチドを含む修飾レトロウイルスエンベロープポリ
    ペプチドを含むものである、プロテオリポソーム。
17. 【請求項１７】 請求項１ないし６のいずれかに記載のベクター粒子であっ
    て、腫瘍の血管の細胞の成長を阻害、防止、または破壊することのできる物質を
    コードしているポリヌクレオチドをさらに含むものである、ベクター粒子。
18. 【請求項１８】 宿主の腫瘍を処置する方法であって、当該宿主に請求項１
    ７に記載のベクター粒子を投与し、当該ベクター粒子が当該宿主の腫瘍の血管の
    細胞の成長を阻害、防止、または破壊するのに有効な量で投与されるものである
    、方法。
19. 【請求項１９】 医薬としての請求項１７に記載のベクター粒子の使用。
20. 【請求項２０】 腫瘍処置のための医薬の製造における請求項１７に記載の
    ベクター粒子の使用。
21. 【請求項２１】 腫瘍の血管の細胞の成長を阻害、防止、または破壊するの
    に有用な医薬の製造における請求項１７に記載のベクター粒子の使用。