JP2000511051A

JP2000511051A - 細胞受容体に関してマスキングされているか又は非マスキング（ｕｎｍａｓｋｅｄ）されたウイルス粒子

Info

Publication number: JP2000511051A
Application number: JP09541705A
Authority: JP
Inventors: コッセ，フランソワ―ロワ; ヴァルセシア，サンドラン; ラッセル，スティーブン・ジェー
Original assignee: サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシェ・シャンティフィク
Priority date: 1996-05-20
Filing date: 1997-05-16
Publication date: 2000-08-29
Also published as: FR2748747A1; FR2748747B1; CA2253874A1; WO1997044474A3; AU725632B2; AU3035697A; EP0953053A2; WO1997044474A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、標的真核細胞中への遺伝子の導入のためのペプチドの用途を特徴とするもので、このペプチドは、約１０〜約２００、特に約１５〜約１５０アミノ酸、そして有利には約２０アミノ酸を含有し、そして少なくとも３０％のアミノ酸は、プロリン残基から構成され、これらのプロリン残基は、約１８０°でのポリペプチド鎖の折り返し（「β−折り返し」又は「逆折り返し」）を誘導するように規則的に配置され、これらの折り返しは、均等に間隔があき、そして該ペプチドのＮ末端側（上流）に、標的表面分子又は細胞表面上に発現する抗原、特に該真核細胞上に位置する適切な受容体（標的受容体）を認識することができるＮ末端（上流）タンパク質ドメインを含有し、そして該ペプチドのＣ末端側（下流）に、該真核細胞上に位置する適切な受容体（補助受容体）を認識することができるＣ末端（下流）タンパク質ドメインを含有するポリペプチド構築物中に、ポリプロリンβ−折り返しらせんを形成し、このペプチドは、Ｃ末端（下流）タンパク質ドメインと補助受容体の間の相互作用を促進又は阻害することができ、この相互作用の阻害は、Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインが標的受容体と相互作用しないときに起こり、そしてＣ末端（下流）タンパク質ドメインと補助受容体の間の相互作用の促進は、Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインが標的受容体と相互作用したときに起こる。

Description

【発明の詳細な説明】細胞受容体に関してマスキングされているか又は非マスキング（unmasked）されたウイルス粒子本発明は、生物学的機構に関して、特に細胞相互作用の機構に関して、マスキングの性質及び非マスキングの性質を有するペプチドを有する、組換えウイルス粒子に関する。本発明はまた、特に遺伝子導入における細胞標的化のための、上述のウイルス粒子の適用に関する。レトロウイルス、そしてしたがってレトロウイルスベクターは、特異的な細胞表面分子（レトロウイルス受容体と呼ばれる）を、レトロウイルス粒子の表面で発現するエンベロープ糖タンパク質で認識することにより、これらの感染サイクルを開始する。次にこの認識により、複雑であまり理解されておらず、またエンベロープ糖タンパク質の第２の機能が介在するプロセスである、ウイルスと細胞膜の間の融合が起こる。標的細胞の表面との相互作用の特異性を改変する可能性は、特にレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質に導入された遺伝子修飾により、以前に証明されている。幾つかの研究により、このような修飾は、レトロウイルスエンベロープ糖タンパク質が成熟し、細胞表面上に発現し、そしてビリオンに選択的に組込まれることを可能にする複雑なプロセスにおいて、妨害作用を伴わないことが証明されている。更には、今やこれらの修飾が、これらのポリペプチドに対応する表面分子との相互作用による細胞の特異的認識をもたらしうることが明らかになった。最後に、ある場合には、この認識により、標的細胞における感染サイクルの継続及び導入遺伝子（transgene）の組み込みが可能になるが、その効率は、最良の可能性ある場合で、未修飾レトロウイルスエンベロープによりその正常レトロウイルス受容体を介して与えられる効率よりもはるかに低下している。よって一方では、幾つかの標的表面分子は、感染を開始するための受容体として使用することができず、そして他方では、これらをそのように使用することができる場合、最初の相互作用に続くプロセスは極めて低い効率で起こると結論される。これらの結論は、「１段階標的化」の方策、即ち、最初の相互作用の目的が、補助プロセスの介入なしに、感染サイクルの継続を直接もたらすことであるアプローチに関しては真である。導入遺伝子の安定な組込み及び発現が必要とされているため、レトロウイルスベクターは、遺伝子導入及び特に遺伝子治療のために今や最も使用されているベクターである。他の遺伝子導入ベクターは存在する（アデノウイルスベクター、リポソーム、ヘルペスウイルスから誘導されたベクター、又はＡＡＶから誘導されたベクター）が、導入遺伝子の安定で効率的な組込みが得られない。現在までに試験された、レトロウイルスベクターを用いる多くの遺伝子治療プロトコールは、患者の細胞の外植(explantation)、インビトロにおけるこれらのトランスジェネシス（transgenesis）及び増殖、これに続くこれらの再移植に基づくのに対して、レトロウイルスベクターによってインビボの状況で治療遺伝子を導入できるようにすることが非常に望まれる。このために、治療遺伝子を運ぶレトロウイルス粒子は、幾つかの追加的特徴、更に詳細には、遺伝子導入の標的細胞を非常に特異的に認識する能力を備える必要があろう。実際、感染の開始のためにレトロウイルスにより自然に認識される表面分子は、多くの細胞上で非常に広範に発現する。このため、遺伝子導入を成し遂げようと考える細胞の正確な識別ができない。幾つかの研究では、レトロウイルスベクターの感染親和性を改変することを目的とした。これらの研究の幾つかは、レトロウイルス粒子の生化学的修飾に基づき、他の幾つかは、レトロウイルスエンベロープ糖タンパク質の遺伝子修飾（全てのレトロウイルス粒子が改変することを保証する）に基づく。この前文に関連して、この研究は、修飾されたウイルス粒子が標的細胞表面分子に付着し、このため感染サイクルが継続する「単一段階標的化」からなっていた。しかし、このように改変されたレトロウイルスベクターの効率は、治療の目的のために使用できる道具を得るために必要とされるものとしては非常に低い。標的化の方策の開発は、既に上述した理由（キメラエンベロープ糖タンパク質の標的表面分子への結合後の、これらの糖タンパク質の遺伝子融合プロセスの非効率、及びレトロウイルス受容体として幾つかの表面分子は使用できないこと）で「単一段階」システムでは成功できない可能性がある。幾つかのヒト遺伝子治療プロトコールでは、組換えレトロウイルス粒子の直接接種によりインビボで遺伝子導入を成し遂げることのできる、レトロウイルスベクターが要求される。現在までに開発されたレトロウイルスベクターに対して、これが前提とする改善点の中で、我々は下記： − 感染価の改善、 − 血清及び更に一般的には種々の体液中でのウイルス粒子の安定性の改善、 − 休止細胞に感染できること、 − 遺伝子治療の標的細胞を識別できること、を列挙することができる。本発明は、遺伝子治療の標的細胞を識別するための手段を提案することを目的とする。遺伝子治療における幾つかの適用では、遺伝子導入は処置すべき細胞でのみ起こり、他のカテゴリーの細胞では起こらないことを保証することが必須である。例えば、我々が化学療法に関して正常細胞にある選択的な利益を与えようとすると、この利益を与える導入遺伝子ががん細胞中に導入されないようにせざるをえない。本発明は、第２段階が第１段階の実現次第である、２段階機構に関する。本発明は、特に、効率については既知である天然のレトロウイルスの機構と関係のある、標的細胞の特異的認識と標的細胞への侵入とを併用するために、標的化の性能に関して有益な代替法に関する。本発明は、更に詳細には２段階標的化機構： − エンベロープ糖タンパク質に挿入された新規なＮ末端結合ドメインにより標的表面分子の認識を可能にする第１段階、 − 当初のエンベロープ糖タンパク質に元々あるドメインを介する正常レトロウイルス受容体の条件つきの認識を可能にし、そしてこのため、細胞中へのウイルス粒子の侵入のプロセスにおける中継を可能にする第２段階(ここで、「条件つき」という用語は、侵入機構における中継が、ウイルス粒子が前もって当初の表面分子と相互作用した場合にのみ達成でき、次いで真に標的に感染させることを保証することを意味する)、に関する。本発明は、２段階機構における第１段階を行うための、そして第１段階が起こらない限り、第２段階に関して「マスキング」の役割を演じ、かつ第１段階が起こった場合のみ、第２段階を可能にする、即ち、第２段階に関して非マスキングの役割を演じる、新規なペプチドに関する。本発明はまた、これらの新規なペプチドを使用する、キメラエンベロープ糖タンパク質の構築に関する。本発明は、標的真核細胞中への遺伝子の導入のためのペプチドの用途に関するもので、このペプチドは、約１０〜約２００、特に約１５〜約１５０アミノ酸、そして好ましくは約２０アミノ酸を含有し、そして少なくとも３０％のアミノ酸は、プロリン残基から構成され、これらのプロリン残基は、約１８０°にポリペプチド鎖の折り返し（「β−折り返し」又は「逆折り返し」）を誘導するように規則的に配置され、これらの折り返しは、均等に間隔があき、そして該ペプチドのＮ末端側（上流）に、標的表面分子又は細胞表面上に発現する抗原、特に該真核細胞上に位置する適切な受容体(標的受容体)を認識することができるＮ末端(上流) タンパク質領域を含有し、そして該ペプチドのＣ末端側（下流）に、上述の真核細胞上に位置する適切な受容体（補助受容体）を認識することができるＣ末端（下流）タンパク質領域を含有するポリペプチド構築物中に、β型折り返しを伴うポリプロリンらせん（「ポリプロリンβ−折り返しらせん」）を形成し、このペプチドは、Ｃ末端（下流）タンパク質領域と補助受容体の間の相互作用を促進又は阻害することができ、この相互作用の阻害は、Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインが標的受容体と相互作用しないときに起こり、そしてＣ末端（下流）タンパク質ドメインと補助受容体の間の相互作用の促進は、Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインが標的受容体と相互作用したときに起こる。２０アミノ酸のペプチド（以下に定義されるΔＰＲＯ）の場合、このβ−折り返しポリプロリンらせんは、４つのβ折り返し及びこのため４つの折り返しを含有し、そして更にα−らせん又はβ−シート二次構造とは適合しない。都合のよいことに、キメラタンパク質の２つのドメイン（Ｎ末端ドメインと補助ドメイン）の間に位置するβ型折り返しを有するポリプロリンらせんは、本質的に、１）弾性力、２）おそらくエンベロープの三量体性に関係して、他のポリプロリンらせんとの自己集成（self assembly）の性質、３）Ｎ末端ドメインのその受容体との結合により誘導される歪みを補助ドメインに伝達し、補助ドメインの活性化を若起する性質を有する。本発明はまた、一般に、第１段階が起こった場合にのみ第２段階が行われる任意の２段階機構に関するものであり、そして例えばキメラタンパク質がその基質を認識することができる場合にのみ起こる、キメラタンパク質に関係する酵素機構に関する。「標的表面分子、又は細胞表面上に発現する抗原を認識することができるＮ末端（上流）タンパク質ドメイン」という表現は、１）このＮ末端タンパク質ドメインと標的表面分子の間の相互作用は、（野生型レトロウイルスエンベロープ糖タンパク質とレトロウイルス受容体の間の相互作用に関してナノモルオーダーの）解離定数により特性を表すことができ；２）このＮ末端タンパク質ドメインの可溶化型（即ち、キメラエンベロープ糖タンパク質の構築に関わっていない）は、キメラエンベロープ糖タンパク質中のＮ末端位置に挿入されると、この同じタンパク質ドメインと同様な結合性を有し；３）Ｎ末端タンパク質ドメインを含有するキメラエンベロープ糖タンパク質は、ウイルス学の古典的な方法（例えば、結合試験；「実施例」を参照のこと）により解析することができる、ことを意味する。標的表面分子、又は細胞表面上に発現する抗原の例として、以下を挙げることができる： − 種々の造血細胞系統を識別するためのマーカー、特に未分化細胞及び／又は造血幹細胞上に発現するマーカー(例：ＣＤ３４)、 − 腫瘍細胞に発現するマーカー(例：がん胎児性抗原)、 − 種々の分化組織に特異的に存在するマーカー(例：増殖因子の受容体、ペプチドホルモンの受容体)。標的表面分子の例としては、以降で標的受容体と呼ばれる受容体を特に挙げることができる。用語法の便宜のために、「標的受容体」という表現は、任意の標的表面分子又は細胞表面上に発現する任意の抗原を包含するように以降使用される。「適切な受容体（補助受容体）を認識することができるＣ末端（下流）タンパク質ドメイン」という表現は、Ｃ末端タンパク質ドメインが補助受容体と相互作用することができ、この相互作用は、Ｃ末端タンパク質ドメインがレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質から誘導され、補助受容体がこの同じ糖タンパク質により使用されるレトロウイルス受容体であるならば、ナノモルオーダーの解離定数により特性を表され、この相互作用が、自然のプロセスに厳密に類似した機構（即ち、キメラエンベロープ糖タンパク質に関係なく）において遺伝子融合プロセスを引き起こすことができることを意味する。本発明の主題であるペプチドは、２つのタンパク質ドメイン（該ペプチドに対してＮ末端タンパク質ドメイン、及び該ペプチドに対してＣ末端タンパク質ドメイン）の間に位置し、Ｎ末端タンパク質ドメインがその機能（例えば結合）において起動した場合に限り、Ｃ末端タンパク質ドメインの機能（例えば、このＣ末端ドメインの機能が結合であれば、結合）を誘導しうるものである。本発明のペプチドによりＣ末端タンパク質ドメインの機能が誘導されないということは、本発明のペプチドの「マスキング」の機構に対応し、一方本発明のペプチドによるＣ末端タンパク質ドメインの機能の誘導は、本発明のペプチドの「非マスキング」の機構に対応する。以降本発明のペプチドを「マスキング／非マスキングペプチド」とも呼ぶのはこのためである。本発明は、標的化及び遺伝子融合活性を有する、本質的に完全な、真核細胞に感染することができるウイルス性又は非ウイルス性組換え遺伝子導入ベクターにより運ばれる糖タンパク質の構築における、本発明のペプチドの用途に関するものであり、該真核細胞は、真核細胞中への該ウイルス性又は非ウイルス性ベクターの侵入の促進を可能にする標的受容体及び補助受容体を有しており、上述の糖タンパク質は、 − 上述のペプチド、 − 上述の標的受容体と相互作用することができる該ペプチドのＮ末端（上流）側のタンパク質ドメイン(このタンパク質ドメインは、上述の遺伝子導入ベクターの特異的結合を可能にする)、及び − 上述の補助受容体と相互作用することができる該ペプチドのＣ末端（下流）側のタンパク質ドメイン（この相互作用は、真核細胞中への上述の遺伝子導入ベクターの侵入の補助機構の役割を果たす）を含んでおり、Ｃ末端（下流）タンパク質ドメインによる真核細胞中へのウイルス性又は非ウイルス性組換えベクターの細胞侵入のプロセスは、Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインがウイルス性又は非ウイルス性組換えベクターを認識し、かつこれを真核細胞の標的受容体と結合させたときにのみ起こることができ、これが、上述のペプチドにより、Ｃ末端（下流）タンパク質ドメインに関して補助受容体の「非マスキング」、即ち接近しやすさの機構をもたらし、そして上述の遺伝子導入ベクターと真核細胞の標的受容体の間にＮ末端（上流）タンパク質ドメインによる認識が起こらない場合には、上述のペプチドにより、Ｃ末端（下流）タンパク質ドメインに関して補助受容体の「マスキング」、即ち接近しにくさの機構が生じる。標的化及び遺伝子融合活性を有する糖タンパク質という表現は、１）導入遺伝子を運ぶ（レトロ）ウイルス粒子に効率よく組込まれることができ、２）標的細胞表面分子を特異的に認識することができ、かつそれを運ぶ（レトロ）ウイルス粒子の結合をこの分子に特異的に向け直すことができ、３）分子標的への定着後、エンベロープ糖タンパク質が誘導された（レトロ）ウイルスが本来使用する機構により、（レトロ）ウイルス粒子の膜と細胞の細胞質膜の融合を引き起こすことができる、糖タンパク質を意味する。「実質的に完全」という表現は、翻訳後プロセス（必要に応じて、オリゴマー化、ウイルス組込み及び融合の性質）を保つために必要な全ての決定基を保持しているウイルス糖タンパク質を意味する。しかし、ある種の変化（突然変異、欠失、付加など）は、その機能に著しい影響を及ぼすことなく糖タンパク質に加えることができ、そしてこれら軽い変更を含む糖タンパク質は、本発明の要求にとっては実質的に完全であると見なされる。詳細には、糖タンパク質は、特にＮ末端で、幾つかのアミノ酸（例えば約１〜１０個）が欠けていてもよいが、一般には野生型タンパク質と同じサイズであって、野生型タンパク質と本質的に同じ生物学的性質を持つ。「ウイルス組換え遺伝子導入ベクター」という表現は、真核細胞型の細胞に感染することができる任意のウイルス、好ましくはアデノウイルス又はレトロウイルス（例えばＣ型レトロウイルス）のような遺伝子治療に適したウイルスを意味する。「非ウイルス組換え遺伝子導入ベクター」という表現は、導入される遺伝子を含有するＤＮＡ、その調節配列、及び１）標的細胞の表面上へのＤＮＡの沈殿を標的化し、２）このＤＮＡを標的細胞中に導入し、そして３）このＤＮＡを標的細胞の核内に導入することのできる機能的特性を有する、脂質、炭水化物、又はタンパク質の分類に属する分子を合わせた高分子複合体を意味する。「ウイルス組換え遺伝子導入ベクターの細胞侵入のプロセス」という表現は、この細胞の表面と遺伝子導入ベクターの間の最初の接触後、標的細胞の細胞質中への輸送された遺伝子の導入に至る全ての事象を意味する。一例として、レトロウイルスベクターでは、「標的化可能な」表面分子が既知（即ち、他の組織に比べて充分に特異的）である、定義された細胞標的及び表面分子に対するリガンド（リガンド又は一本鎖抗体）に関して、この表面分子を標的化するエンベロープ糖タンパク質をコードする遺伝子は、遺伝子的に構築することができる。これは、シグナルペプチド、リガンド、「マスキング／非マスキング」ペプチド、及びレトロウイルスエンベロープの残りの部分を融合（ＮからＣ末端）することにより達成される。このキメラ分子の発現ベクターは、ＭＬＶウイルスのｇａｇ及びｐｏｌタンパク質を発現する「半トランス相補(semi-tran scomplementing)」細胞系中に挿入する(レトロウイルスのウイルスキャプシド及び複製の酵素をコードする)。「トランス相補」細胞系を得て、次にこれを使用して、このレトロウイルスベクターを運ぶプラスミドを追加的に導入すれば、正常レトロウイルスエンベロープを発現する従来のトランス相補細胞系で起こるように、レトロウイルスベクターを産生することができる。本発明はまた、真核細胞に感染することができる組換え（レトロ）ウイルス粒子により運ばれる、本質的に完全な（レトロ）ウイルスエンベロープ糖タンパク質の構築における、本発明のペプチドの用途に関するものであり、該エンベロープ糖タンパク質は、好ましくは重合体型、そして特に三量体型であり、重合体型の各モノマーは、今度はヘテロ二量体型であり、該真核細胞は、真核細胞中への上述の（レトロ）ウイルス粒子（(レトロ)ウイルス受容体）の侵入の促進を可能にする標的受容体と補助受容体を有し、エンベロープ糖タンパク質は、 − 上述のペプチド、 − 上述の標的受容体と相互作用することができる、上述のペプチドのＮ末端側（上流）のタンパク質ドメイン(この相互作用は、（レトロ）ウイルス粒子の特異的結合を可能にする)、及び − 上述の（レトロ）ウイルス受容体と相互作用することができる、上述のペプチドのＣ末端側（下流）のタンパク質ドメイン（この相互作用は、真核細胞中への（レトロ）ウイルス粒子の侵入の補助機構の役割を果たす）を含んでおり、Ｃ末端（下流）タンパク質ドメインによる真核細胞中への（レトロ）ウイルス組換え粒子の細胞侵入のプロセスは、Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインが真核細胞の標的受容体を認識し、かつこれを（レトロ）ウイルス組換え粒子と結合させたときにのみ起こることができ、これが、上述のペプチドにより、Ｃ末端（下流）タンパク質ドメインに関して（レトロ）ウイルス受容体の「非マスキング」、即ち接近しやすさの機構をもたらし、そしてウイルス組換え粒子と真核細胞の標的受容体の間に、Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインによる認識が起こらない場合には、上述のペプチドにより、Ｃ末端（下流）タンパク質ドメインに関して（レトロ）ウイルス受容体の「マスキング」、即ち接近しにくさの機構が生じる。（レトロ）ウイルスエンベロープ糖タンパク質は、表面サブユニット（ＳＵ）及び膜貫通サブユニット（ＴＭ）とのヘテロ二量体の三量体である。三量体化のこの概念は、（レトロ）ウイルスエンベロープの機能性の基本である。本発明のエンベロープ糖タンパク質は、好ましくは三量体型である。本発明の有利な実施態様では、Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインは、以下のポリペプチドから選択される： − 細胞表面分子を認識する一本鎖抗体、 − 細胞表面分子に対する任意のリガンド、特にポリペプチドホルモン、サイトカイン、増殖因子。本発明の有利な実施態様では、Ｃ末端（下流）タンパク質ドメインは、天然結合ドメイン、組換え（レトロ）ウイルス粒子により運ばれるエンベロープ糖タンパク質がそれから誘導される野生型エンベロープ糖タンパク質の融合及び付着の機能、を含む、本質的に完全な（レトロ）ウイルスエンベロープ糖タンパク質に対応する。本発明の有利な実施態様では、ペプチドは、Ｃ型レトロウイルスのエンベロープ糖タンパク質に由来し、そしてここでウイルスは、好ましくは以下：同種指向性ＭＬＶウイルス、両種指向性ＭＬＶウイルス、他種指向性ＭＬＶウイルス、ＭＣＦＭＬＶウイノレス、ＭＬＶ１０Ａ１ウイルス、ＧＡＬＶ(テナガザル白血病ウイルス(Gibbon Ape Leukemia Virus))、ＳＳＡＶ(サル肉腫関連ウイルス( Simian Sarcoma Associated Virus))、ＦｅＬＶＡ、ＦｅＬＶＢ、ＦｅＬＶＣ（ＦｅＬＶ：ネコ白血病ウイルス(Feline Leukemia Virus)）から選択され、そして特にペプチドは、以下の配列：ＰＲＯ(４０７０Ａ)、ＰＲＯ(ＭｏＭＬＶ)、ΔＰＲＯ、ＰＲＯ＋、ΔＰＲＯ＋、ＰＲＯβ、ΔＰＲＯβ、ΔＰＲＯ４− β、ΔＰＲＯ４−ｉｎｔ、ΔＰＲＯ４−ｖｒｂ、ＰＲＯβ、ＰＲＯ−ｉｎｔ、ＰＲＯ−ｖｒｂの１つを含むか又はそれで構成されるペプチドから選択される。本発明は、ウシエラスチンから誘導したか又は適合させた、以下の配列：ＥＬ３、ＥＬ３−Ｖ、ＥＬ５の１つを含むか又はそれで構成されるペプチドから選択されるペプチドの用途に関する。本発明はまた、以下の配列の１つを含むか又はそれで構成される配列から選択されるペプチド配列に関する：本発明はまた、約１０〜約２００、特に約１５〜約１５０アミノ酸、そして好ましくは約２０アミノ酸のペプチドを含有するポリペプチド配列に関するものであり、ここで、アミノ酸の少なくとも３０％はプロリン残基からなり、そしてこれらのプロリン残基は、約１８０°でポリペプチド鎖の折り返し（「β−折り返し」又は「逆折り返し」）を誘導するように規則的に配置され、これらの折り返しは、均等に間隔があき、これら自体ポリプロリンβ−折り返しらせんを構成し、 − 上述のペプチドのＮ末端タンパク質ドメイン（上流）が真核細胞上に位置する適切な受容体（標的受容体）と反応することができ(そしてこのタンパク質ドメインは、該Ｎ末端タンパク質ドメインを含有する組換え（レトロ）ウイルス粒子の特異的な結合を可能にする)、そして − 上述のペプチドのＣ末端タンパク質ドメイン（下流）が該真核細胞上に位置する適切な補助（レトロ）ウイルス受容体（(レトロ)ウイルス受容体）と相互作用することができ(そしてこの相互作用は、該真核細胞中への（レトロ）ウイルス粒子の侵入の補助機構の役割を果たす)、該真核細胞中への該組換え（レトロ）ウイルス粒子のＣ末端（下流）タンパク質ドメインによる細胞侵入のプロセスは、Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインが真核細胞の標的受容体を認識し、かつこれを該組換え（レトロ）ウイルス粒子と結合させたときにのみ起こることができ、これが、上述のペプチドにより、Ｃ末端（下流）タンパク質ドメインに関して（レトロ）ウイルス受容体の非マスキング、即ち接近しやすさの機構をもたらし、そして組換えウイルス粒子と真核細胞の標的受容体の間に、Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインによる認識が起こらない場合には、上述のペプチドにより、Ｃ末端（下流）タンパク質ドメインに関して（レトロ）ウイルス受容体のマスキング、即ち接近しにくさの機構が生じる。本発明はまた、真核細胞に感染することができる組換え（レトロ）ウイルス粒子に関するものであり、この細胞は、標的受容体と上述の（レトロ）ウイルス粒子の補助受容体を含有し、特に重合体型、そして好ましくは三量体型の、実質的に完全なエンベロープ糖タンパク質を含み、重合体型の各モノマーは、好ましくはそれ自体ヘテロ二量体型であり、約１０〜約２００、特に約１５〜約１５０アミノ酸、そして好ましくは約２０アミノ酸のペプチドを含有し、ここでアミノ酸の少なくとも３０％は、プロリン残基からなり、これらのプロリン残基は、約１８０°でポリペプチド鎖の折り返し（「β−折り返し」又は「逆折り返し」）を誘導するように規則的に配置され、これらの折り返しは、均等に間隔があき、これら自体ポリプロリンβ−折り返しらせんを構成し、 − 上述のペプチドのＮ末端側（上流）のタンパク質ドメインが上述の標的受容体と相互作用することができ(このペプチド領域は、（レトロ）ウイルス粒子の特異的な結合を可能にする)、そして − 上述のペプチドのＣ末端側（下流）のタンパク質ドメインが上述の（レトロ）ウイルス受容体と相互作用することができ(この相互作用は、真核細胞中への（レトロ）ウイルス粒子の侵入の補助機構の役割を果たす)、真核細胞中への組換え（レトロ）ウイルス粒子のＣ末端（下流）タンパク質ドメインによる細胞侵入のプロセスは、Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインが真核細胞の標的受容体を認識し、かつこれを該組換え（レトロ）ウイルス粒子と結合させたときにのみ起こることができ、これが、上述のペプチドにより、Ｃ末端（下流）タンパク質ドメインに関して（レトロ）ウイルス受容体の非マスキング、即ち接近しやすさの機構をもたらし、そして組換えウイルス粒子と真核細胞の標的受容体の間に、Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインによる認識が起こらない場合には、上述のペプチドにより、Ｃ末端（下流）タンパク質ドメインに関して（レトロ）ウイルス受容体のマスキング、即ち接近しにくさの機構が生じる。本発明はまた、Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインが以下のペプチドから選択されることを特徴とする、組換え（レトロ）ウイルス粒子に関する： − 細胞表面分子を認識する一本鎖抗体、 − 細胞表面分子に対する任意のリガンド、特にポリペプチドホルモン、サイトカイン、増殖因子。本発明はまた、Ｃ末端（下流）タンパク質ドメインが、組換え（レトロ）ウイルス粒子により運ばれるエンベロープ糖タンパク質がそれから誘導される野生型エンベロープ糖タンパク質の結合、融合及び付着の機能を有する（レトロ）ウイルス由来のポリペプチドに対応し、そしてレトロウイルスのＭＬＶ−Ａ、ＧＡＬＶ、ＦｅＬＶＢ、若しくはアデノウイルス、ヘルペスウイルス、ＡＡＶ（アデノ関連ウイルス(Adeno Associated Vi rus)）のようなウイルスから誘導されるエンベロープ糖タンパク質の結合、融合及び付着の機能を有する天然の領域に由来するか、又は更に一般的には真核細胞由来のウイルス［特に、オルトミクソウイルス（インフルエンザウイルスなど）又はパラミクソウイルス(ＳＶ５など)］から誘導されるウイルス糖タンパク質に由来することができることを特徴とする、組換え（レトロ）ウイルス粒子に関する。本発明はまた、ペプチドが、Ｃ型レトロウイルスのエンベロープ糖タンパク質から誘導され、そしてペプチドが、好ましくは以下：同種指向性ＭＬＶウイルス、両種指向性ＭＬＶウイルス、他種指向性ＭＬＶウイルス、ＭＬＶＭＣＦウイルス、ＭＬＶ１０Ａ１ウイルス、ＧＡＬＶ(テナガザル白血病ウイルス(Gibbon Ape Leukemia Virus))、ＳＳＡＶ(サル肉腫関連ウイルス(Simian Sarcoma Asso ciated Virus))、ＦｅＬＶＡ、ＦｅＬＶＢ、ＦｅＬＶＣ（ＦｅＬＶ：ネコ白血病ウイルス(Feline Leukemia Virus)）から選択されるウイルスから誘導され、そして特にペプチドが、以下の配列：ＰＲＯ(４０７０Ａ)、ＰＲＯ(ＭｏＭＬＶ)、ΔＰＲＯ、ＰＲＯ＋、ΔＰＲＯ＋、ＰＲＯβ、ΔＰＲＯβ、ΔＰＲＯ４ −β、 ΔＰＲＯ４−ｉｎｔ、ΔＰＲＯ４−ｖｒｂ、ＰＲＯβ、ＰＲＯ−ｉｎｔ、ＰＲＯ −ｖｒｂの１つを含むか又はそれで構成されるペプチドから選択されることを特徴とする、組換え（レトロ）ウイルス粒子に関する。本発明はまた、 − ペプチドが、Ｃ型レトロウイルスのエンベロープ糖タンパク質に由来し、そしてウイルスは、好ましくは以下：同種指向性ＭＬＶウイルス、両種指向性ＭＬＶウイルス、他種指向性MＬＶウイルス、ＭＬＶＭＣＦウイルス、ＭＬＶ１０Ａ１ウイルス、ＧＡＬＶ(テナガザル白血病ウイルス(Gibbon Ape Leukemia Virus))、ＳＳＡＶ(サル肉腫関連ウイルス(Simian Sarcoma Associated Virus)) 、ＦｅＬＶＡ、ＦｅＬＶＢ、ＦｅＬＶＣ（ＦｅＬＶ：ネコ白血病ウイルス (Feline Leukemia Virus)）から選択され、そして特にペプチドは、以下の配列：ＰＲＯ(４０７０Ａ)、ＰＲＯ(ＭｏＭＬＶ)、ΔＰＲＯ、ＰＲＯ＋、ΔＰＲＯ＋、ＰＲＯβ、ΔＰＲＯβ、ΔＰＲＯ４−β、ΔＰＲＯ４−ｉｎｔ、ΔＰＲＯ４− ｖｒｂ、ＰＲＯβ、ＰＲＯ−ｉｎｔ、ＰＲＯ−ｖｒｂの１つを含むか又はそれで構成されるペプチドから選択され、 − Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインが、以下のペプチド：＊細胞表面分子を認識する一本鎖抗体、＊細胞表面分子に対する任意のリガンド、特にポリペプチドホルモン、サイトカイン、増殖因子から選択され、 − Ｃ末端タンパク質ドメインが、組換え（レトロ）ウイルス粒子により運ばれるエンベロープ糖タンパク質がそれから誘導される野生型エンベロープ糖タンパク質の結合、融合及び付着の機能を有する（レトロ）ウイルス由来のポリペプチドに対応し、そしてレトロウイルスのＭＬＶ−Ａ、ＧＡＬＶ、ＦｅＬＶＢ、若しくはアデノウイルス、ヘルペスウイルス、ＡＡＶ（アデノ関連ウイルス(Adeno Associated Vi rus)）のようなウイルスから誘導されるエンベロープ糖タンパク質の結合、融合及び付着の機能を有する天然の領域に由来するか、又は更に一般的には真核細胞由来のウイルス［特に、オルトミクソウイルス（インフルエンザウイルスなど）又はパラミクソウイルス(ＳＶ５など)］から誘導されるウイルス糖タンパク質に由来することができることを特徴とする、組換え（レトロ）ウイルス粒子に関する。本発明はまた、Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインをコードするヌクレオチド配列の５’末端が、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’末端に隣接し、Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインをコードするヌクレオチド配列の３’末端が、ペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’末端に隣接し、ペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’末端が、Ｃ末端（下流）タンパク質ドメインをコードするヌクレオチド配列の５’末端に隣接することを特徴とする、組換え（レトロ）ウイルス粒子に関する。本発明はまた、本発明のペプチド又は組換え粒子をコードする核酸に関する。本発明はまた、他の非標的細胞の中に存在する標的真核細胞中への核酸の選択的インビトロ又はエクスビボ導入の方法であって、導入される核酸を含有する本発明の組換え（レトロ）ウイルス粒子を、標的及び非標的細胞へ投与することを含む方法に関する。本発明はまた、生理学的に適切な医薬担体と共に、活性物質として本発明の（レトロ）ウイルス粒子を含有し、そして導入される遺伝子をも含有する、医薬組成物に関する。遺伝子治療に重要な導入される遺伝子に関して、これらは、例えば、ＩＦＮ、ＩＬ２、ｐ５３、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ、ＣＦＴＲ、ＨＳＶ−ＴＫ、ｌａｃＺ、ＧＦＰ、種々のサイトカインの遺伝子、条件自殺遺伝子を含む他の型の自殺遺伝子、抗ウイルス活性を有する他の遺伝子、抗腫瘍活性を有する他の遺伝子、他のマーカー遺伝子及び単一又は多重遺伝子性疾患の治療用の任意の遺伝子である。一例として、最も特異的に関与する病態は、ほとんどの単一又は多重遺伝子性疾患（膵線維症、ミオパシー、リソソーム病、種々の形態のがん、ウイルス性疾患（ＡＩＤＳ）など）である。本発明の機構の正確な理解のためには(図１を参照のこと)、本発明のエンベロープ糖タンパク質（「キメラエンベロープ」とも表示される）は、追加の認識領域と同様、これらの固有の特定領域；即ち(図２を参照のこと)、１）野生型エンベロープ糖タンパク質の表面サブユニット（ＳＵ）のＮ末端部分（そのため余分な結合ドメインの直ぐ下流）に位置する天然結合ドメイン、及び２）サブユニット（ＳＵ）のＣ末端部分及びエンベロープ糖タンパク質複合体の膜貫通サブユニット（ＴＭ）に位置する融合ドメインに対応する機能を有することを心に留める必要がある。前に構築されたキメラエンベロープ（例えば、ＥＭＯ及びＡＭＯエンベロープ）では、図２に図解した一般構造に基づき、天然結合ドメインは機能性である。それが認識するレトロウイルス受容体が標的細胞の表面で発現されるならば、このドメインはそれを認識し、そして感染が進行するのを可能にする。そして、余分な結合ドメインを特異的に認識する表面分子も発現されるとしても、特異的な標的化の可能性はない。しかし、余分な結合ドメインと天然結合ドメインの間に挿入されるペプチドによっては、天然結合ドメインの機能性をかなりの程度調整することは可能であり、幾つかのこれらのペプチドでは、レトロウイルス受容体の認識に関してその接近しやすさを有効に防止しうる(第１の作用)。余分な結合ドメインが前もって標的表面分子と相互作用した場合に限り、この部位を非マスキングし、そして正常レトロウイルス受容体との相互作用に接近しやすくすることは可能であろう。この第２の作用にも、２つのドメインを分離するペプチドが介在する。ここで正常レトロウイルス受容体は、補助分子の役割を演じる。図面の符号： − 図１は、標的化ウイルス粒子の２段階侵入プロセスを表す。ウイルス粒子（Ａ）は、マスキング／非マスキングペプチドのＮ末端ドメイン(リガンド、一本鎖抗体など)、及びＣ末端ドメイン（Ｂ）よりなる標的化エンベロープ糖タンパク質により作成する。標的細胞中へのビリオンの導入を引き起こす段階は、マスキング／非マスキングペプチドにより調整される機構を包含する(Ｃ)。 − 図２は、検討した幾つかの標的化エンベロープの概略図である。幾つかの機能性領域の位置を示す。垂直矢印：タンパク質分解の切断部位。ＳＵ：表面サブユニット、ＴＭ：膜貫通サブユニット、ＳＰ：シグナルペプチド、ＰＲＯ：ポリプロリン領域、Ｔ：膜貫通ドメイン、Ｒａｍ−１リガンド：両種指向性受容体の結合ドメイン、Ｒｅｃ−１リガンド：同種指向性受容体の結合ドメイン、ＥＧＦ：上皮細胞増殖因子。暗灰色の四角：ＭｏＭＬＶのｅｎｖ遺伝子から誘導した配列、明灰色の四角：ＭＬＶ−４０７０Ａのｅｎｖ遺伝子から誘導した配列、白色の四角：ＭＬＶから誘導した他の配列。黒色の四角：ポリプロリン領域から誘導したスペーサーペプチド。全てのｅｎｖ遺伝子は、レトロウイルススプライシング部位、ドナー（ＳＤ）及びアクセプター（ＳＡ）［ｐｏｌ遺伝子の末端（Δ ＰＯＬ）を含有する１９０ｎｔの同一のイントロン配列を有する］を使用して、同じプロモーター（ＬＴＲ）及びサブゲノムｍＲＮＡから開始するポリアデニル化シグナル（ｐＡ）から出発して発現される。幾つかの制限部位の位置を示す。 − 図３は、検討したスペーサーペプチド及び結合ドメインの配列を示す。（Ａ）ＡＭＯシリーズのスペーサーペプチド（ＡＳ２０８及び種々のスペーサーペプチドと融合した）の配列、そして全体は、ＭｏＭＬＶのエンベロープのＳＵのコドン７と融合している。(Ｂ)ＭＯＡシリーズのスペーサーペプチドの配列。Ｒｅｃ−１の結合ドメインは、種々のスペーサーペプチドと融合し、そして全体は、両種指向性ＭＬＶのエンベロープのＳＵのコドン５と融合している。（Ｃ）ＥＭＯ及びＥＡシリーズのスペーサーペプチドの配列。結合ドメインＥＧＦは、種々のスペーサーペプチドと融合し、そして全体は、両種指向性ＭＬＶのエンベロープのＳＵのコドン５、又はＭｏＭＬＶのエンベロープのＳＵのコドン７と融合している。 − 図４は、ＥＭＯシリーズのエンベロープの膜発現の検出を示す。フレオマイシンを使用して選択したトランスフェクションした細胞の集団は、抗ｈＥＧＦ抗体で（黒色ヒストグラム）又はこの抗体なし（白色ヒストグラム）でマークし、次にＦＩＴＣと結合した抗ＩｇＧマウス抗体でマークした。 − 図５は、ＡＭＯシリーズのキメラエンベロープの発現及びウイルス組込みを示す。キメラエンベロープ（図２及び図３Ａを参照のこと）を発現するプラスミドによりトランスフェクションしたＴＥＬＣｅＢ６細胞の分解物、及び超遠心分離により精製したウイルス粒子の沈殿物の免疫ブロット。免疫ブロットは、抗ＳＵ抗血清（上部）又は抗ｐ３０−ＣＡ抗血清（下部、４６KD未満のサイズ）で検出する。ｐ３０−ＣＡ（ＣＡ）の位置、及びＭＯ野生型エンベロープについては前駆体（ＰＲ）及びエンベロープ複合体の表面タンパク質（ＳＵ）の位置を示す。 − 図６は、ＥＭＯ（Ａ）及びＡＭＯ（Ｂ）シリーズのエンベロープのヒト細胞上の結合試験を示す。蛍光のバックグラウンドノイズは、同種指向性エンベロープとのヒト細胞のインキュベーションにより与えられる(白色ヒストグラム)。 − 図７は、ＰＲＯ（４０７０Ａ）のアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図８は、ＰＲＯ（ＭｏＭＬＶ）のアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図９は、ＰＲＯβ（ＭｏＭＬＶ）のアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図１０は、ＰＲＯ＋（４０７０Ａ）のアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図１１は、ΔＰＲＯのアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図１２は、ΔＰＲＯβのアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図１３は、ΔＰＲＯ＋のアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図１４は、ＡＭＯＰＲＯのアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図１５は、ＡＭＯΔＰＲＯのアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図１６は、ＭＯＡＰＲＯのアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図１７は、ＭＯＡΔＰＲＯのアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図１８は、ＥＭＯＰＲＯのアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図１９は、ＥＭＯＰＲＯβのアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図２０は、ＥＭＯＰＲＯ＋のアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図２１は、ＥＡＰＲＯのアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図２２は、ＥＡＰＲＯβのアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図２３は、ＥＡＰＲＯ＋のアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図２４は、ＥＭＯΔＰＲＯのアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図２５は、ＥＭＯΔＰＲＯβのアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図２６は、ＥＭＯΔＰＲＯ＋のアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図２７は、ＥＡΔＰＲＯのアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図２８は、ＥＡΔＰＲＯβのアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図２９は、ＥＡΔＰＲＯ＋のアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図３０は、ＡＭＯＥＬ３のアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図３１は、ＥＬ３のアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図３２は、ＡＭＯＥＬ３−Ｖのアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図３３は、ＥＬ３−Ｖのアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図３４は、ＡＭＯＥＬ５のアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図３５は、ＥＬ５のアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図３６は、ΔＰＲＯ４−ベータのアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図３７は、ΔＰＲＯ４−ｉｎｔのアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図３８は、ΔＰＲＯ４−ｖｒｂのアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図３９は、ＰＲＯ−ベータのアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図４０は、ＰＲＯ−ｉｎｔのアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 − 図４１は、ＰＲＯ−ｖｒｂのアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。実施例実施例１：レトロウイルスは、感染プロセスを開始するために、ウイルス受容体と呼ばれる一定数の細胞表面分子を利用する(２３)。幾つかの著しい例外、特にヒト免疫不全症ウイルスの場合を除けば、他のレトロウイルス、特にＣ型哺乳動物レトロウイルスにより利用される多くの受容体は、宿主生物のほとんどの細胞型にわたって分布している。例えば、両種指向性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ−Ａ）は、その受容体のリン酸輸送体のＲａｍ−１がほぼ全ての細胞で発現されるため、大多数の哺乳動物細胞に感染することができる。Ｃ型哺乳動物レトロウイルスは、特にヒトにおける遺伝子導入の目的のため、遺伝子治療において、レトロウイルスベクターを作成するために現在使用されている。幾つかの遺伝子治療法は、レトロウイルスベクターが、遺伝子導入の真の標的細胞を非常に正確に認識することができるならば、促進されるであろう。このため、我々を含む幾つかの研究グループは、ウイルス粒子と細胞表面の間の認識を調節するための種々の方策を開発した。この相互作用は、本質的にレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質に関係する：したがってこのタンパク質が遺伝子導入の標的細胞で特異的に発現される細胞表面分子を認識することができるように、これに遺伝子的変化を加えることが論理的であると考えられる。このような変化を可能にする２つの型の方策が最近開発された。第１の方策では、その受容体に対するレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質の天然結合ドメインを、細胞表面分子に結合することができる、サイズを縮小したペプチドの挿入又は置換により改変した。この研究は、遺伝子導入のための細胞標的化の実行可能性を証明した(２０)。第２のアプローチでは、種々の細胞表面分子に結合することができるポリペプチド（リガンド、一本鎖抗体）をエンベロープ糖タンパク質のＳＵサブユニットのＮ末端に挿入した(６)(１０)(１３)(１５)(２１)。一般に、これらの種々の型の標的化エンベロープにより作成されるビリオンの研究では、ウイルス粒子の結合を新規な表面分子の方に特異的かつ効率的に向け直せることが可能であることが示された。標的化の効力を制限する幾つかの因子もまた同定された。第１は、標的化される表面分子の生理学的性質(二量体化、内在化、細胞内輸送(「traffic king」)プロセス）に依存すると考えられ(６)、第２は、リガンドのＮ末端挿入により生成するキメラエンベロープの低い内因性遺伝子融合能力に関係する(６)( ２１)。この低い遺伝子融合能力は、新規な結合ドメインとエンベロープの間にスペーサーペプチドを導入することにより部分的に克服することができることが観察された(２１)。しかし、得られた最も良好な感染価は、野生型エンベロープを有するレトロウイルスベクターで得ることのできる感染価よりも１００倍低い。更には、特定の標的化モデル（Ｒａｍ−１の標的化）で得られたこれらの結果は、他の型の標的化エンベロープ糖タンパク質に拡張できないこともある。したがってこれらの問題を解決するための代替となる方策を開発することが必須であると考えられた。更には、Ｎ末端挿入により生成する標的化エンベロープ糖タンパク質で得られる一般的知見は、支持エンベロープの天然結合ドメインが常に機能性であるということである。標的細胞が遺伝子治療におけるヒト細胞である範囲で、使用される支持糖タンパク質が、高等哺乳動物の細胞上の受容体を認識しないＭｏＭＬＶウイルスの同種指向性エンベロープであるため、天然結合ドメインのこの機能性は、感染の「バックグラウンドノイズ」の問題を提起しない。しかし、この認識においてスペーサーペプチドがどのような影響を及ぼすかを見るために、そして感染プロセスにおける２つの型の相互作用の相対的寄与を評価するために、２つの異なる表面分子を認識することができるこれらのキメラエンベロープ糖タンパク質を解析することは興味深いことに思われた。以下に記載される研究の主題を形成するこれらの観察により、最初に標的化糖タンパク質のＮ末端に挿入されたリガンドの間の特異的認識、次に天然レトロウイルス受容体により適正な細胞標的に特異的に結合したウイルスの侵入の促進を可能にする補助機構に関与する、２段階標的化の方策の開発に至った。天然結合ドメインと天然レトロウイルス受容体の間の直接相互作用に関連した感染のバックグラウンドノイズのいかなる問題をも回避するために、標的化部位と支持エンベロープ糖タンパク質の間に挿入され、ウイルス粒子が標的表面分子と相互作用しない限り天然結合ドメインをマスクすることができる、マスキング／非マスキングスペーサーペプチドをも開発した。この相互作用の実現は、天然結合ドメインの非マスキングを誘導し、そして天然結合ドメインと天然レトロウイルス受容体の間の相互作用（補助機構）を誘導し、次にウイルスの細胞中への導入に引き継ぐ。装置と方法：細胞系。細胞系ＴＥＬＣｅＢ６（７）は、ＴＥＬａｃＺ系（１９）から、トランスフェクション、及びＭｏＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス（Moloney Murine L eukemia Virus)）のｇａｇ及びｐｏｌタンパク質を発現する細胞のクローン選択により誘導する。ＴＥＬａｃＺ細胞は、核のβ−ガラクトシダーゼを形質導入することができるレトロウイルスベクターＭＦＧｎｌｓｌａｃＺを発現する。ＴＥＬＣｅＢ６細胞は、ｎｌｓＬａｃＺレトロウイルスマーカーベクターを輸送するレトロウイルスキャプシド（エンベロープを欠いているため、非感染性）の産生を可能にする。細胞Ａ４３１（ＡＴＣＣＣＲＬ１５５５）及びＴＥ６７１（ＡＴＣＣＣＲＬ８８０５）は、１０％ウシ胎児血清（ギブコ社(Gibco-BRL)）を補足したＤＭＥＭ培地（ギブコ社(Gibco-BRL)）中で培養する。細胞ＣＨＯ、ＣＥＲＤ９(９)、及びＣＥＡＲ１３（９）は、１０％ウシ胎児血清及びプロリン（ギブコ社(Gibco-BRL)）を補足したＤＭＥＭ培地（ギブコ社(Gibco-BRL)）中で培養する。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞系及びＮＩＨ−３Ｔ３誘導株は、１０％ウシ新生児血清（ギブコ社(Gibco-BRL)）を補足したＤＭＥＭ培地（ギブコ社 (Gibco-BRL)）中で培養する。キメラエンベロープ。ＥＧＦＲ（ＥＧＦ受容体）又はＲａｍ−１（ＭＬＶ−Ａ受容体）のいずれかを認識するポリペプチドをコードするＤＮＡ断片は、制限部位を含有するオリゴヌクレオチドを使用することによりＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）で作成した。これらのポリペプチドは、コドン＋６にＳｆｉＩ及びＮｏｔｌ制限部位を作成したＭＬＶのＳＵタンパク質（表面タンパク質ｇｐ７０）のＮ末端に導入した(３３)。本明細書で使用した種々のｅｎｖ遺伝子の概略図は図２に示す。簡単に述べると、ヒトＥＧＦ（３）の５３アミノ酸をコードする、ＰＣＲ増幅から誘導したＤＮＡ断片は、ｃＤＮＡマトリックス（ＡＴＣＣ５９９５７）及び２つのオリゴヌクレオチド：ＳｆｉＩ制限部位を伴うＯＵＥＧＦ：及びＮｏｔＩ部位を含有するＯＬＥＧＦ：を使用して作成した。ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩによる消化後、これらの断片を、キメラタンパク質ＥＭＯの場合にはＭｏＭＬＶのＳＵタンパク質、又はキメラタンパク質ＥＡでは４０７０ＡウイルスのＳＵをコードする遺伝子のいずれかに、クローン化した(６)。ＡＭＯ構築物（６）では、ＮｏｔＩ部位は、４０７０Ａエンベロープ（ＡＳ２０８と呼ばれる）中の受容体の認識ドメインの末端に作成し、(２)、そしてヌクレオチド（ｎｔ）７５０（１４）は、２つのオリゴヌクレオチド：ＸｈｏＩの上流８０５ＦＣ(５’＞ＴＣＣＡＡＴＴＣＣＴＴＣＣＡＡＧＧＧＧＣ)、及びＮｏｔＩ制限部位を含有する、に帰すべき、ＸｈｏＩ部位(ｎｔ５９４)から高プロリン領域の前のｎｔ７５０までから作成したＰＣＲ断片を使用して作成した。キメラエンベロープは、ｅｎｖ遺伝子４０７０ＡＭＬＶのＸｈｏＩ／ＣｌａＩ部位の間の、ｅｎｖＥＭＯ遺伝子（ＭｏＭＬＶのＳＵ及びＴＭ-Ｐ１５Ｅ膜貫通タンパク質をコードする）から単離した、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩＰＣＲ断片及びＮｏｔＩ／ＣｌａＩ断片のクローン化により構築する。得られる構築物をＢｇｌII／ＣｌａＩ断片（ＭｏＭＬＶの５４０８〜７６７６位に対応する）の形態で回収し、選択マーカー遺伝子（８）がＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）遺伝子のポリアデニル化配列に融合して、ＭＬＶ−Ｃ５７ウイルスのＬＴＲ３’の下流に導入されたＦＢＭＯＳＡＬＦ発現プラスミド（７）のＢａｍＨＩ及びＣｌａＩ部位にクローン化する。ＥＭＯ、ＥＡ、又はＡＭＯについては、ＮｏｔＩクローニング部位により供給された３つのアラニンからなるスペーサーペプチドにより、残りのＭＬＶエンベロープから新しい認識部位を分離した(１５)。３つの他のシリーズの標的化エンベロープ（エンベロープＥＭＯ、ＥＡ又はＡＭＯから誘導）では、スペーサーアミノ酸はＥＧＦＲ（ＥＧＦ）の認識ドメイン後、又は後述のようにＲａｍ−１（ＡＳ２０８）の認識ドメイン後のいずれかに導入した。Ｒａｍ−１を標的とする一連のエンベロープは、Ｒａｍ−１の認識ドメインとＭｏＭＬＶエンベロープの間に異なるスペーサーを導入することにより作成した (図３Ａ)。ＡＭＯＰＲＯについては、ＳＵ４０７０Ａに由来する高プロリンの５９アミノ酸領域（両種指向性）(ヌクレオチド７５１〜９２７)（１４）を使用した。これもエンベロープＭＬＶ４０７０Ａから単離したより短い高プロリン領域（ｎｔ７５１〜７８９）はＡＭＯΔＰＲＯに使用した。この領域は、ｅｎｖから誘導された領域と細胞遺伝子ｍｐｌの同等領域の間に位置する産物ｖ−ｍｐｌ（骨髄増殖性白血病のウイルスに由来する）(１８)の１３アミノ酸スペーサーに対応する。ＡＭＯ１の場合には、ＭＬＶ４０７０Ａのエンベロープから誘導された最初の２０８アミノ酸をＭｏＭＬＶのＳＵのアミノ酸１に融合した。ＡＭＯ１Ｆｘについては、血液凝固因子Ｘａの切断部位に対応する４アミノ酸部位（Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）（１２）をＲａｍ−１認識部位の後に挿入して、ＭｏＭＬＶのＳＵの＋１コドンに融合した。これらの構築物のために使用される方策は上述される。簡単に述べると、４０７０Ａのｅｎｖ遺伝子のＸｈｏＩ部位(ｎｔ５９４)の直ぐ上流に位置するオリゴヌクレオチド（５’−ＴＣＣＡＡＴＴＣＣＴＴＣＣＡＡＧＧＧＧＣ−３’）を、ＮｏｔＩ部位を有する下記の２つのオリゴヌクレオチド：の一方又は他方と組合せて使用して、ｅｎｖ４０７０Ａマトリックスを使用するＰＣＲにより、それぞれＡＭＯＰＲＯ及びＡＭＯΔＰＲＯエンベロープの３’断片を作成した。これらＰＣＲ断片をＸｈｏＩ及びＮｏｔＩによる消化に付して、ＡＭＯ型のエンベロープを発現するプラスミドである、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩで開いたＦＢＡＭＯＳＡＬＦプラスミドにクローン化した。エンベロープＡＭＯＦｘ、ＡＭＯ１及びＡＭＯ１Ｆｘを発現するプラスミドは、Ｘａ配列を含む（ＡＭＯ１Ｆｘ、ＡＭＯＦｘ）か又は含まない（ＡＭＯ１）、コドン１又はコドン６にＮｏｔＩ部位を作り出すために、修飾ＭｏＭＬＶエンベロープを発現する一連のプラスミド(１３)中にＲａｍ−１（認識部位）を含有するＦＢＡＭＯＳＡＬＦのＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ断片をクローン化することにより作成した。ＡＭＯから誘導し、他の型のスペーサーペプチドを含有するエンベロープを構築した。これら全てのスペーサーペプチドを図３Ａに示す。ＭＯＡＰＲＯ及びＭＯＡΔＰＲＯエンベロープは、ＡＭＯＰＲＯ及びＡＭＯΔ ＰＲＯエンベロープと同様な方法により作成した。ＥＡエンベロープを発現するＦＢＥＡＳＡＬＦプラスミドをＮｄｅＩ／ＮｏｔＩで開いた。このＤＮＡを使用して２つの断片をクローン化した：ＦＢＭＯＳＡＬＦプラスミド(同種指向性ＭＯエンベロープを発現する)の消化からの、ＬＴＲ５’及びレトロウイルスリーダー配列に加えてＭｏＭＬＶウイルスのｅｎｖ遺伝子のＮ末端（６５６５位）を含有する５’ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ断片(１７)。３’断片は、マトリックスとしてＭｏＭＬＶのｅｎｖ遺伝子、オリゴヌクレオチド５’として（５’−ＡＣＴＧＧＧＧＣＴＴＡＣＧＴＴＴＧＴ−３’）ＢａｍＨＩの上流、及びオリゴヌクレオチド３’として、それぞれＭＯＡＰＲＯ及びＭＯＡΔＰＲＯエンベロープを構築するため、を使用してＰＣＲにより作成した。これらのＰＣＲ断片をＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化し、５’断片で同時連結した。これら２つの構築物のスペーサーペプチドの配列は、図３Ｂに示す。ＥＭＯキメラエンベロープ（６）を発現するＦＢＥＭＯＳＡＬＦは、ＢａａＨ IIによる消化、クレノー酵素によるフィリング、そしてＮｄｅＩによる消化に付した。ＬＴＲ５’、リーダー配列、ｐｏｌ遺伝子の末端及びヒトＥＧＦを含有する生じた１．８Kbの断片を単離して、ＦＢＡＭＯΔＰＲＯＳＡＬＦ又はＦＢＡＭＯＰＲＯＳＡＬＦ（それぞれＡＭＯΔＰＲＯ及びＡＭＯＰＲＯキメラエンベロープを発現するプラスミド）のいずれかに挿入し、ここで、それぞれエンベロープＥＭＯΔＰＲＯ＋及びＥＭＯＰＲＯ＋を発現するプラスミドが生成するように、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ断片を削除し、ＥｃｏＲＩ部位を埋めた。エンベロープＥＭＯ１、ＥＭＯ１ＦＸを発現するプラスミドも作成した。これら２つの構築物のためのスペーサーペプチドの配列は、図３Ｃに示す。ＥＡＰＲＯ＋及びＥＡΔＰＲＯ＋エンベロープを発現するプラスミドは、ＦＢＥＡＳＡＬＦプラスミドのＳｆｉＩ／Ｎｏｔ断片を、ＥＭＯＰＲＯ＋及びＥＭＯ ΔＰＲＯ＋エンベロープを発現するプラスミドから得られたＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ断片で置換することにより作成した。最後にこれら種々のエンベロープＥＭＯΔＰＲＯ＋、ＥＭＯＰＲＯ＋、ＥＡＰＲＯ＋及びＥＡΔＰＲＯ＋について、スペーサーペプチドをＮ末端部分で短縮した。このために、ＤＮＡ断片は、マトリックスとしてＥＭＯ遺伝子、オリゴヌクレオチド５’として開始コドンに先行する（５’−ＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＧＧＡＣＡＴＧ−３’）(ＸｂａＩ部位の上流)、及びオリゴヌクレオチド３’ としてＢａｍＨＩ部位を含有する（５’−ＴＡＴＣＡＧＧＡＴＣＣＣＡＡＡＴＧＴＡＡＧＣＣＣＴＧＧＡＴＣＧＣＧＣＡＧＴＴＣＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＡＧＧＴＣＴＣＧＧＴＡＣＴＧＡＣ−３’）を使用するＰＣＲにより作成した。このＤＮＡをＸｂａＩ／ＢａｍＨＩで消化し、事前にＭＯＡＰＲＯ及びＭＯＡ ΔＰＲＯエンベロープを発現するプラスミドから得られたＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ断片で同時連結することによりＸｂａＩ／ＮｏｔＩ断片を除去後、ＥＭＯＰＲＯ＋又はＥＭＯΔＰＲＯ＋エンベロープを発現するプラスミドの一方又は他方にクローン化した。これにより、それぞれＥＭＯＰＲＯβ及びＥＭＯΔＰＲＯβエンベロープを発現することができる２つのプラスミドを得るが(図３Ｃ)、ここで、ＥＧＦは、高プロリン領域の前のＭｏＭＬＶウイルスのエンベロープのＢａｍＨＩ部位の直ぐ上流（ｎｔ６３５７）に融合しており(１７)、潜在的ｂシートはそのまま残されている。これら最後の２つの構築物から得られるＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ断片の一方又は他方を次に、前もってＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ断片の除去後、ＦＢＥＡＳＡＬＦプラスミド中に導入した；これにより、それぞれＥＡＰＲＯβ及びＥＡΔＰＲＯβエンベロープを発現することができる２つのプラスミドが得られる(図３Ｃ)。別の構築物シリーズ（ＥＭＯＰＲＯ、ＥＭＯΔＰＲＯ、ＥＡＰＲＯ、ＥＡΔＰＲＯ）では、潜在的βシートを除去して、ＥＧＦは高プロリン領域のレベルで直接融合した(図３Ｃ)。ウイルスの産生エンベロープを発現するプラスミドは、ＴｅＬＣｅＢ６細胞系にリン酸カルシウム沈殿法（１６）によりトランスフェクションした。細胞は、フレオマイシン（５０mg/ml）による選択に付し、次に耐性クローンをバルクでトリプシン処理した。これらのコンフルエンス細胞を使用して、ＦＣＳ（１０％）の存在下でＤＭＥＭ培地中で一晩インキュベーション後、ウイルスの上清を回収した。これらの上清を、ウェスタンブロット、結合試験及び感染試験での分析のための試料を得る目的で超遠心分離に付す。免疫ブロット。ウイルス産生細胞は、トリトンＸ１００１％、ＳＤＳ０．０５％、デオキシコール酸５mg/ml、ＮａＣｌ１５０mM及びＰＭＳＦ１mMを含有するトリス−ＨＣｌ２０mM（pH７．５）の緩衝液中で４℃で１０分間溶解させる。１０，０００ｇで１０分間遠心分離後、細胞核の沈殿のため、分析時まで上清を−７０℃で凍結する。これらのウイルス試料は、ＳＷ４１ベックマン(Beckman)ローター（３０，０００rpm、４℃で１時間）中でウイルス上清（１０ml）を超遠心分離することにより得る。沈殿物はＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）１００mlに再懸濁して、−７０℃で凍結する。試料（細胞溶解物３０ｍｇ又は精製ウイルス１０ml）は、ＳＤＳ６％、ｂ− メルカプトエタノール３０％、グリセロール１０％及びブロモフェノールブルー０．０６％を含有する３７５mMトリス−ＨＣｌ（pH６．８）の緩衝液と５：１の比で混合し、次に３分間煮沸し、アクリルアミド１０％／ＳＤＳゲルで分析する。ニトロセルロース膜にタンパク質を移行後、免疫学的マーキングをスキムミルク５％及びトゥイーン０．１％の存在下でＴＢＳ(トリス塩基生理食塩水、pH７．４)中で行う。ＲＬＶ（ラウシャー白血病ウイルス）のｇｐ７０−ＳＵ又はＲＬＶのｐ３０に対する、ヤギ抗血清から得られた抗体(クオリティーバイオテク社(Quality Biotech Inc.)、米国)を、それぞれ１：１,０００又は１／１０,０００の希釈で使用した。ブロットは、ヤギ免疫グロブリンに対するウサギ由来の結合抗体（ダコ(DAKO)、英国）を使用して、電気化学発光キット（アマーシャムライフサイエンス(Amersham Life Science)）を用いて展開させた。結合試験。標的細胞をＰＢＳで洗浄して、ＰＢＳ中のバーゼン液（Versene）０．０２％による３７℃で１０分間のインキュベーションにより分離した。これらの細胞をＰＢＡ（２％ＦＣＳ及びアジ化ナトリウム０．１％を含有するＰＢＳ）で洗浄する。次に１０⁶個の細胞をウイルスの存在下で、ＥＭＯエンベロープシリーズでは４℃で３０分間、又はＡＭＯエンベロープシリーズでは３７℃で４５分間インキュベートする。ＰＢＡで洗浄後、細胞を８３Ａ２５モノクローナル抗体（Evan sら，1990）の存在下で４℃で３０分間インキュベートする。ＰＢＡで２回洗浄後、細胞をＦＩＴＣと結合した結合抗ラット抗体（ダコ(Dako)；英国）の存在下で４℃で３０分間インキュベートする。ＰＢＡ中で２回の最終洗浄の５分前に、細胞をヨウ化プロピジウム（２０mg/ml）でカウンター染色した。生存細胞の蛍光をＦＡＣＳ（ＦＡＣＳカリバー(FACScalibur)、ベクトンディッキンソン(Beck ton Dickinson)で分析する。感染試験。標的細胞を２４ウェル培養プレートに３．１０⁴細胞／ウェルの密度で接種する。ポリブレンを４mg/mlで含有するウイルス上清の種々の希釈液を細胞に３７℃で３〜５時間加える。次に上清を新鮮培地で置換して、細胞を３７℃で２４〜４８時間インキュベートする。次にＸ−ｇａｌ染色を以前に報告されたように行う(４)。ウイルス価は、コロニー数／ml（ｌａｃＺ i.u./ml）で以前に報告されたように概算する(５)。ＥＧＦＲをブロックするために、標的細胞を、ヒト組換えＥＧＦ（２３６−ＥＧ、Ｒ＆Ｄシステムズ、英国）１０^-6Mを含有する培地中で３７℃で３０分間インキュベートする。次に細胞を洗浄し、以前に報告されたように感染を行う。エンドソームの酸性化をブロックするために、リン酸クロロキン(シグマ(Sigma)、英国)１００mMを培地に加える。感染の６時間後、細胞を洗浄して通常の培地中でインキュベートする。結果と考察。変異体エンベロープの構築。レトロウイルス受容体Ｒａｍ−１(１１)、(２２)、又はＥＧＦ受容体のいずれかを認識することができる２つのシリーズの修飾エンベロープを作成した。Ｒａｍ−１を標的とする第１のエンベロープのＡＭＯは、ＭｏＭＬＶのエンベロープのＮ末端（コドン７との融合による）に、Ｒａｍ−１を認識（ＡＳ２０８、図３Ａ）し、ＭＬＶ−ＡのＳＵの最初の２０８アミノ酸に対応するポリペプチド（１）を挿入することにより構築した。ＥＧＦをコードする配列を、ＭｏＭＬＶのＳＵの＋６位のＭＬＶのｅｎｖ遺伝子に挿入した(図２)。既に、この挿入部位が、ビリオンの表面上で一本鎖抗体断片の発現を可能にすることは証明されている( １５)。キメラエンベロープＥＭＯの場合には(図２)、ヒトＥＧＦをＭｏＭＬＶのエンベロープに同じ位置で挿入し、一方エンベロープＥＡでは、挿入はＭＬＶの両種指向性エンベロープに＋５位で行った。ＡＭＯ、ＥＭＯ及びＥＡエンベロープについて、新規な結合ドメインを３つのアラニンに対応するスペーサーペプチドにより、レトロウイルス受容体の認識ドメインから分離した。次にＲａｍ−１を標的とするか、又はＥＧＦＲを標的とする、２つの型の親エンベロープについては、異なるサイズと構造のスペーサーの挿入により種々の構築物を作成した。これら異なるスペーサーのタンパク質配列は、Ｒａｍ−１を標的とするエンベロープの場合は図３Ａに、そしてＥＧＦＲを標的とするエンベロープでは図３Ｃに示す同種指向性（ＭＯ）及び両種指向性（Ａ）対照エンベロープを含む種々のエンベロープを発現するプラスミドを、ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子、更にはレトロウイルスベクターｎｌｓＬａｃＺ（７）によりコードされるタンパク質を発現する細胞系ＴＥＬＣｅＢ６中にトランスフェクションした。ビリオン中のエンベロープの発現及び組込み。対応する細胞のタンパク質分解物を、ほとんどのＡＭＯシリーズのエンベロープ（他のキメラエンベロープについては示していない）ではＭＬＶのＳＵに対する抗体（図５）により、エンベロープの発現について分析した。全てのキメラエンベロープについて、エンベロープの前駆体及び成熟形態ＳＵは、予想した大きさで、及び野生型エンベロープと同様なレベルで検出することができたが、このことは、これらキメラエンベロープが正常に産生され、かつ成熟したことを示唆している。細胞表面上での発現は、ＳＵに対する抗体を使用するか、又は抗ＥＧＦモノクローナル抗体を使用して、ＦＡＣＳ中での産生細胞の分析により測定した。種々のエンベロープによりトランスフェクションされた細胞は、抗ＳＵ抗体によりマークすることができる(示していない)。ＥＧＦエンベロープ融合エンベロープを発現する細胞のみ、抗ＥＧＦモノクローナル抗体によりマークすることができる (図４)。このことは、細胞表面上でのキメラエンベロープの発現及びキメラ糖タンパク質上でのＥＧＦの正しい折り畳みを証明する。レトロウイルス粒子へのキメラエンベロープの組込みを証明するために、種々のエンベロープでトランスフェクションしたＴＥＬＣｅＢ６細胞系の上清を超遠心分離に付して、ウイルス粒子の沈殿物を回収した。これらの沈殿物は、ｇａｇ遺伝子の産物（ＣＡｐ３０）及びエンベロープタンパク質の発現に関して免疫ブロットにより分析した(ＡＭＯシリーズのほとんどのエンベロープについては図５、他のキメラエンベロープについては示していない)。種々のキメラエンベロープの間でウイルス組み込みの効率を比較する目的で、同一量のウイルス粒子（抗ＣＡｐ３０抗体によりｇａｇタンパク質をマークすることにより測定）をゲルに沈殿させた。ＳＵタンパク質は、全ての変異体で、予想された大きさであるが、野生型エンベロープで観察されたよりもわずかに少ない割合で検出することができた。ＡＭＯＧ２Ｘ及びＡＭＯＧ３Ｘエンベロープの場合だけは、組込みの効率は、野生型エンベロープに比較してかなり低い。予想されるように、種々のエンベロープによりトランスフェクションしたＴＥＬａｃＺ上清からの沈殿物（ｇａｇ及びｐｏｌタンパク質を発現しない）ではエンベロープの発現は観察されなかった。これらの結果は、キメラＳＵタンパク質がレトロウイルス粒子と結合していることを示す。受容体へのエンベロープの結合受容体Ｒａｍ−１及び／又はＥＧＦの受容体を発現するヒト細胞を本試験に使用した。これらの細胞をウイルス調製物の存在下でインキュベートし、ＳＵに対する抗体によりＦＡＣＳで分析することにより、標的受容体へのウイルスエンベロープの結合を測定する(図６Ｂ)。予想されるように、種々のヒト細胞上でＭＯ同種指向性エンベロープを発現するウイルスの場合には結合は観察されない（示していない）が、一方Ｒａｍ−１を標的とするキメラエンベロープを有するウイルスは、未修飾両種指向性エンベロープを発現するウイルスで観察されるのと同様な効率でＴＥ６７１細胞に結合することができる。ＡＭＯから誘導したＲａｍ −１を標的とする全てのエンベロープは、同様な効率でＴＥ６７１細胞に結合することができる。この結合は、ＡＳ２０８断片（Ｒａｍ−１の精製認識ドメイン）による競合後に阻害することができる（２）が、このことは、この認識が特異的であることを示唆している(結果は提供していない)。ＥＧＦＲを標的とするエンベロープ（ＥＭＯシリーズ）は更にＡ４３１細胞にＥＧＦＲエクスプレッサー上で結合することができる(図６Ａ)。ＥＧＦ（ＥＧＦＲのエンドサイトーシスを誘導する）の存在下でのＡ４３１細胞のプレインキュベーションがこの結合を阻害する（示していない）ため、この結合は特異的であると考えられる。感染におけるＲａｍ−１とＲｅｃ−１の協力。種々の標的化エンベロープにより偽型化されたレトロウイルスベクターの形質導入は、異なる型の受容体を発現する細胞上で測定した：ＥＧＦ及びＲａｍ−１受容体を発現するヒト細胞ＴＥ６７１；マウスＥＧＦ、Ｒｅｃ−１及びＲａｍ−１受容体を発現する３Ｔ３細胞；Ｒｅｃ−１及びＲａｍ−１を発現するＣＥＡＲ１３細胞；Ｒｅｃ−１のみを発現するＣＥＲＤ９細胞。力価測定は、以前に報告されたように行った(６)。予想されるように、ＭＯ同種指向性エンベロープにより偽型化されたウイルスはＴＥ６７１細胞に感染することができなかったが、マウス細胞３Ｔ３、ＣＥＡＲ１３及びＣｅｒｄ９の感染は可能であった(１０⁷ｌａｃＺ i.u./mlのオーダーの力価で)。逆に、両種指向性Ａエンベロープを有するウイルスは、マウス細胞３Ｔ３、ＣＥＡＲ１３及びＴＥ６７１に感染することができる(１０⁷ｌａｃＺ i.u./mlのオーダーの力価で)。キメラＡＭＯエンベロープを有するウイルスは、４．１０³ｌａｃＺ i.u./ml の力価でＴＥ６７１細胞に感染することができる(表１)。比較において、受容体への結合の同様な効率にも関わらず(図６Ｂ)、野生型エンベロープで得られた力価は１０，０００倍高い。驚くべきことに、ＡＭＯＰＲＯエンベロープを発現するウイルスは、結合の良好な効率にも関わらず、ヒト細胞ＴＥ６７１に感染することができないことが判った。ＡＭＯエンベロープで得られた力価と比較すると (表１)、ＡＭＯシリーズのエンベロープに挿入された他の型のスペーサーは、３０倍（ＡＭＯＤＰＲＯ）〜１００倍以上（ＡＭＯ１Ｆｘ）の力価の上昇をもたらし、これにより、４．１０⁵ｌａｃＺ i.u./mlの力価に達することも可能にする。これらの感染は、標的となった受容体Ｒａｍ−１を介して起こることが示された。これは、ＭＬＶ−Ａウイルスで慢性的に感染させた標的細胞における干渉試験により証明した。これらの細胞は、Ｒａｍ−１を標的とするエンベロープを有するウイルスによる感染に特異的に無反応性になる(結果は示していない)。Ｒａｍ−１に結合するための部位が種々のスペーサーによりＭｏＭＬＶのＳＵから分離したキメラエンベロープを有するウイルスは、３Ｔ３細胞に非常に感染性であることが判明した。ＡＭＯエンベロープで得られた力価と比較して、ウイルス価の２００倍（ＡＭＯＰＲＯ）〜１，０００倍以上（ＡＭＯ１Ｆｘ）の増加を測定した(表１)。３Ｔ３の感染は、Ｒｅｃ−１又はＲａｍ−１を介して起こる(表１)。これは、ＭＬＶ−Ａ（Ｒａｍ−１をブロックする）又はＭｏＭＬＶ（Ｒｅｃ−１をブロックする）のいずれかにより慢性的に感染させた３Ｔ３細胞で行った干渉試験により証明することができる。ＡＭＯエンベロープを発現するウイルスは、Ｒｅｃ− １とＲａｍ−１受容体の一方若しくは他方、又は両方が標的細胞上で利用可能であるかどうかに依存して、無差別に３Ｔ３に感染することができると考えられる。これらＡＭＯウイルスと比較して、Ｒａｍ−１を標的とすることができる他のエンベロープを含有するウイルス粒子は、２つの受容体のうち１つしか利用可能でないときに３Ｔ３に感染することはほとんどできない。例えば、ＡＭＯＦｘエンベロープを含有する１００粒子（無傷の３Ｔ３で測定した力価による）を使用して干渉する３Ｔ３に感染させるとき、４つのウイルスは、Ｒｅｃ−１が利用可能でさえあれば細胞に感染することができ、そして２つのウイルスは、Ｒａｍ− １が利用可能でさえあれば細胞に感染することができる。このことは、両方の受容体が利用可能であるときと比較して一方しか利用可能でないとき、感染性がかなり消失することを示す（９４％以上のウイルスが感染性でない）。このことはまた、２つの受容体Ｒａｍ−１及びＲｅｃ−１が協力して３Ｔ３に感染することを示唆している。この協力の現象は、ＡＭＯＰＲＯエンベロープを有するウイルスの場合には更に顕著であると思われる。これら最後に言及したウイルスは、Ｒｅｃ−１のみが利用可能であるとき３Ｔ３に感染するのは困難であり、Ｒａｍ− １のみが利用可能であるときにはまったく感染することができない。しかし、Ｒｅｃ−１とＲａｍ−１の両方が利用可能であるとき、感染は可能であり、６×１０⁴ｌａｃＺ i.u./mlのオーダーの力価を得ることができる(表１)。この協力作用をよりよく解析するために、Ｒｅｃ−１のみ(Ｃｅｒｄ９細胞)、若しくはＲｅｃ−１とＲａｍ−１（Ｃｅａｒ１３細胞）のいずれかを発現するように改変した、ＣＨＯ細胞(天然にはＲａｍ−１及びＲｅｃ−１受容体を欠いている)、又はＲａｍ−１のみを発現するＴＥ６７１細胞を標的として使用して感染試験を行った。更に、ＡＭＯエンベロープから誘導された他のエンベロープを作成した。これらのエンベロープは、Ｒａｍ−１を標的とする部位の後に他の型のスペーサーペプチド(図３Ａを参照のこと)、特にフレキシブルスペーサーを有する。典型的実験の結果は表２に示す。各エンベロープについて、協力性指数を、１つの受容体だけを発現する細胞型で得られた力価の、両方の型の受容体を発現する細胞型で得られた力価に対する比として計算した。したがって１という指数は、受容体が１つだけか両方であるかに関わらず、力価が同じであることを示す。これは、明らかに同種指向性又は両種指向性の野生型エンベロープによる場合である。１未満の指数は、単一受容体が発現されるとき、両方が発現されるときに比べて力価がさほど良好でなく、そして感染を促進するのに両方の受容体が必要であることを示す。この指数が低いほど、２つの受容体の必要性が高まる。表１に示唆されるように、元々のＡＭＯエンベロープを含むビリオンの感染性は、単一型の受容体があるか、又は両方の型があるかに影響されない(表２)。実際、この指数が１を超えることもあり、これは、おそらく２つの結合ドメインが相互に妨げるため、２つの受容体の同時存在が感染プロセスを阻害することを示唆している。ＡＭＯ１Ｆｘエンベロープを含むウイルスでは、ＡＭＯビリオンと比較して、Ｒａｍ−１のみを発現するＴＥ６７１細胞で感染性が少なくとも１００倍良好であるとしても情況は異なっている。Ｒａｍ−１を介する感染性の増大は、２つの結合ドメインを分離するスペーサーペプチドのサイズの増大により説明することができる：ＡＳ２０８部位は、糖タンパク質の残りに関して立体障害を少なくすることが可能であり、そしてこれらのエンベロープは更に容易に遺伝子融合プロセスを誘導することができる。更には、Ｒｅｃ−１のみを発現するＣｅｒｄ９細胞は、ＡＭＯ１Ｆｘビリオンにより比較的容易に感染する。しかし、表１の結果により、２つの受容体の一方のみ又は他方のみが存在するときに比較して、両方の分子Ｒａｍ−１及びＲｅｃ−１が同時発現するときには１０倍感染が促進される(約０．１の指数)。「フレキシブル」スペーサーを含むエンベロープ（ＡＭＯＧ１Ｆｘ、ＡＭＯＧ２、ＡＭＯＧ２Ｆｘ及びＡＭＯＧ３）は、単独で発現されるＲｅｃ−１を介する感染に関してはＡＭＯ１Ｆｘエンベロープと同様の挙動を示すと考えられる。しかし、単独で発現されるＲａｍ−１による感染性（ＲａｍＩＤ）は、スペーサーの長さの関数として低下する傾向にある。これはおそらく、ＡＳ２０８ドメインと融合ドメインの間の距離の増大による、Ｒａｍ −１での結合後の遺伝子融合シグナルの伝達の低下を反映する。そのうえこれらのエンベロープでは、２つの受容体が同一細胞の表面上で同時発現されると感染には好都合である。ＡＭＯ１Ｆｘエンベロープについては、対称ではないが(ＲａｍＩＤは同様、しかしＲｅｃＩＤは非常に異なる)、ＡＭＯΔＰＲＯエンベロープを含有するビリオンは、Ｒａｍ−１が単独で発現されるとき細胞に効率よく感染することができる。そのうえこのエンベロープについては、Ｒｅｃ−１も細胞表面上に存在するとき感染性は約１０倍上昇する。この差は、単にＡＭＯΔＰＲＯビリオンが感染にＲｅｃ−１を優先的に利用するという事実によるものではない。実際、Ｒｅｃ−１単独が利用可能である細胞の感染は、Ｒａｍ−１とＲｅｃ−１が同時発現するときに比べて、極めてわずかである（表１）か又は検出不可能（表２）でさえある。ＲｅｃＩＤ指数は、１０^-5未満である(表２)。このことはまた、２つの受容体が協同して感染できることを証明する。これらの結果はまた、同種指向性受容体Ｒｅｃ−１への結合のドメインは、ＡＭＯΔＰＲＯエンベロープがウイルス粒子で発現するとき接近できず、これらのビリオンが事前にＲａｍ−１と相互作用する場合にのみ接近しやすくなることを示唆している。また、Ｒａｍ−１との結合により、感染プロセスの促進のため、Ｒｅｃ−１への結合のドメインが非マスキングされ利用されることをも示唆することができる。このマスキング／非マスキングは、アロステリック型の機構により起こる可能性があり、このため、Ｒａｍ−１／ＡＳ２０８相互作用により誘導され、スペーサーペプチドに関係する、キメラ糖タンパク質のコンホメーションの変化を引き起こす。この機構は、スペーサーペプチドのアミノ酸組成に強く依存するようである。同等なサイズで、ＡＭＯΔＰＲＯビリオンを、フレキシブルスペーサ−ＡＭＯ１Ｆｘ、ＡＭＯＧ１Ｆｘ及びＡＭＯＧ２を含むエンベロープを含有するビリオンと比較すると、ＲｅｃＩＤに少なくとも１０００倍の差がある。ΔＰＲＯペプチドは、おそらくII 型ポリプロリンらせんに配置された５つのプロリンを含有するが、一方ＡＭＯＧ１Ｆｘ及びＡＭＯＧ２エンベロープは本質的にグリシンを含有する。ＡＭＯΔＰＲＯビリオンと同様に、ＡＭＯＰＲＯエンベロープを含有するビリオンは、細胞に感染するための２つの型の受容体の同時存在を必要とする。しかし２つの受容体を同時発現する細胞型の感染価は、これらのエンベロープの組込みの少なさがこの結果の原因であるという仮説を排除することはできないが、ＡＭＯΔＰＲＯビリオンで観察される感染価よりも低い。ＡＭＯΔＰＲＯよりも更に際だって、ＡＭＯＰＲＯウイルスは、２つの受容体のいずれか１つが単独で発現されるとき細胞に感染することができない(表２)。２つの指数ＲａｍＩＤ及びＲｅｃＩＤは、実際に１０^-5未満である。これらの結果は、１）単独で発現されるとき、Ｒａｍ−１とのＡＭＯＰＲＯビリオンの相互作用は、遺伝子融合を可能にする糖タンパク質のコンホメーションの変化を引き起こすのに充分ではない。更に、ＰＲＯスペーサーペプチドは、堅すぎるか、又は長すぎてこのような変化に適さないこともあり、２）Ｒｅｃ−１との結合のドメインは、ＡＭＯＰＲＯビリオンがＲａｍ−１と相互作用しない限り、Ｒｅｃ−１と相互作用のため、及び侵入プロセスに引き継ぐために接近しにくい、ことを示唆する。標的化部位の下流に位置する結合ドメインのマスキングが、ＰＲＯスペーサーペプチドに結合したＡＳ２０８ペプチドの独自の性質であるかどうかを更に識別することを目的として、逆向きの構築を行った。ＭＯＡＰＲＯエンベロープは、同種指向性エンベロープの結合ドメイン、次にこの同じエンベロープの高プロリン領域を含有し、全体が両種指向性エンベロープのＮ末端に融合している(図２) 。表２に示される結果は、ＡＭＯＰＲＯエンベロープを含有するビリオンと同様に、ＭＯＡＰＲＯビリオンは、受容体Ｒｅｃ−１又はＲａｍ−１のいずれか一方のみを発現する細胞に感染するのは困難を伴うか、又は全然感染できないことを示す。ＭＯＡＰＲＯエンベロープ中のＲａｍ−１ドメインでは、ＡＭＯＰＲＯエンベロープ中におけるＲｅｃ−１ドメイン（ＲｅｃＩＤ５．６×１０^-4未満）よりも更に接近しにくい（ＲａｍＩＤ７×１０^-5未満）とさえ考えられる。ＭＯＡＰＲＯエンベロープは、２つの型の受容体を発現する細胞には１０⁵ｌａｃＺ i.u./mlのオーダーの力価で効率的に感染できるが、このことは、このエンベロープではそのうえ、２つの受容体の存在が相乗的に感染プロセスを行うことを示唆する。これらの結果をまとめると、標的化ドメインと残りのレトロウイルスエンベロープの間に挿入されたスペーサーペプチドが、該ペプチドの下流に位置するドメインの接近しやすさ及び融合の活性化を制御することを示唆している。この制御は、ペプチド自体に依存し、その長さ及びその生化学的組成によって影響を受ける。公式化される仮説は、ＰＲＯスペーサーペプチドが、最終的に、未修飾糖タンパク質中の受容体に対する結合ドメインと融合ドメインの間に位置する、問題の高プロリン領域と同じ役割を果たすということである。この役割は、ドメイン下流（野生型エンベロープの融合ドメイン又はキメラエンベロープの結合ドメイン）のマスキングであり、続いてその受容体とのドメイン上流の相互作用のための非マスキングである。野生型エンベロープの場合には、この非マスキングにより、融合が活性化するが、一方キメラエンベロープの場合には、非マスキングによりウイルス受容体に結合ドメインが接近しやすくなる。受容体が細胞表面で発現するならば、相互作用が起こりえ、これが次に融合ドメインの活性化を引き起こすが、これによって、なぜ２つの受容体の同時存在が感染を相乗的に起こすのかを説明できる。これらの結果により、そのために標的化エンベロープを種々のドメインで構築し、その機能が、高プロリン配列を含有する特異的なスペーサーペプチドにより活性化及び調整される、２段階標的化方策を提案することができる。Ｎ末端からＣ末端まで、標的組織又は標的細胞に特異的に発現する細胞表面分子を認識することができる「標的化」ドメイン（例えば、一本鎖抗体又は表面受容体に対するリガンド）を含む、これらのキメラエンベロープ糖タンパク質は、以下のように理解することができる：補助領域（これは、活性化されると次にウイルスの侵入を促進することができる）をマスクできるスペーサーペプチド。このような補助ドメインは、レトロウイルスエンベロープ全体、即ち、遍在するレトロウイルス受容体との相互作用によりウイルス感染に介在し、これを引き継ぐことのできる構造であることができ、したがってこれは標的表面分子と同時発現する見込みが非常に強い。理想的には、補助ドメインは、ウイルス粒子が標的表面分子と特異的に相互作用するまでマスクされている必要がある。例えば、ＡＭＯＰＲＯ及びＡＭＯΔＰＲＯエンベロープの場合に、標的表面分子は、Ｒａｍ−１であるが、一方補助ドメインは、同種指向性エンベロープである。感染におけるＥＧＦＲとＲｅｃ−１の協力。ＰＲＯ及びΔＰＲＯスペーサーペプチドが、別の型の標的化エンベロープの場合のマスキング／非マスキング機構に介在できるかどうかを証明するために、ＥＧＦ受容体により別の２段階標的化モデルを検討した。Ｒａｍ−１の標的化で得られた結果により、マスキング／非マスキングスペーサーペプチドのＣ末端を提案することができた。しかし、そのＮ末端は正確には定義できなかった。このため、まず第１に、ＥＭＯＰＲＯ＋及びＥＭＯΔＰＲＯ＋エンベロープを構築した（図３Ｂ）(ここで、ＰＲＯ及びΔＰＲＯスペーサーペプチドは更に、Ｎ末端に、両種指向性エンベロープから誘導し、高プロリン領域の直ぐ上流に位置する、４１アミノ酸を含有する)。ＥＭＯＰＲＯ＋及びＥＭＯΔＰＲＯ＋エンベロープでは、標的化ドメインは、ＥＧＦであるが、補助ドメインは、同種指向性エンベロープである。これら２つのエンベロープを、スペーサーペプチドを含有しないＥＭＯエンベロープと比較した(図２及び２Ｂ)。感染試験は、Ｒｅｃ−１単独を発現する細胞（Ｃｅｒｄ９細胞）又はＲｅｃ− １とＥＧＦＲを同時発現する細胞（３Ｔ３細胞）で行った。典型的な実験の結果は、表３に示す。ＡＭＯエンベロープで得られた結果から予想されるように、ＥＭＯエンベロープを含有するウイルスは、Ｃｅｒｄ９及び３Ｔ３細胞に効率的に感染することができるが、このことは、これらのエンベロープのＲｅｃ−１に対する結合ドメインがマスクされていないことを示す。ＥＭＯウイルスと比較して、ＥＭＯＰＲＯ＋及びＥＭＯΔＰＲＯ＋エンベロープを含有するウイルス粒子が、Ｃｅｒｄ９細胞に感染するのは困難である(ＥＭＯウイルスよりも１，０００〜１０，０００倍の間で感染が少ない)。しかし、Ｒｅｃ−１及びＥＧＦＲが同時発現すると、これがＥＭＯビリオンの力価に影響しない場合でさえ、ＥＭＯＰＲＯ＋及びＥＭＯΔＰＲＯエンベロープを含有するウイルス粒子は、Ｒｅｃ−１が単独で発現されるときに比較して、それぞれ２０及び６０倍感染性が高くなる。ＡＭＯＰＲＯ及びＡＭＯΔＰＲＯエンベロープで得られた結果に関連して、マスキングは明らかにあまり奏功せず、このためＣｅｒｄ９細胞への無視できない感染性をもたらす。これはおそらく、ＰＲＯ＋及びΔＰＲＯ＋スペーサーペプチドが、その機能について最適化されていないという事実が原因であるが、またおそらくＣｅｒｄ９細胞がＥＭＯＰＲＯ＋及びＥＭＯΔＰＲＯ＋エンベロープの活性化に寄与するＥＧＦ受容体を少数だけ発現するという事実にも原因がある。表１干渉試験においてRam-1を標的とするエンベロープを含むウイルスで得られた力価（lacZ i.u./ml） a:3T3で得られた力価に対して100の値を示す計算パーセント。 b:MLV-A（3T3-MLV-A）又はMoMLV（3T3-MoMLV）で慢性的に感染された3T3での感染。 c:問題の細胞の表面で利用可能な受容体。表２ Ram-1を標的とするエンベロープを含有するウイルスで得られた力価（lacZ i.u./ml）表３ EGFRを標的とするエンベロープを含有するウイルスで得られた力価(lacZ i.u./ml) 実施例２Ｒｅｃ−１とＲａｍ−１受容体の間の協力、及び受容体のこの協力を調節することができるペプチドを解析することを目的として、新しいシリーズのＡＭＯ型キメラエンベロープ糖タンパク質（前実施例を参照のこと）を構築した： − ＡＭＯＰＲＯ及びＡＭＯＤＰＲＯエンベロープにより得られる感染が、Ｒｅｃ−１との相互作用により第２段階に進むかどうかを証明するために、Ｒｅｃ −１との結合ドメインを、ＡＭＯＰＲＯ及びＡＭＯＤＰＲＯエンベロープ内、及び感染のために受容体の協力を必要としないＡＭＯＧ１Ｘ対照エンベロープ内の点突然変異（Ｄ８４Ｋ突然変異）（MacKrellら，J.Virology，70:1768-1774(199 6)）により不活化した(Valsesia-Wittmannら，The EMBO Journal 16:1214-1223( 1997))。 − 協力ペプチドについてII型ポリプロリンらせん構造の役割を証明するために、エンベロープＡＭＯＥＬ３とＡＭＯＥＬ５を構築した。これらのエンベロープは、文献に解析されているように、II型ポリプロリンらせんのそれぞれ３つ及び５つの折り返しを有する(Urry，Journal of Protein Chemistry 7:1-34(1988) )。これらのキメラエンベロープによりレトロウイルスを作成し、Ｒｅｃ−１単独、若しくはＲａｍ−１単独、又はＲａｍ−１とＲｅｃ−１の２つの分子を発現する細胞を感染させてレトロウイルスを解析した。材料と方法。オリゴヌクレオチドｅｌａｓｔ３Ｕ：を一緒にハイブリダイズした。得られるビカテナリーＤＮＡ断片を、ＥａｅＩ制限酵素で消化し、ＮｏｔＩで前もって開いておいたＦＢＡＭＯＳＡＬＦ発現プラスミドにクローン化した。ペプチドＥＬ３（このペプチド配列は表４に示す）を含有するプラスミドＦＢＡＭＯＥＬ３ＳＡＬＦ（図３０の遺伝子ｅｎｖＡＭＯＥＬ３の配列を参照のこと）が生じた(図３１のヌクレオチド配列を参照のこと)。オリゴヌクレオチドＵｐＥｌ５：を一緒にハイブリダイズした。得られるビカテナリーＤＮＡ断片を、ＥｃｏＮＩ制限酵素で消化し、ＥｃｏＮＩで前もって開いておいたＦＢＡＭＯＥＬ３ＳＡＬＦ発現プラスミドにクローン化した。ペプチドＥＬ５(このペプチド配列は表４に示す)を含有するプラスミドＦＢＡＭＯＥＬ５ＳＡＬＦ（図３２の遺伝子ｅｎｖＡＭＯＥＬ５の配列を参照のこと）が生じた(図３３のヌクレオチド配列を参照のこと)。オリゴヌクレオチドＤＥＬＡＳＴＩＮ３−ＶＵｐｐｅｒ：を一緒にハイブリダイズした。得られるビカテナリーＤＮＡ断片を、ＥａｅＩ制限酵素で消化し、ＮｏｔＩで前もって開いておいたＦＢＡＭＯＳＡＬＦ発現プラスミドにクローン化した。ＥＬ３-Ｖペプチド（このペプチド配列は表４に示す）を含有するプラスミドＦＢＡＭＯＥＬ３−ＶＳＡＬＦ（図３４の遺伝子ＡＭＯＥＬ３−Ｖの配列を参照のこと）が生じた(図３５のヌクレオチド配列を参照のこと)。オリゴヌクレオチドＤＥＬＡＳＴＩＮ３−ＩＵｐｐｅｒ：を一緒にハイブリダイズした。得られるビカテナリーＤＮＡ断片を、ＥａｅＩ制限酵素で消化し、ＮｏｔＩで前もって開いておいたＦＢＡＭＯＳＡＬＦ発現プラスミドにクローン化した。これにより、ペプチドＥＬ３-Ｉ（このペプチド配列は表４に示す）を含有するプラスミドＦＢＡＭＯＥＬ３−ＩＳＡＬＦが生じた。オリゴヌクレオチドＵｐＸｈｏＤ８４Ｋ：を合成した。オリゴヌクレオチド８０５ＦＣとＬＭＯＡＤｅｌｔａＰＲＯ３（前記配列を参照のこと）から出発して、ＦＢＡＭＯＳＡＬＦマトリックスから出発する２つのＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のために、８Ｏ５ＦＣ／ＬｏＸｈｏＤ８４Ｋ又はＵｐＸｈｏＤ８４Ｋ／ＬＭＯＡＤｅｌｔａＰＲＯ３の対を独立に使用した。これら２つのＤＮＡを酵素ＮｏｔＩ／ＸｈｏＩ及びＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩでそれぞれ消化し、前もってＮｏｔＩとＢａｍＨＩで開いておいた３つのプラスミドＦＢＡＭＯＳＡＬＦ、ＦＢＡＭＯＤｅｌｔａＰＲＯＳＡＬＦ、及びＦＢＡＭＯＰｒｏＳＡＬＦのいずれかに同時に連結した。得られるプラスミドは、それぞれエンベロープＡＭＯＤ８４Ｋ、ＡＭＯＤｅｌｔａＰｒｏＤ８４Ｋ、及びＡＭＯＰｒｏＤ８４Ｋを発現する。プラスミドＦＢＡＭＯＧ１Ｘ（Valsesia-Wittmannら，The EMBO Journal 16:1 214-1223(1997)）から、制限酵素ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ及びＸｈｏＩ／ＢｓｔＥII で消化して、それぞれ２００５塩基対と２４１塩基対の２つのＤＮＡ断片を単離した。これらの２つの挿入体を、前もって酵素ＮｄｅＩとＢｓｔＥIIで消化したプラスミドＦＢＡＭＯ８４ＫＳＡＬＦにクローン化して、ＡＭＯＧ１ＸＤ８４Ｋエンベロープを発現することができるプラスミドを得た。結果と考察。キメラエンベロープの発現とウイルスの組込み。エンベロープＡＭＯ、ＡＭＯＤｅｌｔａＰＲＯ、ＡＭＯＰＲＯ、ＡＭＯＥＬ３、ＡＭＯＥＬ５、ＡＭＯＥＬ３ −Ｖ、ＡＭＯＥＬ３−Ｉ、ＡＭＯ１ＦＸ、ＡＭＯＧ１Ｘ、ＡＭＯＤ８４Ｋ、ＡＭＯＤｅｌｔａＰＲＯＤ８４Ｋ、ＡＭＯＰＲＯＤ８４Ｋ、ＡＭＯＧ１ＸＤ８４Ｋ、ＡＭＯＤｅｌｔａＰＲＯ２(Valsesia-Wittmannら,The EMBO Journal 16:1214-12 23(1997))、及びＡＭＯＤｅｌｔａＰＲＯ４（Valsesia-Wittmannら，The EMBO J ournal 16:1214-1223(1997)）の発現プラスミドを、トランスフェクションによりＴＥＬＣｅＢ６系の細胞（Cossetら，Journal of Virology 69:6314-6322 (1995a)）中に導入した。フレオマイシンによる選択後、フレオマイシン耐性コロニーを各ＤＮＡについて合わせて、ビリオンを作成し、最初に報告された方法により分析した(Cossetら，Journal of Virology 69:7430-7436(1995a))。これらの種々のキメラエンベロープを細胞中で通常に発現させそして成熟させ、更にウイルス粒子に効率的に組込む(結果は示していない)。結合試験を行って、これらのレトロウイルスが、標的表面分子Ｒａｍ−１によりヒト細胞に特異的に結合できることを証明した(結果は示していない)。Ｒｅｃ−１のみ(Ｃｅｒｄ９)、若しくはＲａｍ−１のみ(ＣＨＯ−Ｒａｍ−１) 、又はＲａｍ−１とＲｅｃ−１の２つの分子（Ｃｅａｒ１３）のいずれかを発現する細胞を感染させるために、これらの種々のウイルスを使用した。これらのウイルスの力価の結果は、表４に示す。これらの結果は、以下のように要約される： − ＡＭＯエンベロープでは、文献に記載の、合成（ＡＭＯＥＬ３）又は天然のポリプロリンらせんの３つのベータ折り返しによるスペーサーペプチドの置換（ＡＭＯＥＬ３−Ｖ、ウシエラスチンから）は、同種指向性エンベロープの機能をマスクする能力及びＲａｍ−１とＲｅｃ−１受容体の協力を調節する能力に関して、協力するスペーサーペプチドＤｅｌｔａＰＲＯ２、ＤｅｌｔａＰＲＯ、ＤｅｌｔａＰＲＯ４、又はＰＲＯを含有する「ＡＭＯ」エンベロープを有するウイルスと類似の表現型を付与する。エラスチンから誘導されたペプチド（ＡＭＯＥＬ３−Ｖ及びＡＭＯＥＬ３）はII型ポリプロリンらせんとして配置されるため、得られた結果に基づき、ＤｅｌｔａＰＲＯとＰｒｏペプチドによるＲａｍ−１とＲｅｃ−１受容体の協力の調節は、おそらくII型ポリプロリンらせんとして推定される二次構造が原因であると示唆される。更に、エラスチンから誘導されるスペーサーペプチド（ＡＭＯＥＬ３−Ｖ）に導入され、II型ポリプロリンらせんへのペプチドの折り畳みを破壊する目的を有する突然変異（ＡＭＯＥＬ３−Ｉ、各ベータ折り返しのプロリンをイソロイシンで置換して得られる突然変異）により、受容体の協力が解除される。 − 同種指向性受容体への結合能力の破壊（Ｄ８４Ｋ突然変異）は、協力するスペーサーペプチド、特にＰＲＯ（ＡＭＯＰＲＯ対ＡＭＯＰＲＯＤ８４Ｋの結果を参照のこと）を含有するエンベロープの受容体協力を停止させるが、フレキシブルスペーサーペプチドＧ１Ｘを有する対照エンベロープの機能には影響を与えない(ＡＭＯＧ１Ｘ対ＡＭＯＧ１ＸＤ８４Ｋの結果を参照のこと)。ここから我々は、同種指向性受容体への結合が、Ｒａｍ−１受容体への定着後の、第２段階の感染に必要であると結論する。この結果は、キメラエンベロープＡＭＯＰｒｏで作成したレトロウイルスの場合には、同種指向性受容体への結合ドメインがマスクされていることを示すことに注意されたい(Valsesia-Wittmannら，The EMBO Journal 16:1214-1223(1997)) 。したがって、これらの結果をまとめると、２段階相互作用モデルに一致し、ここで： − 「ナイーブ」立体配置（即ち、細胞と相互作用することが許されないとき）では、「ＡＭＯＰＲＯ」レトロウイルスは、標的の「一次」受容体（Ｒａｍ− １分子）とおそらく相互作用することができるが、補助受容体（Ｒｅｃ−１分子）とは直接相互作用することができない。このマスキングは、Ｐｒｏスペーサーペプチドの第１の性質に起因するものと思われる。 − このウイルスがＲａｍ−１と相互作用することが許されるとき、Ｐｒｏスペーサーペプチドのレベルでコンホメーションの局所的変化が起き、このためＲｅｃ−１への結合ドメインが接近しやすくなる。コンホメーションのこの変化は、Ｐｒｏスペーサーペプチドの第２の性質に起因する。 − Ｒａｍ−１を有し、その上にウイルスが結合している同じ細胞の表面にＲｅｃ−１受容体が存在するなら、第２の段階でこの受容体は、ウイルスの侵入分子として作用するであろう。表４力価測定の結果エンベロープ。「ＰＨＱＶ」は、ＭｏＭＬＶのエンベロープのアミノ酸７〜１０を表し、そして「ＮＶＧ」は、Ｒａｍ−１への結合ドメインの最後の３アミノ酸を表す。ｂ.記載した細胞について得られた相対的力価:Ｃｅａｒ１３、受容体Ｒａｍ− １とＲｅｃ−１を発現する；ＣＨＯ−Ｒａｍ−１、Ｒａｍ−１のみを発現する；Ｃｅｒｄ９、Ｒｅｃ−１のみを発現する。実施例３リガンドのＮ末端挿入により生成するキメラエンベロープ糖タンパク質の構築を用いて遺伝子導入を標的とする方策を開発しようとすると、特に、これらの標的化エンベロープの融合を活性化するための、ウイルスと標的表面分子との間の相互作用の能力の低さ又は能力の欠如という困難に突き当たる(CossetとRussell ，Gene Therapy 3:946-956(1996))。２つの表面分子（１つは、標的受容体又は細胞表面付着分子であり、他の１つは、融合専門の（レトロ）ウイルス受容体又は補助表面分子である）を協力させる可能性（Valsesia-Wittmannら，The EMBO Journal 16:1214-1223(1997)）は、この問題（キメラエンベロープの遺伝子融合の能力の低さ、及びより一般的にはレトロウイルスを標的化する効率の低さ）を克服する手段を考えることを可能にする。受容体の協力を３つの標的化モデルで試験したが、この場合以下の３つの細胞表面分子が標的化レトロウイルスの付着部位として機能する：（ｉ）ＥＧＦ（上皮増殖因子）の受容体、及び（ii ）ヒトＣＭＨのクラスＩ分子。これらの２つの表面分子の結合ドメインは、増殖因子(ＥＧＦＲ)、又は一本鎖抗体（ＣＭＨ−Ｉ）のいずれかである。これらのリガンドは、両種指向性ＭＬＶエンベロープ（４０７０Ａ）のＮ末端での融合により挿入し、両種指向性ＭＬＶウイルスのＳＵサブユニットが運ぶ高プロリン領域からの種々のペプチドは、リガンドと４０７０Ａエンベロープの間に挿入した( 表５を参照のこと)。材料と方法スペーサーペプチドＤｅｌｔａＰｒｏ２、ＤｅｌｔａＰｒｏ３、ＤｅｌｔａＰｒｏ４、及びＰｒｏをコードするＤＮＡ断片（表５を参照のこと）は、ＤＮＡマトリックスとして遺伝子ｅｎｖ４０７０Ａ、５'でオリゴヌクレオチドＰＲＯ− ５−ＮＥ（5'-ATC GAG GTC ACC GCG GCC GCG GGA CCC CGA GTC CCC ATA GGG CCC ）（これは、４つのＰＣＲ断片について同じである）及びオリゴヌクレオチド３ ’として配列ＡＭＯＤＰＲＯ（−Ｈ＋Ｐ−Ａ）：を使用してＰＣＲにより作成した。対応するＤＮＡ断片を、酵素ＥａｇＩで消化し、前もってＮｏｔＩ制限部位で開いておいたプラスミドＦＢＥＡＳＡＬＦ（キメラエンベロープ糖タンパク質ＥＡを発現する）（Cossetら，Journal of Virology 69:6314-6322(1995a)）に別々に挿入した。得られたプラスミドは、エンベロープＥＡＤｅｌｔａＰｒｏ２、ＥＡＤｅｌｔａＰｒｏ３、ＥＡＤｅｌｔａＰｒｏ４、及びＥＡＰｒｏを発現する。プロモーターＦＢ２９、並びにＭｏＭＬＶウイルス（Marinら，Journal of Vi rology 70:2957-2962(1996)）のエンベロープ糖タンパク質のシグナルペプチドとともに提供されるｓｃＦｖ抗ＭＨＣ−Ｉを含有するＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ断片を、前もってＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ断片を除去したＦＢＥＡＳＡＬＦプラスミドにクローン化した。これにより、Ｎ末端でｓｃＦｖが融合した４０７０キメラエンベロープを発現することができるプラスミドＦＢ３４ＡＳＡＬＦが得られる。次にこのプラスミドを、前もってＥａｇＩ酵素で消化したスペーサーペプチドＤｅｌｔａＰｒｏ２、ＤｅｌｔａＰｒｏ３、ＤｅｌｔａＰｒｏ４、及びＰｒｏ（表５を参照のこと）を挿入するために、ＮｏｔＩで開いた。これにより、エンベロープ３４ＤｅｌｔａＰｒｏ２、３４ＤｅｌｔａＰｒｏ３、３４ＤｅｌｔａＰｒｏ４、及び３４Ｐｒｏのための一連の発現ベクターが得られる。結果と考察。これらの種々のＤＮＡを、ＴＥＬＣｅＢ６系の細胞にトランスフェクションにより導入し、常法によりレトロウイルスを作成した(実施例１と２を参照のこと) 。これらのレトロウイルスは、キメラエンベロープ糖タンパク質を正しく発現すること、そして後者は、特異的細胞標的上のウイルス粒子の結合の効率的な向け直しを可能にすることが示された(結果は示していない)。種々の群のキメラエンベロープで産生したウイルスは、両種指向性受容体のみを発現し標的表面分子を発現しない細胞を感染させるために使用した。これらのウイルスの力価測定の結果を表５に示す。これらの結果は、高プロリン領域からの断片を用いて両種指向性エンベロープの機能をマスクできることを示す。ＥＧＦで作成したキメラの場合、有意なマスキング効果を得るためには、少なくとも５つのベータ折り返しを挿入することが必要であり、高プロリン領域全体を挿入すると完全に阻害される。ｓｃＦｖ抗ＭＨＣ−Ｉで作成したキメラでは、完全なマスキング効果を得るためには３つのベータ折り返しが必要である。表５力価測定の結果ａ:標的化結合ドメインと４０７０Ａエンベロープの間に挿入されたペプチド。「ＡＡＡ」は、キメラエンベロープで融合を行うために使用されるＮｏｔＩ部位をコードする；「ＰＨＱＶ］は、両種指向性エンベロープのアミノ酸４〜７を表す。ベータ折り返しには、下線を引いてある。ｂ：ＥＧＦＲ標的化エンベロープ（リガンド：ＥＧＦ）と、ＭＨＣ−Ｉを標的とする標的化エンベロープ（リガンド：ｓｃＦｖ抗ＭＨＣ−Ｉ）についてのＣｅａｒ１３細胞上での力価測定。ｃ：リガンドは両種指向性ＳＵの末端で直接融合（４番目のアミノ酸で）し、スペーサーペプチドを持たない。実施例４以前の研究は、マスキング作用及び最少の協力作用を得るのに必要な、協力するペプチドのＣ末端の範囲を明確にし、II型ポリプロリンらせんの折り返しの数を決定することを可能にした。ＡＭＯキメラエンベロープのモデルの場合(前記を参照)、少なくとも２つのらせんの折り返しがあれば充分である(Valsesia-Wit tmannら，The EMBO Journal 16:1214-1223(1997))。しかし、Ｒａｍ−１の結合ドメイン（ＡＭＯキメラの場合）ではなく他の結合ドメインで作成され、そして支持エンベロープとして両種指向性エンベロープを使用して作成されたキメラエンベロープについては、協力作用はあまり顕著でなく、これは一方では、両種指向性エンベロープの機能のマスキングにはポリプロリンらせんの４つの折り返しが必要であること(表５を参照)、そして他方では、標的表面分子にウイルスが結合した後の両種指向性エンベロープの機能の活性化はあまり強くないことが原因である。１つの可能な説明は、ＡＭＯキメラのモデルでは、ＰＲＯスペーサーペプチドとは別に、Ｒａｍ−１自体への結合ドメインは、同種指向性エンベロープの機能の活性化を、このＰＲＯペプチドと協同して誘導するための重要な抗原決定基を有するということである。実際Ｒａｍ−１に対する結合ドメインは、天然には高プロリン領域の直ぐ上流に位置するレトロウイルスエンベロープの断片（両種指向性エンベロープから誘導される）である。受容体の協力におけるそのような領域の存在と重要性を測定するために、標的化ドメインと両種指向性エンベロープとを一緒にしてキメラエンベロープを構築し、これらの２つのポリペプチドの間に挿入し、顕著には両種指向性エンベロープのＮ末端ドメインから誘導されるペプチド断片と組合せた高プロリン領域（又は、この領域の断片）を含有する種々のペプチドを、その協力作用について試験した。材料と方法スペーサーペプチドＤｅｌｔａＰｒｏ４−ベータ、ＤｅｌｔａＰｒｏ４−ｉｎｔ、ＤｅｌｔａＰｒｏ４−ｖｒｂをコードするＤＮＡ断片を、ＰＣＲにより、ＤＮＡマトリックスとして遺伝子ｅｎｖ４０７０Ａ、３’でオリゴヌクレオチドＡＭＯＤＰＲＯ（＋Ｈ＋Ｓ−Ａ）：を使用してそれぞれ作成した(図３６〜３８を参照のこと)。スペーサーペプチドＰｒｏ−ベータ、Ｐｒｏ−ｉｎｔ及びＰｒｏ−ｖｒｂをコードするＤＮＡ断片を、ＰＣＲにより、ＤＮＡマトリックスとして遺伝子ｅｎｖ４０７０Ａ、３’でオリゴヌクレオチドＰＲＯ−３−ＮＥ：を使用してそれぞれ作成した(図３９〜４１を参照のこと)。これらのＤＮＡ断片をＥａｇＩ酵素で消化し、ＦＢＥＡＳＡＬＦプラスミド( 前記参照)に挿入して、キメラエンベロープＥＡＤｅｌｔａＰｒｏ４−ベータ、ＥＡＤｅｌｔａＰｒｏ４−ｉｎｔ、ＥＡＤｅｌｔａＰｒｏ４−ｖｒｂ、ＥＡＰｒｏ−ベータ、ＥＡＰｒｏ−ｉｎｔ及びＥＡＰｒｏ−ｖｒｂの発現ベクターを産生するか、又はＦＢ３４ＡＳＡＬＦプラスミド（前記参照）に挿入して、キメラエンベロープ３４ＡＤｅｌｔａＰｒｏ４−ベータ、３４ＡＤｅｌｔａＰｒｏ４−ｉｎｔ、３４ＡＤｅｌｔａＰｒｏ４−ｖｒｂ、３４ＡＰｒｏ−ベータ、３４ＡＰｒｏ−ｉｎｔ及び３４ＡＰｒｏ−ｖｒｂの発現ベクターを産生した。文献 1．Battini,J.L.,O.Danos,and J.M.Heard.1995.Receptor-binding domain of murine leukemia virus envelope glycoproteins.J.Virol.69:713-719. Receptor-binding properties of a purified fragment of the 4070A amphotro pic murine leukemia virus envelope glycoprotein.J.Virol.in press. 3．Bell,G.I.,N.M.Fong,M.M.Stempien,M.A.Wormsted,D.Caput,L.Ku,M.S.U rdea,L.B.Rall,and R.Sanchez-Pescador.1986.Human epidermal growth factor precursor:cDNA sequence,expression in vitro and gene organization.Nuclei c Acid Res.14:8427-8446. 4．Cosset,F.-L.,C.Legras,Y.Chebloune,P.Savatier,P.Thoraval,J.L.Tho mas,J.Samamt,V.M.Nigon,and G.Verdier.1990.A new avian leukosis virus-bas ed packaging cell line that uses two separate transcomplementing helper genomes.J.Virol.64:1070-1078. 5．Cosset,F.-L.,C.Legras,J.L.Thomas,R.M.Molina,Y.Chebloune,C.Faure ,V.M.Nigon,and G.Verdier.1991.Improvement of avian leukosis virus(ALV)-b ased retrovirus vectors by using different cis-acting sequences from ALV s.J Virol.65:3388-3394. 6．Cosset,F.-L.,F.J.Morling,Y.Takeuchi,R.A.Weiss,M.K.L.Collins,and S.J.Russell.1995a.Retroviral retargeting by envelopes expressing an N-t erminal binding domain.J.Virol.69:6314-6322. 7．Cosset,F.-L.,Y.Takeuchi,J.L.Battini,R.A.Weiss,and M.K.L.Collins .1995b.High titer packaging systems producing recombinant retroviruses r esistant to human serum.J.Virol.69:7430-7436. 8．Gatignol，A.,H.Durand,and G.Tiraby．1988.Bleomycin resistance c onferred by a drug-binding protein.FEBS Letters.230:171-175. 9．Kozak.S.L..D.C.Siess,M.P.Kavanaugh,A.D.Miller,and D.Kabat.1995. The envelope glycoprotein of an amphotropic murine retrovirus binds spec ifically to the cellular receptor/phosphate transporter of susceptible species.J. Virol.69:3433-3440. 10.Marin,M.,D.No‘l,S.Valsesia-Wittmann,F Brock1y,M.Etienne-Julan, S.J.Russell,F.-L.Cosset,and M.Piechaczyk.1996.Targeted infection of huma n cells via MHC class I molecules by MoMuLV-derived viruses displaying s ingle-chain antibody fragment-envelope fusion proteins.in press. 11.Miller,D.G.,R.H.Edwards,and A.D.Miller.1994.Cloning of the cell ular receptor for amphotropic murine retroviruses reveals homology to th at for gibbon apeleukemia virus.Proc Natl Acad Sci USA.91:78-82. 12.Nagai,K.,and H.C.Thorgersen．1984.Generation of betaglobin by s equence-specific proteolysis of a hybrid protein produced in Escherishia coli.Nature(London).309:810-812. 13.Nilson,B.H.K.,F.J.Morling,F-L.Cosset,and S.J.Russell.1996.Targe ting of retroviral vectors through protease-substrate interactions.Gene Ther.in press. 14.Ott,D.,R.Friedrich,and A.Rein.1990.Sequence analysis of amphotr opic and 10Al murine leukemia virus:close relationship to mink cell focu s forming viruses.J.Virol.64:757-766. 15.Russell,S.J.,R.E.Hawkins,and G,Winter.1993.Retroviral vectors d isplaying functional antibody fragments.Nucleic Acids Research.21:1081-1 085. 16.Sambrook,J.,E.F.Fritsch,and T.Maniatis.1989.Molecular cloning,A laboratory manual,2nd ed.Cold Spring Harbor Laborator Press,New York. 17.Shinnick.T.M.,R.A.Lerner,and J.G.Sutcliffe.1981.Nucleotide sequ ence of Moloney murine leukemia virus.Nature.293:543-548. 18.Souyri,M.,I.Vigon,J.F.Penciolelli,J.M.Heard,P Tambourin,and F.W endling．1990.A putative truncated cytokine receptor gene transduced by the myeloproliferative leukemia virus immortalizes hematopoietic progeni tors．Cell.63:1137-1147. 19.Takeuchi,Y.,F.L.Cosset,P.J.Lachmann,H.Okada,R.A.Weiss,and M．K. L.Collins.1994.Type C retrovirus inactivation by human complement is det ermined by both the viral genome and producer cell.J.Virol.68:8001-8007. 20.Valsesia-Wittmann,S.,A.Drynda,G.Deleage,M.Aumailley,J.-M.Heard, O.Danos,G.Verdier,and F.-L.Cosset.1994.Modifications in the binding doma in of avian retrovirus envelope protein to redirect the host range of re troviral vectors.J.Virol.68:4609-4619. 21.Valsesia-Wittmann,S.,F.J.Morling,B.H.K.Nilson,Y.Takeuchi,S.J.Ru ssell,and F.-L.Cosset.1996.Improvement of retroviral retargeting by usin g amino acid spacers between an additional binding domain and the N term inus of Moloney murine leukemia virus SU.J.Virol.70:2059-2064. 22.VanZeijl,M.,S.V.Johann,E.Cross,J.Cunningham,R.Eddy,T.B.Shows,an d B.O'Hara.1994.An amphotropic virus receptor is a second member of the gibbon apeleukemia virus receptor family.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91:1168- 1172. 23.Weiss,R.A.1993.Cellular receptors and viral glycoproteins invol ved in retroviral entry,p.I-108.In J.levy(ed.),The Retroviridae,vol.2.Pl enum Press.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 (72)発明者ラッセル，スティーブン・ジェーイギリス国、ケンブリッジシービー２５イーアール、リトル・シェルフォード、カウントヤーズ 10 【要約の続き】は、Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインが標的受容体と相互作用しないときに起こり、そしてＣ末端（下流）タンパク質ドメインと補助受容体の間の相互作用の促進は、Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインが標的受容体と相互作用したときに起こる。

Claims

【特許請求の範囲】１．標的真核細胞中への遺伝子の導入のためのペプチドの用途であって、このペプチドは、約１０〜約２００、特に約１５〜約１５０アミノ酸、そして有利には約２０アミノ酸を含有し、そして少なくとも３０％のアミノ酸は、プロリン残基から構成され、これらのプロリン残基は、約１８０°でのポリペプチド鎖の折り返し（「β−折り返し」又は「逆折り返し」）を誘導するように規則的に配置され、これらの折り返しは、均等に間隔があき、そして該ペプチドのＮ末端側（上流）に、標的表面分子又は細胞表面上に発現する抗原、特に該真核細胞上に位置する適切な受容体（標的受容体）を認識することができるＮ末端（上流）タンパク質ドメインを含有し、そして該ペプチドのＣ末端側（下流）に、上述の真核細胞上に位置する適切な受容体（補助受容体）を認識することができるＣ末端（下流）タンパク質ドメインを含有するポリペプチド構築物中に、ポリプロリンβ−折り返しらせんを形成し、このペプチドは、Ｃ末端（下流）タンパク質ドメインと補助受容体の間の相互作用を促進又は阻害することができ、この相互作用の阻害は、Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインが標的受容体と相互作用しないときに起こり、そしてＣ末端（下流）タンパク質ドメインと補助受容体の間の相互作用の促進は、Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインが標的受容体と相互作用したときに起こることを特徴とする、ペプチドの用途。２．標的化及び遺伝子融合活性を有する、本質的に完全な、真核細胞に感染することができるウイルス性又は非ウイルス性組換え遺伝子導入ベクターにより運ばれる、糖タンパク質の構築における、請求項１記載のペプチドの用途であって、この真核細胞は、真核細胞中への上述のウイルス性又は非ウイルス性ベクターの侵入の促進を可能にする標的受容体及び補助受容体を有しており、上述の糖タンパク質は、 − 上述のペプチド、 − 該標的受容体と相互作用することができる該ペプチドのＮ末端側（上流）のタンパク質ドメイン(このタンパク質ドメインは、該遺伝子導入ベクターの特異的結合を可能にする)、及び − 該補助受容体と相互作用することができる該ペプチドのＣ末端側（下流）のタンパク質ドメイン（この相互作用は、真核細胞中への該遺伝子導入ベクターの侵入の補助機構の役割を果たす）を含んでおり、Ｃ末端（下流）タンパク質ドメインによる真核細胞中へのウイルス性又は非ウイルス性組換えベクターの細胞侵入のプロセスは、Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインがウイルス性又は非ウイルス性組換えベクターを認識し、かつこれを真核細胞の標的受容体と結合させたときにのみ起こることができ、これが、上述のペプチドの作用で、Ｃ末端（下流）タンパク質ドメインに関して補助受容体の「非マスキング」、即ち接近しやすさの機構をもたらし、そして上述の遺伝子導入ベクターと真核細胞の標的受容体の間にＮ末端（上流）タンパク質ドメインにより、認識が起こらない場合には、上述のペプチドの作用で、Ｃ末端（下流）タンパク質ドメインに関して補助受容体の「マスキング」、即ち接近しにくさの機構が生じることを特徴とする、ペプチドの用途。３．真核細胞に感染することができる組換え（レトロ）ウイルスにより運ばれる、本質的に完全な（レトロ）ウイルスエンベロープ糖タンパク質の構築における、請求項１〜２の１項記載のペプチドの用途であって、該エンベロープ糖タンパク質が、有利には重合体型、そして特に三量体型であり、重合体型の各モノマーが、本来ヘテロ二量体型であり、該真核細胞は、真核細胞中への該（レトロ）ウイルス粒子（(レトロ)ウイルス受容体）の侵入の促進を可能にする標的受容体と補助受容体を含有し、エンベロープ糖タンパク質が、 − 上述のペプチド、 − 該標的受容体と相互作用することができる、該ペプチドのＮ末端側(上流) のタンパク質ドメイン(この相互作用は、（レトロ）ウイルス粒子の特異的結合を可能にする)、及び − 該（レトロ）ウイルス受容体と相互作用することができる、該ペプチドのＣ末端側（下流）のタンパク質ドメイン（この相互作用は、真核細胞中への（レトロ）ウイルス粒子の侵入の補助機構の役割を果たす）を含んでおり、Ｃ末端（下流）タンパク質ドメインによる真核細胞中への組換え（レトロ）ウイルス粒子の細胞侵入のプロセスは、Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインが真核細胞の標的受容体を認識し、かつこれを組換え（レトロ）ウイルス粒子と結合させたときにのみ起こることができ、これが、上述のペプチドの作用で、Ｃ末端（下流）タンパク質ドメインに関して（レトロ）ウイルス受容体の「非マスキング」、即ち接近しやすさの機構をもたらし、そして組換えウイルス粒子と真核細胞の標的受容体の間にＮ末端（上流）タンパク質ドメインによる認識が起こらない場合には、上述のペプチドの作用で、Ｃ末端(下流)タンパク質ドメインに関して（レトロ）ウイルス受容体の「マスキング」、即ち接近しにくさの機構が生じることを特徴とする、ペプチドの用途。４．Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインが、下記ポリペプチド： − 細胞表面分子を認識する一本鎖抗体、 − 細胞表面分子に対する任意のリガンド、特にポリペプチドホルモン、サイトカイン、増殖因子から選択されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載のペプチドの用途。５．Ｃ末端（下流）タンパク質ドメインが、天然結合ドメイン、組換え（レトロ）ウイルス粒子により運ばれるエンベロープ糖タンパク質がそれから誘導される野生型エンベロープ糖タンパク質の融合及び付着の機能、を含む、本質的に完全な（レトロ）ウイルスエンベロープ糖タンパク質に対応することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチドの用途。６．ペプチドが、Ｃ型レトロウイルスのエンベロープ糖タンパク質に由来し、そしてウイルスが、好ましくは以下：同種指向性ＭＬＶウイルス、両種指向性ＭＬＶウイルス、他種指向性ＭＬＶウイルス、ＭＬＶＭＣＦウイルス、ＭＬＶ１０Ａ１ウイルス、ＧＡＬＶ(テナガザル白血病ウイルス(Gibbon Ape Leukemia Vi rus))、ＳＳＡＶ(サル肉腫関連ウイルス(Simian Sarcoma Associated Virus))、ＦｅＬＶＡ、ＦｅＬＶＢ、ＦｅＬＶＣ（ＦｅＬＶ：ネコ白血病ウイルス(F eline Leukemia Virus)）から選択され、そして特にペプチドが、以下の配列：ＰＲＯ(４０７０Ａ)、ＰＲＯ(ＭｏＭＬＶ)、ΔＰＲＯ、ＰＲＯ＋、ΔＰＲＯ＋、ＰＲＯβ、ΔＰＲＯβ、ΔＰＲＯ４−β、ΔＰＲＯ４−ｉｎｔ、ΔＰＲＯ４−ｖｒｂ、ＰＲＯβ、ＰＲＯ−ｉｎｔ、ＰＲＯ−ｖｒｂの１つを含むか又はそれで構成されるペプチドから選択されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項記載のペプチドの用途。７．ペプチドが、ウシエラスチンから誘導されるか又は適合され、そして以下の配列：ＥＬ３、ＥＬ３−Ｖ、ＥＬ５の１つを含むか又はそれで構成されるペプチドから選択されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項記載のペプチドの用途。８．以下の配列：の１つを含むか又はそれで構成される配列から選択される、ペプチド配列。９．約１０〜約２００、特に約１５〜約１５０アミノ酸、そして好ましくは約２０アミノ酸のペプチドを含有するペプチド配列であって、アミノ酸の少なくとも３０％がプロリン残基からなり、これらのプロリン残基が、約１８０°でポリペプチド鎖の折り返し（「β−折り返し」又は「逆折り返し」）を誘導するように規則的に配置され、これらの折り返しが、均等に間隔があき、ポリプロリンβ−折り返しらせんを構成し、 − 該ペプチドのＮ末端タンパク質ドメイン（上流）が真核細胞上に位置する適切な受容体（標的受容体）と反応することができ(そしてこのタンパク質ドメインは、該Ｎ末端タンパク質ドメインを含有する組換え（レトロ）ウイルス粒子の特異的な結合を可能にする)、そして − 該ペプチドのＣ末端タンパク質ドメイン（下流）が該真核細胞上に位置する適切な補助（レトロ）ウイルス受容体（(レトロ)ウイルス受容体）と相互作用することができ(そしてこの相互作用は、該真核細胞中への（レトロ）ウイルス粒子の侵入の補助機構の役割を果たす)、該真核細胞中への該組換え（レトロ）ウイルス粒子の、Ｃ末端（下流）タンパク質ドメインによる細胞侵入のプロセスは、Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインが真核細胞の標的受容体を認識し、かつこれを該組換え（レトロ）ウイルス粒子と結合させたときにのみ起こることができ、これが、上述のペプチドの作用で、Ｃ末端（下流）タンパク質ドメインに関して（レトロ）ウイルス受容体の非マスキング、即ち接近しやすさの機構をもたらし、そして組換えウイルス粒子と真核細胞の標的受容体の間に、Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインによる認識が起こらない場合には、上述のペプチドの作用で、Ｃ末端（下流）タンパク質ドメインに関して（レトロ）ウイルス受容体のマスキング、即ち接近しにくさの機構が生じることを特徴とする、ペプチド配列。１０．真核細胞に感染することができる組換え（レトロ）ウイルス粒子であって、この細胞が、標的受容体と上述の（レトロ）ウイルス粒子の補助受容体を有し、特に重合体型、そして有利には三量体型の、実質的に完全なエンベロープ糖タンパク質を含み、重合体型の各モノマーが、有利にはそれ自体ヘテロ二量体型であり、約１０〜約２００、特に約１５〜約１５０アミノ酸、そして好ましくは約２０アミノ酸のペプチドを含有し、ここでアミノ酸の少なくとも３０％が、プロリン残基からなり、これらのプロリン残基が、約１８０°でポリペプチド鎖の折り返し（「β−折り返し」又は「逆折り返し」）を誘導するように規則的に配置され、これらの折り返しが、均等に間隔があき、ポリプロリンβ−折り返しらせんを構成し、 − 上述のペプチドのＮ末端側（上流）のタンパク質ドメインが上述の標的受容体と相互作用することができ(このペプチドドメインは、（レトロ）ウイルス粒子の特異的な結合を可能にする)、そして − 上述のペプチドのＣ末端側（下流）のタンパク質ドメインが上述の（レトロ）ウイルス受容体と相互作用することができ(この相互作用は、真核細胞中への（レトロ）ウイルス粒子の侵入の補助機構の役割を果たす)、真核細胞中への組換え（レトロ）ウイルス粒子の、Ｃ末端（下流）タンパク質ドメインによる細胞侵入のプロセスは、Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインが真核細胞の標的受容体を認識し、かつこれを組換え（レトロ）ウイルス粒子と結合させたときにのみ起こることができ、これが、上述のペプチドの作用で、Ｃ末端( 下流)タンパク質ドメインに関して（レトロ）ウイルス受容体の非マスキング、即ち接近しやすさの機構をもたらし、そして組換えウイルス粒子と真核細胞の標的受容体の間に、Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインによる認識が起こらない場合には、上述のペプチドの作用で、Ｃ末端（下流）タンパク質ドメインに関して（レトロ）ウイルス受容体のマスキング、即ち接近しにくさの機構が生じることを特徴とする、組換え（レトロ）ウイルス粒子。１１．Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインが、下記ポリペプチド： − 細胞表面分子を認識する一本鎖抗体、 − 細胞表面分子に対する任意のリガンド、特にポリペプチドホルモン、サイトカイン、増殖因子から選択されることを特徴とする、請求項１０記載の組換え（レトロ）ウイルス粒子。１２．Ｃ末端（下流）タンパク質ドメインが、組換え（レトロ）ウイルス粒子により運ばれるエンベロープ糖タンパク質がそれから誘導される野生型エンベロープ糖タンパク質の結合、融合及び付着の機能を有する（レトロ）ウイルス由来のポリペプチドに対応し、そしてレトロウイルスのＭＬＶ−Ａ、ＧＡＬＶ、ＦｅＬＶＢ、若しくはアデノウイルス、ヘルペスウイルス、ＡＡＶ（アデノ関連ウイルス(Adeno Associated Vi rus)）のようなウイルスからのエンベロープ糖タンパク質の結合、融合及び付着の機能を有する天然ドメインに由来するか、又は更に一般的には真核細胞由来のウイルス［特に、オルトミクソウイルス（インフルエンザウイルスなど）又はパラミクソウイルス(ＳＶ５など)］からのウイルス糖タンパク質に由来することができることを特徴とする、請求項１０又は１１の１項記載の組換え(レトロ)ウイルス粒子。１３．ペプチドが、Ｃ型レトロウイルスのエンベロープ糖タンパク質に由来し、そしてペプチドが、有利には以下：同種指向性ＭＬＶウイルス、両種指向性ＭＬＶウイルス、他種指向性ＭＬＶウイルス、ＭＬＶＭＣＦウイルス、ＭＬＶ１０Ａ１ウイルス、ＧＡＬＶ(テナガザル白血病ウイルス(Gibbon Ape Leukemia Vi rus))、ＳＳＡＶ(サル肉腫関連ウイルス(Simian Sarcoma Associated Virus))、ＦｅＬＶＡ、ＦｅＬＶＢ、ＦｅＬＶＣ（ＦｅＬＶ：ネコ白血病ウイルス (Feline Leukemia Virus)）から選択されるウイルスに由来し、そして特にペプチドが、以下の配列：ＰＲＯ(４０７０Ａ)、ＰＲＯ(ＭｏＭＬＶ)、ΔＰＲＯ、ＰＲＯ＋、ΔＰＲＯ＋、ＰＲＯβ、ΔＰＲＯβ、ΔＰＲＯ４−β、ΔＰＲＯ４−ｉｎｔ、ΔＰＲＯ４−ｖｒｂ、ＰＲＯβ、ＰＲＯ−ｉｎｔ、ＰＲＯ−ｖｒｂの１つを含むか又はそれで構成されるペプチドから選択されることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか１項記載の組換え（レトロ）ウイルス粒子。１４．請求項１０〜１３のいずれか１項記載の組換え（レトロ）ウイルス粒子であって、 − ペプチドが、Ｃ型レトロウイルスのエンベロープ糖タンパク質に由来し、そしてウイルスは、好ましくは以下：同種指向性ＭＬＶウイルス、両種指向性ＭＬＶウイルス、他種指向性ＭＬＶウイルス、ＭＬＶＭＣＦウイルス、ＭＬＶ１０Ａ１ウイルス、ＧＡＬＶ(テナガザル白血病ウイルス(Gibbon Ape Leukemia Virus))、ＳＳＡＶ(サル肉腫関連ウイルス(Simian Sarcoma Associated Virus)) 、ＦｅＬＶＡ、ＦｅＬＶＢ、ＦｅＬＶＣ（ＦｅＬＶ：ネコ白血病ウイルス (Feline Leukemia Virus)）から選択され、そして特にペプチドは、以下の配列：ＰＲＯ(４０７０Ａ)、ＰＲＯ(ＭｏＭＬＶ)、ΔＰＲＯ、ＰＲＯ＋、ΔＰＲＯ＋、ＰＲＯβ、ΔＰＲＯβ、ΔＰＲＯ４−β、ΔＰＲＯ４−ｉｎｔ、ΔＰＲＯ４− ｖｒｂ、ＰＲＯβ、ＰＲＯ−ｉｎｔ、ＰＲＯ−ｖｒｂの１つを含むか又はそれで構成されるペプチドから選択され、 − Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインが、以下のペプチド：＊細胞表面分子を認識する一本鎖抗体、＊細胞表面分子に対する任意のリガンド、特にポリペプチドホルモン、サイトカイン、増殖因子から選択され、 − Ｃ末端タンパク質ドメインが、組換え（レトロ）ウイルス粒子により運ばれるエンベロープ糖タンパク質がそれから誘導される野生型エンベロープ糖タンパク質の結合、融合及び付着の機能を有する（レトロ）ウイルス由来のポリペプチドに対応し、そしてレトロウイルスのＭＬＶ−Ａ、ＧＡＬＶ、ＦｅＬＶＢ、若しくはアデノウイルス、ヘルペスウイルス、ＡＡＶ（アデノ関連ウイルス(Adeno Associated Virus)）のようなウイルスからのエンベロープ糖タンパク質の結合、融合及び付着の機能を有する天然ドメインに由来するか、又は更に一般的には真核細胞由来のウイルス［特に、オルトミクソウイルス（インフルエンザウイルスなど）又はパラミクソウイルス(ＳＶ５など)］からのウイルス糖タンパク質に由来することができることを特徴とする、組換え（レトロ）ウイルス粒子。１５．Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインをコードするヌクレオチド配列の５’ 末端が、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’末端に隣接し、Ｎ末端（上流）タンパク質ドメインをコードするヌクレオチド配列の３’末端が、ペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’末端に隣接し、ペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’末端が、Ｃ末端（下流）タンパク質ドメインをコードするヌクレオチド配列の５’末端に隣接することを特徴とする、請求項１０〜１４のいずれか１項記載の組換え（レトロ）ウイルス粒子。１６．請求項１０〜１５のいずれか１項記載のペプチド又は組換え粒子をコードする核酸。１７．他の非標的細胞の中に存在する標的真核細胞中への核酸の選択的インビトロ又はエクスビボ導入の方法であって、導入される核酸を含有する、請求項１０〜１５のいずれか１項記載の組換え（レトロ）ウイルス粒子を、標的及び非標的細胞へ投与することを含む方法。１８.生理学的に適切な医薬担体と組合せて、活性物質として請求項１０〜１５のいずれか１項記載の（レトロ）ウイルス粒子を含有し、そして導入される遺伝子をも含有する、医薬組成物。