FR2748747A1 - Particules virales recombinantes comportant un peptide ayant des proprietes de masquage et de demasquage vis-a-vis d'un mecanisme biologique - Google Patents
Particules virales recombinantes comportant un peptide ayant des proprietes de masquage et de demasquage vis-a-vis d'un mecanisme biologique Download PDFInfo
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Abstract
L'invention concerne l'utilisation d'un peptide en vue d'un transfert de gènes dans une cellule eucaryote cible, lequel peptide présente d'environ 10 à environ 200, notamment d'environ 15 à environ 150 acides aminés, et avantageusement environ 20 acides aminés, dans lequel 30% au moins des acides aminés sont constitués par des résidus proline, lesquels résidus proline sont régulièrement agencés de manière à induire des repliements de la chaîne polypeptidique à environ180 deg. ("bêta-turn" ou "reverse-tum"), ces repliements étant régulièrement espacés et s'assemblant en une hélice polyproline à repliement de type bêta ("polyproline bêta-turn helix"). Dans une construction polypeptidique contenant, du côté N-terminal (en amont) dudit peptide, un domaine protéique N-terminal (amont) susceptible de reconnaître une molécule de surface ciblée ou un antigène exprimé sur une surface cellulaire, notamment un récepteur approprié (récepteur ciblé) situé sur ladite cellule eucaryote, et du côté C-terminal (en aval) dudit peptide, un domaine protéique C-terminal (aval) susceptible de reconnaître un récepteur approprié (récepteur auxiliaire) situé sur la susdite cellule eucaryote, lequel peptide est capable de faciliter ou d'inhiber l'interaction entre le domaine protéique C-terminal (aval) et le récepteur auxiliaire. L'inhibition de cette interaction ayant lieu tant que le domaine protéique N-terminal (amont) n'a pas interagi avec le récepteur ciblé et la favorisation de l'interaction entre le domaine protéique C-terminal (aval) et le récepteur auxiliaire ayant lieu lorsque le domaine protéique N-terminal (amont) a interagi avec le récepteur ciblé.
Description
PARTICULES VIRALES RECOMBINANTES COMPORTANT UN PEPTIDE
AYANT DES PROPRIETES DE MASQUAGE ET DE DEMASQUAGE VIS
A-VIS D'UN MECANISME BIOLOGIQUE
L'invention a pour objet des particules virales recombinantes comportant un peptide ayant des propriétés de masquage et de démasquage vis-à-vis d'un mécanisme biologique, notamment vis-à-vis d'un mécanisme d'interaction cellulaire.
AYANT DES PROPRIETES DE MASQUAGE ET DE DEMASQUAGE VIS
A-VIS D'UN MECANISME BIOLOGIQUE
L'invention a pour objet des particules virales recombinantes comportant un peptide ayant des propriétés de masquage et de démasquage vis-à-vis d'un mécanisme biologique, notamment vis-à-vis d'un mécanisme d'interaction cellulaire.
L'invention concerne également l'application des susdites particules virales, notamment au ciblage cellulaire du transfert de gènes.
Les rétro virus et donc les vecteurs rétroviraux initient leur cycle infectieux par la reconnaissance de molécules de surface cellulaire spécifiques, appelées récepteurs rétroviraux, avec des glycoprotéines d'enveloppe exprimées à la surface des particules rétrovirales. Cette reconnaissance aboutit ensuite à la fusion entre les membranes virales et cellulaires, processus complexe et mal connu qui est médié également par une deuxième fonction de la glycoprotéine d'enveloppe.
La possibilité de modifier la spécificité de l'interaction avec la surface de la cellule cible a été antérieurement démontrée, notamment par le biais de modifications génétiques introduites dans la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale.
Un certain nombre de travaux ont montré que de telles modifications n'entraînent pas d'effets perturbateurs dans les processus complexes qui permettent à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'être maturée, exprimée à la surface cellulaire, et incorporée sélectivement dans les virions. De plus, il est maintenant prouvé que ces modifications peuvent entraîner la reconnaissance spécifique de cellules par interaction avec les molécules de surface correspondant à ces polypeptides. Enfin, dans certains cas, cette reconnaissance permet la poursuite du cycle infectieux et l'intégration du transgène dans la cellule ciblée avec, dans le meilleur des cas, une efficacité extrêmement réduite par rapport à l'efficacité que fournit une enveloppe rétrovirale non modifiée via son récepteur rétroviral normal. On en conclut, d'une part, que certaines molécules de surface cibles ne peuvent être utilisées comme récepteur pour initier l'infection et, d'autre part, dans le cas où elles peuvent l'être, les processus consécutifs à l'interaction primaire se font extrêmement peu efficacement. Ces conclusions sont vraies en ce qui concerne les stratégies de "ciblage à une étape", c'est-à-dire d'approches où l'interaction primaire a pour but d'entraîner directement la poursuite du cycle infectieux, sans intervention de procédés auxiliaires.
Les vecteurs rétroviraux sont actuellement les vecteurs les plus utilisés pour le transfert de gène et en particulier pour la thérapie génique, dès lors que l'on recherche une intégration et une expression stable du transgène. D'autres vecteurs de transfert de gène existent (adénovirus-vecteurs, liposomes, vecteurs dérivés du virus de l'herpès, ou encore vecteurs dérivés des AAV), mais ne permettent pas l'intégration stable et efficace du transgène. Si la plupart des protocoles de thérapie génique explorés jusqu'à présent et utilisant les vecteurs rétroviraux sont basés sur l'explantation de cellules du patient, leur transgénèse et expansion in vitro, suivi de leur réimplantation, il serait hautement souhaitable d'être capable de transférer un gène thérapeutique dans le contexte in vivo par le biais de vecteurs rétroviraux. Pour cela, la particule rétrovirale qui véhicule le gène thérapeutique devrait être dotée de certaines caractéristiques supplémentaires, et plus particulièrement, celle de pouvoir reconnaître très spécifiquement les cellules cibles du transfert génétique. En effet, les molécule de surface naturellement reconnues par les rétrovirus pour l'initiation de l'infection sont exprimées très largement sur la plupart des cellules. Ceci n'autorise pas de discrimination précise des cellules dans lesquelles on souhaite effectuer un transfert de gène.
Plusieurs travaux ont eu pour objet la modification du tropisme d'infection des vecteurs rétroviraux. Certains de ces travaux s'appuient sur des modifications biochimiques des particules rétrovirales, d'autres sur des modifications génétiques des glycoprotéines d'enveloppe rétrovirales, ce qui garantit que toutes les particules rétrovirales seront modifiées. Dans ce dernier contexte, les travaux ont consisté en un "ciblage en une étape", pour laquelle la particule virale modifiée se fixe sur la molécule de surface cellulaire ciblée; ceci entraînant la poursuite du cycle infectieux. Cependant, l'efficacité des vecteurs rétroviraux ainsi modifiés est très faible en regard de ce que l'on attend pour obtenir un outil utilisable dans une perspective thérapeutique.
Il est possible que le développement de stratégies de ciblage ne puisse pas aboutir avec le système "à une étape", dues à certaines raison déjà évoquées plus haut inefficacité du processus fusiogénique des glycoprotéines d'enveloppe chimériques après leur liaison sur la molécule de surface ciblée, impossibilité d'utiliser certaines molécules de surface comme récepteurs rétroviraux.
Un certain nombre de protocoles de thérapie génique chez l'homme vont
requérir des vecteurs rétroviraux capables d'effectuer un transfert de gène in vivo, par inoculation directe des particules rétrovirales recombinantes. Parmi les améliorations que ceci suppose par rapport aux vecteurs rétroviraux développés jusqu'à présent, on peut citer
- l'amélioration des titres infectieux,
- I'amélioration de la stabilité des particules virales dans le sérum et plus généralement dans les divers fluides de l'organisme,
- la possibilité d'infecter les cellules quiescentes,
- la possibilité de discriminer les cellules cibles de la thérapie génique.
requérir des vecteurs rétroviraux capables d'effectuer un transfert de gène in vivo, par inoculation directe des particules rétrovirales recombinantes. Parmi les améliorations que ceci suppose par rapport aux vecteurs rétroviraux développés jusqu'à présent, on peut citer
- l'amélioration des titres infectieux,
- I'amélioration de la stabilité des particules virales dans le sérum et plus généralement dans les divers fluides de l'organisme,
- la possibilité d'infecter les cellules quiescentes,
- la possibilité de discriminer les cellules cibles de la thérapie génique.
L'invention a pour objet de proposer des moyens permettant de discriminer les cellules cibles de la thérapie génique. Il est essentiel, pour certaines applications en thérapie génique, de garantir que le transfert de gène n'aura eu lieu que dans les cellules à traiter et pas dans d'autres catégories cellulaires. Par exemple, quand on souhaite conférer un avantage sélectif à des cellules normales vis-à-vis d'une chimiothérapie, il est impératif que le gène transféré conférant cet avantage n'ait pas été introduit dans des cellules cancéreuses.
L'invention a pour objet un mécanisme à deux étapes, dans lequel la deuxième étape est conditionnée par la réalisation de la première étape.
L' invention a pour objet une alternative intéressante sur le plan des performances du ciblage, notamment puisqu'elle combine la reconnaissance spécifique de la cellule cible et l'entrée dans la cellule cible associée à un mécanisme rétroviral naturel, connu pour son efficacité.
L'invention a plus particulièrement pour objet un mécanisme de ciblage à deux étapes
- la première étape permettant la reconnaissance d'une molécule de surface ciblée par l'intermédiaire du nouveau domaine de liaison N-terminal, inséré dans une glycoprotéine d'enveloppe,
- la deuxième étape permettant la reconnaissance, conditionnelle, d'un récepteur rétroviral normal par l'intermédiaire d'un domaine propre à la glycoprotéine d'enveloppe initiale et ainsi, autorisant un relais dans le processus d'entrée de la particule virale dans la cellule, le terme "conditionnel" signifiant que le relais dans le mécanisme d'entrée ne peut être effectué que si la particule virale a préalablement interagi avec la molécule de surface initiale qui, elle, garantit que l'infection est réellement ciblée.
- la première étape permettant la reconnaissance d'une molécule de surface ciblée par l'intermédiaire du nouveau domaine de liaison N-terminal, inséré dans une glycoprotéine d'enveloppe,
- la deuxième étape permettant la reconnaissance, conditionnelle, d'un récepteur rétroviral normal par l'intermédiaire d'un domaine propre à la glycoprotéine d'enveloppe initiale et ainsi, autorisant un relais dans le processus d'entrée de la particule virale dans la cellule, le terme "conditionnel" signifiant que le relais dans le mécanisme d'entrée ne peut être effectué que si la particule virale a préalablement interagi avec la molécule de surface initiale qui, elle, garantit que l'infection est réellement ciblée.
L'invention a pour objet de nouveaux peptides permettant la réalisation de la première étape dans un mécanisme à deux étapes et jouant le rôle de
"masquage" vis-à-vis de la deuxième étape, tant que la première étape n'a pas eu lieu et permettant la deuxième étape, c'est-à-dire jouant le rôle de démasquage vis-à-vis de la deuxième étape si, et seulement si, la première étape a eu lieu.
"masquage" vis-à-vis de la deuxième étape, tant que la première étape n'a pas eu lieu et permettant la deuxième étape, c'est-à-dire jouant le rôle de démasquage vis-à-vis de la deuxième étape si, et seulement si, la première étape a eu lieu.
La présente invention a également pour objet la construction de glycoprotéines d'enveloppe chimériques utilisant ces nouveaux peptides.
L'invention concerne l'utilisation d'un peptide en vue d'un transfert de gènes dans une cellule eucaryote cible, lequel peptide présente d'environ 10 à environ 200, notamment d'environ 15 à environ 150 acides aminés, et avantageusement environ 20 acides aminés, dans lequel 30% au moins des acides aminés sont constitués par des résidus proline, lesquels résidus proline sont régulièrement agencés de manière à induire des repliements de la chaîne polypeptidique à environ 1800 ("p-turn" ou "reverse-turn"), ces repliements étant régulièrement espacés et s'assemblant en une hélice polyproline à repliement de type ss ("polyproline p-turn helix"), dans une construction polypeptidique contenant, du côté N-terminal (en amont) dudit peptide, un domaine protéique N-terminal (amont) susceptible de reconnaître une molécule de surface ciblée ou un antigène exprimé sur une surface cellulaire, notamment un récepteur approprié (récepteur ciblé) situé sur ladite cellule eucaryote, et du côté C-terminal (en aval) dudit peptide, un domaine protéique C-terminal (aval) susceptible de reconnaître un récepteur approprié (récepteur auxiliaire) situé sur la susdite cellule eucaryote, lequel peptide est capable de faciliter ou d'inhiber l'interaction entre le domaine protéique C-terminal (aval) et le récepteur auxiliaire, l'inhibition de cette interaction ayant lieu tant que le domaine protéique
N-terminal (amont) n'a pas interagi avec le récepteur ciblé et la favorisation de l'interaction entre le domaine protéique C-terminal (aval) et le récepteur auxiliaire ayant lieu lorsque le domaine protéique N-terminal (amont) a interagi avec le récepteur ciblé.
N-terminal (amont) n'a pas interagi avec le récepteur ciblé et la favorisation de l'interaction entre le domaine protéique C-terminal (aval) et le récepteur auxiliaire ayant lieu lorsque le domaine protéique N-terminal (amont) a interagi avec le récepteur ciblé.
Dans le cas d'un peptide de 20 acides aminés (APRO défini ci-après), cette hélice polyproline à repliement de type ss contient 4 repliements 13 et donc 4 spires, et est par ailleurs incompatible avec une structure secondaire en hélice a ou en feuillet ss. De façon avantageuse, l'hélice polyproline à repliement de type ss placée entre les deux domaines de la protéine chimère (domaine N-terminal et domaine auxiliaire) possède intrinsèquement , 1) une force élastomérique, 2) la propriété de s' auto-assembler avec d'autres hélices polyproline, probablement en relation avec la nature trimère de l'enveloppe, 3) la propriété de transmettre au domaine auxiliaire une déformation induite par la liaison du domaine
N-terminal avec son récepteur, provoquant l'activation du domaine auxiliaire.
N-terminal avec son récepteur, provoquant l'activation du domaine auxiliaire.
L'invention vise généralement également tout mécanisme en deux étapes, la deuxième étape ne pouvant être réalisée que si la première étape a eu lieu, et concerne par exemple un mécanisme enzymatique impliquant une protéine chimère et ne devant intervenir que si la protéine chimère a été capable de reconnaître son substrat.
L'expression "domaine protéique N-terminal (amont) susceptible de reconnaître une molécule de surface ciblée, ou un antigène exprimé sur une surface cellulaire", signifie que 1) l'on peut caractériser l'interaction entre ce domaine protéique N-terminal et la molécule de surface ciblée par une constante de dissociation (de l'ordre du nanomolaire en ce qui concerne l'interaction glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale sauvage et récepteur rétroviral); 2) la forme soluble de ce domaine protéique N-terminal (c'est-à-dire non associée dans la construction de la glycoprotéine d'enveloppe chimère) possède des caractéristiques de liaison similaires à ce même domaine protéique quand il est inséré en position N-terminale dans la glycoprotéine d'enveloppe chimère 3) la glycoprotéine d'enveloppe chimère contenant le domaine protéique
N-terminal peut être caractérisée selon des techniques classiques en virologie (exemple : test de liaison, cf. "Exemples").
N-terminal peut être caractérisée selon des techniques classiques en virologie (exemple : test de liaison, cf. "Exemples").
Comme exemple de molécule de surface ciblée ou d'antigène exprimé sur une surface cellulaire, on peut citer
- marqueurs de différenciation des divers lignages hématopoïétiques, en particulier marqueurs exprimés sur les cellules précoces et/ou les cellules souches hématopoïétiques (exemple : CD34),
- marqueurs exprimés sur les cellules tumorales (exemple : antigènes carcino-embryonnaires),
- marqueurs présents spécifiquement sur des tissus différenciés divers (exemple : récepteur de facteurs de croissance, d'hormones peptidiques).
- marqueurs de différenciation des divers lignages hématopoïétiques, en particulier marqueurs exprimés sur les cellules précoces et/ou les cellules souches hématopoïétiques (exemple : CD34),
- marqueurs exprimés sur les cellules tumorales (exemple : antigènes carcino-embryonnaires),
- marqueurs présents spécifiquement sur des tissus différenciés divers (exemple : récepteur de facteurs de croissance, d'hormones peptidiques).
Comme exemple de molécule de surface ciblée, on peut citer notamment un récepteur qui sera dans la suite désigné par récepteur ciblé.
Pour les commodités de langage, dans ce qui suit, on englobera par l'expression "récepteur ciblé" toute molécule de surface ciblée ou tout antigène exprimé sur une surface cellulaire.
L'expression "domaine protéique C-terminal (aval) susceptible de reconnaître un récepteur approprié (récepteur auxiliaire)" signifie que le domaine protéique C-terminal peut interagir avec le récepteur auxiliaire, cette interaction étant caractérisée par une constante de dissociation qui est de l'ordre du nanomolaire si le domaine protéique C-terminal est dérivée d'une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale et si le récepteur auxiliaire est le récepteur rétroviral utilisé par cette même glycoprotéine, cette interaction permettant de déclencher le processus fusiogénique dans un mécanisme strictement similaire au processus naturel, c'est-à-dire en dehors du contexte d'une glycoprotéine d'enveloppe chimère.
Le peptide qui fait l'objet de l'invention est tel que, placé entre deux domaines protéiques, (un domaine protéique N-terminal par rapport audit peptide et un domaine protéique C-terminal par rapport audit peptide), il peut induire la fonction du domaine protéique C-terminal (par exemple la liaison si telle est la fonction de ce domaine C-terminal) si, et seulement si, le domaine protéique N-terminal a été mobilisé dans sa fonction (par exemple la liaison).
La non induction de la fonction du domaine protéique C-terminal par le peptide de l'invention correspond au mécanisme de "masquage" du peptide de l'invention, tandis que l'induction de la fonction du domaine protéique
C-terminal par le peptide de l'invention correspond au mécanisme de "démasquage" du peptide de l'invention. C'est pourquoi, dans la suite du texte, on désignera le peptide de l'invention également par "peptide masquant/démasquant".
C-terminal par le peptide de l'invention correspond au mécanisme de "démasquage" du peptide de l'invention. C'est pourquoi, dans la suite du texte, on désignera le peptide de l'invention également par "peptide masquant/démasquant".
L'invention concerne l'utilisation d'un peptide selon l'invention, dans la construction d'une glycoprotéine à activité ciblante et fusiogénique, essentiellement intacte, portée par un vecteur recombinant viral ou non viral de transfert de gène capable d'infecter une cellule eucaryote, ladite cellule eucaryote comportant un récepteur ciblé et un récepteur auxiliaire permettant de faciliter l'entrée du susdit vecteur viral ou non viral dans la cellule eucaryote, la susdite glycoprotéine comprenant - le susdit peptide, - un domaine protéique du côté N-terminal (en amont) du susdit peptide, susceptible d'interagir avec le susdit récepteur ciblé, lequel domaine protéique permet de lier spécifiquement le susdit vecteur de transfert de gènes et - un domaine protéique du côté C-terminal (en aval) du susdit peptide, susceptible d'interagir avec le susdit récepteur auxiliaire, laquelle interaction joue le rôle de mécanisme auxiliaire d'entrée du susdit vecteur de transfert de gènes dans la cellule eucaryote, le processus d'entrée cellulaire du vecteur viral ou non viral recombinant dans la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique C-terminal (aval) ne pouvant avoir lieu que lorsque le domaine protéique N-terminal (amont) a reconnu et lié le vecteur viral ou non viral recombinant avec le récepteur ciblé de la cellule eucaryote, entraînant par l'intermédiaire du susdit peptide un mécanisme de "démasquage" ou encore d'accessibilité du récepteur auxiliaire vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval), et, dans le cas où il n'y a pas reconnaissance entre le susdit vecteur de transfert de gènes et le récepteur ciblé de la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique N-terminal (amont), se produit un mécanisme de "masquage" ou encore de non accessibilité, par l'intermédiaire du susdit peptide, du récepteur auxiliaire vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval).
L'expression glycoprotéine à activité ciblante et fusiogénique, désigne une glycoprotéine 1) capable d'être incorporée efficacement sur des particules (rétro)virales véhiculant un transgène, 2) capable de reconnaître spécifiquement la molécule de surface cellulaire ciblée et de rediriger spécifiquement la liaison de la particule (rétro)virale qui la porte vers cette molécule, 3) capable de faire fusionner, après fixation sur la cible moléculaire, membrane de la particule (rétro)virale et membrane cytoplasmique de la cellule, selon le mécanisme naturellement utilisé par le (rétro)virus dont est issue la glycoprotéine d'enveloppe.
L'expression "substantiellement intacte" se réfère à une glycoprotéine virale qui retient tous ses déterminants nécessaires pour conserver les processus post-traductionnels, le cas échéant, l'oligomérisation, les propriétés d'incorporation virale et de fusion. Cependant, certaines altérations (telles que mutations, délétions, additions) peuvent être faites à la glycoprotéine sans affecter significativement ces fonctions et les glycoprotéines contenant de telles modifications mineures sont considérées substantiellement intactes pour les besoins de l'invention. En particulier, la glycoprotéine peut manquer de quelques acides aminés (par exemple environ 1 à 10), en particulier à l'extrémité N-terminale, mais sera généralement de la même taille que la protéine de type sauvage et possède essentiellement les mêmes propriétés biologiques que la protéine sauvage.
Par "vecteur recombinant viral de transfert de gène", on désigne n'importe quel virus capable d'infecter des cellules de type eucaryote, et de façon avantageuse un virus approprié pour la thérapie génique, tel qu'un adénovirus ou un rétrovirus (par exemple un rétrovirus de type C).
Par "vecteur recombinant non viral de transfert de gène", on désigne des complexes macromoléculaires associant l'ADN contenant le gène transféré, ses séquences de régulation d'expression, et des molécules appartenant à la classe des lipides, des carbohydrates, ou des protéines, lesquels possèdent des propriétés fonctionnelles capables, 1) de cibler le dépôt de l'ADN sur la surface de la cellule cible, 2) d'introduire cet ADN à l'intérieur de la cellule ciblée, et 3) d'introduire cet ADN dans le noyau de la cellule ciblée.
Par "processus d'entrée cellulaire du vecteur recombinant viral de transfert de gène", on désigne l'ensemble des événements aboutissant à l'introduction du gène véhiculé dans le cytoplasme de la cellule ciblée suite au contact initial entre la surface de cette cellule et le vecteur de transfert de gène.
A titre d'exemple, pour les vecteurs rétroviraux, en fonction d'une cible cellulaire définie pour laquelle on connaît une molécule de surface "ciblable" (c'est-à-dire suffisamment spécifiques par rapport aux autres tissus) et un ligand pour cette molécule de surface (ligand ou anticorps monochaîne), on peut construire génétiquement un gène codant pour la glycoprotéine d'enveloppe ciblant cette molécule de surface. Ceci est réalisé en fusionnant (de N à
C-terminal) un peptide signal, le ligand, le peptide "masquant/démasquant", et le reste de l'enveloppe rétrovirale. Un vecteur d'expression pour cette molécule chimère est inséré dans une lignée cellulaire "semi-transcomplémentante" exprimant les protéines gag et pol du virus MLV (codant pour la capside rétrovirale et les enzymes de réplication du rétrovirus). On obtient une lignée "transcomplémentante" qui peut alors servir à produire des vecteurs rétroviraux si on y introduit, en plus, un plasmide portant ce vecteur rétroviral, comme ceci a lieu pour les lignées transcomplémentantes classiques exprimant des enveloppes rétrovirales normales.
C-terminal) un peptide signal, le ligand, le peptide "masquant/démasquant", et le reste de l'enveloppe rétrovirale. Un vecteur d'expression pour cette molécule chimère est inséré dans une lignée cellulaire "semi-transcomplémentante" exprimant les protéines gag et pol du virus MLV (codant pour la capside rétrovirale et les enzymes de réplication du rétrovirus). On obtient une lignée "transcomplémentante" qui peut alors servir à produire des vecteurs rétroviraux si on y introduit, en plus, un plasmide portant ce vecteur rétroviral, comme ceci a lieu pour les lignées transcomplémentantes classiques exprimant des enveloppes rétrovirales normales.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un peptide selon l'invention, dans la construction d'une glycoprotéine d'enveloppe (rétro)virale essentiellement intacte, portée par une particule (rétro)virale recombinante capable d'infecter une cellule eucaryote, ladite glycoprotéine d'enveloppe étant avantageusement sous forme polymérique, notamment sous forme trimérique, chaque monomère de la forme polymérique étant lui-même sous forme d'hétérodimère, ladite cellule eucaryote comportant un récepteur ciblé et un récepteur auxiliaire permettant de faciliter l'entrée de la susdite particule (rétro)virale (récepteur (rétro)viral) dans la cellule eucaryote, la glycoprotéine d'enveloppe comprenant - le susdit peptide, - un domaine protéique du côté N-terminal (en amont) du susdit peptide, susceptible d'interagir avec le susdit récepteur ciblé, laquelle interaction permet de lier spécifiquement la particule (rétro)virale et
- un domaine protéique du côté C-terminal (en aval) du susdit peptide,
susceptible d'interagir avec le susdit récepteur (rétro)viral, laquelle interaction joue le rôle de mécanisme auxiliaire d'entrée de la particule (rétro)virale dans la cellule eucaryote, le processus d'entrée cellulaire de la particule (rétro)virale recombinante dans la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique C-terminal (aval) ne pouvant avoir lieu que lorsque le domaine protéique N-terminal (amont) a reconnu et lié le récepteur ciblé de la cellule eucaryote avec la particule (rétro)virale recombinante, entraînant par l'intermédiaire du susdit peptide un mécanisme de "démasquage" ou encore d'accessibilité du récepteur (rétro)viral vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval), et, dans le cas où il n'y a pas reconnaissance entre la particule virale recombinante et le récepteur ciblé de la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique N-terminal (amont), se produit un mécanisme de "masquage" ou encore de non accessibilité, par l'intermédiaire du susdit peptide, du récepteur (rétro)viral vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval).
- un domaine protéique du côté C-terminal (en aval) du susdit peptide,
susceptible d'interagir avec le susdit récepteur (rétro)viral, laquelle interaction joue le rôle de mécanisme auxiliaire d'entrée de la particule (rétro)virale dans la cellule eucaryote, le processus d'entrée cellulaire de la particule (rétro)virale recombinante dans la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique C-terminal (aval) ne pouvant avoir lieu que lorsque le domaine protéique N-terminal (amont) a reconnu et lié le récepteur ciblé de la cellule eucaryote avec la particule (rétro)virale recombinante, entraînant par l'intermédiaire du susdit peptide un mécanisme de "démasquage" ou encore d'accessibilité du récepteur (rétro)viral vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval), et, dans le cas où il n'y a pas reconnaissance entre la particule virale recombinante et le récepteur ciblé de la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique N-terminal (amont), se produit un mécanisme de "masquage" ou encore de non accessibilité, par l'intermédiaire du susdit peptide, du récepteur (rétro)viral vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval).
Les glycoprotéines d'enveloppe (rétro)virales sont des trimères d'hétérodimères de sous-unité de surface (SU) et de sous-unité transmembranaire (TM).
Cette notion de trimérisation est fondamentale pour la fonctionnalité de l'enveloppe (rétro)virale. Les glycoprotéines d'enveloppe de l'invention sont avantageusement sous forme trimérique.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le domaine protéique N-terminal (amont) est choisi parmi les polypeptides suivants - anticorps monobrin reconnaissant des molécules de surface cellulaire, - tout ligand pour une molécule de surface cellulaire, notamment hormones polypeptidiques, cytokine, facteurs de croissance.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le domaine protéique C-terminal (aval) correspond à une glycoprotéine d'enveloppe (rétro)virale, essentiellement intacte comportant le domaine naturel de liaison, les fonctions de fusion et d'ancrage de la glycoprotéine d'enveloppe sauvage dont dérive la glycoprotéine d'enveloppe portée par la particule (rétro)virale recombinante.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le peptide provient de la glycoprotéine d'enveloppe des rétrovirus de type C, et en ce que le virus est avantageusement choisi parmi : le virus MLV écotrope, le virus
MLV amphotrope, le virus MLV xénotrope, le virus MLV MCF, le virus
MLV 10A1, GALV (Gibbon Ape Leukemia Virus), SSAV (Simian Sarcoma
Associated Virus), FeLV A, FeLV B, FeLV C (FeLV: Feline Leukemia Virus), et notamment en ce que le peptide est choisi parmi ceux contenant ou étant constitués par l'une des séquences suivantes : PRO (4070A), PRO(MoMLV), #PRO, PRO+, #PRO+ PROss, #PROss.
MLV amphotrope, le virus MLV xénotrope, le virus MLV MCF, le virus
MLV 10A1, GALV (Gibbon Ape Leukemia Virus), SSAV (Simian Sarcoma
Associated Virus), FeLV A, FeLV B, FeLV C (FeLV: Feline Leukemia Virus), et notamment en ce que le peptide est choisi parmi ceux contenant ou étant constitués par l'une des séquences suivantes : PRO (4070A), PRO(MoMLV), #PRO, PRO+, #PRO+ PROss, #PROss.
L'invention a également pour objet des séquences peptidiques choisies parmi celles contenant ou constituées par l'une des séquences suivantes - PRO (4070A), PRO(MoMLV), PROss, PRO+, APRO, APROD, APRO+, - AMOPRO, AMOAPRO, - MOAPRO, MOAAPRO, - EMOPRO, EMOPROss, EMOPRO+, EAPRO, EAPRO13, EAPRO+,
EMOAPRO, EMOAPROss, EMOAPRO +, EAAPRO, EAtPROss, EAAPRO +.
EMOAPRO, EMOAPROss, EMOAPRO +, EAAPRO, EAtPROss, EAAPRO +.
PRO (4070A), PRO(MoMLV), PROss, PRO+, APRO, APRO13, APRO+, sont des peptides masquants/démasquants de l'invention.
AMOPRO, AMO#PRO correspondent à des enveloppes ciblant Ram-1.
MOAPRO, MOA#PRO correspondent à des enveloppes ciblant Rec-1.
EMOPRO, EMOPROss, EMOPRO+, EAPRO, EAPRO13, EAPRO+,
EMOAPRO, EMO#PROss, EMOAPRO +, EAAPRO, EASPROss, EAAPRO + correspondent à des enveloppes ciblant EGFR.
EMOAPRO, EMO#PROss, EMOAPRO +, EAAPRO, EASPROss, EAAPRO + correspondent à des enveloppes ciblant EGFR.
L'invention a également pour objet une séquence polypeptidique contenant un peptide d'environ 10 à environ 200, notamment d'environ 15 à environ 150 acides aminés, et avantageusement d'environ 20, dans lequel 30% au moins des acides aminés sont constitués par des résidus proline, lesquels résidus proline sont régulièrement agencés de manière à induire des repliements de la chaîne polypeptidique à environ 1800 ("ss-turn" ou "reverse-turn"), ces repliements étant régulièrement espacés et s'assemblant en une hélice polyproline à repliement de type ss ("polyproline ss-turn helix"), - un domaine protéique N-terminal (en amont) du susdit peptide, susceptible de réagir avec un récepteur approprié (récepteur ciblé) situé sur une cellule eucaryote, lequel domaine protéique permet de lier spécifiquement une particule (rétro)virale recombinante contenant ledit domaine protéique N-terminal et - un domaine protéique C-terminal (en aval) du susdit peptide, susceptible d'interagir avec un récepteur (rétro)viral auxiliaire approprié (récepteur (rétro)viral) situé sur ladite cellule eucaryote, laquelle interaction joue le rôle de mécanisme auxiliaire d'entrée de la particule (rétro)virale dans ladite cellule eucaryote, le processus d'entrée cellulaire de ladite particule (rétro)virale recombinante dans ladite cellule eucaryote par le biais du domaine protéique C-terminal (aval) ne pouvant avoir lieu que lorsque le domaine protéique N-terminal (amont) a reconnu et lié le récepteur ciblé de la cellule eucaryote avec ladite particule (rétro)virale recombinante, entraînant par l'intermédiaire du susdit peptide un mécanisme de démasquage ou encore d'accessibilité du récepteur (rétro)viral vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval), et, dans le cas où il n'y a pas reconnaissance entre la particule virale recombinante et le récepteur ciblé de la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique N-terminal (amont), se produit un mécanisme de masquage ou encore de non accessibilité, par l'intermédiaire du susdit peptide, du récepteur (rétro)viral vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval).
L'invention concerne également une particule (rétro)virale recombinante susceptible d'infecter une cellule eucaryote, laquelle cellule comporte un récepteur ciblé et un récepteur auxiliaire de la susdite particule (rétro)virale, comprenant une glycoprotéine d'enveloppe substantiellement intacte, notamment sous forme polymérique et avantageusement sous forme trimérique, chaque monomère de la forme polymérique étant avantageusement lui-même sous forme hétérodimère, contenant un peptide d'environ 10 à environ 200, notamment d'environ 15 à environ 150 acides aminés, et avantageusement d'environ 20, dans lequel 30% au moins des acides aminés sont constitués par des résidus proline, lesquels résidus proline sont régulièrement agencés de manière à induire des repliements de la chaîne polypeptidique à environ 1800 ("p-turn" ou "reverse-turn"), ces repliements étant régulièrement espacés et s'assemblant en une hélice polyproline à repliement de type ss ("polyproline p-turn helix"), - un domaine protéique du côté N-terminal (en amont) du susdit peptide, susceptible d'interagir avec le susdit récepteur ciblé, lequel domaine peptidique permet de lier spécifiquement la particule (rétro)virale et - un domaine protéique du côté C-terminal (en aval) du susdit peptide, susceptible d'interagir avec le susdit récepteur (rétro)viral, laquelle interaction joue le rôle de mécanisme auxiliaire d'entrée de la particule (rétro)virale dans la cellule eucaryote, le processus d'entrée cellulaire de la particule (rétro)virale recombinante dans la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique C-terminal (aval) ne pouvant avoir lieu que lorsque le domaine protéique N-terminal (amont) a reconnu et lié le récepteur ciblé de la cellule eucaryote avec la particule (rétro)virale recombinante, entraînant par l'intermédiaire du susdit peptide un mécanisme de masquage ou encore d'accessibilité du récepteur (rétro)viral vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval), et, dans le cas où il n'y a pas reconnaissance entre la particule virale recombinante et le récepteur ciblé de la cellule eucaryote par le biais du do ou encore de non accessibilité, par l'intermédiaire du susdit peptide, du récepteur rétroviral vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval).
L'invention concerne également une particule (rétro)virale recombinante caractérisée en ce que le domaine protéique N-terminal (amont) est choisi parmi les peptides suivants - anticorps monobrin reconnaissant des molécules de surface cellulaire, - tout ligand pour une molécule de surface cellulaire, notamment hormones polypeptidiques, cytokine, facteurs de croissance.
L'invention concerne également une particule (rétro)virale recombinante caractérisée en ce que le domaine protéique C-terminal (aval) correspond à un polypeptide d'origine (rétro)virale comportant les fonctions de liaison, de fusion et d'ancrage de la glycoprotéine d'enveloppe sauvage dont dérive la glycoprotéine d'enveloppe portée par la particule (rétro)virale recombinante, et peut provenir des domaines naturels comportant les fonctions de liaison, de fusion et d'ancrage des glycoprotéines d'enveloppe issues des rétrovirus MLV
A, GALV, FeLVB, ou des virus tels que adénovirus, herpès virus, virus AAV (Adeno Associated Virus), ou plus généralement de glycoprotéines virales issues de virus d'origine eucaryote, notamment orthomyxovirus (tel que virus influenza) ou paramyxovirus (tel que SV5).
A, GALV, FeLVB, ou des virus tels que adénovirus, herpès virus, virus AAV (Adeno Associated Virus), ou plus généralement de glycoprotéines virales issues de virus d'origine eucaryote, notamment orthomyxovirus (tel que virus influenza) ou paramyxovirus (tel que SV5).
L'invention concerne également une particule (rétro)virale recombinante caractérisée en ce que le peptide provient de la glycoprotéine d'enveloppe de rétrovirus de type C, et en ce que le peptide provient avantageusement d'un virus choisi parmi : le virus MLV écotrope, le virus MLV amphotrope, le virus
MLV xénotrope, le virus MLV MCF, le virus MLV 10A1, GALV (Gibbon Ape
Leukemia Virus), SSAV (Simian Sarcoma Associated Virus), FeLV A, FeLV
B, FeLV C (FeLV : Feline Leukemia Virus), et notamment en ce que le peptide est choisi parmi ceux contenant ou étant constitués par l'une des séquences suivantes : PRO (4070A), PRO(MoMLV), APRO, PRO+, APRO+, PRO13, PRO13.
MLV xénotrope, le virus MLV MCF, le virus MLV 10A1, GALV (Gibbon Ape
Leukemia Virus), SSAV (Simian Sarcoma Associated Virus), FeLV A, FeLV
B, FeLV C (FeLV : Feline Leukemia Virus), et notamment en ce que le peptide est choisi parmi ceux contenant ou étant constitués par l'une des séquences suivantes : PRO (4070A), PRO(MoMLV), APRO, PRO+, APRO+, PRO13, PRO13.
L'invention a également pour objet une particule (rétro)virale recombinante caractérisée en ce que - le peptide provient de la glycoprotéine d'enveloppe des rétrovirus de type C, et en ce que le virus est avantageusement choisi parmi : le virus MLV écotrope, le virus MLV amphotrope, le virus MLV xénotrope, le virus MLV MCF, le virus MLV 10A1, GALV (Gibbon Ape Leukemia Virus), SSAV (Simian
Sarcoma Associated Virus), FeLV A, FeLV B, FeLV C (FeLV: Feline
Leukemia Virus), et notamment en ce que le peptide est choisi parmi ceux contenant ou étant constitués par l'une des séquences suivantes : PRO (4070A),
PRO(MoMLV), APRO, PRO+, APRO+, PRO13, APRO13, - le domaine protéique N-terminal (amont) est choisi parmi les peptides suivants:
* anticorps monobrin reconnaissant des molécules de surface cellulaire,
* tout ligand pour une molécule de surface cellulaire, notamment
hormones polypeptidiques, cytokine, facteurs de croissance, - le domaine protéique C-terminal correspond à un polypeptide d'origine (rétro)virale comportant les fonctions de liaison, de fusion et d'ancrage de la glycoprotéine d'enveloppe sauvage dont dérive la glycoprotéine d'enveloppe portée par la particule (rétro)virale recombinante, et peut provenir des domaines naturels comportant les fonctions de liaison, de fusion et d'ancrage des glycoprotéines d'enveloppe issues des rétrovirus
MLV-A, GALV, FeLVB, ou des virus tels que adénovirus, herpès virus, virus
AAV (Adeno Associated Virus), ou plus généralement de glycoprotéines virales issues de virus d'origine eucaryote, notamment orthomyxovirus (tel que virus influenza) ou paramyxovirus (tel que SV5).
Sarcoma Associated Virus), FeLV A, FeLV B, FeLV C (FeLV: Feline
Leukemia Virus), et notamment en ce que le peptide est choisi parmi ceux contenant ou étant constitués par l'une des séquences suivantes : PRO (4070A),
PRO(MoMLV), APRO, PRO+, APRO+, PRO13, APRO13, - le domaine protéique N-terminal (amont) est choisi parmi les peptides suivants:
* anticorps monobrin reconnaissant des molécules de surface cellulaire,
* tout ligand pour une molécule de surface cellulaire, notamment
hormones polypeptidiques, cytokine, facteurs de croissance, - le domaine protéique C-terminal correspond à un polypeptide d'origine (rétro)virale comportant les fonctions de liaison, de fusion et d'ancrage de la glycoprotéine d'enveloppe sauvage dont dérive la glycoprotéine d'enveloppe portée par la particule (rétro)virale recombinante, et peut provenir des domaines naturels comportant les fonctions de liaison, de fusion et d'ancrage des glycoprotéines d'enveloppe issues des rétrovirus
MLV-A, GALV, FeLVB, ou des virus tels que adénovirus, herpès virus, virus
AAV (Adeno Associated Virus), ou plus généralement de glycoprotéines virales issues de virus d'origine eucaryote, notamment orthomyxovirus (tel que virus influenza) ou paramyxovirus (tel que SV5).
L'invention concerne également une particule (rétro)virale recombinante caractérisée en ce que l'extrémité 5' de la séquence nucléotidique codant pour le domaine protéique N-terminal (amont) est contiguë à l'extrémité 3' de la séquence nucléotidique codant pour le peptide signal, l'extrémité 3' de la séquence nucléotidique codant pour le domaine protéique N-terminal (amont) est contiguë à l'extrémité 5' de la séquence nucléotidique codant pour le peptide, l'extrémité 3' de la séquence nucléotidique codant pour le peptide est contiguë à l'extrémité 5' de la séquence nucléotidique codant pour le domaine protéique
C-terminal (aval).
C-terminal (aval).
L'invention a également pour objet un acide nucléique codant pour un peptide ou pour une particule recombinante selon l'invention.
L'invention a également pour objet une méthode de transfert sélective in vitro ou ex vivo d'un acide nucléique dans des cellules eucaryotes cibles présentes parmi d'autres cellules non-cibles, comprenant l'administration aux cellules cibles et non-cibles d'une particule recombinante (rétro)virale selon l'invention, contenant l'acide nucléique à transférer.
L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique contenant à titre de substance active une particule (rétro)virale selon l'invention, et contenant également un gène à transférer, en association avec un véhicule pharmaceutique physiologiquement approprié.
S'agissant des gènes à transférer importants pour la thérapie génique, il s'agit par exemple de IFN, IL2, p53, VEGF, TNF, CFTR, HSV-TK, lacZ,
GFP, gène de cytokines diverses, autres types de gènes suicides y compris gènes de suicide conditionnels, autres gènes à activité antivirale, autres gènes à activité antitumorale, autres gènes marqueurs et tout gène thérapeutique de maladie mono- ou multi-génique. A titre d'exemple, les pathologies les plus spécifiquement concernées sont : la plupart des maladies mono- ou multigénique (mucovisidose, myopathie, maladies lysosomales, les formes diverses de cancer, les maladies virales (SIDA), ...).
GFP, gène de cytokines diverses, autres types de gènes suicides y compris gènes de suicide conditionnels, autres gènes à activité antivirale, autres gènes à activité antitumorale, autres gènes marqueurs et tout gène thérapeutique de maladie mono- ou multi-génique. A titre d'exemple, les pathologies les plus spécifiquement concernées sont : la plupart des maladies mono- ou multigénique (mucovisidose, myopathie, maladies lysosomales, les formes diverses de cancer, les maladies virales (SIDA), ...).
Pour bien comprendre le mécanisme de l'invention (voir figure 1), il faut considérer que les glycoprotéines d'enveloppe selon l'invention (également désignées par "enveloppes chimères") possèdent, outre un domaine de reconnaissance additionnel, les fonctions correspondant à leurs domaines propres ; c'est-à-dire (voir figure 2),
1) le domaine de liaison naturel situé dans la partie N-terminale de la sousunité de surface (SU) de la glycoprotéine d'enveloppe sauvage, et donc, juste en aval du domaine de liaison surnuméraire et
2) le domaine de fusion localisé dans la partie C-terminale de la sous-unité (SU) et dans la sous-unité transmembranaire (TM) du complexe de glycoprotéine d'enveloppe. Pour les enveloppes chimères construites précédemment (enveloppes EMO et AMO, par exemple) en s'appuyant sur la structure générale schématisée en Figure 2, le domaine de liaison naturel est fonctionnel. Si le récepteur rétroviral qu'il reconnaît est exprimé à la surface de la cellule cible, alors ce domaine le reconnaîtra, et permettra le poursuite de l'infection. Il n'y aura alors pas de possibilité de ciblage spécifique, même si une molécule de surface reconnaissant spécifiquement le domaine de liaison surnuméraire est aussi exprimée.
1) le domaine de liaison naturel situé dans la partie N-terminale de la sousunité de surface (SU) de la glycoprotéine d'enveloppe sauvage, et donc, juste en aval du domaine de liaison surnuméraire et
2) le domaine de fusion localisé dans la partie C-terminale de la sous-unité (SU) et dans la sous-unité transmembranaire (TM) du complexe de glycoprotéine d'enveloppe. Pour les enveloppes chimères construites précédemment (enveloppes EMO et AMO, par exemple) en s'appuyant sur la structure générale schématisée en Figure 2, le domaine de liaison naturel est fonctionnel. Si le récepteur rétroviral qu'il reconnaît est exprimé à la surface de la cellule cible, alors ce domaine le reconnaîtra, et permettra le poursuite de l'infection. Il n'y aura alors pas de possibilité de ciblage spécifique, même si une molécule de surface reconnaissant spécifiquement le domaine de liaison surnuméraire est aussi exprimée.
Cependant, en fonction du peptide inséré entre le domaine de liaison surnuméraire et le domaine de liaison naturel, il est possible de moduler fortement la fonctionnalité du domaine de liaison naturel et, dans le cas de certains de ces peptides, d'empêcher efficacement son accessibilité pour la reconnaissance du récepteur rétroviral (première action). Ce même domaine pourra être démasqué, et donc devenir accessible à une interaction avec le récepteur rétroviral normal, si et seulement si le domaine de liaison surnuméraire a préalablement interagi avec la molécule de surface ciblée. Cette deuxième action est également médiée par le peptide séparant les deux domaines. Le récepteur rétroviral normal joue ici le rôle de molécule auxiliaire.
Légende des figures
- la Figure 1 représente le processus d'entrée en deux étapes de la particule virale ciblante. Les particules virales sont générées (A) avec des glycoprotéines d'enveloppes ciblantes composées d'un domaine N-terminal (ligand, anticorps monobrin, etc), du peptide masquant/démasquant, et d'un domaine C-terminal (B). Les étapes donnant lieu à l'introduction du virion dans la cellule ciblée font intervenir un mécanisme coordonné par le peptide masquant/démasquant (C).
- la Figure 1 représente le processus d'entrée en deux étapes de la particule virale ciblante. Les particules virales sont générées (A) avec des glycoprotéines d'enveloppes ciblantes composées d'un domaine N-terminal (ligand, anticorps monobrin, etc), du peptide masquant/démasquant, et d'un domaine C-terminal (B). Les étapes donnant lieu à l'introduction du virion dans la cellule ciblée font intervenir un mécanisme coordonné par le peptide masquant/démasquant (C).
- la Figure 2 est une représentation schématique de certaines des enveloppes ciblantes étudiées. La position de quelques régions fonctionnelles est montrée. Flèches verticales: sites des clivage protéolytique. SU: sous-unité de surface, TM: sous-unité de transmembrane, SP: peptide signal, PRO: région poly-proline, T: domaine transmembranaire, Ram-1 ligand: domaine de liaison pour le récepteur amphotrope, Rec-1 ligand: domaine de liaison pour le récepteur écotrope, EGF: facteur de croissance épidermique ("epidermal growth factor"). Boites gris foncé: séquence dérivées du gène env de MoMLV, Boites gris clair: séquence dérivées du gène env de MLV-4070A, Boites blanches: autres séquences dérivées des MLV. Boites noires: peptides espaceurs dérivés de la région poly-proline. Tous les gènes env sont exprimés à partir du même promoteur (LTR) et signal de polyadenylation (pA) à partir du ARNm sousgénomique utilisant les sites d'épisage rétroviraux, donneur (SD) et accepteur (SA), avec une séquence intronique identique de 190 nts contenant la fin du gène pol (APOL). La position de certains sites de restriction est représentée.
- la Figure 3 représente la séquence des peptides espaceurs et des domaines de liaison étudiés. (A) Séquence des peptides espaceurs dans la série
AMO. AS208 et fusionnés avec les divers peptides espaceurs, et l'ensemble est fusionné avec le codon 7 de la SU de l'enveloppe du MoMLV. (B) Séquence des peptides espaceurs dans la série MOA. Le domaine de liaison à Rec-1 est fusionné avec les divers peptides espaceurs, et l'ensemble est fusionné avec le codon 5 de la SU de l'enveloppe du MLV-Amphotrope. (C) Séquence des peptides espaceurs dans la série EMO et EA. Le domaine de liaison EGF est fusionné avec les divers peptides espaceurs, et l'ensemble est fusionné avec le codon 5 de la SU de l'enveloppe du MLV-Amphotrope ou avec le codon 7 de la
SU de l'enveloppe du MoMLV.
AMO. AS208 et fusionnés avec les divers peptides espaceurs, et l'ensemble est fusionné avec le codon 7 de la SU de l'enveloppe du MoMLV. (B) Séquence des peptides espaceurs dans la série MOA. Le domaine de liaison à Rec-1 est fusionné avec les divers peptides espaceurs, et l'ensemble est fusionné avec le codon 5 de la SU de l'enveloppe du MLV-Amphotrope. (C) Séquence des peptides espaceurs dans la série EMO et EA. Le domaine de liaison EGF est fusionné avec les divers peptides espaceurs, et l'ensemble est fusionné avec le codon 5 de la SU de l'enveloppe du MLV-Amphotrope ou avec le codon 7 de la
SU de l'enveloppe du MoMLV.
- la Figure 4 représente la détection de l'expression membranaire des enveloppes de la série EMO. Des populations de cellules transfectées et sélectionnées à la phléomycine sont marquées avec (histogrammes noirs) ou sans (histogrammes blancs) anticorps anti-hEGF, puis avec des anticorps anti-IgG de souris couplés à la FITC.
- la Figure 5 représente l'expression et l'incorporation virale des enveloppes chimères de la série AMO. Immunoblots sur des lysats de cellules
TELCeB6 transfectées par les plasmides exprimant les enveloppes chimères (voir Figure 2 et Figure 3A) et sur des culots de particules virales purifiées par ultracentrifugation. Les immunoblots sont révélés avec un anti-sérum anti-SU (partie haute) ou avec un anti-sérum anti-p30-CA (partie basse, taille inférieure à 46 KD). Les positions de la p30-CA (CA), et, pour les enveloppes sauvages
MO, du précurseur (PR) et de la protéine surface (SU) du complexe d'enveloppe sont représentées.
TELCeB6 transfectées par les plasmides exprimant les enveloppes chimères (voir Figure 2 et Figure 3A) et sur des culots de particules virales purifiées par ultracentrifugation. Les immunoblots sont révélés avec un anti-sérum anti-SU (partie haute) ou avec un anti-sérum anti-p30-CA (partie basse, taille inférieure à 46 KD). Les positions de la p30-CA (CA), et, pour les enveloppes sauvages
MO, du précurseur (PR) et de la protéine surface (SU) du complexe d'enveloppe sont représentées.
- la Figure 6 représente les tests de liaison sur cellules humaines des enveloppes de la série EMO (A) et AMO (B). Le bruit de fond de fluorescence est fourni par incubation des cellules humaines avec l'enveloppe écotrope (histogrammes blancs),
- la Figure 7 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de PRO(4070A).
- la Figure 7 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de PRO(4070A).
- la Figure 8 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de PRO(MoMLV) .
- la Figure 9 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de PRO13(MoMLV).
- la Figure 10 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de
PRO + (4070A).
PRO + (4070A).
- la Figure 11 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de APRO.
- la Figure 12 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de APRO13.
- la Figure 13 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de Pro + .
- la Figure 14 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de
AMOPRO.
AMOPRO.
- la Figure 15 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de AMOAPRO.
- la Figure 16 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de
MOAPRO.
MOAPRO.
- la Figure 17 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de MOAAPRO.
- la Figure 18 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de
EMOPRO.
EMOPRO.
- la Figure 19 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de EMOPRO13.
- la Figure 20 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de
EMOPRO + .
EMOPRO + .
- la Figure 21 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de
EAPRO.
EAPRO.
- la Figure 22 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de EAPRO13.
- la Figure 23 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de
EAPRO+.
EAPRO+.
- la Figure 24 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de EMOAPRO.
- la Figure 25 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de EMOAPRO13.
- la Figure 26 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de EMOAPRO +.
- la Figure 27 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de EAAPRO.
- la Figure 28 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de EAAPRO13.
- la Figure 29 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de EAAPRO+.
EXEMPLES:
Les rétrovirus utilisent un certain nombre de molécules de surface cellulaire, appelées récepteurs viraux, pour initier le processus infectieux (23).
Les rétrovirus utilisent un certain nombre de molécules de surface cellulaire, appelées récepteurs viraux, pour initier le processus infectieux (23).
Sauf exceptions notables, cas des virus de 1' immunodéficience humaine notamment, la plupart des récepteurs utilisés par les autres rétrovirus et en particulier les rétrovirus mammifères de type C sont distribués sur la plupart des types cellulaires de l'organisme hôte. Par exemple le virus de leucémie murine amphotrope (MLV-A) est capable d'infecter la plupart des cellules mammifères car son récepteur, le transporteur de phosphate Ram- 1, est exprimé sur quasiment toutes les cellules.
Les rétrovirus mammifères de type C sont couramment utilisés pour faire des vecteurs rétroviraux, en particulier à des fins de transfert de gène chez l'homme, en thérapie génique. Certains protocoles de thérapie géniques seraient facilités si les vecteurs rétroviraux étaient capables de reconnaître très précisément les réelles cellules cibles du transfert de gène. Pour cela, un certain nombre de groupes de recherche, dont le nôtre, ont développé des stratégies diverses visant à modifier la reconnaissance entre la particule virale et la surface cellulaire. Cette interaction implique essentiellement la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale; il paraît donc logique de réaliser des modifications génétiques sur cette protéine afin de lui permettre de reconnaître des molécules de surface cellulaire spécifiquement exprimées sur les cellules cibles du transfert de gène.
Deux types de stratégies permettant de telles modifications ont été récemment développés. Dans une première stratégie, c'est le domaine de liaison naturel de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale pour son récepteur qui a été modifié par insertion ou substitution de peptides de tailles réduites capables de lier une molécule de surface cellulaire. Ces travaux ont permis de démontrer la faisabilité du ciblage cellulaire du transfert de gène (20).
Dans une deuxième approche, des polypeptides (ligands, anticorps monobrins) capables de lier des molécules de surface cellulaire diverses ont été insérés à l'extrémité N-terminale de la sous-unité SU de la glycoprotéine d'enveloppes (6) (10) (13) (15) (21). D'une manière générale, I'étude des virions générés avec ces divers types d'enveloppes ciblantes a montré qu'il était possible de rediriger spécifiquement et efficacement la liaison des particules virales vers de nouvelles molécules de surface. Certains facteurs qui limitent l'efficacité du ciblage ont été également identifiés. Le premier semble dépendre de propriétés physiologiques de la molécule de surface ciblée (dimérisation, internalisation, processus de transport ("trafficking") intracellulaire) (6), le deuxième est lié à la faible fusiogénicité intrinsèque des glycoprotéines d'enveloppes chimères générées par insertion N terminale de ligands (6) (21). Il a été observé que cette faible fusiogénicité peut être partiellement surmontée en introduisant un peptide espaceur entre le nouveau domaine de liaison et l'enveloppe (21). Cependant, les meilleurs titres infectieux obtenus sont 100 fois inférieurs à ceux que l'on peut obtenir avec des vecteurs rétroviraux portant une enveloppe sauvage. De plus, il est possible que ces résultats acquis dans un modèle de ciblage particulier (ciblage de Ram-1), ne puisse être étendu à d'autres types de glycoprotéines d'enveloppes ciblantes. Il paraissait donc essentiel de développer des stratégies alternatives pour répondre aux problèmes évoqués.
Par ailleurs, une constatation générale faite avec les glycoprotéines d'enveloppes ciblantes générées par insertions N terminales est que le domaine de liaison naturel de l'enveloppe support est toujours fonctionnel. Dans la mesure où les cellules cibles sont des cellules humaines en thérapie génique, cette fonctionnalité du domaine de liaison naturel ne pose pas de problèmes de "bruit de fond" d'infection car on utilise, comme glycoprotéine support, l'enveloppe écotrope du virus MoMLV qui ne reconnaît pas de récepteur sur les cellules des mammifères supérieurs. Cependant, il a paru intéressant de caractériser ces glycoprotéines d'enveloppes chimères capables de reconnaître deux molécules de surface différentes, de voir quelle pouvait etre l'influence du peptide espaceur dans cette reconnaissance, et d'estimer les contributions relatives des deux types d'interaction dans le processus infectieux.
Ces observations, qui font l'objet des travaux décrits ci-dessous, ont conduit à développer une stratégie de ciblage en deux étapes qui fait d'abord intervenir une reconnaissance spécifique entre le ligand inséré à l'extrémité Nterminale de la glycoprotéine ciblante, et ensuite un mécanisme auxiliaire permettant de faciliter l'entrée du virus spécifiquement lié à la bonne cible cellulaire par le biais du récepteur rétroviral naturel. Pour éviter tout problème de bruit de fond d'infection lié à l'interaction directe entre le domaine naturel de liaison et le récepteur rétroviral naturel, des peptides espaceurs masquant/démasquant ont également été développés, insérés entre le domaine ciblant et la glycoprotéine d'enveloppe support, et qui sont capables de masquer le domaine de liaison naturel tant que la particule virale n'a pas interagi avec la molécule de surface ciblée. La réalisation de cette interaction induit le démasquage du domaine de liaison naturel et l'interaction entre le domaine naturel de liaison et le récepteur rétroviral naturel (mécanisme auxiliaire) qui prend alors le relais pour introduire le virus dans la cellule.
Matériels et Méthodes : Lignées cellulaires.
La lignée cellulaire TELCeB6 (7) dérive de la lignée TELacZ (19) par transfection et sélection clonale des cellules exprimant les protéines gag et pol de MoMLV (Moloney Murine Leukemia Virus : Virus de la leucémie murine
Moloney). Les cellules TELacZ expriment le vecteur rétroviral MFGnlslacZ capable de transduire une ss-galactosidase nucléaire. Les cellules TELCeB6 permettent la production de capsides rétrovirales (non infectieuses car dépourvues d'enveloppes) véhiculant le vecteur rétroviral marqueur nlsLacZ.
Moloney). Les cellules TELacZ expriment le vecteur rétroviral MFGnlslacZ capable de transduire une ss-galactosidase nucléaire. Les cellules TELCeB6 permettent la production de capsides rétrovirales (non infectieuses car dépourvues d'enveloppes) véhiculant le vecteur rétroviral marqueur nlsLacZ.
Les cellules A431 (ATCC CRL1555) et TE671 (ATCC CRL8805) sont cultivées en milieu DMEM (Gibco-BRL) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (Gibco-BRL). Les cellules CHO, CERD9 (9), et CEAR13 (9) sont cultivées en milieu DMEM (Gibco-BRL) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal et proline (Gibco-BRL). Les lignées cellulaires NIH-3T3 et dérivées de NIH-3T3 sont cultivées en milieu DMEM (Gibco-BRL) supplémenté par 10% de sérum de veau nouveau né (Gibco-BRL).
Enveloppes chimères.
Les fragments ADN codant pour les polypeptides reconnaissant soit EGFR (Récepteur à l'EGF) soit Ram-l (Récepteur MLV-A) ont été générés après PCR (polymerase chain reaction) par utilisation d'oligonucléotides comprenant des sites de restrictions. Ces polypeptides ont été introduits en N-terminal de la protéine SU de MLV (protéine de Surface gp70) dans laquelle les sites de restrictions SfiI et NotI ont été créés au codon +6 (33). Un diagramme schématique des différents gènes env utilisés dans cet article est rapporté en
Figure 2. Brièvement, un fragment ADN dérivé d'une amplification PCR, codant pour les 53 acides aminés de l'EGF humain (3) a été généré en utilisant une matrice ADNc (ATCC 59957) et deux oligonucléotides: OUEGF:
(5' > ATGCTCAGAGGGGTCAGTACGGCCCAGCCGGCCATGGCCAA
TAGTGACTCTGAATGTCC)
avec un site de restriction SfiI et OLEGF:
(5' > ACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCGCGGCCGCATGTGGGGGT
CCAGACTCC)
comprenant un site NotI. Après digestion par SfiI et NotI, ces fragments ont été clonés dans un gène codant soit pour la protéine SU de MoMLV dans le cas de la protéine chimère EMO, soit SU du virus 4070A pour la protéine chimère EA (6).
Figure 2. Brièvement, un fragment ADN dérivé d'une amplification PCR, codant pour les 53 acides aminés de l'EGF humain (3) a été généré en utilisant une matrice ADNc (ATCC 59957) et deux oligonucléotides: OUEGF:
(5' > ATGCTCAGAGGGGTCAGTACGGCCCAGCCGGCCATGGCCAA
TAGTGACTCTGAATGTCC)
avec un site de restriction SfiI et OLEGF:
(5' > ACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCGCGGCCGCATGTGGGGGT
CCAGACTCC)
comprenant un site NotI. Après digestion par SfiI et NotI, ces fragments ont été clonés dans un gène codant soit pour la protéine SU de MoMLV dans le cas de la protéine chimère EMO, soit SU du virus 4070A pour la protéine chimère EA (6).
Pour la construction AMO (6), un site NotI a été créé à la fin du domaine de reconnaissance du récepteur dans l'enveloppe 4070A (appelé AS208), (2), et le nucléotide (nt) 750 (14) en utilisant un fragment PCR généré à partir du site
XhoI (nt 594) jusqu'au nt 750 avant la région riche en proline, grâce à deux oligonucléotides: 805FC (5' > TCCAATTCCTTCCAAGGGGC) en amont de
XhoI et 806FC (5' > ACCCCCACATGCGGCCGCTCCCACATTAAGGACCTGCCG) comprenant un site de restriction NotI. L'enveloppe chimère est constituée par clonage du fragment PCR XhoI/NotI et du fragment NotI/ClaI, isolé à partir du gène env EMO (codant pour les protéines SU et TM- P1SE Transmembranaire de MoMLV), entre les sites XhoI/ClaI du gène env 4070A MLV.
XhoI (nt 594) jusqu'au nt 750 avant la région riche en proline, grâce à deux oligonucléotides: 805FC (5' > TCCAATTCCTTCCAAGGGGC) en amont de
XhoI et 806FC (5' > ACCCCCACATGCGGCCGCTCCCACATTAAGGACCTGCCG) comprenant un site de restriction NotI. L'enveloppe chimère est constituée par clonage du fragment PCR XhoI/NotI et du fragment NotI/ClaI, isolé à partir du gène env EMO (codant pour les protéines SU et TM- P1SE Transmembranaire de MoMLV), entre les sites XhoI/ClaI du gène env 4070A MLV.
Les constructions résultantes sont récupérées sous la forme d'un fragment
BglII/ClaI (correspondant aux positions 5408 et 7676 dans MoMLV) et clonées aux sites BamHI et ClaI d'un plasmide d'expression FBMOSALF (7) dans lequel un gène marqueur de sélection (8) fusionnés au séquences de polyadénylation du gène PGK (phospho-glycerate kinase) a été introduit en aval de la LTR 3' du virus MLV-C57.
BglII/ClaI (correspondant aux positions 5408 et 7676 dans MoMLV) et clonées aux sites BamHI et ClaI d'un plasmide d'expression FBMOSALF (7) dans lequel un gène marqueur de sélection (8) fusionnés au séquences de polyadénylation du gène PGK (phospho-glycerate kinase) a été introduit en aval de la LTR 3' du virus MLV-C57.
Pour EMO, EA, ou AMO, le nouveau domaine de reconnaissance a été séparé du reste de l'enveloppe MLV par un peptide espaceur constitué par trois alanines, apporté par le site de clonage NotI (15). Dans trois autres séries d'enveloppes ciblantes (dérivées des enveloppes EMO, EA ou AMO), des acides aminés espaceurs ont été introduits soit après le domaine de reconnaissance de EGFR (EGF), soit après le domaine de reconnaissance de
Ram-1 (AS208) comme décrit ci-après.
Ram-1 (AS208) comme décrit ci-après.
La série d'enveloppes ciblant Ram-1 a été générée en introduisant différents espaceurs entre le domaine de reconnaissance de Ram-1 et l'enveloppe
MoMLV (Figure 3A). Pour AMOPRO, une région de 59 acides aminés riche en proline provenant de la SU 4070A (amphotrope) (nucléotides 751 à 927) (14) a été utilisée. Une plus courte région riche en proline également isolée à partir de l'enveloppe MLV 4070A (nt 751-789) a été utilisée pour AMOAPRO. Cette région correspond à l'espaceur de 13 acides aminés du produit v-mpl (provenant du virus de la leucémie myeloprolifératrice) (18) localisé entre sa région dérivée de env et l'équivalent du gène cellulaire mpl.
MoMLV (Figure 3A). Pour AMOPRO, une région de 59 acides aminés riche en proline provenant de la SU 4070A (amphotrope) (nucléotides 751 à 927) (14) a été utilisée. Une plus courte région riche en proline également isolée à partir de l'enveloppe MLV 4070A (nt 751-789) a été utilisée pour AMOAPRO. Cette région correspond à l'espaceur de 13 acides aminés du produit v-mpl (provenant du virus de la leucémie myeloprolifératrice) (18) localisé entre sa région dérivée de env et l'équivalent du gène cellulaire mpl.
Dans le cas de AMO1, les 208 premiers acides aminés, dérivés de l'enveloppe de MLV 4070A, ont été fusionnés à l'acide aminé 1 de la SU de
MoMLV. Pour AMO1Fx, un site de 4 acides aminés correspondant au site de clivage du facteur de coagulation sanguine Xa (Ile-Glu-Gly-Arg) (12) a été inséré après le domaine de reconnaissance de Ram-1 et fusionné au codon +1 de la SU de MoMLV. La stratégie utilisée pour ces constructions est décrite ci avant. Brièvement, un oligonucléotide (5' -TCCAATTCCTTCCAAGGGGC-3'), localisé juste en amont du site XhoI du gène env de 4070A (nt 594) a été utilisé en combinaison avec soit l'un ou l'autre des deux oligonucléotides suivants apportant le site Notl:
5' -AGTATGCGGCCGCTGGGGGTGGCTGTGGGACAC-3 'et
5' -TATCTGCGGCCGCGTCGGGTAATACTGGGTTGG-3'
afin de générer par PCR, en utilisant une matrice env 4070A, des fragments 3' pour les enveloppes AMOPRO et AMOAPRO respectivement.
MoMLV. Pour AMO1Fx, un site de 4 acides aminés correspondant au site de clivage du facteur de coagulation sanguine Xa (Ile-Glu-Gly-Arg) (12) a été inséré après le domaine de reconnaissance de Ram-1 et fusionné au codon +1 de la SU de MoMLV. La stratégie utilisée pour ces constructions est décrite ci avant. Brièvement, un oligonucléotide (5' -TCCAATTCCTTCCAAGGGGC-3'), localisé juste en amont du site XhoI du gène env de 4070A (nt 594) a été utilisé en combinaison avec soit l'un ou l'autre des deux oligonucléotides suivants apportant le site Notl:
5' -AGTATGCGGCCGCTGGGGGTGGCTGTGGGACAC-3 'et
5' -TATCTGCGGCCGCGTCGGGTAATACTGGGTTGG-3'
afin de générer par PCR, en utilisant une matrice env 4070A, des fragments 3' pour les enveloppes AMOPRO et AMOAPRO respectivement.
Ces fragments PCR ont été soumis à une digestion par XhoI et NotI et clonés dans le plasmide FBAMOSALF ouvert en XhoI/NotI, un plasmide exprimant une enveloppe de type AMO. Les plasmides exprimant les enveloppes
AMOFx, AMO1 et AMOîFx ont été générées par clonage du fragment
NdeI/NotI de FBAMOSALF (comprenant le domaine de reconnaissance Ram-1) dans une série de plasmides (13) exprimant les enveloppes MoMLV modifiées afin de créer un site NotI au codon 1 ou au codon 6 avec (AMO1Fx, AMOFx) ou sans (AMO1) la séquence Xa. Des enveloppes dérivées de AMO et contenant d'autres types de peptides espaceurs ont été construits. L'ensemble de ces peptides espaceurs est représenté en Figure 3A.
AMOFx, AMO1 et AMOîFx ont été générées par clonage du fragment
NdeI/NotI de FBAMOSALF (comprenant le domaine de reconnaissance Ram-1) dans une série de plasmides (13) exprimant les enveloppes MoMLV modifiées afin de créer un site NotI au codon 1 ou au codon 6 avec (AMO1Fx, AMOFx) ou sans (AMO1) la séquence Xa. Des enveloppes dérivées de AMO et contenant d'autres types de peptides espaceurs ont été construits. L'ensemble de ces peptides espaceurs est représenté en Figure 3A.
Les enveloppes MOAPRO et MOAAPRO ont été générées selon une méthode similaire à celle des enveloppes AMOPRO et AMOAPRO. Le plasmide
FBEASALF, exprimant les enveloppes EA a été ouvert en NdeI/NotI. Cet ADN a été utilisé pour cloner deux fragments: le fragment 5' NdeI/BamHI provenant de la digestion du plasmide FBMOSALF (exprimant les enveloppes MO, écotropes) et contenant outre la LTR5' et la séquence rétrovirale leader, l'extrémité N-terminale du gène env du virus MoMLV (position 6565), (17).
FBEASALF, exprimant les enveloppes EA a été ouvert en NdeI/NotI. Cet ADN a été utilisé pour cloner deux fragments: le fragment 5' NdeI/BamHI provenant de la digestion du plasmide FBMOSALF (exprimant les enveloppes MO, écotropes) et contenant outre la LTR5' et la séquence rétrovirale leader, l'extrémité N-terminale du gène env du virus MoMLV (position 6565), (17).
Des fragments 3' ont été générés par PCR en utilisant comme matrice le gène env de MoMLV, comme oligonucléotide 5'(5'-ACTGGGGCTTACGTTTGT-3') en amont du site BamHI, et comme oligonucléotide 3' (5'-TATGTGCGGCCGCCGGTGGAAGTTGGGTAGGGG-3') ou (5 '-TATGTGCGGCCGCGTCTGGCAGAACGGGGTTTGG-3') pour construire les enveloppes MOAPRO et MOAAPRO, respectivement. Ces fragments de PCR ont été digérés par BamHI et NotI, et co-ligués avec le fragment 5'. La séquence des peptides espaceurs pour ces deux constructions est représentée dans la Figure 3B.
FBEMOSALF, exprimant les enveloppes chimères EMO (6), a été soumis à une digestion par BssHII, un remplissage par l'enzyme Klenow et digestion par NdeI. Le fragment résultant de 1,8 Kb, comprenant la LTR5', la séquence leader, la fin du gène pol et EGF humain, a été isolé et inséré soit dans FBAMOAPROSALF soit FBAMOPROSALF (plasmides exprimant respectivement les enveloppes chimères AMOAPRO et AMOPRO) dans lesquels le fragment NdeI/EcoRI a été éliminé et le site EcoRI rempli afin de générer les plasmides exprimant les enveloppes EMOAPRO + et EMOPRO +, respectivement. Des plasmides exprimant les enveloppes EMO1, EMOlFx ont d'autre part été générés. La séquence des peptides espaceurs pour ces deux constructions est représentée dans la Figure 3C.
Les plasmides exprimant les enveloppes EAPRO+ et EAAPRO+ ont été générés par remplacement du fragment SfiI/Not du plasmide FBEASALF par les fragments SfiI/NotI issus des plasmides exprimant les enveloppes EMOPRO + et EMOAPRO +.
Enfin pour ces diverses enveloppes EMODPRO +, EMOPRO +,
EAPRO + et EAAPRO les peptides espaceurs ont été réduits dans leur partie
N-terminale. Pour cela, un fragment d'ADN a été généré par PCR en utilisant comme matrice le gène EMO, oligonucléotide 5' (5' -ACCATCCTCTAGACGGACATG-3 ') en amont du site XbaI précédant le codon initiateur et comme oligonucléotide 3' (5 '-TATCAGGATCCCAAATGTAAGCCCTGGATCGCGCAGTTCCCACC ACTTCAGGTCTCGGTACTGAC-3') contenant un site BamHI. Cet ADN a été digéré par XbaI/BarnHI et cloné dans l'un ou l'autre des plasmides exprimant les enveloppes EMOPRO+ ou EMOA
PRO +, préalablement débarrassés des 1 mM. Après centrifugation 10 min à 10 000 g, afin de culotter les noyaux cellulaires, les surnageants sont congelés à -70 C jusqu'à analyse. Ces échantillons viraux sont obtenus par ultracentrifugation des surnageants viraux (10 ml) dans un rotor SW41 Beckman (30 000 rpm, 1h à 4"C). Les culots sont resuspendus dans 100 ml de PBS (Phosphate Buffered saline) et congelés à 70"C. Les échantillons (30 mg de lysats cellulaires ou 10 ml de virus purifiés) sont mélangés avec un ratio de 5:1 à du tampon 375 mM Tris-HCl (pH 6,8) contenant SDS 6%, b-mercaptoéthanol 30%, glycérol 10% et bleu de bromophénol 0,06%, puis bouillis 3 min et analysés sur gels d'acrylamide 10%/SDS. Après transfert des protéines sur membrane de nitrocellulose; le marquage immunologique est effectué dans du TBS (Tris base Saline, pH 7,4) en présence de lait écrémé 5% et du tween 0,1 % . Des anticorps (Quality
Biotech Inc, USA) provenant d'anti-sérum de chèvre, dirigés contre gp70-SU de
RLV (Rauscher Leukemia Virus) ou p30 de RLV ont été utilisés à la dilution 1:1000 ou 1/10000 respectivement. Les blots ont été révélés par utilisation d'un anticorps conjugué d'origine lapin dirigés contre les Immunoglobulines de chèvres (DAKO, UK) grâce à un kit électrochemoluminescence (Amersham Life
Science).
EAPRO + et EAAPRO les peptides espaceurs ont été réduits dans leur partie
N-terminale. Pour cela, un fragment d'ADN a été généré par PCR en utilisant comme matrice le gène EMO, oligonucléotide 5' (5' -ACCATCCTCTAGACGGACATG-3 ') en amont du site XbaI précédant le codon initiateur et comme oligonucléotide 3' (5 '-TATCAGGATCCCAAATGTAAGCCCTGGATCGCGCAGTTCCCACC ACTTCAGGTCTCGGTACTGAC-3') contenant un site BamHI. Cet ADN a été digéré par XbaI/BarnHI et cloné dans l'un ou l'autre des plasmides exprimant les enveloppes EMOPRO+ ou EMOA
PRO +, préalablement débarrassés des 1 mM. Après centrifugation 10 min à 10 000 g, afin de culotter les noyaux cellulaires, les surnageants sont congelés à -70 C jusqu'à analyse. Ces échantillons viraux sont obtenus par ultracentrifugation des surnageants viraux (10 ml) dans un rotor SW41 Beckman (30 000 rpm, 1h à 4"C). Les culots sont resuspendus dans 100 ml de PBS (Phosphate Buffered saline) et congelés à 70"C. Les échantillons (30 mg de lysats cellulaires ou 10 ml de virus purifiés) sont mélangés avec un ratio de 5:1 à du tampon 375 mM Tris-HCl (pH 6,8) contenant SDS 6%, b-mercaptoéthanol 30%, glycérol 10% et bleu de bromophénol 0,06%, puis bouillis 3 min et analysés sur gels d'acrylamide 10%/SDS. Après transfert des protéines sur membrane de nitrocellulose; le marquage immunologique est effectué dans du TBS (Tris base Saline, pH 7,4) en présence de lait écrémé 5% et du tween 0,1 % . Des anticorps (Quality
Biotech Inc, USA) provenant d'anti-sérum de chèvre, dirigés contre gp70-SU de
RLV (Rauscher Leukemia Virus) ou p30 de RLV ont été utilisés à la dilution 1:1000 ou 1/10000 respectivement. Les blots ont été révélés par utilisation d'un anticorps conjugué d'origine lapin dirigés contre les Immunoglobulines de chèvres (DAKO, UK) grâce à un kit électrochemoluminescence (Amersham Life
Science).
Tests de liaison ("binding").
Les cellules cibles ont été lavées par du PBS et décollées par incubation 10 min à 37"C par du versene 0,02% dans du PBS. Ces cellules sont rincées par du PBA (PBS contenant 2% de FCS et du sodium d'azide 0,1%). 106 cellules sont alors incubées en présence de virus pendant 30 min à 4"C pour la série d'enveloppe EMO ou 45 min à 37"C pour la série des enveloppes AMO. Après rinçage par du PBA, les cellules sont incubées en présence d'anticorps monoclonal 83A25 (Evans et al., 1990) pendant 30 min à 4"C. Après deux rinçages par du PBA, les cellules sont incubées 30 min à 4"C en présence d'anticorps conjugués anti-rat couplés au FITC (Dako; UK). 5 min avant les deux rinçages finaux dans du PBA, les cellules sont contre colorées par de l'iodure de propidium (20 mg/ml). La fluorescence des cellules vivantes est analysée dans un FACS (FACScalibur, Beckton Dickinson).
Tests d'infection.
Les cellules cibles sont ensemencées dans des plaques de culture 24 puits à une densité de 3.104 cellules par puits. Différentes dilutions des surnageants viraux, contenant du polybrène à raison de 4 mg/ml sont ajoutées sur les cellules pendant 3 à 5 h à 37"C. Les surnageants sont par la suite remplacés par du milieu frais et les cellules incubées pendant 24 à 48 h à 37"C. Une coloration
X-gal est alors effectuée comme précédemment décrit (4). Les titres viraux sont estimés comme précédemment rapporté (5) en nombre de colonies par ml (lacZ i.u./ml).
X-gal est alors effectuée comme précédemment décrit (4). Les titres viraux sont estimés comme précédemment rapporté (5) en nombre de colonies par ml (lacZ i.u./ml).
Afin de bloquer les EGFR, les cellules cibles sont incubées pendant 30 min à 37"C dans un milieu contenant 10-6 M d'EGF recombinant humain (236-EG, R & D systems, UK). Les cellules sont alors rincées et les infections effectuées comme précédemment décrit. Afin de bloquer l'acidification des endosomes, 100 mM de phosphate de chloroquine (Sigma, UK) est ajoutée au milieu. Six h après infection, les cellules sont rincées et incubées dans un milieu normal.
Résultats et discussion.
Construction des enveloppes mutantes.
Deux séries d'enveloppes modifiées capables de reconnaître soit le récepteur rétroviral Ram-t (11), (22), soit le récepteur de l'EGF ont été générées. Une première enveloppe ciblant Ram-t, AMO, a été construite par insertion en N-terminal de l'enveloppe de MoMLV (par fusion avec le codon 7) d'un polypeptide reconnaissant Ram-t (AS208, Figure 3A) et correspondant aux 208 premiers acides aminés de la SU de MLV-A (1). La séquence codant pour l'EGF a été insérée dans le gène env de MLV en position +6 de la SU de
MoMLV (Figure 2). Il a préalablement été démontré que ce site d'insertion permettait l'expression d'un fragment simple chaîne d'anticorps à la surface des virions (15). Dans le cas de l'enveloppe chimère EMO (Figure 2), l'EGF humain a été inséré dans l'enveloppe de MoMLV à la même position, alors que pour l'enveloppe EA, l'insertion a été effectuée dans l'enveloppe amphotrope de
MLV en position +5.
MoMLV (Figure 2). Il a préalablement été démontré que ce site d'insertion permettait l'expression d'un fragment simple chaîne d'anticorps à la surface des virions (15). Dans le cas de l'enveloppe chimère EMO (Figure 2), l'EGF humain a été inséré dans l'enveloppe de MoMLV à la même position, alors que pour l'enveloppe EA, l'insertion a été effectuée dans l'enveloppe amphotrope de
MLV en position +5.
Pour les enveloppes AMO, EMO et EA, les nouveaux domaines de liaison ("binding") ont été séparés du domaine de reconnaissance du récepteur rétroviral par un peptide espaceur correspondant à trois alanines. Pour les deux types d'enveloppes parentales ciblant Ram-t ou ciblant EGFR, diverses constructions ont ensuite été générées par insertion d'espaceurs de différentes tailles et structures. Les séquences protéiques de ces différents espaceurs sont rapportés dans la Figure 3A dans le cas des enveloppes ciblant Ram-1 et dans la
Figure 3C pour les enveloppes ciblant EGFR.
Figure 3C pour les enveloppes ciblant EGFR.
Les plasmides exprimant les différentes enveloppes, y compris les enveloppes contrôles écotropes (MO) et amphotropes (A), ont été transfectées dans la lignée cellulaire TELCeB6 qui exprime les protéines codées par les gènes gag et pol, ainsi qu'un vecteur rétroviral nlsLacZ (7).
Expression et incorporation des enveloppes dans les virions.
Les lysats protéiques des cellules correspondantes ont été analysés pour l'expression d'enveloppes à l'aide d'anticorps dirigés contre la SU de MLV (Figure 5) pour la plupart des enveloppes de la série AMO, non montré pour les autres enveloppes chimères). Pour toutes les enveloppes chimères, les précurseurs et la forme mature SU des enveloppes ont pu être décelés à la taille attendue et à un niveau similaire aux enveloppes sauvages, suggérant que ces enveloppes chimères sont normalement produites et maturées.
L'expression à la surface cellulaire a été déterminée par analyse au FACS des cellules productrices, en utilisant des anticorps dirigés contre la SU ou en utilisant un anticorps monoclonal anti-EGF. Les cellules transfectées par les différentes enveloppes peuvent être marquées par l'anticorps anti-SU (non présenté). Seules les cellules exprimant les enveloppes fusion EGF enveloppes peuvent être marquées à l'aide des anticorps monoclonaux anti-EGF (Figure 4).
Ceci démontre l'expression des enveloppes chimères à la surface cellulaire et le repliement correct de l'EGF sur les glycoprotéines chimères.
Afin de démontrer l'incorporation des enveloppes chimères dans les particules rétrovirales, les surnageants des lignées cellulaires TELCeB6 transfectées par les différentes enveloppes ont été soumis à une ultracentrifugation et les culots de particules virales ont été récupérés. Ces culots ont été analysés par immunoblots pour leur expression de produits du gène gag (CAp30) et des protéines d'enveloppes (Figure 5 pour la plupart des enveloppes de la série AMO, non montré pour les autres enveloppes chimères).
Dans le but de comparer l'efficacité d'incorporation virale entre les diverses enveloppes chimères, des quantités identiques de particules virales (déterminées par le marquage des protéines gag à l'aide d'un anticorps anti-CAp30) ont été déposées sur les gels.
Les protéines SU ont pu être mises en évidence pour tous les mutants, à la taille attendue mais à un taux légèrement inférieur à celui observé pour les enveloppes sauvages. Dans le cas des enveloppes AMOG2X et AMOG3X seulement, l'efficacité d'incorporation est sensiblement plus faible par rapport aux enveloppes sauvages. Comme attendu, aucune expression d'enveloppe n'est observée dans les culots de surnageants TELacZ (n'exprimant pas de protéines gag et pol) transfectées par les différentes enveloppes. Ces résultats démontrent que les protéines SU chimères sont associées aux particules rétrovirales.
Liaison des enveloppes aux récepteurs.
Des cellules humaines exprimant les récepteurs Ram-1 et/ou de l'EGF ont été utilisées pour cette étude. Ces cellules sont incubées en présence de préparation virales et la liaison des enveloppes virales sur le récepteur cible est déterminé par analyse au FACS à l'aide d'anticorps dirigés contre la SU (Figure 6B). Comme attendu, aucune liaison n'est observée dans le cas des virus exprimant des enveloppe écotropes MO sur les diverses cellules humaines (non montré), alors que les virus présentant des enveloppes chimères ciblant Ram-l sont capables de se lier aux cellules TE671 avec une efficacité similaire à celle observée pour les virus exprimant des enveloppes amphotropes non modifiées.
Toutes les enveloppes ciblant Ram-l, dérivées de AMO, sont capables de se lier aux cellules TE671 avec une efficacité similaire. Cette liaison peut être inhibée après compétition par du fragment AS208 (le domaine purifié de reconnaissance de Ram-1) (2), ce qui suggère que cette reconnaissance est spécifique (résultats non présentés).
Les enveloppes ciblant EGFR (série EMO) sont par ailleurs capables de se lier aux cellules A431, sur exprimant EGFR (Figure 6A). Cette liaison semble spécifique puisqu'une pré-incubation des cellules A431 en présence d'EGF (induisant l'endocytose des EGFR) inhibe cette liaison (non montré).
Coopération Ram- 1 et Rec- 1 dans l'infection.
La transduction des vecteurs rétroviraux pseudotypés par les diverses enveloppes ciblantes a été mesurée sur des cellules exprimant différents types de récepteurs: des cellules humaines TE671 exprimant les récepteurs EGF et Ram1; des cellules 3T3 exprimant les récepteurs EGF murins, Rec-1 et Ram-l; des cellules CEAR13 exprimant Rec-1 et Ram-l; des cellules CERD9 exprimant seulement Rec-1. Les titrations ont été effectuées comme précédemment décrit (6). Comme attendu, il a été montré que les virus pseudotypés par des enveloppes écotropes MO n'étaient pas capables d'infecter les cellules TE671, mais permettaient l'infection de cellules murines 3T3, CEAR13 et Cerd9 (avec des titres de l'ordre de 107 lacZ i.u./ml). Réciproquement, les virus portant les enveloppes amphotropes A sont capables d'infecter les cellules murines 3T3, CEAR13 et TE671 (avec des titres de l'ordre de l'ordre de 107 lacZ i.u./ml).
Les virus présentant des enveloppes chimères AMO sont capables d'infecter les cellules TE671 à un titre de 4.103 lacZ i.u./ml (Tableau 1). En comparaison; malgré une efficacité de liaison au récepteur similaire (Figure 6B), les titres obtenus avec les enveloppes sauvages sont 10 000 fois plus élevés. De façon surprenante, les virus exprimant des enveloppes AMOPRO, malgré une bonne efficacité de liaison, se sont avérés incapables d'infecter les cellules humaines TE671. Comparés aux titres obtenus pour les enveloppes AMO (Tableau 1), les autres types d'espaceurs insérés dans les enveloppes de la série
AMO permettent une augmentation des titres de 30 fois (pour AMOAPRO) à plus de 100 fois (pour AMOlFx) permettant d'atteindre des titres de 4.105 lacZ i.u./ml. Il est démontré que ces infections ont lieu via le récepteur ciblé Ram-1.
AMO permettent une augmentation des titres de 30 fois (pour AMOAPRO) à plus de 100 fois (pour AMOlFx) permettant d'atteindre des titres de 4.105 lacZ i.u./ml. Il est démontré que ces infections ont lieu via le récepteur ciblé Ram-1.
Ceci a été mis en évidence par un test d'interférence sur des cellules cibles infectées chroniquement par du virus MLV-A. Ces cellules deviennent spécifiquement réfractaires à une infection par des virus portant les enveloppes ciblants Ram-l (résultats non montrés).Les virus portant les enveloppes chimères dans lesquelles le domaine de liaison à Ram-l a été séparé de la SU de
MoMLV par différents espaceurs s'avèrent très infectieux sur cellules 3T3.
MoMLV par différents espaceurs s'avèrent très infectieux sur cellules 3T3.
Comparé aux titres obtenus pour les enveloppes AMO, une augmentation de 200 (pour AMOPRO) à plus de 1000 fois (pour AMOlFx) des titres viraux a été mesurée (Tableau 1).
L'infection des 3T3 s'effectue via Rec-1 ou via Ram-l (Tableau 1). Ceci peut être démontré par des tests d'interférence effectués sur des cellules 3T3 infectées chroniquement soit par MLV-A (bloquant Ram-l) soit par MoMLV (bloquant Rec-1). Les virus exprimant les enveloppes AMO semblent être capables d'infecter les 3T3 indifféremment selon que l'un ou l'autre, ou les deux, récepteurs Rec-1 et Ram-1 sont disponibles sur la cellule cible.
Comparativement à ces virus AMO, les particules virales contenant les autres enveloppes capables de cibler Ram-i sont bien moins capables d'infecter les 3T3 quand seulement un des deux récepteurs est disponible. Par exemple, quand 100 particules (selon le titre déterminé sur 3T3 intactes) contenant les enveloppes
AMOFx sont utilisées pour infecter des 3T3 interférentes, 4 virus sont capables d'infecter les cellules si seulement Rec-1 est disponible et 2 virus sont capables d'infecter les cellules si seulement Ram-l est disponible. Ceci indique une perte considérable de l'infectivité (plus de 94% des virus ne sont pas infectieux) quand un seul récepteur est disponible comparé à quand les deux récepteurs le sont. Ceci suggère également que les deux récepteurs Ram-l et Rec-1 coopèrent dans l'infection des 3T3. Il apparaît que ce phénomène de coopération est encore nettement plus marqué dans le cas des virus portant les enveloppes
AMOPRO. Ces derniers virus peuvent difficilement infecter les 3T3 quand seul
Rec-1 est disponible et ne peuvent pas du tout les infecter quand seul Ram-l est disponible. Cependant quand Rec-1 et Ram-1 sont tout deux disponibles,
I'infection est possible et des titres de l'ordre de 6x104 lacZ i.u./ml peuvent être obtenus (Tableau 1).
AMOFx sont utilisées pour infecter des 3T3 interférentes, 4 virus sont capables d'infecter les cellules si seulement Rec-1 est disponible et 2 virus sont capables d'infecter les cellules si seulement Ram-l est disponible. Ceci indique une perte considérable de l'infectivité (plus de 94% des virus ne sont pas infectieux) quand un seul récepteur est disponible comparé à quand les deux récepteurs le sont. Ceci suggère également que les deux récepteurs Ram-l et Rec-1 coopèrent dans l'infection des 3T3. Il apparaît que ce phénomène de coopération est encore nettement plus marqué dans le cas des virus portant les enveloppes
AMOPRO. Ces derniers virus peuvent difficilement infecter les 3T3 quand seul
Rec-1 est disponible et ne peuvent pas du tout les infecter quand seul Ram-l est disponible. Cependant quand Rec-1 et Ram-1 sont tout deux disponibles,
I'infection est possible et des titres de l'ordre de 6x104 lacZ i.u./ml peuvent être obtenus (Tableau 1).
Dans le but de mieux définir ce phénomène de coopérativité, des tests d'infection ont été menés en utilisant comme cibles des cellules CHO (naturellement dépourvues des récepteurs Ram-l et Rec-1) modifiées de manière à exprimer soit Rec-1 seul (cellules Cerd9), soit Rec-1 et Ram-l (cellules Cearl3) ou des cellules TE671 exprimant Ram-l seul. Par ailleurs d'autres enveloppes dérivées de l'enveloppe AMO ont été générées. Ces enveloppes possèdent d'autres types de peptides espaceurs (voir Figure 3A) après le domaine ciblant Ram-l, notamment des espaceurs flexibles. Les résultats d'une expérience typique sont montrés dans le tableau 2. Pour chaque enveloppe, des index de coopérativité ont été calculés comme le rapport du titre obtenu sur le type cellulaire exprimant seulement un seul récepteur sur le titre obtenu sur le type cellulaire exprimant les deux types de récepteurs. Un index de 1 indique donc que le titre est le même, qu'il y ait un seul ou les deux récepteurs. C'est évidemment le cas des enveloppes sauvages écotropes ou amphotropes. Un index inférieur à 1 indique que le titre est moins bon quand un seul récepteur est exprimé par rapport à quand les deux le sont, et qu'il y a nécessité de deux récepteurs pour favoriser l'infection. Plus cet index est faible, plus le requièrement des deux récepteurs est fort. Comme suggéré dans le tableau 1,
I'infectivité des virions avec les enveloppes AMO originales n'est pas affectée, qu'il y ait qu'un seul type de récepteur ou les deux types (Tableau 2). En fait, les index sont même supérieurs à 1 suggérant que la présence simultanée des deux récepteurs gène le processus infectieux, peut-être parce que les deux domaines de liaison se gênent mutuellement.I1 en va différemment dans le cas des virus avec les enveloppes AMOlFx bien que, comparés aux virions AMO, leur infectivité est au moins 100 fois meilleure dans les cellules TE671 qui expriment Ram-l seul. Cet accroissement de I' infectivité via Ram-l peut être expliqué par la taille accrue du peptide espaceur séparant les deux domaines de liaison: il est possible que le domaine AS208 induise moins d'encombrement stérique vis-à-vis du reste de la glycoprotéine et que ces enveloppes puissent plus facilement induire le processus fusiogénique. De même, les virions
AMOlFx infectent relativement bien les cellules Cerd9 exprimant Rec-l seul.
I'infectivité des virions avec les enveloppes AMO originales n'est pas affectée, qu'il y ait qu'un seul type de récepteur ou les deux types (Tableau 2). En fait, les index sont même supérieurs à 1 suggérant que la présence simultanée des deux récepteurs gène le processus infectieux, peut-être parce que les deux domaines de liaison se gênent mutuellement.I1 en va différemment dans le cas des virus avec les enveloppes AMOlFx bien que, comparés aux virions AMO, leur infectivité est au moins 100 fois meilleure dans les cellules TE671 qui expriment Ram-l seul. Cet accroissement de I' infectivité via Ram-l peut être expliqué par la taille accrue du peptide espaceur séparant les deux domaines de liaison: il est possible que le domaine AS208 induise moins d'encombrement stérique vis-à-vis du reste de la glycoprotéine et que ces enveloppes puissent plus facilement induire le processus fusiogénique. De même, les virions
AMOlFx infectent relativement bien les cellules Cerd9 exprimant Rec-l seul.
Cependant, en accord avec les résultats du tableau 1, I'infection est facilitée par un facteur 10 quand les deux molécules Ram-l et Rec-l sont co-exprimées (index d'environ 0,1) comparativement à quand seulement l'un ou l'autre des deux récepteurs est présent. Les enveloppes avec les espaceurs "flexibles" (AMOGlFx, AMOG2, AMOG2Fx and AMOG3) semblent se comporter comme les enveloppes AMOlFx vis-à-vis de l'infection par l'intermédiaire de Rec-l exprimé seul. Cependant l'infectivité par Ram-l exprimé seul (RamID) tend à diminuer en fonction de la longueur de l'espaceur. Ceci reflète probablement une diminution de la transmission du signal fusiogénique consécutif à la liaison sur Ram-i du fait de l'accroissement de la distance entre le domaine AS208 et le domaine de fusion. Dans le cas de ces enveloppes également, I'infection est favorisée quand les deux récepteurs sont co-exprimés à la surface de la même cellule.
Comme pour les enveloppes AMOlFx, mais de manière non symétrique (RamID similaire, mais RecID très différents), les virions contenant l'enveloppe AMOAPRO peuvent efficacement infecter des cellules quand Ram-l y est exprimé seul. Dans le cas de cette enveloppe également, I'infectivité est accrue d'environ 10 fois quand Rec-l est également présent à la surface cellulaire.
Cette différence n'est pas due au simple fait que les virions AMOAPRO utilisent préférentiellement Rec-l pour l'infection. En effet, I'infection de cellules sur lesquelles Rec-l seul est disponible est extrêmement faible (Tableau 1) voire non détectable (Tableau 2) comparativement à quand Ram-l et Rec-1 sont coexprimés. L'indice RecID est inférieur à 10-5 (Tableau 2). Ceci démontre également que les deux récepteurs peuvent synergiser l'infection. Ces résultats suggèrent également que le domaine de liaison au récepteur écotrope Rec-l n'est pas accessible quand l'enveloppe AMOAPRO est exprimée sur des particules virales, et ne devient accessible que si ces virions interagissent préalablement avec Ram-l. On peut également suggérer que suite à la liaison avec Ram-l, le domaine de liaison à Rec-l est démasqué et recruté pour faciliter le processus infectieux. Il est possible que ce masquage/démasquage se produise selon un mécanisme de type allostérique causant un changement de conformation de la glycoprotéine chimère qui est induit par l'interaction Ram-1/AS208 et qui implique le peptide espaceur. Il est probable que ce mécanisme dépende fortement de la composition en acides aminés du peptide espaceur. A taille comparable, il y a une différence d'au moins 1000 fois dans les RecID quand les virions AMOAPRO sont comparés aux virions contenant les enveloppes avec les espaceurs flexibles AMOlFx, AMOGlFx et AMOG2. Le peptide APRO est contient 5 prolines probablement agencées en hélice polyproline de type II, tandis que les enveloppes AMOGlFx et AMOG2 contiennent essentiellement des glycines.
De manière similaire aux virions AMOAPRO, les virions contenant les enveloppes AMOPRO requièrent la présence simultanée des deux types de récepteurs pour infecter les cellules. Le titre infectieux dans des types cellulaires co-exprimant les deux récepteurs sont cependant inférieurs à ceux que l'on observe avec les virions AMOAPRO, sans pour autant que l'on puisse exclure l'hypothèse que la moindre incorporation de ces enveloppes est responsable de ce résultat. De manière encore plus marquée que AMOAPRO, les virus
AMOPRO ne peuvent pas infecter les cellules quand l'un ou l'autre des deux récepteurs est exprimé seul (Tableau 2). Les deux indices RamID et RecID sont en effet inférieurs à 10-5. Ces résultats suggèrent:
1) que l'interaction des virions AMOPRO avec Ram-l quand il est exprimé seul ne suffit pas à déclencher les changements de conformations de la glycoprotéine lui permettant d'être fusiogène. Il est d'ailleurs possible que le peptide espaceur PRO est soit trop rigide, soit trop long pour favoriser une telle transition.
AMOPRO ne peuvent pas infecter les cellules quand l'un ou l'autre des deux récepteurs est exprimé seul (Tableau 2). Les deux indices RamID et RecID sont en effet inférieurs à 10-5. Ces résultats suggèrent:
1) que l'interaction des virions AMOPRO avec Ram-l quand il est exprimé seul ne suffit pas à déclencher les changements de conformations de la glycoprotéine lui permettant d'être fusiogène. Il est d'ailleurs possible que le peptide espaceur PRO est soit trop rigide, soit trop long pour favoriser une telle transition.
2) le domaine de liaison avec Rec-1 n'est pas accessible pour interagir avec Rec-1 et prendre le relais dans le processus d'entrée tant que le virions
AMOPRO n'a pas interagi avec Ram-l.
AMOPRO n'a pas interagi avec Ram-l.
Dans le but de mieux discriminer si le masquage du domaine de liaison situé en aval du domaine ciblant est une propriété unique du peptide AS208 conjugué au peptide espaceur PRO, la construction réciproque a été faite. Les enveloppes MOAPRO comportent le domaine de liaison de l'enveloppe écotrope suivie de la région proline riche de cette même enveloppe, le tout fusionné à l'extrémité N-terminale de l'enveloppe amphotrope (Figure 2). Les résultats, montrés dans le tableau 2, indiquent que, de manière similaire aux virions contenant les enveloppes AMOPRO, les virions MOAPRO peuvent difficilement, voire pas du tout, infecter les cellules exprimant seulement l'un ou l'autre des récepteurs Rec-l ou Ram- 1. Il semble même que le domaine Ram-l dans l'enveloppe MOAPRO soit encore moins accessible (RamID inférieur à 7x10-5) que ne l'est le domaine Rec-l dans l'enveloppe AMOPRO (RecID inférieur à 5,6x10-4). Les enveloppes MOAPRO peuvent efficacement infecter les cellules exprimant les deux types de récepteurs, avec des titres de l'ordre de 105 lacZ i.u./ml, suggérant que, dans le cas de cette enveloppe également, la présence des deux récepteurs synergise le processus infectieux.
L'ensemble de ces résultats suggère que le peptide espaceur inséré entre le domaine ciblant et le reste de l'enveloppe rétrovirale exerce un contrôle sur
I'accessibilité du domaine situé en aval dudit peptide et sur l'activation de la fusion. Ce contrôle dépend du peptide lui-meme et est influencé par sa longueur et par sa composition biochimique. L'hypothèse que formulée est que le peptide espaceur PRO jouerait finalement le même rôle que la région riche en proline dont il est issu et qui est situé, dans la glycoprotéine non modifiée, entre le domaine de liaison au récepteur et le domaine de fusion. Ce rôle serait le masquage du domaine en aval (domaine fusion pour l'enveloppe sauvage ou domaine de liaison pour l'enveloppe chimère) et le démasquage consécutif à l'interaction du domaine en amont avec son récepteur. Dans le cas de l'enveloppe sauvage, ce démasquage conduirait à l'activation de la fusion, tandis que dans le cas des enveloppes chimères, le démasquage conduirait à l'accessibilité du domaine de liaison au récepteur viral. Si le récepteur est exprimé à la surface cellulaire, il peut alors y avoir interaction, ceci déclenchant ensuite l'activation du domaine fusion expliquant pourquoi la présence simultanée des deux récepteurs synergise l'infection.
I'accessibilité du domaine situé en aval dudit peptide et sur l'activation de la fusion. Ce contrôle dépend du peptide lui-meme et est influencé par sa longueur et par sa composition biochimique. L'hypothèse que formulée est que le peptide espaceur PRO jouerait finalement le même rôle que la région riche en proline dont il est issu et qui est situé, dans la glycoprotéine non modifiée, entre le domaine de liaison au récepteur et le domaine de fusion. Ce rôle serait le masquage du domaine en aval (domaine fusion pour l'enveloppe sauvage ou domaine de liaison pour l'enveloppe chimère) et le démasquage consécutif à l'interaction du domaine en amont avec son récepteur. Dans le cas de l'enveloppe sauvage, ce démasquage conduirait à l'activation de la fusion, tandis que dans le cas des enveloppes chimères, le démasquage conduirait à l'accessibilité du domaine de liaison au récepteur viral. Si le récepteur est exprimé à la surface cellulaire, il peut alors y avoir interaction, ceci déclenchant ensuite l'activation du domaine fusion expliquant pourquoi la présence simultanée des deux récepteurs synergise l'infection.
Ces données permettent de proposer une stratégie de ciblage en deux étapes pour laquelle une enveloppe ciblante est construite avec différents domaines dont les fonctions sont activées et coordonnées par le biais de peptides espaceurs spécifiques contenant des séquences riches en proline. Ces glycoprotéines d'enveloppe chimères peuvent être conçue de la manière suivante, avec de N-terminal à C-terminal, un domaine "ciblant" capable de reconnaître une molécule de surface cellulaire spécifiquement exprimée sur le tissu ou la cellule ciblé(e) (par exemple un anticorps simple chaîne ou un ligand pour un récepteur de surface); un peptide espaceur capable de masquer un domaine auxiliaire lui-même capable de faciliter la pénétration du virus quand il est activé. Un tel domaine auxiliaire peut être une enveloppe rétrovirale entière, c'est-à-dire une structure capable de médier et de prendre le relais de l'infection virale par le biais de l'interaction avec un récepteur rétroviral ubiquiste, qui a donc une très forte probabilité d'être co-exprimé avec la molécule de surface ciblée. Idéalement, le domaine auxiliaire devrait être masqué jusqu'à ce que la particule virale ait spécifiquement interagi avec la molécule de surface ciblée.
Par exemple, dans le cas des enveloppes AMOPRO et AMOAPRO, la molécule de surface ciblée est Ram-l tandis que le domaine auxiliaire est l'enveloppe écotrope.
Coopération EGFR et Rec-1 dans l'infection.
Dans le but de vérifier si les peptides espaceurs PRO et APRO pouvaient médier le mécanisme de masquage/démasquage dans le cas d'un autre type d'enveloppe ciblante, un autre modèle de ciblage en deux étapes a été exploré par le biais du récepteur EGF. Les résultats obtenus avec le ciblage de Ram-t ont permis de proposer des extrémités C-terminales des peptides espaceurs masquant/démasquant. Cependant il n'a pas été possible de définir exactement leurs extrémités N-terminales. C'est pourquoi, dans un premier temps, les enveloppes EMOPRO+ et EMOSPRO + ont été construites (Figure 3B), enveloppes dans lesquelles les peptides espaceurs PRO et APRO contiennent en plus, en N-terminal, 41 acides aminés dérivés de l'enveloppe amphotrope et localisés immédiatement en amont de la région riche en proline. Pour les enveloppes EMOPRO+ et EMOAPRO+, le domaine ciblant est EGF, tandis que le domaine auxiliaire est l'enveloppe écotrope. Ces deux enveloppes ont été comparées avec l'enveloppe EMO (Figure 2 et 2B) qui ne contient pas de peptide espaceur.
Les tests d'infection ont été effectués avec des cellules exprimant Rec-l seulement (cellules Cerd9) ou avec des cellules co-exprimant Rec-l et EGFR (cellules 3T3). Les résultats d'une expérience typique sont rapportés dans le tableau 3. De manière attendue par les résultats obtenus avec les enveloppes
AMO, les virus contenant les enveloppes EMO peuvent efficacement infecter les cellules Cerd9 et 3T3, indiquant que le domaine de liaison à Rec-l dans ces enveloppes n'est pas masqué. Comparativement aux virus EMO, les particules virales contenant les enveloppes EMOPRO + et EMOAPRO + ne peuvent que difficilement infecter les cellules Cerd9 (entre 1000 et 10000 fois moins bien que les virus EMO). Cependant quand Rec-1 et EGFR sont co-exprimés, bien que ceci n'affecte pas le titre des virions EMO, les particules virales contenant les enveloppes EMOPRO+ et EMOAPRO+ sont 20 et 60 fois plus infectieuses, respectivement, comparativement à quand Rec-l est exprimé seul.
AMO, les virus contenant les enveloppes EMO peuvent efficacement infecter les cellules Cerd9 et 3T3, indiquant que le domaine de liaison à Rec-l dans ces enveloppes n'est pas masqué. Comparativement aux virus EMO, les particules virales contenant les enveloppes EMOPRO + et EMOAPRO + ne peuvent que difficilement infecter les cellules Cerd9 (entre 1000 et 10000 fois moins bien que les virus EMO). Cependant quand Rec-1 et EGFR sont co-exprimés, bien que ceci n'affecte pas le titre des virions EMO, les particules virales contenant les enveloppes EMOPRO+ et EMOAPRO+ sont 20 et 60 fois plus infectieuses, respectivement, comparativement à quand Rec-l est exprimé seul.
Par rapport aux résultats obtenus avec les enveloppes AMOPRO et AMOAPRO, le masquage se fait apparemment moins bien, et il en résulte une infectivité non négligeable sur cellules Cerd9. Ceci est peut-être dû au fait que les peptides espaceurs PRO + et APRO + ne sont pas optimisés pour leur fonction, mais peut-être aussi au fait que les cellules Cerd9 expriment un peu de récepteurs EGF qui contribuerait à activer les enveloppes EMOPRO + et EMOAPRO + .
Tableau 1
Titres (lacZ i.u./ml) obtenus pour les virus contenant les enveloppes ciblant Ram-1 en
tests d'interférence env TE671 3T3a 3T3-MLV-Aa,b 3T3-MoMLV1
Ram-1c Ram-1 + Rec-1c Rec-1c Ram-1c 14 < 1 92,000,000 (100) 46,000,000 (100) 40
10,000,000 12,000,000 (100) 240 8,000,000 (100)
AMO 4,000 24 (100) 32 (266.7) 8 (50) AMOFx 230,000 440,000 (100) 8,000 (3.6) 6,000 (2)
AMO1 330,000 1,920,000 (100) 78,000 (8.1) 62,000 (4.8)
AMO1Fx 400,000 1,620,000 (100) 60,000 (7.4) 74,000 (6.8) AMO#PRO 150,000 280,000 (100) 400 (0.29) 64,000 (34.3) AMOPRO 10 60,000 (100) 4 (0.013) < 1 (0.0025)
a: pourcentages calculés en prenant comme valeur 100 les titres obtenus
sur 3T3
b: infection sur 3T3 chroniquement infectées par MLV-A (3T3-MLV-A)
ou par MoMLV (3T3-MoMLV)
c: récepteur disponible à la surface de la cellule considérée
Tableau 2
Titres (lacZ i.u./ml) obtenus pour les virus contenant les enveloppes ciblant Ram-1
Peptide env 3T3 TE671 CERDS RamID RecID espaceur
MO 2.8x10+6 < 1.7x10+0 2.8x10+6 < 6.1x10-7 1
A 5x10+5 5x10+5 6.2x10+ 1 1.2x10-5 3 AMO 1x10+2 2.2x10+2 6.2x10+0 2.2x10+0 6.2x10-2 13 AMO1Fx 6x10+4 1.6x10+4 2.2x10+5 2.7x10-1 3.7x10+0 16 AMO#PRO 1.9x10+4 5x10+3 6.2x10+0 2.6x10-1 3.3x10-4 18 AMOG1Fx 4x10+4 4.5x10+3 8.7x10+3 1.1x10-1 2.2x10-1 19 AMOG2 8x10+3 2.7x10+3 3.1x10+3 3.4x10-1 3.9x10-1
23 AMOG2Fx 6x10+3 1.2x10+3 1.2x10+3 2x10-1 2x10-1 28 AMOG3Fx 9x10+2 1x10+2 1.2x10+3 1.1x10-1 1.3x10+0 62 AMOPRO 1.8x10+3 < 1.7x10+0 < 1x10+2 < 9.4x10-4 < 5.6x10-4
MOAPRO 1.3x10+5 < 9.1x10+0 1.7x10+3 < 7x10-5 1.3x10-2
Tableau 3
Titres (lacZ i.u./ml) obtenus pour les virus
contenant les enveloppes ciblant EGFR env 3T3 CeRD9 RecID
MO 9.2x106 1.3x107 1 EMO#PRO 3.5x104 8.5x102 1.7x10-2
EMOPRO 9.6x102 7x101 5.2x10-2
EMO1 2x106 3x106 1
BIBLIOGRAPHIE
1. Battini, J. L., O. Danos, and J. M. Heard. 1995. Receptor-binding domain of murine leukemia virus envelope glycoproteins. J. Virol. h9:713-719.
Titres (lacZ i.u./ml) obtenus pour les virus contenant les enveloppes ciblant Ram-1 en
tests d'interférence env TE671 3T3a 3T3-MLV-Aa,b 3T3-MoMLV1
Ram-1c Ram-1 + Rec-1c Rec-1c Ram-1c 14 < 1 92,000,000 (100) 46,000,000 (100) 40
10,000,000 12,000,000 (100) 240 8,000,000 (100)
AMO 4,000 24 (100) 32 (266.7) 8 (50) AMOFx 230,000 440,000 (100) 8,000 (3.6) 6,000 (2)
AMO1 330,000 1,920,000 (100) 78,000 (8.1) 62,000 (4.8)
AMO1Fx 400,000 1,620,000 (100) 60,000 (7.4) 74,000 (6.8) AMO#PRO 150,000 280,000 (100) 400 (0.29) 64,000 (34.3) AMOPRO 10 60,000 (100) 4 (0.013) < 1 (0.0025)
a: pourcentages calculés en prenant comme valeur 100 les titres obtenus
sur 3T3
b: infection sur 3T3 chroniquement infectées par MLV-A (3T3-MLV-A)
ou par MoMLV (3T3-MoMLV)
c: récepteur disponible à la surface de la cellule considérée
Tableau 2
Titres (lacZ i.u./ml) obtenus pour les virus contenant les enveloppes ciblant Ram-1
Peptide env 3T3 TE671 CERDS RamID RecID espaceur
MO 2.8x10+6 < 1.7x10+0 2.8x10+6 < 6.1x10-7 1
A 5x10+5 5x10+5 6.2x10+ 1 1.2x10-5 3 AMO 1x10+2 2.2x10+2 6.2x10+0 2.2x10+0 6.2x10-2 13 AMO1Fx 6x10+4 1.6x10+4 2.2x10+5 2.7x10-1 3.7x10+0 16 AMO#PRO 1.9x10+4 5x10+3 6.2x10+0 2.6x10-1 3.3x10-4 18 AMOG1Fx 4x10+4 4.5x10+3 8.7x10+3 1.1x10-1 2.2x10-1 19 AMOG2 8x10+3 2.7x10+3 3.1x10+3 3.4x10-1 3.9x10-1
23 AMOG2Fx 6x10+3 1.2x10+3 1.2x10+3 2x10-1 2x10-1 28 AMOG3Fx 9x10+2 1x10+2 1.2x10+3 1.1x10-1 1.3x10+0 62 AMOPRO 1.8x10+3 < 1.7x10+0 < 1x10+2 < 9.4x10-4 < 5.6x10-4
MOAPRO 1.3x10+5 < 9.1x10+0 1.7x10+3 < 7x10-5 1.3x10-2
Tableau 3
Titres (lacZ i.u./ml) obtenus pour les virus
contenant les enveloppes ciblant EGFR env 3T3 CeRD9 RecID
MO 9.2x106 1.3x107 1 EMO#PRO 3.5x104 8.5x102 1.7x10-2
EMOPRO 9.6x102 7x101 5.2x10-2
EMO1 2x106 3x106 1
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2. Plenum Press.
Claims (17)
1. Utilisation d'un peptide en vue d'un transfert de gènes dans une cellule eucaryote cible, lequel peptide présente d'environ 10 à environ 200, notamment d'environ 15 à environ 150 acides aminés, et avantageusement environ 20 acides aminés, dans lequel 30% au moins des acides aminés sont constitués par des résidus proline, lesquels résidus proline sont régulièrement agencés de manière à induire des repliements de la chaîne polypeptidique à environ 1800 ("p-turn" ou "reverse-turn"), ces repliements étant régulièrement espacés et s'assemblant en une hélice polyproline à repliement de type ss ("polyproline p-turn helix"), dans une construction polypeptidique contenant, du côté N-terminal (en amont) dudit peptide, un domaine protéique N-terminal (amont) susceptible de reconnaître une molécule de surface ciblée ou un antigène exprimé sur une surface cellulaire, notamment un récepteur approprié (récepteur ciblé) situé sur ladite cellule eucaryote, et du côté C-terminal (en aval) dudit peptide, un domaine protéique C-terminal (aval) susceptible de reconnaître un récepteur approprié (récepteur auxiliaire) situé sur la susdite cellule eucaryote, lequel peptide est capable de faciliter ou d'inhiber l'interaction entre le domaine protéique C-terminal (aval) et le récepteur auxiliaire,
I' inhibition de cette interaction ayant lieu tant que le domaine protéique
N-terminal (amont) n'a pas interagi avec le récepteur ciblé et la favorisation de l'interaction entre le domaine protéique C-terminal (aval) et le récepteur auxiliaire ayant lieu lorsque le domaine protéique N-terminal (amont) a interagi avec le récepteur ciblé.
2. Utilisation d'un peptide selon la revendication 1, dans la construction d'une glycoprotéine à activité ciblante et fusogénique, essentiellement intacte, portée par un vecteur recombinant viral ou non viral de transfert de gène capable d'infecter une cellule eucaryote, ladite cellule eucaryote comportant un récepteur ciblé et un récepteur auxiliaire permettant de faciliter l'entrée du susdit vecteur viral ou non viral dans la cellule eucaryote, la susdite glycoprotéine comprenant - le susdit peptide, - un domaine protéique du côté N-terminal (en amont) du susdit peptide, susceptible d'interagir avec le susdit récepteur ciblé, lequel domaine protéique permet de lier spécifiquement le susdit vecteur de transfert de gènes et - un domaine protéique du côté C-terminal (en aval) du susdit peptide, susceptible d'interagir avec le susdit récepteur auxiliaire, laquelle interaction joue le rôle de mécanisme auxiliaire d'entrée du susdit vecteur de transfert de gènes dans la cellule eucaryote, le processus d'entrée cellulaire du vecteur viral ou non viral recombinant dans la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique C-terminal (aval) ne pouvant avoir lieu que lorsque le domaine protéique N-terminal (amont) a reconnu et lié le vecteur viral ou non viral recombinant avec le récepteur ciblé de la cellule eucaryote, entraînant par l'intermédiaire du susdit peptide un mécanisme de "démasquage" ou encore d'accessibilité du récepteur auxiliaire vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval), et, dans le cas où il n'y a pas reconnaissance entre le susdit vecteur de transfert de gènes et le récepteur ciblé de la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique N-terminal (amont), se produit un mécanisme de "masquage" ou encore de non accessibilité, par l'intermédiaire du susdit peptide, du récepteur auxiliaire vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval).
3. Utilisation d'un peptide selon l'une des revendications 1 à 2, dans la construction d'une glycoprotéine d'enveloppe (rétro)virale essentiellement intacte, portée par une particule (rétro)virale recombinante capable d'infecter une cellule eucaryote, ladite glycoprotéine d'enveloppe étant avantageusement sous forme polymérique, notamment sous forme trimérique, chaque monomère de la forme polymérique étant lui-même sous forme d'hétérodimère, ladite cellule eucaryote comportant un récepteur ciblé et un récepteur auxiliaire permettant de faciliter l'entrée de la susdite particule (rétro)virale (récepteur (rétro)viral) dans la cellule eucaryote, la glycoprotéine d'enveloppe comprenant: - le susdit peptide, - un domaine protéique du côté N-terminal (en amont) du susdit peptide, susceptible d'interagir avec le susdit récepteur ciblé, laquelle interaction permet de lier spécifiquement la particule (rétro)virale et - un domaine protéique du côté C-terminal (en aval) du susdit peptide,
susceptible d'interagir avec le susdit récepteur (rétro)viral, laquelle interaction joue le rôle de mécanisme auxiliaire d'entrée de la particule (rétro)virale dans la cellule eucaryote,
le processus d'entrée cellulaire de la particule (rétro)virale recombinante dans la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique C-terminal (aval) ne pouvant avoir lieu que lorsque le domaine protéique N-terminal (amont) a reconnu et lié
le récepteur ciblé de la cellule eucaryote avec la particule (rétro)virale recombinante, entraînant par l'intermédiaire du susdit peptide un mécanisme de "démasquage" ou encore d'accessibilité du récepteur (rétro)viral vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval), et, dans le cas où il n'y a pas reconnaissance entre la particule virale recombinante et le récepteur ciblé de la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique N-terminal (amont), se produit un mécanisme de "masquage" ou encore de non accessibilité, par l'intermédiaire du susdit peptide, du récepteur (rétro)viral vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval).
4. Utilisation d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le domaine protéique N-terminal (amont) est choisi parmi les polypeptides suivants - anticorps monobrin reconnaissant des molécules de surface cellulaire, - tout ligand pour une molécule de surface cellulaire, notamment hormones polypeptidiques, cytokine, facteurs de croissance.
5. Utilisation d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le domaine protéique C-terminal (aval) correspond à une glycoprotéine d'enveloppe (rétro)virale, essentiellement intacte comportant le domaine naturel de liaison, les fonctions de fusion et d'ancrage de la glycoprotéine d'enveloppe sauvage dont dérive la glycoprotéine d'enveloppe portée par la particule (rétro)virale recombinante.
6. Utilisation d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le peptide provient de la glycoprotéine d'enveloppe des rétrovirus de type C, et en ce que le virus est avantageusement choisi parmi : le virus MLV écotrope, le virus MLV amphotrope, le virus MLV xénotrope, le virus MLV MCF, le virus MLV 10A1, GALV (Gibbon Ape Leukemia Virus),
SSAV (Simian Sarcoma Associated Virus), FeLV A, FeLV B, FeLV C (FeLV:
Feline Leukemia Virus), et notamment en ce que le peptide est choisi parmi ceux contenant ou étant constitués par l'une des séquences suivantes
PRO (4070A), PRO(MoMLV), APRO, PRO+, APRO+, PROU, APRO13.
7. Séquences peptidiques choisies parmi celles contenant ou constituées par l'une des séquences suivantes - PRO (4070A), PRO(MoMLV), PROU, PRO+, APRO, APROD, APRO+, - AMOPRO, AMOAPRO, MOAPRO, MOAAPRO, - EMOPRO, EMOPRO13, EMOPRO+, EAPRO, EAPRO13, EAPRO+, EMOA
PRO, EMOSPROss, EMOAPRO+, EAAPRO, EASPROss, EASPRO + .
8. Séquence polypeptidique contenant un peptide d'environ 10 à environ 200, notamment d'environ 15 à environ 150 acides aminés, et avantageusement d'environ 20, dans lequel 30% au moins des acides aminés sont constitués par des résidus proline, lesquels résidus proline sont régulièrement agencés de manière à induire des repliements de la chaîne polypeptidique à environ 180C ("ss-turn" ou "reverse-turn"), ces repliements étant régulièrement espacés et s'assemblant en une hélice polyproline à repliement de type ss ("polyproline ss- turn helix"), - un domaine protéique N-terminal (en amont) du susdit peptide, susceptible de réagir avec un récepteur approprié (récepteur ciblé) situé sur une cellule eucaryote, lequel domaine protéique permet de lier spécifiquement une particule (rétro)virale recombinante contenant ledit domaine protéique N-terminal et - un domaine protéique C-terminal (en aval) du susdit peptide, susceptible d'interagir avec un récepteur (rétro)viral auxiliaire approprié (récepteur (rétro)viral) situé sur ladite cellule eucaryote, laquelle interaction joue le rôle de mécanisme auxiliaire d'entrée de la particule (rétro)virale dans ladite cellule eucaryote, le processus d'entrée cellulaire de ladite particule (rétro)virale recombinante dans ladite cellule eucaryote par le biais du domaine protéique C-terminal (aval) ne pouvant avoir lieu que lorsque le domaine protéique N-terminal (amont) a reconnu et lié le récepteur ciblé de la cellule eucaryote avec ladite particule (rétro)virale recombinante, entraînant par l'intermédiaire du susdit peptide un mécanisme de démasquage ou encore d'accessibilité du récepteur (rétro)viral vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval), et, dans le cas où il n'y a pas reconnaissance entre la particule virale recombinante et le récepteur ciblé de la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique N-terminal (amont), se produit un mécanisme de masquage ou encore de non accessibilité, par l'intermédiaire du susdit peptide, du récepteur (rétro)viral vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval).
9. Particule (rétro)virale recombinante susceptible d'infecter une cellule eucaryote, laquelle cellule comporte un récepteur ciblé et un récepteur auxiliaire de la susdite particule (rétro)virale, comprenant une glycoprotéine d'enveloppe substantiellement intacte, notamment sous forme polymérique et avantageusement sous forme trimérique, chaque monomère de la forme polymérique étant avantageusement lui-même sous forme hétérodimère, contenant un peptide d'environ 10 à environ 200, notamment d'environ 15 à environ 150 acides aminés, et avantageusement d'environ 20, dans lequel 30% au moins des acides aminés sont constitués par des résidus proline, lesquels résidus proline sont régulièrement agencés de manière à induire des repliements de la chaîne polypeptidique à environ 1800 ("p-turn" ou "reverse-turn"), ces repliements étant régulièrement espacés et s'assemblant en une hélice polyproline à repliement de type 13 ("polyproline p-turn helix"), - un domaine protéique du côté N-terminal (en amont) du susdit peptide, susceptible d'interagir avec le susdit récepteur ciblé, lequel domaine peptidique permet de lier spécifiquement la particule (rétro)virale et - un domaine protéique du côté C-terminal (en aval) du susdit peptide, susceptible d'interagir avec le susdit récepteur (rétro)viral, laquelle interaction joue le rôle de mécanisme auxiliaire d'entrée de la particule (rétro)virale dans la cellule eucaryote, le processus d'entrée cellulaire de la particule (rétro)virale recombinante dans la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique C-terminal (aval) ne pouvant avoir lieu que lorsque le domaine protéique N-terminal (amont) a reconnu et lié le récepteur ciblé de la cellule eucaryote avec la particule (rétro)virale recombinante, entraînant par l'intermédiaire du susdit peptide un mécanisme de démasquage ou encore d'accessibilité du récepteur (rétro)viral vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval), et, dans le cas où il n'y a pas reconnaissance entre la particule virale recombinante et le récepteur ciblé de la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique N-terminal (amont), se produit un mécanisme de masquage ou encore de non accessibilité, par l'intermédiaire du susdit peptide, du récepteur rétroviral vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval).
10. Particule (rétro)virale recombinante selon la revendication 9, caractérisée en ce que le domaine protéique N-terminal (amont) est choisi parmi les peptides suivants - anticorps monobrin reconnaissant des molécules de surface cellulaire, - tout ligand pour une molécule de surface cellulaire, notamment hormones polypeptidiques, cytokine, facteurs de croissance.
11. Particule (rétro)virale recombinante selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisée en ce que le domaine protéique C-terminal (aval) correspond à un polypeptide d'origine (rétro)virale comportant les fonctions de liaison, de fusion et d'ancrage de la glycoprotéine d'enveloppe sauvage dont dérive la glycoprotéine d'enveloppe portée par la particule (rétro)virale recombinante, et peut provenir des domaines naturels comportant les fonctions de liaison, de fusion et d'ancrage des glycoprotéines d'enveloppe issues des rétrovirus
MLV-A, GALV, FeLVB, ou des virus tels que adénovirus, herpès virus, virus
AAV (Adeno Associated Virus), ou plus généralement de glycoprotéines virales issues de virus d'origine eucaryote, notamment orthomyxovirus (tel que virus influenza) ou paramyxovirus (tel que SV5).
12. Particule (rétro)virale recombinante selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisée en ce que le peptide provient de la glycoprotéine d'enveloppe de rétrovirus de type C, et en ce que le peptide provient avantageusement d'un virus choisi parmi : le virus MLV écotrope, le virus MLV amphotrope, le virus MLV xénotrope, le virus MLV MCF, le virus
MLV 10A1, GALV (Gibbon Ape Leukemia Virus), SSAV (Simian Sarcoma
Associated Virus), FeLV A, FeLV B, FeLV C (FeLV : Feline Leukemia
Virus), et notamment en ce que le peptide est choisi parmi ceux contenant ou étant constitués par l'une des séquences suivantes PRO (4070A),
PRO(MoMLV), APRO, PRO+, APRO+, PRO13, APROss.
13. Particule (rétro)virale recombinante selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisée en ce que - le peptide provient de la glycoprotéine d'enveloppe des rétrovirus de type C, et en ce que le virus est avantageusement choisi parmi : le virus MLV écotrope, le virus MLV amphotrope, le virus MLV xénotrope, le virus MLV MCF, le virus MLV 10A1, GALV (Gibbon Ape Leukemia Virus), SSAV (Simian
Sarcoma Associated Virus), FeLV A, FeLV B, FeLV C (FeLV: Feline
Leukemia Virus), et notamment en ce que le peptide est choisi parmi ceux contenant ou étant constitués par l'une des séquences suivantes : PRO (4070A),
PRO(MoMLV), APRO, PRO+, APRO+, PRO13, APRO13, - le domaine protéique N-terminal (amont) est choisi parmi les peptides suivants:
* anticorps monobrin reconnaissant des molécules de surface cellulaire,
* tout ligand pour une molécule de surface cellulaire, notamment
hormones polypeptidiques, cytokine, facteurs de croissance, - le domaine protéique C-terminal correspond à un polypeptide d'origine (rétro)virale comportant les fonctions de liaison, de fusion et d'ancrage de la glycoprotéine d'enveloppe sauvage dont dérive la glycoprotéine d'enveloppe portée par la particule (rétro)virale recombinante, et peut provenir des domaines naturels comportant les fonctions de liaison, de fusion et d'ancrage des glycoprotéines d'enveloppe issues des rétrovirus
MLV-A, GALV, FeLVB, ou des virus tels que adénovirus, herpès virus, virus
AAV (Adeno Associated Virus), ou plus généralement de glycoprotéines virales issues de virus d'origine eucaryote, notamment orthomyxovirus (tel que virus influenza) ou paramyxovirus (tel que SV5).
14. Particule (rétro)virale recombinante selon l'une des revendications 9 à 13, caractérisée en ce que l'extrémité 5' de la séquence nucléotidique codant pour le domaine protéique N-terminal (amont) est contiguë à l'extrémité 3' de la séquence nucléotidique codant pour le peptide signal, l'extrémité 3' de la séquence nucléotidique codant pour le domaine protéique N-terminal (amont) est contiguë à l'extrémité 5' de la séquence nucléotidique codant pour le peptide, l'extrémité 3' de la séquence nucléotidique codant pour le peptide est contiguë à ltextrémité 5' de la séquence nucléotidique codant pour le domaine protéique
C-terminal (aval).
15. Acide nucléique codant pour un peptide ou pour une particule recombinante selon l'une quelconque des revendications 9 à 14.
16. Méthode de transfert sélective in vitro ou ex vivo d'un acide nucléique dans des cellules eucaryotes cibles présentes parmi d'autres cellules non-cibles, comprenant l'administration aux cellules cibles et non-cibles d'une particule recombinante (rétro)virale selon l'une des revendications 9 à 14, contenant l'acide nucléique à transférer.
17. Composition pharmaceutique contenant à titre de substance active une particule (rétro)virale selon l'une quelconque des revendications 9 à 14, et contenant également un gène à transférer, en association avec un véhicule pharmaceutique physiologiquement approprié.
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