EP0953053A2 - Particules virales masquees ou demasquees vis-a-vis du recepteur cellulaire - Google Patents

Particules virales masquees ou demasquees vis-a-vis du recepteur cellulaire

Info

Publication number
EP0953053A2
EP0953053A2 EP97925095A EP97925095A EP0953053A2 EP 0953053 A2 EP0953053 A2 EP 0953053A2 EP 97925095 A EP97925095 A EP 97925095A EP 97925095 A EP97925095 A EP 97925095A EP 0953053 A2 EP0953053 A2 EP 0953053A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
peptide
receptor
terminal
protein domain
retro
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP97925095A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
François-Loíc COSSET
Sandrine Valsesia
Stephen J. Russell
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP0953053A2 publication Critical patent/EP0953053A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1075—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of amino acids or peptide residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/13045—Special targeting system for viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13061—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2740/13062—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/6009—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses dsDNA viruses
    • C12N2810/6018—Adenoviridae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/6045—RNA rev transcr viruses
    • C12N2810/6054—Retroviridae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/80—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/80—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates
    • C12N2810/85—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian
    • C12N2810/851—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian from growth factors; from growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/80—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates
    • C12N2810/85—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian
    • C12N2810/852—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian from cytokines; from lymphokines; from interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/80—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates
    • C12N2810/85—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian
    • C12N2810/854—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian from hormones

Definitions

  • Retroviruses and therefore retroviral vectors initiate their infectious cycle by recognizing specific cell surface molecules, called retroviral receptors, with envelope glycoproteins expressed on the surface of retroviral particles. This recognition then leads to the fusion between the viral and cellular membranes, a complex and poorly understood process which is also mediated by a second function of the envelope glycoprotein.
  • the present invention also relates to the construction of chimeric envelope glycoproteins using these new peptides.
  • the invention relates to the use of a peptide for the transfer of genes into a target eukaryotic cell, which peptide has from approximately 10 to approximately 200, in particular from approximately 15 to approximately 150 amino acids, and advantageously approximately 20 amino acids, in which at least 30% of the amino acids consist of proline residues, which proline residues are regularly arranged so as to induce folds of the polypeptide chain at approximately 180 ° (" ⁇ -turn” or "reverse- turn "), these folds being regularly spaced and assembling in a polyproline helix with folding type ⁇ (" polyproline ⁇ -turn helix "), in a polypeptide construction containing, on the N-terminal side (upstream) of said peptide, an N-terminal (upstream) protein domain capable of recognizing a targeted surface molecule or an antigen expressed on a cell surface, in particular an appropriate receptor (targeted receptor) located on said cell
  • this ⁇ -folded polyproline helix contains 4 ⁇ folds and therefore 4 turns, and is moreover incompatible with a secondary structure in ⁇ -helix or in ⁇ sheet.
  • the ⁇ -folding polyproline helix placed between the two domains of the chimeric protein (N-terminal domain and auxiliary domain) intrinsically has, 1) an elastomeric force, 2) the property of self-assembling with other polyproline helices, probably in relation to the trimeric nature of the envelope, 3) the property of transmitting to the auxiliary domain a deformation induced by the binding of the N-terminal domain with its receptor, causing activation of the auxiliary domain .
  • markers specifically present on various differentiated tissues (example: receptor for growth factors, peptide hormones).
  • a targeted surface molecule As an example of a targeted surface molecule, mention may be made in particular of a receptor which will hereinafter be designated as a targeted receptor.
  • substantially intact refers to a viral glycoprotein which retains all of its determinants necessary for preserving the post-translational processes, if necessary, the oligomerization, the viral incorporation and fusion properties.
  • certain alterations can be made to the glycoprotein without significantly affecting these functions and the glycoproteins containing such minor modifications are considered to be substantially intact for the purposes of the invention.
  • the glycoprotein may lack a few amino acids (e.g. about 1 to 10), especially at the N-terminus, but will generally be the same size as the wild type protein and has essentially the same biological properties than wild protein.
  • non-viral recombinant gene transfer vector denotes macromolecular complexes associating the DNA containing the transferred gene, its expression regulation sequences, and molecules belonging to the class of lipids, carbohydrates, or proteins. , which have functional properties capable, 1) of targeting the deposition of DNA on the surface of the target cell, 2) of introducing this DNA into the target cell, and 3) of introducing this DNA into the nucleus of the target cell.
  • the envelope glycoprotein comprising:
  • the C-terminal (downstream) protein domain corresponds to a (retro) viral envelope glycoprotein, essentially intact, comprising the natural binding domain, the fusion and anchoring functions of the wild envelope glycoprotein from which the envelope glycoprotein carried by the recombinant (retro) viral particle is derived.
  • N-terminal protein domain upstream of the above peptide, capable of reacting with an appropriate receptor (targeted receptor) located on a eukaryotic cell, which protein domain makes it possible to specifically bind a recombinant (retro) viral particle containing said protein domain N-terminal and
  • MLV-A, GALV, FeLVB or viruses such as adenovirus, herpes virus, AAV virus (Adeno Associated Virus), or more generally viral glycoproteins derived from viruses of eukaryotic origin, in particular orthomyxovirus (such as influenza virus) or paramyxovirus (such as SV5).
  • viruses such as adenovirus, herpes virus, AAV virus (Adeno Associated Virus), or more generally viral glycoproteins derived from viruses of eukaryotic origin, in particular orthomyxovirus (such as influenza virus) or paramyxovirus (such as SV5).
  • the invention also relates to a recombinant (retro) viral particle characterized in that the 5 'end of the nucleotide sequence coding for the N-terminal (upstream) protein domain is contiguous with the 3' end of the nucleotide sequence coding for the signal peptide, the 3 'end of the nucleotide sequence coding for the N-terminal (upstream) protein domain is contiguous with the 5' end of the nucleotide sequence coding for the peptide, the 3 'end of the nucleotide sequence coding for the peptide is contiguous with the 5 ′ end of the nucleotide sequence coding for the C-terminal protein domain (downstream).
  • the invention also relates to a nucleic acid coding for a peptide or for a recombinant particle according to the invention.
  • the invention containing the nucleic acid to be transferred.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition containing as active substance a (retro) v ⁇ rale particle according to the invention, and also containing a gene to be transferred, in association with a physiologically appropriate pharmaceutical vehicle.
  • genes to be transferred which are important for gene therapy, these are for example IFN, IL2, p53, VEGF, TNF, CFTR, HSV-TK, lacZ, GFP, various cytokine genes, other types of suicide genes including conditional suicide genes, other genes with anti-viral activity, other genes with anti-tumor activity, other marker genes and any therapeutic gene for mono- or multi-gene disease.
  • the pathologies most specifically concerned are: most single and multi-gene diseases (mucovisidosis, myopathy, lysosomal diseases, various forms of cancer, viral diseases (AIDS), ...)
  • FIG. 1 shows the two-stage entry process of the targeting viral particle.
  • the viral particles are generated (A) with targeting envelope glycoproteins composed of an N-terminal domain (ligand, monobrin antibody, etc.), of the masking / unmasking peptide, and of a C-terminal domain (B).
  • the steps leading to the introduction of the virion into the targeted cell involve a mechanism coordinated by the masking / unmasking peptide (C).
  • FIG. 2 is a schematic representation of some of the targeting envelopes studied. The position of some functional regions is shown. Vertical arrows: proteolytic cleavage sites.
  • SU surface subunit
  • TM transmembrane subunit
  • SP signal peptide
  • PRO poly-proline region
  • T transmembrane domain
  • Ram-1 ligand binding domain for the amphotropic receptor
  • Rec-1 ligand binding domain for the ecotropic receptor
  • EGF epidermal growth factor.
  • Dark gray boxes sequence derived from the env gene of MoMLV
  • Light gray boxes sequence derived from the env gene of MLV-4070A
  • White boxes other sequences derived from MLV.
  • Black boxes spacer peptides derived from the poly-proline region. All env genes are expressed from the same promoter (LTR) and polyadenylation signal (pA) from the subgenomic mRNA using the retroviral, donor (SD) and acceptor splice sites.
  • LTR promoter
  • SA SA with an identical intronic sequence of 190 nts containing the end of the pol gene ( ⁇ POL). The position of some restriction sites is shown.
  • FIG. 5 shows the expression and viral incorporation of the chimeric envelopes of the AMO series.
  • FIG. 7 shows the amino acid and nucleotide sequence of PRO (4070A).
  • FIG. 9 shows the amino acid and nucleotide sequence of PRO ⁇ (MoMLV).
  • FIG. 10 shows the amino acid and nucleotide sequence of
  • FIG. 30 shows the amino acid and nucleotide sequence of AMOEL3.
  • FIG. 35 shows the amino acid and nucleotide sequence of EL5.
  • FIG. 36 shows the amino acid and nucleotide sequence of ⁇ PR04-beta.
  • FIG. 39 shows the amino acid and nucleotide sequence of PRO-beta.
  • FIG. 40 shows the amino acid and nucleotide sequence of PRO-int.
  • Retroviruses use a number of cell surface molecules, called viral receptors, to initiate the infectious process (23). With notable exceptions, notably in the case of human immunodeficiency viruses, most of the receptors used by other retroviruses and in particular mammalian type C retroviruses are distributed on most cell types of the host organism. For example, the amphotropic murine leukemia virus (MLV-A) is capable of infecting most mammalian cells because its receptor, the phosphate transporter Ram-1, is expressed on almost all cells.
  • MLV-A amphotropic murine leukemia virus
  • polypeptides capable of binding various cell surface molecules have been inserted at the N-terminal end of the SU subunit of the envelope glycoprotein (6) (10) (13) (15) (21).
  • the study of virions generated with these various types of targeting envelopes has shown that it is possible to specifically and effectively redirect the binding of viral particles to new surface molecules.
  • Some factors that limit the effectiveness of targeting have also been identified. The first seems to depend on physiological properties of the targeted surface molecule (dimerization, internalization, intracellular transport process) (6), the second is linked to the low intrinsic fusiogenicity of the glycerol of envelope chimeras generated by insertion.
  • N terminal ligands (6) (21).
  • the natural binding domain of the support envelope is always functional.
  • this functionality of the natural binding domain does not pose problems of infection "background noise” because the ecotropic envelope of the virus is used as the support glycoprotein.
  • MoMLV which does not recognize a receptor on the cells of higher mammals.
  • N-terminal targeting glycoprotein and then an auxiliary mechanism to facilitate the entry of the virus specifically linked to the right cellular target through the natural retroviral receptor.
  • spacer masking / unmasking peptides have also been developed, inserted between the targeting domain and the glycoprotein of support envelope, and which are capable of masking the natural binding domain as long as the viral particle has not interacted with the targeted surface molecule. The realization of this interaction induces the unmasking of the natural binding domain and the interaction between the natural binding domain and the natural retroviral receptor (auxiliary mechanism) which then takes over to introduce the virus into the cell.
  • the TELCeB ⁇ cell line (7) is derived from the TELacZ line (19) by transfection and clonal selection of cells expressing the gag and pol proteins of MoMLV (Moloney Murine Leukemia Virus: Moloney murine leukemia virus).
  • TELacZ cells express the retroviral vector MFGnlslacZ capable of transducing a nuclear ⁇ -galactosidase.
  • TELCeB ⁇ cells allow the production of retroviral capsids (non-infectious because they lack envelopes) carrying the retroviral marker vector nlsLacZ.
  • the A431 (ATCC CRL1555) and TE671 (ATCC CRL8805) cells are cultured in DMEM medium (Gibco-BRL) supplemented with 10% fetal calf serum (Gibco-BRL).
  • the CHO, CERD9 (9) and CEAR13 (9) cells are cultured in DMEM medium (Gibco-BRL) supplemented with 10% fetal calf serum and proline (Gibco-BRL).
  • the NIH-3T3 and NIH-3T3 cell lines are cultured in DMEM medium (Gibco-BRL) supplemented with 10% newborn calf serum (Gibco-BRL). Chimerical envelopes. DNA fragments encoding polypeptides recognizing either EGFR
  • the chimeric envelope is formed by cloning of the Xhol / Notl PCR fragment and of the Notl / Clal fragment, isolated from the env EMO gene (coding for the SU and TM-P15E transmembrane proteins of MoMLV), between the Xhol / Clal sites of the env 4070A MLV gene.
  • the resulting constructs are recovered in the form of a BglII / ClaI fragment (corresponding to positions 5408 and 7676 in MoMLV) and cloned at the BamHI and ClaI sites of an expression plasmid FBMOSALF (7) in which a selection marker gene (8) fused to the polyadenylation sequences of the PGK (phospho-glycerate kinase) gene was introduced downstream of the 3 'LTR of the MLV-C57 virus.
  • a selection marker gene (8) fused to the polyadenylation sequences of the PGK (phospho-glycerate kinase) gene was introduced downstream of the 3 'LTR of the MLV-C57 virus.
  • the new recognition domain was separated from the rest of the MLV envelope by a spacer peptide consisting of three alanines, provided by the Notl cloning site (15).
  • spacer amino acids were introduced either after the domain of EGFR recognition (EGF), either after the Ram-1 recognition domain (AS208) as described below.
  • AMOl the first 208 amino acids, derived from the envelope of MLV 4070 A, were fused to amino acid 1 of the SU of MoMLV.
  • AMOlFx a site of 4 amino acids corresponding to the cleavage site of blood coagulation factor Xa (Ile-Glu-Gly-Arg) (12) was inserted after the recognition domain of Ram-1 and fused to codon + 1 of MoMLV's SU. The strategy used for these constructions is described above.
  • an oligonucleotide (5'-TCCAATTCCTTCCAAGGGGC-3 '), located just upstream of the Xhol site of the env gene of 4070A (nt 594) was used in combination with either one of the following two oligonucleotides providing Notl site:
  • PCR fragments were subjected to digestion with Xhol and NotI and cloned into the plasmid FBAMOSALF opened in Xhol / NotI, a plasmid expressing an envelope of AMO type.
  • the plasmids expressing the AMOFx, AMOl and AMOlFx envelopes were generated by cloning the NdeI / NotI fragment of FBAMOSALF (comprising the recognition domain Ram-1) in a series of plasmids (13) expressing the MoMLV envelopes modified in order to create a site Notl at codon 1 or codon 6 with (AMOlFx, AMOFx) or without (AMOl) the sequence Xa.
  • Envelopes derived from AMO and containing other types of spacer peptides were constructed. All of these spacer peptides are shown in Figure 3 A.
  • 3 'fragments were generated by PCR using the MoMLV env gene as a template, as a 5' oligonucleotide (5 '-ACTGGGGCTTACGTTTGT-3') upstream of the BamHI site, and as a 3 'oligonucleotide (5' -TATGTGCGGCCGCCGGTGGAAGTTGGGTAGGG- ') or (5' -TATGTGCGGCCGCGTCTGGCAGAACGGGGTTTGG-3 ') to build the MOAPRO and MOA ⁇ PRO envelopes, respectively.
  • These PCR fragments were digested with BamHI and NotI, and co-ligated with the 5 'fragment.
  • the sequence of spacer peptides for these two constructs is shown in Figure 3B.
  • plasmids expressing the EMOI and EMOlFx envelopes were generated.
  • the sequence of spacer peptides. for these two constructions is shown in Figure 3C.
  • the plasmids expressing the EAPRO + and EA ⁇ PRO + envelopes were generated by replacing the Sfil / Not fragment of the FBEASALF plasmid by the Sfil / Notl fragments derived from the plasmids expressing the EMOPRO + and EMO ⁇ PRO + envelopes.
  • the virus-producing cells are lysed for 10 min at 4 ° C. in 20 mM Tris-HCL buffer (pH 7.5), containing 1% tritonXIOO, 0.05% SDS, 5 mg / ml deoxycholate, 150 mM NaCl and PMSF
  • Target cells were washed with PBS and detached by incubation
  • the target cells are incubated for 30 min at 37 ° C. in a medium containing 10 ⁇ 6 M of recombinant human EGF (236-EG, R&D Systems, UK). The cells are then rinsed and the infections carried out as previously described. In order to block the acidification of the endosomes, 100 mM of chloroquine phosphate (Sigma, UK) is added to the medium. Six hours after infection, the cells are rinsed and incubated in a normal medium. Results and discussion.
  • a first envelope targeting Ram-1, AMO was constructed by N-terminal insertion of the MoMLV envelope (by fusion with codon 7) of a polypeptide recognizing Ram-1 (AS208, FIG. 3 A) and corresponding to the first 208 amino acids of the SU of MLV-A (1).
  • the sequence coding for EGF was inserted into the env gene of MLV at position +6 of the SU of
  • the new binding domains were separated from the recognition domain of the retroviral receptor by a spacer peptide corresponding to three alanines.
  • various constructions were then generated by insertion of spacers of different sizes and structures. The protein sequences of these different spacers are reported in Figure 3 A for the envelopes targeting Ram-1 and in Figure 3C for the envelopes targeting EGFR.
  • the plasmids expressing the various envelopes were transfected into the TELCeB ⁇ cell line which expresses the proteins coded by the gag and pol genes, as well as a retroviral vector nlsLacZ ( 7).
  • Cell surface expression was determined by FACS analysis of producer cells, using antibodies against SU, or using anti-EGF monoclonal antibody.
  • the cells transfected with the different envelopes can be labeled with the anti-SU antibody (not shown).
  • Only cells expressing EGF fusion envelopes can be labeled using anti-EGF monoclonal antibodies ( Figure 4). This demonstrates the expression of the chimeric envelopes on the cell surface and the correct folding of the EGF on the chimeric glycoproteins.
  • Envelopes targeting EGFR are also capable of binding to A431 cells, over expressing EGFR ( Figure 6A). This connection seems specific since a pre-incubation of A431 cells in the presence of EGF (inducing the endocytosis of EGFR) inhibits this binding (not shown). Ram-1 and Rec-1 cooperation in infection.
  • the transduction of the pseudotyped retroviral vectors by the various targeting envelopes was measured on cells expressing different types of receptors: human TE671 cells expressing the EGF receptors and
  • Viruses with AMO chimeric envelopes are capable of infecting TE671 cells in a titer of 4.10 ⁇ lacZ i.u./ml (Table 1). In comparison; despite a similar receptor binding efficiency ( Figure 6B), the titers obtained with wild envelopes are 10,000 times higher. Su ⁇ renantly, the viruses expressing AMOPRO envelopes, despite good binding efficiency, have been found incapable of infecting human TE671 cells.
  • Viruses carrying the chimeric envelopes in which the Ram-1 binding domain has been separated from the SU of MoMLV by different spacers prove to be very infectious on 3T3 cells.
  • an increase from 200 (for AMOPRO) to more than 1000 times (for AMOlFx) of the viral titers was measured (Table 1).
  • the virions containing the AMO ⁇ PRO envelope can effectively infect cells when Ram-1 is expressed there alone.
  • the infectivity is increased by approximately 10 times when Rec-1 is also present on the cell surface. This difference is not due to the simple fact that AMO ⁇ PRO virions preferentially use Rec-1 for infection.
  • infection of cells on which only Rec-1 is available is extremely low (Table 1) or even undetectable (Table 2) compared to when Ram-1 and Rec-1 are co-expressed.
  • the RecID index is less than 10 ⁇ 5 (Table 2). This also demonstrates that the two receptors can synergize the infection.
  • the AMO ⁇ PRO virions are compared to the virions containing the envelopes with the flexible spacers AMOlFx, AMOGIFx and AMOG2.
  • the ⁇ PRO peptide is contains 5 prolines probably arranged in a polyproline type II helix, while the AMOGIFx and AMOG2 envelopes essentially contain glycines.
  • virions containing AMOPRO envelopes require the simultaneous presence of both types of receptors to infect cells.
  • the infectious titer in cell types co-expressing the two receptors is however lower than that which is observed with the AMO ⁇ PRO virions, without however excluding the hypothesis that the slightest inco deoration of these envelopes is responsible for this result.
  • AMOPRO viruses cannot infect cells when either of the two receptors is expressed alone (Table 2).
  • the two indices RamID and RecID are indeed lower than A.
  • MOAPRO envelopes include the binding domain of the ecotropic envelope followed by the proline region rich in this same envelope, all fused to the N-terminal end of the amphotropic envelope ( Figure 2).
  • Table 2 The results, shown in Table 2, indicate that, similarly to the virions containing the AMOPRO envelopes, the MOAPRO virions can hardly, if at all, infect cells expressing only one or the other of the Rec-1 receptors or Ram-1.
  • the Ram-1 field in the MOAPRO envelope is even less accessible (Ramid less than 7xl0 "5) than the field is the Rec-1 in AMOPRO envelope (RECID less than 5, 6x10-4
  • the MOAPRO envelopes can effectively infect cells expressing the two types of receptors, with titers of the order of 10 ⁇ lacZ iu / ml, suggesting that, in the case of this envelope too, the presence of the two receptors synergizes the infectious process.
  • the spacer peptide inserted between the targeting domain and the rest of the retroviral envelope exerts a control on the accessibility of the domain located downstream of said peptide and on the activation of the fusion. This control depends on the peptide itself and is influenced by its length and by its biochemical composition.
  • the hypothesis formulated is that the spacer peptide PRO would ultimately play the same role as the proline-rich region from which it originates and which is located, in the unmodified glycoprotein, between the receptor binding domain and the fusion domain. This role would be the masking of the downstream domain (fusion domain for the wild envelope or binding domain for the chimeric envelope) and the unmasking following the interaction of the upstream domain with its receptor.
  • this unmasking would lead to activation of the fusion, while in the case of chimeric envelopes, the unmasking would lead to the accessibility of the binding domain to the viral receptor. If the receptor is expressed on the cell surface, there can then be interaction, this then triggering the activation of the fusion domain explaining why the simultaneous presence of the two receptors synergizes the infection.
  • a targeting envelope in two stages for which a targeting envelope is constructed with different domains whose functions are activated and coordinated by means of specific spacer peptides containing sequences rich in proline.
  • These chimeric envelope glycoproteins can be designed in the following way, with from N-terminal to C-terminal, a "targeting" domain capable of recognizing a cell surface molecule specifically expressed on the targeted tissue or cell (for example a single chain antico ⁇ s or a ligand for a surface receptor); a spacer peptide capable of masking an auxiliary domain itself capable of facilitating the penetration of the virus when it is activated.
  • auxiliary domain can be an entire retroviral envelope, i.e.
  • the helper domain should be masked until the virus particle has specifically interacted with the targeted surface molecule.
  • the targeted surface molecule is Ram-1 while the auxiliary domain is the ecotropic envelope. EGFR and Rec-1 cooperation in infection.
  • the targeting domain is EGF
  • the auxiliary domain is the ecotropic envelope.
  • the infection tests were carried out with cells expressing Rec-1 only (Cerd9 cells) or with cells co-expressing Rec-1 and EGFR (3T3 cells). The results of a typical experiment are reported in Table 3. As expected by the results obtained with the AMO envelopes, viruses containing the EMO envelopes can effectively infect Cerd9 and 3T3 cells, indicating that the Rec- binding domain 1 in these envelopes is not hidden. Compared to EMO viruses, viral particles containing the EMOPRO + and EMO ⁇ PRO + envelopes can only with difficulty infect Cerd9 cells (between 1,000 and 10,000 times worse than EMO viruses).
  • the viral particles containing the EMOPRO + and EMO ⁇ PRO + envelopes are 20 and 60 times more infectious, respectively, compared to when Rec-1 is expressed alone.
  • the masking is apparently less successful, and this results in significant infectivity on Cerd9 cells. This may be due to the fact that the spacer peptides PRO + and ⁇ PRO + are not optimized for their function, but perhaps also to the fact that the Cerd9 cells express a little EGF receptor which would help activate the EMOPRO + and EMO ⁇ envelopes PRO +.
  • a percentages calculated taking as values 100 the titers obtained on 3T3 b: infection on 3T3 chronically infected with MLV-A (3T3-MLV-A) or with MoMLV (3T3-MoMLV) c: receptor available on the surface of the cell considered
  • EXAMPLE 2 In order to characterize the cooperation between the Rec-1 and Ram-1 receptors, as well as the peptides capable of regulating this cooperation of receptors, a new series of AMO-type chimeric envelope glycoproteins (see previous example) a been built - in order to check whether the infection obtained with the AMOPRO and AMODeltaPRO envelopes passes, in a second step, through an interaction with Rec-1, the binding site with Rec-1 was inactivated by point mutagenesis (D84K mutation) (MacKrell et al.,]. Virology, 70: 1768-1774.
  • the AMOEL3 and AMOEL5 envelopes were constructed. These envelopes respectively carry 3 and 5 turns of a type II polyproline helix characterized in the literature (Urry, Journal of Protein Chemistry 7: 1-34. (1988)).
  • Retroviruses were generated with these chimeric envelopes and were characterized by infection of cells expressing either Rec-1 alone, or Ram-1 alone, or the two molecules Ram-1 and Rec-1.
  • oligonucleotides elast3U (5'-TTT ATG GTC ACC GCG GCC GCA CCT GGG GTA GGG GCT CCG GGG GTA GGG GCT CCT GGG GTG GCC ATA TAA) and elast3L (5'-TTA TAT GGC CAC CCC AGG AGC CCC TAC
  • the oligonucleotides UpE15 (5 * -G AT GTA CCT GGG GTA GGC GCC CCT GGA GTC GGG GCT CCT GGG GTA GGA TTC AT) and LowE15: (5 '-ATG AAT CCT ACC CCA GGA GCC CCG ACT CCA GGG GCG CCT
  • the DELASTIN3-V Upper oligonucleotides (5'-GTC ACC GCG GCC GTC CCT GGG GTA GGG GTG CCG GGG GTA GGG GTG CCT GGG GTG GCC ATA TA A) and DELASTIN3-V Lower (5'-TTA TAT GGC CAC CCC AGG CAC CCC TAC CCC CGG CAC CCC TAC CCC AGG GAC GGC CGC GGT GAC) have been hybridized.
  • the resulting double-stranded DNA fragment was digested with the restriction enzyme Eael and cloned into the expression plasmid FBAMOSALF previously opened in NotI. This results in the plasmid
  • FBAMOEL3-VSALF (see sequence of the AMOEL3-V gene in FIG. 34) comprising the peptide EL3-V whose peptide sequence is represented in table 4 (see nucleotide sequence in FIG. 35).
  • FBAMOEL3-ISALF comprising the peptide EL3-I whose peptide sequence is represented in table 4.
  • Expression and viral inco ⁇ oration of chimeric envelopes Expression plasmids for the envelopes AMO, AMODeltaPRO, AMOPRO, AMOEL3, AMOEL5, AMOEL3-V, AMOEL3-I, AMOIFX, AMOG1X, AMOD84K, AMODeltaPROD84K, AMOPROD84K, AMOG1XD84K, AMODeltaPR02
  • the corresponding DNA fragments were digested with the enzyme EagI and separately inserted into the plasmid FBEASALF (expressing the chimeric envelope glycoproteins EA) (Cosset et al., Journal of Virology 69: 6314-6322.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

L'invention concerne l'utilisation d'un peptide en vue d'un transfert de gènes dans une cellule eucaryote cible, lequel peptide présente d'environ 10 à environ 200, notamment d'environ 15 à environ 150 acides aminés, et avantageusement environ 20 acides aminés, dans lequel 30 % au moins des acides aminés sont constitués par des résidus proline, lesquels résidus proline sont régulièrement agencés de manière à induire des repliements de la chaîne polypeptidique à environ 180° ('β-turn' ou 'reverse-turn'), ces repliements étant régulièrement espacés et s'assemblant en une hélice polyproline à repliement de type β ('polyproline β-turn helix'), dans une construction polypeptidique contenant, du côté N-terminal (en amont) dudit peptide, un domaine protéique N-terminal (amont) susceptible de reconnaître une molécule de surface ciblée ou un antigène exprimé sur une surface cellulaire, notamment un récepteur approprié (récepteur ciblé) situé sur ladite cellule eucaryote, et du côté C-terminal (en aval) dudit peptide, un domaine protéique C-terminal (aval) susceptible de reconnaître un récepteur approprié (récepteur auxiliaire) situé sur la susdite cellule eucaryote, lequel peptide est capable de faciliter ou d'inhiber l'interaction entre le domaine protéique C-terminal (aval) et le récepteur auxiliaire, l'inhibition de cette interaction ayant lieu tant que le domaine protéique N-terminal (amont) n'a pas interagi avec le récepteur ciblé et la favorisation de l'interaction entre le domaine protéique C-terminal (aval) et le récepteur auxiliaire ayant lieu lorsque le domaine protéique N-terminal (amont) a interagi avec le récepteur ciblé.

Description

PARTICULES VIRALES MASQUEES OU DEMASQUEES VIS-A-VIS DU RECEPTEUR CELLULAIRE
L'invention a pour objet des particules virales recombinantes comportant un peptide ayant des propriétés de masquage et de démasquage vis-à-vis d'un mécanisme biologique, notamment vis-à-vis d'un mécanisme d'interaction cellulaire. L'invention concerne également l'application des susdites particules virales, notamment au ciblage cellulaire du transfert de gènes.
Les rétrovirus et donc les vecteurs rétroviraux initient leur cycle infectieux par la reconnaissance de molécules de surface cellulaire spécifiques, appelées récepteurs rétroviraux, avec des glycoprotéines d'enveloppe exprimées à la surface des particules rétrovirales. Cette reconnaissance aboutit ensuite à la fusion entre les membranes virales et cellulaires, processus complexe et mal connu qui est médié également par une deuxième fonction de la glycoprotéine d'enveloppe.
La possibilité de modifier la spécificité de l'interaction avec la surface de la cellule cible a été antérieurement démontrée, notamment par le biais de modifications génétiques introduites dans la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale.
Un certain nombre de travaux ont montré que de telles modifications n'entraînent pas d'effets perturbateurs dans les processus complexes qui permettent à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'être maturée, exprimée à la surface cellulaire, et incorporée sélectivement dans les virions. De plus, il est maintenant prouvé que ces modifications peuvent entraîner la reconnaissance spécifique de cellules par interaction avec les molécules de surface correspondant à ces polypeptides. Enfin, dans certains cas, cette reconnaissance permet la poursuite du cycle infectieux et l'intégration du transgène dans la cellule ciblée avec, dans le meilleur des cas, une efficacité extrêmement réduite par rapport à l'efficacité que fournit une enveloppe rétrovirale non modifiée via son récepteur rétroviral normal. On en conclut, d'une part, que certaines molécules de surface cibles ne peuvent être utilisées comme récepteur pour initier l'infection et, d'autre part, dans le cas où elles peuvent l'être, les processus consécutifs à l'interaction primaire se font extrêmement peu efficacement. Ces conclusions sont vraies en ce qui concerne les stratégies de
"ciblage à une étape" , c'est-à-dire d'approches où l'interaction primaire a pour but d'entraîner directement la poursuite du cycle infectieux, sans intervention de procédés auxiliaires.
Les vecteurs rétroviraux sont actuellement les vecteurs les plus utilisés pour le transfert de gène et en particulier pour la thérapie génique, dès lors que l'on recherche une intégration et une expression stable du transgène. D'autres vecteurs de transfert de gène existent (adénovirus-vecteurs, liposomes, vecteurs dérivés du virus de l'herpès, ou encore vecteurs dérivés des AAV), mais ne permettent pas l'intégration stable et efficace du transgène. Si la plupart des protocoles de thérapie génique explorés jusqu'à présent et utilisant les vecteurs rétroviraux sont basés sur l' explantation de cellules du patient, leur transgénèse et expansion in vitro, suivi de leur réimplantation, il serait hautement souhaitable d'être capable de transférer un gène thérapeutique dans le contexte in vivo par le biais de vecteurs rétroviraux. Pour cela, la particule rétrovirale qui véhicule le gène thérapeutique devrait être dotée de certaines caractéristiques supplémentaires, et plus particulièrement, celle de pouvoir reconnaître très spécifiquement les cellules cibles du transfert génétique. En effet, les molécule de surface naturellement reconnues par les retrovirus pour l'initiation de l'infection sont exprimées très largement sur la plupart des cellules. Ceci n'autorise pas de discrimination précise des cellules dans lesquelles on souhaite effectuer un transfert de gène.
Plusieurs travaux ont eu pour objet la modification du tropisme d'infection des vecteurs rétroviraux. Certains de ces travaux s'appuient sur des modifications biochimiques des particules rétrovirales, d'autres sur des modifications génétiques des glycoprotéines d'enveloppe rétrovirales, ce qui garantit que toutes les particules rétrovirales seront modifiées. Dans ce dernier contexte, les travaux ont consisté en un "ciblage en une étape", pour laquelle la particule virale modifiée se fixe sur la molécule de surface cellulaire ciblée; ceci entraînant la poursuite du cycle infectieux. Cependant, l'efficacité des vecteurs rétroviraux ainsi modifiés est très faible en regard de ce que l'on attend pour obtenir un outil utilisable dans une perspective thérapeutique.
Il est possible que le développement de stratégies de ciblage ne puisse pas aboutir avec le système "à une étape", dues à certaines raison déjà évoquées plus haut inefficacité du processus fusiogénique des glycoprotéines d'enveloppe chimériques après leur liaison sur la molécule de surface ciblée, impossibilité d'utiliser certaines molécules de surface comme récepteurs rétroviraux.
Un certain nombre de protocoles de thérapie génique chez l'homme vont requérir des vecteurs rétroviraux capables d'effectuer un transfert de gène in vivo, par inoculation directe des particules rétrovirales recombinantes. Parmi les améliorations que ceci suppose par rapport aux vecteurs rétroviraux développés jusqu'à présent, on peut citer :
- l'amélioration des titres infectieux, - l'amélioration de la stabilité des particules virales dans le sérum et plus généralement dans les divers fluides de l'organisme,
- la possibilité d'infecter les cellules quiescentes,
- la possibilité de discriminer les cellules cibles de la thérapie génique. L'invention a pour objet de proposer des moyens permettant de discriminer les cellules cibles de la thérapie génique. Il est essentiel, pour certaines applications en thérapie génique, de garantir que le transfert de gène n'aura eu lieu que dans les cellules à traiter et pas dans d'autres catégories cellulaires. Par exemple, quand on souhaite conférer un avantage sélectif à des cellules normales vis-à-vis d'une chimiothérapie, il est impératif que le gène transféré conférant cet avantage n'ait pas été introduit dans des cellules cancéreuses.
L'invention a pour objet un mécanisme à deux étapes, dans lequel la deuxième étape est conditionnée par la réalisation de la première étape.
L'invention a pour objet une alternative intéressante sur le plan des performances du ciblage, notamment puisqu'elle combine la reconnaissance spécifique de la cellule cible et l'entrée dans la cellule cible associée à un mécanisme rétro viral naturel, connu pour son efficacité.
L'invention a plus particulièrement pour objet un mécanisme de ciblage à deux étapes : - la première étape permettant la reconnaissance d'une molécule de surface ciblée par l'intermédiaire du nouveau domaine de liaison N-terminal, inséré dans une glycoprotéine d'enveloppe,
- la deuxième étape permettant la reconnaissance, conditionnelle, d'un récepteur rétroviral normal par l'intermédiaire d'un domaine propre à la glycoprotéine d'enveloppe initiale et ainsi, autorisant un relais dans le processus d'entrée de la particule virale dans la cellule, le terme "conditionnel" signifiant que le relais dans le mécanisme d'entrée ne peut être effectué que si la particule virale a préalablement interagi avec la molécule de surface initiale qui, elle, garantit que l'infection est réellement ciblée. L' invention a pour objet de nouveaux peptides permettant la réalisation de la première étape dans un mécanisme à deux étapes et jouant le rôle de "masquage" vis-à-vis de la deuxième étape, tant que la première étape n' a pas eu lieu et permettant la deuxième étape, c'est-à-dire jouant le rôle de démasquage vis-à-vis de la deuxième étape si, et seulement si, la première étape a eu lieu.
La présente invention a également pour objet la construction de glycoprotéines d'enveloppe chimériques utilisant ces nouveaux peptides. L'invention concerne l'utilisation d'un peptide en vue d'un transfert de gènes dans une cellule eucaryote cible, lequel peptide présente d'environ 10 à environ 200, notamment d'environ 15 à environ 150 acides aminés, et avantageusement environ 20 acides aminés, dans lequel 30% au moins des acides aminés sont constitués par des résidus proline, lesquels résidus proline sont régulièrement agencés de manière à induire des repliements de la chaîne polypeptidique à environ 180° ("β-turn" ou "reverse-turn"), ces repliements étant régulièrement espacés et s'assemblant en une hélice polyproline à repliement de type β ("polyproline β-turn helix"), dans une construction polypeptidique contenant, du côté N-terminal (en amont) dudit peptide, un domaine protéique N-terminal (amont) susceptible de reconnaître une molécule de surface ciblée ou un antigène exprimé sur une surface cellulaire, notamment un récepteur approprié (récepteur ciblé) situé sur ladite cellule eucaryote, et du côté C-terminal (en aval) dudit peptide, un domaine protéique C-terminal (aval) susceptible de reconnaître un récepteur approprié (récepteur auxiliaire) situé sur la susdite cellule eucaryote, lequel peptide est capable de faciliter ou d'inhiber l'interaction entre le domaine protéique C-terminal (aval) et le récepteur auxiliaire, l'inhibition de cette interaction ayant lieu tant que le domaine protéique N-terminal (amont) n'a pas interagi avec le récepteur ciblé et la favorisation de l'interaction entre le domaine protéique C-terminal (aval) et le récepteur auxiliaire ayant lieu lorsque le domaine protéique N-terminal (amont) a interagi avec le récepteur ciblé.
Dans le cas d'un peptide de 20 acides aminés (ΔPRO défini ci-après), cette hélice polyproline à repliement de type β contient 4 repliements β et donc 4 spires, et est par ailleurs incompatible avec une structure secondaire en hélice α ou en feuillet β. De façon avantageuse, l'hélice polyproline à repliement de type β placée entre les deux domaines de la protéine chimère (domaine N-terminal et domaine auxiliaire) possède intrinsèquement , 1) une force élastomérique, 2) la propriété de s'auto-assembler avec d'autres hélices polyproline, probablement en relation avec la nature trimère de l'enveloppe, 3) la propriété de transmettre au domaine auxiliaire une déformation induite par la liaison du domaine N-terminal avec son récepteur, provoquant l'activation du domaine auxiliaire. L'invention vise généralement également tout mécanisme en deux étapes, la deuxième étape ne pouvant être réalisée que si la première étape a eu lieu, et concerne par exemple un mécanisme enzymatique impliquant une protéine chimère et ne devant intervenir que si la protéine chimère a été capable de reconnaître son substrat.
L'expression "domaine protéique N-terminal (amont) susceptible de reconnaître une molécule de surface ciblée, ou un antigène exprimé sur une surface cellulaire" , signifie que :
1) l'on peut caractériser l'interaction entre ce domaine protéique N-terminal et la molécule de surface ciblée par une constante de dissociation (de l'ordre du nanomolaire en ce qui concerne l'interaction glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale sauvage et récepteur rétroviral);
2) la forme soluble de ce domaine protéique N-terminal (c'est-à-dire non associée dans la construction de la glycoprotéine d'enveloppe chimère) possède des caractéristiques de liaison similaires à ce même domaine protéique quand il est inséré en position N-terminale dans la glycoprotéine d'enveloppe chimère ;
3) la glycoprotéine d'enveloppe chimère contenant le domaine protéique N-terminal peut être caractérisée selon des techniques classiques en virologie (exemple : test de liaison, cf. "Exemples"). Comme exemple de molécule de surface ciblée ou d'antigène exprimé sur une surface cellulaire, on peut citer :
- marqueurs de différenciation des divers lignages hématopoïétiques, en particulier marqueurs exprimés sur les cellules précoces et/ou les cellules souches hématopoïétiques (exemple : CD34), - marqueurs exprimés sur les cellules tumorales (exemple : antigènes carcino-embryonnaires) ,
- marqueurs présents spécifiquement sur des tissus différenciés divers (exemple : récepteur de facteurs de croissance, d'hormones peptidiques).
Comme exemple de molécule de surface ciblée, on peut citer notamment un récepteur qui sera dans la suite désigné par récepteur ciblé.
Pour les commodités de langage, dans ce qui suit, on englobera par l'expression "récepteur ciblé" toute molécule de surface ciblée ou tout antigène exprimé sur une surface cellulaire.
L'expression "domaine protéique C-terminal (aval) susceptible de reconnaître un récepteur approprié (récepteur auxiliaire)" signifie que le domaine protéique C-terminal peut interagir avec le récepteur auxiliaire, cette interaction étant caractérisée par une constante de dissociation qui est de l'ordre du nanomolaire si le domaine protéique C-terminal est dérivée d'une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale et si le récepteur auxiliaire est le récepteur rétroviral utilisé par cette même glycoprotéine, cette interaction permettant de déclencher le processus fusiogénique dans un mécanisme strictement similaire au processus naturel, c'est-à-dire en dehors du contexte d'une glycoprotéine d'enveloppe chimère.
Le peptide qui fait l'objet de l'invention est tel que, placé entre deux domaines proteiques, (un domaine protéique N-terminal par rapport audit peptide et un domaine protéique C-terminal par rapport audit peptide), il peut induire la fonction du domaine protéique C-terminal (par exemple la liaison si telle est la fonction de ce domaine C-terminal) si, et seulement si, le domaine protéique N-terminal a été mobilisé dans sa fonction (par exemple la liaison).
La non induction de la fonction du domaine protéique C-terminal par le peptide de l'invention correspond au mécanisme de "masquage" du peptide de l'invention, tandis que l'induction de la fonction du domaine protéique C-terminal par le peptide de l'invention correspond au mécanisme de
"démasquage" du peptide de l'invention. C'est pourquoi, dans la suite du texte, on désignera le peptide de l'invention également par "peptide masquant/démasquant" .
L'invention concerne l'utilisation d'un peptide selon l'invention, dans la construction d'une glycoprotéine à activité ciblante et fusiogénique, essentiellement intacte, portée par un vecteur recombinant viral ou non viral de transfert de gène capable d' infecter une cellule eucaryote, ladite cellule eucaryote comportant un récepteur ciblé et un récepteur auxiliaire permettant de faciliter l'entrée du susdit vecteur viral ou non viral dans la cellule eucaryote, la susdite glycoprotéine comprenant :
- le susdit peptide,
- un domaine protéique du côté N-terminal (en amont) du susdit peptide, susceptible d' interagir avec le susdit récepteur ciblé, lequel domaine protéique permet de lier spécifiquement le susdit vecteur de transfert de gènes et - un domaine protéique du côté C-terminal (en aval) du susdit peptide, susceptible d' interagir avec le susdit récepteur auxiliaire, laquelle interaction joue le rôle de mécanisme auxiliaire d'entrée du susdit vecteur de transfert de gènes dans la cellule eucaryote, le processus d'entrée cellulaire du vecteur viral ou non viral recombinant dans la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique C-terminal (aval) ne pouvant avoir lieu que lorsque le domaine protéique N-terminal (amont) a reconnu et lié le vecteur viral ou non viral recombinant avec le récepteur ciblé de la cellule eucaryote, entraînant par l ' intermédiaire du susdit peptide un mécanisme de "démasquage" ou encore d'accessibilité du récepteur auxiliaire vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval), et, dans le cas où il n'y a pas reconnaissance entre le susdit vecteur de transfert de gènes et le récepteur ciblé de la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique N-terminal (amont), se produit un mécanisme de "masquage" ou encore de non accessibilité, par l'intermédiaire du susdit peptide, du récepteur auxiliaire vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval).
L'expression glycoprotéine à activité ciblante et fusiogénique, désigne une glycoprotéine : 1) capable d'être incorporée efficacement sur des particules (rétro)virales véhiculant un transgène,
2) capable de reconnaître spécifiquement la molécule de surface cellulaire ciblée et de rediriger spécifiquement la liaison de la particule (rétro)virale qui la porte vers cette molécule, 3) capable de faire fusionner, après fixation sur la cible moléculaire, membrane de la particule (rétro)virale et membrane cytoplasmique de la cellule, selon le mécanisme naturellement utilisé par le (rétro)virus dont est issue la glycoprotéine d'enveloppe.
L'expression "substantiellement intacte" se réfère à une glycoprotéine virale qui retient tous ses déterminants nécessaires pour conserver les processus post-traductionnels, le cas échéant, l'oligomérisation, les propriétés d'incorporation virale et de fusion. Cependant, certaines altérations (telles que mutations, délétions, additions) peuvent être faites à la glycoprotéine sans affecter significativement ces fonctions et les glycoprotéines contenant de telles modifications mineures sont considérées substantiellement intactes pour les besoins de l'invention. En particulier, la glycoprotéine peut manquer de quelques acides aminés (par exemple environ 1 à 10), en particulier à l'extrémité N-terminale, mais sera généralement de la même taille que la protéine de type sauvage et possède essentiellement les mêmes propriétés biologiques que la protéine sauvage.
Par "vecteur recombinant viral de transfert de gène", on désigne n'importe quel virus capable d'infecter des cellules de type eucaryote, et de façon avantageuse un virus approprié pour la thérapie génique, tel qu'un adénovirus ou un retrovirus (par exemple un retrovirus de type C). Par "vecteur recombinant non viral de transfert de gène", on désigne des complexes macromoléculaires associant l'ADN contenant le gène transféré, ses séquences de régulation d'expression, et des molécules appartenant à la classe des lipides, des carbohydrates, ou des protéines, lesquels possèdent des propriétés fonctionnelles capables, 1) de cibler le dépôt de l'ADN sur la surface de la cellule cible, 2) d'introduire cet ADN à l'intérieur de la cellule ciblée, et 3) d'introduire cet ADN dans le noyau de la cellule ciblée.
Par "processus d'entrée cellulaire du vecteur recombinant viral de transfert de gène" , on désigne l'ensemble des événements aboutissant à l'introduction du gène véhiculé dans le cytoplasme de la cellule ciblée suite au contact initial entre la surface de cette cellule et le vecteur de transfert de gène.
A titre d'exemple, pour les vecteurs rétroviraux, en fonction d'une cible cellulaire définie pour laquelle on connaît une molécule de surface "ciblable" (c'est-à-dire suffisamment spécifiques par rapport aux autres tissus) et un ligand pour cette molécule de surface (ligand ou anticorps monochaîne), on peut construire génétiquement un gène codant pour la glycoprotéine d'enveloppe ciblant cette molécule de surface. Ceci est réalisé en fusionnant (de N à C-terminal) un peptide signal, le ligand, le peptide "masquant/démasquant", et le reste de l'enveloppe rétrovirale. Un vecteur d'expression pour cette molécule chimère est inséré dans une lignée cellulaire "semi-transcomplémentante" exprimant les protéines gag et pol du virus MLV (codant pour la capside rétrovirale et les enzymes de réplication du retrovirus). On obtient une lignée "transcomplémentante" qui peut alors servir à produire des vecteurs rétroviraux si on y introduit, en plus, un plasmide portant ce vecteur rétroviral, comme ceci a lieu pour les lignées transcomplémentantes classiques exprimant des enveloppes rétrovirales normales.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un peptide selon l'invention, dans la construction d'une glycoprotéine d'enveloppe (rétro)virale essentiellement intacte, portée par une particule (rétro)virale recombinante capable d'infecter une cellule eucaryote, ladite glycoprotéine d'enveloppe étant avantageusement sous forme polymérique, notamment sous forme trimérique, chaque monomère de la forme polymérique étant lui-même sous forme d'hétérodimère, ladite cellule eucaryote comportant un récepteur ciblé et un récepteur auxiliaire permettant de faciliter l'entrée de la susdite particule
(rétro)virale (récepteur (rétro)viral) dans la cellule eucaryote, la glycoprotéine d'enveloppe comprenant :
- le susdit peptide,
- un domaine protéique du côté N-terminal (en amont) du susdit peptide, susceptible d' interagir avec le susdit récepteur ciblé, laquelle interaction permet de lier spécifiquement la particule (rétro)virale et
- un domaine protéique du côté C-terminal (en aval) du susdit peptide, susceptible d' interagir avec le susdit récepteur (rétro)viral, laquelle interaction joue le rôle de mécanisme auxiliaire d'entrée de la particule (rétro) virale dans la cellule eucaryote, le processus d'entrée cellulaire de la particule (rétro)virale recombinante dans la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique C-terminal (aval) ne pouvant avoir lieu que lorsque le domaine protéique N-terminal (amont) a reconnu et lié le récepteur ciblé de la cellule eucaryote avec la particule (rétro)virale recombinante, entraînant par l'intermédiaire du susdit peptide un mécanisme de "démasquage" ou encore d'accessibilité du récepteur (rétro)viral vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval), et, dans le cas où il n'y a pas reconnaissance entre la particule virale recombinante et le récepteur ciblé de la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique N-terminal (amont), se produit un mécanisme de "masquage" ou encore de non accessibilité, par l'intermédiaire du susdit peptide, du récepteur (rétro)viral vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval). Les glycoprotéines d'enveloppe (rétro) virales sont des trimères d'hétéro- dimères de sous-unité de surface (SU) et de sous-unité transmembranaire (TM). Cette notion de trimérisation est fondamentale pour la fonctionnalité de l'enveloppe (rétro)virale. Les glycoprotéines d'enveloppe de l'invention sont avantageusement sous forme trimérique. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le domaine protéique N-terminal (amont) est choisi parmi les polypeptides suivants :
- anticorps monobrin reconnaissant des molécules de surface cellulaire,
- tout ligand pour une molécule de surface cellulaire, notamment hormones polypeptidiques, cytokine, facteurs de croissance. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le domaine protéique C-terminal (aval) correspond à une glycoprotéine d'enveloppe (rétro) virale, essentiellement intacte comportant le domaine naturel de liaison, les fonctions de fusion et d'ancrage de la glycoprotéine d'enveloppe sauvage dont dérive la glycoprotéine d'enveloppe portée par la particule (rétro)virale recombinante.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le peptide provient de la glycoprotéine d'enveloppe des retrovirus de type C, et en ce que le virus est avantageusement choisi parmi : le virus MLV écotrope, le virus MLV amphotrope, le virus MLV xénotrope, le virus MLV MCF, le virus MLV 10A1 , GALV (Gibbon Ape Leukemia Virus), SSAV (Simian Sarcoma
Associated Virus), FeLV A, FeLV B, FeLV C (FeLV: Féline Leukemia Virus), et notamment en ce que le peptide est choisi parmi ceux contenant ou étant constitués par l'une des séquences suivantes : PRO (4070A), PRO(MoMLV), ΔPRO, PRO + , ΔPRO + , PROβ, ΔPROβ, ΔPR04-β, ΔPR04-int, ΔPR04-vrb, PROβ, PRO-int, PRO-vrb.
L'invention a pour objet l'utilisation d'un peptide dérivé ou adapté de l'élastine bovine et choisi parmi ceux contenant ou étant constitué par l'une des séquences suivantes : EL3, EL3-V, EL5.
L'invention a également pour objet des séquences peptidiques choisies parmi celles contenant ou constituées par l'une des séquences suivantes :
-PRO (4070A), PRO(MoMLV), PROβ, PRO+, ΔPRO, ΔPROβ, ΔPRO+,
-MOAPRO, MOAΔPRO, - EMOPRO, EMOPROβ, EMOPRO+ , EAPRO, EAPROβ, EAPRO+ ,
EMOΔPRO, EMOΔPROβ, EMOΔPRO + , EAΔPRO, EAΔPROβ, EAΔPRO + , AMOEL3, AMOEL3-V, AMOEL5.
PRO (4070A), PRO(MoMLV), PROβ, PRO + , ΔPRO, ΔPROβ, ΔPRO+ , EL3, EL3-V, EL5 sont des peptides masquants/démasquants de l'invention. AMOPRO, AMOΔPRO, AMOEL3, AMOEL3-V, AMOEL5 correspondent à des enveloppes ciblant Ram-1.
MOAPRO, MOAΔPRO correspondent à des enveloppes ciblant Rec-1. EMOPRO, EMOPROβ, EMOPRO + , EAPRO, EAPROβ, EAPRO+ , EMOΔPRO, EMOΔPROβ, EMOΔPRO + , EAΔPRO, EAΔPROβ, EAΔPRO + correspondent à des enveloppes ciblant EGFR.
L' invention a également pour objet une séquence polypeptidique contenant un peptide d'environ 10 à environ 200, notamment d'environ 15 à environ 150 acides aminés, et avantageusement d'environ 20, dans lequel 30% au moins des acides aminés sont constitués par des résidus proline, lesquels résidus proline sont régulièrement agencés de manière à induire des repliements de la chaîne polypeptidique à environ 180° ("β-turn" ou "reverse-turn"), ces repliements étant régulièrement espacés et s'assemblant en une hélice polyproline à repliement de type β ("polyproline β-turn helix"),
- un domaine protéique N-terminal (en amont) du susdit peptide, susceptible de réagir avec un récepteur approprié (récepteur ciblé) situé sur une cellule eucaryote, lequel domaine protéique permet de lier spécifiquement une particule (rétro)virale recombinante contenant ledit domaine protéique N-terminal et
- un domaine protéique C-terminal (en aval) du susdit peptide, susceptible d' interagir avec un récepteur (rétro) viral auxiliaire approprié (récepteur (rétro)viral) situé sur ladite cellule eucaryote, laquelle interaction joue le rôle de mécanisme auxiliaire d'entrée de la particule (rétro)virale dans ladite cellule eucaryote, le processus d'entrée cellulaire de ladite particule (rétro)virale recombinante dans ladite cellule eucaryote par le biais du domaine protéique C-terminal (aval) ne pouvant avoir lieu que lorsque le domaine protéique N-terminal (amont) a reconnu et lié le récepteur ciblé de la cellule eucaryote avec ladite particule (rétro)virale recombinante, entraînant par l ' intermédiaire du susdit peptide un mécanisme de démasquage ou encore d'accessibilité du récepteur (rétro)viral vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval), et, dans le cas où il n'y a pas reconnaissance entre la particule virale recombinante et le récepteur ciblé de la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique N-terminal (amont), se produit un mécanisme de masquage ou encore de non accessibilité, par l'intermédiaire du susdit peptide, du récepteur (rétro)viral vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval).
L' invention concerne également une particule (rétro)virale recombinante susceptible d' infecter une cellule eucaryote, laquelle cellule comporte un récepteur ciblé et un récepteur auxiliaire de la susdite particule (rétro) virale, comprenant une glycoprotéine d'enveloppe substantiellement intacte, notamment sous forme polymérique et avantageusement sous forme trimérique, chaque monomère de la forme polymérique étant avantageusement lui-même sous forme hétérodimère, contenant un peptide d'environ 10 à environ 200, notamment d'environ 15 à environ 150 acides aminés, et avantageusement d'environ 20, dans lequel 30% au moins des acides aminés sont constitués par des résidus proline, lesquels résidus proline sont régulièrement agencés de manière à induire des repliements de la chaîne polypeptidique à environ 180Λ (" β-turn" ou "reverse-turn"), ces repliements étant régulièrement espacés et s'assemblant en une hélice polyproline à repliement de type β ("polyproline β-turn helix"),
- un domaine protéique du côté N-terminal (en amont) du susdit peptide, susceptible d' interagir avec le susdit récepteur ciblé, lequel domaine peptidique permet de lier spécifiquement la particule (rétro)virale et
- un domaine protéique du côté C-terminal (en aval) du susdit peptide, susceptible d' interagir avec le susdit récepteur (rétro)viral, laquelle interaction joue le rôle de mécanisme auxiliaire d'entrée de la particule (rétro) virale dans la cellule eucaryote, le processus d'entrée cellulaire de la particule (rétro)virale recombinante dans la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique C-terminal (aval) ne pouvant avoir lieu que lorsque le domaine protéique N-terminal (amont) a reconnu et lié le récepteur ciblé de la cellule eucaryote avec la particule (rétro)virale recombinante, entraînant par l' intermédiaire du susdit peptide un mécanisme de démasquage ou encore d'accessibilité du récepteur (rétro)viral vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval), et, dans le cas où il n'y a pas reconnaissance entre la particule virale recombinante et le récepteur ciblé de la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique N-terminal (amont), se produit un mécanisme de masquage ou encore de non accessibilité, par l'intermédiaire du susdit peptide, du récepteur rétroviral vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval).
L'invention concerne également une particule (rétro)virale recombinante caractérisée en ce que le domaine protéique N-terminal (amont) est choisi parmi les peptides suivants :
- anticorps monobrin reconnaissant des molécules de surface cellulaire,
- tout ligand pour une molécule de surface cellulaire, notamment hormones polypeptidiques, cytokine, facteurs de croissance.
L'invention concerne également une particule (rétro)virale recombinante caractérisée en ce que le domaine protéique C-terminal (aval) correspond à un polypeptide d'origine (rétro)virale comportant les fonctions de liaison, de fusion et d'ancrage de la glycoprotéine d'enveloppe sauvage dont dérive la glycoprotéine d'enveloppe portée par la particule (rétro) virale recombinante, et peut provenir des domaines naturels comportant les fonctions de liaison, de fusion et d'ancrage des glycoprotéines d'enveloppe issues des retrovirus
MLV-A, GALV, FeLVB, ou des virus tels que adénovirus, herpès virus, virus AAV (Adeno Associated Virus), ou plus généralement de glycoprotéines virales issues de virus d'origine eucaryote, notamment orthomyxovirus (tel que virus influenza) ou paramyxovirus (tel que SV5). L'invention concerne également une particule (rétro)virale recombinante caractérisée en ce que le peptide provient de la glycoprotéine d'enveloppe de retrovirus de type C, et en ce que le peptide provient avantageusement d'un virus choisi parmi : le virus MLV écotrope, le virus MLV amphotrope, le virus MLV xénotrope, le virus MLV MCF, le virus MLV 10A1 , GALV (Gibbon Ape Leukemia Virus), SSAV (Simian Sarcoma Associated Virus), FeLV A, FeLV
B, FeLV C (FeLV : Féline Leukemia Virus), et notamment en ce que le peptide est choisi parmi ceux contenant ou étant constitués par l 'une des séquences suivantes : PRO (4070A), PRO(MoMLV), ΔPRO, PRO+ , ΔPRO+ , PROβ, ΔPROβ, ΔPR04-β, ΔPR04-int, ΔPR04-vrb, PROβ, PRO-int, PRO-vrb. L'invention a également pour objet une particule (rétro)virale recombinante caractérisée en ce que :
- le peptide provient de la glycoprotéine d'enveloppe des retrovirus de type C, et en ce que le virus est avantageusement choisi parmi : le virus MLV écotrope, le virus MLV amphotrope, le virus MLV xénotrope, le virus MLV MCF, le virus MLV 10A1 , GALV (Gibbon Ape Leukemia Virus), SSAV (Simian Sarcoma Associated Virus), FeLV A, FeLV B, FeLV C (FeLV: Féline Leukemia Virus), et notamment en ce que le peptide est choisi parmi ceux contenant ou étant constitués par l'une des séquences suivantes : PRO (4070A),
PRO(MoMLV), ΔPRO, PRO + , ΔPRO + , PROβ, ΔPROβ, ΔPR04-β, ΔPR04-int, ΔPR04-vrb, PROβ, PRO-int, PRO-vrb.
- le domaine protéique N-terminal (amont) est choisi parmi les peptides suivants:
* anticorps monobrin reconnaissant des molécules de surface cellulaire, * tout ligand pour une molécule de surface cellulaire, notamment hormones polypeptidiques, cytokine, facteurs de croissance,
- le domaine protéique C-terminal correspond à un polypeptide d'origine (rétro)virale comportant les fonctions de liaison, de fusion et d'ancrage de la glycoprotéine d'enveloppe sauvage dont dérive la glycoprotéine d'enveloppe portée par la particule (rétro)virale recombinante, et peut provenir des domaines naturels comportant les fonctions de liaison, de fusion et d'ancrage des glycoprotéines d'enveloppe issues des retrovirus MLV-A, GALV, FeLVB, ou des virus tels que adénovirus, herpès virus, virus AAV (Adeno Associated Virus), ou plus généralement de glycoprotéines virales issues de virus d'origine eucaryote, notamment orthomyxovirus (tel que virus influenza) ou paramyxovirus (tel que SV5).
L'invention concerne également une particule (rétro)virale recombinante caractérisée en ce que l'extrémité 5' de la séquence nucléotidique codant pour le domaine protéique N-terminal (amont) est contiguë à l'extrémité 3' de la séquence nucléotidique codant pour le peptide signal, l'extrémité 3' de la séquence nucléotidique codant pour le domaine protéique N-terminal (amont) est contiguë à l'extrémité 5' de la séquence nucléotidique codant pour le peptide, l'extrémité 3' de la séquence nucléotidique codant pour le peptide est contiguë à l'extrémité 5' de la séquence nucléotidique codant pour le domaine protéique C-terminal (aval).
L'invention a également pour objet un acide nucléique codant pour un peptide ou pour une particule recombinante selon l'invention.
L'invention a également pour objet une méthode de transfert sélective in vitro ou ex vivo d'un acide nucléique dans des cellules eucaryotes cibles présentes parmi d'autres cellules non-cibles, comprenant l'administration aux cellules cibles et non-cibles d'une particule recombinante (rétro)virale selon
/'invention, contenant l'acide nucléique à transférer. L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique contenant à titre de substance active une particule (rétro)vιrale selon l' invention, et contenant également un gène à transférer, en association avec un véhicule pharmaceutique physiologiquement approprié. S 'agissant des gènes à transférer importants pour la thérapie génique, il s'agit par exemple de IFN, IL2, p53, VEGF, TNF, CFTR, HSV-TK, lacZ, GFP, gène de cytokines diverses, autres types de gènes suicides y compris gènes de suicide conditionnels, autres gènes à activité anti virale, autres gènes à activité antitumorale, autres gènes marqueurs et tout gène thérapeutique de maladie mono- ou multi-génique A titre d'exemple, les pathologies les plus spécifiquement concernées sont : la plupart des maladies mono- ou multi- génique (mucovisidose, myopathie, maladies lysosomales, les formes diverses de cancer, les maladies virales (SIDA), ...)
Pour bien comprendre le mécanisme de l'invention (voir figure 1), il faut considérer que les glycoprotéines d'enveloppe selon l'invention (également désignées par "enveloppes chimères") possèdent, outre un domaine de reconnaissance additionnel, les fonctions correspondant à leurs domaines propres , c'est-à-dire (voir figure 2),
1) le domaine de liaison naturel situé dans la partie N-terminale de la sous- unité de surface (SU) de la glycoprotéine d'enveloppe sauvage, et donc, juste en aval du domaine de liaison surnuméraire et
2) le domaine de fusion localisé dans la partie C-terminale de la sous-unité (SU) et dans la sous-unité transmembranaire (TM) du complexe de glycoprotéine d'enveloppe. Pour les enveloppes chimères construites précédemment (enveloppes EMO et AMO, par exemple) en s 'appuyant sur la structure générale schématisée en Figure 2, le domaine de liaison naturel est fonctionnel. Si le récepteur rétroviral qu'il reconnaît est exprimé à la surface de la cellule cible, alors ce domaine le reconnaîtra, et permettra le poursuite de l'infection. Il n'y aura alors pas de possibilité de ciblage spécifique, même si une molécule de surface reconnaissant spécifiquement le domaine de liaison surnuméraire est aussi exprimée
Cependant, en fonction du peptide inséré entre le domaine de liaison surnuméraire et le domaine de liaison naturel, il est possible de moduler fortement la fonctionnalité du domaine de liaison naturel et, dans le cas de certains de ces peptides, d'empêcher efficacement son accessibilité pour la reconnaissance du récepteur rétroviral (première action). Ce même domaine pourra être démasqué, et donc devenir accessible à une interaction avec le récepteur rétroviral normal, si et seulement si le domaine de liaison surnuméraire a préalablement interagi avec la molécule de surface ciblée. Cette deuxième action est également médiée par le peptide séparant les deux domaines. Le récepteur rétroviral normal joue ici le rôle de molécule auxiliaire.
Légende des figures :
- la Figure 1 représente le processus d'entrée en deux étapes de la particule virale ciblante. Les particules virales sont générées (A) avec des glycoprotéines d'enveloppes ciblantes composées d'un domaine N-terminal (ligand, anticorps monobrin, etc), du peptide masquant/démasquant, et d'un domaine C-terminal (B). Les étapes donnant lieu à l'introduction du virion dans la cellule ciblée font intervenir un mécanisme coordonné par le peptide masquant/démasquant (C).
- la Figure 2 est une représentation schématique de certaines des enveloppes ciblantes étudiées. La position de quelques régions fonctionnelles est montrée. Flèches verticales: sites des clivage protéoly tique. SU: sous-unité de surface, TM: sous-unité de transmembrane, SP: peptide signal, PRO: région poly-proline, T: domaine transmembranaire, Ram-1 ligand: domaine de liaison pour le récepteur amphotrope, Rec-1 ligand: domaine de liaison pour le récepteur écotrope, EGF: facteur de croissance épidermique ("epidermal growth factor"). Boites gris foncé: séquence dérivées du gène env de MoMLV, Boites gris clair: séquence dérivées du gène env de MLV-4070A, Boites blanches: autres séquences dérivées des MLV. Boites noires: peptides espaceurs dérivés de la région poly-proline. Tous les gènes env sont exprimés à partir du même promoteur (LTR) et signal de polyadenylation (pA) à partir du ARNm sous- génomique utilisant les sites d'épisage rétroviraux, donneur (SD) et accepteur
(SA), avec une séquence intronique identique de 190 nts contenant la fin du gène pol (ΔPOL). La position de certains sites de restriction est représentée.
- la Figure 3 représente la séquence des peptides espaceurs et des domaines de liaison étudiés. (A) Séquence des peptides espaceurs dans la série AMO. AS208 et fusionnés avec les divers peptides espaceurs, et l'ensemble est fusionné avec le codon 7 de la SU de l'enveloppe du MoMLV. (B) Séquence des peptides espaceurs dans la série MOA. Le domaine de liaison à Rec-1 est fusionné avec les divers peptides espaceurs, et l'ensemble est fusionné avec le codon 5 de la SU de l'enveloppe du MLV-Amphotrope. (C) Séquence des peptides espaceurs dans la série EMO et EA. Le domaine de liaison EGF est fusionné avec les divers peptides espaceurs, et l'ensemble est fusionné avec le codon 5 de la SU de l'enveloppe du MLV-Amphotrope ou avec le codon 7 de la SU de l'enveloppe du MoMLV. - la Figure 4 représente la détection de l'expression membranaire des enveloppes de la série EMO. Des populations de cellules transfectées et sélectionnées à la phléomycine sont marquées avec (histogrammes noirs) ou sans (histogrammes blancs) anticorps anti-hEGF, puis avec des anticorps anti-IgG de souris couplés à la FITC.
- la Figure 5 représente l'expression et l' incorporation virale des enveloppes chimères de la série AMO. Immunoblots sur des lysats de cellules TELCeBό transfectées par les plasmides exprimant les enveloppes chimères (voir Figure 2 et Figure 3A) et sur des culots de particules virales purifiées par ultracentrifugation. Les immunoblots sont révélés avec un anti-sérum anti-SU
(partie haute) ou avec un anti-sérum anti-p30-CA (partie basse, taille inférieure à 46 KD). Les positions de la p30-CA (CA), et, pour les enveloppes sauvages MO, du précurseur (PR) et de la protéine surface (SU) du complexe d'enveloppe sont représentées. - la Figure 6 représente les tests de liaison sur cellules humaines des enveloppes de la série EMO (A) et AMO (B). Le bruit de fond de fluorescence est fourni par incubation des cellules humaines avec l'enveloppe écotrope (histogrammes blancs),
- la Figure 7 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de PRO(4070A).
- la Figure 8 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de PRO(MoMLV).
- la Figure 9 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de PROβ(MoMLV). - la Figure 10 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de
PRO +(4070 A).
- la Figure 11 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de ΔPRO.
- la Figure 12 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de ΔPROβ.
- la Figure 13 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de ΔPRO+ .
- la Figure 14 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de AMOPRO. - la Figure 15 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de
AMOΔPRO.
- la Figure 16 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de MOAPRO. - la Figure 17 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de MOAΔPRO.
- la Figure 18 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de EMOPRO. - la Figure 19 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de
EMOPROβ.
- la Figure 20 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de EMOPRO+ .
- la Figure 21 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de EAPRO.
- la Figure 22 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de EAPROβ.
- la Figure 23 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de EAPRO + . - la Figure 24 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de
EMOΔPRO.
- la Figure 25 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de EMOΔPROβ.
- la Figure 26 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de EMOΔPRO + .
- la Figure 27 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de EAΔPRO.
- la Figure 28 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de EAΔPROβ. - la Figure 29 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de
EAΔPRO + .
- la Figure 30 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de AMOEL3.
- la Figure 31 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de EL3.
- la Figure 32 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de AMOEL3-V.
- la Figure 33 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de EL3-V. - la Figure 34 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de
AMOEL5.
- la Figure 35 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de EL5. - la Figure 36 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de ΔPR04-beta.
- la Figure 37 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de ΔPR04-int. - la Figure 38 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de
ΔPR04-vrb.
- la Figure 39 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de PRO-beta.
- la Figure 40 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de PRO-int.
- la Figure 41 représente la séquence en acides aminés et en nucléotides de PRO-vrb.
EXEMPLES
EXEMPLE 1 :
Les retrovirus utilisent un certain nombre de molécules de surface cellulaire, appelées récepteurs viraux, pour initier le processus infectieux (23). Sauf exceptions notables, cas des virus de l' immunodéficience humaine notamment, la plupart des récepteurs utilisés par les autres retrovirus et en particulier les retrovirus mammifères de type C sont distribués sur la plupart des types cellulaires de l'organisme hôte. Par exemple le virus de leucémie murine amphotrope (MLV-A) est capable d'infecter la plupart des cellules mammifères car son récepteur, le transporteur de phosphate Ram-1 , est exprimé sur quasiment toutes les cellules.
Les retrovirus mammifères de type C sont couramment utilisés pour faire des vecteurs rétroviraux, en particulier à des fins de transfert de gène chez l'homme, en thérapie génique. Certains protocoles de thérapie géniques seraient facilités si les vecteurs rétroviraux étaient capables de reconnaître très précisément les réelles cellules cibles du transfert de gène. Pour cela, un certain nombre de groupes de recherche, dont le nôtre, ont développé des stratégies diverses visant à modifier la reconnaissance entre la particule virale et la surface cellulaire. Cette interaction implique essentiellement la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale; il paraît donc logique de réaliser des modifications génétiques sur cette protéine afin de lui permettre de reconnaître des molécules de surface cellulaire spécifiquement exprimées sur les cellules cibles du transfert de gène. Deux types de stratégies permettant de telles modifications ont été récemment développés. Dans une première stratégie, c'est le domaine de liaison naturel de la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale pour son récepteur qui a été modifié par insertion ou substitution de peptides de tailles réduites capables de lier une molécule de surface cellulaire. Ces travaux ont permis de démontrer la faisabilité du ciblage cellulaire du transfert de gène (20).
Dans une deuxième approche, des polypeptides (ligands, anticorps monobrins) capables de lier des molécules de surface cellulaire diverses ont été insérés à l'extrémité N-terminale de la sous-unité SU de la glycoprotéine d'enveloppes (6) (10) (13) (15) (21). D'une manière générale, l'étude des virions générés avec ces divers types d'enveloppes ciblantes a montré qu'il était possible de rediriger spécifiquement et efficacement la liaison des particules virales vers de nouvelles molécules de surface. Certains facteurs qui limitent l'efficacité du ciblage ont été également identifiés. Le premier semble dépendre de propriétés physiologiques de la molécule de surface ciblée (dimérisation, internalisation, processus de transport ("trafficking") intracellulaire) (6), le deuxième est lié à la faible fusiogénicité intrinsèque des glycoprotéines d'enveloppes chimères générées par insertion N terminale de ligands (6) (21). Il a été observé que cette faible fusiogénicité peut être partiellement surmontée en introduisant un peptide espaceur entre le nouveau domaine de liaison et l'enveloppe (21). Cependant, les meilleurs titres infectieux obtenus sont 100 fois inférieurs à ceux que l'on peut obtenir avec des vecteurs rétroviraux portant une enveloppe sauvage. De plus, il est possible que ces résultats acquis dans un modèle de ciblage particulier (ciblage de Ram-1), ne puisse être étendu à d'autres types de glycoprotéines d'enveloppes ciblantes. Il paraissait donc essentiel de développer des stratégies alternatives pour répondre aux problèmes évoqués.
Par ailleurs, une constatation générale faite avec les glycoprotéines d'enveloppes ciblantes générées par insertions N terminales est que le domaine de liaison naturel de l'enveloppe support est toujours fonctionnel. Dans la mesure où les cellules cibles sont des cellules humaines en thérapie génique, cette fonctionnalité du domaine de liaison naturel ne pose pas de problèmes de "bruit de fond" d'infection car on utilise, comme glycoprotéine support, l'enveloppe écotrope du virus MoMLV qui ne reconnaît pas de récepteur sur les cellules des mammifères supérieurs. Cependant, il a paru intéressant de caractériser ces glycoprotéines d'enveloppes chimères capables de reconnaître deux molécules de surface différentes, de voir quelle pouvait être l'influence du peptide espaceur dans cette reconnaissance, et d'estimer les contributions relatives des deux types d'interaction dans le processus infectieux.
Ces observations, qui font l'objet des travaux décrits ci-dessous, ont conduit à développer une stratégie de ciblage en deux étapes qui fait d'abord intervenir une reconnaissance spécifique entre le ligand inséré à l'extrémité
N-terminale de la glycoprotéine ciblante, et ensuite un mécanisme auxiliaire permettant de faciliter l'entrée du virus spécifiquement lié à la bonne cible cellulaire par le biais du récepteur rétroviral naturel. Pour éviter tout problème de bruit de fond d'infection lié à l'interaction directe entre le domaine naturel de liaison et le récepteur rétroviral naturel, des peptides espaceurs masquant/démasquant ont également été développés, insérés entre le domaine ciblant et la glycoprotéine d'enveloppe support, et qui sont capables de masquer le domaine de liaison naturel tant que la particule virale n'a pas interagi avec la molécule de surface ciblée. La réalisation de cette interaction induit le démasquage du domaine de liaison naturel et l'interaction entre le domaine naturel de liaison et le récepteur rétroviral naturel (mécanisme auxiliaire) qui prend alors le relais pour introduire le virus dans la cellule.
Matériels et Méthodes : Lignées cellulaires. La lignée cellulaire TELCeBό (7) dérive de la lignée TELacZ (19) par transfection et sélection clonale des cellules exprimant les protéines gag et pol de MoMLV (Moloney Murine Leukemia Virus : Virus de la leucémie murine Moloney). Les cellules TELacZ expriment le vecteur rétroviral MFGnlslacZ capable de transduire une β-galactosidase nucléaire. Les cellules TELCeBό permettent la production de capsides rétrovirales (non infectieuses car dépourvues d'enveloppes) véhiculant le vecteur rétroviral marqueur nlsLacZ. Les cellules A431 (ATCC CRL1555) et TE671 (ATCC CRL8805) sont cultivées en milieu DMEM (Gibco-BRL) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal (Gibco-BRL). Les cellules CHO, CERD9 (9), et CEAR13 (9) sont cultivées en milieu DMEM (Gibco-BRL) supplémenté par 10% de sérum de veau foetal et proline (Gibco-BRL). Les lignées cellulaires NIH-3T3 et dérivées de NIH-3T3 sont cultivées en milieu DMEM (Gibco-BRL) supplémenté par 10% de sérum de veau nouveau né (Gibco-BRL). Enveloppes chimères. Les fragments ADN codant pour les polypeptides reconnaissant soit EGFR
(Récepteur à l'EGF) soit Ram-1 (Récepteur MLV- A) ont été générés après PCR (polymerase chain reaction) par utilisation d'oligonucléotides comprenant des sites de restrictions. Ces polypeptides ont été introduits en N-terminal de la protéine SU de MLV (protéine de Surface gp70) dans laquelle les sites de restrictions Sfil et Notl ont été créés au codon +6 (33). Un diagramme schématique des différents gènes env utilisés dans cet article est rapporté en Figure 2. Brièvement, un fragment ADN dérivé d'une amplification PCR, codant pour les 53 acides aminés de l'EGF humain (3) a été généré en utilisant une matrice ADNc (ATCC 59957) et deux oligonucléotides: OUEGF: (5' > ATGCTCAGAGGGGTCAGTACGGCCCAGCCGGCCATGGCCAATAG TGACTCTGAATGTCC) avec un site de restriction Sfil et OLEGF: (5'>ACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCGCGGCCGCATGTGGGGGTCCA GACTCC) comprenant un site Notl. Après digestion par Sfil et Notl, ces fragments ont été clones dans un gène codant soit pour la protéine SU de MoMLV dans le cas de la protéine chimère EMO, soit SU du virus 4070A pour la protéine chimère EA (6) .
Pour la construction AMO (6), un site Notl a été créé à la fin du domaine de reconnaissance du récepteur dans l'enveloppe 4070 A (appelé AS208), (2), et le nucléotide (nt) 750 (14) en utilisant un fragment PCR généré à partir du site Xhol (nt 594) jusqu'au nt 750 avant la région riche en proline, grâce à deux oligonucléotides: 805FC (5 ' > TCCAATTCCTTCCAAGGGGC) en amont de
Xhol et
806FC (5 ' > ACCCCCACATGCGGCCGCTCCCACATTAAGGACCTGCCG) comprenant un site de restriction Notl. L'enveloppe chimère est constituée par clonage du fragment PCR Xhol/Notl et du fragment Notl/Clal, isolé à partir du gène env EMO (codant pour les protéines SU et TM- P15E Transmembranaire de MoMLV), entre les sites Xhol/Clal du gène env 4070A MLV.
Les constructions résultantes sont récupérées sous la forme d'un fragment BglII/Clal (correspondant aux positions 5408 et 7676 dans MoMLV) et clonées aux sites BamHI et Clal d'un plasmide d'expression FBMOSALF (7) dans lequel un gène marqueur de sélection (8) fusionnés au séquences de polyadénylation du gène PGK (phospho-glycerate kinase) a été introduit en aval de la LTR 3' du virus MLV-C57.
Pour EMO, EA, ou AMO, le nouveau domaine de reconnaissance a été séparé du reste de l'enveloppe MLV par un peptide espaceur constitué par trois alanines, apporté par le site de clonage Notl (15). Dans trois autres séries d'enveloppes ciblantes (dérivées des enveloppes EMO, EA ou AMO), des acides aminés espaceurs ont été introduits soit après le domaine de reconnaissance de EGFR (EGF), soit après le domaine de reconnaissance de Ram-1 (AS208) comme décrit ci-après.
La série d'enveloppes ciblant Ram-1 a été générée en introduisant différents espaceurs entre le domaine de reconnaissance de Ram-1 et l'enveloppe MoMLV (Figure 3A). Pour AMOPRO, une région de 59 acides aminés riche en proline provenant de la SU 4070A (amphotrope) (nucléotides 751 à 927) (14) a été utilisée. Une plus courte région riche en proline également isolée à partir de l'enveloppe MLV 4070A (nt 751-789) a été utilisée pour AMOΔPRO. Cette région correspond à l' espaceur de 13 acides aminés du produit v-mpl (provenant du virus de la leucémie myeloprolifératrice) (18) localisé entre sa région dérivée de env et l'équivalent du gène cellulaire mpl.
Dans le cas de AMOl , les 208 premiers acides aminés, dérivés de l'enveloppe de MLV 4070 A, ont été fusionnés à l'acide aminé 1 de la SU de MoMLV. Pour AMOlFx, un site de 4 acides aminés correspondant au site de clivage du facteur de coagulation sanguine Xa (Ile-Glu-Gly-Arg) (12) a été inséré après le domaine de reconnaissance de Ram-1 et fusionné au codon + 1 de la SU de MoMLV. La stratégie utilisée pour ces constructions est décrite ci- avant. Brièvement, un oligonucléotide (5'-TCCAATTCCTTCCAAGGGGC-3'), localisé juste en amont du site Xhol du gène env de 4070A (nt 594) a été utilisé en combinaison avec soit l'un ou l'autre des deux oligonucléotides suivants apportant le site Notl :
5'-AGTATGCGGCCGCTGGGGGTGGCTGTGGGACAC-3'et 5 ' -T ATCTGCGGCCGCGTCGGGT AAT ACTGGGTTGG-3 ' afin de générer par PCR, en utilisant une matrice env 4070A, des fragments 3' pour les enveloppes AMOPRO et AMOΔPRO respectivement.
Ces fragments PCR ont été soumis à une digestion par Xhol et Notl et clones dans le plasmide FBAMOSALF ouvert en Xhol/Notl, un plasmide exprimant une enveloppe de type AMO. Les plasmides exprimant les enveloppes AMOFx, AMOl et AMOlFx ont été générées par clonage du fragment Ndel/Notl de FBAMOSALF (comprenant le domaine de reconnaissance Ram-1) dans une série de plasmides (13) exprimant les enveloppes MoMLV modifiées afin de créer un site Notl au codon 1 ou au codon 6 avec (AMOlFx, AMOFx) ou sans (AMOl) la séquence Xa. Des enveloppes dérivées de AMO et contenant d'autres types de peptides espaceurs ont été construits. L'ensemble de ces peptides espaceurs est représenté en Figure 3 A.
Les enveloppes MOAPRO et MOAΔPRO ont été générées selon une méthode similaire à celle des enveloppes AMOPRO et AMOΔPRO. Le plasmide FBEASALF, exprimant les enveloppes EA a été ouvert en Ndel/Notl. Cet ADN a été utilisé pour cloner deux fragments: le fragment 5 ' Ndel/BamHI provenant de la digestion du plasmide FBMOSALF (exprimant les enveloppes MO, écotropes) et contenant outre la LTR5' et la séquence rétrovirale leader, l 'extrémité N-terminale du gène env du virus MoMLV (position 6565), (17). Des fragments 3 ' ont été générés par PCR en utilisant comme matrice le gène env de MoMLV, comme oligonucléotide 5 ' (5 ' -ACTGGGGCTTACGTTTGT-3 ') en amont du site BamHI, et comme oligonucléotide 3' (5 '-TATGTGCGGCCGCCGGTGGAAGTTGGGTAGGGG-3 ') ou (5 ' -TATGTGCGGCCGCGTCTGGCAGAACGGGGTTTGG-3 ' ) pour construire les enveloppes MOAPRO et MOAΔPRO, respectivement. Ces fragments de PCR ont été digérés par BamHI et Notl, et co-ligués avec le fragment 5 ' . La séquence des peptides espaceurs pour ces deux constructions est représentée dans la Figure 3B.
FBEMOSALF, exprimant les enveloppes chimères EMO (6), a été soumis à une digestion par BssHII, un remplissage par l'enzyme Klenow et digestion par Ndel. Le fragment résultant de 1 ,8 Kb, comprenant la LTR5 ' , la séquence leader, la fin du gène pol et EGF humain, a été isolé et inséré soit dans FBAMOΔPROSALF soit FBAMOPROSALF (plasmides exprimant respectivement les enveloppes chimères AMOΔPRO et AMOPRO) dans lesquels le fragment Ndel/EcoRI a été éliminé et le site EcoRI rempli afin de générer les plasmides exprimant les enveloppes EMOΔPRO + et EMOPRO + , respectivement. Des plasmides exprimant les enveloppes EMOI , EMOlFx ont d'autre part été générés. La séquence des peptides espaceurs . pour ces deux constructions est représentée dans la Figure 3C. Les plasmides exprimant les enveloppes EAPRO + et EAΔPRO + ont été générés par remplacement du fragment Sfil/Not du plasmide FBEASALF par les fragments Sfil/Notl issus des plasmides exprimant les enveloppes EMOPRO + et EMOΔPRO + .
Enfin pour ces diverses enveloppes EMODPRO + , EMOPRO + , EAPRO + et EAΔPRO + , les peptides espaceurs ont été réduits dans leur partie
N-terminale. Pour cela, un fragment d'ADN a été généré par PCR en utilisant comme matrice le gène EMO, oligonucléotide 5 '
(5 '-ACCATCCTCTAGACGGACATG-3 ' ) en amont du site Xbal précédant le codon initiateur et comme oligonucléotide 3 ' (5'- TATCAGGATCCCAAATGTAAGCCCTGGATCGCGCAGTTCCCACCACTT
CAGGTCTCGGTACTGAC-3 ') contenant un site BamHI. Cet ADN a été digéré par Xbal/BamHI et clone dans l 'un ou l'autre des plasmides exprimant les enveloppes EMOPRO + ou EMOΔPRO + , préalablement débarrassés des fragments Xbal/Notl, par co-ligation avec les fragments BamHI/Notl obtenus à partir des plasmides exprimant les enveloppes MOAPRO et MOAΔPRO. Il en résulte deux plasmides capables d'exprimer les enveloppes EMOPROβ et EMOΔPROβ, respectivement (Figure 3C), dans lesquelles EGF est fusionné juste en amont du site BamHI de l'enveloppe du virus MoMLV (nt 6537), (17) avant la région riche en proline et en laissant intact le feuillet β potentiel. L'un ou l'autre des fragments Sfil/Notl issus de ces deux dernières constructions ont ensuite été réintroduits dans le plasmide FBEASALF préalablement débarrassés du fragment Sfil/Not; il en résulte deux plasmides capables d'exprimer les enveloppes EAPROβ et EAΔPROβ, respectivement (Figure 3C).
Dans une autre série de construction (EMOPRO, EMOΔPRO, EAPRO, EAΔPRO), le feuillet β potentiel a été enlevé, et EGF fusionné directement au niveau de la région riche en proline (Figure 3C). Production de virus. Les plasmides exprimant les enveloppes ont été transfectés par la méthode de précipité de phosphate de calcium (16) dans la lignée cellulaire TeLCeBό. Les cellules ont été soumises à une sélection par la phléomycine (50 mg/ml), puis les clones résistants ont été trypsinés en masse. Ces cellules à confluence sont utilisées pour récupérer les surnageants viraux après une nuit d'incubation dans du milieu DMEM en présence de FCS (10%). Ces surnageants sont soumis à une ultracentrifugation dans le but d'obtenir des échantillons d'analyse en Western Blots, en tests de liaison (tests de "binding") et d'infection. Immunoblots. Les cellules productrices de virus sont lysées pendant 10 min à 4°C dans du tampon Tris-HCL 20mM (pH 7,5), contenant du tritonXIOO 1 % , SDS 0,05 % , deoxycholate 5 mg/ml, NaCl 150 mM et PMSF
1 mM. Après centrifugation 10 min à 10 000 g, afin de culotter les noyaux cellulaires, les surnageants sont congelés à -70 °C jusqu'à analyse. Ces échantillons viraux sont obtenus par ultracentrifugation des surnageants viraux (10 ml) dans un rotor SW41 Beckman (30 000 rpm, lh à 4°C). Les culots sont resuspendus dans 100 ml de PBS (Phosphate Buffered saline) et congelés à
-70°C. Les échantillons (30 mg de lysats cellulaires ou 10 ml de virus purifiés) sont mélangés avec un ratio de 5: 1 à du tampon 375 mM Tris-HCl (pH 6,8) contenant SDS 6% , b-mercaptoéthanol 30% , glycérol 10% et bleu de bromophénol 0,06% , puis bouillis 3 min et analysés sur gels d'acrylamide 10% /SDS. Après transfert des protéines sur membrane de nitrocellulose; le marquage immunologique est effectué dans du TBS (Tris base Saline, pH 7,4) en présence de lait écrémé 5 % et du tween 0, 1 % . Des anticorps (Quality Biotech Inc, USA) provenant d'anti-sérum de chèvre, dirigés contre gp70-SU de RLV (Rauscher Leukemia Virus) ou p30 de RLV ont été utilisés à la dilution 1 :1000 ou 1/10000 respectivement. Les blots ont été révélés par utilisation d'un anticorps conjugué d'origine lapin dirigés contre les Immunoglobulines de chèvres (DAKO, UK) grâce à un kit électrochemoluminescence (Amersham Life Science).
Tests de liaison ("binding").
Les cellules cibles ont été lavées par du PBS et décollées par incubation
10 min à 37°C par du versene 0,02% dans du PBS. Ces cellules sont rincées par du PBA (PBS contenant 2% de FCS et du sodium d'azide 0, 1 %). 106 cellules sont alors incubées en présence de virus pendant 30 min à 4°C pour la série d'enveloppe EMO ou 45 min à 37 °C pour la série des enveloppes AMO. Après rinçage par du PBA, les cellules sont incubées en présence d'anticorps monoclonal 83A25 (Evans et al., 1990) pendant 30 min à 4°C. Après deux rinçages par du PBA, les cellules sont incubées 30 min à 4°C en présence d'anticorps conjugués anti-rat couplés au FITC (Dako; UK). 5 min avant les deux rinçages finaux dans du PBA, les cellules sont contre colorées par de l'iodure de propidium (20 mg/ml). La fluorescence des cellules vivantes est analysée dans un FACS (FACScalibur, Beckton Dickinson).
Tests d'infection. Les cellules cibles sont ensemencées dans des plaques de culture 24 puits à une densité de 3.10^ cellules par puits. Différentes dilutions des surnageants viraux, contenant du polybrène à raison de 4 mg/ml sont ajoutées sur les cellules pendant 3 à 5 h à 37°C. Les surnageants sont par la suite remplacés par du milieu frais et les cellules incubées pendant 24 à 48 h à 37 °C. Une coloration X-gal est alors effectuée comme précédemment décrit (4). Les titres viraux sont estimés comme précédemment rapporté (5) en nombre de colonies par ml
(lacZ i.u./ml).
Afin de bloquer les EGFR, les cellules cibles sont incubées pendant 30 min à 37°C dans un milieu contenant 10~6 M d'EGF recombinant humain (236-EG, R&D Systems, UK). Les cellules sont alors rincées et les infections effectuées comme précédemment décrit. Afin de bloquer l'acidification des endosomes, 100 mM de phosphate de chloroquine (Sigma, UK) est ajoutée au milieu. Six h après infection, les cellules sont rincées et incubées dans un milieu normal. Résultats et discussion.
Construction des enveloppes mutantes.
Deux séries d'enveloppes modifiées capables de reconnaître soit le récepteur rétroviral Ram-1 (11), (22), soit le récepteur de l'EGF ont été générées. Une première enveloppe ciblant Ram-1 , AMO, a été construite par insertion en N-terminal de l'enveloppe de MoMLV (par fusion avec le codon 7) d'un polypeptide reconnaissant Ram-1 (AS208, Figure 3 A) et correspondant aux 208 premiers acides aminés de la SU de MLV-A (1). La séquence codant pour l'EGF a été insérée dans le gène env de MLV en position +6 de la SU de
MoMLV (Figure 2). Il a préalablement été démontré que ce site d'insertion permettait l'expression d'un fragment simple chaîne d'anticorps à la surface des virions (15). Dans le cas de l'enveloppe chimère EMO (Figure 2), l'EGF humain a été inséré dans l'enveloppe de MoMLV à la même position, alors que pour l'enveloppe EA, l'insertion a été effectuée dans l'enveloppe amphotrope de
MLV en position +5.
Pour les enveloppes AMO, EMO et EA, les nouveaux domaines de liaison ("binding") ont été séparés du domaine de reconnaissance du récepteur rétroviral par un peptide espaceur correspondant à trois alanines. Pour les deux types d'enveloppes parentales ciblant Ram-1 ou ciblant EGFR, diverses constructions ont ensuite été générées par insertion d' espaceurs de différentes tailles et structures. Les séquences proteiques de ces différents espaceurs sont rapportés dans la Figure 3 A dans le cas des enveloppes ciblant Ram-1 et dans la Figure 3C pour les enveloppes ciblant EGFR. Les plasmides exprimant les différentes enveloppes, y compris les enveloppes contrôles écotropes (MO) et amphotropes (A), ont été transfectées dans la lignée cellulaire TELCeBό qui exprime les protéines codées par les gènes gag et pol, ainsi qu'un vecteur rétroviral nlsLacZ (7).
Expression et incorporation des enveloppes dans les virions.
Les lysats proteiques des cellules correspondantes ont été analysés pour l'expression d'enveloppes à l'aide d'anticorps dirigés contre la SU de MLV (Figure 5) pour la plupart des enveloppes de la série AMO, non montré pour les autres enveloppes chimères). Pour toutes les enveloppes chimères, les précurseurs et la forme mature SU des enveloppes ont pu être décelés à la taille attendue et à un niveau similaire aux enveloppes sauvages, suggérant que ces enveloppes chimères sont normalement produites et maturées.
L'expression à la surface cellulaire a été déterminée par analyse au FACS des cellules productrices, en utilisant des anticorps dirigés contre la SU ou en utilisant un anticorps monoclonal anti-EGF. Les cellules transfectées par les différentes enveloppes peuvent être marquées par l'anticorps anti-SU (non présenté). Seules les cellules exprimant les enveloppes fusion EGF enveloppes peuvent être marquées à l'aide des anticorps monoclonaux anti-EGF (Figure 4). Ceci démontre l'expression des enveloppes chimères à la surface cellulaire et le repliement correct de l'EGF sur les glycoprotéines chimères.
Afin de démontrer l'incorporation des enveloppes chimères dans les particules rétrovirales, les surnageants des lignées cellulaires TELCeBό transfectées par les différentes enveloppes ont été soumis à une ultracentrifugation et les culots de particules virales ont été récupérés. Ces culots ont été analysés par immunoblots pour leur expression de produits du gène gag (CAp30) et des protéines d'enveloppes (Figure 5 pour la plupart des enveloppes de la série AMO, non montré pour les autres enveloppes chimères). Dans le but de comparer l'efficacité d'incorporation virale entre les diverses enveloppes chimères, des quantités identiques de particules virales (déterminées par le marquage des protéines gag à l'aide d'un anticorps anti-CAp30) ont été déposées sur les gels.
Les protéines SU ont pu être mises en évidence pour tous les mutants, à la taille attendue mais à un taux légèrement inférieur à celui observé pour les enveloppes sauvages. Dans le cas des enveloppes AMOG2X et AMOG3X seulement, l'efficacité d'incoφoration est sensiblement plus faible par rapport aux enveloppes sauvages. Comme attendu, aucune expression d'enveloppe n'est observée dans les culots de surnageants TELacZ (n'exprimant pas de protéines gag et pol) transfectées par les différentes enveloppes. Ces résultats démontrent que les protéines SU chimères sont associées aux particules rétrovirales.
Liaison des enveloppes aux récepteurs.
Des cellules humaines exprimant les récepteurs Ram-1 et/ou de l'EGF ont été utilisées pour cette étude. Ces cellules sont incubées en présence de préparation virales et la liaison des enveloppes virales sur le récepteur cible est déterminé par analyse au FACS à l'aide d'anticorps dirigés contre la SU (Figure
6B). Comme attendu, aucune liaison n'est observée dans le cas des virus exprimant des enveloppe écotropes MO sur les diverses cellules humaines (non montré), alors que les virus présentant des enveloppes chimères ciblant Ram-1 sont capables de se lier aux cellules TE671 avec une efficacité similaire à celle observée pour les virus exprimant des enveloppes amphotropes non modifiées.
Toutes les enveloppes ciblant Ram-1 , dérivées de AMO, sont capables de se lier aux cellules TE671 avec une efficacité similaire. Cette liaison peut être inhibée après compétition par du fragment AS208 (le domaine purifié de reconnaissance de Ram-1) (2), ce qui suggère que cette reconnaissance est spécifique (résultats non présentés).
Les enveloppes ciblant EGFR (série EMO) sont par ailleurs capables de se lier aux cellules A431 , sur exprimant EGFR (Figure 6A). Cette liaison semble spécifique puisqu'une pré-incubation des cellules A431 en présence d'EGF (induisant l'endocytose des EGFR) inhibe cette liaison (non montré). Coopération Ram-1 et Rec-1 dans l'infection.
La transduction des vecteurs rétroviraux pseudotypés par les diverses enveloppes ciblantes a été mesurée sur des cellules exprimant différents types de récepteurs: des cellules humaines TE671 exprimant les récepteurs EGF et
Ram-1 ; des cellules 3T3 exprimant les récepteurs EGF murins, Rec-1 et Ram-1 ; des cellules CEAR13 exprimant Rec-1 et Ram-1 ; des cellules CERD9 exprimant seulement Rec-1. Les titrations ont été effectuées comme précédemment décrit (6). Comme attendu, il a été montré que les virus pseudotypés par des enveloppes écotropes MO n'étaient pas capables d'infecter les cellules TE671, mais permettaient l'infection de cellules murines 3T3, CEAR13 et Cerd9 (avec des titres de l'ordre de 10? lacZ i.u./ml). Réciproquement, les virus portant les enveloppes amphotropes A sont capables d'infecter les cellules murines 3T3, CEAR13 et TE671 (avec des titres de l'ordre de l'ordre de 10^ lacZ i.u./ml).
Les virus présentant des enveloppes chimères AMO sont capables d'infecter les cellules TE671 à un titre de 4.10^ lacZ i.u./ml (Tableau 1). En comparaison; malgré une efficacité de liaison au récepteur similaire (Figure 6B), les titres obtenus avec les enveloppes sauvages sont 10 000 fois plus élevés. De façon suφrenante, les virus exprimant des enveloppes AMOPRO, malgré une bonne efficacité de liaison, se sont avérés incapables d'infecter les cellules humaines TE671. Comparés aux titres obtenus pour les enveloppes AMO (Tableau 1), les autres types d' espaceurs insérés dans les enveloppes de la série AMO permettent une augmentation des titres de 30 fois (pour AMOΔPRO) à plus de 100 fois (pour AMOlFx) permettant d'atteindre des titres de 4.10^ lacZ i.u./ml. Il est démontré que ces infections ont lieu via le récepteur ciblé Ram-1. Ceci a été mis en évidence par un test d'interférence sur des cellules cibles infectées chroniquement par du virus MLV-A. Ces cellules deviennent spécifiquement réfractaires à une infection par des virus portant les enveloppes ciblants Ram-1 (résultats non montrés). Les virus portant les enveloppes chimères dans lesquelles le domaine de liaison à Ram-1 a été séparé de la SU de MoMLV par différents espaceurs s'avèrent très infectieux sur cellules 3T3. Comparé aux titres obtenus pour les enveloppes AMO, une augmentation de 200 (pour AMOPRO) à plus de 1000 fois (pour AMOlFx) des titres viraux a été mesurée (Tableau 1).
L'infection des 3T3 s'effectue via Rec-1 ou via Ram-1 (Tableau 1). Ceci peut être démontré par des tests d'interférence effectués sur des cellules 3T3 infectées chroniquement soit par MLV-A (bloquant Ram-1) soit par MoMLV (bloquant Rec-1). Les virus exprimant les enveloppes AMO semblent être capables d'infecter les 3T3 indifféremment selon que l'un ou l'autre, ou les deux, récepteurs Rec-1 et Ram-1 sont disponibles sur la cellule cible. Comparativement à ces virus AMO, les particules virales contenant les autres enveloppes capables de cibler Ram-1 sont bien moins capables d'infecter les 3T3 quand seulement un des deux récepteurs est disponible. Par exemple, quand 100 particules (selon le titre déterminé sur 3T3 intactes) contenant les enveloppes AMOFx sont utilisées pour infecter des 3T3 interférentes, 4 virus sont capables d'infecter les cellules si seulement Rec-1 est disponible et 2 virus sont capables d'infecter les cellules si seulement Ram-1 est disponible. Ceci indique une perte considérable de l'infectivité (plus de 94% des virus ne sont pas infectieux) quand un seul récepteur est disponible comparé à quand les deux récepteurs le sont. Ceci suggère également que les deux récepteurs Ram-1 et Rec-1 coopèrent dans l'infection des 3T3. Il apparaît que ce phénomène de coopération est encore nettement plus marqué dans le cas des virus portant les enveloppes
AMOPRO. Ces derniers virus peuvent difficilement infecter les 3T3 quand seul Rec-1 est disponible et ne peuvent pas du tout les infecter quand seul Ram-1 est disponible. Cependant quand Rec-1 et Ram-1 sont tout deux disponibles, l'infection est possible et des titres de l'ordre de 6x10^ lacZ i.u./ml peuvent être obtenus (Tableau 1).
Dans le but de mieux définir ce phénomène de coopérativité, des tests d'infection ont été menés en utilisant comme cibles des cellules CHO
(naturellement dépourvues des récepteurs Ram-1 et Rec-1) modifiées de manière à exprimer soit Rec-1 seul (cellules Cerd9), soit Rec-1 et Ram-1 (cellules Cearl3) ou des cellules TE671 exprimant Ram-1 seul. Par ailleurs d'autres enveloppes dérivées de l'enveloppe AMO ont été générées. Ces enveloppes possèdent d'autres types de peptides espaceurs (voir Figure 3A) après le domaine ciblant Ram-1, notamment des espaceurs flexibles. Les résultats d'une expérience typique sont montrés dans le tableau 2. Pour chaque enveloppe, des index de coopérativité ont été calculés comme le rapport du titre obtenu sur le type cellulaire exprimant seulement un seul récepteur sur le titre obtenu sur le type cellulaire exprimant les deux types de récepteurs. Un index de 1 indique donc que le titre est le même, qu'il y ait un seul ou les deux récepteurs. C'est évidemment le cas^ des enveloppes sauvages écotropes ou amphotropes. Un index inférieur à 1 indique que le titre est moins bon quand un seul récepteur est exprimé par rapport à quand les deux le sont, et qu'il y a nécessité de deux récepteurs pour favoriser l'infection. Plus cet index est faible, plus le requièrement des deux récepteurs est fort. Comme suggéré dans le tableau 1 , l'infectivité des virions avec les enveloppes AMO originales n'est pas affectée, qu'il y ait qu'un seul type de récepteur ou les deux types (Tableau 2). En fait, les index sont même supérieurs à 1 suggérant que la présence simultanée des deux récepteurs gène le processus infectieux, peut-être parce que les deux domaines de liaison se gênent mutuellement.il en va différemment dans le cas des virus avec les enveloppes AMOlFx bien que, comparés aux virions AMO, leur infectivité est au moins 100 fois meilleure dans les cellules TE671 qui expriment Ram-1 seul. Cet accroissement de l'infectivité via Ram-1 peut être expliqué par la taille accrue du peptide espaceur séparant les deux domaines de liaison: il est possible que le domaine AS208 induise moins d'encombrement stérique vis-à-vis du reste de la glycoprotéine et que ces enveloppes puissent plus facilement induire le processus fusiogénique. De même, les virions AMOlFx infectent relativement bien les cellules Cerd9 exprimant Rec-1 seul. Cependant, en accord avec les résultats du tableau 1 , l'infection est facilitée par un facteur 10 quand les deux molécules Ram-1 et Rec-1 sont co-exprimées
(index d'environ 0, 1) comparativement à quand seulement l'un ou l'autre des deux récepteurs est présent. Les enveloppes avec les espaceurs "flexibles" (AMOGIFx, AMOG2, AMOG2Fx and AMOG3) semblent se comporter comme les enveloppes AMOlFx vis-à-vis de l'infection par l'intermédiaire de Rec-1 exprimé seul. Cependant l'infectivité par Ram-1 exprimé seul (RamID) tend à diminuer en fonction de la longueur de l'espaceur. Ceci reflète probablement une diminution de la transmission du signal fusiogénique consécutif à la liaison sur Ram-1 du fait de l'accroissement de la distance entre le domaine AS208 et le domaine de fusion. Dans le cas de ces enveloppes également, l'infection est favorisée quand les deux récepteurs sont co-exprimés à la surface de la même cellule.
Comme pour les enveloppes AMOlFx, mais de manière non symétrique (RamID similaire, mais RecID très différents), les virions contenant l'enveloppe AMOΔPRO peuvent efficacement infecter des cellules quand Ram-1 y est exprimé seul. Dans le cas de cette enveloppe également, l'infectivité est accrue d'environ 10 fois quand Rec-1 est également présent à la surface cellulaire. Cette différence n'est pas due au simple fait que les virions AMOΔPRO utilisent préférentiellement Rec-1 pour l'infection. En effet, l'infection de cellules sur lesquelles Rec-1 seul est disponible est extrêmement faible (Tableau 1) voire non détectable (Tableau 2) comparativement à quand Ram-1 et Rec-1 sont co- exprimés. L'indice RecID est inférieur à 10~5 (Tableau 2). Ceci démontre également que les deux récepteurs peuvent synergiser l'infection. Ces résultats suggèrent également que le domaine de liaison au récepteur écotrope Rec-1 n'est pas accessible quand l'enveloppe AMOΔPRO est exprimée sur des particules virales, et ne devient accessible que si ces virions interagissent préalablement avec Ram-1. On peut également suggérer que suite à la liaison avec Ram-1 , le domaine de liaison à Rec-1 est démasqué et recruté pour faciliter le processus infectieux. Il est possible que ce masquage/démasquage se produise selon un mécanisme de type allostérique causant un changement de conformation de la glycoprotéine chimère qui est induit par l'interaction Ram-l/AS208 et qui implique le peptide espaceur. Il est probable que ce mécanisme dépende fortement de la composition en acides aminés du peptide espaceur. A taille comparable, il y a une différence d'au moins 1 000 fois dans les RecID quand les virions AMOΔPRO sont comparés aux virions contenant les enveloppes avec les espaceurs flexibles AMOlFx, AMOGIFx et AMOG2. Le peptide ΔPRO est contient 5 prolines probablement agencées en hélice polyproline de type II, tandis que les enveloppes AMOGIFx et AMOG2 contiennent essentiellement des glycines.
De manière similaire aux virions AMOΔPRO, les virions contenant les enveloppes AMOPRO requièrent la présence simultanée des deux types de récepteurs pour infecter les cellules. Le titre infectieux dans des types cellulaires co-exprimant les deux récepteurs sont cependant inférieurs à ceux que l'on observe avec les virions AMOΔPRO, sans pour autant que l'on puisse exclure l'hypothèse que la moindre incoφoration de ces enveloppes est responsable de ce résultat. De manière encore plus marquée que AMOΔPRO, les virus AMOPRO ne peuvent pas infecter les cellules quand l'un ou l'autre des deux récepteurs est exprimé seul (Tableau 2). Les deux indices RamID et RecID sont en effet inférieurs à lθA Ces résultats suggèrent:
1) que l'interaction des virions AMOPRO avec Ram-1 quand il est exprimé seul ne suffit pas à déclencher les changements de conformations de la glycoprotéine lui permettant d'être fusiogène. Il est d'ailleurs possible que le peptide espaceur PRO est soit trop rigide, soit trop long pour favoriser une telle transition,
2) le domaine de liaison avec Rec-1 n'est pas accessible pour interagir avec Rec-1 et prendre le relais dans le processus d'entrée tant que le virions AMOPRO n'a pas interagi avec Ram-1.
Dans le but de mieux discriminer si le masquage du domaine de liaison situé en aval du domaine ciblant est une propriété unique du peptide AS208 conjugué au peptide espaceur PRO, la construction réciproque a été faite. Les enveloppes MOAPRO comportent le domaine de liaison de l'enveloppe écotrope suivie de la région proline riche de cette même enveloppe, le tout fusionné à l'extrémité N-terminale de l'enveloppe amphotrope (Figure 2). Les résultats, montrés dans le tableau 2, indiquent que, de manière similaire aux virions contenant les enveloppes AMOPRO, les virions MOAPRO peuvent difficilement, voire pas du tout, infecter les cellules exprimant seulement l'un ou l'autre des récepteurs Rec-1 ou Ram-1 . Il semble même que le domaine Ram-1 dans l 'enveloppe MOAPRO soit encore moins accessible (RamID inférieur à 7xl0"5) que ne l 'est le domaine Rec-1 dans l'enveloppe AMOPRO (RecID inférieur à 5 ,6x10-4). Les enveloppes MOAPRO peuvent efficacement infecter les cellules exprimant les deux types de récepteurs, avec des titres de l'ordre de 10^ lacZ i.u./ml, suggérant que, dans le cas de cette enveloppe également, la présence des deux récepteurs synergise le processus infectieux.
L'ensemble de ces résultats suggère que le peptide espaceur inséré entre le domaine ciblant et le reste de l 'enveloppe rétrovirale exerce un contrôle sur l'accessibilité du domaine situé en aval dudit peptide et sur l' activation de la fusion. Ce contrôle dépend du peptide lui-même et est influencé par sa longueur et par sa composition biochimique. L'hypothèse que formulée est que le peptide espaceur PRO jouerait finalement le même rôle que la région riche en proline dont il est issu et qui est situé, dans la glycoprotéine non modifiée, entre le domaine de liaison au récepteur et le domaine de fusion. Ce rôle serait le masquage du domaine en aval (domaine fusion pour l'enveloppe sauvage ou domaine de liaison pour l'enveloppe chimère) et le démasquage consécutif à l'interaction du domaine en amont avec son récepteur. Dans le cas de l'enveloppe sauvage, ce démasquage conduirait à l'activation de la fusion, tandis que dans le cas des enveloppes chimères, le démasquage conduirait à l 'accessibilité du domaine de liaison au récepteur viral. Si le récepteur est exprimé à la surface cellulaire, il peut alors y avoir interaction, ceci déclenchant ensuite l'activation du domaine fusion expliquant pourquoi la présence simultanée des deux récepteurs synergise l'infection.
Ces données permettent de proposer une stratégie de ciblage en deux étapes pour laquelle une enveloppe ciblante est construite avec différents domaines dont les fonctions sont activées et coordonnées par le biais de peptides espaceurs spécifiques contenant des séquences riches en proline. Ces glycoprotéines d'enveloppe chimères peuvent être conçue de la manière suivante, avec de N-terminal à C-terminal, un domaine "ciblant" capable de reconnaître une molécule de surface cellulaire spécifiquement exprimée sur le tissu ou la cellule ciblé(e) (par exemple un anticoφs simple chaîne ou un ligand pour un récepteur de surface); un peptide espaceur capable de masquer un domaine auxiliaire lui-même capable de faciliter la pénétration du virus quand il est activé. Un tel domaine auxiliaire peut être une enveloppe rétrovirale entière, c'est-à-dire une structure capable de médier et de prendre le relais de l'infection virale par le biais de l'interaction avec un récepteur rétroviral ubiquiste, qui a donc une très forte probabilité d'être co-exprimé avec la molécule de surface ciblée. Idéalement, le domaine auxiliaire devrait être masqué jusqu'à ce que la particule virale ait spécifiquement interagi avec la molécule de surface ciblée. Par exemple, dans le cas des enveloppes AMOPRO et AMOΔPRO, la molécule de surface ciblée est Ram-1 tandis que le domaine auxiliaire est l'enveloppe écotrope. Coopération EGFR et Rec-1 dans l'infection.
Dans le but de vérifier si les peptides espaceurs PRO et ΔPRO pouvaient médier le mécanisme de masquage/démasquage dans le cas d'un autre type d'enveloppe ciblante, un autre modèle de ciblage en deux étapes a été exploré par le biais du récepteur EGF. Les résultats obtenus avec le ciblage de Ram-1 ont permis de proposer des extrémités C-terminales des peptides espaceurs masquant/démasquant. Cependant il n'a pas été possible de définir exactement leurs extrémités N-terminales. C'est pourquoi, dans un premier temps, les enveloppes EMOPRO + et EMOΔPRO + ont été construites (Figure 3B), enveloppes dans lesquelles les peptides espaceurs PRO et ΔPRO contiennent en plus, en N-terminal, 41 acides aminés dérivés de l'enveloppe amphotrope et localisés immédiatement en amont de la région riche en proline. Pour les enveloppes EMOPRO+ et EMOΔPRO + , le domaine ciblant est EGF, tandis que le domaine auxiliaire est l'enveloppe écotrope. Ces deux enveloppes ont été comparées avec l'enveloppe EMO (Figure 2 et 2B) qui ne contient pas de peptide espaceur.
Les tests d'infection ont été effectués avec des cellules exprimant Rec-1 seulement (cellules Cerd9) ou avec des cellules co-exprimant Rec-1 et EGFR (cellules 3T3). Les résultats d'une expérience typique sont rapportés dans le tableau 3. De manière attendue par les résultats obtenus avec les enveloppes AMO, les virus contenant les enveloppes EMO peuvent efficacement infecter les cellules Cerd9 et 3T3, indiquant que le domaine de liaison à Rec-1 dans ces enveloppes n'est pas masqué. Comparativement aux virus EMO, les particules virales contenant les enveloppes EMOPRO + et EMOΔPRO + ne peuvent que difficilement infecter les cellules Cerd9 (entre 1000 et 10000 fois moins bien que les virus EMO). Cependant, quand Rec-1 et EGFR sont co-exprimés, bien que ceci n'affecte pas le titre des virions EMO, les particules virales contenant les enveloppes EMOPRO + et EMOΔPRO + sont 20 et 60 fois plus infectieuses, respectivement, comparativement à quand Rec-1 est exprimé seul. Par rapport aux résultats obtenus avec les enveloppes AMOPRO et AMOΔ PRO, le masquage se fait apparemment moins bien, et il en résulte une infectivité non négligeable sur cellules Cerd9. Ceci est peut-être dû au fait que les peptides espaceurs PRO+ et ΔPRO+ ne sont pas optimisés pour leur fonction, mais peut-être aussi au fait que les cellules Cerd9 expriment un peu de récepteurs EGF qui contribuerait à activer les enveloppes EMOPRO + et EMOΔ PRO+ .
Tableau 1 Titres (lacZ i.u./ml) obtenus pour les virus contenant les enveloppes ciblant Ram-1 en tests d'interférence
env TE671 3T3a 3T3-MLV-Aa'b 3T3-MoMLVa'b
Ram-Ie Ram-1 + Rec-lc Rec-lc Ram-1e
MO <1 92,000,000 (100) 46,000,000 (100) 40
A 10, 000,000 12,000,000 (100) 240 8,000,000 (100)
AMO 4, 000 24 (100) 32 (266.7) 8 (50)
AMOFx 230,000 440,000 (100) 8,000 (3.6) 6,000 (2)
AMOl 330,000 1,920,000 (100) 78,000 (8.1) 62,000 (4.8)
AMOlFx 400,000 1,620,000 (100) 60,000 (7.4) 74,000 (6.8)
AMOΔPRO 150, 000 280,000 (100) 400 (0.29) 64,000 (34.3)
AMOPRO 10 60,000 (100) 4 (0.013) <1 (0.0025)
a: pourcentages calculés en prenant comme valeur 100 les titres obtenus sur 3T3 b: infection sur 3T3 chroniquement infectées par MLV-A (3T3-MLV-A) ou par MoMLV (3T3-MoMLV) c: récepteur disponible à la surface de la cellule considérée
Tableau 2 Titres (lacZ î u /ml) obtenus pour les virus contenant les enveloppes ciblant Ram-1
Peptide env 3T3 TE671 CERD9 RamID RecID espaceur
MO 2 8xl0+6 <1 7xl0+0 2 8xl0+6 <6 1x10 7 1
- A 5xl0+5 5xl0+5 6 2xl0+0 1 1 2xl0~5
3 AMO lxl0+2 2 2xl0+2 6 2xl0+0 2 2xl0+0 6 2x10 2
13 AMOlFx 6xl0+4 1 6xl0+4 2 2xl0+5 2 7xl0_1 3 7xl0+0
16 AMOΔPRO 1 9xl0+4 5xl0+3 6 2xl0+0 2 6x10 1 3 3xl0"4
18 AMOGIFx 4xl0+4 4 5xl0+3 8 7xl0+3 l.lxlO"1 2 2X10"1
19 AMOG2 8xl0+3 2 7xl0+3 3 lxl0+3 3 4x10 1 3 9X10" 1
23 AMOG2FX 6X10"*3 1 2xl0+3 1 2xl0+3 2x10 X 2xl0_1
28 AMOG3FX 9xl0+2 lxl0+2 1 2xl0+3 1 lxlO"1 1 3xl0+0
62 AMOPRO 1 8xl0+3 <1 7xl0+0 <.lxl0+2 <9 4xl0~4 <5 6xl0"4
MOAPRO 1 3xl0+5 <9 lxl0+0 1 7xl0+3 <7xl0 5 1 3xl0~2
Tableau 3
Titres (lacZ i.u./ml) obtenus pour les virus contenant les enveloppes ciblant EGFR
env 3T3 CeRD9 RecID
MO 9.2x10e 1.3X107
EMOΔPRO 3.5xl04 8.5xl02 1 7x10 "
EMOPRO 9.6xl02 7xlOx 5 . 2x10 "
EMOI 2x106 3x10e
EXEMPLE 2 : Dans le but caractériser la coopération entre les récepteurs Rec-1 et Ram-1 , ainsi que les peptides capables de réguler cette coopération de récepteurs, une nouvelle série de glycoprotéines d'enveloppes chimères de type AMO (voir exemple précédent) a été construite - afin de vérifier si l'infection obtenue avec les enveloppes AMOPRO et AMODeltaPRO passe, dans une deuxième étape, par une interaction avec Rec-1 , le site de liaison avec Rec-1 a été inactivé par mutagenèse ponctuelle (mutation D84K) (MacKrell et al. , ]. Virology, 70: 1768-1774. (1996)) dans les enveloppes AMOPRO et AMODeltaPRO ainsi que dans l'enveloppe contrôle AMOG1X laquelle ne fait pas appel à la coopération de récepteurs pour permettre l'infection (Valsesia-Wittmann et al., The EMBO Journal 16: 1214-1223. (1997)).
- afin de démontrer le rôle de la structure en hélice polyproline de type II pour les peptides coopérants, les enveloppes AMOEL3 et AMOEL5 ont été construites. Ces enveloppes portent respectivement 3 et 5 spires d'une hélice polyproline de type II caractérisée dans la littérature (Urry, Journal of Protein Chemistry 7: 1-34. (1988)).
Des retrovirus ont été générés avec ces enveloppes chimères et ont été caractérisés par infection de cellules exprimant soit Rec-1 seul, soit Ram-1 seul, soit les deux molécules Ram-1 et Rec-1.
Matériel et Méthodes.
Les oligonucléotides elast3U: (5'-TTT ATG GTC ACC GCG GCC GCA CCT GGG GTA GGG GCT CCG GGG GTA GGG GCT CCT GGG GTG GCC ATA TAA) et elast3L (5'-TTA TAT GGC CAC CCC AGG AGC CCC TAC
CCC CGG AGC CCC TAC CCC AGG TGC GGC CGC GGT GΛC CΛT AAA) ont été hybrides entre eux. Le fragment d'ADN bicaténaire résultant a été digéré par l'enzyme de restriction Eael et clone dans le plasmide d'expression FBAMOSALF préalablement ouvert en Notl. Il en résulte le plasmide FBAMOEL3SALF (voir séquence du gène env AMOEL3 en Fig. 30) comportant le peptide EL3 dont la séquence peptidique est représentée dans le tableau 4 (voir séquence nucléotidique en Fig. 31).
Les oligonucléotides UpE15: (5* -G AT GTA CCT GGG GTA GGC GCC CCT GGA GTC GGG GCT CCT GGG GTA GGA TTC AT) et LowE15: (5' -ATG AAT CCT ACC CCA GGA GCC CCG ACT CCA GGG GCG CCT
ACC CCA GGT ACA TC) ont été hybrides entre eux. Le fragment d'ADN bicaténaire résultant a été digéré par l'enzyme de restriction EcoNI et clone dans le plasmide d'expression FBAMOEL3SALF préalablement ouvert en EcoNI. Il en résulte le plasmide FBAMOEL5SALF (voir séquence du gène env AMOEL5 en Fig. 32) comportant le peptide EL5 dont la séquence peptidique est représentée dans le tableau 4 (voir séquence nucléotidique en Fig. 33).
Les oligonucléotides DELASTIN3-V Upper: (5'-GTC ACC GCG GCC GTC CCT GGG GTA GGG GTG CCG GGG GTA GGG GTG CCT GGG GTG GCC ATA TA A) et DELASTIN3-V Lower (5'-TTA TAT GGC CAC CCC AGG CAC CCC TAC CCC CGG CAC CCC TAC CCC AGG GAC GGC CGC GGT GAC) ont été hybrides entre eux. Le fragment d'ADN bicaténaire résultant a été digéré par l'enzyme de restriction Eael et clone dans le plasmide d'expression FBAMOSALF préalablement ouvert en Notl. Il en résulte le plasmide
FBAMOEL3-VSALF (voir séquence du gène AMOEL3-V en Fig. 34) comportant le peptide EL3-V dont la séquence peptidique est représentée dans le tableau 4 (voir séquence nucléotidique en Fig. 35).
Les oligonucléotides DELASTIN3-I Upper: (5' -GTC ACC GCG GCC GTC ATA GGG GTA GGG GTG ATT GGG GTA GGG GTG ATC GGG GTG GCC
ATA TAA) et DELASTIN3-I Lower (5'-TTA TAT GGC CAC CCC GAT CAC CCC TAC CCC AAT CAC CCC TAC CCC TAT GAC GGC CGC GGT GAC) ont été hybrides entre eux. Le fragment d'ADN bicaténaire résultant a été digéré par l'enzyme de restriction Eael et clone dans le plasmide d'expression FBAMOSALF préalablement ouvert en Notl. Il en résulte le plasmide
FBAMOEL3-ISALF comportant le peptide EL3-I dont la séquence peptidique est représentée dans le tableau 4.
Les oligonucléotides UpXhoD84K: (5'-AGG CTG CTC GAG AAΛ ATG CGA AGA ACC TTT AAC CTC CC) et LoXhoD84K: (5' -ATT TTC TCG AGC AGC CTG GGC TGC TGC CCC C) ont été synthétisés. A partir des oligonucléotides 805FC et LMOADeltaPR03 (voir séquence plus haut), les couples 805FC/LoXhoD84K ou UpXhoD84K/LMOADeltaPR03 ont été utilisés indépendamment pour amplifier par PCR deux fragments d'ADN -à partir de la matrice FBAMOSALF. Ces deux ADN ont été respectivement digérés par les enzymes Notl/Xhol ou XhoI/BamHI et co-ligués dans l'un ou l'autre des trois plasmides FBAMOSALF, FBAMODeltaPROSALF, et FBAMOProSALF préalablement ouverts en Notl et BamHI. Les plasmides résultants expriment respectivement les enveloppes AMOD84K, AMODeltaProD84K, et AMOProD84K. Deux fragments d'ADN de 2005 pbs et 241 pbs ont été isolés à partir du plasmide FBAMOG1X (Valsesia-Wittmann et al. , The EMBO Journal 16: 1214- 1223. (1997)) par digestion avec les enzymes de restriction Ndel/Xhol et XhoI/BstEII respectivement. Ces deux inserts ont été clones dans le plasmide FBAMOD84KSALF préalablement digérés par les enzymes Ndel et BstEII, résultant en un plasmide capable d'exprimer l'enveloppe AMOG1XD84K. Résultats et Discussion.
Expression et incoφoration virale des enveloppes chimères. Les plasmides d'expression pour les enveloppes AMO, AMODeltaPRO, AMOPRO, AMOEL3, AMOEL5, AMOEL3-V, AMOEL3-I, AMOIFX, AMOG1X, AMOD84K, AMODeltaPROD84K, AMOPROD84K, AMOG1XD84K, AMODeltaPR02
(Valsesia-Wittmann et al. , The EMBO Journal 16: 1214-1223. (1997)), et AMODeltaPR04 (Valsesia-Wittmann et al. , The EMBO Journal 16: 1214-1223. (1997)) ont été introduits par transfection dans les cellules de la lignée TELCeBό (Cosset et al , Journal of Virology 69:7430-7436. (1995b)). Après sélection par la phléomycine, les colonies résistantes à la phléomycine ont été réunies pour chaque ADN et des virions ont été générés et analysés en suivant les procédures initialement décrites (Cosset et al. , Journal of Virology 69:6314-6322. (1995a)).
Ces diverses enveloppes chimères sont normalement exprimées et maturées dans les cellules, et, de plus, efficacement incoφorées sur les particules virales (résultats non montrés). Les tests de liaison effectués démontrent que ces retrovirus peuvent spécifiquement se lier sur des cellules humaines par l'intermédiaire de la molécule de surface ciblée Ram-1 (résultats non montrés).
Ces divers virus ont été utilisés pour infecter des cellules exprimant soit Rec-1 seul (Cerd9), soit Ram-1 seul (CHO-Ram-1), soit les deux molécules Ram-1 et Rec-1 (Cearl3). Les résultats de la titration de ces virus sont présentés dans le tableau 4.
Ces résultats peuvent être résumés de la manière suivante:
- dans une enveloppe AMO, la substitution du peptide espaceur par trois "beta-turns" d'une hélice polyproline synthétique (AMOEL3) ou naturelle, décrite dans la littérature (AMOEL3-V, issue de l'élastine bovine) confère, en terme de capacité à masquer la fonction de l'enveloppe écotrope et à réguler la coopération des récepteurs Ram-1 et Rec-1 , un phénotype similaire aux virus portant les enveloppes "AMO" comprenant les peptides espaceurs coopérants
DeltaPR02, DeltaPRO, DeltaPR04, ou PRO. Puisque les peptides dérivés de l'élastine (AMOEL3-V et AMOEL3) sont agencés en hélice polyproline de type
II, les résultats obtenus permettent de suggérer que la régulation de la coopération des récepteurs Ram-1 et Rec-1 par les peptides DeltaPro et Pro est probablement due à leur structure secondaire présumée, en hélice polyproline de type IL De plus, des mutations introduites dans le peptide espaceur dérivé de l'élastine (AMOEL3-V) et ayant pour but de détruire le repliement du peptide en hélice polyproline de type II (AMOEL3-I, mutations obtenues par remplacement de la proline de chaque "beta-turn" par une isoleucine) résultent en une annulation de la coopération de récepteurs. - la destruction de la capacité de liaison au récepteur écotrope (mutations D84K) enraye la coopération de récepteur pour les enveloppes comportant des peptides espaceurs coopérants, notamment PRO (voir résultats AMOPRO vs AMOPROD84K), mais n'affecte pas la fonctionnalité des enveloppes contrôles portant le peptide espaceur G IX flexible (voir résultats
AMOG1X vs AMOG1XD84K). On en déduit que la liaison au récepteur écotrope est nécessaire pour l'infection, dans une seconde étape, suite à la fixation sur le récepteur Ram-I.
Rappelons que les présents résultats montrent que dans le cas des retrovirus générés avec l'enveloppe chimère AMOPro, le site de liaison au récepteur écotrope est masqué (Valsesia-Wittmann et al., The EMBO Journal 16: 1214- 1223. (1997)). L'ensemble des résultats est donc compatible avec un modèle d'interaction en deux étapes dans lequel:
- dans sa configuration "naïve" , c'est-à-dire quand il n'a pas été autorisé à interagir avec une cellule, le retrovirus "AMOPRO" peut potentiellement interagir avec le récepteur "primaire" ciblé (la molécule Ram-1), mais ne peut directement interagir avec le récepteur auxiliaire (la molécule Rec-1). Ce masquage semble être dû à une première propriété du peptide espaceur Pro. - quand ce virus est autorisé à interagir avec Ram-1 , il se produit un changement de conformation local au niveau du peptide espaceur Pro qui va rendre accessible le site de liaison à Rec-1. Ce changement de conformation est dû à une deuxième propriété du peptide espaceur Pro.
- si le récepteur Rec-1 est présent à la surface de la même cellule qui présente Ram-1 et sur laquelle s'est lié le virus, alors, dans une deuxième étape, ce récepteur va servir de molécule d'entrée pour le virus.
'10
Tableau 4 Résultats de titration
Env séquence du peptide cspaceura Cearl 3b CHO-Ram- l b Ccrd9b
ΛMO NVG AAΛ PHQV 4 + Λ
ΛMOD84K NVG PRVP1GPNPAA PHQV + + -
ΛMODcltaPro2 NVG PRVPIGPNPΛA PHQV H-++) ++-+ 4/-
ΛM01FX NVG AAAIEGRASPGSS PHQV +-H-+ +++ +++
AMODeltaPro NVG PRVPIGPNPVLPDΛAA PHQV ++++ +++ -
ΛMθDcltal'roD84K NVG PRVPIGPNPVLPDAAA PHQV ++4 +++ -
AMOEL3 NVG AΛAPGVGAPGVGAPGVAA PHQV +++ + -
AMOEL3-V NVG AΛVPGVGVPGVGVPGVAA PHQV +++ + -
AMOEL3-I NVG AAVIGVGVIGVGVIGVΛA PHQV +++ +++ +++
AMOG1 X NVG AAΛGGGGS1EGRASPGSS PHQV +++ ++ ++
AMOG1 XD84K NVG AAAGGGGSIEGRASPGSS PHQV ++ ++ -
AMODeltaPro4 NVG PRVPIGPNPVLPDQRLPSSAA PHQV +-H ++ -
AMOEL5 NVG ΛAAPGVGAPGVGAPGVGAPGVGΛPGVAA PHQV +++ _ _
AMOPRO NVG PRVP1GPNPVLPDQRLPSSPIEIVPΛPQPPSP . LNTSYPPSTTSTPSTSPTSPSVPQPPPAAA PHQV M→
AMOPROD84K NVG PRVPIGPNPVLPDQRLPSSPIEIVPAPQQPPSP LNTSYPPSTT STPSTSPTSPSVPQPPPAAA PHQV -
a peptide inséré entre le domaine de liaison pour Ram-I et l'enveloppe MoMLV "PHQV" représente les acides aminés 7 à 10 de l'enveloppe de MoMLV et "NVG' représente les 3 derniers acides aminés du domaine de liaison à Ram- 1 b titres relatifs obtenus sur les cellules indiquées Cearl 3, exprimant les récepteurs Ram-I et Rec-1, CHO-Ram- 1 , exprimant Ram-I seul, Cerd9, exprimant Rec-I seul EXEMPLE 3.
Le développement de stratégies du ciblage du transfert de gène par le biais de la construction de glycoprotéines d'enveloppes chimères, générées pai insertions N-terminales de ligands, se heurte, notamment, à la faible capacité, voire à l' incapacité de l' interaction virus/molécule de surface ciblée à activer la 0 fusion de ces enveloppes ciblantes (Cosset and Russell , Gène Therapy 3 946-956
( 1996)) La possibilité de laire coopérer deux molécules de surface (Valsesia- Wittmann et al. , The EMBO Journal 16. 1214- 1223 ( 1997)), l une étant le récepteur ciblée ou molécule de surface cellulaire d'attachement, l' autie étant un récepteur (rétro)vιral spécialise dans la fusion ou molécule de surface auxiliaire, 5 permet d'entrevoir un moyen de surmonter ce problème de faible fusiogénicité des enveloppes chimères et plus généralement de faible efficacité des retrovirus ciblants On a testé la coopération de récepteurs dans trois modèles de ciblage dans lesquels les trois molécules de surface cellulaire suivantes servent de points d'attachement aux retrovirus ciblants (î) recepteui de l' EGF (epidermal growth ^.0 lactor), et (π) molécule de classe I du CMH humain Ixs domaines de liaison pour ces deux molécules de surface sont soit des facteurs de croissance (EGFR), soit un anticoφs mono-brin (CMH-I). Ces ligands ont été insertion par fusion à l'extrémité N-terminales de l'enveloppe MLV amphotrope (4070A) et divers peptides issus de la région riche en proline portée par la sous-unité SU du virus MLV amphotrope ont été insérés entre les ligands et l'enveloppe 4070A (voir
Tableau 5).
Matériels et Méthodes
Des fragments d'ADN codants pour les peptides espaceurs DeltaPro2, DeltaPro3, DeltaPro4, et Pro (voir tableau 5) ont été générés par PCR en utilisant comme matrice ADN le gène env 4070A, en 5' l' oligonucléotide PRO-5-NE (5'-ATC GAG GTC ACC GCG GCC GCG GGA CCC CGA GTC CCC ATA GGG CCC) qui est le même pour les 4 fragments PCR et comme oligonucléotides 3' les séquences AMODPRO(-H -f-P-A): (5*-TAT GAG CGG CCG GGT TGG GCC CTA TGG GGA C), DPro3: (5'-TTA TAC GGC CGT GTC GGG TAA TAC TGG), AMODPRO(+H+S-A): (5'-TAT GTG CGG CCG AGG AAG GGA GTC TTT GGT C) et PRO-3-NE: (5'ATA ATC GGC CGG GGG TGG CTGTGG GAC).
Les fragments d'ADN correspondants ont été digérés par l'enzyme EagI et séparément insérés dans le plasmide FBEASALF (exprimant les glycoprotéines d'enveloppe chimère EA) (Cosset et al., Journal of Virology 69:6314-6322.
(1995a)) préalablement ouvert au site de restriction Notl. Les plasmides résultants expriment les enveloppes EADeltaPro2, EADeltaPro3, EADeltaPro4, et EAPro.
Le fragment Ndel/Notl contenant le promoteur FB29 ainsi que le scFv anti- MHC-I muni du peptide signal de la glycoprotéine d'enveloppe du virus MoMLV
(Marin et al., Journal of Virology 70:2957-2962. (1996)) a été clone dans le plasmide FBEASALF préalablement débarrassé du fragment Ndel/Notl. Il en résulte le plasmide FB34ASALF capable d'exprimer une enveloppe chimère 4070 à l'extrémité N-terminale de laquelle est fusionné le scFv. Ce plasmide a été ensuite ouvert en Notl afin d'y insérer les peptides espaceurs DeltaPro2,
DeltaPro3, DeltaPro4, et Pro (voir tableau 5) préalablement digérés avec l'enzyme EagI. Il en résulte une série de vecteurs d'expression pour les enveloppes 34DeltaPro2, 34DeltaPro3, 34DeltaPro4, et 34Pro.
Résultats et Discussion.
Ces divers ADN ont été introduits par transfection dans les cellules de la lignée TELCeBό et des retrovirus ont été générés en suivant la procédure habituelle (voir exemples 1 et 2). On a montré que ces retrovirus expriment correctement les glycoprotéines d'enveloppe chimères et que ces dernières permettent de rediriger efficacement la liaison des particules virales sur les cibles cellulaires spécifiques (résultats non montrés).
I.es virus produits avec les enveloppes chimères des divers groupes ont été utilisés pour infecter des cellules n'exprimant que le récepteur amphotrope et pas la molécule de surface ciblée Les résultats de la titration de ces virus sont montrés dans le tableau 5.
Ces résultats montrent qu'il est possible de masquer les lonctions de l'enveloppe amphotrope par le biais de fragments de la région riche en proline Dans le cas des chimères réalisées avec EGF, il est nécessaire d' insérer au moins cinq "beta-turns" pour obtenir un effet masquant significatil, l' insertion de la région riche en proline dans sa totalité résultant en une inhibition totale Pour les chimères réalisées avec le scFv anti-MHC-1, trois "beta-turns" sont requis pour obtenir un effet masquant total
Tableau 5 Résultats de titration.
peptιdea ligand pour" nom séquence EGFR MHC-I
sansc AAA PHQV 6e3 39e2 DeltaPro2 AAA GPRVPIGPNPAA PHOV 7c3 18e l
DeltaPro3 AAA GPRVPIGPNPVLPDTAA PHQV 1 2e 3 < l e l DeltaPro4 AAA GPRVPIGPNPVLPDQRLPSSAA PHQV 7e 1 < I c i Pro AAA G^RYPIGJUffiVLEDQRLESSEIEIVPAPQPP
SPLNTSYPPSTTSTPSTSPTSPSVPQPPPΛΛ PI IQV < le l < lel
a: peptide inséré entre le domaine de liaison ciblant et l'enveloppe 4070A "AAA" code pour le site Notl utilisé pour réaliser la fusion dans l'enveloppe chimère, "PHQV" représente les acides aminés 4 à 7 de l'enveloppe amphotrope Les "beta-turns" sont soulignés b titration sur les cellules Ceaι l3 pour les enveloppes ciblantes EGFR (ligand. EGF) et pour les enveloppes ciblantes ciblant MIIC-I (ligand scl v anti MHC-I) c le ligand est directement fusionné à l'extrémité de la SU amphotrope (avec le 4eme acide aminé), et n'a pas de peptide espaceui EXEMPLE 4.
Les études précédentes ont permis de délimiter les extrémités C-terminales des peptides coopérants et de déterminer le nombre de tours d'hélice polyproline de type II nécessaire pour obtenir un effet masquant et un effet coopérant minimal. Dans le cas du modèle des enveloppes chimères AMO (voir plus haut), il suffit d'un minimum de deux tours d'hélice (Valsesia-Wittmann et al., The EMBO Journal 16: 1214-1223. (1997)). Cependant, pour des enveloppes chimères générés avec d'autres domaines de liaison que celui pour Ram-1 (cas des chimères AMO) et utilisant l'enveloppe amphotrope comme enveloppe support, l'effet coopératif est moins marqué, d'une part car le masquage des fonctions de l'enveloppe amphotrope nécessite quatre tours d'hélice polyproline (voir tableau 5) et d'autre part car l'activation des fonctions de l'enveloppe amphotrope est moins forte suite à la liaison des virus sur les molécules de surface ciblées. Une explication possible est que, dans le modèle des chimères AMO, outre le peptide espaceur PRO, le domaine de liaison à Ram-1 porte lui- même des déterminants importants pour induire, de manière concertée avec ce peptide PRO, l'activation des fonctions de l'enveloppe écotrope. Le domaine de liaison pour Ram-1 est en effet un fragment d'enveloppe rétrovirale (issu de l'enveloppe amphotrope) qui est naturellement situé immédiatement en amont de la région riche en proline. Afin de déterminer la présence et l'importance de telles régions dans la coopération de récepteurs, on a construit des enveloppes chimères associant un domaine ciblant avec l'enveloppe amphotrope et, inséré entre ces deux polypeptides, divers peptides testés pour leur effet coopérant contenant notamment la région riche en proline (ou un fragment de cette région) combinée avec des fragments peptidiques issus du domaine N-terminal de l'enveloppe amphotrope.
Matériels et Méthodes
Des fragments d'ADN codant pour les peptides espaceurs DeltaPro4-beta, DeltaPro4-int, DeltaPro4-vrb et ont été générés par PCR en utilisant comme matrice ADN le gène env 4070A, en 3' l' oligonucléotide AMODPRO(+H+S- A): (5' -TAT GTG CGG CCG AGG AAG GGA GTC TTT GGT C) et en 5' les oligonucléotides UPro-beta: (5' -ATG CTG GCG GCC GCG GAT CCT ATT ACC ATG TTC TCC CTG ACC CGG C), UPro-int: (5 ' ATG CTG GCG GCC GCG AAC CCT CTA GTC CTA GAA TTC ACT GAT GC), et UPRO-vrb.
(5 ' ATG CTG GCG GCC GCG GAA ACC ACC GGA CAG GCT TAC TGG AAG CCC), respectivement (voir figs 36 à 38). Des fragments d'ADN codant pour les peptides espaceurs Pro-beta, Pro-int et Pro-vrb ont été générés par PCR en utilisant comme matrice ADN le gène env 4070A, en 3' l' oligonucléotide PRO-3-NE: (ATA ATC GGC CGG GGG TGG CTG TGG GAC) et en 5' les oligonucléotides UPro-beta: (5' -ATG CTG GCG GCC GCG GAT CCT ATT ACC ATG TTC TCC CTG ACC CGG
C), UPro-int: (5'-ATG CTG GCG GCC GCG AAC CCT CTA GTC CTA GAA TTC ACT GAT GC), et UPRO-vrb: (5' -ATG CTG GCG GCC GCG GAA ACC ACC GGA CAG GCT TAC TGG AAG CCC), respectivement (voir figs 39 à 41). Ces fragments d'ADN ont été digérés avec l'enzyme EagI et insérés soit dans le plasmide FBEASALF (voir plus haut) résultant en l'obtention des vecteurs d'expression pour les enveloppes chimères EADeltaPro4-beta, EADeltaPro4-int, EADeltaPro4-vrb, EAPro-beta, EAPro-int et EAPro-vrb, soit dans le plasmide FB34ASALF (voir plus haut) résultant en l'obtention des vecteurs d'expression pour les enveloppes chimères 34ADeltaPro4-beta,
34ADeltaPro4-int, 34ADeltaPro4-vrb, 34APro-beta, 34APro-int et 34APro-vrb.
BIBLIOGRAPHIE
1 . Battini, J. L. , O. Danos, and J. M. Heard. 1995. Receptor-binding domain of murine leukemia virus envelope glycoproteins. J. Virol. 62:713-719.
2. Battini, J. L., P. Rodrigues, R. MΫller, O. Danos, and J .-M. Heard. 1996. Receptor-binding properties of a purified fragment of the 4070A amphotropic murine leukemia virus envelope giycoprotein. J. Virol. in press.
3. Bell, G. L , N. M. Fong, M. M. Stempien, M. A. Wormsted, D. Caput, L. Ku, M. S. Urdea, L. B. Rail, and R. Sanchez-Pescador. 1986. Human epidermal growth factor precursor: cDNA séquence, expression in vitro and gène organization. Nucleic Acid Res. 14:8427-8446.
4. Cosset, F.-L. , C. Legras, Y. Chebloune, P. Savatier, P. Thoraval, J. L. Thomas, J. Samarut, V. M. Nigon, and G. Verdier. 1990. A new avian leukosis virus-based packaging cell Une that uses two separate transcomplementing helper génomes. J Virol. M: 1070-1078.
5. Cosset, F.-L. , C. Legras, J. L. Thomas, R. M. Molina, Y. Chebloune, C. Faure, V. M. Nigon, and G. Verdier. 1991. Improvement of avian leukosis virus (ALV)- based retrovirus vectors by using différent cis-acting séquences from ALVs. J Virol. 65_:3388-3394.
6. Cosset, F.-L. , F. J. Morling, Y. Takeuchi, R. A. Weiss, M. K. L. Collins, and S. J. Russell. 1995a. Rétroviral retargeting by envelopes expressing an N-terminal binding domain. J. Virol. 62:6314-6322.
7. Cosset, F.-L., Y. Takeuchi, J. L. Battini, R. A. Weiss, and M. K. L.
Collins. 1995b. High titer packaging Systems producing recombinant retroviruses résistant to human sérum. J. Virol. 62:7430-7436.
8. Gatignol, A. , H. Durand, and G. Tiraby. 1988. Bleomycin résistance conferred by a drug-binding protein. FEBS Letters. 230: 171-175.
9. Kozak, S. L. , D. C. Siess, M. P. Kavanaugh, A. D. Miller, and D. Kabat. 1995. The envelope giycoprotein of an amphotropic murine retrovirus binds specifically to the cellular receptor/phosphate transporter of susceptible species. J. Virol. 62:3433-3440.
10. Marin, M. , D. No'l, S. Valsesia-Wittmann, F. Brockly, M. Etienne-Julan, S. J. Russell, F.-L. Cosset, and M. Piechaczyk. 1996. Targeted infection of human cells via MHC class I molécules by MoMuLV-derived viruses displaying single-chain antibody fragment-envelope fusion proteins, in press.
11. Miller, D. G. , R. H. Edwards, and A. D. Miller. 1994. Cloning of the cellular receptor for amphotropic murine retroviruses reveals homology to that for gibbon ape leukemia virus. Proc Natl Acad Sci USA. 21:78-82.
12. Nagai, K. , and H. C. Thorgersen. 1984. Génération of beta- globin by sequence-specific proteolysis of a hybrid protein produced in
Escherishia coll. Nature (London). 202:810-812.
13. Nilson, B. H. K. , F. J. Morling, F.-L. Cosset, and S. J . Russell. 1996. Targeting of rétroviral vectors through protease-substrate interactions. Gène Ther. in press.
14. Ott, D. , R. Friedrich, and A. Rein. 1990. Séquence analysis of amphotropic and 10A1 murine leukemia virus: close relationship to mink cell focus forming viruses. J. Virol. 64:757-766.
15. Russell, S. J. , R. E. Hawkins, and G. Winter. 1993. Rétroviral vectors displaying functional antibody fragments. Nucleic Acids Research. 21:1081-1085.
16. Sambrook, J. , E. F. Fritsch, and T. Maniatis . 1989. ,
Molecular cloning, A laboratory manual, 2nd éd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
17. Shinnick, T. M., R. A. Lerner, and J. G. Sutcliffe. 1981. Nucleotide séquence of Moloney murine leukemia virus. Nature. 223_:543-548.
18. Souyri, M., I. Vigon, J. F. Penciolelli, J. M. Heard, P. Tambourin, and F. Wendling. 1990. A putative truncated cytokine receptor gène transduced by the myeloproliferativc leukemia virus immortalizes hematopoietic progenitors. Cell. 6_3_: 1137-1147.
19. Takeuchi, Y., F. L. Cosset, P. J. Lachmann, H. Okada, R. A. Weiss, and M. K. L. Collins. 1994. Type C retrovirus inactivation by human complément is determined by both the viral génome and producer cell. J. Virol. 63: 8001-8007.
20. Valsesia-Wittmann, S. , A. Drynda, G. Deleage, M. Aumailley, J.-M. Heard, O. Danos, G. Verdier, and F.-L. Cosset. 1994. Modifications in the binding domain of avian retrovirus envelope protein to redirect the host range of rétroviral vectors. J. Virol. 68:4609-4619.
21. Valsesia-Wittmann, S. , F. J. Morling, B. H. K. Nilson, Y. Takeuchi, S. J. Russell, and F.-L. Cosset. 1996. Improvement of rétroviral retargeting by using amino acid spacers between an additional binding domain and the N terminus of Moloney murine leukemia virus SU. J. Virol. 70_:2059- 2064.
22. VanZeijl, M., S. V. Johann, E. Cross, J. Cunningham, R.
Eddy, T. B. Shows, and B. O'Hara. 1994. An amphotropic virus receptor is a second member of the gibbon ape leukemia virus receptor family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 21: 1168-1172.
23. Weiss, R. A. 1993. Cellular receptors and viral glycoproteins involved in rétroviral entry, p. 1-108. In J. Levy (éd.), The Retroviridae, vol. 2. Plénum Press.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un peptide en vue d'un transfert de gènes dans une cellule eucaryote cible, lequel peptide présente d'environ 10 à environ 200, notamment d'environ 15 à environ 150 acides aminés, et avantageusement environ 20 acides aminés, dans lequel 30% au moins des acides aminés sont constitués par des résidus proline, lesquels résidus proline sont régulièrement agencés de manière à induire des repliements de la chaîne polypeptidique à environ 180° ("β-turn" ou "reverse-turn"), ces repliements étant régulièrement espacés et s'assemblant en une hélice polyproline à repliement de type β ("polyproline β-turn helix"), dans une construction polypeptidique contenant, du côté N-terminal (en amont) dudit peptide, un domaine protéique N-terminal (amont) susceptible de reconnaître une molécule de surface ciblée ou un antigène exprimé sur une surface cellulaire, notamment un récepteur approprié (récepteur ciblé) situé sur ladite cellule eucaryote, et du côté C-terminal (en aval) dudit peptide, un domaine protéique C-terminal (aval) susceptible de reconnaître un récepteur approprié (récepteur auxiliaire) situé sur la susdite cellule eucaryote, lequel peptide est capable de faciliter ou d'inhiber l'interaction entre le domaine protéique C-terminal (aval) et le récepteur auxiliaire, l'inhibition de cette interaction ayant lieu tant que le domaine protéique
N-terminal (amont) n'a pas interagi avec le récepteur ciblé et la favorisation de l'interaction entre le domaine protéique C-terminal (aval) et le récepteur auxiliaire ayant lieu lorsque le domaine protéique N-terminal (amont) a interagi avec le récepteur ciblé.
2. Utilisation d'un peptide selon la revendication 1 , dans la construction d'une glycoprotéine à activité ciblante et fusogénique, essentiellement intacte, portée par un vecteur recombinant viral ou non viral de transfert de gène capable d'infecter une cellule eucaryote, ladite cellule eucaryote comportant un récepteur ciblé et un récepteur auxiliaire permettant de faciliter l'entrée du susdit vecteur viral ou non viral dans la cellule eucaryote, la susdite glycoprotéine comprenant :
- le susdit peptide,
- un domaine protéique du côté N-terminal (en amont) du susdit peptide, susceptible d'interagir avec le susdit récepteur ciblé, lequel domaine protéique permet de lier spécifiquement le susdit vecteur de transfert de gènes et
- un domaine protéique du côté C-terminal (en aval) du susdit peptide, susceptible d'interagir avec le susdit récepteur auxiliaire, laquelle interaction joue le rôle de mécanisme auxiliaire d'entrée du susdit vecteur de transfert de gènes dans la cellule eucaryote, le processus d'entrée cellulaire du vecteur viral ou non viral recombinant dans la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique C-terminal (aval) ne pouvant avoir lieu que lorsque le domaine protéique N-terminal (amont) a reconnu et lié le vecteur viral ou non viral recombinant avec le récepteur ciblé de la cellule eucaryote, entraînant par l'intermédiaire du susdit peptide un mécanisme de "démasquage" ou encore d'accessibilité du récepteur auxiliaire vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval), et, dans le cas où il n'y a pas reconnaissance entre le susdit vecteur de transfert de gènes et le récepteur ciblé de la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique N-terminal (amont), se produit un mécanisme de "masquage" ou encore de non accessibilité, par l'intermédiaire du susdit peptide, du récepteur auxiliaire vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval).
3. Utilisation d'un peptide selon l'une des revendications 1 à 2, dans la construction d'une glycoprotéine d'enveloppe (rétro)virale essentiellement intacte, portée par une particule (rétro) virale recombinante capable d' infecter une cellule eucaryote, ladite glycoprotéine d'enveloppe étant avantageusement sous forme polymérique, notamment sous forme trimérique, chaque monomère de la forme polymérique étant lui-même sous forme d'hétérodimère, ladite cellule eucaryote comportant un récepteur ciblé et un récepteur auxiliaire permettant de faciliter l'entrée de la susdite particule (rétro)vifàle (récepteur (rétro)viral) dans la cellule eucaryote, la glycoprotéine d'enveloppe comprenant: - le susdit peptide,
- un domaine protéique du côté N-terminal (en amont) du susdit peptide, susceptible d'interagir avec le susdit récepteur ciblé, laquelle interaction permet de lier spécifiquement la particule (rétro)virale et
- un domaine protéique du côté C-terminal (en aval) du susdit peptide, susceptible d'interagir avec le susdit récepteur (rétro)viral, laquelle interaction joue le rôle de mécanisme auxiliaire d'entrée de la particule (rétro)virale dans la cellule eucaryote, le processus d'entrée cellulaire de la particule (rétro)virale recombinante dans la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique C-terminal (aval) ne pouvant avoir lieu que lorsque le domaine protéique N-terminal (amont) a reconnu et lié le récepteur ciblé de la cellule eucaryote avec la particule (rétro)virale recombinante, entraînant par l' intermédiaire du susdit peptide un mécanisme de "démasquage" ou encore d'accessibilité du récepteur (rétro)viral vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval), et, dans le cas où il n'y a pas reconnaissance entre la particule virale recombinante et le récepteur ciblé de la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique N-terminal (amont), se produit un mécanisme de "masquage" ou encore de non accessibilité, par l'intermédiaire du susdit peptide, du récepteur (rétro)viral vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval).
4. Utilisation d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le domaine protéique N-terminal (amont) est choisi parmi les polypeptides suivants :
- anticorps monobrin reconnaissant des molécules de surface cellulaire,
- tout ligand pour une molécule de surface cellulaire, notamment hormones polypeptidiques, cytokine, facteurs de croissance.
5. Utilisation d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à
4, caractérisé en ce que le domaine protéique C-terminal (aval) correspond à une glycoprotéine d'enveloppe (rétro)virale, essentiellement intacte comportant le domaine naturel de liaison, les fonctions de fusion et d'ancrage de la glycoprotéine d'enveloppe sauvage dont dérive la glycoprotéine d'enveloppe portée par la particule (rétro) virale recombinante.
6. Utilisation d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à
5, caractérisée en ce que le peptide provient de la glycoprotéine d'enveloppe des retrovirus de type C, et en ce que le virus est avantageusement choisi parmi : le virus MLV écotrope, le virus MLV amphotrope, le virus MLV xénotrope, le virus MLV MCF, le virus MLV 10A1 , GALV (Gibbon Ape Leukemia Virus), SSAV (Simian Sarcoma Associated Virus), FeLV A, FeLV B, FeLV C (FeLV: Féline Leukemia Virus), et notamment en ce que le peptide est choisi parmi ceux contenant ou étant constitués par l'une des séquences suivantes :
PRO (4070A), PRO(MoMLV), ΔPRO, PRO + , ΔPRO + , PROβ, ΔPROβ, ΔPR04-β, ΔPR04-int, ΔPR04-vrb, PROβ, PRO-int, PRO-vrb.
7. Utilisation d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le peptide est dérivé ou adapté de l'élastine bovine et choisi parmi ceux contenant ou étant constitué par l'une des séquences suivantes: EL3, EL3-V, EL5.
8. Séquences peptidiques choisies parmi celles contenant ou constituées par l'une des séquences suivantes :
- PRO (4070A), PRO(MoMLV), PROβ, PRO + , ΔPRO, ΔPROβ, ΔPRO + ,
- MOAPRO, MOAΔPRO, - EMOPRO, EMOPROβ, EMOPRO + , EAPRO, EAPROβ, EAPRO+ ,
EMOΔPRO, EMOΔPROβ, EMOΔPRO + , EAΔPRO, EAΔPROβ, EAΔPRO + , EL3, EL3-V, EL5, AMOEL3, AMOEL3-V, AMOEL5, ΔPR04-β , ΔPR04-int, ΔPR04-vrb, PROβ, PRO-int, PRO-vrb.
9. Séquence polypeptidique contenant un peptide d'environ 10 à environ
200, notamment d'environ 15 à environ 150 acides aminés, et avantageusement d'environ 20, dans lequel 30% au moins des acides aminés sont constitués par des résidus proline, lesquels résidus proline sont régulièrement agencés de manière à induire des repliements de la chaîne polypeptidique à environ 180° ("β-turn" ou "reverse-turn"), ces repliements étant régulièrement espacés et s'assemblant en une hélice polyproline à repliement de type β ("polyproline β-turn helix"),
- un domaine protéique N-terminal (en amont) du susdit peptide, susceptible de réagir avec un récepteur approprié (récepteur ciblé) situé sur une cellule eucaryote, lequel domaine protéique permet de lier spécifiquement une particule
(rétro)virale recombinante contenant ledit domaine protéique N-terminal et
- un domaine protéique C-terminal (en aval) du susdit peptide, susceptible d'interagir avec un récepteur (rétro)viral auxiliaire approprié (récepteur (rétro)viral) situé sur ladite cellule eucaryote, laquelle interaction joue le rôle de mécanisme auxiliaire d'entrée de la particule (rétro)virale dans ladite cellule eucaryote, le processus d'entrée cellulaire de ladite particule (rétro)virale recombinante dans ladite cellule eucaryote par le biais du domaine protéique C-terminal (aval) ne pouvant avoir lieu que lorsque le domaine protéique N-terminal (amont) a reconnu et lié le récepteur ciblé de la cellule eucaryote avec ladite particule
(rétro)virale recombinante, entraînant par l'intermédiaire du susdit peptide un mécanisme de démasquage ou encore d'accessibilité du récepteur (rétro)viral vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval), et, dans le cas où il n'y a pas reconnaissance entre la particule virale recombinante et le récepteur ciblé de la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique N-terminal (amont), se produit un mécanisme de masquage ou encore de non accessibilité, par l'intermédiaire du susdit peptide, du récepteur (rétro)viral vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval).
10. Particule (rétro)virale recombinante susceptible d'infecter une cellule eucaryote, laquelle cellule comporte un récepteur ciblé et un récepteur auxiliaire de la susdite particule (rétro)virale, comprenant une glycoprotéine d'enveloppe substantiellement intacte, notamment sous forme polymérique et avantageusement sous forme trimérique, chaque monomère de la forme polymérique étant avantageusement lui-même sous forme hétérodimère, contenant un peptide d'environ 10 à environ 200, notamment d'environ 15 à environ 150 acides aminés, et avantageusement d'environ 20, dans lequel 30% au moins des acides aminés sont constitués par des résidus proline, lesquels résidus proline sont régulièrement agencés de manière à induire des repliements de la chaîne polypeptidique à environ 180° ("β-turn" ou "reverse-turn"), ces repliements étant régulièrement espacés et s'assemblant en une hélice polyproline à repliement de type β ("polyproline β-turn helix"), - un domaine protéique du côté N-terminal (en amont) du susdit peptide, susceptible d'interagir avec le susdit récepteur ciblé, lequel domaine peptidique permet de lier spécifiquement la particule (rétro)virale et - un domaine protéique du côté C-terminal (en aval) du susdit peptide, susceptible d'interagir avec le susdit récepteur (rétro)viral, laquelle interaction joue le rôle de mécanisme auxiliaire d'entrée de la particule (rétro)virale dans la cellule eucaryote, le processus d'entrée cellulaire de la particule (rétro)virale recombinante dans la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique C-terminal (aval) ne pouvant avoir lieu que lorsque le domaine protéique N-terminal (amont) a reconnu et lié le récepteur ciblé de la cellule eucaryote avec la particule (rétro)virale recombinante, entraînant par l'intermédiaire du susdit peptide un mécanisme de démasquage ou encore d'accessibilité du récepteur (rétro)viral vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval), et, dans le cas où il n'y a pas reconnaissance entre la particule virale recombinante et le récepteur ciblé de la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique N-terminal (amont), se produit un mécanisme de masquage ou encore de non accessibilité, par l'intermédiaire du susdit peptide, du récepteur rétroviral vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval).
11. Particule (rétro) virale recombinante selon la revendication 10, caractérisée en ce que le domaine protéique N-terminal (amont) est choisi parmi les peptides suivants : - anticorps monobrin reconnaissant des molécules de surface cellulaire, - tout ligand pour une molécule de surface cellulaire, notamment hormones polypeptidiques, cytokine, facteurs de croissance.
12. Particule (rétro)virale recombinante selon l'une des revendications 10 ou 11, caractérisée en ce que le domaine protéique C-terminal (aval) correspond à un polypeptide d'origine (rétro)virale comportant les fonctions de liaison, de fusion et d'ancrage de la glycoprotéine d'enveloppe sauvage dont dérive la glycoprotéine d'enveloppe portée par la particule (rétro)virale recombinante, et peut provenir des domaines naturels comportant les fonctions de liaison, de fusion et d'ancrage des glycoprotéines d'enveloppe issues des retrovirus
MLV-A, GALV, FeLVB, ou des virus tels que adénovirus, herpès virus, virus AAV (Adeno Associated Virus), ou plus généralement de glycoprotéines virales issues de virus d'origine eucaryote, notamment orthomyxovirus (tel que virus influenza) ou paramyxovirus (tel que SV5).
13. Particule (rétro)virale recombinante selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisée en ce que le peptide provient de la glycoprotéine d'enveloppe de retrovirus de type C, et en ce que le peptide provient avantageusement d'un virus choisi parmi : le virus MLV écotrope, le virus MLV amphotrope, le virus MLV xénotrope, le virus MLV MCF, le virus
MLV 10A1 , GALV (Gibbon Ape Leukemia Virus), SSAV (Simian Sarcoma Associated Virus), FeLV A, FeLV B, FeLV C (FeLV : Féline Leukemia Virus), et notamment en ce que le peptide est choisi parmi ceux contenant ou étant constitués par l'une des séquences suivantes PRO (4070A), PRO(MoMLV), ΔPRO, PRO+ , ΔPRO+ , PROβ, ΔPROβ, ΔPR04-β,
ΔPR04-int, ΔPR04-vrb, PROβ, PRO-int, PRO-vrb.
14. Particule (rétro)virale recombinante selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, caractérisée en ce que : - le peptide provient de la glycoprotéine d'enveloppe des retrovirus de type C, et en ce que le virus est avantageusement choisi parmi : le virus MLV écotrope, le virus MLV amphotrope, le virus MLV xénotrope, le virus MLV MCF, le virus MLV 10A1 , GALV (Gibbon Ape Leukemia Virus), SSAV (Simian Sarcoma Associated Virus), FeLV A, FeLV B, FeLV C (FeLV: Féline Leukemia Virus), et notamment en ce que le peptide est choisi parmi ceux contenant ou étant constitués par l'une des séquences suivantes : PRO (4070 A), PRO(MoMLV), ΔPRO, PRO+ , ΔPRO + , PROβ, ΔPROβ, ΔPR04-β, ΔPR04-int, ΔPR04-vrb, PROβ, PRO-int, PRO-vrb, - le domaine protéique N-terminal (amont) est choisi parmi les peptides suivants:
* anticorps monobrin reconnaissant des molécules de surface cellulaire,
* tout ligand pour une molécule de surface cellulaire, notamment hormones polypeptidiques, cytokine, facteurs de croissance, s - le domaine protéique C-terminal correspond à un polypeptide d'origine
(rétro)virale comportant les fonctions de liaison, de fusion et d'ancrage de la glycoprotéine d'enveloppe sauvage dont dérive la glycoprotéine d'enveloppe portée par la particule (rétro)virale recombinante, et peut provenir des domaines naturels comportant les fonctions de liaison, de 0 fusion et d'ancrage des glycoprotéines d'enveloppe issues des retrovirus
MLV-A, GALV, FeLVB, ou des virus tels que adénovirus, herpès virus, virus AAV (Adeno Associated Virus), ou plus généralement de glycoprotéines virales issues de virus d'origine eucaryote, notamment orthomyxovirus (tel que virus influenza) ou paramyxovirus (tel que SV5). 5
15. Particule (rétro) virale recombinante selon l'une des revendications 10 à 14, caractérisée en ce que l'extrémité 5 ' de la séquence nucléotidique codant pour le domaine protéique N-terminal (amont) est contiguë à l'extrémité 3' de la séquence nucléotidique codant pour le peptide signal, l'extrémité 3' de la 0 séquence nucléotidique codant pour le domaine protéique N-terminal (amont) est contiguë à l'extrémité 5 ' de la séquence nucléotidique codant pour le peptide, l'extrémité 3 ' de la séquence nucléotidique codant pour le peptide est contiguë à l'extrémité 5 ' de la séquence nucléotidique codant pour le domaine protéique C-terminal (aval).
25
16. Acide nucléique codant pour un peptide ou pour une particule recombinante selon l'une quelconque des revendications 10 à 15.
17. Méthode de transfert sélective in vitro ou ex vivo d'un acide nucléique 30 dans des cellules eucaryotes cibles présentes parmi d'autres cellules non-cibles, comprenant l'administration aux cellules cibles et non-cibles d'une particule recombinante (rétro)virale selon l'une des revendications 10 à 15, contenant l'acide nucléique à transférer.
35 18. Composition pharmaceutique contenant à titre de substance active une particule (rétro)virale selon l'une quelconque des revendications 10 à 15, et contenant également un gène à transférer, en association avec un véhicule pharmaceutique physiologiquement approprié. pharmaceutique physiologiquement approprié.
EP97925095A 1996-05-20 1997-05-16 Particules virales masquees ou demasquees vis-a-vis du recepteur cellulaire Withdrawn EP0953053A2 (fr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9606234 1996-05-20
FR9606234A FR2748747B1 (fr) 1996-05-20 1996-05-20 Particules virales recombinantes comportant un peptide ayant des proprietes de masquage et de demasquage vis-a-vis d'un mecanisme biologique
PCT/FR1997/000870 WO1997044474A2 (fr) 1996-05-20 1997-05-16 Particules virales masquees ou demasquees vis-a-vis du recepteur cellulaire

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP0953053A2 true EP0953053A2 (fr) 1999-11-03

Family

ID=9492280

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP97925095A Withdrawn EP0953053A2 (fr) 1996-05-20 1997-05-16 Particules virales masquees ou demasquees vis-a-vis du recepteur cellulaire

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP0953053A2 (fr)
JP (1) JP2000511051A (fr)
AU (1) AU725632B2 (fr)
CA (1) CA2253874A1 (fr)
FR (1) FR2748747B1 (fr)
WO (1) WO1997044474A2 (fr)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2773561A1 (fr) * 1998-01-15 1999-07-16 Centre Nat Rech Scient Utilisation d'une sequence riche en proline pour augmenter le caractere fusogenique d'enveloppes de retrovirus
WO2000071578A2 (fr) * 1999-05-20 2000-11-30 Cnrs Centre National De La Recherche Scientifique Nouveaux polypeptides et leur utilisation pour le sauvetage de virus ou de glycoproteines virales a defaut de fusion

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE111715T1 (de) * 1988-04-21 1994-10-15 Uab Research Foundation Bioelastomer ohne adhäsionseigenschaft zum einsatz am wundort.
US5637481A (en) * 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
WO1994011524A1 (fr) * 1992-11-09 1994-05-26 The United States Government As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Particules vectorielles pouvant etre ciblees
US5773577A (en) * 1994-03-03 1998-06-30 Protein Polymer Technologies Products comprising substrates capable of enzymatic cross-linking
GB9412844D0 (en) * 1994-06-27 1994-08-17 Medical Res Council Improvements in or relating to therapeutic methods
US5662885A (en) * 1994-07-22 1997-09-02 Resolution Pharmaceuticals Inc. Peptide derived radionuclide chelators

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO9744474A2 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2253874A1 (fr) 1997-11-27
AU3035697A (en) 1997-12-09
JP2000511051A (ja) 2000-08-29
FR2748747A1 (fr) 1997-11-21
WO1997044474A3 (fr) 1998-03-05
FR2748747B1 (fr) 1998-08-07
WO1997044474A2 (fr) 1997-11-27
AU725632B2 (en) 2000-10-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Romano et al. Gene transfer technology in therapy: current applications and future goals
Cosset et al. High-titer packaging cells producing recombinant retroviruses resistant to human serum
EP0840797B1 (fr) Procedes et moyens d&#39;apport cible de genes
US6117681A (en) Pseudotyped retroviral particles
US6534051B1 (en) Cell type specific gene transfer using retroviral vectors containing antibody-envelope fusion proteins and wild-type envelope fusion proteins
US5869331A (en) Cell type specific gene transfer using retroviral vectors containing antibody-envelope fusion proteins and wild-type envelope fusion proteins
JPH09509329A (ja) 遺伝子搬送媒体を標的とする組成物及び方法
EP0769062A2 (fr) Nouveau site interne d&#39;entree des ribosomes, vecteur le contenant et utilisation therapeutique
EP0827547B1 (fr) Vecteurs retroviraux derives de virus de sarcomes-leucoses aviaires permettant le transfert de genes dans des cellules de mammiferes et leurs emplois therapeutiques
WO1996004934A1 (fr) Vecteurs retroviraux produits par des lignees de cellules productrices resistantes a la lyse par le serum humain
WO1995023846A1 (fr) Transfert genique specifique de types de cellules a l&#39;aide de vecteurs retroviraux contenant des proteines de fusion d&#39;enveloppe d&#39;anticorps et d&#39;enveloppe de type sauvage
WO1994012626A1 (fr) Transfert de genes specifique a un type cellulaire a l&#39;aide de vecteurs retroviraux contenant des proteines de fusion enveloppe-anticorps
US5858743A (en) Delivery of nucleic acids
US6448390B1 (en) Stable envelope proteins for retroviral, viral and liposome vectors and use in gene drug therapy
AU2008221564A1 (en) Methods and Compositions for Treating Disorders
WO1997044474A2 (fr) Particules virales masquees ou demasquees vis-a-vis du recepteur cellulaire
CA2317026A1 (fr) Utilisation d&#39;une sequence riche en proline pour augmenter le caractere fusogenique d&#39;enveloppes de retrovirus
EP0817860B1 (fr) Particules retrovirales pseudotypees
Romano et al. Gene transfer technology in therapy: current applications and future goals
JP2005532075A (ja) 改変した細胞結合活性を有するウィルス粒子の調製方法およびその使用
US20020164583A1 (en) Targeting viral vectors to specific cells
FR2727429A1 (fr) Lignees d&#39;encapsidation et vecteurs d&#39;expression pour la transcomplementation de vecteurs retroviraux defectifs
EP1006123A2 (fr) Protéines d&#39;enveloppe, methodes et utilisations
Chowdhury Retroviral targeting to tumour antigens
CA2524892A1 (fr) Polypeptide purifie, acides nucleiques isoles le codant, vecteurs et utilisation correspondante

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 19981111

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FI FR GB GR IE IT LI LU MC NL PT SE

17Q First examination report despatched

Effective date: 20030925

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20040206