DE69823813T2 - Malignitätsunterdrückung unter verwendung von ribonukleotidreduktase r1 - Google Patents

Malignitätsunterdrückung unter verwendung von ribonukleotidreduktase r1 Download PDF

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • 1. GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft Nukleinsäuren und Proteine und Peptide für eine Verwendung bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Modulation der Vermehrung von malignen Zellen und Vektoren, welche jene Nukleinsäuren umfassen, und pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Nukleinsäuren, Proteine und Peptide und Vektoren umfassen.
  • Spezieller betrifft sie die Verwendung der R1-Gensequenz von Ribonukleotidreduktase, des Genprodukts und von Derivaten und analogen Sequenzen.
  • 2. BESCHREIBUNG DES DAMIT IN ZUSAMMENHANG STEHENDEN STANDES DER TECHNIK
  • Der erste einzigartige Schritt, welcher zur DNA-Synthese führt, ist die Umwandlung von Ribonukleotiden zu deren entsprechenden Desoxyribonukleotiden, eine Reaktion, die in einer Zellzyklusspezifischen Weise durch das Haushaltsgen Ribonukleotidreduktase katalysiert wird [Lewis et al., 1978; Reichard, 1993; Wright, 1989a; Wright et al., 1990a; Stubbe, 1989]. Das Säugetier-Enzym wird aus zwei unähnlichen dimeren Protein-Komponenten, welche oftmals als R1 und R2 bezeichnet werden, die durch zwei unterschiedliche Gene, die sich auf unterschiedlichen Chromosomen befinden, kodiert werden, gebildet [Björklund et al., 1993; Tonin et al., 1987]. Das Säugetier-Protein R1 ist eine homodimere Struktur und weist Substratstellen und allosterische Effektorstellen, die die Enzymaktivität und Substratspezifität kon trollieren, auf [Wright, 1989b; Thelander et al., 1980; Caras et al., 1985; Wright et al., 1990a]. Das Protein R2 ist ein Homodimer und bildet zwei äquivalente zweikernige Eisen-Zentren, welches ein freies Tyrosylradikal, welches für die Katalyse benötigt wird, stabilisiert [Wright et al., 1990a; Thelander et al., 1985; McClarty et al., 1990]. Die R1- und R2-Proteine wechselwirken an ihren C-terminalen Enden unter Bildung eines aktiven Holoenzyms [Reichard, 1993; Wright et al., 1990a; Davis et al., 1994].
  • Ribonukleotidreduktase dient zusätzlich zu der Bereitstellung von Substraten für die DNA-Replikation anderen biologischen Funktionen. Beispielsweise kann ihre Aktivität außerhalb der S-Phase durch DNA-Vernetzungsmittel, wie Chorambucil und UV-Bestrahlung, induziert werden, was eine Rolle für das Enzym bei dem DNA-Reparaturprozess nahe legt [Hurta und Wright, 1992].
  • R1 und R2 werden während des Zellzyklus in unterschiedlicher Weise reguliert. Es gibt eine mit der S-Phase korrelierende Zunahme des R2-Proteins, welche aus dessen de novo-Synthese resultiert [Lewis et al., 1978; Mann et al., 1988]. Die Aktivität von Ribonukleotidreduktase, und dementsprechend die DNA-Synthese und Zellproliferation, wird in proliferierenden Zellen während des Zellzyklus durch die Synthese und den Abbau der R2-Komponente kontrolliert [Eriksson et al., 1984; Choy et al., 1988]. Die geschwindigkeitslimitierende R2-Komponente ist ein Phosphoprotein, welches in der Lage ist, durch die CDC2- und CDK2-Proteinkinase-Mediatoren des Fortschreitens des Zellzyklus phosphoryliert zu werden [Chan et al., 1993], und enthält Nicht-Häm-Eisen, welches ein einzigartiges freies Tyrosol-Radikal, welches für die Enzymaktivität benötigt wird, stabilisiert [Reichard, 1993; McClarty et al., 1990].
  • Die Konzentrationen des R1-Proteins scheinen sich während des Zellzyklus von proliferierenden Zellen nicht substantiell zu verändern und können während des gesamten Zellzyklus nachgewiesen werden. Die Synthese von R1-mRNA scheint, wie bei R2-mRNA, hauptsächlich während der S-Phase aufzutreten [Eriksson et al., 1984; Choy et al., 1988; Mann et al., 1988]. Die breitere Verteilung des R1-Proteins während des Zellzyklus wird dessen längerer Halbwertszeit verglichen mit dem R2-Protein zugeschrieben [Choy et al., 1988; Mann et al., 1988].
  • Die Regulation von Ribonukleotidreduktase und insbesondere der R2-Komponente ist in malignen Zellen, welche Tumorpromotoren oder dem Wachstumsfaktor TGF-β ausgesetzt sind, deutlich verändert [Amara et al., 1994; Chen et al., 1993; Amara et al., 1995b; Hurta und Wright, 1995; Hurta et al., 1991]. Bei einigen humanen Kolorektalkarzinomen kann eine R1-Deletion nachgewiesen werden [Glenney, 1986]. In kultivierten malignen Zellen sind höhere Niveaus von Enzymaktivität verglichen mit nicht-malignen Zellen beobachtet worden [Weber, 1983; Takeda und Weber, 1981; Wright et al., 1989a] und erhöhte Konzentrationen von R2-Protein und R2-mRNA sind in prä-malignen und malignen Geweben verglichen mit Proben von normalem Kontrollgewebe gefunden worden [Saeki et al., 1995; Jensen et al., 1994]. Die Regulation von Ribonukleotidreduktase und insbesondere die R2-Komponente ist in transformierten Zellen, welche Tumorpromotoren oder dem transformierenden Wachstumsfaktor β bei Wachstumsfaktor-vermittelten Mechanismen der Tumorprogression ausgesetzt sind, signifikant erhöht [Amara et al., 1996; Chen et al., 1993; Amara et al., 1995b].
  • Gegenwärtig eingesetzte chemotherapeutische Verbindungen, wie Hydroxyharnstoff, hemmen die Ribonukleotidreduktase-Aktivität durch Destabilisierung des Eisen-Zentrums des R2-Proteins, wodurch die Zerstörung des freien Tyrosylradikals bewirkt wird [McClarty et al., 1990] und Zellen daran gehindert werden, die S-Phase des Zellzyklus zu durchlaufen [Ashiara und Baserga, 1979]. Solche Arzneimittel haben bei der Behandlung von Krebs beim Menschen eine begrenzte Nützlichkeit und dementsprechend werden zusätzliche Ansätze, die auf die Ribonukleotidreduktase abzielen, benötigt.
  • Durchbrüche in der Molekularbiologie und dem humanen Genomprojekt haben zuvor nicht vorhergesehene Möglichkeiten für eine zielgerichtete Intervention in Hinblick auf die Säugetier-Genexpression eröffnet [Blaese, 1997; Felgner, 1997]. Diese umfassen Ansätze, wie eine Gentherapie, um in neoplastische Zellen genetische Kontrollsequenzen einzuschleusen, und spezifische Proteine, um proliferierende Zellen zu töten. Es wäre nützlich, diesen Ansatz einzusetzen, um die Expression von Ribonukleotidreduktase in Zellen, bei denen die Vermehrung kontrolliert werden muss, wie neoplastischen Zellen, zu modifizieren.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung stellt eine exprimierbare Nukleinsäure für eine Verwendung bei der Modulation der Vermehrung von malignen Zellen in einem Säugetier bereit, wobei die Nukleinsäure: (a) eine Nukleinsäure, die eine Säugetier-Ribonukleotidreduktase R1 kodiert, ist oder (b) eine Nukleinsäure, wie in (a), die modifiziert ist, so dass sie ein biologisch aktives Analog oder Derivat von Ribonukleotidreduktase R1 kodiert, ist. Die Nukleinsäure gemäß (a) kann eine Sequenz umfassen, wie sie in SEQ ID No: 1 aufgeführt ist, oder kann die Ribonukleotidreduktase R1 kodierende Sequenz, wie sie in SEQ ID No: 1 aufgeführt ist, umfassen oder sie kann modifiziert worden sein, so dass sie ein biologisch aktives Analog oder Derivat von jener Ribonukleotidreduktase R1 kodiert.
  • Die Erfindung stellt auch einen Vektor, welcher eine Nukleinsäure der Erfindung umfasst, bereit und stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche einen pharmazeutisch physiologisch geeigneten Träger oder ein pharmazeutisch physiologisch geeignetes Verdünnungsmittel und eine Nukleinsäure oder einen Vektor der Erfindung umfasst, bereit.
  • Die Erfindung stellt des weiteren ein Protein oder Peptid für eine Verwendung bei der Modulation der Vermehrung von malignen Zellen in einem Säugetier bereit, wobei das Protein oder Peptid (a) eine Säugetier-Ribonukleotidreduktase R1 oder (b) ein biologisch aktives Analog oder Derivat der Ribonukleotidreduktase R1 von (a) ist. Das Protein oder Peptid kann rekombinant produziert werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen, welche ein Protein oder Peptid der Erfindung und einen pharmazeutisch physiologisch geeigneten Träger bzw. ein pharmazeutisch physiologisch geeignetes Verdünnungsmittel umfassen, werden ebenfalls bereitgestellt.
  • Die Erfindung stellt auch die Verwendung einer Nukleinsäure oder eines Vektors oder eines Proteins oder eines Peptids der Erfindung bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Modulation der Vermehrung von malignen Zellen in einem Säugetier bereit.
  • Es wird auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure für die Herstellung eines Vektors bereitgestellt.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Modulation der Tumorigenizität, des Metastasierungs-Potenzials oder der Vermehrung von neoplastischen Zellen, welche aus einem Säugetier isoliert worden sind, bereit, welches umfasst, die neoplastische Zelle in vitro mit einer die Vermehrung modulierenden Menge einer exprimierbaren Nukleinsäuresequenz für eine Säugetier-Ribonukleotid-R1 des Säugetiers in Kontakt zu bringen.
  • Die Modulation der Vermehrung von malignen Zellen kann durch Inhibition der Vermehrung von neoplastischen Zellen oder durch Modulation der Tumorigenizität erfolgen. Die Modulation der Vermehrung von malignen Zellen umfasst vorzugsweise, die neoplastischen Zellen des Säugetiers mit der Nukleinsäure oder dem Protein oder Peptid in Kontakt zu bringen. Die Nukleinsäure kann über ein Genabgabe-Vehikel, das in Form eines Vektors für die Gentherapie vorliegen kann, abgegeben werden. Das Protein oder Peptid kann in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die an die zu kontrollierende Zelle abgegeben werden kann, vorliegen. Die neoplastische Zelle kann mit einer die Vermehrung kontrollierenden Menge einer exprimierbaren Nukleinsäuresequenz für Ribonukleotidreduktase R1 des Säugetiers in Kontakt gebracht werden und kann in einer Ausführungsform für Menschen SEQ ID No: 1 oder die spezifische R1 kodierende Sequenz daraus sein.
  • Die Verwendung der Nukleinsäuren, Proteine und Peptide, Vektoren und pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung ermöglicht eine generell verstärkte Expression der R1-Komponente von Säugetier-Ribonukleotidreduktase in einer zu kontrollierenden Zelle.
  • BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Andere Vorteile der Erfindung werden leicht erfasst werden, als diese durch Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung besser verstanden wird, wenn diese in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen betrachtet wird, in denen:
  • 1A–B Photographien sind, welche eine Analyse der Expression von Myc-Epitop-markiertem R1 [Fan et al., 1996b] ausgehend von transient pSHD/mR1-transfizierten BHK-Zellen durch den indirekten Immunfluoreszenzassay (A) und ausgehend von der stabilen retroviralen Verpackungszelllinie PA/mR1 durch Radioimmunpräzipitation (B) zeigen. Für beide Assays wurde der Anti-Myc-Epitop-Antikörper 9E10 verwendet.
  • 2 ein Balkendiagramm ist, welches die verringerte Vermehrungseffizienz in Weichagar bei rekombinantes R1 exprimierenden Zellen zeigt. Stabil mit dem viralen R1-Vektor infizierte Zelllinien wurden mit Kontrollzelllinien, die mit einem geeigneten leeren Vektor infiziert worden waren, verglichen (Tabelle 1). Die aufgeführten Daten wurden aus wenigstens drei unabhängigen Experimenten erhalten, welche jeweils aus dreifach erstellten Platten pro Zelllinien bestanden. Die Inokulum-Größen (Zel len/Platte) waren, wie folgt: 5 × 105 für C1/SHD- und C1/mR1-Zellen, 1 × 105 für C1/mR2- und C1/mR2/mR1-Zellen, 1 × 104 für C1/mR2a/SHD- und C1/mR2a/mR1-Zellen, ras-3/SHD- und ras-3/mR1-Zellen und 1 × 103 für Colo/SHD- und Colo/mR1-Zellen. In allen Fällen war der Unterschied bei der Anzahl von gebildeten Kolonien zwischen rekombinantes R1 exprimierenden Zellen und den Kontrollzellen statistisch signifikant (p < 0,001).
  • 3 Photographien von Platten sind, welche eine erhöhte Koloniebildungs-Effizienz in Weichagar bei N/ras&ASR1-Zellen (B) verglichen mit N/ras-Kontrollzellen (A) zeigen. Jede Platte wurde mit 1 × 104 Zellen inokuliert. N/ras&ASR1-Zellen bildeten wenigstens viermal mehr Kolonien, die im allgemeinen größer waren als jene, die durch N/ras-Zellen gebildet wurden. Die in (A) gezeigten Kolonien entwickelten sich nach 3 Wochen und jene, die in (B) gezeigt sind, entwickelten sich nach 2 Wochen Inkubation. Wenn die Daten aus sechs Experimenten, welche jeweils aus vier Platten pro Zelllinie bestanden, analysiert wurden, wurde festgestellt, dass der Unterschied bei den Koloniebildungs-Effizienzen, welche die beiden Zelllinien zeigten, hochgradig signifikant war (p < 0,0001).
  • 4 Photographien sind, welche die Ergebnisse von (A) Western-Blot-Analysen, welche verringertes R1-Protein in N/ras&ASR1-Zellen (b) verglichen mit N/ras-Kontrollzellen (a) zeigen, und (B) einer „India-Ink"-Anfärbung der in (A) gezeigten Nitrocellulose-Membran [Wright und Anazodo, 1996], welche eine ungefähr gleiche Beladung mit Zellextrakten zeigt, zeigen.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft die Modulation, einschließlich Tumorsuppression, der malignen Eigenschaften einer Zelle in einem Menschen oder anderen Säugetier durch Erhöhung der Expression von Ribonukleotidreduktase R1 in der Zelle durch Verwendung von pharmakologischen Mitteln oder Maßnahmen oder von Gentherapie maßnahmen. Beispielsweise kann eine neoplastische Zelle mit einer die Vermehrung modulierenden Menge einer exprimierbaren Nukleinsäuresequenz von Ribonukleotidreduktase R1 (für Menschen siehe SEQ ID No: 1) des Säugetiers in Kontakt gebracht werden, was eine generell erhöhte Expression der R1-Komponente der Säugetier-Ribonukleotidreduktase bewirkt. Alternativ muss die Zelle mit dem Ribonukleotidreduktase R1-Protein oder biologisch aktiven Analogen oder Derivaten davon in Kontakt gebracht werden. Die exprimierbare Nukleinsäuresequenz wird im allgemeinen in einem Genabgabe-Vehikel, das in Form eines Vektors für die Gentherapie vorliegen kann, bereitgestellt.
  • Dementsprechend ermöglicht die Erfindung die bereits oben dargelegten Aspekte der Erfindung.
  • Es wird die Verwendung einer exprimierbaren Nukleinsäure bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Modulation der Vermehrung von malignen Zellen in einem Säugetier bereitgestellt, wobei die Nukleinsäure (a) Nukleinsäure, welche eine Säugetier-Ribonukleotidreduktase R1 kodiert, oder (b) eine Nukleinsäure wie in (a), die modifiziert worden ist, so dass sie ein biologisch aktives Analog oder Derivat von Ribonukleotidreduktase R1 kodiert, ist. Die Nukleinsäure (a) kann eine Sequenz, wie in SEQ ID No: 1 aufgeführt, umfassen oder kann die Ribonukleotidreduktase R1 kodierende Sequenz, wie in SEQ ID No: 1 aufgeführt, umfassen oder kann modifiziert worden sein, so dass sie ein biologisch aktives Analog oder Derivat von jener Ribonukleotidreduktase R1 kodiert. Auch bereitgestellt wird die Verwendung eines Proteins oder Peptids bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Modulation der Vermehrung von malignen Zellen in einem Säugetier, wobei das Protein oder Peptid ist: (a) eine Säugetier-Ribonukleotidreduktase R1; oder (b) ein biologisch aktives Analog oder Derivat der Ribonukleotidreduktase R1 von (a).
  • Eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung zur Modulation der Vermehrung von malignen Zellen in einem Menschen oder anderen Säugetier kann aus einer wirksamen Menge einer exprimierbaren Nukleinsäuresequenz für Ribonukleotidreduktase R1 des Säugetiers oder von Analoga davon, die in Form eines Vektors vorliegen kann, und einem pharmazeutisch physiologisch geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel bestehen. Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Modulation der Vermehrung von malignen Zellen in einem Menschen oder anderen Säugetier kann aus einer wirksamen Menge von Ribonukleotidreduktase R1-Protein des Säugetiers oder von biologisch aktiven Analoga oder Derivaten davon und einem pharmazeutisch physiologisch geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel bestehen.
  • Zusätzlich kann die Zelle pharmakologisch behandelt werden, um die R1-Expression zu erhöhen, wie in diesem Fachgebiet bekannt ist, wie beispielsweise Arzneimittel, die die Expression erhöhen, indem geeignete Stoffwechsel- oder Signalwege aktiviert werden, oder die die mRNA-Stabilität erhöhen. Beispielsweise erhöht eine Stimulation der cAMP-Synthese durch Verwendung von entweder Forskolin oder Choleratoxin die R1-Expression in Zellen, in denen es ein funktionsfähiges Gen gibt [Hurta und Wright, 1994]. Ein anderes Mittel, das verwendet werden kann, umfasst 3-Isobutyl-1-methylxanthen (einen Inhibitor des cAMP-Abbaus). Die Expression von R1-mRNA wird durch einen Proteinkinase C-Signalweg reguliert; dementsprechend würden Arzneimittel, die in diesem Signalweg die Message-Stabilität erhöhen, die Verfügbarkeit von R1-mRNA erhöhen [Chen et al., 1994A].
  • Mit Modulation ist eine Suppression der zellulären Transformations-Charakteristiken, wie Verankerungs-unabhängige Vermehrung und andere Merkmale, die in diesem Fachgebiet bekannt sind und wie hier in den Beispielen exemplifiziert, gemeint. Modulation umfasst Tumor-suppressive Aktivität und Aktivität, welche Tumorwachstum verlangsamt und/oder eine Tumorregression und eine Ver ringerung der Tumorigenizität und des Metastasierungs-Potenzials bewirkt. Modulation kann eine Inhibition einer jeglichen abnormalen Zell- oder Gewebevermehrung oder -proliferation umfassen und kann umfassen, eine Zelle zu einem normalen Phänotyp zurückkehren zu lassen.
  • Die Vermehrungs-modulierende Menge einer exprimierbaren Nukleinsäuresequenz von Ribonukleotidreduktase, die in Form eines Gentherapie-Vektors vorliegen kann, oder des R1-Genprodukts selbst oder von Analoga oder Derivaten davon wird verabreicht und dosiert gemäß der guten medizinischen Praxis („good medical practice") unter Berücksichtigung des klinischen Zustands des individuellen Patienten, des Verabreichungsorts und der Verabreichungsmethode, des Zeitplans der Verabreichung, des Alters, Geschlechts, Körpergewichts des Patienten und anderer Faktoren, die den praktizierenden Ärzten bekannt sind. Die pharmazeutisch „wirksame Menge" wird für die hiesigen Zwecke dementsprechend durch solche Erwägungen, wie sie in diesem Fachgebiet bekannt sind, bestimmt. Die Menge muss wirksam sein, um eine Verbesserung zu erzielen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Schrumpfung des Tumors und verbesserte Überlebensrate oder schnellere Genesung oder Verbesserung oder Eliminierung von Symptomen und andere Indikatoren, die durch die Fachleute auf diesem Gebiet als geeignete Messparameter ausgewählt werden.
  • Gentherapie, wie hier verwendet, bezieht sich auf den Transfer von genetischem Material (z. B. DNA oder RNA) von Interesse in einen Wirt, um einen Phänotyp einer genetischen oder erworbenen Erkrankung oder eines genetischen oder erworbenen Zustands zu behandeln oder zu verhüten. Das genetische Material von Interesse kodiert ein Produkt (z. B. ein Protein, Polypeptid, Peptid oder funktionale RNA), dessen Produktion in vivo gewünscht wird. Das genetische Material von Interesse kann beispielsweise ein Hormon, einen Rezeptor, ein Enzym, Polypeptid oder Peptid von therapeutischem Wert kodieren. Für eine Übersicht siehe allge mein den Text „Gene Therapy" (Advances in Pharmacology 40, Academic Press, 1997).
  • Es haben sich zwei grundlegende Ansätze für eine Gentherapie herauskristallisiert: (a) eine ex vivo- und (2) eine in vivo-Gentherapie. Bei einer ex vivo-Gentherapie werden Zellen aus einem Patienten entfernt und in vitro behandelt, während sie kultiviert werden. Allgemein wird ein funktionsfähiges Ersatzgen in die Zelle über ein(e) geeignete(s) Genabgabe-Vehikel/Methode (Transfektion, Transduktion, homologe Rekombination u. s. w.) und ein Expressionssystem, wie benötigt, eingeführt und dann werden die modifizierten Zellen in Kultur vermehrt und in den Wirt/Patienten zurückgegeben. Es ist gezeigt worden, dass diese genetisch reimplantierten Zellen das Produkt des durch Transfektion eingeführten Gens in situ produzieren.
  • Bei einer in vivo-Gentherapie werden Zielzellen nicht aus dem Patienten entfernt, sondern das zu transferierende Gen wird in die Zellen des Empfängerorganismus in situ, d. h. innerhalb des Empfängers, eingeführt. Wenn das Wirtsgen fehlerhaft oder mangelhaft vorhanden ist, wird das Gen alternativ in situ repariert [Culver, 1998. Es ist gezeigt worden, dass diese genetisch veränderten Zellen das Produkt des durch Transfektion eingeführten Gens in situ produzieren.
  • Das Genexpressions-Vehikel ist zu einer Abgabe/einem Transfer von heterologer Nukleinsäure in eine Wirtszelle in der Lage. Das Expressions-Vehikel kann Elemente umfassen, um die Zielgerichtetheit, die Expression und die Transkription der Nukleinsäure in einer Zell-selektiven Weise zu kontrollieren, wie in diesem Fachgebiet bekannt ist. Es sollte festgehalten werden, dass oftmals die 5'-UTR und/oder die 3'-UTR des Gens durch die 5'-UTR und/oder 3'-UTR des Expressions-Vehikels ersetzt werden kann. Dementsprechend umfasst, wie hier verwendet, das Expressions-Vehikel möglicherweise, wie notwendig, nicht die in SEQ ID No: 1 gezeigte 5'-UTR und/oder 3'-UTR und umfasst nur die spezielle Aminosäure-kodierende Region für R1, ein R1-Peptid oder diese kodierende Region kann modifiziert sein, um ein R1-Analog oder -Derivat zu produzieren.
  • Das Expressions-Vehikel kann einen Promotor zur Kontrolle der Transkription des heterologen Materials umfassen und kann entweder ein konstitutiver oder induzierbarer Promotor, um eine selektive Transkription zu ermöglichen, sein. Gegebenenfalls können Verstärkungselemente (Enhancer), die erforderlich sein können, um notwendige Transkriptionsniveaus zu erzielen, mit aufgenommen werden. Enhancer sind im allgemeinen eine jegliche nicht-translatierte DNA-Sequenz, die in benachbarter Lage mit der kodierenden Sequenz (in cis) zusammenarbeitet, um das Transkriptionsgrundniveau, welches durch den Promotor diktiert wird, zu verändern. Das Expressions-Vehikel kann auch ein Selektionsgen, wie hier nachfolgend beschrieben, umfassen.
  • Vektoren sind ein Mittel eines Genabgabe-Vehikels und können in Zellen oder Gewebe durch eine jegliche von verschiedenen Methoden, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, einschleust werden. Solche Methoden können allgemein beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992), in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989), Chang et al., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, MI (1995), Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor, MI (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston MA (1988) und Gilboa et al. (1986) gefunden werden und umfassen beispielsweise eine stabile oder transiente Transfektion, Lipofection, Elektroporation und Infektion mir rekombinanten viralen Vektoren. Zusätzlich siehe das U.S.-Patent 4,866,042 für Vektoren, welche das Zentralnervensystem mit einbeziehen, und auch die U.S.-Patente 5,464,764 und 5,487,992 für Positiv-Negativ-Selektionsme thoden wie auch siehe die U.S.-Patente 5,698,443; 5,686,278; 5,538,885; 5,691,176; 5,585,254; 5,614,396; 5,670,488; 5,599,712; 5,645,829; 5,641,680 und 5,688,773.
  • Die Einführung von Nukleinsäuren durch Infektion bietet mehrere Vorteile gegenüber den anderen aufgelisteten Methoden. Aufgrund ihrer infektiösen Natur kann eine höhere Effizienz erzielt werden. Darüber hinaus sind Viren hoch spezialisiert und infizieren und vermehren sich typischerweise in spezielle(n) Zelltypen. Dementsprechend kann ihre natürliche Spezifität verwendet werden, um die Vektoren in vivo oder innerhalb einer Gewebe- oder gemischten Kultur von Zellen zu speziellen Zelltypen zu dirigieren. Virale Vektoren können auch mit spezifischen Rezeptoren oder Liganden modifiziert werden, um die Zielspezifität durch Rezeptor-vermittelte Ereignisse zu verändern.
  • Ein spezielles Beispiel eines viralen DNA-Vektors zur Einführung und Expression von rekombinanten Sequenzen ist der von Adenovirus abgeleitete Vektor Adenop53TK. Dieser Vektor exprimiert ein Herpes-Virus-Thymidinkinase(TK)-Gen für eine entweder positive oder negative Selektion und eine Expressionskassette für gewünschte rekombinante Sequenzen. Dieser Vektor kann verwendet werden, um Zellen zu infizieren, die einen Adenovirus-Rezeptor aufweisen, was die meisten Krebsarten von epithelialem Ursprung wie auch andere einschließt. Dieser Vektor wie auch andere, die ähnliche gewünschte Funktionen aufweisen, können verwendet werden, um eine gemischte Population von Zellen zu behandeln, und diese kann beispielsweise eine in vitro- oder ex vivo-Kultur von Zellen, ein Gewebe oder einen menschlichen Patienten umfassen (siehe beispielsweise U.S.-Patente 5,691,176; 5,585,254; 5,670,488; 5,681,731).
  • Zu dem Vektor können zusätzliche Merkmale hinzugefügt werden, um dessen Sicherheit sicherzustellen und/oder dessen therapeutische Wirksamkeit zu erhöhen. Solche Merkmale umfassen beispielsweise Marker, die verwendet werden können, um eine negative Selektion gegenüber Zellen, welche mit dem rekombinanten Virus infiziert sind, auszuführen. Ein Beispiel für einen solchen negativen Selektionsmarker ist das oben beschriebene TK-Gen, welches Empfindlichkeit gegenüber dem Antibiotikum Gancyclovir verleiht. Negative Selektion ist dementsprechend ein Mittel, durch welches die Infektion kontrolliert werden kann, da es durch die Zugabe eines Antibiotikums einen induzierbaren Selbstmord ermöglicht.
  • Zusätzlich sind rekombinante virale Vektoren für eine in vivo-Expression einer gewünschten Nukleinsäure nützlich, da sie Vorteile, wie eine laterale Infektion und Zielspezifität, bieten. Eine laterale Infektion ist ein ureigenes Merkmal während des Lebenszyklus von beispielsweise Retroviren und ist der Prozess, durch welchen eine einzelne infizierte Zelle viele Nachkommen-Virionen produziert, die knospen und benachbarte Zellen infizieren. Das Ergebnis ist, dass schnell ein großer Bereich infiziert wird, dessen größter Teil anfänglich nicht durch die ursprünglichen Viruspartikel infiziert worden war. Dies steht im Gegensatz zu dem vertikalen Infektionstyp, bei welchem das infektiöse Mittel sich nur durch Tochter-Nachkommenschaft verbreitet. Es können auch virale Vektoren hergestellt werden, die zu einer lateralen Verbreitung nicht in der Lage sind. Dieses Merkmal kann nützlich sein, wenn der gewünschte Zweck darin besteht, ein spezielles Gen nur in eine lokalisierte Anzahl von Zielzellen einzuführen.
  • Wie oben beschrieben, sind Viren hoch spezialisierte infektiöse Agentien, die sich in vielen Fällen dahin entwickelt haben, dass sie Abwehrmechanismen des Wirts entgehen. Typischerweise infizieren und vermehren sich Viren in spezielle(n) Zelltypen. Die Zielspezifität von viralen Vektoren nutzt dessen natürliche Spezifität aus, um spezifisch vorher festgelegte Zelltypen anzusteuern und dadurch ein rekombinantes Gen in die infizierte Zelle einzuführen. Der in den Verfahren der Erfindung zu verwenden de Vektor wird von dem gewünschten Zelltyp, welcher zielgerichtet angesteuert werden soll, abhängen und wird den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sein. Wenn beispielsweise Brustkrebs behandelt werden soll, dann würde ein Vektor, welcher für solche Epithelzellen spezifisch ist, verwendet werden. In ähnlicher Weise würde, wenn Erkrankungen oder pathologische Zustände des hämopoetischen Systems behandelt werden sollen, dann ein viraler Vektor, der für Blutzellen und deren Vorstufen, vorzugsweise für den speziellen Typ von hämopoetischer Zelle spezifisch ist, verwendet werden.
  • Retrovirale Vektoren können so konstruiert werden, dass sie entweder als infektiöse Partikel funktionieren oder nur eine einzelne anfängliche Infektionsrunde durchlaufen. In dem ersten Falle ist das Genom des Virus so modifiziert, dass es alle notwendigen Gene, regulatorischen Sequenzen und Verpackungssignale, um neue virale Proteine und RNA zu synthetisieren, weiterhin enthält. Sind diese Moleküle einmal synthetisiert, verpackt die Wirtszelle die RNA in neue virale Partikel, die in der Lage sind, weitere Infektionsrunden zu durchlaufen. Das Genom des Vektors ist gentechnologisch auch so modifiziert, dass es das gewünschte rekombinante Gen kodiert und exprimiert. Im Falle von nicht-infektiösen viralen Vektoren ist das Vektorgenom üblicherweise so mutiert, dass das virale Verpackungssignal, das benötigt wird, um die RNA in virale Partikel zu verkapseln, zerstört ist. Ohne ein solches Signal werden jegliche Partikel, die gebildet werden, keine nachfolgende Infektionsrunden durchlaufen. Der spezielle Vektortyp wird von der beabsichtigten Anwendung abhängen. Die gegenwärtig eingesetzten Vektoren sind ebenfalls bekannt und in diesem Fachgebiet leicht erhältlich oder können durch einen Fachmann auf diesem Gebiet unter Verwendung von wohlbekannten Methodiken konstruiert werden.
  • Der rekombinante Vektor kann auf mehrere Weisen verabreicht werden. Wenn beispielsweise virale Vektoren verwendet werden, kann die Prozedur aus deren Zielspezifität Nutzen ziehen, und sie müssen folglich nicht lokal an der Erkrankungsstelle verabreicht werden. Jedoch kann eine lokale Verabreichung eine schnellere und wirkungsvollere Behandlung ermöglichen; die Verabreichung kann auch durch beispielsweise intravenöse oder subkutane Injektion in den Patienten erfolgen. Die Injektion der viralen Vektoren in eine Rückenmarksflüssigkeit kann auch als Verabreichungsmodus verwendet werden, speziell im Falle von neurodegenerativen Erkrankungen. Nach der Injektion werden die viralen Vektoren zirkulieren, bis sie Wirtszellen mit der geeigneten Zielspezifität für eine Infektion erkennen.
  • Eine alternative Verabreichungsweise kann durch direkte Inokulation lokal an dem Ort der Erkrankung oder des pathologischen Zustands oder durch Inokulation in das Gefäßsystem, welches den Ort mit Nährstoffen versorgt, oder in die Rückenmarksflüssigkeit erfolgen. Eine lokale Verabreichung ist vorteilhaft, da es keinen Verdünnungseffekt gibt und dementsprechend eine geringere Dosis erforderlich ist, um eine Expression in einem Großteil der Zielzellen zu erzielen. Eine lokale Inokulation kann zusätzlich das Erfordernis einer zielgerichteten Wirkung, welches bei anderen Verabreichungsformen benötigt wird, abmildern, da ein Vektor verwendet werden kann, der alle Zellen in dem Inokulationsbereich infiziert. Wenn eine Expression nur in einer speziellen Untergruppe von Zellen innerhalb des Inokulationsbereichs gewünscht wird, dann können Promotor- und regulatorische Elemente, die für die gewünschte Untergruppe spezifisch sind, verwendet werden, um dieses Ziel zu erreichen. Solche nicht-zielgerichtet wirkenden Vektoren können beispielsweise virale Vektoren, ein Virusgenom, Plasmide, Phagemide und dergleichen sein. Es können auch Transfektionsvehikel, wie Liposome, verwendet werden, um die oben beschriebenen nicht-viralen Vektoren in Empfängerzellen innerhalb des Inokulationsbereichs einzuschleusen. Solche Transfektionsvehikel sind den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt.
  • Mit Analog, wie hier verwendet, ist eine Variante (alternativ können die Begriffe Abänderung, Aminosäuresequenz-Änderung, Aminosäuresequenz-Variante verwendet werden) mit einigen Unterschieden in deren Aminosäuresequenzen verglichen mit der nativen Aminosäuresequenz von Ribonukleotidreduktase R1 gemeint. Gewöhnlich wird das Analog innerhalb eines jeglichen Abschnitts, der funktional relevant ist, zu wenigstens 70% homolog sein. In mehr bevorzugten Ausführungsformen wird die Homologie wenigstens 80% betragen und kann 95% Homologie zu der Aminosäuresequenz erreichen. Die Aminosäure- oder Nukleotidsequenz eines Analogs kann sich von jener des Ribonukleotidreduktase R1-Proteins unterscheiden, wenn wenigstens ein Rest deletiert, inseriert oder substituiert ist, das Protein aber funktional, d. h. biologisch aktiv bleibt. Unterschiede in der Glycosylierung können Analoga bereitstellen.
  • Derivat, wie hier verwendet, kann ein Peptidfragment des Ribonukleotidreduktase R1-Proteins, das die gleiche oder eine ähnliche biologische Aktivität, wie hier in den Beispielen gezeigt, bereitstellt, bedeuten. Es versteht sich, dass das Peptidfragment möglicherweise nicht so wirksam ist wie das vollständige Proteinmolekül, dass es aber nach wie vor biologische Aktivität, wie hier in den Beispielen gemessen, bereitstellen kann. Das Peptidfragment kann jedoch bessere pharmakokinetische Parameter als das vollständige Protein für verschiedene Abgabesysteme bereitstellen und dementsprechend eine Alternative bieten. Die spezielle Aminosäure-kodierende Region für R1 kann modifiziert werden, um ein biologisch aktives R1-Peptidderivat für eine Verwendung in der Gentherapie, wie hier oben beschrieben, herzustellen. Derivate können sich des weiteren auf pharmazeutisch geeignete Modifikationen des Proteins oder Peptids, wie in diesem Fachgebiet bekannt, um Fluidität und Löslichkeit zu verbessern, ohne die biologische Aktivität signifikant zu verändern, beziehen.
  • Biologisch aktiv bezieht sich auf die biologische Eigenschaft des Moleküls, Analogs oder Derivats, und bedeutet in diesem Kontext eine in vivo-Effektorwirkung oder Aktivität, die direkt oder indirekt durch eine in der Natur vorkommende (native) Ribonukleotidreduktase R1 ausgeübt wird, insbesondere wie in den Beispielen gemessen und definiert. Effektorfunktionen umfassen Rezeptorbindung, eine jegliche enzymatische Aktivität oder ein Enzym modulierende Aktivität, eine jegliche Trägerbindungsaktivität, eine jegliche hormonelle Aktivität, eine jegliche Aktivität bei der Förderung oder Inhibition der Anheftung von Zellen an extrazelluläre Matrix oder Zelloberflächenmoleküle oder eine jegliche strukturelle Rolle, sind aber nicht beschränkt darauf, diese zu umfassen. Die biologische Aktivität der Analoga oder Derivate kann bestimmt werden, wie in den Beispielen offenbart, wie den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt ist.
  • Das Ribonukleotidreduktase R1-Protein oder biologisch aktive Analoga oder Derivate davon können hergestellt werden, indem das Protein oder Peptid basierend auf der Sequenz synthetisiert wird, oder rekombinant durch Klonierungstechniken hergestellt werden oder das natürliche Genprodukt und/oder Abschnitte davon können isoliert und verwendet werden, wie in diesem Fachgebiet bekannt ist.
  • Bei der Verabreichung der Ribonukleotidreduktase R1 und von deren biologisch aktiven Analoga oder Derivaten können Dosen einzelne Dosen oder eine Mehrzahl von Dosen über einen Zeitraum von mehreren Tagen bis zu mehreren Monaten, oder bis eine Verringerung der Erkrankung erzielt wird, sein. Die Behandlung hat im allgemeinen eine Länge proportional zu der Länge des Erkrankungsprozesses und der Arzneimittelwirksamkeit und der behandelten Patientenspezies. Optimale Dosierungspläne können unter Verwendung von Messungen der Arzneimittelanhäufung im Körper berechnet werden. Praktizierende Ärzte von gewöhnlicher Qualifikation auf diesem Fachgebiet können optimale Dosierungen, Dosie rungsmethodiken und Wiederholungsraten leicht bestimmen. Optimale Dosierungen können abhängig von der relativen Wirkkraft von Ribonukleotidreduktase R1, biologisch aktiven Analoga und Derivaten variieren und können allgemein basierend auf ED50-Werten in in vitro- und in vivo-Tierstudien und klinischen Studien bestimmt werden.
  • Die Ribonukleotidreduktase R1 und deren biologisch aktive Analoga oder Derivate können der Wirkstoff in Kombination mit pharmazeutisch geeigneten Trägern, Verdünnungsmittel, Adjuvantien und Vehikeln in einer pharmazeutischen Zusammensetzung sein. Die Zusammensetzung kann oral, subkutan, topisch oder parenteral, einschließlich einer intravenösen, intraarteriellen, intramuskulären, intraperitonealen und intranasalen Verabreichung, wie auch intrathekal und durch Infusionstechniken verabreicht werden.
  • Zäpfchen und Implantate der Verbindungen sind ebenfalls nützlich. Der behandelte Patient ist ein warmblütiges Tier und insbesondere Säugetiere, einschließlich des Menschen. Die pharmazeutisch geeigneten Träger, Verdünnungsmittel, Adjuvantien und Vehikel wie auch Implantatträger beziehen sich allgemein auf inerte, nicht-toxische, feste oder flüssige Füllstoffe, Verdünnungsmittel oder Verkapselungsmaterial, welche mit den Wirkstoffen der Erfindung nicht reagieren.
  • Bei einer parenteralen Verabreichung wird die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung im allgemeinen in einer injizierbarer. Einheitsdosisform (Lösung, Suspension, Emulsion) formuliert. werden. Die pharmazeutischen Formulierungen, welche für eine Injektion geeignet sind, umfassen sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver für eine Rekonstitution zu sterilen injizierbaren Lösungen und Dispersionen. Der Träger kann ein Lösemittel oder Dispergiermedium, enthaltend beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (beispielsweise Glycerol, Propylenglycol, flüssiges Polyethylenglycol und dergleichen), geeignete Mischungen davon und pflanzliche Öle, sein.
  • Eine geeignete Fluidität kann beispielsweise durch die Verwendung eines Überzugs, wie Lecithin, durch die Aufrechterhaltung der erforderlichen Teilchengröße im Falle einer Dispersion und durch die Verwendung von grenzflächenaktiven Substanzen aufrechterhalten werden. Nicht-wässrige Vehikel, wie Baumwollsamenöl, Sesamöl, Olivenöl, Sojabohnenöl, Maisöl, Sonnenblumenöl oder Erdnussöl und Ester, wie Isopropylmyristat, können ebenfalls als Lösemittelsysteme für Verbindungszusammensetzungen verwendet werden. Zusätzlich können verschiedene Zusatzstoffe, die die Stabilität, Sterilität und Isotonie der Zusammensetzungen verbessern, einschließlich antimikrobiell wirksamen Konservierungsstoffen, Antioxidationsmitteln, Chelatbildnern und Puffern, zugesetzt werden. Die Verhinderung der Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und antifungale Mittel, beispielsweise Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure und dergleichen, sichergestellt werden. In vielen Fällen wird es wünschenswert sein, isotonische Mittel, beispielsweise Zucker, Natriumchlorid und dergleichen, hinzuzusetzen. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren pharmazeutischen Form kann durch die Verwendung von Mitteln, welche die Absorption verzögern, beispielsweise von Aluminiummonostearat und Gelatine, erzielt werden. Gemäß der Erfindung müsste jedoch ein jegliches Vehikel, Verdünnungsmittel oder Additiv mit den Verbindungen verträglich sein.
  • Sterile injizierbare Lösungen können hergestellt werden, indem die bei der praktischen Ausführung der Erfindung eingesetzten Verbindungen in die benötigte Menge des geeigneten Lösemittels mit verschiedenen der anderen Bestandteile, wie gewünscht, eingebracht werden.
  • Eine topische Verabreichung kann durch eine jegliche Methode, die in diesem Fachgebiet bekannt ist, erfolgen und kann ein Ein bringen der pharmazeutischen Zusammensetzung in Cremes, Salben oder transdermale Pflaster umfassen.
  • Eine pharmakologische Formulierung kann an den Patienten in einer injizierbaren Formulierung, welche jegliche verträgliche Träger, wie verschiedene Vehikel, Adjuvantien, Additive und Verdünnungsmittel, enthält, verabreicht werden; oder die in der Erfindung eingesetzten Verbindungen können an den Patienten parenteral in Form von subkutanen Implantaten mit langsamer Freisetzung oder zielgerichtet wirkenden Abgabesystemen, wie monoklonale Antikörper, vektorgestützte Abgabe, iontophoretisch, Polymermatrices, Liposome und Mikrosphären, verabreicht werden. Beispiele von Abgabesystemen, die im Rahmen der Erfindung nützlich sind, umfassen: die U.S.-Patente mit den Nummern 5,225,182; 5,169,383; 5,167,616; 4,959,217; 4,925,678; 4,487,603; 4,486,194; 4,447,233; 4,447,224; 4,439,196; und 4,475,196. Viele andere derartige Implantate, Abgabesysteme und Module sind den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt.
  • Eine pharmakologische Formulierung, die im Rahmen der Erfindung eingesetzt wird, kann ein den Patienten oral verabreicht werden. Es können herkömmliche Methoden, wie eine Verabreichung der Verbindungen in Tabletten, Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Kapseln, Pulvern, Sirupen und dergleichen, eingesetzt werden.
  • Bekannte Techniken, die eine orale, subkutane oder parenterale Abgabe, einschließlich einer intravenösen, intraarteriellen, intramuskulären, intraperitonealen und intranasalen Verabreichung wie auch intrathekalen Verabreichung und Infusionstechniken, bewirken und die biologische Aktivität bewahren, sind bevorzugt.
  • Für eine Abgabe innerhalb des ZNS kann eine intrathecale Abgabe beispielsweise mit einem Ommaya-Reservoir verwendet werden. Das U.S.-Patent 5,455,044 stellt die Verwendung eines Dispersionssystems für eine Abgabe an das ZNS bereit, oder siehe U.S.- Patent 5,558,852 für eine Diskussion einer Abgabe an das ZNS. Zusätzlich können pharmakologische Formulierungen, die die Blut-Hirn-Schranke passieren, verabreicht werden [Betz et al., 1994; Brem et al., 1993]. Solche Formulierungen können jetzt verfügbare Methoden zur Herstellung von chimären Peptiden, in denen die Erfindung mit einem Hirntransportvektor, welcher einen Transport durch die Schranke hindurch ermöglicht, gekoppelt ist, ausnutzen [Pardridge et al., 1992; Pardridge, 1992; Bickel et al., 1993]. Ferner kann in geeigneten Fällen ein Aufbrechen der Blut-Hirn-Schranke eingesetzt werden [Neuwelt et al., 1980].
  • Die in den hier nachfolgend aufgeführten Beispielen erhaltenen Ergebnisse zeigen erstmals, dass eine verstärkte Expression der R1-Komponente von Säugetier-Ribonukleotidreduktase Zelltransformationscharakteristiken, wie Verankerungs-unabhängige Vermehrung, supprimieren kann. Mit diesen Ergebnissen war die Beobachtung konsistent, dass eine Expression der R1-Sequenz in der Antisinn-Orientierung zu einer Abnahme des R1-Proteins und einer Zunahme der Zelltransformation führte, wie durch eine ausgeprägte Erhöhung der Fähigkeit zu Verankerungs-unabhängiger Vermehrung gezeigt wurde. Ähnlich zu den in dieser Untersuchung verwendeten Maus-Zelllinien führte eine Überexpression von R1 in der humanen Tumorzelllinie Colo 320HSR auch zu einer verringerten Verankerungs-unabhängigen Vermehrung, was zeigt, dass R1 eine supprimierende Funktion auch in menschlichen Zellen ausüben kann. Die Niveaus der R1-Genexpression sind eindeutig wichtig bei der Bestimmung des malignen Potenzials und eine verringerte Expression kann mit Malignität in Zusammenhang stehende Charakteristiken verstärken.
  • Die Expression von R1 konnte auch Tumorigenizität und malignes Potenzial in vivo unterdrücken, wie in den Beispielen gezeigt wird. Drei der vier getesteten Zelllinien zeigten erhöhte Tumorlatenz und verringerte Tumorwachstumseigenschaften bei Tieren in Gegenwart einer verstärkten R1-Expression.
  • Interessanterweise ist zuvor gezeigt worden, dass eine Überexpression von R2 eine gegenteilige Wirkung auf die Transformations-, tumorigenen und malignen Eigenschaften von Zellen hat. Eine Überexpression von R2 kooperiert mit aktivierten Onkogenen bei der Förderung der Tumorprogression, und dieser Prozess scheint wenigstens teilweise durch Veränderungen in dem MAPK-Weg vermittelt zu werden [Fan et al., 1996a]. Frühere Arbeiten [Fan et al., 1996a] und die vorliegende Untersuchung zeigen, dass die beiden unterschiedlichen Proteine R1 und R2, die für die Ribonukleotidreduktion, eine geschwindigkeitslimitierende Schlüssel-Aktivität bei der DNA-Synthese [Reichard, 1993; Wright, 1989a], benötigt werden, gegenteilige und sehr dramatische, für die Malignität relevante Effekte haben, wenn sie in Tumorzellen überexprimiert werden. Es kann vermutet werden, dass es ein empfindliches Gleichgewicht zwischen den R1- und R2-Konzentrationen in Zellen gibt und dass eine Aufhebung dieses Gleichgewichts das maligne Potenzial von Tumorzellen signifikant modifiziert. Wie in den hier nachfolgend aufgeführten Beispielen gezeigt, kann die Veränderung der regulatorischen Expression der R1-Expression als ein neuer Malignitätssuppressor wirken.
  • Die obige Diskussion liefert eine faktische Grundlage für die Verwendung von R1 als Malignitätssuppressor. Die mit der Erfindung verwendeten Verfahren und die Nützlichkeit von dieser können durch die folgenden nicht-einschränkenden Beispiele und die begleitenden Figuren gezeigt werden.
  • BEISPIELE
  • ALLGEMEINE VERFAHREN
  • ALLGEMEINE VERFAHREN DER MOLEKULARBIOLOGIE
  • Molekularbiologische Standardtechniken, die in diesem Fachgebiet bekannt sind und nicht speziell beschrieben werden, wurden im allgemeinen ausgeführt, wie in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992); in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); und in Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, New York (1988) beschrieben. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde allgemein ausgeführt wie in PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990).
  • VEKTOREN
  • Vektoren können für die Erfindung durch die Fachleute auf diesem Gebiet konstruiert werden und sollten alle Expressionselemente enthalten, welche erforderlich sind, um die gewünschte Transkription der Sequenzen zu erzielen. Die Expressionselemente können so ausgewählt werden, dass sie eine Expression nur in der Zelle, auf die abgezielt wird, ermöglichen. Andere nützliche Eigenschaften können in den Vektoren ebenfalls enthalten sein, wie Mechanismen für die Gewinnung der Nukleinsäuren in einer unterschiedlichen Form. Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird wissen, welche Expressionselemente mit einem speziellen Zelltyp verträglich sind. Die Vektoren können in Zellen oder Gewebe durch eine beliebige von verschiedenen bekannten Methoden innerhalb dieses Fachgebiets, wie hier beschrieben, eingeführt werden.
  • Expressionsvektoren
  • Die mit humanem Myc-Epitop markierte („tagged") Maus-R1-cDNA [Fan et al., 1996b] wurde erhalten durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung des 5'-Primers ACCGCTCGAGCCACCATGGAACAAAAGCTTATTTCTGAAGAAGACTTGATGCATGTG ATCAAGCGAGA (SEQ ID No: 2, wobei die Kozak-Sequenz, ein mögliches Ribosomenbindungssignal [Kozak, 1987] kursiv geschrieben ist; die Sequenz, welche das humane Myc-Epitop kodiert, unterstrichen ist; und das natürliche ATG-Startcodon fettgedruckt ist) und des 3'-Primers CCGCTCGAATCAGGATCCACACATCAG (SEQ ID No: 3; wobei das Stopcodon fettgedruckt ist) und des Matrizen-Plasmids pcD-M1 [Thelander und Berg, 1986]. Das PCR-Produkt wurde mit Proteinase K behandelt, mit Xho1 verdaut, mittels eines Gels gereinigt und an dephosphoryliertes Xho1-verdautes pLXSHD-Plasmid [Miller et al., 1993; Fan et al., 1996c] ligiert, wodurch der retrovirale Vektor pSHD/mR1 erzeugt wurde. Die Verpackung des retroviralen Vektors und die Herstellung von Virusstammlösungen erfolgten durch Verwendung von ψ2- und PA317-Zelllinien, wie wir zuvor beschrieben haben [Fan et al., 1996a; 1996b], mit der Ausnahme, dass von PA317 abgeleitete stable Verpackungslinien durch Selektion mit Histidinol über 15 Tage hinweg erhalten wurden. Um einen Expressionsvektor für R1 in der Antisinn-Orientierung zu erhalten, wurde Maus-R1-cDNA durch PCR unter Verwendung der Primer GCCTCGAGCTGACAGTCGTCTCTGTCCCT (SEQ ID No: 4) und TAAAGCTTATCACTTAGAAATGTTTATTTCAAAAT (SEQ ID No: 5) hergestellt, mit Xho1 und HindIII verdaut und in das Säugetier-Expressionsplasmid pcDNA3 (Invitrogen Corp.) inseriert, wodurch das Plasmid pASR1 erhalten wurde. Die Konstruktion von sowohl pSHD/mR1 als auch pASR1 wurde durch Sequenzierungsanalyse wie auch durch Restriktion durch Endonuklease-Verdaue bestätigt.
  • Zelllinien und Zellkultur
  • In dieser Untersuchung verwendete Zelllinien und damit in Zusammenhang stehende Angaben sind in Tabelle 1 aufgeführt. Zellen wurden routinemäßig in α-minimalem essentiellem Medium (MEM), ergänzt mit 8% Kälberserum (Fetalclone III, Hyclone) kultiviert. Um Zellen zu erzeugen, die rekombinantes R1 exprimierten, wurden Zellen mit SHD/mR1-Virus-Stammlösung, welche ausgehend von der stabilen Verpackungslinie PA/mR1 hergestellt worden war, in Gegenwart von Polybren infiziert [Fan et al., 1996a; Miller et al., 1993]. Stabil infizierte Zellen (≥ 500 Klone) wurden durch Selektion mit 4–15 mM Histidinol abhängig von den Zelllinien erhalten und wurden gepoolt und vermehrt. Parallel dazu wurden Kontroll-Zelllinien durch Verwendung von LXSHD-Virus, welchem die R1-Sequenz fehlte, erzeugt. Eine R1-Antisinn-Sequenz exprimierende Zellen wurden durch Transfektion von NIH 3T3-Zellen unter Verwendung eines LipofectAmine-Kits (Life Technologies), gefolgt von einer Selektion mit G418 [Egan et al., 1987a; Taylor et al., 1992], erzeugt.
  • Zellvermehrungsraten wurden bestimmt, indem die Absorption bei 260 nm in Zellextrakten, die in 1,0 N NaOH hergestellt wurden, gemessen wurde [Kempe et al., 1976] und/oder durch Zählen der Zellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach dem Animpfen [Egan et al., 1987a]. Die Vermehrung in Weichagar wurde in 10 cm-Gewebekulturplatten, welche 15 ml Basisagar (0,5% Bacto-Agar in MEM, enthaltend 10% Kälberserum) und 10 ml Vermehrungsagar (0,33% Agar in MEM, enthaltend 10% Kälberserum) enthielten, abgeschätzt. Zellen wurden ausgehend von subkonfluenten Kulturen erhalten und Kolonien 14–21 Tage später gezählt [Fan et al., 1996a; 1996b; Taylor et al., 1992].
  • Assays auf Tumorigeniziät und Metastasen
  • In diesen Assays wurden syngene C3H/HeN-Mäuse (Charles River Breeding Laboratories, Quebec) verwendet, wie zuvor beschrieben [Fan et al., 1996a; Egan et al., 1987b]. Zellen wurden ausgehend von subkonfluenten, sich logarithmisch vermehrenden Kulturen hergestellt, durch sanfte Behandlung mit Trypsin/EDTA-Lösung gesammelt und auf eine geeignete Konzentration eingestellt. Die Tumorlatenz wurde bestimmt, indem Zellen subkutan injiziert wurden und die Zeit, welche benötigt wurde, um einen durch Tasten detektierbaren Tumor (2 × 2 cm) zu bilden, aufgezeichnet wurde. Tumore wurden 21 Tage später aus den Mäusen entfernt und das Tumorgewicht wurde aufgezeichnet. Im Falle von keiner Tumorbildung wurden die Mäuse 2 Monate nach der Injektion gehalten und dann getötet. Für die Metastasen-Assays wurden Zellen in die Schwanzvenen von 6–8 Wochen alten syngenen C3H/HeN-Mäusen injiziert und eine Abschätzung der Anzahl von Lungentumoren erfolgte 21 Tage später, wie beschrieben [Fan et al., 1996a; Egan et al., 1987b]. Um zu bestätigen, dass gleiche Anzahlen von Test- und Kontrollzellen injiziert wurden, wurden zweifach erstellte Kulturplatten, welche Vermehrungsmedium enthielten, mit 100 Zellen pro Platte inokuliert. Nach 10 Tagen in Kultur wurden die Platten mit Methylenblau angefärbt und die Kolonien wurden gezählt.
  • Detektion der Expression von rekombinantem R1-Protein
  • Es wurde ein indirekter Immunfluoreszenzassay verwendet, um die transiente Expression von rekombinantem R1-Protein in BHK-Zellen zu detektieren [Fan et al., 1996a, b]. Zu siebzig Prozent konfluente Zellen, welche auf Deckgläschen kultiviert wurden, wurden mit pSHD/mR1-Plasmid unter Verwendung eines LipofectAmine-Reagens transfiziert. 20 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit 3% Formaldehyd, hergestellt in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,2 (PBS), fixiert, mit 0,1% Triton X-100 (in PBS) permeabilisiert, mit monoklonalem anti-Myc-Epitop-9E10-Antikörper (American Type Culture Collection) inkubiert, gewaschen, mit Ziege-anti-Maus-IgG (vollständiges Molekül)-FITC-Konjugat (Sigma) reagieren gelassen, erneut gewaschen und schließlich unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht [Leonhardt et al.]. Eine Immunpräzipitation von rekombinantem R1 durch den 9E10-Antikörper ausgehend von [35S]-Methionin/Cysteinmarkierten Zellen wurde unter Verwendung von zuvor beschriebenen Prozeduren [McClarty et al., 1990; Goding, 1978] ausgeführt. In einigen Experimenten wurden R1-Proteinkonzentrationen durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung des monoklonalen anti-R1-Antikörpers AD203 bestimmt, wie zuvor beschrieben [McClarty et al., 1990; Fan et al., 1996a].
  • Ribonukleotidreduktase-Assay
  • Die Ribonukleotidreduktase-Aktivität in ausgehend von SC2/mR1- und SC2/SHD-Kontroll-Zelllinien hergestellten Rohextrakten wurde bestimmt, wie zuvor beschrieben [Lewis, 1978; Hurta und Wright, 1992; Hurta et al., 1991]. In einigen Experimenten wurden Enzymassays ausgeführt, indem gereinigtes rekombinantes R2-Protein mit mit 9E10-Antikörper präzipitiertem R1-Protein zusammengegeben wurde. Pansorbin-Zellen (Formaldehyd-fixierte Staphylokokken, Calbiochem, La Jolly, CA), welche Oberflächen-Protein A und Kaninchen-anti-Maus-IgG trugen, wurden hergestellt, wie beschrieben [Goding, 1978]. Diese Konjugat wurde weiter mit einer Überschussmenge von 9E10-Antikörper inkubiert und fünfmal gewaschen. Zwanzig μl die ses Komplexes (10%-ige Suspension) wurde zu 1,0 ml aus 5 × 107 Zellen hergestelltem Extrakt hinzugesetzt und 2 h auf eine Schaukelvorrichtung („rocker") bei 4°C gestellt, dreimal mit PBS, enthaltend 10 mg/ml Rinderserumalbumin, gewaschen und auf Ribonukleotidreduktase-Aktivität nach der Zugabe von 1,0 μg gereinigtem rekombinanten R2-Protein getestet [Hurta und Wright, 1992; Fan et al., 1996a; Mann et al., 1991].
  • BEISPIEL 1
  • Expression von rekombinantem R1
  • Um das R1-Protein in Zellen überzuexprimieren, wurde ein Säugetier-Expressionsvektor pSHD/mR1 konstruiert. In diesem Vektor steht die Expression der mit humanem Myc-Epitop markierten („tagged") R1-cDNA unter der Kontrolle eines retroviralen Promotors, einer langen terminalen Wiederholungssequenz [Miller et al., 1993]. Die Expression von rekombinantem R1 wurde zuerst in BHK-Zellen nach einer transienten Transfektion analysiert. Ein indirekter Immunfluoreszenzassay unter Verwendung des monoklonalen anti-Myc-9E10-Antikörpers enthüllte eine zytoplasmatische Expression des rekombinanten R1-Proteins in mit pSHD/mR1 transfizierten Zellen (1A). Als Kontrolle zeigten nicht-transfizierte oder mit dem leeren Vektor pLXSHD transfizierte Zellen keinerlei spezifische Fluoreszenz. Nach der Demonstration, dass das rekombinante R1-Protein in Säugetierzellen exprimiert werden kann, wandelten wir dann die exprimierbare DNA in ein infektöses, aber Replikations-defektes Vektor-Virus, das hohe Abgabeeffizienz aufweist, durch Verwendung von retroviralen Verpackungszellen um. Die Expression von rekombinantem R1 in der stabilen Verpackungslinie PA/mR1 wurde erneut analysiert. Eine Immunpräzipitation unter Verwendung des 9E10-Antikörpers detektierte ein einzelnes Protein von ungefähr 88 kDa ausgehend von Extrakt, welcher aus PA/mR1-Zellen (Tabelle 1), die metabolisch mit [35S]-Methionin/Cystein markiert worden waren (1B), hergestellt worden war. Wie erwartet, wurde kein Protein aus der stabilen Kontrollvirus-Verpackungszelllinie PA/SHD präzipitiert (1B). Diese Ergebnisse zeigten, dass eine stabile Expression des rekombinanten R1-Proteins erzielt werden konnte.
  • Es wurde dann bestimmt, ob in Zellen exprimiertes rekombinantes R1 biologisch aktiv ist. Für diese Untersuchung wurde eine gegen Hydroxyharnstoff resistente Maus L-Zelllinie, SC2, mit viralen SHD/mR1- oder LXSHD-Vektoren infiziert und verwendet, um stabile infizierte Zellen zu selektieren (Tabelle 1). Da SC2-Zellen mehr R2 bezogen auf die R1-Untereinheit exprimieren, würde die Expression von biologisch aktivem R1-Protein in dieser Zelllinie zu einer erhöhten Ribonukleotidreduktase-Aktivität führen [McClarty et al., 1990]. In vier Experimenten betrug die CDP-Reduktase-Aktivität in dem aus SC2/mR1-Zellen hergestellten Rohextrakt 13,2 ± 0,7 nmol/mg Protein/h, was ungefähr 30% mehr ist als jene in Extrakt, welcher ausgehend von SC2/SHD-Kontrollzellen hergestellt worden ist (10,1 ± 0,2 nmol/mg/h). Darüber hinaus wurde das rekombinante R1 aus C1/mR1-Zellen unter Verwendung des 9E10-Antikörpers immunpräzipitiert und wurde verwendet, um Ribonukleotidreduktase-Aktivität zu bestimmen, indem das gewaschene Immunpräzipitat mit gereinigtem rekombinantem R2-Protein zusammengegeben wurde [Hurta und Wright, 1992; Fan et al., 1996a; Mann et al., 1991]. In drei unabhängigen Experimenten wurde eine Enzymaktivität von 15,4 ± 2,0 pmol/mg/h detektiert, wenn C1/mR1-Zellen (Tabelle 1) als Quelle für rekombinantes R1 verwendet wurden, und, wie erwartet, wurde keine Aktivität gefunden, wenn C1/SHD-Kontrollzellen (Tabelle 1) verwendet wurden.
  • BEISPIEL 2
  • Verringerte Verankerungsunabhängigkeit durch Zellen, die R1 überexprimieren
  • Eine Zelltransformation wird häufig von einer Verankerungs-unabhängigen Vermehrung in vitro begleitet, welche oftmals mit tumorigenem Potenzial in vivo korreliert, und kann durch die Fähigkeit zur Proliferation und Bildung von Kolonien in Agar enthaltendem Medium ausgewertet werden [Fan et al., 1996a; Egan et al., 1987a]. Um die Rolle zu untersuchen, die R1 möglicherweise bei der Zelltransformation spielt, wurden CIRAS-1-Zellen mit dem viralen PA/mR1-Vektor oder der leeren Virus-Kontrolle LXSHD infiziert (Tabelle 1). CIRAS-1-Zellen wurden von nicht-malignen Mäuse-10T½-Wildtypzellen durch Transfektion mit onkogenem T24-H-ras abgeleitet [Egan et al., 1987a]. Frühere Studien haben gezeigt, dass dies eine moderat maligne Zelllinie ist und dass sie als ein gutes Modell zum Analysieren von Transformation und mit Malignität in Verbindung stehenden Merkmalen dienen kann [Hurta und Wright, 1995; Fan et al., 1996a; Egan et al, 1987a; Wright et al., 1993]. Stabile infizierte Klone, welche nach Histidinol-Selektion erhalten wurden, wurden auf ihre Fähigkeiten zur Vermehrung in Weichagar hin ausgewertet. Es wurde festgestellt, dass die Koloniebildungseffizienz in Weichagar durch C1/mR1-Zellen, die erhöhte Konzentrationen von R1 enthielten, signifikant verringert war verglichen mit C1/SHD-Kontrollzellen (2). Die Wirkungen einer R1-Expression wurden auch hinsichtlich einer Vermehrung auf Weichagar mit Zellen, welche eine deregulierte R2-Expression aufwiesen, getestet. C1/mR2 ist ein CIRAS-1-Derivat, welches rekombinantes R2 exprimiert, und hat ein erhöhtes malignes Potenzial erworben [Fan et al., 1996a]. Wieder wurde beobachtet, dass die Koloniebildungseffizienz von C1/mR2/mR1-Zellen mit erhöhtem R1 signifikant verringert war, wenn sie mit C1/mR2-Kontrollzellen verglichen wurde (2).
  • Um die Möglichkeit (obgleich unwahrscheinlich) auszuschließen, dass die verringerten Effizienzen hinsichtlich der Vermehrung auf Weichagar, welche bei R1-Zellen beobachtet wurden, aus einer Selektion von Zellen mit intrinsisch geringeren Vermehrungseffizienzen ausgehend von einer relativ heterogenen Zellpopulation resultiert haben könnten, wurde ein als C1/mR2a bezeichneter Subklon aus C1/mR2-Zellen isoliert. Aus dieser Subklon-Population wurden zwei Zelllinien (C1/mR2a/mR1 und die C1mR2a/SHD-Kontrolle) abgeleitet (Tabelle 1). Konsistent mit den Beobach tungen mit der Ausgangslinie zeigten C1/mR2a/mR1-Zellen ähnliche Verringerungen bei den Vermehrungseffizienzen in Weichagar verglichen mit C1/mR2a/SHD-Kontrollzellen (2). Dies zeigt, dass die verringerte Verankerungsunabhängigkeit durch die Expression von rekombinantem R1 bewirkt wird.
  • BEISPIEL 3
  • Die oben getesteten Zelllinien sind von Mäuse-Ursprung. Um zu bestimmen, ob die Expression von rekombinantem R1 in humanen Tumorzellen ebenfalls Transformationseigenschaften verändert, wie durch Veränderungen bei der Fähigkeit zur Vermehrung in Weichagar demonstriert wird, oder nicht, wurde die humane Kolonadenokarzinom-Zelllinie Colo 320HSR [Quinn et al., 1979] verwendet. Diese Zellen wurden mit dem viralen Vektor, welcher die R1-Sequenz enthielt, infiziert, wodurch die Colo/mR1-Zelllinie erhalten wurde (Tabelle 1). Interessanterweise war die Vermehrungseffizienz in Weichagar bei Colo/mR1-Zellen bei Vergleich mit Colo/SHD-Zellen, welche den leeren Vektor enthielten, um ungefähr 50% verringert (2).
  • BEISPIEL 4
  • Suppression des tumorigenen und/oder Metastasierungs-Potenzials in vivo bei Zellen, welche erhöhtes R1 enthalten
  • Um die Rolle, die Veränderungen bei der R1-Expression möglicherweise bei der malignen Progression spielen, weiter auszuwerten, wurden tumorigene und Metastasierungs-Eigenschaften von C1/mR1-Zellen in in vivo-Modellen analysiert. C1/mR1-Zellen zeigten bei Vergleich mit C1/SHD-Kontrollzellen eine dramatische Verringerung des malignen Potenzials (Tabelle 2). Wohingegen alle Mäuse, denen subkutan C1/SHD-Zellen injiziert worden waren, ungefähr 11 Tage nach der Injektion Tumore entwickelten, bildete sogar bis zu zwei Monate nach der Injektion keines der Tiere, denen C1/mR1-Zellen injiziert worden waren, detektierbare Tumor. Zusätzlich zeigten experimentelle Metastasen-Assays, dass bei Vergleich mit den C1/SHD-Kontrollzellen C1/mR1-Zellen viel weniger effizient waren, Lungen-Metastasen zu bilden (Tabelle 2). Ähnliche Experimente wurden mit einer anderen, unabhängig selektierten, als ras-3 bezeichneten T24-H-ras-transfizierten Maus-10T1/2-Zelllinie, welche zuvor beschrieben worden war [Taylor et al., 1992], ausgeführt. Obwohl die Tumor-supprimierende Aktivität des rekombinanten R1 in ras-3-Zellen nicht so groß war, wie sie in von CIRAS-1 abgeleiteten Zellen beobachtet worden waren, war die Tumorigenizität bei ras-3/mR1-Zellen verglichen mit ras-3/SHD-Kontrollzellen signifikant verringert, wie anhand einer verlängerten Tumorlatenz und anhand von kleineren Tumorgrößen beurteilt wurde. Ähnlich zu den von CIRAS-1 abgeleiteten Zellen zeigten ras-3/mR1-Zellen ein ausgeprägt verringertes Metastasierungs-Potenzial bei Vergleich mit den ras-3/SHD-Kontrollzellen (Tabelle 2).
  • Ebenfalls in vivo getestet wurde der Einfluss einer Expression von rekombinantem R1 auf das maligne Potenzial bei Zellen, die eine deregulierte R2-Expression aufwiesen. Konsistent mit früheren Beobachtungen zeigten C1/mR2-Zellen ein höheres tumorigenes und Metastasierungs-Potenzial als C1/SHD-Kontrollzellen, was die Malignitäts-fördernde Funktion von R2 bestätigte [Fan et al., 1996a]. Ebenfalls in Übereinstimmung mit den Daten, die in in vitro-Experimenten erhalten worden waren (2), waren C1/mR2/mR1-Zellen viel weniger maligne als C1/mR2-Kontrollzellen (Tabelle 2). Ferner waren sowohl das tumorigene als auch das Metastasierungs-Potenzial von C1/mR2/mR1-Zellen auf signifikant niedrigere Niveaus als jene von C1/SHD-Zellen reduziert (Tabelle 2).
  • Dann wurde die potentielle Fähigkeit der Expression von rekombinantem R1, die malignen Eigenschaften einer hochgradig malignen Zelllinie, die eine Mehrzahl von Onkogen-Veränderungen enthält, zu modifizieren, getestet. Die Maus-RMP-6-10T1/2-Linie, die mit einer Kombination von aktiviertem H-ras, c-myc und einer mutier ten onkogenen Form von p53 transfiziert worden ist, ist gut charakterisiert worden [Taylor et al., 1992; Huang et al., 1995] und wurde in diesen Studien verwendet. Anders als die oben untersuchten, R1 überexprimierenden Zelllinien zeigten RMP/mR1-Zellen (Tabelle 1) keine Veränderungen der Tumorigenizität bei Vergleich mit RMP/SHD-Kontrollzellen (Tabelle 2). In Übereinstimmung mit diesen in vivo-Ergebnissen wurde beobachtet, dass RMP/mR1- und RMP/SHD-Zellen ungefähr die gleichen Koloniebildungseffizienzen in Weichagar-Vermehrungs-Experimenten aufwiesen. Interessanterweise bildeten jedoch RMP/mR1-Zellen in syngenen Mäusen in experimentellen Metastasen-Assays signifikant weniger Lungentumore als RMP/SHD-Kontrollzellen (Tabelle 2). Der Unterschied bei der Anzahl von Lungen-Metastasen, welcher in Tabelle 2 gezeigt ist, könnte tatsächlich unterschätzt worden sein, da Lungentumore in Mäusen, die RMP/SHD-Zellen erhalten hatten, im allgemeinen größer waren als jene, die sich in den Lungen von Mäusen entwickelten, denen RMP/mR1-Zellen injiziert worden waren. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Überexpression von R1 in hochgradig malignen RMP-6-Zellen das Metastasierungs-Potenzial deutlich supprimiert.
  • VERGLEICHSBEISPIEL
  • Erhöhte Verankerungs-Unabhängigkeit bei mit onkogenem ras transfizierten Zellen, welche R1 in der Antisinn-Orientierung exprimieren
  • Eine Expression einer Antisinn-Sequenz ist ein üblicherweise verwendeter Ansatz, um eine herunterregulierte Genexpression zu erzielen [Spearman et al., 1994; Wright und Anazodo, 1996]. Wenn R1 die Zelltransformation inhibieren kann, wie oben gezeigt, sollte eine Expression einer R1-Antisinn-Sequenz die Konzentrationen des R1-Proteins verringern und Transformationscharakteristika weiter verstärken. Um dies zu testen, wurde ein Expressionsvektor konstruiert, in den die R1-Sequenz in einer Antisinn-Orientierung bezogen auf den Vektor-Promotor platziert worden ist. NIH-3T3-Zellen wurden mit dem Antisinn-Vektor und dem pH06Ti-Plasmid, welches das T24-H-ras-Onkogen exprimiert [Egan et al., 1987a], cotransfiziert. Die H-ras-Expression transformiert Säugetierzellen so, dass sie oftmals zu einer Kolonienbildung in Vermehrungsmedium, welches Weichagar enthält, in der Lage sind [Fan et al., 1996a; Egan et al., 1987a]. Stabile Cotransfektanten, welche nach einer Selektion mit G418 erhalten worden sind, wurden auf Verankerungs-unabhängige Vermehrung hin ausgewertet. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen, welche in oben beschriebenen Experimenten erhalten worden waren, zeigten N/ras&ASR1-Zellen, welche Antisinn-R1 enthielten, bei Vergleich mit N3/ras-Kontrollzellen, die das H-ras-Onkogen ohne die R1-Antisinn-Sequenz enthielten, eine dramatisch höhere Koloniebildungseffizienz in Weichagar (3). Eine Western-Blot-Analyse (4) und eine Northern-Blot-Analyse zeigten, wie erwartet, eine geringere Expression von R1 in N/ras&ASR1-Zellen als in N/ras-Zellen. Die Vermehrungsraten von N/ras&ASR1- und N/ras-Zellen auf der Oberfläche von Kunststoff-Kulturplatten waren ungefähr die gleichen mit Verdopplungszeiten von 14 bis 16 h.
  • In dieser gesamten Anmeldung wird auf verschiedene Veröffentlichungen, einschließlich U.S.-Patente, anhand von Autor und Jahr und auf Patente anhand der Nummer Bezug genommen. Für die Veröffentlichungen sind die vollständigen Zitate nachfolgend aufgelistet.
  • Die Erfindung ist auf eine veranschaulichende Weise beschrieben worden und soll so verstanden werden, dass die Terminologie, die verwendet worden ist, so beabsichtigt ist, dass sie beschreibender, anstelle von einschränkender Natur ist.
  • Selbstverständlich sind viele Modifizierungen und Variationen der Erfindung im Lichte der obigen Lehren möglich. Es versteht sich dementsprechend, dass innerhalb des Umfangs der beigefügten Ansprüche die Erfindung auf andere Weise, als speziell beschrieben, praktisch ausgeführt werden kann:
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  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (52)

  1. Exprimierbare Nukleinsäure zur Verwendung bei der Modulation der Vermehrung von malignen Zellen in einem Säugetier, wobei die Nukleinsäure ist: (a) eine Nukleinsäure, die eine Säugetier-Ribonukleotidreduktase R1 kodiert; oder (b) eine Nukleinsäure wie in (a), die modifiziert ist, so dass sie ein biologisch aktives Analog oder Derivat der Ribonukleotidreduktase R1 kodiert.
  2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure ist: (i) eine Nukleinsäure wie in (a), umfassend eine Sequenz wie in SEQ ID NR: 1 aufgeführt; (ii) eine Nukleinsäure wie in (a), umfassend die Ribonukleotidreduktase R1 kodierende Sequenz wie in SEQ ID NR: 1 aufgeführt; oder (iii) eine Nukleinsäure wie in (i) oder (ii), die modifiziert ist, so dass sie ein biologisch aktives Analog oder Derivat der Ribonukleotidreduktase R1 kodiert.
  3. Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, die ein Derivat wie in (b) oder (iii) kodiert und wobei das Derivat ein Peptid ist.
  4. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Modulation der Vermehrung von malignen Zellen durch Inhibition der neoplastischen Zellvermehrung erfolgt.
  5. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Modulation der Vermehrung von malignen Zellen durch Inhibition der Metastasierung von neoplastischen Zellen erfolgt.
  6. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Modulation der Vermehrung von malignen Zellen durch Modulation der Tumorigenizität neoplastischer Zellen erfolgt.
  7. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung in der Gentherapie.
  8. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Verwendung das Inkontaktbringen von neoplastischen Zellen des Säugetiers mit der Nukleinsäure umfasst.
  9. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Säugetier ein Mensch ist.
  10. Nukleinsäure nach Anspruch 9, wobei die Säugetier-Ribonukleotidreduktase R1 eine humane Ribonukleotidreduktase R1 ist.
  11. Vektor umfassend die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
  12. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und ein(en) pharmazeutisch physiologisch geeigneten/s Träger oder Verdünnungsmittel.
  13. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend den Vektor nach Anspruch 11 und ein(en) pharmazeutisch physiologisch geeigneten/s Träger oder Verdünnungsmittel.
  14. Protein oder Peptid zur Verwendung bei der Modulation der Vermehrung von malignen Zellen in einem Säugetier, wobei das Protein oder Peptid ist: (a) eine Säugetier-Ribonukleotidreduktase R1; oder (b) ein biologisch aktives Analog oder Derivat der Ribonukleotidreduktase R1 von (a).
  15. Protein oder Peptid nach Anspruch 14, das rekombinant hergestellt ist.
  16. Peptid nach Anspruch 14 oder 15, das ein biologisch aktives Derivat der Ribonukleotidreduktase R1 wie in (b) ist.
  17. Protein oder Peptid nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei die Modulation der Vermehrung von malignen Zellen durch Inhibition der neoplastischen Zellvermehrung erfolgt.
  18. Protein oder Peptid nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei die Modulation der Vermehrung von malignen Zellen durch Inhibition der Metastasierung von neoplastischen Zellen erfolgt.
  19. Protein oder Peptid nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei die Modulation der Vermehrung von malignen Zellen durch Modulation der Tumorigenizität von neoplastischen Zellen erfolgt.
  20. Protein oder Peptid nach einem der Ansprüche 14 bis 19, wobei die Verwendung das Inkontaktbringen von neoplastischen Zellen des Säugetiers mit dem Protein oder Peptid umfasst.
  21. Protein oder Peptid nach einem der Ansprüche 14 bis 20, wobei das Säugetier ein Mensch ist.
  22. Protein oder Peptid nach Anspruch 22, wobei die Säugetier-Ribonukleotidreduktase R1 eine humane Ribonukleotidreduktase R1 ist.
  23. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend das Protein oder Peptid nach einem der Ansprüche 14 bis 22 und ein(en) pharmazeutisch physiologisch geeigneten/s Träger oder Verdünnungsmittel.
  24. Verwendung einer exprimierbaren Nukleinsäure bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Modulation der Vermehrung von malignen Zellen in einem Säugetier; wobei die Nukleinsäure ist: (a) eine Nukleinsäure, die eine Säugetier-Ribonukleotidreduktase R1 kodiert; oder (b) eine Nukleinsäure wie in (a), die modifiziert ist, so dass sie ein biologisch aktives Analog oder Derivat von Ribonukleotidreduktase R1 kodiert.
  25. Die Verwendung nach Anspruch 24, wobei die Nukleinsäure ist. (i) eine Nukleinsäure wie in (a), umfassend eine Sequenz wie in SEQ ID NR: 1 aufgeführt; (ii) eine Nukleinsäure wie in (a), umfassend die Ribonukleotidreduktase R1 kodierende Sequenz wie in SEQ ID NR: 1 aufgeführt; oder (iii) eine Nukleinsäure wie in (i) oder (ii), die modifiziert ist, so dass sie ein biologisch aktives Analog oder Derivat von Ribonukleotidreduktase R1 kodiert.
  26. Verwendung nach Anspruch 24 oder Anspruch 25, wobei die Nukleinsäure ein Derivat wie in (b) oder (iii) kodiert und das Derivat ein Peptid ist.
  27. Verwendung nach einem der Ansprüche 24 bis 26, wobei die Modulation der Vermehrung von malignen Zellen durch Inhibition von neoplastischer Zellvermehrung erfolgt.
  28. Verwendung nach einem der Ansprüche 24 bis 26, wobei die Modulation der Vermehrung von malignen Zellen durch In hibition der Metastasierung von neoplastischen Zellen erfolgt.
  29. Verwendung nach einem der Ansprüche 24 bis 26, wobei die Modulation der Vermehrung von malignen Zellen durch Modulation der Tumorigenizität von neoplastischen Zellen erfolgt.
  30. Verwendung nach einem der Ansprüche 24 bis 29, wobei das Arzneimittel zur Verwendung in der Gentherapie bestimmt ist.
  31. Verwendung nach einem der Ansprüche 24 bis 30, wobei das Arzneimittel zum Inkontaktbringen neoplastischer Zellen des Säugetiers mit der Nukleinsäure bestimmt ist.
  32. Verwendung nach einem der Ansprüche 24 bis 31, wobei das Säugetier ein Mensch ist.
  33. Verwendung nach Anspruch 32, wobei die Säugetier-Ribonukleotidreduktase R1 eine humane Ribonukleotidreduktase R1 ist.
  34. Verwendung nach einem der Ansprüche 24 bis 33, wobei die Nukleinsäure sich in einem Vektor befindet.
  35. Verwendung eines Proteins oder Peptids bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Modulation der Vermehrung von malignen Zellen in einem Säugetier, wobei das Protein oder Peptid ist: a) eine Säugetier-Ribonukleotidreduktase R1; b) oder ein biologisch aktives Analog oder Derivat der Ribonukleotidreduktase R1 von (a).
  36. Verwendung nach Anspruch 35, wobei das Protein oder Peptid rekombinant hergestellt ist.
  37. Verwendung nach Anspruch 35 oder 36, wobei das Peptid ein biologisch aktives Derivat von Ribonukleotidreduktase R1 wie in (b) ist.
  38. Verwendung nach einem der Ansprüche 35 bis 37, wobei die Modulation der Vermehrung von malignen Zellen durch Inhibition von neoplastischer Zellvermehrung erfolgt.
  39. Verwendung nach einem der Ansprüche 35 bis 37, wobei die Modulation der Vermehrung von malignen Zellen durch Inhibition der Metastasierung von neoplastischen Zellen erfolgt.
  40. Verwendung nach einem der Ansprüche 35 bis 37, wobei die Modulation der Vermehrung von malignen Zellen durch Modulation der Tumorigenizität von neoplastischen Zellen erfolgt.
  41. Verwendung nach einem der Ansprüche 35 bis 40, wobei das Arzneimittel zum Inkontaktbringen neoplastischer Zellen des Säugetiers mit dem Protein oder Peptid bestimmt ist.
  42. Verwendung nach einem der Ansprüche 35 bis 41, wobei der Säugetier ein Mensch ist.
  43. Verwendung nach Anspruch 39, wobei die Säugetier-Ribonukleotidreduktase R1 eine humane Ribonukleotidreduktase R1 ist,
  44. Verwendung einer exprimierbaren Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines Vektors.
  45. Verfahren zum Modulieren der Tumorigenizität von neoplastischen Zellen, die aus einem Säugetier isoliert sind, umfassend das Inkontaktbringen der neoplastischen Zelle in vitro mit einer die Vermehrung modulierenden Menge einer exprimierbaren Nukleinsäuresequenz für eine Säugetier-Ribonukleotidreduktase R1 des Säugetiers.
  46. Verfahren zum Reduzieren des Metastasierungs-Potenzials von neoplastischen Zellen, die aus einem Säugetier isoliert sind, umfassend das Inkontaktbringen der neoplastischen Zellen in vitro mit einer die Vermehrung modulierenden Menge einer exprimierbaren Nukleinsäuresequenz für eine Säugetier-Ribonukleotidreduktase R1.
  47. Verfahren zum Inhibieren der Vermehrung von neoplastischen Zellen, die aus einem Säugetier isoliert sind, umfassend das Inkontaktbringen der neoplastischen Zellen in vitro mit einer die Vermehrung modulierenden Menge einer exprimierbaren Nukleinsäuresequenz für eine Säugetier-Ribonukleotidreduktase R1.
  48. Verfahren nach einem der Ansprüche 45 bis 47, wobei die neoplastischen Zellen aus einem Menschen isoliert sind.
  49. Verfahren nach Anspruch 48, wobei die Säugetier-Ribonukleotidreduktase R1 eine humane Ribonukleotidreduktase R1 ist.
  50. Verwendung wie in einem der Ansprüche 24 bis 44 beansprucht, wobei das Medikament weiterhin ein Arzneimittel umfasst, das die Expression durch Aktivierung geeigneter Stoffwechsel- oder Signalwege erhöht oder das die mRNA-Stabilität erhöht.
  51. Verwendung wie in Anspruch 50 beansprucht, wobei das Arzneimittel Forskolin oder Choleratoxin ist.
  52. Verwendung wie in Anspruch 50 beansprucht, wobei das Arzneimittel ein Arzneimittel ist, das die Stabilität der Message in einem Proteinkinase-C-Stoffwechsel- oder Signalweg erhöht.
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