EP1556070A2 - Dyslokalisationsmolek le und deren verwendung - Google Patents

Dyslokalisationsmolek le und deren verwendung

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EP1556070A2
EP1556070A2 EP03775198A EP03775198A EP1556070A2 EP 1556070 A2 EP1556070 A2 EP 1556070A2 EP 03775198 A EP03775198 A EP 03775198A EP 03775198 A EP03775198 A EP 03775198A EP 1556070 A2 EP1556070 A2 EP 1556070A2
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EP
European Patent Office
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tumor
compound
specific molecule
cells
gfp
Prior art date
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Ceased
Application number
EP03775198A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Wolfgang Berdel
Carsten Müller-Tidow
Hubert Serve
Björn Steffen
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BERDEL, WOLFGANG
MUELLER-TIDOW, CARSTEN
SERVE, HUBERT
STEFFEN, BJOERN
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Publication of EP1556070A2 publication Critical patent/EP1556070A2/de
Ceased legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/635—Externally inducible repressor mediated regulation of gene expression, e.g. tetR inducible by tetracyline
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]

Definitions

  • the present invention relates to dyslocalization molecules, processes for their preparation and their use as medicaments, in particular for the treatment of tumors.
  • a protein i.e. its location in a cell, in a tissue or in plasma, has a significant influence on the function and activity of the protein. This applies in particular to proteins that are involved in cell regulation.
  • Eukaryotic cells contain intracellular membranes that divide almost half of the cell contents into spatially separated compartments, known as organelles.
  • organelles The main types of membrane-enclosed organelles found in all eukaryotic cells are the endoplasmic reticulum, the Golgi apparatus, the cell nucleus, the mitochondria, the lysosomes, the endosomes and the peroxisomes. Every organelle has a certain sentence
  • the newly synthesized proteins find their way from the cytosol, where they are formed, to the organelle, in which they perform specific tasks by following a specific transport route.
  • the transport route is determined by signals in the form of signal peptides or signal areas in the amino acid sequence of the protein. These signal peptides are recognized by corresponding receptors of the target organ. Proteins that do their job in the cytosol do not contain any signal peptides and therefore remain in the cytosol (Alberts et al., Molecular biology of the cell; VCH Verlag, 3rd edition).
  • the targeted localization of the proteins is further achieved through their organization as multimeric complexes, which can be transported to subcellular structures. These complexes are held in place by their affinity for anchor or scaffold proteins and by means of other structural components. The affinity of individual proteins for these structures depends on corresponding localization domains, post-translational modifications, alosteric changes and other effects (Stein et al., J. Cell Biochem., Suppl. (2000), pp. 84-92) ,
  • DNA-binding and transactivating activity essentially depends on the transport from the cytosol into the cell nucleus.
  • CML chronic myeloid leukemia
  • Bcr-Abl the transforming potential of Bcr-Abl depends not only on the activated kinase activity of the Abi, but also on the interfered with actin-bound localization of the protein. Because of this localization, both mitogenic and anti-apoptotic signaling pathways are activated, whereby the transforming activity is achieved (Daley et al., Science, Vol. 247 (1990), pp. 824-830).
  • AML acute myeloid leukemia
  • chromosomal translocations produce chimeric proteins that include transcription factors, thereby often fusing the DNA binding domain of a transcription activator to a transcriptional repressor.
  • the transcription repressor is thus incorrectly transported to the target genes of the transcription activator.
  • AML1 The most common chromosomal translocation in AML is t (8; 21) translocation, which is found in 10-15% of adult patients with this disease (Downing JR, Br.J. Haematol. Vol. 106 (1999), S. 296-308). Due to this translocation, the C-terminal end of the transcription activator AML1 is replaced by the transcription repressor ETO and produces the fusion protein AML1-ETO (Meyers et al., Mol. Cell.Biol., Vol. 15 (1995), pp. 1974- 1982; and Lenny et al., Oncogene, Vol. 11 (1995), 1761-1769).
  • the AML1-ETO fusion protein is able to bind various co-repressors and histone deacetylases (HDACs) and in this way to express the AML1 target genes, for example GM-CSF, the neutrophil elastase and c / EBP, inhibit (Britos-Bray, M. & Friedman, AD, Mol.Cell.Biol., Vol.17 (1997), p.5127-5135); Frank et al. , Oncogene, Vol.11 (1995), pp. 2667-2674); Pabst, et al., Nat.Med., Vol. 7 (2001), pp. 444-451; and Oelgeschlager et al. , Mol.Cell.Biol., Vol.16
  • HDACs histone deacetylases
  • tumor diseases are usually treated by a combination of surgery, radiation and the administration of chemotherapy drugs.
  • the therapy is primarily limited to the administration of chemotherapeutic agents.
  • the classic chemotherapeutic approaches as well as radiation do not have a specific effect on cancer cells.
  • the therapy is in any case associated with serious side effects, because the effect of the respective therapeutic approach affects all proliferating cells.
  • STI571 an inhibitor of various tyrosine kinases, including Bcr-Abl, has been shown to be effective against t (9; 22) leukaemias (Vigneri et al., 2001, Nat.Med., Vol.7, p.228-34) , Despite the effectiveness of the STI571 in inhibiting the molecular targets in BCR-ABL-associated diseases, full effectiveness is only achieved in CML patients with an early (chronic phase) but not fully developed disease.
  • the present invention was therefore based on the object of providing compounds which, as an active ingredient in a pharmaceutical, enable improved treatment of tumors, in particular leukemias.
  • the dyslocalization of the tumor-specific molecule caused by the compounds according to the invention inhibits the growth of tumor-specific cells or even induces apoptosis in tumor-specific cells.
  • the therapeutic approach of the present invention is thus directed towards dyslocalization of an oncogenic molecule, in which the function of the oncogene is not inhibited but is used to eliminate the oncogene-containing cells.
  • the compounds according to the invention are highly specific and have no effect on cells which do not have the tumor-specific molecule.
  • This new therapeutic approach therefore does not reverse individual oncogenic events, but changes a specific property of the tumor cells in such a way that the tumor cell is eliminated.
  • This method uses the fact that the function of many proteins - including oncogenic proteins - not only depends on their shape, but also crucially on their location in the cell.
  • the compound is a peptide, oligopeptide, protein or fusion protein.
  • small molecules which are characterized by their specific binding to the tumor-specific molecule.
  • organic molecules can be used here.
  • organic molecules are understood to be hydrocarbons of low molecular weight. These can have a molecular weight of ⁇ 5000 Da, preferably ⁇ 1000 Da and particularly preferably ⁇ 500 Da. It is also conceivable to use assembled molecules that consist of two different components.
  • the tumor-specific molecule is a molecule that is either only present in tumor cells in this form or is present in tumor cells in a different concentration than in healthy cells.
  • the tumor-specific molecule is preferably also a peptide, oligopeptide, protein, fusion protein, RNA or DNA.
  • tumor-specific post-translational modifications such as phosphorylation, glycosylation, acetylation, methylation and similar modifications are also possible as tumor-specific parameters.
  • the tumor-specific molecule is a fusion protein which is exclusively present in tumor cells, for example the AML1-ETO molecule.
  • Tumor-specific molecules that are more vulnerable are the fusion proteins that arise from other chromosomal translocations in leukaemias (Bcr-Abl, PML-RARalpha, PLZF-RARalpha, MLL-fusion proteins, etc.) and in other malignant diseases (e.g. EWS-Fli in sarcomas).
  • the compounds according to the invention have a binding affinity for the tumor-specific molecules.
  • the binding affinity is preferably in the range from 10 "5 to 10 " 12 , and particularly preferably in the range from 10 "7 to 10 " 9 .
  • dyslocalization of a tumor-specific molecule is understood to mean the transport of the molecule within the cell or the tissue to a location where this molecule is usually not present in tumor cells.
  • dyslocation can cause tumor-specific proteins (for example transcription activators or repressors) to bind to the genomic DNA at positions where the tumor-specific proteins would otherwise not bind.
  • tumor-specific proteins for example transcription activators or repressors
  • the dyslocation of a tumor-specific molecule can result in it being secreted or transported into a cell organ, even though it is a cytoplasmic molecule in the tumor cell.
  • the tumor-specific molecule can be exported from the nucleus, although it is a nuclear molecule in tumor cells.
  • the dyslocation of the tumor-specific molecule leads to more than 60% inhibition of the growth of the tumor cells, with more than 80% inhibition being particularly preferred.
  • the growth inhibition can be reduced by reducing the formation of colonies in methyl cellulose by the method of Mizuki, M. et al. "Flt3 mutations from patients with acute myeloid leukemia induce transformation of 32D cells mediated by the Ras and STAT5 pathways", Blood, 2000 Dec 1, Vol. 96 (12), 3907-14.
  • dyslocalization leads to induction of apoptosis in the tumor cells.
  • the apoptosis in the tumor cells in cells which have been treated with the molecule according to the invention is preferably increased by a factor of 2 compared to untreated cells, an increase in apoptosis by at least a factor of 3 being particularly preferred.
  • the increased induction of apoptosis in the tumor cells can be measured using standard assays (Darzynkiewitz, Z. et al., "Flow cytometry in analysis of cell cycle and apoptosis", Semin Hematol. 2001 Apr, Vol. 38 (2), 179-93 ).
  • the dyslocalization of the tumor-specific molecule can lead, for example, to the binding of the tumor-specific molecule to a nucleic acid sequence which regulates the transcription of a gene.
  • the transcription of the gene can , """""
  • the compound comprises the peptide sequence of the c-myb DNA binding domain and / or the peptide sequence of the AML1 binding domain of the MEF ("myeloid elf like factor").
  • the compound according to the invention has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the present invention further relates to nucleic acids which code for a peptide or protein according to the invention which has binding affinity for a tumor-specific molecule and can cause dyslocalization of the tumor-specific molecule.
  • the nucleic acid is preferably DNA or RNA.
  • the nucleic acid can be part of a vector which can be designed for expression of the nucleic acid.
  • the compound according to the invention is encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the present invention relates to host cells which have one of the nucleic acids according to the invention.
  • the invention further comprises pharmaceutical compositions which comprise a compound according to the invention, nucleic acid or host cells.
  • the drug may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier and be formulated for oral, intravenous or intramuscular administration.
  • the present invention further relates to the use of the compound, nucleic acids or host cells according to the invention for the manufacture of a medicament for the treatment of tumors, leukemias, in particular acute myeloid leukemia. Treatment of acute myeloid leukemia caused by a t (8; 21) translocation is particularly preferred.
  • processes for the preparation of the compounds according to the invention are also included. If it is a peptide or protein, it can be expressed recombinantly or obtained by protein synthesis.
  • the present invention relates to methods of identifying a compound suitable for the treatment of tumors, in which:
  • (b) identifies a compound that has a binding affinity for the tumor-specific molecule and can cause dyslocalization of the tumor-specific molecule.
  • tumor-specific molecules are identified using modern genomics and proteomics methods.
  • microarray analyzes or 2D protein gel electrophoresis with subsequent mass spectrometric identification and a combination of these methods can be used.
  • All methods known in the prior art for analyzing differences between tumor cells and non-degenerate cells can be used according to the invention to identify tumor-specific molecules.
  • the target molecule is identified which can be used to dislocate the tumor-specific molecule.
  • This can in turn be a protein, an RNA or a DNA fragment.
  • the screening method is preferably used as a high-throughput method such that thousands of substances are tested for their binding to the tumor-specific molecule and to the dyslocalization molecule by means of automatic pipetting robots. Compounds are then selected which each bind to one of the two molecules or to both at the same time with high affinity and specificity. If two different molecules are identified (one binding to the tumor-specific molecule and the other triggering dyslocalization), these molecules are coupled by chemical methods, for example by inserting a polylinker.
  • a great advantage of this screening method is that each molecule only has to bind to the target molecule, but does not necessarily have to influence the function of the target molecule.
  • a recombinant fusion protein was generated to target AMLI-ETO repressor activity to promoters essential for survival and proliferation of myeloid cells.
  • a high degree of specificity was achieved through various effects.
  • the c-myb binding sites were used as a target for GFP-M & M and AMLl-ETO repression complexes.
  • C-myb is essential for hematopoietic cells, but not for the development of other organs (Mucenski, 1991, Cell Vol.65, pp.677-89).
  • the experiments show that the dyslocalization molecule according to the invention (here a recombinant fusion protein) compared Cells that do not express AMLl-ETO are not toxic.
  • a high specific toxicity was achieved for cells that had undergone tumor-inducing transformations.
  • Figure 1 Construction of an AMLI-ETO dyslocalization protein a hypothesis of the function of a chimeric protein consisting of the DNA binding domain of c-myb and the AML1 binding domain of MEF. b Structure of the chimeric protein and the deletion mutant. c Immunoblot detection from Cos7 cell lysates with an anti-GFP antibody after transfection of the
  • FIG. 2 Specific binding of GFP-M & M to myb binding sites and binding of AMLl-ETO in vitro.
  • Nuclear extracts from Cos7 cells transfected with c-myb GFP-M & M and AMLl-ETO were analyzed in "Electrophoretic Mobility Shift Assays" (EMSA).
  • ESA Electrophoretic Mobility Shift Assays
  • Competition experiments with specific myb and non-specific oligonucleotides show the specificity of GFP-M & M binding.
  • the M&M supershift that results from the co-transfection of GFP-M & M with AMLl-ETO shows the dyslocalization of AMLl-ETO to the myb binding sites.
  • Figure 3 Binding of the AMLl-ETO to the endogenous c-kit promoter by means of GFP-M & M.
  • KCL22 cells were transfected with FLAG-AML1-ETO and GFP or GFP-M & M, DNA- Binding proteins were tightly coupled to DNA with the help of formaldehyde, the cells were lysed, the DNA fragmented and immunoprecipitated with anti-FLAG or non-specific antibodies.
  • the promoter sequences of c-kit and pI4 ARF were detected in the immunoprecipitated chromatin using a PCR. A representative of two experiments is shown.
  • FIG. 4 Specific repression of the myb-dependent promoter by GFP-M & M in the presence of AML1-ETO.
  • KCL22 cells were transiently transfected with a myb-dependent luciferase construct and c-myb, AML1, AMLl-ETO, GFP- ⁇ M & M and GFP-M & M (as indicated). The mean and standard error of three independent experiments are shown.
  • FIG. 5 GFP-M & M represses colony growth in cells expressing AML1-ETO.
  • a 32D cells were transfected with GFP as a control or AMLl-ETO and GFP-M & M as indicated and 1 ⁇ 10 5 cells were colonized using a colonial detection method.
  • the photos show representative colonies on day 10.
  • b 32D cells were transfected as indicated and removed using the colony detection method. The colonies were counted on day 10.
  • the repression of colony growth compared to control transfection with GFP (set as 1) is shown here.
  • the mean and standard error of three independent experiments are shown.
  • c AMLl-ETO was used alone or in combination with GFP- M&M or GFP- ⁇ M & M transfected in 32D cells and then resettled for colony detection.
  • the mean and standard error of three independent experiments are shown, d GFP or GFP-M & M were transfected into Kasumi-1 cells, which naturally express AMLl-ETO and were colonized.
  • the mean and standard error of three independent experiments are shown.
  • FIG. 6 GFP-M & M induces apoptosis in cells expressing AML1-ETO.
  • 32D cells were transfected with AMLI-ETO, GFP-M & M or both vectors and then the transfected cells were sorted by flow cytometry. The transfected cells were then analyzed in a TUNEL detection method.
  • FIG. 7 In cells without AML1-ETO, MYB-dependent promoters are not repressed by GFP-M & M in vivo. Primary murine bone marrow cells were transduced with GFP or GFP-M & M. The expression of KIT in the GFP-positive cells was then analyzed. The results of one of two independent experiments are shown. Materials and methods
  • the GFP-M & M expression plasmid in pcDNA3.1 was prepared by means of a PFU polymerase chain reaction (PCR) using a murine c-myb expression plasmid and cDNA from KCL22 cells as templates, with specific primers for the DNA binding domain of c-myb (encoded by nucleotides 193-594 of SEQ ID NO: 13; including the restriction sites for Kpnl and BamHI) and the AML1 binding domain of MEF (encoded by nucleotides 251-618 of SEQ ID: 12; including restriction sites for BamHI and EcoRI) were used.
  • PCR polymerase chain reaction
  • GFP-pcDNA3.1 GFP corresponds to nucleotides 91-813 from SEQ ID NO: 11.
  • GFP ⁇ M & M was cloned accordingly using a PCR fragment lacking the first 159 base pairs of the c-Myb DNA binding domain.
  • MEF-EcoRl rev 5'- CAG AAT TCG CCT TTG CCA TCC TTT GAT TTC-3 '(SEQ ID NO:
  • myb-BamHl rev 5'- CAG AGA GGA TCC GTA GCC TTC CTG TTC CAC-3 ⁇ (SEQ ID NO: 5)
  • the myb-TK (thymidine kinase) luciferase construct was a gift from Prof. Dr. Klempnauer.
  • the AMLI-ETO cDNA was subcloned into pcDNA3.1.
  • the IL-3-dependent murine myeloid cell line 32Dcl3, the human myeloid cell lines KC122 and Kasumi-1, as well as the monkey kidney cell line Cos7 were cultivated according to methods known in the art.
  • 32Dcl3 cells and KC122 cells were transfected by electroporation with 15 ug plasmid DNA and Cos cells were transfected with 5 ug plasmid DNA using Lipofectamine (Invitrogen).
  • Protein lysates were prepared from the Cos cells transfected with the expression vectors for GFP, GFP-M & M or GFP- ⁇ M & M.
  • the three proteins were detected using the monoclonal murine GFP antibody (Clonetech, Heidelberg, Germany), the detection being carried out by incubation with radish peroxidase-conjugated secondary IgG antibody against mouse IgG (Jackson ImmunoResearch).
  • Cos7 cells were transfected with a total amount of 5 ⁇ g of the expression vectors for c-myb, AMLl-ETO, GFP and GFP-M & M in various combinations.
  • the production of nuclear extracts of the transfected Cos7 cells, the binding reaction and the oligonucleotides which have the c-myb consensus binding sequence are described in Müller et al., 1999, Blood, Vol. 94, pp. 4255-62. 100 ng of double-stranded oligonucleotides were used for the competitive experiments, which either had the myb consensus site or an unspecific binding site.
  • ⁇ .Chromatin immunoprecipitation 100 ng of double-stranded oligonucleotides were used for the competitive experiments, which either had the myb consensus site or an unspecific binding site.
  • KCL22 cells were transfected with FLAG AMLl-ETO and GFP or GFP-M & M. 12 hours after the transfection, the cellular proteins were bound to the DNA by adding 1% formaldehyde for 10 minutes and then the reaction was terminated by adding 0.125 M glycine. The cells were washed twice in ice-cold PBS and lysed in 1 ml of RIPA lysis buffer with protease inhibitors, 200 ⁇ M sodium orthovanadate and 50 ⁇ M NaF. After a 10 minute incubation on ice, the chromatin was fragmented using UV rays (9 pulses of 5 seconds). The cell debris was removed by centrifugation and 50 ul was saved as an "input" control.
  • the rest of the lysate was pre-purified in 40 ⁇ l protein A / G agarose with 5 ⁇ g rabbit and mouse IgG. The rest of each lysate was divided into two samples and immunoprecipitation was performed using either 3 ⁇ g of anti-FLAG or mouse IgG with 40 ⁇ l of protein A / G agarose overnight. The immunocomplexes were washed eight times in a low salt buffer (0.1% SDS, 150 ⁇ M NaCl, 1% Triton X-100, 2 ⁇ M EDTA, pH 8.0, 20 ⁇ M Tris-HCl, pH 8.1).
  • the PCR was carried out using a Taq polymerase (Promega) on a master cycler (Eppendorf) (95 ° C. for 3 min., 37
  • c-kit for: 5'- ACT GTT GTT GCT TTC CGT TCA A-3 '
  • the detection of the promoter activity was carried out according to methods known in the prior art (Müller et al., 2000, Mol.Cell.Biol., Vol.20, pp. 3316-29). A total of 15.5 ⁇ g of plasmid is transfected by electrophoresis. The mixture consisted of 5 ⁇ g of a myb-TK luciferase construct, 0.5 ⁇ g PRL-null plasmid (Promega, Madison, WI) for internal standardization and 5 ⁇ g of the expression vectors for AML1, AMLl-ETO, GFP- ⁇ M & M and GFP-M & M in different combinations. Empty vector was also transfected to compensate for the total amount of transfected DNA.
  • 32Dcl3 cells and Kasumi cells were transient with one A total of 15 g of the expression vectors for AML1, AMLl-ETO, GFP, GFP-M & M and GFP M&M were transfected in various combinations.
  • the transfected cells were separated on the day after the electroporation by means of gradient centrifugation and, in a concentration of 1 ⁇ 10 5 living cells per 35 mm plate, settled in 1 ml of a culture mix.
  • This mix consisted of "Isocove Modified Dulbecco Medium” (IMDM, Life Technologies, Grand Island, NY), 1% methyl cellulose, 20% FCS, IL-3 (lng / ml) and 0.6 mg / dl G418. All experiments were set up in triplicate and the colonies counted on day 10. Average values and standard errors were calculated from three independent experiments (two experiments for the Kasumi cells).
  • 32Dcl3 cells were transiently transfected with the expression vectors for GFP, GFP-M & M and AMLl-ETO in various combinations. After 24 hours, the GFP-positive cells were sorted out of the entire cells by means of flow cytometry and examined further. The percentage of apoptotic cells within the GFP positive cells was determined by means of a TUNEL assay (APO-BrdU kit from Pharmigen), the experiments being carried out according to the manufacturer's instructions. The results of one of the three independent experiments with similar results are shown.
  • Bone marrow cells were removed from the femura of six-month-old BALB / c mice and cultured in RPMI1640 medium with the addition of murine IL-3.
  • Phoenix cells were transiently transfected with GFP or GFP-M & M in MSCV2.2 using Lipofectamin Plus (Invitrogen). After 24 hours changed the medium. The supernatants were harvested 48 hours after the transfection, filtered (0.45 ⁇ m) and after
  • a fusion protein from the "enhanced green fluorescent protein” (GFP, for detection purposes; encoded by nucleotides 91-813 of SEQ ID NO: 11), the DNA binding domain of murine c-myb (nucleotides 193-594 of SEQ ID NO: 13 code for amino acid residues 65-198 of murine c-myb; see Sakura et al., 1989, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, Vol. 86, pp. 5758-61) and the AML1 binding domain of the human Myeloid eleven like factor, MEF (nucleotides 251-618 of SEQ ID: 12 code for amino acid residues 87-206 of human MEF; see Mao S. et al., 1999, Mol. Cell.Biol., Vol. 19, S.3635-44)) was constructed.
  • GFP "enhanced green fluorescent protein”
  • the transcription factor c-myb is known to be essential for normal hematopoiesis and survival of the hematopoietic cells (Mucenski et al., 1991, Cell, Vol.65, pp.677-89). It could be shown that the inhibition of c-myb by antisense strategies or c-myb knock out mice are not able to to develop normal hematopoiesis (Ratajczak et al., 1992, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, Vol. 89, pp. 1123-7).
  • the AMLI binding domain of the MEF (myeloid like ELF factor) was used as the second part of the chimeric protein. Amino acids 87-206 of the MEF bind strongly to AMLl and AMLl-ETO in vivo and in vitro (Mao S. et al., 1999, Mol.Cell.Biol., Vol.19, S.3635-44). All three domains were cloned into the expression vector pcDNA3.1 in the reading direction. This construct was named GFP-M & M ( Figure lb). For control purposes, a deletion mutant which does not have the first 53 amino acids of the c-myb DNA binding domain was produced. The deletion mutant was named GFP-M&M.
  • the expression of the recombinant proteins was analyzed after transient transfection in Cos7 cells by means of immunoblot detection methods using anti-GFP antibody (GFP alone 35 kDa, GFP-M&M 80 kDA; GFP-M & M 85 kDa; FIG. 1c).
  • Example 3 GFP-M & M binds AMLl-ETO to the endogenous c-kit promoter
  • the c-kit promoter was chosen as the c-myb dependent endogenous promoter.
  • the detected binding of AMLl-ETO to the pI4 ARF promoter was analyzed as a positive control (Linggi et al., Nature Medicine, 8 (7), July 2002)).
  • a form of AMLI-ETO marked with FLAG was expressed in combination with GFP or GFP-M & M in KCL22 cells.
  • the transcription factors were cross-linked with DNA using formaldehyde. After cell lysis and DNA fragmentation, DNA / AML1-ETO complexes were immunoprecipitated using an anti-FLAG antibody or nonspecific antibodies for control purposes.
  • the c-kit promoter sequences were immunoprecipitated with AMLI-ETO (FIG. 3).
  • the pl4 ARF promoter sequence was detected in immune complexes from KCL22 cells that had been transfected with AMLl-ETO and GFP. The sequence was not detected in the presence of AMLI-ETO and GFP-M&M (Fig. 3).
  • Example 4 Inhibition of myb-dependent promoters in the presence of GFP-M & M and AMLl-ETO GFP-M & M binds to myb-dependent promoters, forms a complex with AMLl-ETO (if available) and thereby inhibits gene expression.
  • luciferase assays were carried out, the luciferase gene being under the control of a minimal thymidine kinase promoter with three additional myb DNA binding sites (Ziebold et al., 1997, Curr. Biol., Vol. 7, S . 253-60).
  • KCL22 cells were transfected with the reporter constructs and GFP, GFP-M & M and AMLl-ETO in various combinations (FIG. 4). None of the proteins alone was able to significantly influence the luciferase activity.
  • the activity of the transcription factor Myb and the expression of the myb-dependent genes are essential for the growth and proliferation of hematopoietic cells (White et al., 2000, Oncogene, Vol.19, p.1196-205). Therefore, the effect of GFP-M & M on the proliferation and survival rate of the cells containing AMLl-ETO was analyzed.
  • Example 6 Induction of apoptosis by GFP-M & M in cells containing AMLl-ETO Hematopoietic cells that have no c-myb activity are subject to apoptosis (Taylor et al., 1996, Genes Dev., Vol.10, pp. 2732-44).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Dyslokalisationsmoleküle, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung als Arzneimittel, insbesondere zur Behandlung von Tumoren.

Description

Dyslokalisationsmolekule und deren Verwendung
Die vorliegende Erfindung betrifft Dyslokalisationsmolekule, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung als Arzneimittel, insbesondere zur Behandlung von Tumoren.
Die Lokalisation eines Proteins, also der Aufenthaltsort in einer Zelle, in einem Gewebe oder im Plasma hat wesentlichen Einfluss auf die Funktion und Aktivität des Proteins. Dies gilt in besonderem Maße für Proteine, die an der Zellregulation beteiligt sind.
Eukaryonten-Zellen enthalten intrazelluläre Membranen, die nahezu die Hälfte des Zellinhaltes in räumlich getrennte, als Organellen bezeichnete Kompartimente aufteilen. Die Haupttypen der in allen eukaryontisehen Zellen vorkommenden membranumschlossenen Organellen sind das Endoplasmatische Reticulum, der Golgi-Apparat, der Zellkern, die Mitochondrien, die Lysosomen, die Endosomen und die Peroxisomen. Jedes Organell besitzt einen bestimmten Satz an
Proteinen, der die Aufrechterhaltung der organellspezifischen Funktionen gewährleistet.
Die neusynthetisierten Proteine finden ihren Weg vom Cytosol, wo sie gebildet werden, zu dem Organell, in dem sie spezifische Aufgaben erfüllen, indem sie einem spezifischen Transportweg folgen. Der Transportweg ist durch Signale in Form von Signal- peptiden oder Signalbereichen in der Aminosäure-Sequenz des Proteins festgelegt. Diese Signalpeptide werden von entsprechenden Rezeptoren des Zielorganells erkannt. Proteine, die ihre Aufgabe im Cytosol erfüllen, enthalten keine Signalpeptide und verbleiben daher im Cytosol (Alberts et al., Molekularbiologie der Zelle; VCH Verlag, 3. Auflage).
Die zielgerichtete Lokalisation der Proteine wird ferner durch deren Organisation als multimere Komplexe erzielt, welche gezielt zu subzellulären Strukturen transportiert werden können. Diese Komplexe werden an entsprechenden Orten durch ihre Affinität gegenüber Anker- oder Scaffold-Proteinen und mittels anderer struktureller Komponenten an diesem Ort gehalten. Die Affinität einzelner Proteine zu diesen Strukturen hängt von entsprechenden Lokalisationsdomänen, post-translationalen Modifikationen, alo- sterischen Veränderungen und anderen Effekten ab (Stein et al., J.Cell.Biochem. , Suppl. (2000) , S.84-92).
Die Funktion verschiedener Proteinfamilien, die DNA-bindende und transaktivierende Aktivität aufweisen, wie beispielsweise Catenin, Notch oder STAT-Proteine, hängt essentiell von dem Transport aus dem Cytosol in den Zellkern ab.
In vielen Erkrankungen ergeben sich funktionale Konsequenzen einer Mutation durch veränderte Lokalisation der mutierten Genprodukte. Bei der Chronischen Myeloischen Leukämie (CML) beispielsweise hängt das transformierende Potential des Bcr-Abl nicht nur von der aktivierten Kinaseaktivität des Abi ab, sondern auch von der ge- störten, Aktin-gebundenen Lokalisation des Proteins. Aufgrund dieser Lokalisation werden sowohl mitogene als auch anti- apoptotisc e Signalwege aktiviert, wodurch die transformierende Aktivität erreicht wird (Daley et al., Science, Vol.247 (1990), S.824-830) .
Ein nukle rer Einschluß des Bcr-Abl durch unspezifische Hemmung der nuklearen Exportmaschinerie führt beispielsweise zur Apoptose der Bcr-Abl positiven Zellen (Vigneri P.& Wang J.Y., Nat.med., Vol.7 (2001), S.228-234).
Bei der Akuten Myeloischen Leukämie (AML) ist die maligne Transformation oft mit einer Proteindyslokalisation verbunden. Die häufigsten chromosomalen Translokationen erzeugen chimäre Proteine, die Transkriptionsfaktoren umfassen, wodurch häufig die DNA-Bindungsdomäne eines Transkriptionsaktivators mit einem Transkriptionsrepressor fusioniert wird. Es erfolgt somit ein Fehltransport des Transkriptionsrepressors zu den Zielgenen des Transkriptionsaktivators .
Die häufigste chromosomale Translokation bei der AML ist die t(8;21) Translokation, die in 10-15% der erwachsenen Patienten mit dieser Krankheit gefunden wird (Downing J.R., Br.J. Haematol. Vol. 106 (1999), S.296-308) . Aufgrund dieser Translokation wird das C- terminale Ende des Transkriptionsaktivators AML1 durch den Transkriptionsrepressor ETO ersetzt und erzeugt das Fusionsprotein AML1-ETO (Meyers et al . , Mol.Cell.Biol . , Vol.15 (1995), S.1974- 1982; und Lenny et al . , Oncogene, Vol.11 (1995), 1761-1769).
Das Fusionsprotein AML1-ETO ist in der Lage, die Bindung verschiedener Co-Repressoren und Histon-Deacetylasen (HDACs) zu bewirken, und auf diese Weise die Expression der AML1 Zielgene, beispielsweise von GM-CSF, der neutrophilen Elastase und c/EBP , zu inhibieren (Britos-Bray, M. & Friedman, A.D., Mol.Cell.Biol., Vol.17 (1997), S.5127-5135) ; Frank et al . , Oncogene, Vol.11 (1995), S.2667-2674) ; Pabst, et al., Nat.Med., Vol .7 (2001), S.444-451; und Oelgeschlager et al . , Mol.Cell.Biol., Vol.16
(1996) , S.4717-25) . Es ist davon auszugehen, daß diese Wirkung des AMLl-ETO für die für AML typische Blockade der Differenzierung verantwortlich ist.
Tumorerkrankungen werden heute üblicherweise durch eine Kombination aus chirurgischem Eingriff, Bestrahlung und der Verabreichung von Chemotherapeutika behandelt . Bei den hämatologisehen Tumorerkrankungen beschränkt sich die Therapie vor allem auf die Verabreichung von Chemotherapeutika. Die klassischen chemotherapeutischen Ansätze wie auch die Bestrahlung wirken jedoch nicht spezifisch auf die Krebszellen. Für den Patienten ist die Therapie daher in jedem Fall mit schwerwiegenden Nebenwirkungen verbunden, weil die Wirkung des jeweiligen Therapieansatzes alle proliferierenden Zellen trifft.
Die Nebenwirkungen der Chemotherapie können bis zu akutem Nierenversagen und toxisch bedingten Organschädigungen an Herz, Lunge, Leber und Nervensystem führen. Als Folge der immunsuppressiven Wirkung dieser Therapie muß mit einer gehäuften Anzahl von tödlich verlaufenden Infektionen gerechnet werden. Gerade für ältere Patienten kommen viele Therapien wegen ihrer Toxizität nicht in Frage.
Die beschränkte Verfügbarkeit von Wirkstoffen, die spezifisch gegen Krebszellen gerichtet sind und diese angreifen, ist ein wesentlicher Grund für die immer noch sehr schlechte Prognose bei vielen Krebsarten.
Im Stand der Technik wurde daher versucht, Tumorzeil-spezifische Therapieansätze zu entwickeln. So wurde ein defizientes Adenovirus konstruiert, das ausschließlich in Tumoren mit Mutationen im p53 Signaltransduktionsweg replizieren kann (Bischoff et al., 1996, Science, Vol.274, S.373-6) . Durch dieses Vorgehen werden Tumor- zellen, welche eine p53 Mutation aufweisen, infiziert, während andere Zellen nicht beeinflußt werden. Der praktische Wert dieser Therapie wird gegenwärtig in klinischen Versuchen untersucht (McCormick F., 2000, Semin. Cancer Biol . , Vol.10, S.453-9).
Die meisten Therapieansätze sind jedoch auf die Identifizierung kleiner Moleküle gerichtet, die als Inhibitoren onkogener Proteine verwendet werden könnten, beispielsweise spezifische Inhibitoren der Tyrosinkinasen. STI571, ein Inhibitor verschiedener Tyoro- sinkinasen, darunter Bcr-Abl, hat sich gegen t(9;22) Leukämien als wirksam erwiesen (Vigneri et al., 2001, Nat.Med., Vol.7, S.228- 34) . Trotz der Wirksamkeit des STI571 bei der Hemmung der molekularen Ziele in BCR-ABL-assoziierten Erkrankungen wird volle Wirksamkeit nur bei CML-Patienten mit einer frühen (chronischen Phase) , aber nicht voll ausgebildeten Erkrankung erreicht. Im Gegensatz dazu ist ein Rückfall bei den meisten Patienten mit Bcr- Abl positiver Akuter Lymphoblastischer Leukämie und CML- Blastenkrise zu beobachten. Der Grund besteht wahrscheinlich darin, daß der Krebs das Ergebnis einer Serie genetischer Veränderungen ist und die Umkehr eines dieser onkogenen Ereignisse durch einen Wirkstoff für die Heilung der Erkrankung nicht ausreichend ist.
Obwohl molekulare Angriffsziele (sogenannte "targets") für eine Krebstherapie mit zunehmender Geschwindigkeit identifiziert werden, sind bislang kaum Ideen entwickelt worden, wie dieses Wissen für spezifische Therapien genutzt werden könnte.
Der vorliegenden Erfindung lag somit die Aufgabe zugrunde, Verbindungen zur Verfügung zu stellen, die als aktiver Wirkstoff eines Arzneimittels eine verbesserte Behandlung von Tumoren, inbesondere von Leukämien ermöglichen.
Diese Aufgabe wurde nunmehr durch Verbindungen gelöst, die Bindungsaffinität für ein Tumor-spezifisches Molekül aufweisen und eine Dyslokalisation des Tumor-spezifischen Moleküls bewirken können.
Für alle Ausführungsformen der vorliegenden Anmeldung ist es bevorzugt, daß die durch die erfindungsgemäßen Verbindungen bewirkte Dyslokalisation des Tumor-spezifischen Moleküls das Wachstum Tumor-spezifischer Zellen inhibiert oder sogar in Tumorspezifischen Zellen Apoptose induziert.
Im Gegensatz zu den Therapieansätzen aus dem Stand der Technik richtet sich der Therapieansatz der vorliegenden Erfindung somit auf eine Dyslokalisation eines onkogenen Moleküls, bei dem die Funktion des Onkogens nicht inhibiert, sondern zur Eliminierung der Onkogen-enthaltenden Zellen genutzt wird. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind hoch spezifisch und haben keinerlei Wirkung auf Zellen, die das Tumor-spezifische Molekül nicht aufweisen. Dieser neue Therapieansatz kehrt deshalb nicht einzelne onkogene Ereignisse um, sondern verändert eine spezifische Eigenschaft der Tumorzellen in einer solchen Weise, daß die Tumorzelle eliminiert wird. Hierbei nutzt diese Methode die Tatsache, dass die Funktion vieler Proteine - auch der onkogenen Proteine - nicht nur von ihrer Form, sondern auch ganz entscheidend von ihrer Lokalisation in der Zelle abhängt.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Verbindung um ein Peptid, Oligopeptid, Protein oder Fusionsprotein. Es ist aber ebenfalls möglich, kleine Moleküle einzusetzen, die durch ihre spezifische Bindung an das Tumorspezifische Molekül charakterisiert sind. Eine Vielzahl organischer Moleküle ist hierbei einsetzbar. Als organische Moleküle werden vorliegend Kohlenwasserstoffe von geringem Molekulargeweicht verstanden. Diese können ein Molekulargewicht von <5000 Da, vorzugsweise <1000 Da und besonders bevorzugt <500 Da aufweisen. Ebenso ist es denkbar, zusammengefügte Moleküle zu verwenden, die aus zwei unterschiedlichen Komponenten bestehen. Das Tumor-spezifische Molekül ist ein Molekül, das in dieser Form entweder ausschließlich in Tumorzellen vorliegt oder in Tumorzellen in einer anderen Konzentration als in gesunden Zellen vorliegt. Vorzugsweise handelt es sich auch bei dem Tumorspezifischen Molekül um ein Peptid, Oligopeptid, Protein, Fusionsprotein, RNA oder DNA. Hierbei sind auch tumorspezifische posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierung, Glykosylierung, Acetylierung, Methylierung und ähnliche Modifikationen als Tumor-spezifische Parameter möglich.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Tumor-spezifischen Molekül um ein Fusionsprotein, welches ausschließlich in Tumorzellen vorliegt, beispielsweise das Molekül AMLl-ETO. Weiter angreifbare Tumor-spezifische Moleküle sind die aus anderen chromosomalen Translokationen entstehenden Fusionsproteine bei Leukämien (Bcr-Abl, PML-RARalpha, PLZF- RARalpha, MLL-Fusionsproteine, etc.) sowie bei anderen malignen Erkrankungen (z.b. EWS-Fli bei Sarkomen).
Die erfindungsgemäßen Verbindungen weisen eine Bindungsaffinität für die Tumor-spezifischen Moleküle auf. Die Bindungsaffinität liegt vorzugsweise im Bereich von 10"5 bis 10"12, und besonders bevorzugt im Bereich von 10"7 bis 10"9.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind in der Lage, eine Dys- lokalisation der Tumor-spezifischen Moleküle zu bewirken. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter einer Dyslokalisation eines Tumor-spezifischen Moleküls der Transport des Moleküls innerhalb der Zelle oder des Gewebes an einen Ort verstanden, an dem dieses Molekül in Tumorzellen üblicherweise nicht vorliegt. Beispielsweise kann eine Dyslokalisation eine Bindung Tumor-spezifischer Proteine (beispielsweise Transkriptionsaktivatoren oder - repressoren) an die genomische DNA an Positionen bewirken, an denen die Tumor-spezifischen Proteine sonst nicht binden würden. Gemäß eines anderen Beispiels kann die Dyslokalisation eines Tumor-spezifischen Moleküls zur Folge haben, daß dieses sezerniert oder in ein Zellorganell transportiert wird, obwohl es in der Tumorzelle ein cytoplasmatisches Molekül ist. Das Tumor-spezifische Molekül kann beispielsweise aus dem Nukleus exportiert werden, obwohl es in Tumorzellen ein nukleares Molekül ist.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung führt die Dyslokation des Tumor-spezifischen Moleküls zu einer mehr als 60%igen Inhibierung des Wachstums der Tumorzellen, wobei eine mehr als 80%ige Inhibierung besonders bevorzugt ist. Die Wachstumsinhibition kann über eine Verringerung der Kolonien- Bildung in Methylzellulose nach dem Verfahren von Mizuki, M. et al. "Flt3 mutations from patients with acute myeloid leukemia induce transformation of 32D cells mediated by the Ras and STAT5 pathways", Blood, 2000 Dec 1, Vol. 96(12), 3907-14, bestimmt werden.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform führt die Dyslokalisation zu einer Induktion von Apoptose in den Tumorzellen. Die Apoptose in den Tumorzellen ist dabei in Zellen, welche mit dem erfindungsgemäßen Molekül behandelt wurden, im Vergleich zu unbehandelten Zellen vorzugsweise um den Faktor 2 erhöht, wobei eine Steigerung der Apoptose um mindestens den Faktor 3 besonders bevorzugt ist. Die gesteigerte Induktion der Apoptose in den Tumorzellen kann mittels Standardassays gemessen werden (Darzynkiewitz, Z. et al., "Flow cytometry in analysis of cell cycle and apoptosis", Semin Hematol. 2001 Apr, Vol.38(2), 179-93).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Dyslokalisation des Tumor-spezifischen Moleküls beispielsweise zur Bindung des Tumor- spezifischen Moleküls an eine Nukleinsäuresequenz führen, welche die Transkription eines Gens reguliert. Durch die Bindung des Tumor-spezifischen Moleküls kann die Transkription des Gens , „„„„„
WO 2004/037278
- 9 - aktiviert oder inhibiert werden.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Verbindung die Peptidsequenz der c-myb DNA-Bindungsdomäne und/oder die Peptidsequenz der AML1-Bindungsdomäne des MEF ("myeloid elf like factor") . Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Verbindung die in SEQ ID NO:l gezeigte Aminosäuresequenz auf.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Nukleinsäuren, die für ein erfindungsgemäßes Peptid oder Protein kodieren, das Bindungsaffinität für ein Tumor-spezifisches Molekül aufweist und eine Dyslokalisation des Tumor-spezifischen Moleküls bewirken kann. Bei der Nukleinsaure handelt es sich vorzugsweise um DNA oder RNA. Die Nukleinsaure kann Teil eines Vektors sein, der für eine Expression der Nukleinsaure ausgelegt sein kann. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemäße Verbindung von der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Nukleotidsequenz kodiert .
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Wirts-Zellen, die eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren aufweisen.
Die Erfindung umfasst ferner Arzneimittel, welche eine erfindungsgemäße Verbindung, Nukleinsaure oder Wirts-Zellen umfassen. Das Arzneimittel kann ferner einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen und zur oralen, intravenösen oder intramuskulären Verabreichung formuliert sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindung, Nukleinsäuren oder Wirts-Zellen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumoren, Leukämien, insbesondere der Akuten Myeloischen Leukämie. Die Behandlung einer Akuten Myeloischen Leukämie, die durch eine t(8;21) Translokation verursacht wurde, ist besonders bevorzugt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind ferner Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen umfaßt. Soweit es sich dabei um ein Peptid oder Protein handelt, kann dieses rekombinant exprimiert oder durch Proteinsynthese gewonnen werden.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die zur Behandlung von Tumoren geeignet ist, bei denen man:
(a) ein Tumor-spezifisches Molekül identifiziert; und
(b) eine Verbindung identifiziert, die eine Bindungsaffinität für das Tumor-spezifische Molekül aufweist und eine Dyslokalisation des Tumor-spezifischen Moleküls bewirken kann.
Tumorspezifische Moleküle werden bei diesem Verfahren mittels moderner Genomik- und Proteomik-Verfahren identifiziert. Hierbei können zum Beispiel Microarray-Analysen oder 2D- Proteingelelektrophoresen mit nachfolgender massen- spektrometrischer Identifizierung sowie eine Kombination dieser Verfahren eingesetzt werden.
Alle im Stand der Technik bekannten Verfahren zur Analyse von Unterschieden zwischen Tumorzellen und nicht-entarteten Zellen können erfindungsgemäß zur Identifizierung Tumor-spezifischer Moleküle verwandt werden.
In einem zweiten Schritt wird das Zielmolekül identifiziert, das zur Dyslokation des Tumor-spezifischen Moleküls benutzt werden kann. Hierbei kann es sich wiederum um ein Protein, eine RNA oder ein DNA-Fragment handeln. Das Screening-Verfahren wird vorzugsweise als Hochdurchsa zverfahren so angewandt, daß mittels automatischer Pipettierroboter tausende von Substanzen auf ihre Bindung an das Tumor-spezifische Molekül und an das Dyslokalisationsmolekül getestet werden. Ausgewählt werden dann Verbindungen, die jeweils mit hoher Affinität und Spezifität an eines der beiden Moleküle oder an beide zugleich binden. Werden zwei unterschiedliche Moleküle identifiziert (wobei eines an das Tumor-spezifische Molekül bindet und das andere die Dyslokalisation auslöst) , so werden diese Moleküle durch chemische Verfahren, z.B. durch das Einführen eines Polylinkers gekoppelt. Ein großer Vorteil dieses Screeningverfahrens liegt darin, daß jedes Molekül nur an das Zielmolekül binden muß, aber nicht notwendigerweise auch die Funktion des Zielmoleküls beeinflußen muß.
In den nachfolgenden Beispielen wurde ein rekombinantes Fusionsprotein erzeugt, um die AMLl-ETO-Repressoraktivität auf Promotoren zu richten, die für das Überleben und die Proliferation myeloischer Zellen essentiell sind. Ein hohes Maß an Spezifität wurde durch verschiedene Effekte erreicht. Die c-myb Bindungsstellen wurden als Ziel für GFP-M&M und AMLl-ETO Repres- sorkomplexe genutzt. C-myb ist für hämatopoetische Zellen essentiell, jedoch nicht für die Entwicklung anderer Organe (Mu- censki, 1991, Cell Vol.65, S.677-89).
Die essentielle Bedeutung des c-myb für Zellproliferationen leukämischer Zellen ist allgemein bekannt . Die Hemmung myb- abhängiger Gene stellt ein wesentliches Ziel der Leukämietherapie dar (Mucenski, 1991, Cell Vol.65, S.677-89; Ratajczak, 1992, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, Vol.89, S.118237; Gewirtz et al . , 1988, Science, Vol.242, S.1303-6; Gewirtz A.M. , 1999, Oncogene, Vol.18, 3056-62) .
Die Experimente zeigen, daß das erfindungsgemäße Dyslokalisationsmolekül (hier ein rekombinantes Fusionsprotein) gegenüber Zellen, welche AMLl-ETO nicht exprimieren, nicht toxisch ist. Eine hohe spezifische Toxizität wurde für Zellen erzielt, die tumorinduzierende Transformationen erlitten hatten.
Beschreibung der Figuren
Figur 1: Konstruktion eines AMLl-ETO Dyslokalisationspro- teins a Hypothese der Funktion eines Chimären Proteins bestehend aus der DNA Bindungsdomäne von c-myb und der AML1 Bindungsdomäne von MEF. b Struktur des Chimären Proteins und der Deletionsmu- tante . c Immunoblot-Nachweis aus Cos7-Zell-Lysaten mit einem Anti-GFP-Antikörper nach Transfektion der
Zellen mit GFP, GFP-ΔM&M und GFP-M&M.
Figur 2: Spezifische Bindung des GFP-M&M an myb Bindungsstellen und Bindung von AMLl-ETO in vitro. Zellkernextrakte von Cos7-Zellen, die mit c-myb GFP-M&M und AMLl-ETO transfiziert worden waren, wurden in "Elektrophoretischen Mobilitäts Shift Assays" (EMSA) analysiert. Kompetitions-Experimente mit spezifischen myb und unspezifischen Oligonukleotiden zeigen die Spezifität der GFP-M&M Bindung. Der Supershift von M&M, der durch die Kotransfektion von GFP-M&M mit AMLl-ETO entsteht, zeigt die Dyslokalisation von AMLl-ETO zu den myb Bindungsstellen.
Figur 3: Bindung des AMLl-ETO an den endogenen c-kit Promotor mittels GFP-M&M. KCL22 Zellen wurden mit FLAG- AML1-ETO und GFP oder GFP-M&M transfiziert, DNA- bindende Proteine wurden mit Hilfe von Formaldehyd fest an DNA gekoppelt, die Zellen lysiert, die DNA fragmentiert und mit anti-FLAG oder unspezifischen Antikörpern immunpräzipitiert . Im immunpräzipitierten Chromatin wurden die Promotor-Sequenzen von c-kit und pl4ARF mit einer PCR detektiert . Ein repräsentatives von zwei Experimenten wird gezeigt.
Figur 4: Spezifische Repression des myb-abhängigen Promotors durch GFP-M&M in Anwesenheit von AMLl-ETO. KCL22- Zellen wurden transient mit einem myb abhängigen Luciferase-Konstrukt und c-myb, AML1, AMLl-ETO, GFP-ΔM&M und GFP-M&M (wie angezeigt) transfiziert. Der Mittelwert und der Standardfehler von drei unabhängigen Experimenten ist dargestellt.
Figur 5: GFP-M&M reprimiert Koloniewachstum in AMLl-ETO exprimierenden Zellen.
a 32D Zellen wurden mit GFP als Kontrolle oder AMLl- ETO und GFP-M&M wie angegeben transfiziert und 1 x 105 Zellen in Kolonienachweisverfahren ausgesiedelt. Die Photos zeigen repräsentative Kolonien an Tag 10. b 32D Zellen wurden wie angegeben transfiziert und im Kolonie-Nachweisverfahren ausgesiedelt. An Tag 10 wurden die Kolonien gezählt . Hier ist die Repression des Koloniewachstums verglichen mit der Kontrolltransfektion mit GFP (als 1 gesetzt) dargestellt. Der Mittelwert und der Standardfehler von drei unabhängigen Versuchen wird gezeigt. c AMLl-ETO wurde alleine oder in Kombination mit GFP- M&M oder GFP-ΔM&M in 32D-Zellen transfiziert und anschließend für Kolonienachweisverfahren ausgesiedelt. Der Mittelwert und der Standardfehler von drei unabhängigen Experimenten ist dargestellt, d GFP oder GFP-M&M wurden in Kasumi-1-Zellen transfiziert, die natürlicherweise AMLl-ETO exprimieren und in Kolonienachweisverfahren ausgesiedelt. Der Mittelwert und der Standardfehler von drei unabhängigen Experimenten ist dargestellt.
Figur 6: GFP-M&M induziert in AMLl-ETO exprimierenden Zellen Apoptose. 32D Zellen wurden mit AMLl-ETO, GFP-M&M oder beiden Vektoren transfiziert und anschließend wurden die transfizierten Zellen durch Durchflußzytometrie sortiert. Die transfizierten Zellen wurden dann in einem TUNEL-Nach- weisverfahren analysiert .
a Darstellung der FACS Ergebnisse für BrdU-positive, apoptotische Zellen. Die offenen Kurven stellen die Apoptoserate in Zellen, die zu Kontrollzwecken mit einem Leervektor transfiziert wurden, dar. b Dargestellung der Anteile von apoptotischen Zellen in den transfizierten 32D Zellen.
Figur 7: In Zellen ohne AMLl-ETO werden MYB-abhängige Promotoren in vivo nicht von GFP-M&M reprimiert. Primäre murine Knochenmarkzellen wurden mit GFP oder GFP-M&M tansduziert. Anschließend wurde die Expression von KIT in den GFP-positiven Zellen analysiert. Die Ergebnisse eines von zwei unabhängigen Experimenten werden gezeigt . Materialien und Methoden
In den Beispielen wurden die folgenden Materialien und Methoden verwendet :
1. Plasmide:
Das GFP-M&M Expressionsplasmid in pcDNA3.1 wurde mittels PFU- Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines murinen c-myb Expressionsplasmides und von cDNA aus KCL22 Zellen als Template hergestellt, wobei spezifische Primer für die DNA- Bindungsdomäne von c-myb (kodiert von den Nukleotiden 193-594 der SEQ ID NO: 13; umfassend die Restriktionsschnittstellen für Kpnl und BamHI) und die AML1 Bindungsdomäne von MEF (kodiert von den Nukleotiden 251-618 der SEQ ID:12; umfassend Restriktionsschnittstellen für BamHI und EcoRI) verwendet wurden. Die PCR Produkte wurden in Leserichtung in GFP- pcDNA3.1 (GFP entspricht den Nukleotiden 91-813 von SEQ ID NO: 11) kloniert. GFPΔM&M wurde entsprechend kloniert, wobei ein PCR Fragment verwendet wurde, welchem die ersten 159 Basenpaare der DNA-Bindungsdomäne des c-Myb fehlten.
Primer für die AML1 Bindungsdomäne von MEF:
MEF-BamHl for: 5'- ATA GGA TCC GCC ACC TCG CAC ACC ATG TCA-3' (SEQ
ID NO: 3)
MEF-EcoRl rev:5'- CAG AAT TCG CCT TTG CCA TCC TTT GAT TTC-3' (SEQ
ID NO: 4)
Primer für die DNA-Bindungsdomäne von c-myb: myb-Kpnl for: 5'- CAG AGA GGT ACC GTC ATT GCC AAT TAT CTG-3' (SEQ
ID NO: 5) myb-BamHl rev:5'- CAG AGA GGA TCC GTA GCC TTC CTG TTC CAC-3 ■ (SEQ
ID NO: 6) Das myb-TK (Thymidinkinase) Luziferasekonstrukt war ein Geschenk von Prof. Dr. Klempnauer. Die AMLl-ETO cDNA wurde in pcDNA3.1 subkloniert .
2. Zelllinien und Transfektion:
Die IL-3-abhängige murine myeloische Zelllinie 32Dcl3, die humanen myeloischen Zelllinien KC122 und Kasumi-1, sowie die Affennieren Zelllinie Cos7 wurden nach im Stand der Technik bekannten Verfahren kultiviert. 32Dcl3 Zellen und KC122 Zellen wurden durch Elektroporation mit 15 μg Plasmid DNA transfiziert und Cos-Zellen wurden unter Verwendung von Lipofectamin (Invitrogen) mit 5 μg Plasmid DNA transfiziert.
3. I munoblotting:
Aus den mit den Expressionsvektoren für GFP, GFP-M&M oder GFP- ΔM&M transfizierten Cos-Zellen wurden Proteinlysate hergestellt . Die drei Proteine wurden unter Verwendung des monoklonalen murinen GFP-Antikörpers (Clonetech, Heidelberg, Deutschland) nachgewiesen, wobei der Nachweis durch eine Inkubation mit Radieschen-Peroxidase konjugiertem sekundärem IgG- Antikörper gegen Maus IgG erfolgte (Jackson ImmunoResearch) .
4.Elektrophoretischer Mobilitäts-Shift-Assay
Cos7-Zellen wurden mit einer Gesamtmenge von 5 μg der Expressionsvektoren für c-myb, AMLl-ETO, GFP und GFP-M&M in verschiedenen Kombinationen transfiziert. Die Herstellung von Zellkernextrakten der transfizierten Cos7-Zellen, die Bindungsreaktion und die Oligonukleotide, welche die c-myb Konsensus-Bindungssequenz aufweisen, sind in Müller et al., 1999, Blood, Vol.94, S. 4255-62, beschrieben. Für die kom- petitiven Experimente wurden 100 ng doppelsträngiger Oligonukleotide verwendet, die entweder die myb Konsensusstelle oder eine unspezifische Bindungsstelle aufwiesen. δ.Chromatin Immunopräzipitation:
KCL22 Zellen wurden mit FLAG AMLl-ETO und GFP oder GFP-M&M transfiziert. 12 Stunden nach der Transfektion wurden durch Zugabe von 1% Formaldehyd für 10 Minuten die zellulären Proteine an die DNA gebunden und anschließend die Reaktion durch die Zugabe von 0,125 M Glycin beendet. Die Zellen wurden zweimal in eiskaltem PBS gewaschen und in 1ml RIPA Lysepuffer mit Protease-Inhibitoren, 200 μM Natrium Orthovanadat und 50 μM NaF lysiert. Nach einer 10-minütigen Inkubation auf Eis wurde das Chromatin mit Hilfe von UV-Strahlen fragmentiert (9 Pulse von 5 Sekunden) . Die Zelltrümmer wurden mittels Zentrifugation abgetrennt und 50 μl wurden als "input" -Kontrolle aufbewahrt. Der Rest des Lysates wurde in 40 μl Protein A/G-Agarose mit 5 μg Kaninchen- und Maus-IgG vorgereinigt . Der Rest jedes Lysates wurde in zwei Proben aufgeteilt und die Immunopräzipitation wurde entweder unter Verwendung von 3 μg eines anti-FLAG oder Maus-IgG mit 40 μl Protein A/G-Agarose über Nacht durchgeführt. Die Immunokomplexe wurden achtfach in einem Puffer mit geringem Salzgehalt gewaschen (0,1% SDS, 150 μM NaCl, 1% Triton X-100, 2 μM EDTA, pH 8,0, 20 μM Tris-HCl, pH 8,1). Anschließend wurden die Verbindungen zwischen der DNA und den Proteinen in den Immunkomplexen und der "input" -Kontrolle wieder gelöst und die DNA aus der Lösung Phenol/Chloroform extrahiert . Dann wurden in den Proben spezifische Promotor-Sequenzen für die c-kit Promotor Region und die pl4ARF Promotor Region mittels PCR detektiert.
Die PCR wurde mit einer Taq-Polymerase (Promega) auf einem Mastercycler (Eppendorf) durchgeführt (95°C für 3 Min., 37
Cyclen bei 95°C für 1 Min., 60°C für 1 Min. und 72°C für 1 Min.). Die Produkte wurden auf einem 2% Agarosegel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid gefärbt . Primer für die p!4ARF Promoter Region: pl4ARF for: 5 ' -AGT GGC TAC GTA AGA GTG ATC GC-3' (SEQ ID NO: 7) pl4ARF rev: 5'-CTT ACA GAT CAG ACG TCA AGC CC -3' (SEQ ID NO:
8)
Primer für die c-kit Promoter Region: c-kit for: 5'- ACT GTT GTT GCT TTC CGT TCA A-3 '
(SEQ ID NO: 9) c-kit rev: 5'- TTA AGC CCG ATT TCA CTG CC-3 '
(SEQ ID NO: 10)
6. Luziferase-Nachweis :
Der Nachweis der Promotoraktivität erfolgte nach im Stand der Technik bekannten Verfahren (Müller et al., 2000, Mol.Cell.Biol., Vol.20, S. 3316-29). Dabei wird eine Gesamtmenge von 15,5 μg Plasmid mittels Elektrophorese transfiziert. Die Mischung bestand aus 5 μg eines myb-TK Luziferasekonstruktes, 0,5 μg PRL-null Plasmid (Promega, Madison, WI) zur internen Standarisierung und 5 μg der Expressionsvektoren für AML1, AMLl-ETO, GFP-ΔM&M und GFP-M&M in verschiedenen Kombinationen. Leervektor wurde zum Ausgleich der Gesamtmenge an transfizierter DNA mittransfiziert . Nach 18 Stunden wurden die Zellen lysiert und die Aktivität der Firefly- und Renilla-Luziferase unter Verwendung des "Dual Luciferase Assay Systems" der Firma Promega detektiert. Die Renilla- Luziferase Aktivität wurde zur internen Standardisierung der Transfektionseffizienz benutzt. Aus drei unabhängigen Experimenten wurden die Mittelwerte und Standardfehler berechnet .
7.Klonales Wachstum in Methylzellulose:
32Dcl3 Zellen und Kasumi Zellen wurden transient mit einer Gesamtmenge von 15 g der Expressionsvektoren für AML1, AMLl- ETO, GFP, GFP-M&M und GFP M&M in verschiedenen Kombinationen transfiziert. Um das klonale Wachstum zu untersuchen, wurden die transfizierten Zellen am Tag nach der Elektroporation über eine Gradienten-Zentrifugation separiert und in einer Konzentration von 1 x 105 lebenden Zellen pro 35 mm Platte in 1 ml eines Kultur-Mixes ausgesiedelt. Dieser Mix bestand aus "Isocove modifiziertes Dulbecco Medium" (IMDM, Life Technologies, Grand Island, N.Y.), 1% Methylzellulose, 20% FCS, IL- 3 (lng/ml) und 0,6 mg/dl G418. Alle Versuche wurden dreifach angesetzt und die Kolonien am Tag 10 gezählt. Aus drei unabhängigen Experimenten (für die Kasumi Zellen zwei Experimente) wurden Mittelwerte und Standardfehler berechnet.
8.Apoptoseassay:
32Dcl3 Zellen wurden transient mit den Expressionsvektoren für GFP, GFP-M&M und AMLl-ETO in verschiedenen Kombinationen transfiziert. Nach 24 Stunden wurden die GFP-positiven Zellen mittels Durchflußzytometrie aus den gesamten Zellen heraussortiert und weiter untersucht . Der Prozentsatz der apoptotischen Zellen innerhalb der GFP positiven Zellen wurde mittels eines TUNEL Assays (APO-BrdU Kit der Firma Pharmigen) bestimmt, wobei die Experimente nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt wurden. Die Ergebnisse von einem der drei unabhängigen Experimente mit ähnlichen Ergebnissen werden gezeigt.
9. Retrovirale Transduktion von primären Knochenmarkzellen:
Aus den Femura sechs Monate alter BALB/c-Mäusen wurden Knochenmarkzellen entnommen und in RPMI1640-Medium unter Zugabe von murinem IL-3 kultiviert. Phoenix-Zellen wurden mit Hilfe von Lipofectamin Plus (Invitrogen) transient mit GFP oder GFP-M&M in MSCV2.2 transfiziert. Nach 24 Stunden wurde das Medium gewechselt. 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Überstände geerntet, gefiltert (0.45μm) und nach
Hinzufügen von 4μg/ml Polybrene zu den Knochenmarkzellen gegeben. Dann wurden die Zellen 45 min bei 2000g zentrifugiert und 2 Stunden bei 37°C inkubiert und anschließend ein zweites Mal wie beschrieben transduziert . Zwei weitere Runden der Transduktion erfolgten am nächsten Tag.
24 Stunden nach dem Ende der Transduktion wurde in den Zellen mit Hilfe der Durchflusszytometrie die Expression von GFP und KIT (anti-CD117-PE von PharMingen) und die Apoptose mit Annexin V-PE (PharMingen) gemäß der Protokolle des Herstellers untersucht .
Beispiel 1 Klonierung des GFP-M&M und Expression in Cos-Zellen
Ein Fusionsprotein aus dem "enhanced green fluorescent protein" (GFP, für Nachweiszwecke; kodiert von den Nukleotiden 91-813 der SEQ ID NO: 11), der DNA Bindungsdomäne des murinen c-myb (die Nukleotide 193-594 der SEQ ID NO: 13 kodieren für die Aminosäurereste 65-198 des murinen c-myb; vgl. Sakura et al., 1989, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, Vol.86, S. 5758-61) und der AML1- Bindungsdomäne des humanen Myeloid elf like Faktors, MEF (die Nukleotide 251-618 der SEQ ID:12 kodieren für die Aminosäurereste 87-206 des humanen MEF; vgl. Mao S. et al . , 1999, Mol.Cell.Biol., Vol.19, S.3635-44)) wurde konstruiert.
Der Transkriptionsfaktor c-myb ist dafür bekannt, daß er für eine normale Hämatopoese und das Überleben der hämatopoetischen Zellen essentiell ist (Mucenski et al., 1991, Cell, Vol.65, S.677-89). Es konnte gezeigt werden, daß die Hemmung des c-myb durch Antisense- Strategien oder c-myb Knock out Mäuse nicht in der Lage sind, eine normale Hämatopoese auszubilden (Ratajczak et al., 1992, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, Vol.89, S.11823-7).
Als zweiter Teil des Chimären Proteins wurde die AMLl Bindungsdomäne des MEF (Myeloid like ELF factor) verwendet. Die Aminosäuren 87-206 des MEF binden stark an AMLl und AMLl-ETO in vivo und in vitro (Mao S. et al., 1999, Mol.Cell.Biol., Vol.19, S.3635-44). Alle drei Domänen wurden in Leserichtung in den Expressionsvektor pcDNA3.1 kloniert. Dieses Konstrukt wurde als GFP-M&M bezeichnet (Figur lb) . Für Kontrollzwecke wurde eine Deletionsmutante, welche die ersten 53 Aminosäuren der DNA Bindungsdomäne des c-myb nicht aufweist, hergestellt. Die Deletionsmutante wurde als GFP- M&M bezeichnet.
Die Expression der rekombinanten Proteine wurde nach transienter Transfektion in Cos7-Zellen mittels Immunoblot-Nachweisverfahren unter Verwendung von Anti-GFP-Antikörper analysiert (GFP alleine 35 kDa, GFP- M&M 80 kDA; GFP-M&M 85 kDa; Fig. lc) .
Beispiel 2 Analyse der Bindung von GFP-M&M an myb Bindungsstellen
Um die Interaktion des GFP-M&M mit myb DNA Bindungsstellen zu analysieren, wurden elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assays durchgeführt (vgl. Figur 2). Dafür wurden nukleare Extrakte transient transfizierter Cos7-Zellen hergestellt. Ein doppelsträngiges myb-Consensus Oligonucleotid diente als Ziel-DNA. Diese Experimente zeigten, daß GFP-M&M ähnlich wie c-myb spezifisch an myb DNA-Bindungsstellen bindet. AMLl-ETO alleine wies keine Bindung an die myb-Bindungsstellen auf, aber GFP-M&M führte zu einer Bindung von AMLl-ETO an die DNA. Dies resultierte in einem Supershift des Komplexes bestehend aus DNA, GFP-M&M und AMLl-ETO (Fig.2) .
Beispiel 3 GFP-M&M bindet AMLl-ETO an den endogenen c-Kit Promotor
Die Bindung des GFP-M&M und die Bindung von AMLl-ETO an endogene c-myb Ziel-Promotoren wurde unter Verwendung eines Chromatin Immunpräzipitations-Nachweisverfahrens (ChiP) in KCL22 Zellen analysiert.
Als c-myb abhängiger endogener Promotor wurde der c-kit Promotor gewählt. Als Positivkontrolle wurde die nachgewiesene Bindung von AMLl-ETO an den pl4ARF Promotor analysiert (Linggi et al . , Nature Medicine, 8 (7), Juli 2002)). Eine mit FLAG markierte Form des AMLl-ETO wurde in Kombination mit GFP oder GFP-M&M in KCL22 Zellen exprimiert. Die Transkriptionsfaktoren wurden mit DNA unter Verwendung von Formaldehyd vernetzt. Nach Zell-Lyse und DNA Fragmentierung wurden DNA/AML1-ETO Komplexe unter Verwendung eines anti-FLAG-Antikörpers oder für Kontrollzwecke unspezifischer Antikörper immunprazipitiert. Die Vernetzung wurde aufgehoben und die Gegenwart der c-kit- und pl4ARF-Promotor DNA Sequenz wurde mittels PCR analysiert. Die Sequenz des c-kit Promotors war in den ChiP-Proben der KCL22 Zellen, die mit AML-ETO und GFP transfiziert worden waren, nicht nachweisbar.
In Gegenwart des GFP-M&M wurden jedoch die c-kit Promotor- Sequenzen mit AMLl-ETO immunprazipitiert (Fig.3) . Im Gegensatz dazu wurde die pl4ARF Promotorsequenz in Immunkomplexen aus KCL22 Zellen nachgewiesen, die mit AMLl-ETO und GFP transfiziert worden waren. Die Sequenz wurde nicht in Gegenwart von AMLl-ETO und GFP- M&M nachgewiesen (Fig.3) .
Diese Ergebnisse zeigen, daß GFP-M&M AMLl-ETO an den endogenen c- myb abhängigen Promotor c-kit in vivo binden kann.
Beispiel 4 Hemmung von myb abhängigen Promotoren in Gegenwart von GFP-M&M und AMLl-ETO GFP-M&M bindet an myb abhängige Promotoren, bildet mit AMLl-ETO (soweit vorhanden) einen Komplex und inhibiert dadurch die Genexpession.
Als weiterer Nachweis wurden Luziferase-Assays durchgeführt, wobei das Luziferase-Gen unter der Kontrolle eines minimalen Thymidin- Kinase-Promotors mit drei zusätzlichen myb DNA-Bindungsstellen stand (Ziebold et al., 1997, Curr.Biol., Vol.7, S. 253-60). KCL22 Zellen wurden mit den Reporterkonstrukten und GFP, GFP-M&M und AMLl-ETO in verschiedenen Kombinationen transfiziert (Fig.4) . Keines der Proteine war alleine in der Lage, die Luziferase- Aktivität wesentlich zu beeinflussen. Zellen, die GFP-M&M und AMLl-ETO zusammen exprimieren, zeigten jedoch eine mehr als 5- fache Hemmung der Promotor-Aktivität (Fig.4). Anschließend wurde analysiert, ob die funktionale Interaktion zwischen GFP-M&M und myb DNA Bindungsstellen für die Hemmung der Luziferase-Aktivität mittels GFP-M&M in AMLl-ETO positiven Zellen notwendig war. Die Mutation der DNA Bindungsstelle in GFP-ΔM&M hemmt die DNA Bindung des rekombinanten Proteins, wobei jedoch die Expression des Proteins nicht verändert wird (Figur lb) . Weder die Expression von GFP-ΔM&M alleine, noch die Expression von GFP-ΔM&M und AMLl-ETO zusammen hemmten die Luziferase-Aktivität.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die GFP-M&M Bindung an die DNA für die Repression des myb abhängigen Gens in Gegenwart von AMLl-ETO notwendig ist (Fig.4).
Beispiel 5 Hemmung des Koloniewachstums durch GFP-M&M in AMLl- ETO exprimierenden Zellen
Die Aktivität des Transkriptionsfaktors Myb und die Expression der myb abhängigen Gene sind für das Wachstum und die Proliferation hämatopoetischer Zellen essentiell (White et al., 2000, Oncogene, Vol.19, S.1196-205). Daher wurde die Wirkung von GFP-M&M auf die Proliferation und Überlebensrate der AMLl-ETO enthaltenden Zellen analysiert .
Zunächst wurde die Fähigkeit der transfizierten hämatopoetischen 32D Zellen zur Kolonienbildung untersucht. Das Koloniewachstum wurde in Zellen, die mit AMLl, GFP-M&M oder AMLl und GFP-M&M transfiziert worden waren, nicht gehemmt.
Zellen, die mit AMLl-ETO alleine transfiziert worden waren, zeigten eine sechsfache Hemmung des Kolonienwachstums, welche wahrscheinlich auf den toxischen Effekt des AMLl-ETO selbst zurückzuführen ist (Muller et al., Mol. Cell.Bio. , 2000, Vol.20., S.3316-29). Transfektion der 32D Zellen mit GFP-M&M in Gegenwart von AMLl-ETO reduzierte jedoch das Wachstum der Kolonien etwa um das 60fache (Figur 5a und b) . Im Vergleich zu GFP-M&M und GFP-ΔM&M in Kolonie-Assays wurde festgestellt, daß eine gemeinsame Expression von GFP-M&M und AMLl-ETO die relative Anzahl der Kolonien um mehr als 80% reduzierte. Im Gegensatz dazu inhibierten GFP-ΔM&M und AMLl-ETO nicht das Kolonienwachstum (Fig.5c) . Die letztere Beobachtung zeigt, daß eine funktionale Interaktion zwischen GFP-M&M und myb DNA-Bindungsstellen für die Hemmung des Kolonienwachstums in AMLl-ETO positiven Zellen notwendig ist.
Neben den Wirkungen von GFP-M&M in AMLl-ETO transfizierten Zellen wurde auch die Aktivität von GFP-M&M in t(8;21) positiven Kasumi-1 Leukämiezellen untersucht. Das Koloniewachstum wurde nach Transfektion mittels GFP-M&M im Vergleich zu Zellen, die mit GFP- pcDNA3.1 alleine (Kontrolle) transfiziert worden waren, um das 12fache reduziert (Fig.5d) .
Beispiel 6 Induktion der Apoptose durch GFP-M&M in AMLl-ETO enthaltenden Zellen Hämatopoetische Zellen, die keine c-myb Aktivität aufweisen, unterliegen der Apoptose (Taylor et al., 1996, Genes Dev. , Vol.10, S.2732-44) .
Um die Wirkung von GFP-M&M in AMLl-ETO positiven Zellen und deren Einfluß auf die Apoptose zu untersuchen, wurde die Gegenwart von DNA Strangbrüchen mittels TUNEL-Assay untersucht. 32D-Zellen wurden mit GFP, AMLl-ETO oder GFP-M&M oder mit einer Kombination aus AMLl-ETO und GFP-M&M transfiziert. Nach 24 Stunden befanden sich etwa 10% der Zellen, die GFP, AMLl-ETO oder GFP-M&M allein exprimieren, in Apoptose. Im Gegensatz dazu betrug der Prozentsatz apoptotischer Zellen unter den Zellen, die sowohl AMLl-ETO als auch GFP-M&M exprimierten, 39%. Dies entspricht einer vierfachen Zunahme der Apoptoserate (Fig.6a und b) .
Beispiel 7 In Zellen ohne AMLl-ETO werden MYB-abhängige
Promotoren in vivo nicht von GFP-M&M reprimiert
Um zu zeigen, dass GFP-M&M in Abwesenheit von AMLl-ETO die MYB- abhängigen Promotoren in vivo nicht reprimiert, wurden primäre Maus-Knochenmarkzellen mit GFP oder GFP-M&M retroviral transduziert . Hierdurch kam es in den GFP-positiven Zellen zu keinem signifikanten Unterschied in der Expression von KIT (Fig.7) und der Rate der Apoptose. Dies zeigt, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen keine spezifische Repression der Transkription von MYB-abhängigen Promotoren in gesunden Zellen induzieren.

Claims

Patentansprüche
1. Verbindung, die Bindungsaffinität für ein Tumor spezifisches Molekül aufweist und eine Dyslokalisation des Tumor-spezifischen Moleküls bewirken kann.
2. Verbindung gemäß ein Anspruch 1, in der die
Dyslokalisation das Wachstum Tumor-spezifischer Zellen inhibiert .
3. Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2 , in der die
Dyslokalisation in Tumor-spezifischen Zellen Apoptose induziert.
4. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 , die ein
Peptid, Oligopeptid, Protein, Fusionsprotein, oder ein organisches Molekül mit einem Molekulargewicht von < 5000, < 1000 oder < 500 ist.
5. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, in der das
Tumor-spezifische Molekül ein Peptid, Oligopeptid, Protein, Fusionsprotein, RNA oder DNA ist.
6. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, die eine
Bindungsaffinität in 10"5 - 10~12, und besonders bevorzugt von 10"7 bis 10"9 aufweist .
7. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, in der das
Tumor-spezifische Molekül in gesunden Zellen nicht oder in anderer Form vorliegt.
8. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, in der das
Tumor-spezifische Molekül ein Fusionsprotein ist.
9. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, in der das
Tumor-spezifische Molekül AMLl-ETO ist.
10. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, in der das
Tumor-spezifische Molekül eine DNA-Bindungsdomäne, ein Signalpeptid, Kinaseaktivität, Chromatinmodulatorische Eigenschaften, Protein-Proteininteraktionsdomänen oder Transkriptionelle Eigenschaften aufweist.
11. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, in der die
Dyslokalisation das Tumor-spezifische Molekül an eine Nukleinsäuresequenz bindet, welche die Transkription eines Gens reguliert.
12. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, in der die
Dyslokalisation das Tumor-spezifische Molekül an eine Nukleinsäuresequenz bindet, welche die Transkription eines Gens reguliert, wodurch die Transkription des Gens aktiviert oder inhibiert wird.
13. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, in der die
Verbindung die Peptidsequenz der c-myb DNA-Bindungsdomäne umfaßt .
14. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, in der die
Verbindung die Peptidsequenz der AML-1-Bindungs-domäne des "myeloid elf like factor" umfaßt.
15. Verbindung gemäß Anspruch 13 oder 14, in der die
Verbindung die Peptidsequenz der c-myb DNA-Bindungsdomäne und die Peptidsequenz der AML-1-Bindungsdomäne des "myeloid elf like factor" umfaßt .
16. Verbindung gemäß Anspruch 15, in der die Verbindung die in
SEQ ID NO: 1 gezeigte Sequenz aufweist.
17. Nukleinsaure, die für ein Peptid oder Protein gemäß einem der Ansprüche 2 bis 16 kodiert.
18. Nukleinsaure gemäß Anspruch 17, die eine DNA oder RNA ist.
19. Vektor, der eine Nukleinsaure gemäß einem der Ansprüche 17 oder 18 umfaßt.
20. Wirtszelle, die eine Nukleinsaure gemäß einem der
Ansprüche 17 oder 18 oder einen Vektor gemäß Anspruch 19 aufweist .
21. Arzneimittel, das eine Verbindung gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 16, eine Nukleinsaure gemäß einem der Ansprüche 17 oder 18, einen Vektor gemäß Anspruch 19 oder eine Wirtszelle gemäß Anspruch 20 umfaßt.
22. Arzneimittel gemäß Anspruch 21, das ferner einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
23. Arzneimittel gemäß Anspruch 21 oder 22, das zur oralen, intravenösen oder intramuskulären Verabreichung formuliert ist.
24. Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, einer Nukleinsaure gemäß einem der Ansprüche 17 oder 18, eines Vektors gemäß Anspruch 19 oder einer Wirtszelle gemäß Anspruch 20 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumoren.
25. Verwendung gemäß Anspruch 24, wobei der Tumor Leukämie, insbesondere Akute Myeloische Leukämie ist.
26. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, bei dem man das Peptid oder Protein rekombinant exprimiert oder durch Proteinsynthese gewinnt .
27. Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die zur
Behandlung von Tumoren geeignet ist, bei dem man:
(a) ein Tumor-spezifisches Molekül identifiziert;
(b) eine Verbindung identifiziert, die eine
Bindungsaffinität für das Tumor-spezifische Molekül aufweist und eine Dyslokalisation des Tumorspezifischen Moleküls bewirken kann.
28. Verfahren gemäß Anspruch 27, bei dem man solche
Verbindungen identifiziert, in denen die Dyslokalisation das Wachstum Tumor- spezifischer Zellen inhibiert oder in Tumor-spezifischen Zellen Apoptose induziert.
29. Verfahren gemäß Anspruch 27 oder 28, bei dem man das
Tumor-spezifische Molekül mittels Micoarray-Analysen, 2D- Proteingelelektrophoresen mit nachfolgender massenspek- trometrischer Identifizierung oder einer Kombination der genannten Verfahren identifiziert.
30. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 27 bis 29, bei dem die
Verbindung, welche eine Bindungsaffinität für das Tumorspezifische Molekül aufweist und eine Dyslokalisation des Tumor-spezifischen Moleküls bewirken kann, ein Protein, eine RNA eine DNA oder eine organisches Verbindung ist.
31. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 27 bis 30, bei dem man die Verbindung, welche eine Bindungsaffinität für das Tumor-spezifische Molekül aufweist und eine Dyslokalisation des Tumor-spezifischen Moleküls bewirken kann, mittels Hochdurchsatz-Screening-Verfahren identifiziert .
32. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 27 bis 29, bei dem die
Verbindung, welche eine Bindungsaffinität für das Tumorspezifische Molekül aufweist und eine Dyslokalisation des Tumor-spezifischen Moleküls bewirken kann, aus zwei Teilen zusammengesetzt wurde.
33. Verfahren gemäß Anspruch 32, bei dem ein Teil der
Verbindung eine Bindungsaffinität für das Tumorspezifische Molekül aufweist und der zweite Teil die Dyslokalisation des Tumor-spezifischen Moleküls bewirken kann.
34. Verfahren gemäß Anspruch 32 oder 33, bei dem die zwei
Teile in getrennten Screening-Verfahren identifiziert werden.
35. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, Schritte umfassend, bei denen man:
(a) eine Verbindung, die zur Behandlung von Tumoren geeignet ist, mittels eines Verfahrens gemäß den Ansprüchen 27 bis 33 identifiziert;
(b) die Verbindung synthetisch oder rekombinant herstellt; und
(c) die Verbindung zu einem Arzneimittel formuliert.
36. Verfahren gemäß Anspruch 35, bei dem das Arzneimittel zur
Behandlung von Tumoren, beispielsweise zur Behandlung von Leukämie und insbesondere zur Behandlung Akuter Myeloischer Leukämie geeignet ist .
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