WO2008128526A9 - Verwendung von egfl7 zur modulation von stammzellen - Google Patents

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Frank Bicker
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Mirko Schmidt
Ivan Dikic
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Definitions

  • the invention relates to the use of polynucleotides encoding the EGFL7 polypeptide, and to the use of EGFL7 polypeptides and / or modulators of EGFL7 for the modulation of stem cells. Furthermore, the invention relates to corresponding pharmaceutical compositions for the modulation of stem cells.
  • the development of the brain is based on a well-regulated interaction of various factors that control the proliferation and differentiation of neuronal stem cells in the developing embryo.
  • the adult brain has limited potential for nerve cell regeneration and cell loss usually can not be compensated. This finding has until recently been explained by the fact that the adult brain does not contain stem cells that allow regeneration of lost or damaged nerve cells.
  • the Notch proteins comprise a group of membrane receptors that are part of a nuclear signaling pathway that regulates the expression of specific genes.
  • the Notch signal cascade is present in all metazoans studied so far. In mammals four different Notch receptors are distinguished, Notch 1 to Notch 4.
  • EGFL7 has been identified as such a molecule known from US 2003/0166907 A1 under the name Zneul. In this paper, it has been suggested for EGFL7 that it could possibly interact with the Notch receptor (see paragraphs [0096] to [0098] of US 2003/0166907 A1). There was no evidence for this speculation. In particular, the use of EGFL7 to modulate stem cells has not been described.
  • the present invention provides the use of an isolated polynucleotide for the modulation of stem cells, wherein the polynucleotide encodes at least one of the following polynucleotides:
  • polypeptide which has at least 80% sequence identity to the EGFL7 polypeptide (SEQ ID NO 2) or its equivalent polypeptide fragments
  • fragments having at least 80% sequence identity also having an effect equivalent to the EGFL7 polypeptide.
  • polypeptide that can interact with one of the above-mentioned polypeptides.
  • the polynucleotide according to SEQ ID NO 1 encodes the EGFL7 polypeptide.
  • the effect of the EGFL7 polypeptide will be apparent to those skilled in the art, in particular from the experimental results presented in the examples and the representation contained herein, in particular with respect to the protein Notch.
  • the term “equivalent” includes all similar to the effect of EGFL7 qualitatively similar, without being limited to a particular quantity in the effect.
  • a polypeptide "interferes with" another polypeptide when it binds the other polypeptide or inhibit activation or inactivation of another protein.
  • the above-mentioned sequence identity to the EGFL7 polypeptide or its equivalent polypeptide fragments is 85%, 88% or 90%, more preferably 95% to the EGFL7 polypeptide or its fragments.
  • the inhibiting polypeptide comprises an EGF-like domain or a fragment thereof.
  • the inhibiting polypeptide may comprise an EGF-like domain of a Notch receptor or a fragment thereof.
  • the inhibiting polypeptide is a polypeptide according to SEQ ID NO 7 to 10.
  • the modulation of the stem cells relates in particular to their growth (proliferation) and / or their differentiation.
  • the stem cells are neural stem cells of the central and / or peripheral nervous system.
  • the present invention further provides the use of an isolated polypeptide and / or a modulator for modulating stem cells, in particular neural stem cells of the central and / or peripheral nervous system, wherein the polypeptide is selected from the group consisting of:
  • Polypeptides which have at least one sequence identity of the said EGFL7 polypeptide or its polypeptide fragments of 80%, preferably 85% or 90%, particularly preferably 95%, and which have the same effect with respect to the EGFL7 polypeptide. This includes in particular the binding of EGFL7 to Notch and the activation of the signal cascade.
  • Said modulator is selected from a group consisting of activators and inhibitors of EGFL7 polypeptide action.
  • the polypeptide fragments of EGFL7 should have a length of 10 to 240 amino acid residues. Preferred are polypeptide fragments having a length of 20 to 200 amino acid residues, more preferred are polypeptide fragments of 50 to 150 amino acid residues in length.
  • the effect of the EGFL7 polypeptide on the Notch receptor is mediated, in particular, over certain domains of the EGFL7 polypeptide (see Fig. 3 and the description thereof).
  • the polypeptide fragments used comprise specific domains.
  • EMI domain which mediates the binding to the Notch receptor (AS 27 to 104 of the human EGFL7, SEQ ID NO 2).
  • this EMI domain is the sequence Y R T I Y R T A Y R R S P G contained (AS 64 to 78 of the human EGFL7, SEQ ID NO 2), which correlates with the sequence contained in known Notch ligands (Y) YYG. Accordingly, the EMI domain should have the sequence YxxxYxxxYxxxxG, where x is any suitable amino acid.
  • the following polypeptide fragments of the EGFL7 polypeptide can be used to inhibit the Notch receptor: the signal peptide (amino acids (AS) 1 to 23 of EGFL7, SEQ ID NO 3), the EMI domain (aa 27 to 104 of EGFL7, SEQ ID NO 4), the EGF-like domain 1 (AS 103 to 135 of EGFL7, SEQ ID NO 5) or the EGF-like domain 2 (AS 137 to 177 of EGFL7, SEQ ID NO 6).
  • the signal peptide amino acids (AS) 1 to 23 of EGFL7, SEQ ID NO 3
  • the EMI domain a 27 to 104 of EGFL7, SEQ ID NO 4
  • the EGF-like domain 1 AS 103 to 135 of EGFL7, SEQ ID NO 5
  • EGF-like domain 2 AS 137 to 177 of EGFL7, SEQ ID NO 6
  • the EGF-like domain 9-12 of the Notch receptors 1, 2, and 4 (SEQ ID NO 7, 8, 10) and / or the EGF-like domain 8-11 of the Notch receptor 3 (FIG. SEQ ID NO 9) used.
  • the respective EGF-like domain of the Notch receptor binds to EGFL7 and thus prevents its interaction with the Notch receptor. This allows the Notch receptor to be activated by other ligands.
  • an activator can be used to activate EGFL7.
  • Such activators are cytokines, especially those selected from the group consisting from vascular endothelial growth factors (VEGF), fibroblast growth factors (FGF), platelet-derived growth factors (PDGF).
  • VEGF vascular endothelial growth factors
  • FGF fibroblast growth factors
  • PDGF platelet-derived growth factors
  • Chemokines, interleukins and hypoxia are also activators.
  • the soluble EGFL7 has an inhibitory effect on the Notch receptor.
  • a suitable inhibitor of EGFL7 may be used.
  • Suitable such inhibitors are monoclonal or polyclonal antibodies whose method of preparation is known to the person skilled in the art. Also suitable are siRNA molecules.
  • the cDNA sequence of the EGFL7 (SEQ ID NO 1) can be cloned into a suitable adenovirus and expressed as an antisense molecule (compare Figures 7 and 8).
  • antisense peptides and antagonists can be used as inhibitors, for example Notch activating molecules can be used to reduce the expression of EGFL7.
  • the activation of the Notch signaling cascade leads to increased differentiation of the neural stem cells into astrocytes, whereas the differentiation of neurons and oligodendrocytes is reduced. Accordingly, the use of the invention can be used to control the formation of neurons and / or oligodendrocytes, both in vivo and in vitro.
  • the use according to the invention can be used for the therapy of a number of disorders of the nervous system, in particular for the treatment of degenerative diseases.
  • diseases include dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, multiple sclerosis, Creutzfeldt-Jakob's disease, Lewy body disease, lobar atrophy, chorea Huntington's and Wilson's disease.
  • said substances may be used to treat or stimulate neurogenesis in the event of injury or damage to the nervous system. Fall under it For example, stroke, paraplegia, as well as the damage caused by metabolic diseases, neurotoxins or HIV.
  • the use of said substances also includes the manipulation of neural stem cells in vitro, such as in stem cell therapy.
  • the present invention also encompasses pharmaceutical compositions for modulating stem cells, in particular neural stem cells of the central and / or peripheral nervous system.
  • Such pharmaceutical compositions contain a polynucleotide as described above.
  • Such a polynucleotide may be in the form of a plasmid, cosmid or virus and introduced into a cell by known transfection methods such as lipofection or ballistic transfer.
  • the pharmaceutical composition may also contain a polypeptide and / or a modulator as described above.
  • the present invention also relates to a method for modulating stem cells.
  • neural stem cells are affected with a polypeptide and / or a modulator in their differentiation.
  • the polypeptide used here is selected from the group consisting of: a) an EGFL7 polypeptide (SEQ ID NO 2), and its equivalent polypeptide fragments, b) polypeptides having at least 80% sequence identity to the polypeptide or polypeptide fragments mentioned under a) and which are equally active to the EGFL7 polypeptide, and c) polypeptides which inhibit interaction with a polypeptide mentioned under a) and b); and wherein the modulator is selected from the group consisting of activators and inhibitors of EGFL7 polypeptide activity.
  • the present invention further provides a method of differentiating neural stem cells into neurons and / or oligodendrocytes.
  • the method is characterized by the administration of the EGFL7 polypeptide or its activation.
  • the activation of EGFL7 can take place in one of the ways described above and resulting from the examples.
  • the differentiation of neural stem cells into astrocytes is achieved.
  • the reduction or inhibition of EGFL7 can take place in one of the ways described above and resulting from the examples.
  • the described invention relates to the modulation of mammalian stem cells, particularly stem cells from mice, rats, monkeys and humans.
  • the stem cells modulated according to the invention can be administered to a patient within the scope of a therapy or introduced into the body of a patient.
  • This patient may be a mammal, in particular a mouse, a rat, a monkey or a human.
  • the invention further relates to a kit for carrying out a use or carrying out a method of the type described here.
  • a kit comprises in particular one of the substances described here for the modulation of stem cells.
  • FIG. 1 It has been shown by means of a Yeast Two-Hybrid System, bacterial EGFL7-GST fusion proteins (GST pull-down assays) and coimmunoprecipitations that EGFL7 binds to Notch receptors. In this experiment, EGFL7 binds to Notch 1 to 3 after these proteins were overexpressed in HEK293 cells.
  • FIG. 2 The interaction of EGFL7 with Notch 1 to Notch 3 was verified with endogenously expressed receptors after recombinantly purified EGFL7 (His-EGFL7) was administered into the cell medium. After coimmunoprecipitation, an interaction between Notch 1 to Notch 3 and EGFL7 was found (HUVEC: human endothelial cells, MRC5: human fibroblasts, hAoSMC: human smooth muscle cells).
  • Figure 3 Analysis of the binding site in EGFL7 by various EGFL7-GFP fusion proteins revealed that the EMI domain of EGFL7 mediates particularly strong binding to Notch receptors and that the EGF-like domains 1 and 2 can contribute to binding, but weaker alone tie. All three domains together mediate binding to Notch receptors, as demonstrated by the Yeast two-hybrid system and GST pull-down assays.
  • the signal peptide (SS) of EGFL7 is important for optimal binding to Notch receptors. Presumably, EGFL7 and Notch are transported within the cell via the same synthetic route where they meet and interact.
  • FIG. 4 By coimmunoprecipitation of EGFL7 and Notch-GFP fusion proteins, overexpression in HEK293 cells revealed that EGFL7 within the Notch receptors bind to the EGF-like domains 9-12 (in notch 1, 2 and 4) and 8-11, respectively (in Notch 3) binds. This area is particularly important for the activation of Notch receptors.
  • FIG. 5 Measurement of the activation of Notch receptors by activation of reporter genes (luciferase, activated by TP1, Hes1 and Hes5 promoters), as well as Western blots specific for activated Notch 1, showed that EGFL7 is an antagonist for the Jagged by the known Notch agonists and 2 induced Notch 1 activation. This is consistent with the fact that known Notch agonists are membrane-bound molecules and soluble Notch ligands act as antagonists.
  • FIG. 6 The self-renewal of neural stem cells in culture in the form of so-called neurospheres depends on an intact interaction of Jagged 1 and Notch 1. Figure 5 shows that this interface is disturbed with EGFL7.
  • EGFL7 in neurospheres (after infection with various EGFL7-encoding adenoviruses) leads to a reduction in self-renewal of neural stem cells (measured as secondary spheres%).
  • Knockdown of endogenous EGFL7 with an antisense construct (EGFL7 as) has the opposite effect.
  • Chemical inhibition of Notch signals occurs by the gamma-secretase inhibitor DAPT (N- [N- (3,5-difluorophenacetyl) -L-alanyl] -s-phenylglycine t-butyl ester.
  • FIG. 7 Further investigations showed that the finding shown in FIG. 6 is due to a reduced proliferation (measured by BrdU incorporation into the DNA of proliferating cells) of the neural stem cells. The apoptosis and necrosis of infected neural stem cells was not altered, so that a toxic effect of EGFL7 or the adenoviruses can be excluded.
  • FIG. 8 Infection of neural stem cells with adenoviral constructs and measurement of the specific activation of Notch 1 signaling by the quantitative PCR of the specific gene product Hes5 showed that EGFL7 also acts as an antagonist of Notch signaling in the neurosphere model.
  • FIG. 9 With the identical samples from FIG. 8 and quantitative PCR of murine EGFL7 (mEGFL7, SEQ ID NO 11) in the neurospheres, it was shown conversely that Notch downregulates EGFL7 signals. If the Notch signal is blocked by the inhibitor DAPT, EGFL7 production increases by a factor of 5.5. This implies a negative feedback loop in which Notch receptors block the production of the own inhibitor.
  • Figure 10 Quantitative PCR of murine EGFL7 in various tissues of the mouse brain shows a large amount of EGFL7 RNA in the hippocampus and cortex.
  • SVZ subventricular zone
  • the amount decreases strongly and is in neurospheres prepared from SVZ, barely detectable.
  • the concentration of EGFL7 should be particularly low there, which is the case. This result indicates that the previous observations are physiologically relevant.
  • EOMA positive control, lots of mEGFL7, fibroblasts MEFs 3 NIH 3T3, little mEGFL7, M6363 mouse adenocarcinoma, negative control, no mEGFL7.
  • Figure 11 The concept shown is known from the literature (Louvi and Artavanis-Tsakonas Notch signaling in vertebrate neural development, Nat Rev Neurosci., 2006, 7 (2): 93-102), which also refers to the differentiation of neural stem cells in Neurospheres is transferable. An increased Notch signal leads to the formation of more astrocytes and fewer neurons as well as fewer oligodendrocytes under differentiation conditions.
  • FIG. 12 The concept according to FIG. 11 was examined as follows. Coverslips were coated with 10 ⁇ g / ml bovine serum albumin (left bar of a gray shade) or 10 ⁇ g / ml recombinantly produced EGFL7 (respective right bar of a gray shade). Young neurospheres were spread on the coated coverslips and stimulated to differentiate. After staining of specific markers it was counted how many astrocytes (marker GFAP), how many neurons (marker NF 160) and how many oligodendrocytes (marker 04) were formed. The EGFL7-coated cover slips of differentiated neural stem cells formed significantly more neurons and oligodendrocytes but fewer astrocytes. This experiment demonstrates that EGFL7 affects the differentiation of neural stem cells through inhibition of Notch signaling. Examples
  • EGFL7 in Notch 3 binds to the extracellular region required for the activation of the receptor (the so-called DSL domain). After coimmunoprecipitation of endogenous and recombinant Notch, respectively the DSL domains from Notch, it could be verified that EGFL7 binds to all four Notch receptors. It has also been found that in EGFL7 the so-called EMI domain mediates binding and that the two EGF-like domains following the EMI domain enhance binding.
  • neural stem cells These so-called neurospheres have been isolated and selected from mouse brains, as their self-renewal in cell culture depends on an intact Jagged 1-Notch 1 interaction. If this bond is interrupted, the neural stem cells renew poorly or not at all in the neurosphere model.
  • HEK293 cells were transfected and lysed after two days in ice-cold Triton X-100 lysis buffer (50 mmol / l HEPES (pH 7.4), 150 mmol / l NaCl, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 1.5 mmol / 1 MgC12 5 1 mmol / 1 EDTA, 1 mmol / 1 EGTA, 1 mmol / 1 sodium orthovanadate, 20 mmol / 1 NaF, 1 mmol / 1 PMSF, 10 ⁇ g / ml aprotinin, 2 ⁇ g / ml leupeptin, and 10 ⁇ mol / 1 ZnCl 2 ).
  • Triton X-100 lysis buffer 50 mmol / l HEPES (pH 7.4), 150 mmol / l NaCl, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 1.5 mmol
  • the lysates were purified at 4 ° C by centrifugation at 16200 g for 20 minutes and then incubated for 2 hours at 4 ° C with rotation with antibody. Protein- antibody complexes were detected by incubation with protein A-agarose (Roche) collected for a further two hours at 4 0 C, then centrifuged and washed three times with lysis buffer. Subsequently, Western blot analyzes were carried out. The precipitates were boiled at 95 ° C for five minutes and the proteins separated by standard SDS-PAGE. The proteins were then blotted onto a nitrocellulose membrane and incubated with the indicated antibodies. Bound antibody complexes were detected by horseradish peroxidase-coupled secondary antibodies and visualized by ECL substrate (Santa Cruz Biotechnolgy).
  • Freshly prepared HUVEC cells from umbilical vein vein were a good source of endogenous Notch 1 receptor and Jagged 1 and 2.
  • Human MRC5 fibroblasts contained significant amounts of Notch 2 receptor and human aortic smooth muscle cells provided detectable levels of Notch 3.
  • Recombinant human EGFL7 from Sf9 insect cells were applied in the medium at a concentration of 1 ⁇ g / ml and after cell lysis Koimmunostoryzipitationsstudien (see above) were performed with specific antibodies.
  • Anti-Erk2 antibody served as a negative control since, like the other antibodies used in this experiment, it was polyclonal and derived from Santa Cruz Biotechnology and derived from the rabbit but against an intracellular control protein. is directed.
  • EGFL7 associated with the tested Notch receptors and Jagged 2 but not Jagged 1 under these conditions.
  • HEK293 cells were transfected with the indicated plasmids plus 200 ng of 12xCBF1 TPl -leaf luciferase reporter gene plasmid pGa981-6 plus 50 ng of pSV- ⁇ -gal control plasmid (from Ursula Zimber-Strobl and Lothar Strobl, but another plasmid known to those skilled in the art may also be used used) by Lipofectamin 2000 (Invitrogen) transfected.
  • Tissue was enzymatically treated by 0.8 mg / ml Papain (Worthington) in Leibovitz L-15 medium with 400 U DNase I and Dissolved 0.5 mmol / 1 EDTA.
  • DMEM neurospheres medium
  • Hams-F12 1 1 + Glutamax, B27 supplement, 10 mmol / 1 HEPES (pH 7.4) and 2 mmol / L-glutamine
  • 20 ng / ml EGF 20 ng / cultured FGF
  • 100 U / ml penicillin 100 ug / ml streptomizine under standard conditions.
  • DAPT Notch signal inhibitor
  • RNA from cell lines and neurospheres were isolated with Trizol (Invitrogen). RNA from tissue samples was isolated using the RNeasy Kit (Qiagen). cDNA (SEQ ID NO 11) was synthesized from 1 ⁇ g of RNA per sample by the Thermoscript RT-PCR system (Invitrogen). For quantitative real-time PCR, the following primers were used (Nyfeler et al., 2005):
  • Freshly dissociated neurosphere cells were transferred to slides 10 ⁇ g / ml BSA or recombinant EGFL7. Then cells were incubated for 12 days in neurosphere medium plus 1% FCS without EGF and FGF. Finally, the cells were fixed in 4% PFA for 10 minutes at RT and incubated with the cell type-specific markers anti-GFAP (astrocytes), anti-beta (III) tubulin and anti-NF 160 (neurons) and anti-O4 (oligodendrocytes). colored. Thereafter, the distribution of each cell type was determined by counting in 15 independent sectors under the fluorescence microscope.

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Polynukleotids zur Modulation von Stammzellen. Erfindungsgemäß kodiert das Polynukleotid für a) ein EGFL7 Polypeptid oder für dessen gleichwirkende Polypeptidfragmente, oder b) ein Polypeptid, das mindestens 80 % Sequenzidentität zu den unter a) genannten Polypeptid oder Polypeptidfragmenten aufweist und welches zu dem EGFL7 Polypeptid gleichwirkend ist, oder c) ein Polypeptid, das mit einem unter a) und b) genannten Polypeptid oder Polypeptidfragment inhibierend in Wechselwirkung tritt.

Description

Verwendung von EGFL7 zur Modulation von Zellen
Die Erfindung betrifft die Verwendung von für das EGFL7 Polypeptid kodierenden Polynukleotiden, sowie die Verwendung von EGFL7 Polypeptiden und/oder von Modulatoren von EGFL7 zur Modulation von Stammzellen. Weiterhin betrifft die Erfindung entsprechende pharmazeutische Zusammensetzungen zur Modulation von Stammzellen.
Hintergrund der Erfindung
Der Entwicklung des Gehirns liegt ein genau reguliertes Zusammenspiel verschiedener Faktoren zu Grunde, die die Proliferation und Differenzierung von neuronalen Stammzellen im sich entwickelnden Embryo kontrollieren. Im Gegensatz dazu besitzt das adulte Gehirn ein lediglich eingeschränktes Potential zur Regeneration von Nervenzellen und Zellverluste können gewöhnlich nicht ausgeglichen werden. Dieser Befund wurde bis vor kurzem damit erklärt, dass das adulte Gehirn keine Stammzellen enthält, die eine Regeneration von verlorenen oder beschädigten Nervenzellen ermöglichen.
In den letzten Jahren konnte nachgewiesen werden, dass auch im adulten Gehirn von Säugetieren ausgehend von Stammzellen eine Neurogenese stattfindet und beschädigte Zellen ersetzt werden können. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass in den Regionen des Gehirns, in denen Stammzellen lokalisiert worden sind, sogenannte Notch Rezeptoren exprimiert werden.
Die Notch Proteine umfassen eine Gruppe von membranständigen Rezeptoren, die Teil eines Signalweges in den Zellkern darstellen, mit dessen Hilfe die Expression bestimmter Gene reguliert wird. Die Notch Signalkaskade ist in allen bisher untersuchten Metazoen vorhanden. In Säugetieren werden vier verschiedene Notch Rezeptoren unterschieden, Notch 1 bis Notch 4.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, Moleküle bereitzustellen, die die Modulation, also das Wachstum (Proliferation) und die Differenzierung von Stammzellen, insbesondere von neuralen Stammzellen beeinflussen. Überraschender Weise wurde als ein derartiges Molekül EGFL7 identifiziert, dass aus der US 2003/0166907 Al unter dem Namen Zneul bekannt ist. In dieser Schrift wurde für EGFL7 gemutmaßt, dass es möglicher Weise mit dem Notch Rezeptor interagieren könnte (siehe Absätze [0096] bis [0098] der US 2003/0166907 Al). Belege für diese Spekulation gab es jedoch nicht. Insbesondere wurde die Verwendung von EGFL7 zur Modulation von Stammzellen nicht beschrieben.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines isolierten Polynukleotids zur Modulation von Stammzellen bereit, wobei das Polynukleotid für mindestens eines der nachfolgend genannten Polynukleotide kodiert:
- Für ein EGFL7 Polypeptid gemäß SEQ ID NO 2 oder für beliebige Polypeptidfragmente des EGFL7 Polypeptids, die die gleiche Wirkung zeitigen, wie das EGFL7 Polypeptid.
- Für ein Polypeptid, welches mindestens 80% Sequenzidentität zu dem EGFL7 Polypeptid (SEQ ID NO 2) oder zu dessen gleichwirkenden Polypeptidfragmenten aufweist, wobei auch die Fragmente mit mindestens 80% Sequenzidentität eine zu dem EGFL7 Polypeptid gleiche Wirkung zeitigen.
- Für ein Polypeptid, dass mit einem der oben genannten Polypeptide inhibierend in Wechselwirkung treten kann.
Das Polynukleotid gemäß SEQ ID NO 1 kodiert für das EGFL7 Polypeptid.
Die Wirkung des EGFL7 Polypeptides ergibt sich für den Fachmann insbesondere aus den in den Beispielen dargestellten Versuchsergebnissen und der hierin enthaltenen Darstellung, insbesondere in Bezug auf das Protein Notch. Der Begriff „gleichwirkend" umfasst dabei alle zur Wirkung von EGFL7 qualitativ ähnlichen Ausprägungen, ohne dabei auf eine bestimmte Quantität in der Wirkung beschränkt zu sein. Ein Polypeptid tritt mit einem anderen Polypeptid „inhibierend in Wechselwirkung", wenn es das andere Polypeptid an der Bindung oder Aktivierung oder Inaktivierung eines weiteren Proteins hindert. In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung beträgt die oben genannte Sequenzidentität zu dem EGFL7 Polypeptid oder zu dessen gleichwirkenden Polypeptidfragmenten 85 %, 88 % oder 90 %, besonders bevorzugt 95 % zu dem EGFL7 Polypeptid oder dessen Fragmenten.
In einer bevorzugten Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verwendung umfasst das inhibierende Polypeptid eine EGF-ähnliche Domäne oder ein Fragment davon. Insbesondere kann das inhibierende Polypeptid eine EGF-ähnliche Domäne eines Notch Rezeptors oder ein Fragment davon umfassen. Bevorzugter Weise ist das inhibierende Polypeptid ein Polypeptid gemäß SEQ ID NO 7 bis 10.
Die Modulation der Stammzellen bezieht sich insbesondere auf deren Wachstum (Proliferation) und/oder deren Differenzierung. Bevorzugter Weise sind die Stammzellen neurale Stammzellen des zentralen und/oder peripheren Nervensystems.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin die Verwendung eines isolierten Polypeptids und/oder eines Modulators zur Modulation von Stammzellen bereit, insbesondere von neuralen Stammzellen des zentralen und/oder peripheren Nervensystems, wobei das Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
Einem EGFL7 Polypeptid gemäß SEQ ID NO 2 und einem beliebigen Polypeptidfrag- ment dieses EGFL7 Polypeptids, wobei alle Polypeptidfragmente in Bezug auf das EGFL7 Polypeptid die gleiche Wirkung zeitigen.
Polypeptide die zu den genannten EGFL7 Polypeptid oder dessen genannten Polypeptidfragmenten mindestens eine Sequenzidentität von 80 %, bevorzugt von 85 % bzw. von 90%, besonders bevorzugt von 95%, aufweisen und welche in Bezug auf das EGFL7 Polypeptid die gleiche Wirkung zeitigen. Dies umfasst insbesondere die Bindung von EGFL7 an Notch und die Aktivierung der Signalkaskade.
- Ein Polypeptid, das mit einem der oben genannten Polypeptide inhibierend in Wechselwirkung treten kann. Dadurch wird insbesondere die Aktivierung der Notch Signalkaskade verhindert.
Der genannte Modulator ist ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Aktivatoren und Inhibitoren der EGFL7 Polypeptidwirkung. Um den Notch Rezeptor in ausreichender Weise zu aktivieren, sollen die Polypeptidfragmente von EGFL7 eine Länge von 10 bis 240 Aminosäurereste aufweisen. Bevorzugt sind Polypeptidfragmente mit einer Länge von 20 bis 200 Aminosäureresten, besonders bevorzugt sind Polypeptidfragmente mit einer Länge von 50 bis 150 Aminosäureresten.
Wie Versuche gezeigt haben, wird die Wirkung des EGFL7 Polypeptids auf den Notch Rezeptor insbesondere über bestimmte Domänen des EGFL7 Polypeptids vermittelt (vgl. Fig. 3 und die Beschreibung hierzu). Damit ein erfindungsgemäßes Polypeptidfragment in ausreichender Weise mit dem Notch Rezeptor interagiert und eine entsprechende Signalkaskade auslöst, ist es daher von Vorteil, wenn die verwendeten Polypeptidfragmente bestimmte Domänen umfassen.
Eine ausreichende Aktivierung des Notch Rezeptors erfolgt insbesondere durch solche Fragmente des EGFL7 Polypeptids, welche die die Bindung zum Notch Rezeptor vermittelnde EMI Domäne umfassen (AS 27 bis 104 des humanen EGFL7, SEQ ID NO 2). In dieser EMI- Domäne ist die Sequenz Y R T I Y R T A Y R R S P G enthalten (AS 64 bis 78 des humanen EGFL7, SEQ ID NO 2), die mit der in bekannten Notch Liganden enthaltenen Sequenz (Y)YYG korreliert. Demgemäß sollte die EMI-Domäne die Sequenz YxxxYxxxYxxxxG aufweisen, wobei x für jede beliebige geeignete Aminosäure steht.
Vorteilhafter Weise können die folgenden Polypeptidfragmente des EGFL7 Polypeptids zur Inhibierung des Notch Rezeptors verwendet werden: das Signalpeptid (Aminosäuren (AS) 1 bis 23 von EGFL7, SEQ ID NO 3), die EMI-Domäne (AS 27 bis 104 von EGFL7, SEQ ID NO 4), die EGF-ähnliche Domäne 1 (AS 103 bis 135 von EGFL7, SEQ ID NO 5) oder die EGF-ähnliche Domäne 2 (AS 137 bis 177 von EGFL7, SEQ ID NO 6).
Zur Inhibierung von EGFL wird vorteilhafter Weise die EGF-ähnliche Domäne 9-12 der Notch Rezeptoren 1, 2, und 4 (SEQ ID NO 7, 8, 10) und/oder die EGF-ähnliche Domäne 8-11 des Notch Rezeptors 3 (SEQ ID NO 9) verwendet. Die jeweilige EGF-ähnliche Domäne des Notch Rezeptors bindet an EGFL7 und verhindert somit seine Wechselwirkung mit dem Notch Rezeptor. Dadurch kann der Notch Rezeptor von anderen Liganden aktiviert werden.
Weiterhin kann zur Aktivierung von EGFL7 ein Aktivator verwendet werden. Derartige Aktivator sind Zytokine, insbesondere solche, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus vasculären endothelialen Wachstumsfaktoren (VEGF), Fibroblasten Wachstumsfaktoren (FGF), Thrombocyten-abgeleiteten Wachstumsfaktoren (PDGF). Auch Chemokine, Inter- leukine und Hypoxia gehören zu den Aktivatoren.
Im Gegensatz zu den membranständigen Liganden des Notch Rezeptors Jagged 1 und Jag- ged 2, die bekannter Weise eine in Bezug auf den Notch Rezeptor aktivierende Wirkung haben, wirkt das lösliche EGFL7 auf den Notch Rezeptor inhibierend. Um die inhibierende Wirkung des EGFL7 Polypeptids zu vermindern bzw. auszuschalten, kann ein geeigneter Inhibitor von EGFL7 verwendet werden.
Als derartige geeignete Inhibitoren kommen monoklonale oder polyklonale Antikörper in Frage, deren Herstellungsweise dem Fachmann bekannt ist. Ebenfalls in Frage kommen siR- NA Moleküle. Zur Inhibition kann beispielsweise die cDNA Sequenz des EGFL7 (SEQ ID NO 1) in einen geeigneten Adenovirus kloniert werden und als antisense Molekül exprimiert werden (vgl. Figuren 7 und 8). Ebenso können antisense Peptide und Antagonisten als Inhibitoren verwendet werden, beispielsweise kann durch Notch aktivierende Moleküle ein Verringerung der Expression von EGFL7 erreicht werden.
Wie die in den Beispielen gezeigten Versuche belegen (siehe z. B. Figur 12), führt die Aktivierung der Notch Signalkaskade zur vermehrten Differenzierung der neuralen Stammzellen in Astrozyten, wohingegen die Ausdifferenzierung von Neuronen und Oligodendrozyten vermindert wird. Demgemäß kann die erfindungsgemäße Verwendung zur Steuerung der Bildung von Neuronen und/oder Oligodendrocyten genutzt werden, und zwar sowohl in vivo als auch in vitro.
Die erfindungsgemäße Verwendung kann zur Therapie von einer Reihe von Erkrankungen des Nervensystems, insbesondere zu Therapie degenerative Erkrankungen eingesetzt werden. Solche Erkrankungen schließen Demenz, Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, Multiple Sklerose, Morbus Creutzfeldt- Jakob, die Lewy-Körperchen-Erkrankung, die Lobärathrophie, Chorea-Huntington und Morbus Wilson mit ein.
Ebenso können die genannten Stoffe zur Behandlung oder zur Stimulation der Neurogenese bei Verletzungen oder Schädigungen des Nervensystems verwendet werden. Darunter fallen beispielsweise der Schlaganfall, die Querschnittslähmung, sowie die Schädigung durch Stoffwechselerkrankungen, Nervengifte oder HIV.
Ebenfalls ist es möglich, erfindungsgemäße Verwendung zur Manipulation von nicht pathologischen Vorgängen, etwa zur Stimulation von Lern- und Gedächtnisprozessen einzusetzen.
Die Verwendung der genannten Stoffe umfaßt auch die Manipulation von neuralen Stammzellen in vitro, wie beispielsweise bei der Stammzelltherapie.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen zur Modulation von Stammzellen, insbesondere neuraler Stammzellen des zentralen und/oder peripheren Nervensystems. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten ein Polynukleotid gemäß der obigen Beschreibung.
Solch ein Polynukleotid kann in Form eines Plasmids, Cosmids oder eines Virus vorliegen und mittels bekannter Transfektionsverfahren, wie der Lipofektion oder des ballistischen Transfers in eine Zelle eingeführt werden.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann auch ein Polypeptid und/oder einen Modulator gemäß der obigen Beschreibung enthalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Modulation von Stammzellen. Bei einem derartigen Verfahren werden neurale Stammzellen mit einem Polypeptid und/oder einem Modulator in ihrer Differenzierung beeinfmsst. Das dabei verwendete Polypeptid ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) einem EGFL7 Polypeptid (SEQ ID NO 2), und dessen gleichwirkenden Polypeptidfrag- mente, b) Polypeptiden, die mindestens 80 % Sequenzidentität zu den unter a) genannten Polypeptid oder Polypeptidfragmenten aufweist und welche zu dem EGFL7 Polypeptid gleichwirkend sind, und c) Polypeptiden, die mit einem unter a) und b) genannten Polypeptid inhibierend in Wechselwirkung treten; und wobei der Modulator ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aktivatoren und Inhibitoren der EGFL7 Polypeptid- Wirkung. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Differenzierung von neuralen Stammzellen in Neuronen und/oder Oligodendrozyten bereit. Das Verfahren zeichnet sich durch die Gabe des EGFL7 Polypeptids oder dessen Aktivierung aus. Die Aktivierung von EGFL7 kann dabei in einer der oben beschriebenen und sich aus den Beispielen ergebenden Arten erfolgen.
Dem gegenüber wird mit einem Verfahren, bei dem das EGFL7 Polypeptid reduziert oder inhibiert wird, die Differenzierung von neuralen Stammzellen in Astrozyten erreicht. Die Reduktion oder Inhibition von EGFL7 kann dabei in einer der oben beschriebenen und sich aus den Beispielen ergebenden Arten erfolgen.
Die beschriebene Erfindung bezieht sich auf die Modulation von Stammzellen aus Säugetieren, insbesondere aus Stammzellen von Mäusen, Ratten, Affen und Menschen.
Die erfindungsgemäß modulierten Stammzellen können im Rahmen einer Therapie einem Patienten verabreicht bzw. in den Körper eines Patienten eingebracht werden. Dieser Patient kann ein Säugetier sein, insbesondere eine Maus, eine Ratte, ein Affe oder ein Mensch.
Insbesondere ist ein Verfahren zum Klonen von menschlichen Lebewesen oder ein Verfahren zur Veränderung der genetischen Identität der Keimbahn des menschlichen Lebewesens in einer Ausfuhrungsform der Erfindung nicht umfasst.
Die Erfindung betrifft weiterhin einen Kit zur Durchführung einer Verwendung oder zur Durchführung eines Verfahrens der hier beschriebenen Art. Ein derartiger Kit umfasst insbesondere einen der hier beschriebenen Stoffe zur Modulation von Stammzellen.
Die Erfindung wird nun unter Verweis auf die Beispiele anhand der Figuren näher erläutert.
Es zeigen:
Figur 1 : Mittels eines Yeast Two-Hybrid Systems, bakterieller EGFL7-GST Fusionsproteine (GST pull-down Assays) und Koimmunopräzipitationen konnte gezeigt werden, dass EGFL7 an Notch Rezeptoren bindet. In diesem Experiment bindet EGFL7 an Notch 1 bis 3, nachdem diese Proteine in HEK293 Zellen überexprimiert wurden.
Figur 2: Die Interaktion von EGFL7 mit Notch 1 bis Notch 3wurde mit endogen exprimier- ten Rezeptoren verifiziert, nachdem rekombinant gereinigtes EGFL7 (His-EGFL7) ins Zellmedium appliziert wurde. Nach Koimmunopräzipitation wurde eine Interaktion zwischen Notch 1 bis Notch 3 und EGFL7 festgestellt (HUVEC: humane Endothelzellen, MRC5: humane Fibroblasten, hAoSMC: humane glatte Muskelzellen).
Figur 3: Die Analyse der Bindungsstelle in EGFL7 durch verschiedene EGFL7-GFP Fusionsproteine zeigte, dass die EMI-Domäne von EGFL7 eine besonders starke Bindung an Notch Rezeptoren vermittelt und dass die EGF-ähnlichen Domänen 1 und 2 zur Bindung beitragen können, aber alleine schwächer binden. Alle drei Domänen zusammen vermitteln die Bindung an Notch Rezeptoren, was auch im Yeast Two-Hybrid System und durch GST pull-down Assays gezeigt werden konnte. Außerdem ist das Signalpeptid (SS) von EGFL7 für eine optimale Bindung an Notch Rezeptoren wichtig. Vermutlich werden EGFL7 und Notch innerhalb der Zelle über den gleichen Syntheseweg transportiert, wo sie sich treffen und inter- agieren.
Figur 4: Durch Koimmunopräzipitation von EGFL7 und Notch-GFP Fusionsproteinen konnte nach Überexpression in HEK293 Zellen gezeigt werden, dass EGFL7 innerhalb der Notch Rezeptoren an die EGF-ähnlichen Domänen 9-12 (in Notch 1, 2 und 4) bzw. 8-11 (in Notch 3) bindet. Dieser Bereich ist für die Aktivierung von Notch Rezeptoren besonders wichtig.
Figur 5: Messung der Aktivierung von Notch Rezeptoren durch Aktivierung von Reportergenen (Luziferase, angeschaltet durch TPl, Hesl und Hes5 Promotoren), sowie Western Blots spezifisch für aktiviertes Notch 1, zeigte, dass EGFL7 ein Antagonist für die durch die bekannten Notch Agonisten Jagged 1 und 2 induzierte Notch 1 Aktivierung ist. Dies geht mit der Tatsache konform, dass bekannte Notch Agonisten membranständige Moleküle sind und lösliche Notch-Liganden als Antagonisten wirken. Figur 6: Die Selbsterneuerung von neuralen Stammzellen in Kultur in Form von sogenannten Neurosphären hängt von einer intakten Interaktion von Jagged 1 und Notch 1 ab. Figur 5 zeigt, dass dieses Interface mit EGFL7 gestört wird. Konsequenterweise führt die Expression von EGFL7 in Neurosphären (nach Infektion mit verschiedenen EGFL7 kodierenden Adenoviren) zu einer Reduktion der Selbsterneuerung von neuralen Stammzellen (gemessen als sekundär gebildete Sphären %). Knockdown von endogenem EGFL7 mit einem antisense Konstrukt (EGFL7 as) hat einen gegenteiligen Effekt. Chemische Inhibition von Notch Signalen erfolgt durch den gamma-Sekretase Inhibitor DAPT (N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]- S-phenylglycine-t-butyl-ester.
Figur 7: Weitere Untersuchungen zeigten, dass der in Fig. 6 gezeigte Befund auf eine reduzierte Proliferation (gemessen durch BrdU-Inkorporation in die DNA von proliferierenden Zellen) der neuralen Stammzellen zurückzuführen ist. Die Apoptose und Nekrose von infizierten neuralen Stammzellen war nicht verändert, so dass ein toxischer Effekt von EGFL7 oder der Adenoviren ausgeschlossenen werden kann.
Figur 8: Infektion von neuralen Stammzellen mit adenoviralen Konstrukten und Messung der spezifischen Aktivierung der Notch 1 Signalgebung durch die quantitative PCR des spezifischen Genproduktes Hes5 zeigte, dass EGFL7 auch im Neurosphä- renmodell als Antagonist der Notch Signalgebung wirkt.
Figur 9: Mit den identischen Proben aus Fig. 8 und quantitativer PCR von murinem EGFL7 (mEGFL7, SEQ ID NO 11) in den Neurosphären zeigte sich im Umkehrschluß, dass Notch Signale EGFL7 herunterregulieren. Wird das Notch Signal durch den Inhibitor DAPT blockiert, steigt die EGFL7 Produktion um den Faktor 5,5 an. Dies impliziert einen negativen Feedback Loop, in dem Notch Rezeptoren die Produktion des eigenen Inhibors blockieren.
Figur 10: Quantitative PCR von murinem EGFL7 in verschiedenen Geweben des Mäusehirns zeigt eine große Menge an EGFL7 RNA im Hippocampus und im Kortex. In der Subventrikulärzone (SVZ), in der neurale Stammzellen gebildet werden, sinkt die Menge jedoch stark ab und ist in aus der SVZ präparierten Neurosphären, kaum noch zu detektieren. Da aus den vorhergehenden Daten hervorgeht, dass EGFL7 die Bildung von neuralen Stammzellen herunterreguliert, erscheint es stimmig, dass das Molekül in Bereichen des Hirns weniger produziert wird, wo neurale Stammzellen proliferieren sollen. Da außerdem das Überleben der Neuro- sphären in Kultur von intakter Selbsterneuerung abhängt, sollte die Konzentration von EGFL7 dort besonders gering sein, was auch der Fall ist. Dieses Ergebnis indiziert, dass die vorhergehenden Beobachtungen physiologisch relevant sind. (EOMA: Positivkontrolle, viel mEGFL7; Fibroblasten MEFs3 NIH 3T3, wenig mEGFL7; M6363 Maus-Adenokarzinom, Negativkontrolle, kein mEGFL7).
Figur 11 : Aus der Literatur ist das gezeigte Konzept bekannt (Louvi und Artavanis- Tsakonas. Notch signalling in vertebrate neural development. Nat Rev Neurosci. 2006, 7(2): 93-102), welches auch auf die Differenzierung von neuralen Stammzellen in Neurosphären übertragbar ist. Ein erhöhtes Notch Signal führt unter Differenzierungsbedingungen zur Bildung von mehr Astrozyten und weniger Neuronen sowie weniger Oligodendrozyten.
Figur 12: Das Konzept gemäß Fig. 11 wurde wie folgt untersucht. Coverslips wurden mit 10 μg/ml bovinem Serumalbumin (linker Balken eines Grautons) oder 10 μg/ml rekombinant hergestelltem EGFL7 (jeweiliger rechter Balken eines Grautons) beschichtet. Junge Neurosphären wurden auf die so beschichteten Coverslips ausgebracht und zur Differenzierung angeregt. Nach Färbung spezifischer Marker wurde ausgezählt, wie viele Astrozyten (Marker GFAP), wie viele Neuronen (Marker NF 160) und wie viele Oligodendrozyten (Marker 04) sich gebildet haben. Die auf EGFL7 beschichteten Coverslips differenzierten neuralen Stammzellen bildeten signifikant mehr Neuronen und Oligodendrozyten, aber weniger Astrozyten. Dieses Experiment zeigt, dass EGFL7 die Differenzierung von neuralen Stammzellen durch Inhibition der Notch Signalgebung beeinflußt. Beispiele
Zusammenfassung
Unter Verwendung eines Hefe 2-Hybrid System Screens konnten gezeigt werden, dass EGFL7 in Notch 3 an die extrazelluläre Region bindet, die für die Aktivierung des Rezeptors benötigt wird (die so genannte DSL-Domäne). Nach Koimmunopräzipitation von endogenem und rekombinantem Notch, beziehungsweise der DSL-Domänen aus Notch, konnten verifiziert werden, dass EGFL7 an alle vier Notch Rezeptoren bindet. Ebenfalls wurde herausgefunden, dass in EGFL7 die sogenannte EMI-Domäne die Bindung vermittelt und dass die auf die EMI-Domäne folgenden beiden EGF-ähnlichen Domänen die Bindung verstärken.
In der EMI-Domäne wurde die Sequenz YxxxYxxxYxxxxG (Y = Tyrosin, G = Glyzin, x = beliebige Aminosäure) ermittelt, welche die Bindung von EGFL7 und Notch Rezeptoren wahrscheinlich vermittelt. Eine strukturell ähnliche Sequenz YYYG, gefolgt von EGF- ähnlichen Domänen, ist bereits aus existierenden Notch-spezifischen Liganden (z. B. Jagged 1) bekannt. Die modifizierte Sequenz in EGFL7 war bisher allerdings unbekannt. Die Quantifizierung der Bindung voll EGFL7 an Notch 1 unter Verwendung der Biacore-Technik ergab eine Dissoziationskonstante von größer 150 nmol/1, was einer starken Bindung entspricht. Nach Messung der spezifischen, durch Notch Rezeptoren induzierten Signaltransduktion durch sogenannte Reporter Gene Assays fanden wir, dass die durch Jagged 1 und Jagged 2 induzierte Aktivierung von Notch Rezeptoren herabgesetzt wird.
Um diese Wirkung im biologischen System zu testen, wählten wir die Selbsterneuerung von neuralen Stammzellen. Diese sogenannten Neurosphären wurden aus Mäusehirnen isoliert und ausgewählt, da ihre Selbsterneuerung in Zellkultur von einer intakten Jagged 1 - Notch 1 Interaktion abhängt. Wird diese Bindung unterbrochen, erneuern sich die neuralen Stammzellen schlecht bis gar nicht im Neurosphären-Modell.
Da EGFE7 und Jagged 1 an dieselbe Region im Notch 1 binden und EGFL7 die Notch- induzierte Signaltransduktion inhibiert, wurden diese Neurosphären mit einem Adenovirus infiziert, der EGFL7 exprimiert. Es zeigte sich, dass in den Neurosphären, welche EGFL7 ex- primierten, die Expression von Hes 5 heruntergesetzt war (einem spezifisch durch Notch 1 aktivierten Gen) und das diese Zellen sich signifikant schlechter selbst erneuerten.
Im Folgenden werden die durchgerührten Experimente mit Verweis auf die jeweiligen Figuren detailliert beschrieben:
Immunpräzipitationsstudien ('s. Figur 1)
HEK293 Zellen wurden transfiziert und nach zwei Tagen in eiskaltem Triton X-100 Lysepuf- fer lysiert (50 mmol/1 HEPES (pH 7,4), 150 mmol/1 NaCl, 1 % Triton X-100, 10 % Glyzerin, 1.5 mmol/1 MgC125 1 mmol/1 EDTA, 1 mmol/1 EGTA, 1 mmol/1 Natriumorthovanadat, 20 mmol/1 NaF, 1 mmol/1 PMSF, 10 μg/ml Aprotinin, 2 μg/ml Leupeptin, und 10 μmol/1 ZnCl2). Die Lysate wurden bei 4 °C durch Zentrifugation bei 16200 g für 20 Minuten gereinigt und dann für zwei Stunden bei 4 °C unter Rotation mit Antikörper inkubiert. Protein- Antikörper Komplexe wurden durch Inkubation mit Protein A-Agarose (Roche) für weitere zwei Stunden bei 4 0C gesammelt, dann zentrifugiert und drei Mal mit Lysepuffer gewaschen. Anschließend wurden Western blot Analysen durchgerührt. Die Präzipitate wurden bei 95 °C fünf Minuten lang gekocht und die Proteine durch Standard SDS-PAGE getrennt. Daraufhin wurden die Proteine auf eine Nitrozellulose-Membran geblottet und mit den angezeigten Antikörpern inkubiert. Gebundene Antikörper-Komplexe wurden durch Meerrettich Peroxidase- gekoppelte Sekundärantikörper detektiert und durch ECL Substrat (Santa Cruz Biotechnolo- gy) visualisiert.
Immunpräzipitationsstudien (s. Figur 2)
Frisch präparierte HUVEC Zellen aus Nabelschnurvenen waren eine gute Quelle für endogenen Notch 1 Rezeptor sowie Jagged 1 and 2. Humane MRC5 Fibroblasten enthielten beträchtliche Mengen an Notch 2 Rezeptor und humane glatte Muskelzellen aus Aorta lieferten detek- tierbare Mengen an Notch 3. Rekombinantes humanes EGFL7 gereinigt aus Sf9 Insektenzellen wurde im Medium bei einer Konzentration von 1 μg/ml appliziert und nach der Zelllyse wurden Koimmunopräzipitationsstudien (siehe oben) mit spezifischen Antikörpern durchgeführt. Anti-Erk2 Antikörper diente als Negativkontrolle, da er wie die anderen Antikörper, die in diesem Experiment verwendet wurden, polyklonal sowie von Santa Cruz Biotechnology war und aus dem Kaninchen stammte, allerdings gegen ein intrazelluläres Kontrollprotein ge- richtet ist. Unter diesen Bedingungen assoziierte EGFL7 mit den getesteten Notch Rezeptoren und Jagged 2 aber nicht mit Jagged 1.
Analyse der Bindungsstellen in EGFL7 (s. Figur I)
Um die Bindungsstelle in EGFL7 an Notch Rezeptoren zu bestimmen wurden verschiedene EGFL7 Konstrukte mit GFP fusioniert und zusammen mit Notchl in HEK293 Zellen übe- rexprimiert. Analyse siehe Fig. 1.
Analyse der Bindungsstellen in Notch (s. Figur 1)
Um die Bindungsstelle in Notch Rezeptoren an EGFL7 zu bestimmen wurden die extrazellulären EGF-Domänen, die für die Aktivierung von Notch Rezeptoren verantwortlich sind, mit GFP fusioniert und zusammen mit EGFL7 in HEK293 Zellen überexprimiert. Analyse siehe Fig. 1.
Reportergen Experimente (s. Figur 5)
Transaktivierung von Notch-sensitiven Elementen wurde wie von Kurode et al. 2003 beschrieben durchgeführt. HEK293 Zellen wurden mit den angezeigten Plasmiden plus 200 ng 12xCBFl TPl -Leuchtkäfer Luziferase Reportergen Plasmid pGa981-6 plus 50 ng pSV-ß-gal Kontroll Plasmid (von Ursula Zimber-Strobl und Lothar Strobl; es kann aber auch ein anderes dem Fachmann bekanntes Plasmid verwendet werden) durch Lipofectamin 2000 (Invitrogen) transfiziert. 24 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen in SDS-freiem Lysepuffer Iy- siert und die intrazelluläre Luziferase-Konzentration mit dem Chemiluminscent Luciferase Reporter Gene Assay (Roche) gemessen. Ebenso wurde die ß-Galaktosidase Aktivität in den Zellextrakten mit dem Chemiluminescent ß-gal Reporter Gene Assay (Roche) bestimmt. Die Proben wurden in einem Victor3 microplate reader (Perkin Eimer) analysiert.
Kulturen und Assavs mit Neurosphären (s. Figuren 6 und 7)
Primäre Kulturen wurden aus erwachsenen C57bl6 Mäusen (6 bis 8 Wochen alt) durch Präparation der lateralen Wand des lateralen Ventrikels präpariert. Gewebe wurde enzymatisch durch 0,8 mg/ml Papain (Worthington) in Leibovitz L- 15 Medium mit 400 U DNase I und 0,5 mmol/1 EDTA dissoziiert. Zellen wurden in Neurosphären Medium (DMEM/Hams-F12 1:1 + Glutamax, B27 Supplement, 10 mmol/1 HEPES (pH 7,4) und 2 mmol/1 L-Glutamin) mit 20 ng/ml EGF, 20 ng/ml FGF, 100 U/ml Penizillin und 100 μg/ml Streptomizin unter Standardbedingungen kultiviert.
Zur Bestimmung des Selbsterneuerungspotentials der neuralen Stammzellen wurden drei Tage alte Sphären mit verschiedenen Adenoviren oder dem Notch Signalinhibitor DAPT (N-[N- (3,5-Difluorophenacetyl)~L-alanyl]-S-phenylgrycine t-butyl Ester) inkubiert. Danach wurden die Zellen dissoziiert und bei klonaler Dichte (100 Zellen/cm2 oder 0,5 Zellen/μl) ausgesät. Nach fünf Tagen wurden die gebildeten Neurosphären gezählt (Singec et al., 2006). Proliferation wurde durch Inkorporation von Bromdesoxiuridin (BrdU) für zwölf Stunden und FACS Analyse bestimmt (FACS-Calibur, Beckton-Dickinson).
Konstruktion adenoviraler Expressionsvektoren
Human und Maus EGFL7 sowie korrespondierende anti-sense Sequenz wurden in das Trans- ferplasmid pDC515 (von Andreas Simm) kloniert. Es kann aber auch ein anderes dem Fachmann bekanntes Transferplasmid verwendet werden. Infektiöse Partikel wurden durch Ko- transfektion mit dem adenoviralen pBHGfrt(del)El,3FLP in Ela-transformierte HEK293 Zellen (Bett et al., 1994) kreiert. Nach 14 bis 20 Tagen wurden die Partikel gesammelt und titriert (1 pfu pro 500 Partikel).
Quantitative RT-PCR (s. Figuren 8 bis IQ^)
RNA von Zelllinien und Neurosphären wurden mit Trizol (Invitrogen) isoliert. RNA von Gewebeproben wurde mit dem RNeasy Kit (Qiagen) isoliert. cDNA (SEQ ID NO 11) wurde von 1 μg RNA pro Probe durch das Thermoscript RT-PCR System (Invitrogen) synthetisiert. Für quantitative real-time PCR wurden folgende Primer verwendet (Nyfeler et al., 2005):
Maus RNA-Polymerase II
5'-CAG ACA GAC AAC AAG AAG AAG A-3' (forward) (SEQ ID NO 12) und
5'-GAC ATA AGA ACC ATC AAA GGA GA-3' (reverse) (SEQ ID NO 13)
Maus EGFL7:
5'-CAC CTA CCGAAG GAT CTA CC-3' (forward) (SEQ ID NO 14) und
5'-GGC TTT GTC CCT CCC ATC-3' (reverse) (SEQ ID NO 15), Maus Hes5:
5'-AAG TAC CGT GGC GGT GGA GAT GC-3' (forward) (SEQ ID NO 16) und
5'-CGC TGG AAG TGG TAA AGC AGC TT-3' (reverse) (SEQ ID NO 17).
Real-time PCR wurde mit iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) durchgeführt. Resultate wurden zu RNA Polymerase II mit iQ5 Optical System Software (Bio-Rad) normalisiert.
Differenzierung von Neurosphären (Fig. 12)
Frisch dissoziierte Neurosphären-Zellen wurden auf Objektträger 10 μg/ml BSA oder rekom- binantem EGFL7 überführt. Dann wurden die Zellen zwölf Tage in Neurosphären-Medium plus 1 % FCS ohne EGF und FGF inkubiert. Zum Schluß wurden die Zellen in 4 % PFA 10 Minuten bei RT fixiert und mit den Zelltyp-spezifischen Markern anti-GFAP (Astrozyten), anti-beta(III)tubulin and anti-NF 160 (Neuronen) und anti-O4 (Oligodendrozyten) gefärbt. Danach wurde die Verteilung der einzelnen Zelltypen durch Zählung in 15 unabhängigen Sektoren unter dem Fluoreszenzmikroskop bestimmt.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung eines Polynukleotids zur Modulation von Stammzellen, dadurch gekennzeichnet, dass das Polynukleotid kodiert für a) ein EGFL7 Polypeptid oder für dessen gleichwirkende Polypeptidfragmente, oder b) ein Polypeptid, dass mindestens 80 % Sequenzidentität zu den unter a) genannten Polypeptid oder Polypeptidfragmenten aufweist und welches zu dem EGFL7 Polypeptid gleichwirkend ist, oder c) ein Polypeptid, das mit einem unter a) und b) genannten Polypeptid oder Polypeptidfragment inhibierend in Wechselwirkung tritt und eine EGF-ähnliche Domäne oder ein Fragment davon umfasst.
2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die EGF-ähnliche Domäne von einem Notch Rezeptor stammt.
3. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das inhibierende Polypeptid ein Polypeptid gemäß SEQ ID NO 7 bis 10 ist.
4. Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, zur Modulation des Wachstums und/oder der Differenzierung von Stammzellen.
5. Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Stammzellen neurale Stammzellen des zentralen und/oder peripheren Nervensystems sind.
6. Verwendung eines Polypeptids und/oder eines Modulators zur Modulation von Stammzellen, wobei das Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) EGFL7 Polypeptid, und dessen gleichwirkende Polypeptidfragmente, b) einem Polypeptid, das mindestens 80 % Sequenzidentität zu dem unter a) genannten Polypeptid oder Polypeptidfragmenten aufweist und welche zu dem EGFL7 Polypeptid gleichwirkend sind, und c) einem Polypeptid, das mit einem unter a) und b) genannten Polypeptid oder Polypeptidfragment inhibierend in Wechselwirkung tritt; wobei der Modulator ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
Aktivatoren der EGFL7 Polypeptid- Wirkung und Inhibitoren der EGFL7 Polypeptid-
Wirkung.
7. Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei die Polypeptidfragmente ein Signalpeptid, eine EMI-Domäne und/oder eine EGF-ähnliche Domäne aufweisen.
8. Verwendung gemäß Anspruch 6 oder 7, wobei die Polypeptidfragmente 10 bis 240 Aminosäurereste aufweisen.
9. Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei die inhibierenden Polypeptide eine EGF- ähnliche Domäne oder ein Fragment davon umfassen.
10. Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei die inhibierenden Polypeptide eine EGF- ähnliche Domäne eines Notch Rezeptors oder ein Fragment davon umfassen.
11. Verwendung gemäß Anspruch 9 oder 10, wobei das inhibierende Polypeptide ein Polypeptid gemäß SEQ ID NO 7 bis 10 ist.
12. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 6 bis 11, wobei die Stammzellen neurale Stammzellen des zentralen und/oder peripheren Nervensystems sind.
13. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 6 bis 12, wobei der Aktivator ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus VEGF, FGF, PDGF, Hypoxia, Chemokinen und Zytokinen.
14. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 6 bis 13, wobei der Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe der Antikörper, siRNA Moleküle, antisense Peptide und Antagonisten.
15. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 6 bis 14, zur Steuerung der Bildung von Neuronen und/oder Gliazellen, insbesondere der Manipulation von Stammzellen aus Hirngewebe und/oder zur Neurogenesemodulation.
16. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 6 bis 15, zur Therapie von Erkrankungen des Nervensystems, wie beispielsweise Demenz, Alzheimer, Parkinson, Multiple Sklerose, Creutzfeld- Jakob, Lewy-Köφerchen-Erkrankung, Lobärathrophie, Chorea Huntington und Morbus Wilson.
17. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 6 bis 16, zur Behandlung oder Stimulation der Neurogenese bei Verletzungen oder Schädigungen des Nervensystems, wie beispielsweise Schlaganfall, Querschnittslähmung, Schädigung durch Stoffwechseler- krankungen, Nervengifte und HIV.
18. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 6 bis 17, zur Manipulation von nichtpathologischen Vorgängen, wie Lern- oder Gedächtnisprozessen.
19. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Modulation von Stammzellen, insbesondere neuralen Stammzellen des zentralen und/oder peripheren Nervensystems, enthaltend
A) ein Polynukleotid, wobei das Polynukleotid kodiert für aa) ein EGFL7 Polypeptid oder für dessen gleichwirkende Polypeptidfragmente, bb) ein Polypeptid, dass mindestens 80 % Sequenzidentität zu den unter a) genannten Polypeptid oder Polypeptidfragmenten aufweist und welches zu dem EGFL7 Polypeptid gleichwirkend ist, oder cc) ein Polypeptid, dass mit einem unter aa) und ab) genannten Polypeptid oder
Polypeptidfragment inhibierend in Wechselwirkung tritt und eine EGF- ähnliche Domäne oder ein Fragment davon umfasst, oder
B) ein Polypeptid und/oder einen Modulator, wobei das Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: dd) EGFL7 Polypeptid, und dessen gleichwirkende Polypeptidfragmente, ee) einem Polypeptid, das mindestens 80 % Sequenzidentität zu dem unter a) genannten Polypeptid oder Polypeptidfragmenten aufweist und welche zu dem EGFL7 Polypeptid gleichwirkend sind, und ff) einem Polypeptid, das mit einem unter dd) und ee) genannten Polypeptid oder
Polypeptidfragment inhibierend in Wechselwirkung tritt; und wobei der Modulator ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Aktivatoren und Inhibitoren der EGFL7 Polypeptid- Wirkung.
20. Verfahren zur Modulation von Stammzellen, gekennzeichnet durch die Beeinflussung der Differenzierung von neuralen Stammzellen mit einem Polypeptid und/oder einem Modulator zur Modulation von Stammzellen.
21. Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei die Modulation von Stammzellen eine Differenzierung von neuralen Stammzellen in Neuronen und Oligodendrozyten ist, gekennzeichnet durch die Gabe oder Aktivierung von EGFL7.
22. Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei die Modulation von Stammzellen eine Differenzierung von neuralen Stammzellen in Astrozyten ist, gekennzeichnet durch die Reduktion oder Inhibierung von EGFL7.
23. Verfahren zur Therapie oder Prophylaxe eines Individuums, insbesondere eines Menschen, wobei eine nach Anspruch 20 bis 22 modulierte Stammzelle dem Individuum verabreicht wird.
24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Therapie oder Prophylaxe degenerative und akute Erkrankungen umfasst, insbesondere Demenz, Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, Multiple Sklerose, Morbus Creutzfeldt-Jakob, die Lewy-Körperchen- Erkrankung, die Lobärathrophie, Chorea-Huntington, Morbus Wilson, Schlaganfall, Querschnittslähmung und die Schädigung durch Stoffwechselerkrankungen, Nervengifte und/oder HIV, sowie die Stimulation von Lern- und Gedächtnisprozessen.
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