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Hintergrund der Erfindung
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Pluripotente
Stammzellen, die an der normalen Erneuerung und Reparatur teilnehmen,
während sie
eine Selbsterneuerung durchmachen, wurden in mehreren Geweben im
erwachsenen Säuger
nachgewiesen (Hay, 1966, Regeneration, Holt, Rinehart und Winston,
New York; McKay, 1999, Nature Med. 5:261–262; Lemiscka, 1999, Ann.
N.Y. Acad. Sci. 872:274–288;
Owens und Friedenstein, 1988, Ciba Foundation Syp. 136, Chichester,
U.K. pp. 42–60; Prockop,
1997, Science 276:71–74;
Ferrari et al., 1998, Science 279:1528–1530; Caplan, 1991, J. Orthop.
Res. 9:641–650;
Pereira et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4857–4861; Kuznetsov
et al., 1997, Brit. J. Haemotology 97:561–570; Majumdar et al., 1998,
J. Cell Physiol. 176:57–66;
Pittenger et al., 1999, Science 284:143–147). Eine Unterklasse von Knochenmarkstammzellen
ist ein Ausgangstyp, der imstande ist, in vitro in osteogene, chondrogene,
adipogene und andere mesenchymale Linien zu differenzieren (Owens
und Friedenstein, 1988, Ciba Foundation Symp. 136, Chichester, U.K.
pp. 42–60; Prockop,
1997, Science 276; 71–74;
Ferrari et al., 1998, Science 279:1528–1530; Caplan, 1991, J. Orthop.
Res. 9:641–650;
Pereira et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4857–4861; Kuznetsov
et al., 1997, Brit. J. Haemotology 97:561–570; Majumdar et al., 1998,
J. Cell. Physiol. 176:57–66;
Pittenger et al., 1999, Science 284:143–147). Diese pluripotenten Zellen
wurden als Markstromazellen (MSC) bezeichnet und wurden in letzter
Zeit klinisch eingesetzt, um Osteogenesis imperfecta zu behandeln
(Horwitz et al., 1999, Nature Med. 5:309–313).
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Die
neue Entdeckung von Stammzellpopulationen im Zentralnervensystem
(ZNS) hat starkes Interesse hervorgerufen, weil das Gehirn lange
Zeit als nicht regenerationsfähig
erachtet wurde (Reynolds und Weiss, 1992, Science 255:1707–1710; Richards et
al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8591–8595; Morshead et al., 1994,
Neuron 13:1071–1082).
Neurale Stammzellen (NSC) sind imstande, in vitro eine Expansion
und ein Differenzieren in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten durchzumachen
(Rey- Holds und Weiss,
1992, Science 255:1707–1710;
Johansson et al., 1999, Cell 96:25–34; Gage et al., 1995, Annu.
Rev. Neurosci. 18:159–192;
Vescovi et al., 1993, Neuron 11:951–966). In das Gehirn des adulten
Nagers replantierte NSC überleben
und differenzieren zu Neuronen und Glia, womit die Möglichkeit
eines therapeutischen Potenzials geschaffen wird (Lundberg et al.,
1997, Exp. Neurol. 145:342–360;
Lundberg et al., 1996, Brain Res. 737:295–300; Renfranz et al., 1991, Cell
66:713–729;
Flax et al., 1998, Nature Biotech. 16:1033–1039; Gage et al., 1995, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 92:11879–11883;
Svendsen et al., 1997, Exp. Neurol. 148:135–146). Jedoch schränkt die
fehlende Zugänglichkeit
von NSC-Quellen tief im Gehirn die klinische Verwendbarkeit schwerwiegend
ein. Der neue Bericht, der zeigt, dass NSC in vivo hämatopoetische
Zellen schaffen können,
lässt darauf
schließen,
dass Stammzellpopulationen weniger einschränkt sein können, als früher angenommen
wurde (Bjornson, 1999, Science 283:534–537).
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In
WO99/56759 wurden Knochenmarkstromazellen
(BMSC, engl. „bone
marrow stromal cells") in
vitro und in vivo zur Differenzierung in neuronenähnliche
Phänotypen
veranlasst, indem man solche Zellen mit Wachstumsfaktoren (wie zum
Beispiel mit PDGF, GDNF, FGF2, NGF und BDNF) und Retinolsäure (cis-9-Retinolsäure, All-trans-Retinolsäure oder
einer Kombination davon) in Berührung
brachte.
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Der
Nachweis, dass in die Seitenventrikel neugeborener Mäuse injizierte
MSC zu Astrozyten und Zellen, die Neurofilamente enthalten, differenzieren
können,
unterstützt
diese Behauptung (Kopen et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96:10711–10716).
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Jedoch
gab es, obwohl eine Differenzierung von MSC in Astrozyten und Gliazellen
nachgewiesen wurde (
WO 99/43286 ),
bis heute kein Verfahren, MSC dazu zu verlassen, in neuronale Zellen
zu differenzieren. Somit war trotz des wichtigen Bedarfs, neuronale
Zellen zur Behandlung von Krankheiten, Funktionsstörungen oder
Zuständen
des Zentralnervensystems zu erhalten, kein Verfahren verfügbar, um
große
Zahlen von neuronalen Zellen zu erhalten, ohne auf die technischen
und ethischen Hindernisse zu stoßen, die das Beschaffen menschlicher
NSC oder fetalen Gewebes mit sich bringt. Die vorliegende Erfindung
bewältigt
diesen Bedarf.
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Kurze Zusammenfassung der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung beinhaltet ein Verfahren zum Induzieren der
Differenzierung von einer isolierten Markstromazelle in eine neuronale
Zelle. Das Verfahren umfasst ein Transferieren besagter Markstromazellen
in ein Serum-freies Medium, das wenigstens eine neuronale Differenzierung
induzierende Verbindung enthält.
Dies induziert die Differenzierung von der isolierten Markstromazelle
in eine neuronale Zelle.
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In
einem Aspekt ist die isolierte Markstromazelle eine Rattenzelle.
Vorzugsweise ist die isolierte Markstromazelle eine menschliche
Zelle.
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Die
neuronale Differenzierung induzierende Verbindung ist ein Antioxidationsmittel.
Das Antioxidationsmittel ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus beta-Mercaptoethanol,
Dimethylsulfoxid, butyliertem Hydroxytoluol, butyliertem Hydroxyanisol,
Ascorbinsäure,
Dimethylfumarat und N-Acetylcystein.
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In
einem anderen Aspekt ist das Antioxidationsmittel beta-Mercaptoethanol.
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In
einem anderen Aspekt ist das Antioxidationsmittel Dimethylsulfoxid.
In noch einem anderen Aspekt ist das Antioxidationsmittel Dimethylsulfoxid und
butyliertes Hydroxyanisol.
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Die
Erfindung beinhaltet ferner ein In-vitro-Verfahren zum Herstellen
einer isolierten neuronalen Zelle. Das Verfahren umfasst ein Isolieren
einer Markstromazelle, Transferieren einer isolierten Markstromazelle
in ein Serum-freies Medium enthaltend ein Antioxidationsmittel,
wobei die Verbindung ein Differenzieren der isolierten Markstromazelle
in eine isolierte neuronale Zelle induziert, und dadurch Herstellen
einer isolierten neuronalen Zelle.
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Zusätzlich beinhaltet
die Erfindung die Verwendung von einer isolierten Zellpopulation,
die neuronale Zellen umfasst und aus einer Knochenmarkprobe von
einem menschlichen Spender gewonnen wurde, nach Isolierung von Stromazellen
aus besagter Kno chenmarkprobe und Induktion von besagten Stromazellen
zum Differenzieren in isolierte neuronale Zellen, indem besagte,
isolierte Stromazellen mit mindestens einem Antioxidationsmittel
in Kontakt gebracht werden, zum Herstellen eines Arzneimittels zum
Bewirken einer Behandlung von einer Krankheit, einer Funktionsstörung oder
eines Zustandes des zentralen Nervensystems von einem menschlichen Patienten.
Das Vorliegen von den isolierten neuronalen Zellen im Zentralnervensystem
des menschlichen Patienten bewirkt eine Behandlung von der Krankheit,
der Funktionsstörung
oder von dem Zustand.
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In
einem Aspekt ist die Krankheit, die Funktionsstörung oder der Zustand des Zentralnervensystems
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit,
Huntington'scher
Krankheit, amyotropher Lateralsklerose, einem Tumor, einem Trauma,
Altersdemenz, Tay-Sach's-Krankheit,
Sandhoff-Krankheit, Hurler-Syndrom,
Krabbe-Syndrom, einer Geburts-induzierten, traumatischen Verletzung
des zentralen Nervensystems, Epilepsie, Multipler Sklerose, Trauma, Tumor,
einem Schlaganfall und einer Verletzung des Rückenmarks.
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In
einem anderen Aspekt wurden die isolierten neuronalen Zellen mit
einer für
ein therapeutisches Protein kodierenden, isolierten Nukleinsäure transfiziert,
wobei das Protein, wenn das Protein in den Zellen exprimiert wird,
dazu dient, eine Behandlung von der Krankheit, der Funktionsstörung oder des
Zustandes zu bewirken.
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In
einem alternativen Aspekt wurden die isolierten neuronalen Zellen
mit einer isolierten, für
ein Zytokin, ein Chemokin, ein Neurotrophin, ein anderes trophisches
Protein, einen Wachstumsfaktor, einen Antikörper oder ein Gliom-toxisches
Protein kodierenden Nukleinsäure
transfiziert.
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Die
vorliegende Erfindung beinhaltet ferner die Verwendung von einer
Zellpopulation umfassend neuronale Zellen zur Herstellung eines
Arzneimittels für
die Behandlung von einem menschlichen Patienten, der die besagten
neuronalen Zellen benötigt,
wobei die neuronalen Zellen aus Markstromazellen eines menschlichen
Patienten erhalten wurden, nach einem Vermehren dieser Markstromazellen
in einer Kultur unter Bedingungen, welche die Differenzierung der
Markstromazellen in neuronale Zellen induzieren, wobei induziert
wurde durch Transferieren der isolierten Markstromazellen in ein
Serum-freies Medium enthaltend ein Antioxidationsmittel.
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Die
Erfindung beinhaltet auch eine isolierte Zellpopulation umfassend
eine neuronale Zelle, die durch das Verfahren zum Induzieren einer
Differenzierung von einer isolierten Markstromazelle in eine neuronale
Zelle hergestellt wurde. Das Verfahren umfasst ein Transferieren
besagter Markstromazellen in ein Serum-freies Medium, das ein Antioxidationsmittel
enthält.
Der Kontakt zwischen der isolierten Markstromazelle und dem eine
neuronale Differenzierung induzierenden Antioxidationsmittel induziert eine
Differenzierung der isolierten Markstromazelle in die neuronale
Zelle der Erfindung.
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In
einem Aspekt ist die Zellpopulation umfassend neuronale Zellen,
die mittels dieses Verfahrens hergestellt ist, eine Nager-Zellpopulation.
In einem anderen Aspekt sind die neuronalen Zellen Rattenzellen.
In einem bevorzugten Aspekt ist die mittels dieses Verfahrens hergestellte,
neuronale Zelle eine menschliche, neuronale Zellpopulation.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung beinhaltet eine isolierte, neuronale Zellpopulation,
die mit einem therapeutischen Protein transfiziert ist. Die neuronale
Zellpopulation wird durch das oben vorgetragene Verfahren des Induzierens
einer Differenzierung von einer isolierten Markzelle in eine neuronale
Zelle isoliert. Die neuronale Zellpopulation ist dann zur Transfektion
mit einer isolierten Nukleinsäure
geeignet, welche für
ein therapeutisches Protein kodiert, das, wenn es exprimiert wird,
eine Behandlung von einer Krankheit, einer Funktionsstörung oder
von einem Zustand des Zentralnervensystems bewirken wird. In einem
Aspekt der Erfindung ist das therapeutische Protein, für das die
isolierte Nukleinsäure
kodiert, ein Zytokin, ein Chemokin, ein Neurotrophin, ein anderes
trophisches Protein, ein Wachstumsfaktor, ein Antikörper oder
ein Gliomtoxisches Protein.
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Die
Erfindung umfasst Krankheiten, Funktionsstörungen oder Zustände des
Zentralnervensystems, die Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Huntington'sche Krankheit, amyotrophe
Lateralsklerose, einen Tumor, ein Trauma, Altersdemenz, Tay-Sach's- Krankheit, Sandhoff-Krankheit, Hurler-Syndrom,
Krabbe-Syndrom, Geburts-induzierte, traumatische Verletzung des
zentralen Nervensystems, Epilepsie, Multiple Sklerose, Trauma, Tumor, Schlaganfall
und Verletzung des Rückenmarks
einschließen,
aber nicht darauf beschränkt
sind.
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In
einem Aspekt handelt es sich bei der Zellpopulation umfassend eine
neuronale Zelle, die mittels des Verfahrens des Induzierens einer
Differenzierung einer isolierten Markstromazelle hergestellt wurde,
um Rattenzellen oder Nagerzellen. Vorzugsweise sind die transfizierten
neuronalen Zellen menschliche Zellen.
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Die
Erfindung beinhaltet auch eine isolierte Zellpopulation umfassend
neuronale Zellen, die durch ein In-vitro-Verfahren, das ein Isolieren
einer Markstromazelle und ein Transferieren besagter Markstromazellen
in ein Serum-freies Medium enthaltend mindestens ein Antioxidationsmittel
umfasst, hergestellt wurden.
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Dies
induziert die isolierte Markstromazelle, in isolierte, neuronale
Zellen zu differenzieren.
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Eine
transfizierte, isolierte Zellpopulation umfassend neuronale Zellen,
die durch ein Isolieren einer Markstromazelle und ein Transferieren
besagter Markstromazellen in ein Serum-freies Medium enthaltend
mindestens ein Antioxidationsmittel hergestellt wurden, ist auch
in der Erfindung eingeschlossen. Die isolierte Zellpopulation umfassend neuronale
Zellen, die mit diesem Verfahren hergestellt wurden, wird dann mit
einer isolierten Nukleinsäure
transfiziert, welche für
ein therapeutisches Protein kodiert, welches, wenn es in den neuronalen
Zellen exprimiert wird, eine Behandlung von einer Krankheit, einer
Funktionsstörung
oder von einem Zustand des Zentralnervensystems bewirken wird.
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In
einem bevorzugten Aspekt ist das therapeutische Protein, für das die
isolierte Nukleinsäure kodiert,
ein Zytokin, ein Chemokin, ein Neurotrophin, ein anderes trophisches
Protein, ein Wachstumsfaktor, ein Antikörper oder ein Gliom-toxisches
Protein.
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In
einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die transfizierte Zellpopulation
umfassend neuronale Zellen, die durch das In-Kontakt-Bringen einer eine
neuronale Differenzierung induzierenden Verbindung mit einer Markstromazelle
hergestellt wurden, eine Rattenzelle. In einem anderen Aspekt sind die
transfizierten, neuronalen Zellen Nagerzellen. In einem bevorzugten
Aspekt sind die transfizierten, neuronalen Zellen menschliche Zellen.
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Kurze Beschreibung der verschiedenen
Darstellungen der Abbildungen
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Die
vorhergehende Zusammenfassung und auch die folgende ausführliche
Beschreibung der Erfindung werden besser verstanden werden, wenn
sie im Zusammenhang mit den beigefügten Abbildungen gelesen werden.
Zum Zweck der Veranschaulichung der Erfindung werden in den Abbildungen
Ausführungsform(en),
die derzeit bevorzugt werden, gezeigt. Es sollte sich jedoch verstehen,
dass die Erfindung nicht auf die genauen Anordnungen und Mittel, die
gezeigt werden, beschränkt
ist. Zu den Zeichnungen:
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1A ist
eine Graphik, die eine Fluoreszenz-Zellsortierung von Passage-1-rMSC
unter Verwendung von monoklonalen Mausantikörpern, die spezifisch an den
Zelloberflächenmarker
CD11b binden (CD11/Integrin alphaM/Mac-1
Alphakette; Pharmingen, San Diego, CA) (leere Flächen unter den Kurven), darstellt.
Der verwendete Sekundärantikörper war
ein mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) konjugierter Anti-Maus-Antikörper. Eine
Isotypen-Kontrolle ist in jedem Versuch enthalten, um Hintergrund-Fluoreszenz
(gefüllte
Flächen
unter den Kurven) zu bestimmen. Die Zahl der analysierten Zellen (Ereignisse)
ist auf der Y-Achse aufgetragen, während die Intensität der Färbung auf
der X-Achse aufgetragen
ist.
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1B ist
eine Graphik, die eine Fluoreszenz-Zellsortierung von Passage-1-rMSC
unter Verwendung von monoklonalen Mausantikörpern, die spezifisch an den
Zelloberflächenmarker
CD45/gemeinsames Leukozyten-Antigen binden (Pharmingen) (leere Flächen unter
den Kurven), darstellt. Der Sekundärantikörper ist ein mit Fluoresceinisothiocyanat
(FITC) konjugierter Anti-Maus-Antikörper. Eine Isotypen-Kontrolle
ist in jedem Versuch enthalten, um Hintergrund-Fluoreszenz (gefüllte Flächen unter
den Kurven) zu bestimmen. Die Zahl der analysierten Zellen (Ereignisse)
ist auf der Y-Achse aufgetragen, während die Intensität der Färbung auf
der X-Achse aufgetragen ist.
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1C ist
eine Graphik, die eine Fluoreszenz-Zellsortierung von Passage-1-rMSC
unter Verwendung von monoklonalen Mausantikörpern, die spezifisch an den
Zelloberflächenmarker CD90/Thy-1/CD90.1/Thy1.1
binden (Pharmingen) (leere Flächen
unter den Kurven), darstellt. Der Sekundärantikörper ist ein mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC)
konjugierter Anti-Maus-Antikörper.
Eine Isotypen-Kontrolle ist in jedem Versuch enthalten, um Hintergrund-Fluoreszenz
(gefüllte
Flächen
unter den Kurven) zu bestimmen. Die Zahl der analysierten Zellen
(Ereignisse) ist auf der Y-Achse aufgetragen, während die Intensität der Färbung auf
der X-Achse aufgetragen ist. Die hier offengelegten Daten zeigen, dass
im Vergleich zu Kontrollantikörpern
(gefüllt)
die Fluoreszenzintensität
höher (nach
rechts verschoben) ist, wenn rMSC mit CD90-Antikörper (leer) inkubiert werden,
was darauf hinweist, dass die weitgehende Mehrheit der Zellen in
den rMSC-Kulturen im Einklang mit ihrem undifferenzierten Status
CD90 exprimiert.
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2, die
2A–
2H umfassend,
ist ein Bild, das neuronale Differenzierung von rMSC zu verschiedenen
Zeitpunkten nach der Behandlung darstellt. In Kürze wurde das hier offenbarte
Protokoll zur neuronalen Differenzierung bei 0 Minuten begonnen
und 210 Minuten lang befolgt.
2A stellt
0 Minuten dar,
2B stellt 30 Minuten dar,
2C stellt 60
Minuten dar,
2D stellt 90 Minuten dar,
2E stellt
120 Minuten dar,
2F stellt 150 Minuten dar,
2G stellt
180 Minuten dar und
2H stellt 210 Minuten dar. Eine
flache rMSC in
2A wird vor der Differenzierung
(
)
identifiziert. Mit zunehmender Zeit sind eine Einziehung des Zeltkörpers und
eine Ausbildung von Ausläufern
offenkundig. Der Pfeil in
2E weist
auf eine zweite, differenzierende Zelle hin. Auf einen sich retrahierenden
Neuriten wird mit (>)
hingewiesen. (Vergrößerung =
200X).
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3A ist
ein Bild, das die Expression von Neuronen-spezifischer Enolase (NSE)
in differenzierenden Neuronen unter Verwendung eines polyklonalen
Anti-NSE-Antikörpers
(Polysciences, Warrington, PA) darstellt. In Kürze behielten undifferenzierte rMSC
(mit einem ">" gekennzeichnet) eine abgeflachte Morphologie
bei und färbten
sich nur leicht auf NSE-Expression an. Von rMSC abstammende Neurone
(Pfeile) färbten
sich dunkelbraun auf NSE-Expression an und zeigten verdichtete Zellkörper und
in hohem Ausmaß verzweigte
Ausläufer. Übergangszellen
(→) zeigten
intermediäre
neuronale Morphologien mit teilweise zusammengezogenen Zellkörpern und
hellbrauner NSE-Anfärbung.
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3B ist
ein Bild, das zeigt, dass die Morphologien von Neuronen, die von
rMSC abstammen, einfache, bipolare (
)
und komplexe, multipolare Zellen mit in hohem Ausmaß verzweigten
Ausläufern (Pfeil)
einschließen.
Eine starke NSE-Anfärbung
ist in beiden Arten neuronaler Zellen ersichtlich.
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3C ist
ein Bild, das zeigt, dass unter Einsatz der hier an anderer Stelle
offenbarten Protokolle manchmal NSE-positive Zellen, die pyramidale
Morphologien aufweisen, geschaffen werden. Der Kontakt mit einer Übergangszelle
(hellbraun) wird über einen
einzelnen, nicht verzweigten Ausläufer aufrechterhalten.
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3D ist
ein Bild, das ein NSE-positives Neuron, das einen langen Ausläufer mit
offensichtlichen Verdickungen (Pfeile) ausbildet, darstellt. Die hier
offenbarten Daten zeigen, dass sich der neuronale Zellkörper in
engem Kontakt mit einer Übergangszelle
befindet.
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3E ist
ein Bild, das zeigt, dass Gruppen von Neuronen, die von rMSC abstammen
und unterschiedliche Morphologien aufweisen, komplexe Netzwerke
bilden. Die hier offenbarten Daten zeigen, dass eine undifferenzierte
rMSC (>) in diesem
Geflecht von Ausläufern
eingeschlossen ist. (Vergrößerung =
320X).
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3F ist
ein Bild einer Western-Blot-Analyse, die eine Expression niedriger
Spiegel von NSE in nicht induzierten rMSC (U) offenbart. Die hier
offenbarten Daten zeigen, dass eine signifikante Steigerung der
Expression von NSE 5 Stunden nach BME-Behandlung offensichtlich ist (I). In
jeder Bahn wurden vergleichbare Spiegel von Tubulin nachgewiesen,
was auf ein gleichmäßiges Auftragen
von Proben hinweist.
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4A ist
ein Bild, das die Expression von NeuN in Neuronen, die von rMSC
abstammen, unter Verwendung eines monoklonalen Anti-NeuN-Antikörpers (Chemicon,
Temeeula, CA) darstellt. In Kürze zeigen
die hier offenbarten Daten, dass NeuN im Kern und im umgebenden
Zytoplasma von Neuronen, die von rMSC abstammen, nachgewiesen werden
kann (Pfeil).
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4B ist
ein Bild, das die Expression von NeuN in Neuronen, die von rMSC
abstammen, unter Verwendung eines monoklonalen Anti-NeuN-Antikörpers (Chemicon)
darstellt. In Kürze
zeigen die hier offenbarten Daten, dass NeuN im Kern und im umgebenden
Zytoplasma von Neuronen, die von rMSC abstammen, nachgewiesen werden
kann (Pfeil). Ferner zeigen die hier offenbarten Daten, dass sich
die Färbung
mit Anti-NeuN-Antikörper nicht
in die Ausläufer der
positiven Zellen erstreckt. Das Bild zeigt weiter, dass Übergangszellen
(→) und
nicht differenzierte rMSC (<)
NeuN nicht exprimieren.
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5A ist
ein Bild, das die Expression von NF-M und tau durch differenzierende
Zellen darstellt. In Kürze
wurden von rMSC abstammende Neuronen unter Verwendung eines polyklonalen
Anti-NF-M-Antikörpers
(Chemicon) immungefärbt,
um Expression von NF-M nachzuweisen. Die hier offenbarten Daten zeigen,
dass Zellen, die neuronale Morphologien aufweisen, NF-M sowohl in
den Zellkörpern
(Pfeil) als auch in den Fortsätzen
(*) exprimieren. Flache, nicht differenzierte rMSC (>) färben sich nicht auf Expression
von NF-M an.
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5B ist
ein Bild, das darstellt, dass eine vorherige Adsorption von Anti-NF-M-Antikörper (Chemicon)
mit 20 Mikrogramm von gereinigtem Protein NF-M über Nacht bei 4°C die Färbung von
Neuronen, die von rMSC abstammten, unterband, was die Spezifität der NF-M-Färbung anzeigt.
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5C ist
ein Bild, das von rMSC abstammende Neuronen, die unter Verwendung
eines polyklonalen Anti-tau-Antikörpers (Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO) auf die Expression von tau gefärbt sind, darstellt. Die hier
offenbarten Daten zeigen, dass Zellen, die neuronale Morphologien
(Pfeile) aufweisen, sich innerhalb des Zellkörpers und in die Ausläufer (*)
ausgedehnt dunkelbraun auf die Expression von tau anfärben. Fla che,
undifferenzierte rMSC (>)
exprimieren tau nicht und sind ungefärbt. (Vergrößerung = 320X).
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5D ist
ein Bild, das von rMSC abstammende Neuronen, die unter Verwendung
eines polyklonalen Anti-tau-Antikörpers (Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO) auf die Expression von tau gefärbt sind, darstellt. Die hier
offenbarten Daten zeigen, dass Zellen, die neuronale Morphologien
(Pfeile) aufweisen, sich innerhalb des Zellkörpers und in die Ausläufer (*)
ausgedehnt dunkelbraun auf die Expression von tau anfärben. Flache,
undifferenzierte rMSC (>)
exprimieren tau nicht und sind ungefärbt. (Vergrößerung = 320X).
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6A ist
ein Bild, das eine FM1-43-Markierung von Neuronen, die von rMSC
abstammen, darstellt. Die hier offenbarten Daten zeigen, dass von rMSC
abstammende Neuronen, die unter Verwendung von KCl depolarisiert
sind, eine intensive Markierung von terminalen, mutmaßlichen
Wachstumskegeln (durch ein leeres Dreieck gekennzeichnet) zeigen.
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6B ist
ein Bild, das eine FM1-43-Markierung von Neuronen, die von rMSC
abstammen, darstellt. Die hier offenbarten Daten zeigen, dass von rMSC
abstammende Neuronen, die unter Verwendung von KCl depolarisiert
sind, eine intensive Markierung von terminalen, mutmaßlichen
Wachstumskegeln (durch ein leeres Dreieck gekennzeichnet) zeigen.
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7A ist
ein Bild, das die Differenzierung klonaler rMSC-Linien darstellt.
NSE-Färbung des
individuellen rMSC-Klons #1, der dem hier offenbarten Differenzierungsprotokoll
unterzogen wurde. Von jeder klonalen Linie stammen NSE-positive
Zellen (dunkelbraun) ab. Undifferenzierte rMSC (>) und/oder Übergangszellen (→) sind in
jedem Feld offenkundig. (Vergrößerung =
320X).
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7B ist
ein Bild, das die Differenzierung klonaler rMSC-Linien darstellt.
NSE-Färbung des
individuellen rMSC-Klons #2, der dem hier offenbarten Differenzierungsprotokoll
unterzogen wurde. Von jeder klonalen Linie stammen NSE-positive
Zellen (dunkelbraun) ab. Undifferenzierte rMSC (>) und/oder Übergangszellen (→) sind in
jedem Feld offenkundig. (Vergrößerung =
320X).
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7C ist
ein Bild, das die Differenzierung klonaler rMSC-Linien darstellt.
NSE-Färbung des
individuellen rMSC-Klons #3, der dem hier offenbarten Differenzierungsprotokoll
unterzogen wurde. Von jeder klonalen Linie stammen NSE-positive
Zellen (dunkelbraun) ab. Undifferenzierte rMSC (>) und/oder Übergangszellen (→) sind in
jedem Feld offenkundig. (Vergrößerung =
320X).
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7D ist
ein Bild, das die Differenzierung klonaler rMSC-Linien darstellt.
NSE-Färbung des
individuellen rMSC-Klons #4, der dem hier offenbarten Differenzierungsprotokoll
unterzogen wurde. Von jeder klonalen Linie stammen NSE-positive
Zellen (dunkelbraun) ab. Undifferenzierte rMSC (>) und/oder Übergangszellen (→) sind in
jedem Feld offenkundig. (Vergrößerung =
320X).
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8A ist
ein Bild, das die Differenzierung von menschlichen MSC darstellt.
Die hier offenbarten Daten zeigen, dass menschliche MSC zu Neuronen differenzieren
und hohe Spiegel von NSE (dunkelbraun) exprimieren. Eine heller
gefärbte Übergangszelle
(mit → gekennzeichnet)
ist unten links dargestellt.
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8B ist
ein Bild, das darstellt, dass ein NSE-positives, von hMSC abstammendes
Neuron einen Ausläufer,
der eine Neuronen-ähnliche,
terminale, zwiebelförmige
Morphologie aufweist, ausbildet.
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8C ist
ein Bild, das ein Phasenkontrastbild von gepaarten, NSE-positiven
Neuronen darstellt. Die hier offenbarten Daten zeigen Wachstumskegelmorphologien
mit filopodialen Erweiterungen (Doppelpfeil). Das Bild ist um 50
% vergrößert, um Einzelheiten
zu zeigen.
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8D ist
ein Bild, das darstellt, dass von hMSC abstammende Neuronen sich
positiv für
NF-M anfärben.
(Vergrößerung =
320X).
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9, die 9A–9F umfassend,
ist ein Bild, das die Expression von Nestin und trkA in differenzierenden,
von rMSC abstammenden Neuronen darstellt. Die 9A–9C zeigen
Zellen, die auf Expression von Nestin gefärbt sind, bei 5 Stunden, 1
Tag beziehungsweise 6 Tagen. Die 9D–9F stellen
Zellen, die auf Expression von trkA gefärbt sind, bei 5 Stunden, 1
Tag beziehungsweise 6 Tagen dar. (Vergrößerung = 320X).
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Die
Erfindung beruht auf der Entdeckung, dass ein In-Kontakt-Bringen
von Markstromazellen mit einem Antioxidationsmittel wie in den Ansprüchen definiert
eine Differenzierung der Zellen in Neuronen-ähnliche Zellen, die eine Vielzahl
von Neuronen-spezifischen
Markern (zum Beispiel NeuN, Neurofilament-M, Neuronen-spezifische
Enolase [NSE], tau, Nestin, trkA und Ähnliches) exprimieren, vermittelt.
Die Zellen zeigen andere, Neuronen-ähnliche phänotypische Kennzeichen wie
zum Beispiel sphärische
und refraktile Zellkörper,
die ein typisch neuronales, perikaryales Erscheinungsbild aufweisen,
Zellkörper,
die lange Ausläufer,
die in Wachstumskegeln und für
Neuronen typischen Filopodien enden, ausbilden, und Markierung der
Wachstumskegel mit dem fluoreszierenden Farbstoff FM1-43, der üblicherweise
die Freisetzung neuronaler Transmitter und die Wiedergewinnung synaptischer
Vesikel markiert, aber nicht darauf beschränkt. Somit induzieren die hier
offenbarten Verfahren eine Differenzierung von Markstromazellen
in neuronale Zellen. Solche Verfahren sind in der Entwicklung von
zellbasierten Therapeutika zur Behandlung von Krankheiten, Funktionsstörungen oder
Zuständen
des Zentralnervensystems (ZNS) äußerst wichtig.
In der Tat behinderte vor der vorliegenden Erfindung das Fehlen
einer Quelle von neuronalen Zellen, die in das ZNS eines menschlichen
Patienten eingebracht werden können,
die Entwicklung von ZNS-Therapeutika schwerwiegend.
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Beschreibung
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Die
Erfindung schließt
ein Verfahren zum Induzieren von einer isolierten Markstromazelle
zum Differenzieren in eine isolierte neuronale Zelle (siehe Anspruch
1) ein. Ausfüh rungsformen
des Verfahrens der Erfindung sind in den Ansprüchen definiert und hier im
Abschnitt mit den Beispielen beschrieben. Im Allgemeinen werden
Zellen aus einem Spender isoliert, daraus werden Markstromazellen
erhalten, üblicherweise
unter Einsatz eines Zellsortierungsverfahrens, und die Stromazellen
werden anschließend
in vitro kultiviert. Der Spender kann zum Beispiel eine Ratte sein
oder der Spender kann ein Mensch sein. Es ist beabsichtigt, dass
die Erfindung einen Säuger als
Spender umfasst und sie sollte nicht auf die spezifischen, hier
offenbarten Spender beschränkt
werden.
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Um
den neuronalen Phänotyp
hervorzurufen werden die Zellen mit einer wirksamen Menge von einer
eine neuronale Differenzierung induzierenden Verbindung, die für eine Zeitdauer
in die Zeltkultur eingebracht wird, vorbehandelt. Die Länge der
Zeit kann entsprechend dem konkreten Verfahren, das in Betracht
gezogen wird, schwanken und sollte nicht als die Erfindung in irgendeiner
Art und Weise limitierend ausgelegt werden. Nach der vor der Behandlung
stattfindenden Einwirkung der eine neuronale Differenzierung induzierenden
Verbindung werden die Zellen in ein Serum-freies Medium, das eine
Menge derselben, eine neuronale Differenzierung induzierenden Verbindung
enthält,
transferiert. Eine neuronale Morphologie ist innerhalb von etwa
einer Stunde offensichtlich, siehe zum Beispiel 2,
und die Morphologie wird im Lauf der Zeit stetig offensichtlicher.
Eine Expression neuronaler Marker ist auch innerhalb von etwa 30
Minuten nach der Behandlung ersichtlich. So differenzierte, neuronale
Zellen exprimieren schließlich
auch verschiedene Proteinmarker, einschließlich, aber nicht beschränkt auf
Tyrosinhydroxylase, Tubulin, Cholinacetyltransferase, Synaptophysin
und TOAD, die alle Proteine sind, die notwendigerweise mit Neuronen
und neuronalen Prozessen verbunden sind.
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Diese
neu differenzierten neuronalen Zellen sind beim Behandeln von Patienten,
die von Krankheiten der cholinergen und katecholaminergen Systeme
betroffen sind, und allgemeiner von Patienten, die von Krankheiten
des Zentralnervensystems betroffen sind, nützlich.
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Antioxidationsmittel
dienen als diejenigen Verbindungen, die eine neuronale Differenzierung
induzieren, einschließlich
beta-Mercaptoethanols, Dimethylsulfoxids, butylierten Hydroxytoluols,
butylierten Hydroxyanisols, Ascorbinsäure, Dimethylfumarats und N-Acetylcysteins,
aber nicht darauf beschränkt.
Besonders bevorzugte Ausführungsformen,
wie hier im Abschnitt mit den Beispielen offenbart, schließen beta-Mercaptoethanol,
Dimethylsulfoxid und eine Kombination von Dimethylsulfoxid und butyliertem
Hydroxyanisol als bevorzugte Antioxidationsmittel ein. Die Erfindung
ist jedoch nicht auf jene Antioxidationsmittel, die hier offenbart
sind, beschränkt
und sollte dahingehend ausgelegt werden, dass sie alle Antioxidationsmittel
und auch andere Verbindungen, die eine neuronale Differenzierung von
Markstromazellen induzieren, einschließt.
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Die
Erfindung veranschaulicht auch die Verwendung von Wachstumsfaktoren
als diejenigen Verbindungen, die eine neuronale Differenzierung
induzieren, im Verfahren des Induzierens einer Differenzierung von
MSC zu neuronalen Zellen. Solche Wachstumsfaktoren schließen Fibroblasten-Wachstumsfaktor
2, Plättchen-Wachstumsfaktor
und Nerven-Wachstumsfaktor und auch verwandte Wirkstoffe ein, sind
aber nicht darauf beschränkt.
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Neuronale
Identität
kann durch Anfärben
der differenzierten, neuronalen Zellen zum Nachweis von Neuronen-spezifischen
Markern bestätigt
werden. Beispiele solcher Marker sind Neurofilament-M (NF-M), Protein
tau, Neu-N, Neuronen-spezifische Enolase (NSE), Nestin und trkA.
Eine fortschreitende Differenzierung von der Markstromazelle zur
neuronalen Zelle korrespondiert mit einem Anstieg bei jedem von
diesen Markern, was darauf hinweist, dass neuronale Zellen produziert
werden. Eine weitere Charakterisierung kann unter Einsatz bekannter
immunzytochemischer und Antikörpertechniken
erreicht werden. Zum Beispiel enthüllt eine immunzytochemische
Analyse dieser neuronalen Zellen, dass die Zellen auch Proteine,
die mit natürlich
differenzierten Neuronen in Zusammenhang stehen, exprimieren. Solche
Proteine schließen
Tubulin, TOAD und Synaptophysin ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Es
kann auch ein Antikörpernachweis
von Cholinacetyltransferase und Tyrosinhydroxylase bewertet werden.
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Es
ist aus den hier offenbarten Daten offenkundig, dass es möglich ist,
isolierte Markstromazellen in vitro zu neuronalen Zellen zu differenzieren.
So differenzierte, neu ronale Zellen sind beim Behandeln von Patienten,
die von irgendeiner aus einer großen Vielfalt von Krankheiten,
Funktionsstörungen
oder Zuständen
des Zentralnervensystems betroffen sind, nützlich.
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Die
Erfindung beinhaltet auch ein Verfahren zum Herstellen einer isolierten
neuronalen Zelle aus isolierten Markstromazellen wie in den Ansprüchen (siehe
Anspruch 7) dargelegt. Das Verfahren umfasst das Differenzieren
einer isolierten Markstromazelle in derselben allgemeinen Art wie
oben vorgetragen, womit man eine isolierte neuronale Zelle herstellt. Eine
Zellpopulation umfassend ist in den Ansprüchen 13–12 definiert.
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Die
isolierte neuronale Zelle, die in beiden der obigen Verfahren vorgetragen
wurde, kann mit einer isolierten Nukleinsäure, die für ein therapeutisches Protein
kodiert, transfiziert sein. Das therapeutische Protein wird, wenn
es exprimiert wird, einen Patienten, der eine Krankheit, eine Funktionsstörung oder
einen Zustand des Zentralnervensystems hat, behandeln.
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Eine
große
Fülle vorteilhafter
Proteine ist im Fachgebiet gut bekannt und ist zum Beispiel in
WO 96/30031 und
WO 99/43286 dargelegt. Solche
Beispiele schließen
Zytokine, Chemokine, Neurotrophine, andere trophische Proteine,
Wachstumsfaktoren, Antikörper
und Gliom-toxisches Protein ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Wenn
die transfizierten, neuronalen Zellen, die für solche Proteine kodieren, einem
Patienten verabreicht werden, werden die neuronalen Zellen in vorteilhafter
Weise Zellen, die bereits im Zentralnervensystem vorhanden sind,
beeinflussen. Zum Beispiel können
transfizierte, neuronale Zellen, die in das Zentralnervensystem
eingebracht werden, dazu verwendet werden, jeglichen Schaden am
Zentralnervensystem zu reparieren und/oder Tumoren des zentralen
Nervensystems zu bekämpfen.
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Die
internationalen Patentanmeldungen
WO 96/30031 und
WO 99/43286 beschreiben
auch die Verwendung von MSC in Therapien für eine große Vielfalt von Krankheiten,
Funktionsstörungen
und Zuständen
des ZNS, die generische Erkrankungen des ZNS (zum Beispiel Tay-Sach's-, Sandhoff-Krankheit, Hurler-Syndrom,
Krabbe-Syndrom), Geburts-induzierte, traumatische Verletzung des
ZNS, Krankheiten, Funktionsstörungen oder
Zustände
des ZNS im Erwachsenenalter (zum Beispiel Parkinson-, Alzheimer-
und Huntington'sche
Krankheiten, Altersdemenz, Epilepsie, amyotrophe Lateralsklerose,
Multiple Sklerose, Trauma, Tumoren, Schlaganfall und Ähnliches)
und degenerative Krankheiten und traumatische Schädigung des
Rückenmarks
beinhalten, aber nicht darauf beschränkt sind.
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Bei
Neugeborenen und Kindern können transfizierte,
neuronale Zellen zur Behandlung einer Zahl von genetischen Krankheiten
des Zentralnervensystems verwendet werden, einschließlich Tay-Sach's-Krankheit und der
verwandten Sandhoff-Krankheit, Hurler-Syndroms und verwandten Mucopolysaccharidosen
und Krabbe-Syndroms, aber nicht darauf beschränkt. Diese Krankheiten rufen
auch in unterschiedlichen Ausmaßen
Schädigungen
im Rückenmark
und in peripheren Nerven hervor und sie haben auch nicht neurologischen
Wirkungen. Während
die nicht neurologischen Wirkungen dieser Krankheiten mit Knochenmarkstransplantation
therapierbar sein können,
bessern sich die Wirkungen auf das Zentralnervensystem trotz Knochenmarkstransplantation
nicht. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist dazu nützlich,
die Wirkungen dieser Arten von Krankheiten auf das Zentralnervensystem
anzugehen. Darüber
hinaus ist bei Neugeborenen und Kindern eine Kopfverletzung während oder
nach der Geburt durch Einbringen dieser neuronalen Zellen direkt
in das Zentralnervensystem der Kinder therapierbar. Eine Tumorbildung
im Zentralnervensystem bei Kinder ist unter Einsatz der Verfahren
der vorliegenden Erfindung auch therapierbar.
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Krankheiten
des Zentralnervensystems im Erwachsenenalter sind auch durch Verabreichen
isolierter, neuronaler Zellen an den Erwachsenen therapierbar. Solche
Krankheiten des Erwachsenenalters beinhalten Parkinson-Krankheit,
Alzheimer-Krankheit, Verletzung des Rückenmarks, Schlaganfall, Trauma,
Tumoren, degenerative Krankheiten des Rückenmarks wie zum Beispiel
amyotrophe Lateralsklerose, Huntington'sche Krankheit und Epilepsie, sind aber
nicht darauf beschränkt.
Eine Behandlung von Multipler Sklerose wird auch in Erwägung gezogen.
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Eine
Behandlung von Verletzungen des Rückenmarks wird von der vorliegenden
Erfindung auch in Erwägung
gezogen. Verfahren zum Behandeln von Verletzungen des Rü ckenmarks
auf dem Stand der Technik gehen mit dem Verwenden von Fibroblastenzellen
einher, um bei Tieren Neurotrophine an die Stellen der Schädigungen
des Rückenmarks
zu bringen. Die auf diese Weise abgegebenen Neurotrophine verringern
die Schädigung
oder behandeln die Verletzung auf eine andere Weise. Jedoch produzieren
Fibroblasten große
Mengen von Kollagen, was zu einer Fibrose an der Stelle der Schädigung führt und somit
die vorteilhaften Wirkungen der Behandlung zunichte macht. Die Abgabe
von Neurotrophinen an Schädigungen
des Rückenmarks
unter Verwendung von transfizierten, neuronalen Zellen ist gegenüber Verfahren
auf dem Stand der Technik von Vorteil, weil neuronale Zellen keine
großen
Mengen von Kollagen produzieren und daher nicht zur Fibrose führen sollten.
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Die
Erfindung zieht ferner in Erwägung,
einen menschlichen Patienten, der eine Krankheit, eine Funktionsstörung oder
einen Zustand des Zentralnervensystems hat, durch Verabreichen der
differenzierten, neuronalen Zeilen der Erfindung an das Zentralnervensystem
des Patienten wie in den Ansprüchen
definiert (siehe Ansprüche
8–12)
zu behandeln. Verfahren zum Behandeln eines menschlichen Patienten
sind in
WO 96/30031 und
WO 99/43286 , die hier durch
Bezugnahme als Bestandteil gelten, als ob sie ihrer Gesamtheit hier
dargelegt wären,
beschrieben. Verfahren zum Verabreichen differenzierter Neuronen
an einen Patienten sind mit denen, die für MSC wie in
WO 96/30031 und
WO 99/43286 beschrieben verwendet
wurden, identisch. Die Verfahren umfassen das Einbringen von einer
isolierten Nukleinsäure,
die für
ein heilsames Protein kodiert, in differenzierte, neuronale Zellen
und umfassen auch das Verwenden differenzierter, neuronaler Zellen selbst
in zellbasierten Therapeutika, wenn ein Patient der Verabreichung
solcher Zellen bedarf. Die differenzierten, neuronalen Zellen der
vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise einem Menschen zu verabreichen
und ferner sind die neuronalen Zellen vorzugsweise dem Zentralnervensystem
des Menschen zu verabreichen. Unter einigen Umständen sind die differenzierten,
neuronalen Zellen dem Teil des Corpus striatum im menschlichen Gehirn
zu verabreichen. Die genaue Stelle der Verabreichung der neuronalen
Zellen wird von jeder Zahl von Faktoren abhängen, einschließlich der
Stelle der zu behandelnden Schädigung,
der Art der Krankheit, die behandelt wird, des Alters des Menschen
und der Schwere der Krankheit und Ähnlichem, aber nicht darauf
beschränkt.
Die Festlegung der Stelle der Verabreichung liegt sehr im Geschick
des Fachmanns, der in der Verabreichung von Zellen an Säuger erfahren
ist.
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Die
Art der Verabreichung der differenzierten, neuronalen Zellen an
das Zentralnervensystem des Menschen kann in Abhängigkeit von vielen Faktoren
variieren, einschließlich
der Art der Krankheit, die behandelt wird, des Alters des Menschen,
ob in die neuronalen Zellen isolierte DNA eingebracht ist und Ähnlichem,
aber nicht darauf beschränkt.
Ein Beispiel der Verabreichung von neuronalen Zellen direkt in Hirngewebe
wird hier in dem Abschnitt mit den Beispielen bereitgestellt. Im
Allgemeinen werden Zellen in das Gehirn eines Säugers eingebracht, indem zuerst
eine Öffnung
in der Schädelkapsel,
durch welche die Zellen in das Hirngewebe eingeführt werden, geschaffen wird.
Zellen können
durch direkte Injektion, durch Verwenden eines Shunts und durch
jedes andere Mittel, das im Fachgebiet zur Einbringung von Verbindungen
in das Zentralnervensystem eingesetzt wird, eingebracht werden.
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Definitionen
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Die
Artikel „ein" und „eine" werden hier verwendet,
um auf ein oder mehr als ein (das heißt auf mindestens ein) grammatikalisches
Objekt des Artikels zu verweisen. Als Beispiel bedeutet „ein Element" ein Element oder
mehr als ein Element.
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Wie
hier verwendet sollte „Zentralnervensystem" so interpretiert
werden, dass es Gehirn und/oder das Rückenmark eines Säugers einschließt. Der
Begriff kann unter einigen Umständen auch
das Auge und den Sehnerv beinhalten.
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Wie
hier verwendet werden „Stromazellen", „isolierte
Markstromazellen" und „MSC" austauschbar verwendet
und sollen sich auf die kleine Fraktion von Zellen im Knochenmark,
die als Stammzellen-ähnliche
Vorläufer
von Osteozyten, Chondrozyten und Adipozyten dienen können und
die durch ihre Fähigkeit,
an Plastikschalen anzuhaften, aus dem Knochenmark isoliert werden,
beziehen. Markstromazellen können
von jedem Tier stammen. In einigen Ausführungsformen stammen Stromazellen
von Primaten, vorzugsweise Menschen.
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Wie
hier verwendet soll sich der Begriff „Antioxidationsmittel" auf diejenigen Substanzen,
die Oxidation oder Reaktionen, die von Sauerstoff oder Peroxiden
gefördert
werden, hemmen, beziehen. Beispiele von Antioxidantien schließen beta-Mercaptoethanol,
Dimethylsulfoxid, butyliertes Hydroxytoluol, butyliertes Hydroxyanisol,
Ascorbinsäure,
Dimethylfumarat und N-Acetylcystein ein, sind aber nicht darauf
beschränkt.
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Wie
hier verwendet werden die Begriffe „heilsames Protein" und „therapeutisches
Protein" austauschbar
verwendet und sollen sich auf ein Protein beziehen, welches das
Protein, für
das ein fehlerhaftes Gen kodiert, und/oder unzureichende Genexpression,
die kausal mit der Krankheit oder Symptomen der Krankheit, der Funktionsstörung oder
des Zustandes, die oder der durch einen Gendefekt gekennzeichnet
ist, verbunden ist, kompensieren kann. Die Gegenwart des Proteins
lindert, vermindert, verhindert die Ursachen und/oder die Symptome,
welche die Krankheit, die Funktionsstörung oder den Zustand charakterisieren,
oder führt
dazu, dass sie gelindert, vermindert oder verhindert werden.
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Wie
hier verwendet soll sich eine Krankheit, eine Funktionsstörung oder
ein Zustand, die oder der mit einem heilsamen oder therapeutischen
Protein behandelt werden kann, auf eine Krankheit, eine Funktionsstörung oder
einen Zustand beziehen, welche oder welcher durch die Gegenwart
eines Proteins, das die Ursachen und/oder die Symptome, welche die
Krankheit, die Funktionsstörung
oder den Zustand charakterisieren, lindert, vermindert, verhindert oder
dazu führt,
dass sie gelindert, vermindert oder verhindert werden, behandelt
oder verhindert werden kann. Krankheiten, Funktionsstörungen und
Zustände,
die mit einem heilsamen Protein behandelt werden können, beinhalten
Krankheiten, Funktionsstörungen
und Zustände,
die durch einen Gendefekt gekennzeichnet sind, und auch solche,
die nicht durch einen Gendefekt gekennzeichnet sind, die aber gleichwohl
durch die Gegenwart eines Proteins, das die Ursachen und/oder die
Symptome, welche die Krankheit, die Funktionsstörung oder den Zustand charakterisieren,
lindert, vermindert, verhindert oder dazu führt, dass sie gelindert, vermindert
oder verhindert werden, behandelt oder verhindert werden können.
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Der
Begriff „isolierte
Nukleinsäure" sollte so interpretiert
werden, dass er sich auf eine Nukleinsäuresequenz oder ein Segment
oder Fragment bezieht, die oder das aus den Sequenzen, die es in
einem natürlicherweise
auftretenden Zustand flankieren, aufgereinigt wurde, zum Beispiel
auf ein DNA-Fragment, das aus den Sequenzen, die normalerweise dem
Fragment benachbart sind, entfernt wurde, zum Beispiel aus den Sequenzen,
die dem Fragment in einem Genom, in dem es natürlicherweise vorliegt, benachbart
sind. Der Begriff trifft auch auf Nukleinsäuren, die im Wesentlichen von
anderen Bestandteilen, die normalerweise mit der Nukleinsäure einhergehen,
zum Beispiel von RNA oder DNA oder Proteinen, die normalerweise
in der Zelle mit ihr einhergehen, gereinigt worden sind, zu.
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Wie
hier verwendet sollen sich „transfizierte Zellen" auf Zellen beziehen,
welche unter Einsatz einer jeglichen Technologie, die eingesetzt
wird, um Nukleinsäuremoleküle in Zellen
einzubringen, wie zum Beispiel klassischer Transfektion (von Calciumphosphat
oder DEAE-Dextran vermittelte Transfektion), Elektroporation, Mikroinjektion,
Liposomvermittelten Transfers, chemisch vermittelten Transfers,
Liganden-vermittelten Transfers oder rekombinanten Virusvektortransfers,
aber nicht darauf beschränkt, mit
einem Genkonstrukt ausgestattet wurden.
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Der
Begriff „Differenzierung" wie hier verwendet
sollte so interpretiert werden, dass er die Induktion von einem
differenzierten Phänotyp
in einer undifferenzierten Zelle durch gemeinsames Kultivieren der
undifferenzierten Zelle in Gegenwart einer im Wesentlichen homogenen
Population von differenzierten Zellen, in Gegenwart von Produkten
von differenzierten Zellen oder in Gegenwart eines Mittels, das
Zelldifferenzierung induziert, bedeutet.
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Der
Begriff „neuronale
Zelle" wie hier
verwendet sollte so interpretiert werden, dass er eine MSC bedeutet,
die so differenziert ist, dass sie mindestens einen der folgenden
neuronalen Marker exprimiert: Neuronen-spezifische Enolase (NSE), NeuN,
Neurofilament M oder Protein tau.
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Der
Begriff „Neuron" wie hier verwendet
sollte so interpretiert werden, dass er eine Nervenzelle bedeutet,
die fähig
ist, elektrische Impulse vom Zentralnervensystem zu empfangen und
zu leiten. Eine Nervenzelle oder ein „Neuron" umfasst üblicherweise einen Zellkörper, ein
Axon, Axonenden und Dendriten.
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Der
Begriff „eine
neuronale Differenzierung induzierende Verbindung" soll sich auf diejenigen Verbindungen
beziehen, die fähig
sind, eine Differenzierung einer Stromazelle zu einer neuronalen
Zelle zu induzieren. Diese Verbindungen schließen Antioxidationsmittel, trophische
Faktoren und Wachstumsfaktoren ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
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Die
Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden experimentellen
Beispiele weiter ausführlich
beschrieben. Diese Beispiele werden lediglich zu Zwecken der Veranschaulichung
bereitgestellt und sind nicht als limitierend vorgesehen, außer wenn
es anderweitig angegeben ist. Somit sollte die Erfindung keineswegs
so interpretiert werden, dass sie auf die folgenden Beispiele beschränkt wäre, sondern
sollte vielmehr so interpretiert werden, dass sie jegliche und alle
Variationen wie in den Ansprüchen definiert,
die als Ergebnis des hier bereitgestellten Lehrinhalts offenkundig
werden, umfasst.
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Beispiele
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Die
in diesem Beispiel aufgezeigten Experimente können wie folgt zusammengefasst
werden.
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Stromazellen
aus Knochenmark weisen viele Merkmale einer Stammzellenpopulation
auf. Sie können
in großem
Ausmaß in
vitro expandiert und zum Differenzieren zu vielen mesenchymalen
Zelltypen induziert werden (siehe zum Beispiel
WO 96/30031 ;
WO 99/43286 ). Eine Differenzierung
zu nicht mesenchymalen Entwicklungsgängen wurde jedoch nicht nachgewiesen.
Hier wurden Stromazellen der adulten Ratte als undifferenzierte
Zellen für
mehr als 14 Passagen in Kultur expandiert, was auf ihre proliferative
Kapazität
hinweist. Ferner veranlasste ein neues Behandlungsprotokoll die
Stromazellen dazu, einen neuronalen Phänotyp, der verschiedene Neuronen-spezifische Marker,
das heißt
Neuronen-spezifische Enolase (NSE), NeuN, Neurofilament-M, tau, Nestin
und trkA, exprimiert, aufzuweisen.
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Darüber hinaus
bildeten die refraktilen Zellkörper
der behandelten Zellen lange Ausläufer, die in Wachstumskegeln
und Filopodien, die für
neuronale Zellen typisch sind, endeten, aus. Der fluoreszierende
Farbstoff FM1-43 markierte Wachstumskegel, passend zu einer Transmitterfreisetzung
und einer Wiedergewinnung synaptischer Vesikel durch die behandelten
Zellen. Klonale Zelllinien, die aus Einzelzellen etabliert wurden,
proliferierten und führten
sowohl zu undifferenzierten Zellen als auch zu Zellen, die einen
neuronalen Phänotyp
aufwiesen.
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Menschliche
Markstromazellen, die unter Verwendung des hier offenbarten, neuen
Protokolls behandelt wurden, differenzierten ähnlich wie rMSC zu Neuronen,
was zeigt, dass das Protokoll nicht auf Stromazellen von Nagern
beschränkt
ist. Die hier offenbarten Daten zeigen konsequenterweise zum ersten
Mal, dass Markstromazellen von Säugern
dazu veranlasst werden können,
ihre mesenchymale Festlegung zu überwinden
und dass sie ein reichliches und zugängliches, zelluläres Reservoir
für die
Behandlung einer Vielfalt von neurologischen Krankheiten, Funktionsstörungen und
Zuständen
bilden können.
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Die
in den in diesem Beispiel aufgezeigten Experimenten eingesetzten
Materialen und Methoden werden nun beschrieben.
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Zellkultur
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MSC
von Ratten wurden ursprünglich
in Alpha-modifiziertem Eagle Medium (alpha-MEM), ergänzt mit 20 % FBS, 2 mM L-Glutamin,
100 Einheiten pro Milliliter Penicillin, 100 Milligramm pro Milliliter Streptomycin
und 25 Nanogram pro Milliliter Amphotericin B, kultiviert. Für jede Passage
wurden die Zellen bei etwa 8.000 Zellen pro Quadratzentimeter ausplattiert
und zur Konfluenz angezogen. Bei Passage 6 wurden die Zellen in
DMEM (pH 8,0)/20 % FBS ohne zusätzliche
Ergänzung
transferiert und über Passage
14 hinaus gehalten. Die MSC von Ratten wurden mit einem Protokoll
und Verfahren, die vom Institutional IACUC genehmigt waren, gewonnen. Die
menschlichen Proben wurden von Freiwilligen mit Einverständniserklärung und
in Übereinstimmung mit
einem vom Institutional Review Board genehmigten Protokoll gewonnen.
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Western-Blot
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Dreißig Milligramm
Proteinextrakt aus unbehandelten (U) und BME-induzierten (I) rMSC-Kulturen wurden auf
einem 4 %–20
% Acrylamid-Gradientengel aufgetrennt und elektrophoretisch auf
eine Nylonmembran übertragen.
Der Western-Blot wurde unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen
Tubulin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), gefolgt von einem Sekundärantikörper, der
mit Peroxidase aus Meerrettich (HRP) konjugiert war, auf Expression
von Tubulin untersucht. Die Farbentwicklung wurde unter Verwendung
von angereicherten Chemilumineszenz-Reagenzien (Amersham, Piscataway,
NJ) vorgenommen. Der Blot wurde dann gestrippt und unter Verwendung
eines polyklonalen Antikörpers
gegen NSE (ICN) auf Expression von NSE untersucht. Wieder waren
die Sekundärantikörper HRP-konjugiert
und Farbe wurde unter Einsatz von ECL-Reagenzien entwickelt.
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Immunzytochemie
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Kultivierte
rMSC wurden mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, mit einem Primärantikörper über Nacht bei
4°C inkubiert,
mit einem Sekundärantikörper eine Stunde
lang inkubiert, gefolgt von einer Einwirkung eines Avidin-Biotin-Komplexes
für eine
Stunde bei 25°C.
Als chromogenes Substrat für
HRP diente Diaminobenzidin (DAB).
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FM1-43-Markierung
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Die
Kulturen wurden mit DMSO/BHA in Serum-freien Medien (SFM) etwa 4
Stunden lang behandelt. Die Zellen wurden weitere 30 Minuten lang in
künstlichem
Liquor cerebrospinalis (aCSF)/BHA gehalten. Die Zellen wurden in
aCSF, der 1 millimolar FM1-43 und 75 mM KCl enthielt, 60 Sekunden
lang markiert. Die Markierungsmischung wurde entfernt, die Kulturen
wurden zweimal mit aCSF gewaschen und die Zellen wurden 60 Minuten
lang in aCSF inkubiert, um Hintergrundfärbung zu vermindern. Die Kulturen
wurden mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und vor der Untersuchung
24 Stunden lang in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) eingeweicht.
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Die
Ergebnisse der in diesem Beispiel aufgezeigten Experimente werden
nun beschrieben.
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Charakterisierung von Stromazellen
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Mesenchymale
Stromazellen von der Ratte (rMSC) wurden aus den Oberschenkelknochen
von adulten Ratten isoliert und in vitro propagiert (Azizi et al.,
1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3908–3913). Die in 1A offenbarten
Daten zeigen, dass sich die Verteilung der Zellen, die mit Antikörper gegen CD
11b gefärbt
sind (leer), nicht von derjenigen der Isotyp-Kontrolle (gefüllt) unterscheidet,
was darauf hinweist, dass die rMSC-Kulturen keine wesentlichen Zahlen von
kontaminierenden, CD11b exprimierenden Zellen enthalten. Ferner
zeigen die in 1B offenbarten Daten auch, dass
sich die Intensität
der Färbung
zwischen den Profilen für
CD45-Antikörper (leer)
und Kontrolle (gefüllt)
nicht unterscheidet, was darauf hinweist, dass die kultivierten
rMSC nicht von CD45 exprimierenden Zellen kontaminiert sind. Fluoreszenz-Zellsortierung
bei Passage 1 zeigte auch, dass die Zellen für CD11b (1A)
und für
CD45 (1B), welche mit lymphohämatopoetischen
Zellen verbundene Zelloberflächenmarker
sind, negativ waren. Somit gab es keinen Nachweis von hämatopoetischen
Vorläufern
in den Kulturen.
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Dagegen
zeigen die hier offenbarten Daten, dass rMSC CD90 exprimierten (10), passend zu ihrem undifferenzierten
Zustand. Bei geringen Plattierungsdichten wuchsen rMSC als eine
Monolage von großen,
flachen Zellen. Als die Zellen Konfluenz erreichten, nahmen sie
eine mehr spindelförmige,
fibroblastische Morphologie an. Zu Beginn der Untersuchungen zur
neuronalen Differenzierung, die hier an anderer Stelle offenbart
werden, wurden unbehandelte rMSC ferner durch Färbung auf die Zelloberflächenmarker
CD44 und CD71 charakterisiert. Die Zellen waren für Expression
von CD44 und CD71 positiv, im Einklang mit früheren Berichten (Pittenger et
al., 1999, Science 284:143–147;
Bruder et al., 1998, Clin. Orthop. Relat. Res. 355S:S247–S256).
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Neuronale Differenzierung
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Um
den neuronalen Phänotyp
zu induzieren wurden rMSC anfänglich
in subkonfluenten Kulturen in Medien, die mit 1 mM beta-Mercaptoethanol
(BME) ergänzt
waren, 24 Stunden lang gehalten. Unter diesen Bedingungen waren
keine Änderungen
in der Morphologie offensichtlich. Um eine neuronale Differenzierung
zu bewirken wurden die Zellen in Serum-freies Medium, das 1–10 millimolar
BME enthielt (SFM/BME), transferiert. Der Prozentsatz von Zellen, die
eine neuronale Morphologie annahmen, stieg bei höheren BME-Konzentrationen an
und wurde durch eine Vorbehandlung mit BME gesteigert. Innerhalb von
60 Minuten Einwirkens von SFM/BME waren Änderungen in der Morphologie
von einigen der rMSC ersichtlich (2C). Reagierende
Zellen nahmen fortschreitend neuronale morphologische Kennzeichen über die
ersten drei Stunden an. Anfänglich
zog sich das Zytoplasma in den flachen rMSC in Richtung auf den
Zellkern hin zurück,
wodurch es einen geschrumpften, multipolaren Zellkörper bildete
und peripher membranöse,
Ausläufern ähnliche
Ausdehnungen hinterließ (0–90 Minuten).
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Behandelte
Zellen zeigten innerhalb von 30 Minuten der Behandlung eine erhöhte Expression von
dem neuronalen Marker NSE. Über
die nachfolgenden 2 Stunden wurden die Zellkörper zunehmend sphärisch und
refraktil, wobei sie ein typisch neuronales, perikaryales Erscheinungsbild
aufwiesen. Es wurden weiter Ausläufer
ausgebildet, die terminale Auftreibungen, die Wachstumskegeln ähnlich waren, und
filipodiale Erweiterungen (siehe zum Beispiel 2G und 2H)
entwickelten. Die zellulären Ausläufer wiesen
primäre
und sekundäre
Verzweigungen auf und machten ein dynamisches Wachstum durch. Retraktion
wie auch Extension waren offensichtlich, als sie durch die Tatsache,
dass die bei 120 Minuten (2E) mit
einem Pfeil markierte Zelle ursprünglich mit einem benachbarten
Ausläufer (markiert
durch ">") in Kontakt stand, welcher sich bei 180
Minuten (2G) mit Kontaktverlust zurückzog, nachgewiesen
wurden.
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Um
mögliche
neuronale Differenzierung weiter zu charakterisieren wurden mit
BME behandelte Kulturen gefärbt,
um eine Expression des neuronalen Markers Neuronen-spezifische Enolase
(NSE) nachzuweisen. Nicht reagierende, flache rMSC exprimierten sehr
niedrige, aber nachweisbare Spiegel von dem Protein NSE, passend
zum früheren
Nachweis von winzigen Mengen von Protein und/oder Vorläufer in
Zellen, die aus Knochenmark stammen (Pechumer et al., 1993, Lab.
Invest. 89:743–749;
Reid et al., 1991, Clin. Pathol. 44:483–486; vanObberghen et al., 1988,
J. Neurosci. Res. 19:450–456).
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Ein
fortschreitender Übergang
von rMSC zu einem neuronalen Phänotyp
fiel mit erhöhter
Expression von NSE zusammen (
3A). Zellen,
die geschrumpfte Zellkörper
und Ausläufer
aufwiesen, färben
sich dunkelbraun für
Expression von NSE an (Pfeile), während flache, nicht reagierende
rMSC (>) eine minimale
NSE-Färbung
zeigten. Zellen in Zwischenstadien im Differenzierungsablauf (→) zeigten Übergangsmorphologien
und hellbraune Färbung, was
auf eine Gleichzeitigkeit von morphologischer und molekularer Differenzierung
hinweist. Von rMSC abstammende Neuronen zeigten verschiedene neuronale
Morphologien (
3B), die von einfachen, bipolaren
(
)
bis zu großen,
komplex verzweigten, multipolaren Zellen (Pfeil) reichen. Seltene
NSE-positive Neuronen zeigten Pyramidalzell-Morphologien (
3C),
während
Neuronen, die lange Ausläufer mit
offensichtlichen Verdickungen (Pfeile) ausbildeten, häufiger waren
(
3D). Gruppen von differenzierten Zellen wiesen
intensiv positiven NSE-Nachweis auf und die Ausläufer bildeten komplexe Netzwerke
(
3E). Auch innerhalb dieser Gruppen waren typische,
flache rMSC (>) nur
leicht gefärbt,
passend zu ihrem undifferenzierten Zustand.
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Die
Western-Blot-Analyse (3E) bestätigte die Expression von geringen
Spiegeln des Proteins NSE in nicht induzierten rMSC. Eine Induktion
des neuronalen Phänotyps
führte
zu einer dramatischen Steigerung der Expression von NSE, passend
zu den immunzytochemischen Daten.
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Um
die neuronalen Kennzeichen weiter zu untersuchen wurden differenzierte
Kulturen auf NeuN, einen Neuronen-spezifischen Marker, der in postmitotischen
Zellen exprimiert wird (Sarnat et al., 1998, Brain Res. 20:88–94), angefärbt. Eine
Untergruppe von Zellen, die abgerundete Zellkörper und Ausläufer (Pfeil)
aufwiesen, färbten
sich auf Expression von NeuN an, während undifferenzierte Zellen (<) NeuN-negativ blieben
(4A). Im Einklang mit früheren Berichten, die eine NeuN-Anfärbung von neuronalen
Zellen be schreiben (Sarnat et al., 1998, Brain Res. 20:88–94), war
die Anfärbung
von NeuN auf den Kern und umgebendes Zytoplasma beschränkt und
dehnte sich nicht in die Ausläufer
aus. Einige Zellen, die eindeutige neuronale Morphologien aufwiesen,
exprimierten NeuN nicht (→),
während benachbarte
Zellen intensiv positiv waren (Pfeil) (4B). Dieses
Muster steht in Gegensatz zu dem, das für NSE-Anfärbung ermittelt wurde, wo jede
Zelle, die eine neuronale Morphologie aufwies, eine gesteigerte
Expression von NSE zeigte. Ohne durch irgendeine bestimmte Theorie
gebunden sein zu wollen lassen diese Daten darauf schließen, dass
es sich bei einer Untergruppe von NSE-positiven Zellen um postmitotische
Neuronen handelt. Ebenso ohne durch irgendeine bestimmte Theorie
gebunden sein zu wollen kann es sein, dass die antioxidativen Eigenschaften
von BME, welche das neuronale Überleben
in vitro verbessern (Ishii et al., 1993, Neurosci. Lett. 163:159–162), teilweise
die Induktion von neuronaler Differenzierung in MSC vermitteln können, obwohl
dieses überraschende
Ergebnis basierend auf früheren
Untersuchungen unerwartet war.
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Nestin,
ein intermediäres
Faserprotein, wird in neuroepithelialen, neuronalen Vorläuferstammzellen
exprimiert, wobei die Expression mit der Reifung des Neurons abnimmt.
Experimentelle Daten zeigen, dass die Expression von Nestin im Lauf
der Zeit abnimmt, wenn die MSC-differenzierten, neuronalen Zellen
angefärbt
werden, um Nestin nachzuweisen (9A–9C).
Ferner zeigt die Färbung
auf trkA, einen Rezeptor für
Nervenwachstumsfaktor von hoher Affinität, der in Neuronen vorhanden
ist, dass die Spiegel von trkA während
des ganzen Reifungsprozesses der MSC-differenzierten, neuronalen
Zelle unverändert
bleiben (9D–9F).
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Um
damit zu beginnen, die Hypothese, dass die antioxidativen Eigenschaften
von BME die Induktion von neuronaler Differenzierung in MSC vermittelten,
zu untersuchen, wurden rMSC mit anderen Antioxidationsmitteln, zum
Beispiel mit Dimethylsulfoxid (DMSO), butyliertem Hydroxyanisol
(BHA) oder butyliertem Hydroxytoluol (BHT), Ascorbinsäure, Dimethylfumarat,
N-Acetylcystein und Ähnlichem
behandelt, sowohl allein als auch in. Kombination miteinander. Ferner
induzierte eine Behandlung mit dem Antioxidationsmittel Dithiothreitol
(DTT) in Kombination mit BHA auch die neuronale Differenzierung
durch MSC, was darauf schließen
lässt,
dass DTT allein auch eine neuronale Differenzierung hervorrufen kann.
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Jede
Behandlung mit einem Antioxidationsmittel (zum Beispiel DMSO, BHA,
BHT, Ascorbinsäure,
Dimethylfumarat, N-Acetylcystein und Ähnlichem, sowohl allein als
auch in Kombination) rief neuronale Morphologien mit einem Zeitverlauf,
der den Wirkungen von BME ähnlich
war, hervor. Zusätzlich
ließen vorläufige Daten
darauf schließen,
dass eine Behandlung, die etwa 2 % (v/v) DMSO und etwa 200 millimolar
BHA (DMSO/BHA) verwendet, bevorzugt war, obwohl eine weite Spanne
von Konzentrationen neuronale Differenzierung hervorrief.
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Um
die neuronale Identität
weiter zu charakterisieren wurden MSC, die mit DMSO/BHA behandelt
waren, auf Neurofilament-M (NF-M), ein neuronenspezifisches, intermediäres Filament,
das dabei hilft, die Verlängerung
von Neuriten in Gang zu bringen (Carden et al., 1987, Neurosci.
7:3489–3504)
angefärbt.
Die vorher hier an anderer Stelle offenbarten Daten zeigten, dass
eine Behandlung von MSC mit BME zu einer gesteigerten Expression
von NF-M in Zellen, die neuronale Morphologien aufwiesen, führte. Die
meisten Zellen, die nach Einwirkung von DMSO/BHA abgerundete Zellkörper mit
Ausläufern (Pfeil)
zeigten, exprimierten hohe Spiegel von NF-M, während flache, undifferenzierte
Zellen (>) dies nicht taten
(5A). Eine vorherige Adsorption des NF-M-Antikörpers mit
gereinigtem Protein NF-M hob die Färbung auf (5B),
was die Spezifität
feststellte.
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Mit
DMSO/BHA behandelte Kulturen wurden dann auf das Vorliegen von tau,
einem Neuronen-spezifischen, mit Mikrotubuli verbundenen Protein,
das von differenzierenden Neuronen exprimiert wird (Kosik und Finch,
1987, J. Neurosci. 7:3142–3153),
hin untersucht. Zellen, die eine neuronale Morphologie (Pfeil) aufwiesen,
exprimierten das Protein tau sowohl im Zellkörper als auch in den Ausläufern (*),
während
undifferenzierte, flache Zellen tau-negativ waren (<) (5C und 5D).
Die hier offenbarten Daten weisen darauf hin, dass das hier beschriebene
Verfahren neuronale Differenzierung von Markstromazellen induziert.
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Aktivitätsabhängige Wiedergewinnung synaptischer Vesikel
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Um
neuronale Eigenschaften weiter zu charakterisieren wurden Kulturen
mit dem Styrylfarbstoff FM1-43, der die äußere Schicht von synaptischen Vesikeln
nach aktivitätsabhängiger Transmitterfreisetzung
markiert (Setz und Bewick, 1992, Science 255:200–203; Betz et al., 1992, J.
Neurosci. 12:363–375;
Diefenbach et al., 1999, J. Neurosci. 19:9436–9444), behandelt. Eine Einwirkung
depolarisierender Konzentrationen von K+ führte zu
einer fluoreszierenden Markierung von Wachstumskegeln (→) was darauf
schließen
lässt,
dass die Zellen nach einer aktivitätsabhängigen Transmitterfreisetzung
synaptische Vesikel rückgewannen.
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Klonale Untersuchung
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Um
festzustellen, ob einzelne rMSC Stammzelleigenschaften der Selbsterneuerung
und der Pluripotenz aufweisen, wurden einzelne Klone untersucht.
Um Klone zu etablieren wurden rMSC bei etwa 10 Zellen pro Quadratzentimeter
ausplattiert, auf 50–150
Zellen pro Kolonie angezüchtet,
mit Klonierungszylindern isoliert, in gesonderte Vertiefungen und
schließlich
in einzelne Kolben transferiert. Einzelne Zellen replizierten sich
als typische rMSC und differenzierten nach Behandlung mit BME zu NSE-positiven
Neuronen.
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Eine
Untersuchung von vier verschiedenen klonalen Linien ist in 7A–7D gezeigt.
Jeder einzelne Klon brachte nach Behandlung mit BME refraktile,
Ausläufer
tragende, NSE-positive Zellen hervor. Undifferenzierte rMSC (>) und Übergangzellen (→) waren
in jeder klonalen Linie offensichtlich. Daher können Klone, die von einer einzigen
Zelle abstammen, sowohl zu rMSC als auch zu Neuronen führen, was
auf Stammzelleigenschaften hinweist.
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Menschliche Stromazellen differenzieren
zu Neuronen
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Das
neuronale Potenzial von MSC war nicht auf Nager beschränkt, wie
durch die folgenden Experimente unter Verwendung von MSC, die von
Menschen erhalten wurden (hMSC), gezeigt wurde. hMSC wurden aus
einem gesunden, erwachsenen Spender isoliert und in vitro angezogen
(Bjornson et al., 1999, Science 283:534–537). hMSC glichen ihren Entsprechungen
aus Nagern, wobei sie im undifferenzierten Zustand als große, flache
Zellen wuchsen.
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Zellen
aus Passage zwei wurden dem neuronalen Differenzierungsprotokoll
unterzogen und auf Expression von NSE oder NF-M angefärbt. Nach
Behandlung mit BME erlangten hMSC neuronale Eigenschaften und steigerten
die Expression von NSE in einem Zeitrahmen, der demjenigen, der
für rMSC
beobachtet wurde, ähnlich
war. Geschrumpfte Zellkörper
bildeten Ausläufer
aus und färbten
sich innerhalb von 3 Stunden stark auf die Expression von NSE an (8A und 8B).
Es waren auch Übergangzellen
(→) offensichtlich.
Viele Ausläufer,
die von Neuronen, die von hMSC abstammten, ausgebildet worden waren,
zeigten terminale Auftreibungen (Pfeil in 86), die Wachstumskegel
darstellen können.
Wachstumskegelmorphologien mit filopodialen Erweiterungen (↔) waren
auf den Ausläufern,
die von gepaarten Neuronen, die im Bild in 8C abgebildet
sind, ausgebildet wurden, klar ersichtlich. Diese Zellen exprimierten
auch NF-M, passend zu ihrer neuronalen Differenzierung (8D).
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Die
hier offenbarten Daten zeigen, dass MSC von Ratten und Menschen
die Kapazität
zum Differenzieren zu nicht mesenchymalen Abkömmlingen, speziell zu Neuronen,
beibehalten, was darauf schließen
lässt,
dass intrinsische, genomische Mechanismen der Festlegung, der Abstammungslinien-Beschränkung und
des Zellschicksals veränderlich
sind. Umweltsignale können
anscheinend die Expression von einer Pluripotenz, die sich sehr
wohl über
die akzeptierten Schicksalsbeschränkungen von Zellen, die von
klassischen embryonalen Keimblättern
stammen, hinaus erstreckt, herbeiführen. Diese adulten Zellen
sind sowohl selbsterneuernd als auch multipotent (Owens und Friedenstein,
1988, Ciba Foundation Symp. 136, Chichester, U.K. pp. 42–60; Prockop,
1997, Science 276; 71–74;
Ferrari et al., 1998, Science 279:1528–1530; Caplan, 1991, J. Orthop.
Res. 9:641–650;
Pereira et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4857–4861; Kuznetsov
et al., 1997, Brit. J. Haemotology 97:561–570; Majumdar et al., 1998,
J. Cell. Physiol. 176:57–66;
Pittenger et al., 1999, Science 284:143–147), womit sie viele der
Kriterien einer Stammzellpopulation erfüllen.
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Nach
bestem Wissen der Anmelder ist dies der erste Bericht darüber, dass
periphere, mesenchymale Zellen in vitro zu Neuronen differenzieren
können.
Ferner stellt die vorliegende Erfindung zum ersten Mal Verfahren
zum Richten einer Differenzierung von MSC zu neuronalen Zellen in
vitro bereit. MSC sind in der Behandlung einer großen Vielfalt
von neurologischen Krankheiten, Funktionsstörungen und Zuständen nützlich und
diese Zellen bieten erhebliche Vorteile gegenüber anderen, sogenannten „Stamm"zellen. Das heißt, dass
Knochenmarkzellen leicht zugänglich
sind, was die Risiken des Beschaffens neuraler Stammzellen aus dem
Gehirn umgeht, und dass sie eine erneuerbare Population, die in
vitro expandiert werden kann, bereitstellen, was somit ermöglicht,
dass komplexe Genmanipulationen zur Ex-vivo-Gentherapie und/oder
zur Zelltherapie für
Erkrankungen, Funktionsstörungen
oder Zustände
des ZNS, die eine Verabreichung von Zellen an eine Stelle des ZNS
erfordern, vorgenommen werden. Weiterhin überwindet eine autologe Transplantation
die ethischen und immunologischen Bedenken, die mit der Verwendung
von fetalem Gewebe verbunden sind. Darüber hinaus wachsen MSC in Kultur
schnell, womit sie die Notwendigkeit einer Immortalisierung ausschließen, und
differenzieren ausschließlich
unter Verwendung der hier offenbarten Protokolle zu Neuronen.
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Expression von neuralen Proteinen
in MSC-differenzierten neuronalen Zellen
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Die
hier offenbarten Daten zeigen, dass neuronale Zellen, die aus MSC
wie hier beschrieben differenziert sind, verschiedene, mit Neuronen
in Beziehung stehende Proteine exprimieren. Zum Beispiel zeigte
eine immunzytochemische Untersuchung dieser differenzierten Neuronen
die Expression von beta-3-Tubulin. Ferner ist auch TOAD-64, ein
neuronales Protein von unbekannter Funktion, unter Verwendung immunzytochemischer
Verfahren nachweisbar, ebenso wie Synaptophysin, das mit Synapsen
und synaptischen Vesikeln verbunden ist. Unter Verwendung von Verfahren,
die auf polyklonalen und monoklonalen Antikörpern basieren, wurde gezeigt,
dass diese Zellen Cholinacetyltransferase, ein Enzym, das für die Synthese
des Neurotransmitters Acetylcholin verantwortlich ist, exprimieren.
Schließlich
wurde auch Tyrosinhydroxylase, das geschwindigkeitslimitierende
Enzym bei der Katecholamin-Biosynthese, immunzytochemisch in einer
Population dieser differenzierten Neuronen nachgewiesen.
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Es
ist offensichtlich, dass infolge des Vorliegens dieser neuronalen
Genprodukte die differenzierten Neuronen zum Behandeln jener Krankheiten, die
cholinerge und katecholaminerge Systeme beeinträchtigen, wie zum Beispiel Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit oder Schizophrenie
therapeutisch vorteilhaft sein können.
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Transplantation von den differenzierten
Neuronen in Versuchstiere
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Die
differenzierten Neuronen, die wie hier beschrieben geschaffen wurden,
wurden weiter untersucht, um ihre Lebensfähigkeit in vivo zu bestimmen.
Die Neuronen wurden unter Einsatz von steriler Technik und von bekannten
und akzeptierten neurochirurgischen Verfahren (1997, Grill et al.;
1995, Gage et al.; 1994, Dunnett et al.) in den Hippocampus oder
das Striatum des Gehirns oder in das dorsale Horn des Rückenmarks
einzelner Ratten transplantiert. Jede Ratte erhielt ein Transplantat
in eines der oben erwähnten
Gebiete. Die Ratten wurden in ihre Käfige zurückgebracht und erhielten postoperative
Standardpflege mit Zugang zu Futter und Wasser nach Belieben.
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Um
zu ermitteln, ob die Lebensfähigkeit
der Neuronen in vivo erhalten blieb, wurde eine postoperative Untersuchung
der Ratten, die das Transplantat erhielten, durchgeführt. Ratten,
die das neuronale Transplantat erhielten, wurden 42 Tage, nachdem
die Transplantationsoperation stattgefunden hatte, untersucht. Unter
Einsatz von Fluoreszenzmikroskopie, um Bisbenzimid-positive, transplantierte
Zellen nachzuweisen, zeigten histologische Untersuchungen der Regionen
des Hippocampus und des Striatums des Gehirns, dass die transplantierten
Neuronen im Hippocampus überlebten.
Dieses Ergebnis zeigt, dass ein langfristiges Überleben der transplantieren,
differenzieren Neuronen möglich
ist. Eine Untersuchung der Ratten, welche die transplantierten Neuronen
in das Hinterhorn des Rückenmarks
erhielten, zeigte eine Überlebenszeit
von mindestens drei Tagen. Ferner wuchsen die Ausläufer der
transplantierten Neuronen in dieser Region in der Länge auf
mindestens das Zwei- bis Dreifache des Durchmessers des Zellkörpers.
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Transplantierte,
differenzierte Neuronen exprimieren, wie aus diesen Ergebnissen
offensichtlich ist, viele neuronale Proteine, behalten ihre Lebensfähigkeit
in vivo und üben anscheinend
keine nachweisbare, schädliche
Wirkung auf das lebende Tier aus. Als Ergebnis schaffen diese Neuronen
eine mögliche
therapeutische Behandlung für
eine Vielfalt von Krankheiten des Gehirns und des Rückenmarks, einschließlich Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit,
Schizophrenie und Verletzung des Rückenmarks aufgrund von Trauma
oder Degeneration, aber nicht darauf beschränkt.
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Obwohl
die Erfindung unter Bezugnahme auf spezielle Ausführungsformen
offenbart wurde, ist es offensichtlich, dass andere Ausführungsformen
und Variationen dieser Erfindung wie in den Ansprüchen definiert
von anderen Fachleuten entwickelt werden können, ohne vom wahren Geist
und dem Geltungsbereich der Erfindung abzuweichen. Es ist beabsichtigt,
dass die beigefügten
Ansprüche
so interpretiert werden, dass sie alle diese Ausführungsformen
und gleichwertigen Variationen einschließen.
