CN101605552A - 神经元前体细胞用于治疗中枢神经系统损伤的用途 - Google Patents

Abstract

公开了治疗中枢神经系统损伤的方法和材料。优选的方法和材料包括神经元前体细胞和/或骨髓粘附性干细胞衍生的神经元细胞。

Description

神经元前体细胞用于治疗中枢神经系统损伤的用途

发明背景

发明领域

本发明涉及治疗中枢神经系统损伤，特别是治疗中风。

相关领域描述

有许多原因造成中枢神经系统(“CNS”)组织损伤。CNS损伤的一个主要原因是中风。中风的特征是大脑某区域的血循环突然丧失，导致神经功能的相应丧失。也称为脑血管突发综合征或中风综合征。中风是包含异源病理生理原因的非专用术语，包括血栓形成、栓塞和出血。近年的报导表明每年各型新的中风患者的发病率超过50万。中风是主要的致死和致残原因。综合所有类型的中风，它是第三致死原因和第一致残原因。近年的倾向是，到2050年此病发病将跃升到每年一百万。综合考虑中风的直接化费(护理和治疗)和间接化费(劳动力丧失)，美国社会每年因中风将丧失433亿美元。目前将中风分类为出血型和局部缺血型。急性局部缺血型中风指血栓或栓塞引起的中风，占所有中风的80％。

四种主要的神经解剖学局部缺血性中风综合征是由它们各自脑血供遭破坏所致。

前脑动脉堵塞主要影响前额叶功能，导致精神状态改变、判断力受损、对侧下肢虚弱和感觉迟钝，及步态失调。

中脑动脉(MCA)堵塞常产生对侧轻度偏瘫、对侧感觉迟钝、同侧偏盲(视野的一半失明)和凝视力偏向损伤侧。如果损伤发生在优势半球，常见认知不能，并且可导致接受或表达性失语。因为MCA向上肢运动元带供血，手臂和面部虚弱常比下肢严重。

后脑动脉堵塞影响视觉和思考，产生同侧偏盲、皮质性失明、视觉性认知不能、精神状态改变和记忆力受损。

脊椎基底动脉堵塞众所周知难以检测，因为它们能引起各种颅神经、脑神经和脑干损伤，包括眩晕、眼球震颤、复视、视野缺失、吞咽困难、构语障碍、面部感觉迟钝、晕厥和共济失调。常发生同侧面部和对侧躯体痛觉和温度感觉丧失。相反，前脑中风只产生一侧躯体症状。

发生这些堵塞有各种原因。可因心脏、颅外动脉，或罕见的右侧血循环(感觉性栓塞)而发生栓塞。心源性栓塞的来源包括：心瓣膜血栓(如左房室瓣狭窄、心内膜炎、人造修复瓣膜中)、壁血栓(如心肌梗塞[MI]、心房纤颤、扩张性心肌病变)和心房粘液瘤。MI与2-3％的栓塞性中风发病相关，其中85％发生在MI后的第一个月。

脑室梗塞占所有脑梗塞的13-20％，常常涉及皮质下脑区域和脑干的小末梢血管。脑室梗塞常见于小血管疾病患者，如糖尿病和高血压患者。认为称为透明栓塞(lipohyalinosis)的小栓塞或原位栓塞可引起脑室梗塞。最常见的脑室梗塞综合征包括单纯运动、单纯感觉轻度偏瘫中风和共济失调中风。由于脑室梗塞的范围小且限于皮层下部位，通常不导致认知、记忆、语言或意识水平的损伤。

血栓性梗塞最常见部位是脑动脉分枝点，特别是颈内动脉分布区。动脉狭窄(即血流紊乱)、动脉粥样硬化(即出现溃疡性脂斑)和血小板粘附导致血凝块形成而栓塞或堵塞动脉。较少见的血栓形成原因包括：红细胞增多症、镰状细胞贫血、蛋白C缺乏、脑动脉的纤维肌肉发育不良、和偏头痛病导致的血管收缩延长。可导致脑动脉剥离的任何过程也可引起血栓性中风(如创伤、胸主动脉剥离、动脉炎)。偶然地，向远端狭窄或堵塞动脉的血流灌注不足，或二条脑动脉供血区之间的脆弱分流区血流灌注不足可引起局部缺血性中风。

现转到出血性中风，术语脑内出血(ICH)与出血性中风本文中可互换使用，分别指从出血转到局部缺血性中风。ICH占所有中风的约20％，死亡率高于脑梗塞。出血性中风患者存在类似的局灶性神经缺损，而倾向于比局部缺血性中风的病情更重。脑内出血患者更可能患有头痛、精神状态改变、癫痫、恶心和呕吐、和/或显著高血压；然而凭这些症状不易区分出血性与局部缺血性中风。

在ICH时，脑实质中直接发生出血。常见机制是受慢性高血压损伤的脑内小动脉渗漏所致。其它机制包括：出血素质、医源性抗凝血治疗、脑淀粉样变和可卡因成瘾。ICH倾向于发生在某些脑内部位，包括丘脑、豆状核、小脑和脑干。除了出血损伤的脑区域外，由于血肿块质量效应产生的压力也会损伤周围脑区域。可发生颅内压升高。出血性中风的30天死亡率为40-80％。所有死亡中约50％发生在最初的48小时。

通常所知的CNS损伤的其它原因包括创伤和各种CNS疾病。

治疗CNS损伤涉及神经发生，即在患者的感兴趣组织区域中再生神经原，包括但不限于置换中枢神经系统病损中的受损神经元。不幸的是，众所周知神经元(CNS)组织的修复/再生能力有限。成人中新神经元的产生主要限于二个区域：侧脑室的SVZ和齿状脑回的颗粒下区(subgranular zone)。已证明可通过从SVZ迁移的内源性前体干细胞实现有限的神经元置换。

关于特定神经元产生的方法已有某些初步成功的报导，但这些方法在临床上并不成功。因此，需要能克服本领域上述问题用于治疗中枢神经系统损伤的方法和组合物。

发明概述

一方面，本发明提供促进患者神经功能恢复的方法，该方法包括：提供神经元前体细胞，和给予中枢神经系统损伤患者足够量的所述神经元前体细胞。

另一方面，本发明涉及一种移植物形成单元，该单元包含神经元前体细胞神经元前体细胞和药学上可接受的载体，所述神经元前体细胞存在的量足以在给予患者所述神经元前体细胞后促进患有中枢神经系统损伤患者神经功能恢复。

还有一方面，本发明涉及促进患者神经功能恢复的方法，该方法包括：提供骨髓粘附性干细胞衍生的神经元细胞(neuronal cell)，和给予患有中枢神经系统损伤患者足够量的所述骨髓粘附性干细胞衍生的神经元细胞。

再有一方面，本发明涉及一种移植物形成单元，该单元包含骨髓粘附性干细胞衍生的神经元细胞和药学上可接受的载体，所述神经元细胞存在的量足以在给予患者所述骨髓粘附性干细胞衍生的神经元细胞后促进患有中枢神经系统损伤患者神经功能恢复。

附图的简要说明

图1.显示MCAo方法的结果。

图2.显示MCAo方法的结果。

图3.显示MCAo方法的结果。

图4.显示MCAo方法的结果。

图5.显示MCAo方法的结果。

图6.显示MCAo方法的结果。

图7.显示MCAo方法的结果。

图8.显示MCAo方法的结果。

图9.显示MCAo方法的结果。

图10.显示MCAo方法的结果。

图11.显示MCAI方法的结果。

图12.显示MCAI方法的结果。

图13.显示MCAI方法的结果。

图14.显示MCAI方法的结果。

图15.显示MCAI方法的结果。

图16.显示MCAI方法的结果。

图17.显示MCAI方法的结果。

图18.显示MCAI方法的结果。

图19.显示MCAI方法的结果。

图20.显示MCAI方法的结果。

图22.显示TGI方法的结果。

图23.显示TGI方法的结果。

图24.显示TGI方法的结果。

图25.显示TGI方法的结果。

图26.显示TGI方法的结果。

图27.显示TGI方法的结果。

图28.显示TGI方法的结果。

图29.显示实施例的组织学检测结果。

图30.显示实施例的组织学检测结果。

图31.阐述了神经功能的恢复和移植物的存活。

图32.显示MCAo方法的结果。

图33.显示MCAo方法的结果。

图34.显示MCAI方法的结果。

图35.显示MCAI方法的结果。

图36.显示TGI方法的结果。

图37.显示TGI方法的结果。

图38.阐述了移植物的存活。

图39.阐述了移植物的存活。

图40.显示杠杆平衡试验(beam balance test)的结果。移植后第28天，与MASC组和对照组相比，MNC组的平均评分显示有显著改进。^*：P＜0.05，^**：P＜0.01。

图41.显示肢体定位试验的结果。第21天和28天时MNC组和MASC组的平均评分显著不同于对照组。MNC与MASC组之间无显著差异：^*：P＜0.05，^**：P＜0.01。

图42.显示Morris水迷宫试验的结果。对最后一组，MNC组的平均潜伏时间与MASC和对照组的平均潜伏时间有显著差异。

图43.显示水迷宫“空间探索试验”的结果。三组中，MNC组获得了最佳结果，MNC组与其它组之间具有显著性差异，^*：P＜0.05，^**：P＜0.01。

图44.显示实施例9中进行的Bederson试验结果。

图45.显示实施例9中进行的EBST结果。

图46.说明实施例9的移植物存活。

图47.显示实施例9的移植物存活。

图48.显示实施例9的Nissi染色结果。

发明详述

A.前言

本发明人出乎意料和令人惊喜地发现上述问题和限制可通过实施本文所述的发明而克服。具体说，本发明人出乎意料地发现：可通过提供NPC和MNC，和给予患中枢神经系统损伤的患者足够量的这些NPC和/或MNC来促进该患者的神经功能恢复。

本文公开的方法与现有技术相比有几个优点。首先，提供了一种剂量依赖性关系，使医生能根据患者个体确定外科手术方案以修补中枢神经系统的损伤。其次，提供了一种同种异体移植方法，可用此法特征鉴定NPC和/或MNC和/或移植物形成单元，和提供与细胞批次及移植方法相一致的GFU到GFU(或NPC到NPC，或MNC到MNC)。另外，采用NPC能够比采用其它多能细胞更精确地重建中枢神经系统。这是因为分化时神经元前体细胞而不是其它类型的多能细胞明显占大多数，因而不会分化成其它类型的细胞。这可能对试图控制移植结局和限制植入细胞的不良生长(或未分化)时至关重要。还有，采用MNC很理想，因为该细胞是分化更好的多能细胞，可提供改进的神经功能恢复。

现在将更详细地描述本发明。

B.定义

本说明书中引用的所有出版物的内容出于所有目的全体纳入本文作为参考，如同各出版物专门和单独纳入本文作参考那样。

“给予”指向患者提供NPC和/或本发明的移植物。

“区域”指范围或确定的容积。例如，中枢神经系统的一个区域是位于中枢神经系统中的一个范围或确定的容积。

“中枢神经系统局部缺血事件”或“CNS局部缺血事件”指患者中枢神经系统某区域的血流供应发生中断或生理上显著减少。在一优选实施方式中，CNS局部缺血事件包括局部缺血性中风。

“中枢神经系统损伤”或“CNS损伤”指由于CNS局部缺血或由于出血(如一优选实施方式中为出血性中风)导致中枢神经系统某区域的神经元组织被破坏、功能丧失或患病，或中枢神经系统某区域神经元周围组织被破坏、功能丧失或患病。

“中枢神经系统组织”指通常与中枢神经系统结合在一起的组织。脑组织和脊髓组织是中枢神经系统组织的非限定性例子。在涉及中枢神经系统组织的本发明特定实施方式中，由于局部缺血导致中枢神经系统组织遭到破坏。发生的这种破坏通常可理解为失去了氧供应和其它相关的级联反应，以及失去氧供应和相关级联反应导致产生的副产物。

“功能恢复”指通过测定神经功能的特征性神经生理学参数(即CBF、EEG、皮质扩张等)，或测定行为功能参数(如本文公开的或本领域已知的小鼠模型或其它模型的抚养幼鼠或听声惊跳)来确定CNS损伤区的CNS功能恢复。所检测的变量倾向于接近正常或对照群体的观察值时可确定功能恢复。通过合适的统计学检测方法，测定的参数值恢复到正常或对照群体观察到的值时即为功能完全恢复。功能恢复也可能是不完全或部分的恢复。例如，某患者测定的参数可能是功能完全恢复，或恢复75％，或恢复50％等。

“中枢神经系统功能恢复区域”指原先涉及损伤的CNS组织经实施本发明后功能恢复的区域。

“移植物形成单元”或“GFU”指一种组合物，其(1)含NPC和/或MNC及药学上可接受的载体，(2)可将其给予患者。在一优选实施方式中，明白考虑NPC和MNC的混合物。在其它优选实施方式中，采用NPC而基本上不用MNC。在还有其它优选实施方式中，采用MNC而基本上不用NPC。

“骨髓粘附性干细胞”指一类有丝分裂性多能细胞，它能产生各种类型的细胞：骨细胞(成骨细胞)、软骨细胞、脂肪细胞、和其它种类的结缔组织细胞如肌腱中的细胞。

“MASC-衍生的神经元细胞(MNC)”指有丝分裂后的神经元，其(1)衍生自骨髓粘附性干细胞，和(2)经免疫组化测定表达神经元标记，在电生理分析实验中显示神经元性质。可在PCT/JP03/01260中找到体外产生MNC的合适方法。本发明实施过程中也可采用本领域已知的其它产生MNC的方法，只要它们符合本文对MNC的定义。在一实施方式中，人MNC是MAP-2+、神经纤丝-M+、和β微管蛋白III+(即TuJ-1+)。用PCT/JP03/01260公开的技术产生MNC后，可利用这些标记以FACS分离MNC。通常知道处理MNC的合适方法，包括例如Carpenter的美国专利6,833,269中公开的那些方法。

“MCAo”指中脑动脉堵塞。

“MCAI”指中脑动脉连通。

“神经元生成”指在患者组织的感兴趣区域中产生(再生)神经元和神经组织，包括但不限于置换中枢神经系统损伤中的受破坏神经元。

“神经元前体细胞(NPC)”指衍生自MASC的有丝分裂性、能表达神经元前体细胞/神经元祖细胞特异性脑巢蛋白(nestin)和其它细胞标记的细胞。NPC可分化成神经元、神经胶质细胞和少突胶质细胞，及任何上述细胞的前体细胞。在一实施方式中，可按PCT/JP03/01260所述方法从骨髓粘附性干细胞(MASC)产生NPC。本发明实施过程中也可采用本领域已知的其它技术来产生NPC，只要它们符合本文对NPC的定义。优选NPC包括人NPC，虽然其它种类的哺乳动物也包括在本发明的范围内。在一实施方式中，NPC中优选的人NPC是CD29+、CD90+、CD105+、CD31-、CD34-和CD45-。用PCT/JP03/01260公开的技术产生NPC后，可利用这些标记以FACS分离NPC，优选分离人NPC。通常知道处理NPC的合适方法，包括例如Goldman等的美国专利申请20020012903中公开的那些方法。

“神经元”指构成脑、脊柱和神经的神经冲动传导细胞，它们由有核细胞体和一个或多个树突及一条轴突组成。神经元的生物化学特征是能与Map、神经纤丝-M、和β微管蛋白III(即TuJ-1+)的抗体反应。神经元细胞另一特征是含有神经递质合成酶或神经递质相关蛋白，和能分泌神经递质，如神经肽Y和物质P。

“神经元细胞(neuronal)”指神经元、神经胶质细胞和少突胶质细胞，及它们任何一种的前体细胞。

“患者”指需要治疗疾病或疾患的动物，通常是哺乳动物，更常是人。

“药学上可接受的载体”指任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂、抗真菌剂、冷冻保护剂、等渗和吸收延缓剂等，它们应与NPC或MNC的给药相容。可用的介质和药物是该领域熟知的。除了迄今已知的与NPC或MNC不相容的任何常规介质或药物外，考虑均可用于本发明的GFU中。

“全身性”指患者的全身或基本上全身(给药)。

“组织”指生物体中一种由结构和功能类似的细胞聚集组成的部分。本发明优选的组织是神经组织。

“TGI”指短暂性全脑缺血。

“移植”使用时与“植入”同义，指在患者某区域中安置非内源性细胞。移植可以是同种异体或非自身细胞的移植。移植也可以是自身或自体细胞移植，如同一患者的一处组织移到另一处。

“转分化的(transdifferentiated)”指某种细胞从其经典相关类型沿谱系分化发育。

A.NPC及其药物组合物

在一实施方式中，采用NPC作为GFU的一部分移植给患者来实施本发明。目的是使该NPC生长和分化成神经元细胞，在患者的中枢神经系统损伤的功能恢复中发挥作用。例如，NPC可分化为神经元，替代受损伤的内源神经元。或者，NPC可分化成神经胶质细胞或神经元而分泌生长因子。这些生长因子对受损的神经元具有营养活性可帮助它们恢复功能。以这种方式可治疗中枢神经系统损伤。

优选的NPC和提供此NPC的优选方法可参见Dezawa等的PCT/JP03/01260所述，题头是“用转染(transferring)Notch基因(“Dezawa”)使骨髓间质细胞分化/诱导成为神经元细胞和骨骼肌细胞的方法”。具体说，可采用Dezawa描述的，具体是实施例7中描述的Dezawa“神经元前体细胞”作为本发明的NPC细胞。Dezawa公开说，MASC可转分化成为神经元前体细胞，从而可用作本发明的NPC。

在某些实施方式中，采用GFU来实施本发明。本发明GFU中所用的药学上可接受的载体包括：灭菌等渗缓冲液、FRS、isolyte、灭菌稀释液如水、生理盐水、非挥发性油、聚乙二醇、甘油、聚丙二醇或其它合成的溶剂；抗菌剂或抗真菌剂，如抗坏血酸、硫柳汞、三甲氧苄二氨嘧啶-磺胺甲氧唑盐、萘啶酮酸、乌洛托品马尿酸盐或硝化呋喃妥因粗晶盐等；抗氧化剂如抗坏血酸或硫酸氢钠；以及调节张力的制剂如氯化钠或葡聚糖。可用酸或碱，如盐酸或氢氧化钠调节pH。

在一实施方式中，适合用于本发明的移植物形成单元包括含NPC的灭菌组合物。对于静脉给药，合适的药学上可接受的载体包括：生理盐水、normasol、isolyte、电解质输注液(plasma-lyte)或磷酸缓冲盐水(PBS)。所有例子中，GFU必须灭菌(除了存在的任何NPC和MNC外)并应为液体成分而便于装在针筒中注射(可保持适当的流动性，如利用卵磷脂等物质，作为分散剂时应维持一定的颗粒大小，和包含表面活性剂)。在如上所述的制造和贮存条件下，该GFU必须稳定，必须防腐对抗微生物如细菌和真菌的污染。某些情况下，优选GFU中含有，例如糖、多元醇如甘露醇或山梨糖醇、氯化钠、LiCl、丁酸钠、和原钒酸钠。通常可将NPC结合到含有基础分散介质和任选的上述其它成分的灭菌运载体中来制备本发明的GFU。

特别优选将本发明的GFU配制成易于给药和均匀给药的移植物形成单位剂型。本文所用移植物形成单位剂型指作为一次剂量给予待治疗对象的物理上分散的合适单位剂型。在一实施方式中，各GFU单位剂型含有经计算能产生所需治疗效果的预定量的NPC和所需的药学载体。在个体治疗中，对本发明移植物形成单位剂型的规定直接取决于NPC的独特特性、要达到的具体治疗效果和制备NPC领域固有的局限性。每一移植物单位剂型中的NPC含量可不同，从约1000个细胞到10亿个细胞，优选约10000个细胞到1亿个细胞，更优选约5万个细胞到5千万个细胞。每一移植单位剂型中的NPC浓度宜可不同，从约100个细胞/微升到10万个细胞/微升，更优选从约1000个细胞/微升到5万个细胞/微升。

可将NPC装在容器、包装袋和分配器中，与给药说明书一起包装。此移植物优选在约37℃保存。

在某些实施方式中，可能需要先标记NPC再移植。在临床前(即除人以外的)动物模型中可能需要追踪移植NPC的迁移、移植NPC的分化、移植NPC的成活等等。可根据临床前环境(此环境下可阅读标记)采用各种标记细胞方法。例如，可采用荧光蛋白(绿荧光蛋白、红荧光蛋白等)，将检测仪适当放在植入部位附近的环境下检测。

当要在非临床条件下分析经植入的脑时，可采用免疫组化分析。在一实施方式中，可用绿荧光蛋白(GFP)或其它细胞标记β微管蛋白III、NeuN(神经元特异性蛋白)、胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)或O4(一种少突胶质细胞特异性蛋白)进行双重免疫染色来鉴定神经元、星形细胞、胶质细胞或少突胶质细胞情况。可按照Abercrombie的校正公式估计某给定抗体阳性的细胞数和表达GFP的细胞数。可测定每5张切片中含有至少10％GFP-阳性细胞(或其它标记阳性)的脑区面积，乘以离开脑前部含GFP-阳性(或其它标记阳性)细胞的距离来计算GFP(或其它标记)阳性细胞的体积和总数。

在一实施方式中，用GFP标记NPC时，以下材料是有用的：

材料：冻存的NPC细胞，PBS(Invitrogen 14190-1360)、HTS-FRS(BioLife溶液99-609-DV)、GFP-慢病毒贮存悬浮液滴度约为10⁷/ml、溴化已脒定(聚凝胺polybrene，Sigma H-9268)-1或2支冻存等份@10mg/ml、灭菌水、USP、Opti-MEM(Invitrogen)和胎牛血清(Hyclone)。

可从商业上获得GFP-慢病毒贮存悬浮液。或者可用商品化购得的试剂盒，如VirePower慢病毒表达系统(得自Invitrogen，Carisbad，CA)制备。具体说，可按照制造商的说明将Plenti6/V5 Gateway载体与GFP盒组合最后产生合适的慢病毒悬液。

在一实施方式中，按照得自制造商如上述Invitrogen系统的转染方法进行标记。

在另一实施方式中，采用以下方法用GFP标记NPC细胞：除离心步骤外，细胞处理程序宜在2级生物安全柜中进行。将10mg聚凝胺溶于1ml灭菌水(USP)中，过滤通过0.25微米滤膜制备聚凝胺贮备液。将得到的过滤贮备液分成等份，-20℃避光保存。

病毒感染前一天，在含30ml细胞培养液的T225瓶中以每瓶2百万个细胞的密度接种NPC细胞，在37℃/5％CO₂培养箱中培养细胞过夜。

病毒感染当天，室温下融化慢病毒贮存液，37℃水浴融化聚凝胺贮液。在50ml falcon试管中加入45ml含10％FBS的预温(37℃)αMEM培养液和5ml融化的病毒贮液，获得MOI约为10的培养液。加入最终浓度10μg/ml(1000倍稀释)融化的聚凝胺。去除T225瓶中的旧培养液，加入此病毒混合液来回轻轻摇动3-4次。将培养瓶送回37℃/CO₂培养箱中。

次日，完全去除培养瓶中的病毒介质。用含10％FBS的αMEM培养液洗涤(6×30ml)。每次洗涤取5ml进行感染测试。加入新鲜培养液，将培养瓶放回到培养箱中。次日，收获病毒感染的细胞、计数和重悬于总体积360微升的HTS-FRS中。转移到1.5ml无DNA酶、无RNA酶、无热原的灭菌小离心管中。可没置感染细胞的浓度与相应的移植体积相比配。然后将此细胞保持在湿冰上直到用于移植。

B.MNC及其药物组合物

在一实施方式中，采用MNC作为移植物的一部分移植给患者来实施本发明。目的是使该MNC在患者的感兴趣组织区域功能恢复中发挥作用。以此种方式可治疗中枢神经系统的损伤。

优选的MNC和提供此MNC的优选方法可参见Dezawa等的PCT/JP03/01260所述，题头是“利用转染Notch基因(“Dezawa”)使骨髓间质细胞分化/诱导成为神经细胞和骨骼肌细胞的方法”。具体说，可采用Dezawa描述的，具体是实施例1中描述的Dezawa“神经细胞”作为本发明的MNC细胞。Dezawa公开说，骨髓粘附性干细胞可转分化成为神经元细胞，从而可用作本发明的MNC。

在一优选实施方式中，利用神经营养制剂从NPC产生MNC。有用的神经营养制剂包括但不限于：碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和睫状神经营养因子(CNTF)。利用神经营养因子体外诱导NPC的合适方法可参见PCT/JP03/01260。

在一些实施方式中，可用GFU来实施本发明。GFU中所用的药学上可接受的载体包括：灭菌等渗缓冲液、FRS、isolyte、灭菌稀释液如水、生理盐水、非挥发性油、聚乙二醇、甘油、聚丙二醇或其它合成的溶剂；抗菌剂或抗真菌剂，如抗坏血酸、硫柳汞、三甲氧苄二氨嘧啶-磺胺甲氧唑盐、萘啶酮酸、乌洛托品马尿酸盐或硝化呋喃妥英粗晶盐等；抗氧化剂如抗坏血酸或硫酸氢钠；以及调节张力的制剂如氯化钠或葡聚糖。可用酸或碱，如盐酸或氢氧化钠调节pH。

在一实施方式中，适合用于本发明的移植物形成单元包括含MNC的灭菌组合物。对于静脉给药，合适的药学上可接受的载体包括：生理盐水、CremophorEL.TM.(BASF；Parsippany，N，J.)、normasol、isolyte、电解质输注液或磷酸缓冲盐水(PBS)。所有例子中，GFU必须灭菌(除存在的任何NPC或MNC外)并应为液体成分而便于装在针筒中注射(可保持适当的流动性，如利用卵磷脂等物质，作为分散剂时应维持一定的颗粒大小，和包含表面活性剂)。在如上所述的制造和贮存条件下，该GFU必须稳定，必须防腐对抗微生物如细菌和真菌的污染。某些情况下，优选GFU中含有，例如糖、多元醇如甘露醇或山梨糖醇、氯化钠、LiCl、丁酸钠、和原钒酸钠。通常可将NPC结合入到含有基础分散介质和任选的上述其它成分的灭菌运载体中来制备本发明的GFU。

特别优选将本发明的GFU配制成易于给药和均匀给药的移植物形成单位剂型。本文所用移植物形成单位剂型指作为一次剂量给予待治疗对象的物理上分散的合适单位剂型。在一实施方式中，各GFU单位剂型含有经计算能产生所需治疗效果的预定量的NPC和所需的药学载体。在个体治疗中，对本发明移植物形成单位剂型的规定直接取决于MNC的独特特性、要达到的具体治疗效果和制备MNC领域固有的局限性。每一移植物单位剂型中的MNC含量可不同，从约1000个细胞到10亿个细胞，优选约10000个细胞到1亿个细胞，更优选约5万个细胞到5千万个细胞。每一移植单位剂型中的MNC浓度宜可不同，从约100个细胞/微升到10万个细胞/微升，更优选从约1000个细胞/微升到5万个细胞/微升。

可将GFU装在容器、包装袋和分配器中，与给药说明书一起包装。此移植物优选在约4℃保存。

在某些非临床实施方式中，可能需要先标记MNC再移植。可能需要追踪移植的MNC迁移、移植的MNC进一步的变化、移植的NPC成活等等。可根据阅读标记的环境采用各种细胞标记方法。例如，可采用荧光蛋白(绿荧光蛋白、红荧光蛋白等)，将检测仪适当放在植入部位附近的环境下检测。

当要在非临床条件下分析经植入的脑时，可采用免疫组化分析。在一实施方式中，可用绿荧光蛋白(GFP)或其它细胞标记如β微管蛋白III、NeuN(神经元特异性蛋白)、胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)或O4(一种少突胶质细胞特异性蛋白)进行双重免疫染色来鉴定神经元、星形细胞、胶质细胞或少突胶质细胞的情况。可按照Abercrombie的校正公式估计某给定抗体阳性的细胞数和表达GFP的细胞数。可测定每5张切片中含有至少10％GFP-阳性(或其它标记阳性)细胞的脑区面积，乘以离开脑前部含GFP-阳性(或其它标记阳性)细胞的距离来计算GFP(或其它标记)阳性细胞的体积和总数。在一实施方式中，可通过pBabeneo-GFP载体用逆转录病毒感染来标记MNC。M.Dezawa等“通过植入体外分化的骨髓基质细胞诱导大鼠坐骨神经再生”Eur J Neurosci.2001.14：1771-6。可改进此法将其它荧光蛋白掺入此载体中。

C.NPC移植

在一实施方式中，可采用常规给药方法和途径给予本发明的NPC和/或GFU，可利用常规确定剂量范围的技术优化给予患者的NPC和/或GFU剂量。可单独或与其它药物或组合物一起给予本发明的NPC和/或GFU。给药途径可选自本领域技术人员已知的常规给药途径。

考虑可用各种方法，包括但不限于通过注射导管、针或旁路导管灌注，或包埋在运载体如生物可降解的胶囊内进行移植，但其它给药途径也包括在本发明范围内。

可全身，例如胃肠外途径如静脉内(I.V)给予本发明的NPC和/或GFU，或优选的全身给药途径是动脉内(如通过颈内或颈外动脉)给药。全身给药技术可取自通常给予前体细胞的技术，如D Lu等“动脉内给予创伤性脑损伤大鼠模型骨髓基质细胞”J.Neurotrauma.2001 Aug，18(8)：813-9所述的技术。

在实施方式中，可将本发明的NPC和/或GFU给予患者的中枢神经系统损伤局部。在一优选实施方式中，可通过脑实质内途径给予本发明的NPC和/或GFU。患者中枢神经系统损伤处局部给予本发明的NPC和/或GFU的优点是可减少患者血脑屏障内侧免疫系统的激活。因此可降低宿主免疫排斥该NPC的机会，和(即使仍然要用免疫抑制剂)提高移植物存活的机会。局部给药的另一优点是能使NPC精确靶向CNS损伤处。

当要植入到中枢神经系统损伤处时，可用立体定位外科手术进行移植。此方法要麻醉患者。将患者的头安置在与MRI相容的立体定位框架中，用安置在头颅上的携带有显微注射器的显微定位仪定位。可用牙科钻或其它合适的仪器在患者的颅骨上钻孔暴露靶部位上方的硬脑膜区域。

在一实施方式中，采用26号针和Hamilton显微注射器(或其它大小合适的针筒)钻孔，此时用MRI摄象手动操纵引导注射针到植入部位以确保NPC和/或GFU的正确定位。植入部位的注射优选推注。输注的速度可不同，优选的输注体积每分钟约0.1-10微升，更优选每分钟约0.5-5微升，还要优选每分钟约1.0-3.0微升。在一实施方式中，输注后注射针可留置一段时间，优选约1-10分钟，更优选约5分钟。在注射针留置此段时间后可将注射针拔出一点，优选约1-10mm，更优选约2mm，然后在该位置再保持一些时间，优选约5-30分钟，更优选约15分钟。然后从患者中取出注射器，用解剖衬垫层闭合伤口部位，监视患者从麻醉恢复。

如需要，作为手术/手术后程序，给予止痛药(如丁丙诺啡)和抗菌素(如头孢唑啉Cephazolin，50mg/kg.肌内，每天二次，共5天)。抗菌素治疗可在术后持续一段时间，优选直到术后30天以抑制机会感染。

其它植入技术可参见K S Bankiewicz等“利用一种自动化输送系统在猴颅内双侧植入细胞的技术”Cell Transplantation.9(5)：595-607(2000)。

在某些实施方式中，可一起给予免疫抑制剂和本发明的移植物和/或NPC。这些制剂可帮助抑制患者免疫系统对NPC的排斥，特别是当全身给予移植物和/或NPC时。可用于实施本发明的免疫抑制剂的例子包括但不限于：抗代谢药如硫唑嘌呤、烷化剂如环磷酰胺、叶酸拮抗剂如甲氨蝶呤或巯基嘌呤(6-MP)、霉酚酸盐(CellCept)、环孢菌素A和Tacrolimus(FK-506)。优选的免疫抑制剂是CsA。CsA可获自各种来源，包括Novartis Pharma AG，Basel，Switzeland的Novartis药物制造公司(Novartis)，East Hanover，NJ制造的注射用

可通过各种途径，包括口服、腹腔内和静脉内给予免疫抑制剂。剂量可根据免疫抑制剂的性质和患者而不同。在一实施方式中，移植前二天给予免疫抑制剂然后以适当间隔持续给予。在一实施方式中，移植当天(约在术后4小时)开始给予免疫抑制剂然后间隔24小时持续给予。剂量范围优选在每天约0.5-100mg/kg，更优选每天约5-75mg/kg，还要优选每天约5-50mg/kg。可静脉内推注给予，速度范围优选每分钟约0.005-0.100ml，更优选每分钟约0.050ml。

可用常规方法和常规途径给予本发明的NPC和/或GFU，可利用常规确定剂量范围的技术优化给予患者的NPC和/或GFU剂量。可单独或与其它药物或组合物一起给予本发明的NPC和/或GFU。给药途径可选自本领域技术人员已知的常规给药途径。

考虑可用各种方法，包括但不限于通过注射导管、针或旁路导管灌注，或包埋在运载体如生物可降解的胶囊内进行移植，但其它给药途径也包括在本发明范围内。

在实施方式中，可将本发明的NPC和/或GFU给予患者的中枢神经系统损伤局部。在一优选实施方式中，可通过脑实质内途径给予本发明的NPC和/或GFU。患者中枢神经系统损伤处局部给予本发明的NPC和/或GFU的优点是可减少患者血脑屏障内侧免疫系统的激活。因此可降低宿主免疫排斥该NPC的机会，和(即使仍然要用免疫抑制剂)提高移植物存活的机会。局部给药的另一优点是能使NPC精确靶向CNS损伤处。

D.MASC驱动的神经元细胞移植

在一实施方式中，可用常规方法和常规途径给予本发明的MNC和/或GFU，可利用常规确定剂量范围的技术优化给予患者的MNC和/或GFU剂量。可单独或与其它药物或组合物一起给予本发明的MNC和/或GFU。给药途径可选自本领域技术人员已知的常规给药途径。

考虑可用各种方法，包括但不限于通过注射导管、针或旁路导管灌注，或包埋在运载体如生物可降解的胶囊内进行移植，但其它给药途径也包括在本发明范围内。

在实施方式中，可将本发明的MNC和/或GFU给予患者的中枢神经系统损伤局部。在一优选实施方式中，可通过脑实质内途径给予本发明的MNC和/或GFU。患者中枢神经系统损伤处局部给予本发明的MNC和/或GFU的优点是可减少患者血脑屏障内侧免疫系统的激活。因此可降低宿主免疫排斥该MNC的机会，和(即使仍然要用免疫抑制剂来)提高移植物存活的机会。局部给药的另一优点是能使MNC精确靶向CNS损伤处。

当要植入到中枢神经系统损伤处时，可用立体定位外科手术进行移植。此方法要麻醉患者。将患者的头安置在与MRI相容的立体定位框架中，用安置在头颅上的携带有显微注射器的显微定位仪定位。可用牙科钻或其它合适的仪器在患者的颅骨上钻孔以暴露靶部位上方的硬脑膜区域。

在一实施方式中，采用26号针和Hamilton显微注射器(或其它大小合适的针筒)钻孔，此时在MRI摄象下手动操纵引导注射针到植入部位以确保MNC和/或GFU的正确定位。植入部位的注射优选推注。输注的速度可不同，优选的输注体积每分钟约0.1-10微升，更优选每分钟约0.5-5微升，还要优选每分钟约1.0-3.0微升。在一实施方式中，输注后可留置注射针一段时间，优选约1-10分钟，更优选约5分钟。在注射针留置此段时间后可将注射针拔出一点，优选约1-10mm，更优选约2mm，然后在该位置再保持一些时间，优选约5-30分钟，更优选约15分钟。然后从患者中取出注射器，用解剖衬垫层闭合伤口部位，监视患者从麻醉恢复。

如需要，作为手术/手术后程序，可给予止痛药(如丁丙诺啡)和抗菌素(如头孢唑啉，50mg/kg.肌肉内，每天二次，共5天)。术后抗菌素治疗可持续一段时间，优选直到术后30天以抑制机会感染。

其它植入技术可参见K S Bankiewicz等“利用自动化输送系统在猴颅内双侧植入细胞的技术”Cell Transplantation.9(5)：595-607(2000)。

在某些实施方式中，可一起给予免疫抑制剂和本发明的移植物和/或MNC。这些制剂可帮助抑制患者免疫系统对MNC的排斥。可用于实施本发明的免疫抑制剂的例子包括但不限于：抗代谢药如硫唑嘌呤、烷化剂如环磷酰胺、叶酸拮抗剂如甲氨蝶呤或巯基嘌呤(6-MP)、霉酚酸盐(CellCept)、环孢菌素A和Tacrolimus(FK-506)。优选的免疫抑制剂是CsA。CsA可获自各种来源，包括Novartis Pharma AG，Basel，Switzeland的Novartis药物制造公司(Novartis)，EastHanover，NJ制造的注射用

可通过各种途径，包括口服、腹腔内和静脉内给予免疫抑制剂。剂量可根据免疫抑制剂的性质和患者而不同。在一实施方式中，移植前二天给予免疫抑制剂然后以适当间隔持续给予。在一实施方式中，移植当天(约在术后4小时)开始给予免疫抑制剂然后间隔24小时持续给予。剂量范围优选每天约0.5-100mg/kg，更优选每天约5-75mg/kg，，还要优选每天约5-50mg/kg。可静脉内推注给予，速度范围优选每分钟约0.005-0.100ml，更优选每分钟约0.050ml。

E.NPC的实验观察和优点

虽然本发明考虑可移植自体或同种异体的NPC，包括含NPC的药物组合物，但优选同种异体移植(同种动物的移植物形成单位)。在一实施方式中，同种异体移植模拟了在患有中枢神经系统损伤患者中发生的同种异体移植NPC时的临床状况。本文公开了在患中脑动脉栓塞(MCAo)、中脑动脉结扎(MCAI)或暂时性全脑缺血(TGI)的成年雌性Sprague-Dawley大鼠脑中立体定位植入本发明NPC的结果。这些动物模型可用于了解本发明治疗中枢神经系统损伤的效果。这些模型的进一步讨论可参见文献，具体为C.Borlongan等“移植冻存的人胚胎癌衍生的神经元(NT2N细胞)促进了局部缺血大鼠的功能恢复”，ExpNeurol，1998，149：310-21和C.Borlongan等“褪黑激素诱导提高了胶质细胞的存活对脑缺血提供了神经保护”，FASEBJ，2000，14：1307-17。每只中风动物接受含有4万、10万和20万(下文中这些数量应理解为大约数量)活NPC细胞三种剂量之一的移植物。中风后6周进行移植，整个移植后存活期间每天用环孢菌素A(10mg/kg，i.p)免疫抑制动物。移植后4周内每周分析移植大鼠的运动和认知行为的特征，移植后12周再进行一次。移植后5周和12周用组织学方法检查随机选择的动物脑局部缺血的程度和移植物的存活。

在最后确定中风手术和移植效果时采用了以下试验以更详细描述。进行这些试验的方法见本文中所述，也是本领域技术人员知道的。

表1.NPC移植效果的参数

检测            目的

EBST            揭示中风后的运动缺陷和移植后的恢复

                神经学检查揭示中风后的感觉-运动异常和移植后的恢复

Morris水迷宫    揭示中风后的认知缺陷和移植后的恢复

TTC组织学检查   揭示脑梗塞程度

GFAP            揭示脑梗塞程度和对移植物的宿主免疫应答

GFP病毒载体     提示移植的NPC细胞的存活与迁移

Neu-N           提示移植的NPC细胞表达的神经元表型

EBST：提高身体转向试验；TTC：氯化三苯四唑；GFAP：胶质细胞纤原酸性蛋白。

以下实施例中获得的数据显示在所研究的模型中，移植了NPC的动物显示运动和认知行为与移植前基线行为相比有显著改善。二种较高剂量(约10万个和约20万个细胞)比较低剂量(约4万细胞)显示行为效果更加改善，提示剂量-效应有关。观察到早至移植后一周中风导致的行为缺陷已有实质性恢复并持续超过移植后4周。观察到所有三种类型的中风中运动行为都有显著改善(用提高身体转向试验和Bederson试验评价)。相对地，与MCAI移植动物相比，MCAo和TGI移植动物认知行为的显著改善更显著更稳定(用Morris水迷宫检测)。研究期间所有中风动物移植后看起来健康，没发现明显的不良反应。

中风的类型看来是影响功能恢复的一种因素，即虽然所有的中风动物显示运动行为有显著改善，但MCAo和TGI移植动物的认知行为比MCAI移植动物恢复得更好。MCAo和TGI移植动物中运动和认知功能显著恢复的现象提示，分别产生基底神经节和海马损伤的这二种中风模型对NPC植入有反应。探索这些观察结果在临床中的应用将表明，患固定基底神经节和海马中风的患者可能受益于NPC移植。

移植后5周和12周组织学检查结果表明，存活的NPC导致了所观察到的功能改善。这些资料提示，植入10万和20万个NPC比低剂量的4万个细胞使行为恢复得更好。移植物存活与行为恢复效果之间的相关性分析进一步支持以下观点：存活的NPC细胞促进了中风动物的运动和认知恢复。注意，移植物存活是用慢病毒标记方法测定的，此法能可靠地标记移植的NPC。用此法也易于追踪NPC的迁移。

取决于中风的类型，看来如MCAo和MCAI中所见，脑损伤越重，NPC迁移得越好。相反，TGI所导致的中度脑损伤中该细胞的迁移较差。观察到NPC能越过较长距离到达损伤部位，提示它能够迁移到特定的中风靶部位发挥修复作用。以下实施例提供的结果支持以下观点：迁移的NPC很可能分化成为神经元表型。许多因素可能影响到迁移细胞的优先分化，包括但不限于宿主的微环境和中风类型(部位和程度/死亡细胞的类型)。

F.MNC的实验观察和优点

虽然本发明考虑可移植自体或同种异体的MNC，包括含MNC的药物组合物，但优选同种异体移植(同种动物的移植物形成单位)。在一实施方式中，同种异体移植模拟了在患有中枢神经系统损伤患者中发生的同种异体移植MNC时的临床状况。在以下J章节中提供了在中风动物模型中移植同种异体MNC的动物试验结果。这些动物模型可用于了解本发明治疗中枢神经系统损伤的效果。

章节H的结果提示，在行为评估试验中，与对照组和MASC组相比，MNC组显示显著性改善。组织学分析中，MCAo后41天时测定的梗塞面积显示三组之间无显著性差异。与MASC相比，MNC显示较高的存活率，宿主脑中较大比例的MNC显示神经元标记阳性和轴突延伸。

在行为评估试验中，与对照组相比，MASC组显示有轻度改善但不如MNC组。

本发明MNC移植的另一优点是，与例如多能MASC相比，MNC的存活率更高。移植后一个月，检测到约30-45％移植的MNC，而只检测到10-20％移植的MASC。MNC的较高存活率对功能恢复有益。

在近年的研究中，观察到在宿主脑的皮质、纹状体和海马中某些MNC产生了延伸的轴突，但在MASC组中没观察到。因此MNC组显著性行为改善提示，移植的MNC在宿主脑中维持了神经元特征，对MCAo大鼠模型的功能恢复有贡献。

G.NPC实施例

本文提供这些实施例的目的是说明而非限制本发明的范围。

实验方案所有动物先接受MCAo、MCAI或TGI中风手术。术后约6周用提高身体转向试验、bederson试验、Morris水迷宫试验检测动物。只用随后出现明显运动缺陷的动物进行移植手术并随机分配至以下各治疗组。表2给出了此项研究各分支的样品大小。

表2.治疗状况

此项研究所用的大鼠总数

所有动物经历中风手术，接受3针(MCAo和MCAI)或2针(TGI)注射细胞，并每天用环孢菌素A(10mg/kg，i.p)治疗。

移植后前4周每周检测动物情况。移植后第5周一半动物安乐死作脑梗塞、移植物存活、表型表达和细胞迁移的组织学分析。其余动物用于评估长期行为，中风后第12周安乐死作NPC的组织学检查。为了说明，以下提供了流程图。

                    中风手术

                       ↓

行为试验(中风后6周，此项研究只包括达到标准的动物)

                  ↓

         移植(中风后第6周)

                 ↓

行为试验(移植后4周内第周一次和第12周

用GFP慢病毒载体系统标记细胞：GFP慢病毒系统由日内瓦大学(Geneva，Switzerland)的Didier Trono博士提供。用以下通用方法标记NPC细胞。此法耐受微小变异。

所需材料

10mg/ml聚凝胺贮备液/过滤除菌(Sigma)

Opti-MEM培养液(Gibco/Invitrogen)

1％胎牛血清和抗菌素(青霉素/链霉素)

6孔板约1X10⁶个San-Bio细胞

病毒悬浮液

详细步骤

1.在37℃培养箱中温热细胞培养液。

2.加入聚凝胺至10μg/ml(将10微升10mg/ml聚凝胺贮备液加入到10ml培养液中，充分混匀。)

3.在另一试管中将1ml病毒悬浮液加到1ml含聚凝胺的培养液中。

4.在37℃水浴中快速溶化一小瓶SanBio细胞。用70％乙醇淋洗小瓶擦干。

5.将全部内容物加入到一装有10ml预温PBS的15ml离心管中；轻轻混合，在临床用低速离心机中室温下1000RPM离心5分钟。

6.轻轻抽吸上清液并将细胞颗粒重悬在2ml含有病毒的预温培养液(步骤3)中。

7.将内容物转移到6孔板的一孔中，放置在37℃培养箱中培养3小时。

8.用10ml预温的PBS洗涤细胞二次。

9.用20微升PBS或所选培养液重悬细胞。转移到1.5ml小离心管中。冰上保持。细胞已准备好移植。

行为试验：在本发明的药理学研究中检测动物的以下感觉运动行为和认知行为：

提高身体的转向试验(Elevated Body Swing Test，EBST)

Morris水迷宫试验

Bederson神经学评分

提高身体的转向试验(EBST)

提高身体的转向试验(EBST)检测基础性体位反射功能和不对称躯干功能。已证明实验鼠在MCAo和MCAI局部缺血后显示EBST有长期缺陷。C.Boriongan等“中脑动脉梗塞后的运动和被动回避缺失”PhysiolBehav.1995，58：909-17。也参见C.Boriongan等“成功堵塞中脑动脉时运动功能失调的早期评价”，Neuroreport.1998b，9：3615-21。对慢性中风的神经元移植范例也作了评价。C.Boriongan等“成功堵塞中脑动脉时运动功能失调的早期评价”，Neuroreport.1998；9：3615-21。

EBST包括手握住动物的尾巴和记录其头转向的方向。实验装置为透明的普列克斯玻璃(plexiglas)盒(40x40x35.5cm)。轻轻握住动物的尾根部，提起尾巴直到动物的鼻子离开地表面2英寸。记数鼠头向两侧运动偏离身体中线约10度的左或右转次数。一次转向试验后，将动物放回普列克斯玻璃盒中让其自由活动30秒再进行实验。每只动物重复这些步骤20次。正常大鼠显示转向差别(swing bias)为50％，即左转和右转的次数相同。75％转向差别表示20次试验中15次转向一侧5次转向另一侧。先前的EBST工作发现，黑质纹状体系统(nigrostriatal)脑损伤动物在损伤后一个月出现＞75％的转向运动差异，这种不对称性可保持6个月。

Bederson神经学检查

Bederson神经学评分检查的是感觉运动功能。J Bederson等“大鼠中脑动脉栓塞：神经学检查的模型和开发评价”Stroke.1986.17：472-6；M Altumbabic，“大鼠的脑内出血：血肿抽吸术的效果”Stroke.1998，29：1917-22。先前工作表明，在大鼠MCAo和MCAI中风模型中，如Bederson模式那样可检测到这段时间中有神经学缺陷。

按上述步骤在EBST后约1小时进行Bederson神经学检查。4种试验得到各个大鼠的神经学评分，包括：

(a)观察有无自发性同侧转圈，分数0(不转圈)-3分(不停转圈)；

(b)对侧后肢回缩，待测动物在其后肢侧移2-3cm后能否恢复原位，0分(立即回缩)，3分(几分钟后回缩或不能回缩)；

(c)杠杆行走能力，0分(大鼠在2.4cm宽80cm长的杠杆上行走容易)，3分(大鼠在杠杆上不能站稳10秒钟)；和

(d)双侧前爪握持力，检测握住2mm直径钢棍的能力，0分(大鼠前爪握持力正常)，3分(大鼠不能用前爪握持)。

每个评估日进行所有4次试验，各15分钟，评分相加得到神经缺陷评分(最大可能评分为12分)。

Morris水迷宫(MWM)试验

Morris水迷宫试验可评估几个方面的认知功能，包括任务的获得和保留、寻找方法和坚持。推测水迷宫任务试验对受MCAo影响的几处脑区域包括纹状体和前额皮层损伤敏感。

在Bederson神经学检查后约1小时，对动物进行Morris水迷宫试验以评估空间立体记忆。Morris水迷宫试验设备为直径6英寸深3英寸的可充气槽。在该槽中加入12cm的水和300ml牛奶使其不透明。将具有直径10cm园形表面的用透明普列克斯玻璃制作的11cm高平台放入此水槽中4位置之一。平台低于水面1cm如此不让水中的动物看见。将此水槽分成4等份，每份面积相等。将测试鼠放入水槽中面朝向槽外侧，从4个起始位置之一(东、南、西、北)释放，这些位置是随机确定的，距水槽边缘相等距离任意定位。平台位于南西象限中部距水槽边缘25cm。每次试验后改变起始点。给动物约60秒寻找平台和在平台上休息约30秒钟，再放回起始点。从随机确定的起始点共进行3次试验。如果大鼠在约60秒内不能找到隐藏的平台，则将其放到平台上休息约30秒钟。休息后将大鼠放回水槽再测试2次。共包括3次测试训练。第2天进行测试(探索试验，见下文)。每次训练和测试后将大鼠放回底部装有加热垫的笼子中。用连接计算机的摄象机通过影象分析仪监视泳道。利用逃走到找到平台的间隔时间和大鼠找到平台游泳的距离长度来评估水迷宫任务完成情况。用公式：游泳速度＝距离长度/逃走时间来评估完成此任务的大鼠运动能力。为评估对平台的记忆，第2天在水槽中进行无平台的60秒钟探索试验。监测找到先前平台位置花费时间的百分比。

MCAo中风手术：在无菌条件下进行所有的手术步骤。MCAo中风方法取自文献，具体是C.Boriongan等“给血脑屏障损伤大鼠长期注射环孢菌素A不会伤害其被动回避的记忆”Neurosci Res.1998，32：195-200。用多普勒激光检测成功堵塞(动脉)的各动物，显示在堵塞1小时期间脑血流显著减少(＞75％)。MCAo产生了一致的纹状体损伤。

MCAI中风手术：MCAI手术方法见Y.Wang等“胶质细胞产生的神经营养因子可保护局部缺血引起的脑皮层损伤”1997，J Neuroscience，17(11)：4341-4348。也可采用多普勒激光来验证动脉结扎。MCAI产生了一致的皮层损伤。

TGI中风手术：采用一种4-血管堵塞技术。在深度麻醉下给动物作颈椎中线切口。通过一颈椎前侧孔分离椎动脉。用显微镊子结扎两侧颈总动脉15分钟。此技术证明能产生全脑缺血，与海马损伤相符。

神经元前体细胞：神经元前体细胞由SanBio公司(Mountain View，CA)提供。通常按照PCT/JP03/01260产生这些细胞。

移植方法：在无菌条件下进行所有手术步骤。在equithesin(3mg/kg，i.p)麻醉下(检查动物的疼痛反射)，用26号植入套管针将NPC直接植入到MCAo动物的纹状体中，MACI动物的皮层中，或TGI动物的海马中。参见Y.Wang等“胶质细胞产生的神经营养因子可保护局部缺血引起的脑皮层损伤”1997，JNeuroscience，17(11)：4341-4348和C.Borlongan等“移植冻存的人胚胎癌衍生的神经元(NT2N细胞)促进了局部缺血大鼠的功能恢复”，Exp Neurol，1998，149：310-21。可用本文所述方法获得冻存的NPC。用台盼兰排除法计数活细胞然后立即移植给最后的接受动物。预定的细胞用量(4万、10万和20万)是指活细胞数。在融化细胞后2小时内进行移植手术。输注速度为每分钟1微升细胞液。输注后给予3分钟吸收时间然后抽回注射针。手术期间用加热垫和直肠温度计维持体温约37℃直到从麻醉恢复。

统计学分析：利用重复测定的ANOVA分析行为数据，p＜0.05为有统计学显著性差异。用包括Posthoc检验的折中t检验来提示各治疗组之间有无显著性差异(p’s＜0.05)。

实施例1：MCAo结果--移植后4周每周检测

给测试动物进行上述MCAo手术，移植后4周每周评价一次，结果如下。

EBST：移植后4周每周检测一次，全体ANOVA显示有明显的主要治疗效果(F2，21＝57.06，p＜0.0001)(图1)。还观察到剂量依赖性显著作用(20万＞10万＞4万)(p’s＜0.01)。移植后4周每周的运动不对称性比基线显著降低(p’s＜0.0001)，移植后1周时出现最强烈恢复(p’s＜0.0001)，移植后2、3和4周则显示稳定的恢复。Posthoc检验显示，移植后1周时三种剂量细胞之间运动不对称性的显著减少没有差异；但移植后第2、3和4周时可见剂量依赖性效果(p’s＜0.05)(图2)。

Bederson试验：移植后4周每周检测一次，全体ANOVA显示有明显的主要治疗效果(F2，21＝9.65，p’s＜0.001)(图3)。20万和10万细胞较高剂量的神经缺陷评分比4万个细胞低剂量有更好的改善(p’s＜0.01)。移植后4周每周的神经缺陷评分比基线明显要低(p’s＜0.0001)。随时间推移移植动物的行为改善倾向于更佳，移植后2、3和4周比移植后第1周好(p’s＜0.0001)。Posthoc检验显示，移植后一周时三种剂量细胞之间的神经缺陷评分的显著减少没有不同；但第2周10万和20万高剂量的恢复比4万低剂量为好(p’s＜0.05)；移植后3和4周显示有剂量依赖效应(20万＞10万＞4万)(p’s＜0.05)(图4)。

MWM获得：移植后4周每周检测一次，全体ANOVA显示无显著的主要治疗效果(F2，21＝2.87，p＝0.08)(图5)。与基线和移植后一周相比，如2、3和4周较长获得时间所显示的那样，看来在整个移植后4周的时间里倾向于较长的MWM获得时间(p’s＜0.01)(图6)。

MWM探索试验：找到平台的时间。移植后4周每周检测一次，全体ANOVA显示有明显的主要治疗效果(F2，21＝61.33，p＜0.0001)(图7)。20万和10万细胞较高剂量找到平台的时间比4万个细胞低剂量明显缩短(p’s＜0.0001)。移植后4周每周找到平台的时间比基线明显缩短(p’s＜0.0001)。随时间推移移植动物的行为改善倾向于更佳，移植后2、3和4周比移植后第1周好(p’s＜0.0001)。Posthoc检验显示移植后4周内20万和10万较高剂量找到平台的时间显著少于低剂量4万细胞；移植后1周和4周显示有剂量依赖效应(20万＞10万＞4万)(p’s＜0.05)(图8)。

MWM探索试验：在平台区域花费的时间。移植后4周每周检测一次，全体ANOVA显示有明显的主要治疗效果(F2，21＝15.19，p’s＜0.0001)(图9)。20万和10万细胞较高剂量在平台区域花费的时间比4万个细胞低剂量明显较长(p’s＜0.01)。移植后4周每周在平台区域花费的时间比基线明显增加(p’s＜0.0001)。随时间推移移植动物的行为改善倾向于更佳，移植后3和4周比移植后第1和2周好(p’s＜0.0001)。Posthoc检验显示移植后4周内20万和10万高剂量在平台区域花费的时间比4万低剂量明显更长(p’s＜0.05)(图10)。

实施例2：MCAI结果--移植后4周每周检测

给测试动物进行上述MCAI手术，移植后4周每周评价一次，结果如下。

EBST：移植后4周每周检测一次，全体ANOVA显示有明显的主要治疗效果(F2，24＝76.30，p’s＜0.001)(图11)。20万和10万细胞较高剂量的运动不对称恢复得比4万个细胞低剂量更好(p’s＜0.0001)。移植后4周每周的运动不对称比基线明显减少(p’s＜0.0001)。移植后2、3和4周显示恢复得更好。Posthoc检验显示移植后一周较高剂量细胞的运动不对称减少显著好于低剂量，有剂量依赖效应(20万＞10万＞4万)(p’s＜0.05)(图12)。

Bederson试验：移植后4周每周检测一次，全体ANOVA显示有明显的主要治疗效果(F2，24＝3.65，(p＜0.05)(图13)。20万细胞最高剂量的神经缺陷评分的改善比4万个细胞低剂量更好(p’s＜0.05)；中等剂量10万细胞与低剂量4万细胞之间未见明显差异(图13)。移植后4周每周的神经缺陷评分改善比基线明显要低(p’s＜0.0001)，整个期间保持稳定，整个期间每周神经评分不同剂量细胞之间无显著性差异(p’s＞0.05)。Posthoc检验显示3周和4周时最高剂量20万个细胞的恢复比低剂量4万个细胞要好(p’s＜0.01)；移植后较早时间点不同剂量细胞之间未见显著差异(p’s＞0.05)(图14)。

MWM获得：移植后4周每周检测一次，全体ANOVA显示无显著的主要治疗效果(F2，24＝5.78-16，p＞0.05)(图15)。与基线相比，如1、2、3和4周较长获得时间所显示的那样，看来在整个移植后4周的时间里倾向于更长的MWM获得时间(p’s＜0.0001)(图16)。

MWM探索试验：找到平台的时间。移植后4周每周检测一次，全体ANOVA显示无明显的主要治疗效果(F2，24＝0.62，p＝0.55)(图17)。在整个移植后时间内，注意到找到平台的时间显著更久(p’s＜0.001)(图18)。

MWM探索试验：在平台区域上花费的时间。移植后4周每周检测一次，全体ANOVA显示无明显的主要治疗效果(F2，24＝2.01，p＝0.16)(图19)。虽然在移植后整个4周内在平台区域花费的时间比基线明显要长(p’s＜0.001)，但只在移植后1周观察到短暂的剂量依赖效应(p’s＜0.05)，其余3周测试时间内未见到(p’s＞0.05)(图20)。

实施例3：TGI结果--移植后4周每周检测

给测试动物进行上述MCAI手术，移植后4周每周评价一次，结果如下。

Bederson试验：移植后4周每周检测一次，全体ANOVA显示有明显的主要治疗效果(F2，23＝47.33，p’s＜0.001)(图21)。20万和10万个细胞较高剂量的神经缺陷评分的改善比4万个细胞低剂量更好(p’s＜0.0001)。移植后4周每周的神经缺陷评分改善比基线明显要低(p’s＜0.0001)。Posthoc检验显示移植后1周神经缺陷评分显著降低在三种细胞剂量之间无差异，但在2、3和4周时最高剂量10万和20万个细胞的恢复比低剂量4万个细胞要好(p’s＜0.005)；移植后4周呈现剂量依赖效应(20万＞10万＞4万)(p’s＜0.05)(图22)。

MWM获得：移植后4周每周检测一次，全体ANOVA显示有显著的主要治疗效果(F2，23＝9.88-16，p’s＜0.001)(图23)。然而此显著治疗效果的获得只是由于最高剂量20万个细胞与其它二种10万和4万个细胞剂量相比在移植后1周获得此任务时产生了短暂的显著改善)(p’s＜0.005)。然而注意到，移植后2、3和4周的获得时间比基线和移植后1周时更长(p’s＜0.005)(图24)。

MWM探索试验：找到平台的时间。移植后4周每周检测一次，全体ANOVA显示有明显的主要治疗效果(F2，23＝30.98，p’s＜0.0001)(图25)。20万和10万细胞较高剂量找到平台的时间比4万个细胞低剂量明显缩短(p’s＜0.0001)。移植后4周每周找到平台的时间比基线明显缩短(p’s＜0.0001)。随时间推移移植动物的行为改善倾向于更佳，移植后3和4周比移植后第1和2周要好(p’s＜0.0001)。Posthoc检验显示，移植后2和3周20万较高剂量找到平台的时间显著少于其它二种10万和4万个细胞(p’s＜0.05)；而移植后4周内对找到平台二种较高剂量比低剂量获得了更好的改善(p’s＜0.05)(图26)。

MWM探索试验：在平台区域花费的时间。移植后4周每周检测一次，全体ANOVA显示有明显的主要治疗效果(F2，23＝54.06，p’s＜0.0001)(图27)。在整个移植后4周内呈现明显的剂量依赖效应(20万＞10万＞4万)(p’s＜0.0001)。此外，整个移植后4周内在平台区域花费的时间变长(p’s＜0.0001)。Posthoc检验显示，移植后3和4周20万和10万较高剂量在平台区域花费的时间比4万低剂量明显更长(p’s＜0.05)。在移植后2周时只有最高剂量细胞导致在平台区域花费的时间比其它二种剂量细胞显著更长(p’s＜0.05)(图28)。

实施例4：移植后5周的组织学检查

移植后5周对随机选择的动物实行安乐死(见表3)。限于对每种剂量和中风类型的2-3份脑样品进行组织学检查。因此根据GFP表面荧光只定量分析了存活和迁移的移植细胞。采用各种其它组织学参数标记物的特异性抗体检测表型的表达，只提供了总体描述。

移植NPC细胞的存活：GFP表面荧光显示所有三种中风类型的移植细胞存活均为剂量依赖型(20万＞10万＞4万)(F8，32＝33.9，p＜0.0001)(图29)。GFP阳性细胞平均数显示，较低剂量4万细胞导致低数量的GFP阳性移植细胞存活，而二种较高剂量10万和20万细胞导致较高数量的GFP阳性移植细胞存活。这些观察与MCAo、MCAI和TGI移植动物所见相符。然而，计算每种细胞剂量的移植细胞存活百分比时，三种剂量得到的百分比无显著差异(F8.32＝1.67，p’s＞0.05)(图30)。

表3移植后5周时的组织学检查

移植细胞类型    细胞数量    中风类型    样品大小

NPC             4万个       MCAo        4

                            MCAI        5

                            TGI         4

                10万个      MCAo        5

                            MCAI        5

                            TGI         4

                20万个      MCAo        5

                            MCAI        5

                            TGI         4

移植细胞的存活与功能恢复之间呈正相关：回归分析显示移植的NPC细胞存活数越多(20万＞10万＞4万)，功能的改善越好(图31)。

移植NPC细胞的迁移：GFP表面荧光显示大多数移植细胞(约55％-85％)仍呆在最初移植部位(图32)。MCAo移植动物中，在最初的纹状体植入部位易于鉴定到一些GFP阳性细胞(62％)，MCAI移植动物中GFP阳性细胞仍呆在最初植入的皮质部位(53％)，TGI移植动物中GFP阳性细胞仍呆在最初的海马部位(86％)。然而看来MCAo和MCAI移植动物显示比TGI移植动物有更多迁移的移植细胞。然而观察到的迁移移植细胞仍呆在到整个靶区域内，即MCAo观察到的迁移细胞在纹状体内，MCAI在皮质内，TGI在海马内。MCAo和MCAI中迁移的移植细胞的特征是，移植细胞分别位于纹状体和皮质局部缺血性半影内层。MCAo还观察到细胞沿纹状体局部缺血半影的中部向外侧(1.8mm)，背侧向腹侧(2.3mm)迁移。MCAI中见到细胞从中部向外侧迁移(4.4mm)。TGI移植动物中移植细胞的迁移特征是，在CA2和CA3区中鉴定到GFP阳性的SBDP(分别距离最初的CA1植入部位1.6mm和0.7mm远)。

NPC表达的表型：植入的NPC细胞为GFAP阳性(约5％)，极少数细胞(每个大脑2-5个细胞)NeuN也阳性。用GFP共定位这两个标记。所有剂量和所有三种类型的中风中这些观察相一致。

实施例5：移植后12周MCAo的结果

移植后12周评价了进行上述TGI手术后的测试动物，结果如下。

EBST：移植后12周检测，全体ANOVA显示有明显的主要治疗效果(F2，9＝11.84，p＜0.005)(图32).Posthoc检验显示移植后12周运动不对称显著低于基线(p＜0.001)。

Bederson试验：移植后12检测，全体ANOVA显示有明显的主要治疗效果(F2，9＝41.83，p＜0.001)(图32)。Posthoc检验显示移植后12周神经缺陷显著少于基线水平(p＜0.001)。

MWM获得：移植后12周检测，全体ANOVA显示无显著的主要治疗效果(F2，9＝0.36，p＝0.71)(图33)。这些结果表明基线与移植后12周之间的MWM获得无显著性差异。

MWM探测试验：找到平台的时间。移植后12周检测，全体ANOVA显示有明显的主要治疗效果(F2，9＝6.18，p＜0.05)(图33)。Posthoc检验显示移植后12周找到平台的时间明显少于基线(p＜0.001)。

MWM探测试验：在平台区域花费的时间。移植后12周检测，全体ANOVA显示有明显的主要治疗效果(F2，9＝6.18，(p＜0.05)(图33)。Posthoc检验显示移植后12周在平台区域花费的时间明显多于基线(p＜0.001)。

实施例6：移植后12周MCAI的结果

移植后12周评价了给予上述MCAI手术的测试动物，结果如下。

EBST：移植后12周检测，全体ANOVA显示有明显的主要治疗效果(F2，9＝23.02，(p＜0.0005)(图34).Posthoc检验显示移植后12周运动不对称显著低于基线(p＜0.0001)。

Bederson试验：移植后12检测，全体ANOVA显示有明显的主要治疗效果(F2，9＝9.29，(p＜0.001)(图34)。Posthoc检验显示移植后12周神经缺陷显著少于基线水平(p＜0.0001)。

MWM获得：移植后12周检测，全体ANOVA显示无显著的主要治疗效果(F2，9＝1.37，p＝0.30)(图35)。这些结果表明基线与移植后12周之间的MWM获得无显著性差异。

MWM探索试验：找到平台的时间。移植后12周检测，全体ANOVA显示无明显的主要治疗效果(F2，9＝0.26，p＝0.78)(图35)。这些结果表明MWM探索试验，即有平台时基线与移植后12周之间无显著差异。

MWM探索试验：在平台区域上花费的时间。移植后12周检测，全体ANOVA显示无明显的主要治疗效果(F2，9＝0.15，p＝0.86)(图35)。这些结果表明MWM探索试验，即无平台时基线与移植后12周之间无显著差异。

实施例7：移植后12周TGI的结果

移植后12周评价了进行上述TGI手术的测试动物，结果如下。

Bederson试验：移植后12周检测，全体ANOVA显示有明显的主要治疗效果(F2，9＝184.02，p＜0.0001)(图36)。Posthoc检验显示移植后12周神经缺陷显著少于基线水平(p＜0.0001)。

MWM获得：移植后12周检测，全体ANOVA显示无显著的主要治疗效果(F2，9＝0.31，p＝0.74)(图37)。这些结果表明基线与移植后12周之间的MWM获得无显著性差异。

MWM探索试验：找到平台的时间。移植后12周检测，全体ANOVA显示有明显的主要治疗效果(F2，9＝5.14，p＜0.05)(图37)。Posthoc检验显示移植后12周找到平台的时间明显少于基线(p＜0.0001)。

MWM探索试验：在平台区域花费的时间。移植后12周检测，全体ANOVA显示有明显的主要治疗效果(F2，9＝4.39，p＜0.05)(图37)。Posthoc检验显示移植后12周在平台区域花费的时间明显多于基线(p＜0.0001)。

实施例8：移植后12周的组织学检查

移植后12周对所有存留的动物实行安乐死(见表4)。根据GFP表面荧光和采用各种其它免疫组化参数标记物的特异性抗体检测表型的表达，定量分析了存活和迁移的移植细胞。

表4移植后5周时的组织学检查

移植细胞类型    细胞数量(大约)    中风类型    样品大小

NPC    4万个    MCAo     4

                MCAI     4

                TGI      4

       10万个   MCAo     4

                MCAI     4

                TGI      4

       20万个   MCAo     4

                MCAI     4

                TGI      4

移植NPC细胞的存活：GFP表面荧光显示所有三种中风类型的移植细胞存活均为部分剂量依赖型(20万＝10万＞4万)(F8，27＝14.88，p＜0.0001)(图38)。GFP阳性细胞平均数显示，较低剂量4万细胞导致低数量的GFP阳性移植细胞存活，而二种较高剂量10万和20万细胞导致较高数量的GFP阳性移植细胞存活。这些观察与MCAo、MCAI和TGI移植动物所见相符。然而，计算每种细胞剂量的移植细胞存活百分比时，三种剂量得到的百分比无显著差异(F8.27＝1.37，p＞0.05)(图39)。提示低和高剂量的移植细胞存活百分率主要因CsA的免疫抑制作用而维持。

移植NPC细胞的迁移：与5周时的组织学检查相同，GFP表面荧光显示大多数移植的细胞(约65％-90％)仍呆在最初移植部位。MCAo移植动物中，在最初的纹状体植入部位易于鉴定到一些GFP阳性细胞(72％)；MCAI移植动物中GFP阳性细胞仍呆在最初植入的皮质部位(64％)；TGI移植动物中GFP阳性细胞仍呆在最初的海马部位(91％)。看来MCAo和MCAI移植动物显示比TGI移植动物有更多迁移的移植细胞。然而，观察到的迁移移植细胞仍呆在整个靶区域内，即MCAo观察到的迁移细胞在纹状体内，MCAI在皮质内，TGI在海马内。MCAo和MCAI迁移的移植细胞特征是，移植细胞分别位于纹状体和皮质局部缺血性半影内层。MCAo还观察到细胞沿纹状体局部缺血半影的中部向外侧(2.0mm)，背侧向腹侧(2.5mm)迁移。MCAI中见到细胞从中部向外侧迁移(4.5mm)。TGI移植动物的移植细胞迁移特征是，在CA2和CA3区中鉴定到GFP阳性的SBDP(分别距离最初的CA1植入部位1.6mm和0.8mm远)。

NPC表达的表型：所有类型的中风和剂量中，存活率约为15％。在这些最初的移植部位中，大多数细胞保留了其串珠状外观，NeuN或GFAP阴性。然而在MCAo移植动物中，这些细胞的少数显示为NeuN和GFAP阳性。分别检测到MCAo、MCAI和TGI移植动物中GFP阳性细胞沿纹状体半影、皮质半影和CA3区迁移，NeuN免疫染色的确显示这些细胞表达了成熟神经元的这种标记。总体上，所有类型的中风和剂量中，约25％存活的GFP阳性细胞为NeuN阳性；从移植部位迁移出的细胞约60％为NeuN阳性。这些细胞呈现神经元特有的精细长突起形态，这在MCAo移植动物中很丰富。GFP表面荧光显微观察显示各类中风都有独特的神经元形态，以及移植的NPC细胞间接触。经GFAP染色证实一些细胞(所有类型的中风和剂量中共约5％)显示为胶质细胞形态。发现大多数(如果不是全部的话)GFAP阳性细胞位于血管内或其附近。

移植物抗宿主组织病理学：纹状体、皮质或海马的Nissi染色无肿瘤形成证据。

实施例9：中风模型的其它NPC检测

此项研究的目的是检查用NPC治疗中风动物的效果。利用行为试验来揭示中风动物移植细胞后的运动和神经功能。中风后1个月时进行移植，移植后1月的整个存活期间每天给予环孢菌素A(CsA，10mg/kg，i.p)抑制动物的免疫排斥反应。移植后7、14和28天特征分析移植动物的运动和神经功能。用运动行为和神经功能评价，确定NPC的有效范围剂量显示移植结果很成功。

采用三种治疗方案：0(单用培养液)，低剂量90k NPC和高剂量190k NPC。根据统计学分析所需的样本大小确定每种治疗方案所需的相应动物数量(每组＝10只)。达不到行为缺陷标准(神经功能检测时转向运动75％偏向一侧和2.5分)的动物不包括在此项研究中。因此，此研究只包括达到这些标准和超过这些标准的动物。通常大多数中风动物可达到此标准，最终统计学分析至少需要8只动物。研究期间所有动物给予免疫抑制剂(每天CsA，10mg/kg，i.p)。

所有动物先接受MCAo中风手术。手术后4周用EBST测试动物，1小时后Bederson神经学检查。只将出现明显运动和神经功能缺陷的动物随后用于移植手术并随机分配作以下治疗：

表5.治疗方案

移植细胞类型	细胞量	中风类型	动物数目(样本大小)
				NPC	9万	MCAo	10
NPC	18万	MCAo	10
				运载体	0	MCAo	10

说明：所有动物经历中风手术，接受纹状体(MCAo)细胞移植和用CsA长期治疗

移植后7、14和28天对动物再次进行同一组行为测试。为说明，以下提供了流程图。

                         中风手术

                            ↓

行为试验(中风后1月，此项研究只包括此后达到和超过标准的动物)

                            ↓

                     移植(中风后1月)

                            ↓

               行为试验(移植后7、14和28天)

在无菌条件下进行所有的手术步骤。用equithesin(300mg/kg，i.p.)麻醉动物，通过疼痛反射核查。MCA堵塞技术包括通过颈动脉插入缝合丝到达MCA结合部阻断颈总动脉和大脑动脉环的血流。通过腹侧中线颈椎切口确定右侧颈总动脉并分离此动脉。4-0号缝合丝用无菌不吸收的缝合线制成(Ethicon公司)，其尖端直径变细可用橡胶粘结剂与24-26号针连接。将长约15-17mm的缝合丝从外部插入到颈动脉内阻断MCA。堵塞右侧MCA 1小时；MCA堵塞1小时通常导致最大梗塞。此外，已发现该栓子尖端的长度和大小在体重250-350克的大鼠中可产生MCA完全堵塞。采用加热垫和直肠温度计有利于维持体温在正常范围。用多普勒激光检测堵塞和再灌注是否成功。将多普勒探头放在预计堵塞的纹状体区上方硬膜区域(AP：+2.0，ML：±2.0和DV：-4.0mm)测量堵塞前，期间和堵塞后的脑血流。

在无菌条件下进行所有的手术步骤。在equithesin(3mg/kg，i.p.)麻醉下(通过疼痛反射核查)，用28号植入套管针直接将NPC细胞或运载体植入动物的纹状体(前囟前0.5mm，距中线侧面2.8mm和硬膜表面下方5.0mm)中。冻存的人NPC获自SanBio公司，在移植手术前融化。移植前和最后一只动物手术后立刻进行活细胞计数，采用台盼兰排除法。根据预实验研究确定的有效剂量范围，预先确定细胞剂量(9万和18万)。

融化细胞后2小时内进行移植术。输注速度为每分钟1微升细胞液。输注后给予3分钟吸收，然后抽回注射针。一次用一个注射针，但3处背腹侧沉积点各接受3微升细胞液。整个手术和随后的麻醉苏醒期间用加热垫和直肠温度计维持体温在37℃左右。

如EBST和Bederson两种试验中检查转向运动和神经缺陷与中风前动物的行为比较有显著性偏差显示的那样，1小时的MCAo中风手术在中风后1个月内产生了一致的行为损伤。中风前与中风后动物行为之间的配对比较，显示此项研究包括的所有中风动物在两种试验中都有显著损伤(p’s＜0.0001)。

随机安排，用运载体、低剂量90k NPC或高剂量180k NPC治疗中风动物，ANOVA显示两种检查都有显著治疗效果(p’s＜0.0001)。治疗组之间的配对比较显示，早至移植后7天不论剂量，移植NPC的中风动物与用运载体治疗的中风动物相比，显示行为缺陷有明显缓和(p’s＜0.05)。移植NPC中风动物的这种行为恢复持续直到移植后第14天和28天，即与用运载体相比，不论剂量，NPCGFP显著减少了运动和神经损伤(p’s＜0.0001)。更密切地检查二种NPC剂量显示，移植后所有天内EBST试验(p’s＜0.01)和移植后14和28天Bederson试验(p’s＜0.0005)中高剂量180k导致的行为缺陷缓和显著好于低剂量90k。结果见图44-45。

这些行为试验数据证明，早至移植后7天NPC对行为恢复即有治疗效益。结果进一步显示，移植NPC的正面疗效可稳定保持到移植后28天(研究截止期)。虽然低和高剂量的NPC都促进了功能恢复，但高剂量的行为恢复比低剂量明显更好。

此研究中对所有的中风动物都给予了免疫抑制剂。因为用载体处理的中风动物没有表现出任何可见的行为恢复，从而消除了免疫抑制剂CsA可能产生的混淆作用，这种混淆作用在先前中风前、中风期间和中风后给予药物的研究中可以见到。观察到的行为恢复只限于移植了NPC的中风动物，表明此种治疗效果的来源不可能是免疫抑制剂，而是移植的细胞。

进行苏木精和伊红(H&E)染色及Nissi染色，用NIH的成像系统测定各动物的最大梗塞面积。用以下公式计算：梗塞体积＝2mm(切片厚度)×[所有脑切片中梗塞面积之和(mm²)]。

移植后一个月，随机选择的动物实行安乐死以进行免疫组化分析。用标准的ABC法处理组织，步骤如下：用4倍放大的数字化PC基成像工具计算机程序观察20微米速冻组织切片。盲法记录脑切片数据，用Abercrombie公式计算免疫阳性细胞总数。

采用不会与鼠细胞表面标记或其它鼠蛋白交叉反应的抗人细胞表面标记的特异性人单克降抗体HuNu评估移植后NPC细胞的存活。分别用Neu-N和GFAP的免疫组化分析在移植细胞中检测神经元、胶质细胞和少突胶质细胞表型的表达。迁移的NPC植入细胞也具有有这些细胞表面标记。

总之，移植后一个月纹状体中NPC细胞存活良好，少数为MAP2阳性神经元。两种剂量NPC之间存活的移植细胞数无显著差异。NPC补充了局部缺血中风半影区的细胞丧失。两种剂量水平显示几乎相同程度的神经元拯救效果。图46-48提供了这些分析的数据。

H.MNC实施例

提供以下实施例是为了说明而不是限制本发明的范围。

实验步骤

培养MASC和诱导产生神经元

如S.Azizi等“植入albino-大鼠脑中的人骨髓基质细胞的迁移类似于移植的星形细胞”，Proc natl Acad Sci USA，1998，95：3908-13所述，分离Wistar大鼠的MASC细胞。如M.Dezawa等“移植体外分化的骨髓基质细胞诱生了大鼠坐骨神经的再生”，Eur J Neurosci，2001，14：1771-6所述用pBabe neo-GFP载体通过逆转录病毒感染对MASC进行绿荧光蛋白(GFP)标记。

如M.Dezawa等“从骨髓基质细胞特异性诱生神经元细胞及其在自身移植中的应用”，J Clin Invest，2004，113：1710-10所述，从MASC诱生神经元。简言之，用脂质转染胺Lipofectamin2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)将含Notch胞内结构域(NICD)的载体(pCI neo-NICD)转染入MASC细胞。11天后用G418选择细胞。为诱生MNC，将NICD转染的MASC细胞亚克隆一次(60-70％融合)，用含10％FBS、5μM FSK(Calbiochem，La Jolla，California)、10ng/mlbFGF(Peprotech，London，UK)的α-MEM培养。5天后将细胞移植入MCAo大鼠模型中。为体外鉴定诱生的MNC，进行免疫细胞化学分析。采用抗-MAP-2ab(Sigma，St，Louis，Missouri)、神经纤丝-M(NF-M)(Chemicon，Temecula，California)和β-微管蛋白3(β-tubulin3)(Sigma，St，Louis，Missouri)作为神经元标记，90-95％的MNC细胞显示这些免疫标记为阳性。

MCAo大鼠模型：

200-250g雄性Wistar大鼠维持在室温(24℃)下，白天-黑夜各12小时循环，给予食物自由饮水。此MCAO方法是J.Koizumi等“局部缺血性脑水肿的实验研究。1，一种在局部缺血区域引入重循环血的大鼠脑栓塞新实验模型”，Jpn J Stroke，1986，8：1-8和E.Longa等“无须切开颅骨的大鼠可逆性中脑动脉堵塞模型”，Stroke，1989，20：84-91所述方法的改进。简言之，在用0.1-1.5％氟烷、10％O₂和空气混合气体诱导的深度麻醉下，作颈椎中线切口，确定左颈动脉分叉处，在外部结扎的颈动脉中插入直径0.3mm头部带硅橡胶涂层的4-0号尼龙线制成的探头，推进到颈动脉中距分叉处16-18mm。手术期间用反溃式加热垫(BWT-100，Bio Reseach Center Co.Ltd，Tokyo，Japan)和直肠温度计维持体温在37.5-38.0℃。进行动脉的血气分析，并通过麻醉机的控制将氧气压力维持在85-120mm Hg。堵塞后通过10mm探头管道引流进行4小时重灌注。

移植

MCAO术后第7天，腹腔内注射50mg/kg的苯巴比妥钠麻醉大鼠，放在立体定位框中。初步实验时，产生距中线侧面约3.5mm一侧区域的栓塞区域。为了在非坏死的脑实质中移植细胞，通过立体定位将含8000-16000个培养细胞的3微升磷酸缓冲细胞悬液(PBS，pH7.4)注射到各鼠左前脑的以下三个部位：前囟前+2mm、0mm和-2mm处；中线外侧2mm处；和距皮质表面深1.2mm处。移植细胞总数为24000-48000。

准备了三组动物：对照组，仅接受PBS(不进行细胞移植)(n＝7)；MASC组，进行非处理的完整MASC细胞移植(n＝10)；和NMC组，其中植入有MNC(n＝10)。

行为测试

用以下试验评价神经损伤的严重程度：杠杆平衡试验、肢体位置试验和Morris水迷宫试验。MCAO后7(移植前一天)、14、21、28和35天进行杠杆平衡试验和肢体位置试验。MCAO术后36-40天进行Morris水迷宫试验。

杠杆平衡试验(beam balance test)

用杠杆平衡试验来评估总体前庭运动功能，按C.Dixon等“实验性大鼠脑损伤的一种液体叩诊模型”J.Neurosurg，1987，67：110-9所述进行。根据以下标准评分：0分为爪子握住杠杆上部姿态稳定而平衡；1分为握住杠杆侧面和/或动作发抖；2分为有一个或几个爪子滑脱；3分为试图在杠杆上平衡但失败；4分为从杠杆上跌下不再尝试平衡或吊在杠杆上。

肢体定位试验

肢体定位试验检查对视觉、触觉和本体感受刺激肢体位置反应的感觉运动整合，一般按照M.De Ryck等“光化学中风模型：盐酸氟苯桂嗪预防大鼠新皮质梗塞后的感觉运动缺陷”，Stroke，1989，20：1383-1390所述进行此试验。一般也按照De Ryck此文所述进行本体感受加合试验。各试验的评分根据以下标准：0分为立即和完全摆好肢体位置；1分为不完全和/或延迟(＞2秒)摆好，包括间有连枷；2分为摆不好肢体位置。给予右前肢视觉、正面和侧面触碰及本体感受刺激。给予右后肢正面和侧面触碰及本体感觉刺激。对前肢和后肢进行本体感受加合试验。总评分范围0-18分。

Morris水迷宫试验

Morris水迷宫试验是用于评估感知功能的方法。报道了此试验的几种改进。一种采用A.Fukunaga等“局部缺血大鼠脑中植入间充质中枢神经系统干细胞后的分化和血管生成”，Cell Transplant.1999，8：435-41中所述的试验方法。在MACO术后36-40天进行此试验。准备水池(直径150cm深35cm)。逃脱平台(直径10cm)位于不透明白色牛奶水池表面以下1cm。围绕水池边缘设计有4个起始点N、E、S和W。平台保持在象限的中部，与水池中心和边缘等距。从各起始点放入大鼠让其游泳直到爬上平台，记录到达平台的时间(最大120秒)。每天2套4次试验训练大鼠连续5天。第一套5天训练后进行第二套空间探索试验。用该试验估计短期记忆保留。撤去平台让大鼠游泳60秒钟，测定各大鼠通过平台区域的次数。也测定在平台象限上花费的时间。

第41天，给予过量戊巴比妥处死动物，经颈动脉灌注0.9％盐水，然后是高碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液，如McLean等，″Periodate-lysine-paraformaldehyde fixative.A new fixation for immunoelectronmicroscopy″(高碘酸-赖氨酸-低聚甲醛固定剂，免疫电子显微镜用的一种新固定剂)J Histochem Cytochem.1974；22：1077-83实施例1部分所述。用Brain Matrix(BAS Inc.Warwickshire，UK)将脑切割成2毫米厚的冠状切片。由各个冠状切片制备10μm厚的冷冻切片。用苏木精和伊红(H&E)染色各切片以评估梗塞面积。用1×物镜在光学显微镜下获取切片图像，用Scion Image(Scion Corporation，Frederick，MD)追踪损伤区域。一般根据R.Swanson等，″A semiautomatedmethod for measuring brain infarct volume.″J Cereb Blood Flow Metab(测量脑梗塞体积的半自动化方法).1990；10：290-29所述计算梗塞体积，以对侧半球体积的百分比表示。

为进行免疫染色，将切片在40℃下与MAP-2(1∶100，Boehringer Mannheim，Germany)、β-微管蛋白3(1∶400，Sigma，Missouri)、NF-M(1∶200，BoehringerMannheim，Germany)、Tuj-1(1∶100，BAbCO，CA)或GFAP(1∶400，Dako，CA)的初级抗体孵育过夜。使用Alexa Fluor 546-偶联的抗鼠IgG(Molecular Probes，Eugene，OR)(对于MAP-2)或抗兔IgG(Molecular Probes，Eugene，OR)(对于β-微管蛋白3、NF-M、Tuj-1和GFAP)作为第二抗体。用TOTO-3进行核染色。用共聚焦激光扫描显微镜(CLMS)(Radiance 2000，Bio-Rad，Hertfordshire，UK)观察样本。

计算每只大鼠整个前脑中GFP-标记细胞的总量。以相同方式计算海马中GFP-标记细胞的数量。

统计学分析

用非重复性ANOVA检测分析行为评价数据和阻塞体积。当结果有显著性时(p＜0.05)，采用95％显著水平的Student-newman-Keuls Posthoc程序分析。除非另有说明，提供的数值是平均值±标准差。

实施例10：行为测试

MCAO术后一周移植前刻进行此测试，此时已出现严重的右侧神经缺陷，各行为试验的平均记分显示三组之间无统计学差异。

杠杆平衡试验

从第7天到21天三组之间的平均记分无统计学差异。第28和35天MNC组平均记分显示比对照组(28天p＝0.0041；35天p＝0.0001)和MASC组(分别为p＝0.0471；0.0007)明显改善。虽然28天和35天MASC组检测显示比对照组有轻度改善，但无统计学显著差异。

肢体定位试验

7-21天三组的平均评分之间无统计学差异。28和35天时，MNC和MASC组与对照组相比显示有显著性改善(分别为28天p＝0.0022和0.085；35天p＝0.0022和0.0211)。然而整个试验期间MNC与MASC组之间平均评分显示无显著差异(图41)。

Morris水迷宫试验

图42显示三组中各组大鼠每套4次试验找到淹没的逃脱平台记录的花费时间。显示MNC组花费的时间与对照和MASC组相比最短。39天第二套和40天第一套试验的平均花费时间显示MNC与对照组之间有显著性差异(分别为p＝0.0339和0.0492)(图42)。虽然MNC组找到逃脱平台花费的时间倾向短于MASC组，但不存在统计学显著差异。

空间探索试验中，MNC组大鼠显示比对照组(p＝0.0419)和MASC组(p＝0.0453)大鼠有显著改善(图43)。呆在平台位置象限上的平均时间三组中MNC组最长。MNC与对照组之间存在显著性差异(p＝0.0339)(图43)。

实施例11：组织学研究

阻塞区域位于左半球外侧一半，包括皮质、纹状体和海马，大部分脑损伤区观察到囊肿和疤痕形成。与对侧相比，患病侧海马萎缩，出现部分形态不规则的神经元和神经元丧失。测定了所有MCAO模型中的阻塞体积。33天时MNC、MASC和对照组的平均阻塞体积分别为50.7±10.9％、51.0±10.2％和50.9±11.1％，三组之间无统计学显著差异。

移植的GFP标记的MASC和MNC细胞主要位于完整组织与阻塞区之间的边缘区域，包括同侧皮质、白质胼胝体、纹状体和海马。观察到炎症细胞渗入阻塞病灶。MNC与MASC二组之间阻塞病灶中渗入的炎症细胞数似无差异。

大量GFP标记的MNC细胞为MAP-2免疫标记阳性，显示在宿主脑中长出了轴突。它们也是Tuj1和β-微管蛋白3免疫标记阳性。在同侧海马，GFP标记的MNC细胞有许多细胞小体和轴突为NF-M阳性。大部分GFP标记的移植MNC细胞为MAP-2B阳性(84.0±8.1％)，而只有一小部分细胞为GFAP阳性(1.0±0.2％)。

相反，在宿主脑中绝大多数MASC细胞为神经元标记(MAP-2、Tuj1、β-微管蛋白3和NF-M)和胶质细胞标记(GFAP)阴性。GFP-标记细胞中的MAP-2和GFAP阳性细胞的百分比分别为1.4±0.2％和4.8±1.0％。没发现MAP-2阳性MASC细胞中形成轴突。

宿主前脑中MNV和MASC的平均数为13250±1126和5850±997。移植后一个月检测到约30-45％移植的MNC细胞，另一方面检测到10-20％的移植MASC细胞。在局部缺血的脑中MNC的存活率大大高于MASC。在海马中，MNC的平均数为790±160，89％为MAP-2阳性。相反，MASC的平均数为470±66，0.6％为MAP-2阳性，表明大多数移植的MASC细胞是神经元和胶质细胞标记阴性。

所有各组大鼠MCAO术后41天，脑实质中没观察到肿瘤形成。

参考文献

Aihara N，Mizukawa K，Koie K，Mabe H，Nishino H.Striatal grafts in infarctstriatopallidum increase GABA release，recognize GABAa receptor and improvewater maze learning in the rat(大鼠梗塞的纹状体苍白球纹状体移植提高了GABA释放、识别GABAa受体和改善了水迷宫识别)Brain Res.1994；33：483-488

Altumbabic M，Peeling J，Del Bigio MR.Intracerebral hemorrhage in the rat：effects of hematoma aspiration(大鼠脑内出血：血肿抽吸术的效果).Stroke.1998；29：1917-22.

Azizi，S.A.，Stokes，D.，Augelli，B.J.，DiGirolamo，C.，Prockop，D.J.Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in thebrains of albino rats-similarities to astrocyte grafts(植入albino-大鼠脑中的人骨髓基质细胞的迁移类似于移植的星形细胞).Proc Natl Acad Sci U S A，1998；95：3908-13.

Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，Nishimura MC，Davis RL，Bartkowski H.Ratmiddle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of aneurologic examination(大鼠中脑动脉梗塞：神经学检查的模型评价和开发).Stroke.1986；17：472-6.

Bjorklund A，Lindvall O.Cell replacement therapies for central nervoussystem disorders(中枢神经系统疾病的细胞置换疗法).Nat Neurosci.2000；3：537-44.

Borlongan CV，Cahill DW，Sanberg PR.Locomotor and passive avoidancedeficits following occlusion of the middle cerebral artery(中脑动脉梗塞后的运动和被动回避缺陷).Physiol Behav.1995，58：909-17.

Borlongan CV，Fujisaki T，Watanabe S.Chronic cyclosporine-A injection inrats with damaged blood-brain barrier does not impair retention of passiveavoidance(给血脑屏障损伤大鼠长期注射环孢菌素A不会伤害其被动回避的记忆).Neurosci Res.1998，32：195-200.

Borlongan CV，Hida H，Nishino H.Early assessment of motor dysfunctionsaids in successful occlusion of the middle cerebral artery(成功堵塞中脑动脉时运动功能失调的早期评价).Neuroreport.1998；9：3615-21.

Borlongan CV，Tajima Y，Trojanowski JQ，Lee VM，Sanberg PRTransplantation of cryopreserved human embryonal carcinoma-derived neurons(NT2N cells)promotes functional recovery in ischemic rats(移植冻存的人胚胎癌衍生的神经元(NT2N细胞)促进了局部缺血大鼠的功能恢复).Exp Neurol.1998；149：310-21.

Borlongan CV，Yamamoto M，Takei N，Kumazaki M，Ungsuparkorn C，HidaH，Sanberg PR，Nishino H.Glial cell survival is enhanced duringmelatonin-induced neuroprotection against cerebral ischemia(褪黑激素诱导提高了胶质细胞的存活对脑缺血提供了神经保护).FASEB J.2000；14：1307-17

Brundin P，Widner H，Nilsson OG，Strecker RE，Bjorklund A.Intracerebralxenografts of dopamine neurons：the role of immunosuppression and theblood-brain barrier(多巴胺神经元脑内异种移植：免疫抑制和血脑屏障的作用).Exp Brain Res.1989；75：195-207.

Butcher SP，Henshall DC，Teramura Y，Iwasaki K，Sharkey J.Neuroprotectiveactions of FK506 in experimental stroke：in vivo evidence against anantiexcitotoxic mechanism(FK506在实验性中风中的神经保护作用：抗兴奋毒素机制的体内证据).J Neurosci.1997；17：6939-46.

Butovas S，Lukkarinen J，Virtanen T，Jolkkonen J，Sivenius J.Differentialeffect of the alpha2-adrenoceptor antagonist，atipamezole，in limb-placing task andskilled forepaw use following experimental stroke(α2-肾上腺能受体拮抗剂atipamezole在实验性中风后的肢体位置试验和熟练的前爪使用中的不同作用).Restor Neurol Neurosci.2001；18：143-51.

Chen J，Li Y，Wang L，Lu M，Zhang X，Chopp M.Therapeutic benefit ofintracerebral transplantation of bone marrow stromal cell s after cerebral ischemiain rats(大鼠脑缺血后大脑内移植骨髓基质细胞的治疗效果).J Neurol Sci.2000；189：49-57.

Chen J，Sanberg PR，Li Y，Wang L，Lu M，Willing AE，Sanchez-Ramos J，Chopp M.Intravenous administration of human umbilical cord blood reducesbehavioral deficits after stroke in rats(静脉内给予人脐带血减少了大鼠中风后的行为缺陷).Stroke.2001 Nov；32(11)：2682-8.

Chen J，Li Y，Wang L，Zhang Z，Lu D，Lu M，Chopp M.Therapeutic benefitof intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemiain rats(静脉给予脑局部缺血大鼠骨髓基质细胞的治疗效果).Stroke.2001；32：1005-11.

Chopp M，Li Y.Treatment of neural injury with marrow stromal cells(用骨髓基质细胞治疗神经损伤).Lancet Neurol.2002；1：92-100.

Chu，K，Manho Kim，Kyung-ll Park，Sang-Wuk Jeong，Hee-Kwon Park，Keun-Hwa Jung，Soon-Tae Lee，Lami Kang，Kyungmi Lee，Dong-Kyu Park，SeungU.Kim and Jae-Kyu Roh.Human neural stem cells improve sensorimotor deficitsin the adult rat brain with experimental focal ischemia(人神经干细胞改善了实验性局部缺血成年大鼠脑的感觉运动缺陷).Brain Research，2004 1016：145-153

Cicchetti F，Fodor W，Deacon TW，van Home C，Rollins S，Burton W，Costantini LC，lsacson O.lmmune parameters relevant to neural xenograft survivalin the primate brain(与神经异种移植物在灵长动物脑中存活有关的免疫参数).Xenotransplantation 2003；10：41-9

Dezawa M，Takahashi I，Esaki M，Takano M，Sawada H.Sciatic nerveregeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiatedbone-marrow stromal cells(移植体外分化的骨髓基质细胞诱生了大鼠坐骨神经的再生).Eur J Neurosci.2001；14：1771-6.

Dezawa M，Kanno H，Hoshino M，Cho H，Matsumoto N，Itokazu Y，Tajima N，Yamada H，Sawada H，Ishikawa H，Mimura T，Kitada M，Suzuki Y，lde C.Specificinduction of neuronal cells from bone marrow stromal cells and application forautologous transplantation(从骨髓基质细胞特异性诱生神经元细胞及其在自身移植中的应用).J Clin Invest.2004；113：1701-10.

De Ryck M，Van Reempts J，Borgers M，Wauquier A，Janssen PAJ.Photochemical stroke model：flunarizine prevents sensorimotor deficits afterneocortical infarcts in rats(光化学中风模型：盐酸氟苯桂嗪预防大鼠新皮质梗塞后的感觉运动缺陷)，Stroke，1989；20：1383-1390.

Ding Y，Li J，Luan X，Ding YH，Lai Q，Rafols JA，Phillis JW，Clark JC，DiazFG.Exercise pre-conditioning reduces brain damage in ischemic rats that may beassociated with regional angiogenesis and cellular overexpression ofneurotrophin(运动预调减少了脑局部缺血大鼠的脑损伤，可能与局部新血管生成和细胞过度表达神经营养因子有关).Neuroscience.2004；124(3)：583-91.

Dixon CE，Lyeth BG，Povlishock JT，Findling RL，Hamm RJ，Marmarou A，Young HF，Hayes RL.A fluid percussion model of experimental brain injury in therat(实验性大鼠脑损伤的一种液体叩诊模型).J Neurosurg.1987；67：110-9.

Fahr A.Cyclosporin clinical pharmacokinetics(环孢菌素的临床药物动力学).Clin Pharmacokinet.1993 Jun；24(6)：472-95.

Ferrari G，Cusella-De Angelis G，Coletta M，Paolucci E，Stornaiuolo A，CossuG，Mavilio F.Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenicprogenitors(骨髓衍生的肌原前体细胞导致的肌肉再生).Science.1998；279：1528-30.

Fukuda S，del Zoppo，GJ.Models of focal cerebral ischemia in the nonhumanprimate(非人灵长动物的局部脑缺血模型).ILAR J.2003；44(2)：96-104.

Fukunaga A，Uchida K，Hara K，Kuroshima Y，Kawase T.Differentiation andangiogenesis of central nervous system stem cells implanted with mesenchyme intoischemic rat brain(植入的中枢神经系统干细胞与间充质在大鼠缺血脑中的分化和新血管生成).Cell Transplant.1999；8：435-41.

Furuichi，Y.Masashi Maeda，Akira Moriguchi，Taiji Sawamoto，AkioKawamura.Nobuya Matsuoka，Seitaro Mutoh，and Takehiko Yanagihara.Tacrolimus，a Potential Neuroprotective Agent，Ameliorates Ischemic BrainDamage and Neurologic Deficits After Focal Cerebral Ischemia in NonhumanPrimates(一种潜在的神经保护剂减轻了非人灵长动物局部脑缺血后的脑损伤和神经缺陷).Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism.23：1183-1194，2003

Gharbawie OA，Gonzalez CL，Whishaw IQ.Skilled reaching impairmentsfrom the lateral frontal cortex component of middle cerebral artery stroke：aqualitative and quantitative comparison to focal motor cortex lesions in rats(熟练达到的中脑动脉中风皮质前侧叶组分的损伤：与大鼠皮质运动区的定性和定量比较).Behav Brain Res.2005；156：125-37.

Gonzalez CL，KoIb B.A comparison of different models of stroke onbehaviour and brain morphology(不同中风模型的行为和脑形态的比较).Eur JNeurosci.2000；18：1950-62.

Goto S，Yamada K，Yoshikawa M，Okamura A，Ushio Y.GABA receptoragonist promotes reformation of the striatonigral pathway by transplant derivedfrom fetal striatal promordia in the lesioned striatum(GABA受体激动剂促进了胚胎纹状体前运动神经元衍生的移植物在受损纹状体中黑质纹状体通路再生).Exp Neural.1997；147：503-509.

Grabowski M，Johansson BB，Brundin P.Survival of fetal neocortical graftsimplanted in brain infarcts of adult rats：the influence of postlesion time and age ofdonor tissue(胚胎神经皮质移植物在脑梗塞成年大鼠中的存活：损伤后时间和供者组织年龄的影响).Exp Neural.1994；127：126-36.

Green R，Odergren T，Ashwood T.Animal models of stroke：do they havevalue for discovering neuroprotective agents？(中风的动物模型：如何评价它们发现神经保护剂的价值？)Trends Pharmacol Sci.2003；24：402-8.

Hartings JA，Williams AJ，Tortella FC.Occurrence of nonconvulsive seizures，periodic epileptiform discharges，and intermittent rhythmic delta activity in ratfocal ischemia(大鼠脑局部缺血时发生的非阻塞性癫痫、间发性癫痫发作和间歇性δ节律脑电波活动).Exp Neural.2003；179：139-49.

Huang，J MD；J.Mocco，MD；Tanvir F.Choudhri，MD；Alexander Poisik，MDjSuIIi J.Popilskis，DVM；Ronald Emerson，MD；Robert L.DelaPaz，MD；Alexander G.Khandji，MD；David J.Pinsky，MD；E.Sander Connolly，Jr，MD.AModified Transorbital Baboon Model of Reperfused StrokeStroke(改进的经眼框重灌注中风模型).2000；31：3054-63.

Jiang Y，Jahagirdar BN，Reinhardt RL，Schwartz RE，Keene CD，Ortiz-Gonzalez XR，Reyes M，Lenvik T，Lund T，Blanckstad M，Du J，Aldrich S，Lisberg A，Low WC，Largaespada DA，Verfaillie CM.Pluripotency ofmesenchymal stem cells derived from adult marrow(成年骨髓中的多能间充质干细胞).Nature.2002；418：41-49.

Kaminska，B，Gaweda-Walerych，K，Zawadzka，M.Molecular mechanisms ofneuroprotective action of immunosuppressants-facts and hypotheses(免疫抑制剂神经保护作用的分子机制-事实与假设).J Cell MoI Med.2004；8：45-58.

Koizumi J，Yoshida Y，Nakazawa T，Ooneda G，Experimental studies ofischemic brain edema.1.A new experimental model of cerebral embolism in rats inwhich recirculation can be introduced in the ischemic area(大鼠脑梗塞的新实验模型，可在缺血区域重建血循环).Jpn J Stroke.1986；8：1-8.

Kohyama J，Abe H，Shimazaki T，Koizumi A，Nakashima K，Gojo S，Taga T，Okano H，Hata J，Umezawa A.Brain from bone：efficient″meta-differentiation″ofmarrow stroma-derived mature osteoblasts to neurons with Noggin or ademethylating agent(用Noggin或脱甲基试剂使骨髓基质衍生的成熟成骨细胞有效‘偏向分化’为神经元，从骨髓产生脑细胞).Differentiation.2001；68：235-44.

Kondziolka D，Wechsler L，Achim C.Neural transplantation for stroke(中风的神经移植).J Clin Neurosci.2002；9：225-30.

Kondziolka D，Wechsler L，Goldstein S，Meltzer C，Thulborn KR，Gebel J，Jannetta P，DeCesare S，Elder EM，McGrogan M，Reitman MA，Bynum L.Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke(培养的人神经细胞移植给中风患者).Neurology.2000；55：565-9.

Lemaire M，Pardridge WM，Chaudhuri G.Influence of blood components onthe tissue uptake indices of cyclosporin in rats(血液组分对大鼠组织摄入环孢菌素的影响).J Pharmacol Exp Ther.1988；24：740-3.

Li Y，Chopp M，Chen J，Wang L，Gautam S C，Xu Y X，and Zhang Z.lntrastriatal transplantation of bone marrow nonhematopoietic cells improvesfunctional recovery after stroke in adult mice(纹状体内移植骨髓非生血细胞促进了成年小鼠中风后的功能恢复).J Cereb Blood Flow Metab.2000；20：1311-19.

Lindner MD，Gribkoff VK，Donlan NA，Jones TA.Long-lasting functionaldisabilities in middle-aged rats with small cerebral infarcts(患小脑梗塞的中年大鼠长期功能性残疾).J Neurosci.2003；23：10913-22.

Lindvall O，Kokaia Z，Martinez-Serrano A.Stem cell therapy for humanneurodegenerative disorders-how to make it work(人神经退行性疾病的干细胞疗法-如何使其成功).Nat Med.2004；10 Suppl：S42-50.

Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，Cummins R.Reversible middle cerebralartery occlusion without craniectomy in rats(不用开颅逆转大鼠中脑动脉梗塞).Stroke.1989；20：84-91.

Mack，WJ，Ricardo J.Komotar，J Mocco，Alexander L.Coon，Daniel J.Hoh，Ryan G.King，Andrew F.Ducruet，Evan R.Ransom，Marcello Oppermann，RobertDeLaPaz and E.Sander Connolly Jr.Serial magnetic resonance imaging inexperimental primate stroke：Validation of MRI for preclinical cerebroprotectivetrials(实验性灵长动物中风的系列核磁共振成像：临床前脑保护试验的MRI验证).Neurological Research，2003；25：846-852.

Makino S，Fukuda K，Miyoshi S，Konishi F，Kodama H，Pan J，Sano M，Takahashi T，Hori S，Abe H，Hata J，Umezawa A，Ogawa S.Cardiomyocytes canbe generated from marrow stromal cells in vitro(可从体外骨髓基质细胞产生心肌细胞).J Clin Invest.1999；103：697-705.

Markgraf CG，Green EJ，Watson B，McCabe PM，Schneiderman N，DietrichWD，Ginsberg MD.Recovery of sensorimotor function after distal middle cerebralartery photothrombotic occlusion in rats(大鼠远端中脑动脉光血栓堵塞后的感觉运动功能恢复).Stroke.1994；25：153-9.

Marshall JW，Ridley RM.Assessment of cognitive and motor deficits in amarmoset model of stroke(中风模型中的认知和运动缺陷评估).ILAR J.2003；44：153-60.

Matsumoto S，lsshiki A，Watanabe Y，Wieloch T.Restricted clinical efficacyof cyclosporin A on rat transient middle cerebral artery occlusion(环孢菌素A对大鼠短暂是脑动脉阻塞的临床疗效有限).Life Sci.2002；72：591-600.

McLean I W，Nakane P K.Periodate-lysine-paraformaldehyde fixative.A newfixation for immunoelectron microscopy(高碘酸盐-赖氨酸-低聚甲醛固定剂，免疫电子显微镜用的一种新固定剂).J Histochem Cytochem.1974；22：1077-83.

Modo，M，R.Paul Stroemer，PhD；Ellen Tang，BSc；Sara Patel，PhD；HelenHodges，PhD.Effects of Implantation Site of Stem Cell Grafts on BehavioralRecovery From Stroke Damage(干细胞移植的植入部位对中风损伤后行为恢复的影响).Stroke.2002；33：2270-2278.

Modo，M，R.P.Stroemer，E.Tang，T.Veizovic，P.Sowniski，H.Hodges.Neurological sequelae and long-term behavioural assessment of rats with transientmiddle cerebral artery occlusion(对短暂中脑动脉阻塞大鼠的神经后果和长期行为的评估).Journal ofNeuroscience Methods 2000；194：99-109.

Morris R G M.Spatial localization does not require the presence of localcues(空间定位不需要存在位置提示).Learn Motiv.1981；12：239-260.

Nikkhah G，Rosenthal C，Hedrich HJ，Samii M.Differences in acquisition andfull performance in skilled forelimb use as measured by the′staircase test′in fiverat strains(五种大鼠品系爬楼梯试验检测熟练使用前肢获得和完善行为的差异).Behav Brain Res.1998；92：85-95

Nishino H and Borlongan CV.Restoration of function by neuraltransplantation in the ischemic brain(缺血脑神经移植导致功能恢复).Prog BrainRes.2000；127：461-76.

Nudo RJ，Larson D，Plautz EJ，Friel KM，Barbay S，Frost SB.A squirrelmonkey model of poststroke motor recovery(中风后运动恢复的松鼠猴模型).ILAR J.2003；44：161-74.

Orlic D，Kajstura J，Chimenti S，Jakoniuk I，Anderson SM，Li B，Pickel J，McKay R，Nadal-Ginard B，Bodine DM，Leri A.Anversa P.Bone marrow cellsregenerate infarcted myocardium(骨髓细胞再生阻塞了心肌层).Nature.2001；410：701-5.

Pakzaban P，lsacson O.Neural xenotransplantation：reconstruction of neuronalcircuitry across species barriers(神经异体移植：重建跨越物种屏障的神经环路).Neuroscience.1994；62：989-1001.

Pedersen EB，Zimmer J，Finsen B.Triple immunosuppression protects murineintracerebral，hippocampal xenografts in adult rat hosts：effects on cellularinfiltration，major histocompatibility complex antigen induction and blood-brainbarrier leakage(免疫抑制保护了成年大鼠宿主的脑内、海马异种移植物存活：对细胞渗出、主要组织相容性复合物抗原诱导的血脑屏障渗漏的影响).Neuroscience.1997；78：685-701.

Plautz，EJ，Barbay.S，Frost，SB，Friel，KM，Dancause，N，Zoubina，EV，Stowe，AM，Quaney，BM and RJ Nudo.Post-infarct cortical plasticity andbehavioral recovery using concurrent cortical stimulation and rehabilitative training：A feasibility study in primates(用同时刺激皮质和康复训练使梗塞后皮质重塑和行为恢复：在灵长类中的可行性研究).Neurological Research，2003，25：801-810

Roitberg，B.Transplantation for stroke(中风的移植).Neurol Res.2004；26：256-64.

Roitberg.B.，Khan，N..，Tuccar，E.，Kompoliti，K.，Chu，Y，Alperin，N.，Kordower，JH，and ME Emborg.Chronic ischemic stroke model in cynomologousmonkeys：Behaviral，neuroimaging and anatomical study(慢性缺血中风的食蟹猴模型：行为、神经成像和解剖学研究).Neurological Research，2003，25：68-78.

Roof RL，Schielke GP，Ren X，Hall ED.A comparison of long-termfunctional outcome after 2 middle cerebral artery occlusion models in rats(大鼠模型二次中脑动脉栓塞后的功能恢复长期比较).Stroke.2001；32：2648-57.

Sanchez-Ramos，JR.Neural cells derived from adult bone marrow andumbilical cord blood(成年骨髓和脐带血衍生的神经细胞).J Neurosci Res.2002；69：880-893.

Sorensen JC，Grabowski M，Zimmer J，Johansson BB.Fetal neocortical tissueblocks implanted in brain infarcts of adult rats interconnect with the host brain(植入成年脑梗塞大鼠中的胚胎神经皮质组织阻碍了与宿主脑的相互连接).ExpNeurol.1996；138：227-35.

Stroke Therapy Academic Industry Roundtable(中风治疗学术产业园桌会)(STAIR).Recommendations for Standards Regarding PreclinicalNeuroprotective and Restorative Drug Development(关于神经保护和恢复药物开发临床前研究标准的推荐).Stroke.1999；30：2752-2758.

Sullivan PG，Rabchevsky AG，Hicks RR，Gibson TR，Fletcher-Turner A，Scheff SW.Dose-response curve and optimal dosing regimen of cyclosporin Aafter traumatic brain injury in rats(大鼠外伤性脑损伤后环孢菌素A治疗的剂量反应曲线和最佳剂量方案).Neuroscience.2000；101：289-9

Swanson RA，Morton MT，Tsao-Wu G，Savalos RA，Davidson C，Sharo FR.Asemiautomated method for measuring brain infarct volume(测量脑梗塞体积的半自动化方法).J Cereb Blood Flow Metab.1990；10：290-293

Szentirmai O，Carter BS.Neurosurgery.Genetic and cellular therapies forcerebral infarction(神经外科，脑梗塞的遗传和细胞治疗).2004；55：283-6.

Takamatsu.H，Hideo Tsukada，Akihiro Noda，Takeharu Kakiuchi，ShingoNishiyama，Shintaro Nishimura.and Kazuo Umemura.FK506 Attenuates EarlyIschemic Neuronal Death in a Monkey Model of Stroke(FK506缓解了中风猴子模型的早期缺血性神经元细胞死亡).J Nucl Med 2001；42：1833-1840

Toda H，Takahashi J，Iwakami N，Kimura T，Hoki S，Mozumi-Kitamura K，Ono S，Hashimoto N.Grafting neural stem cells improved the impaired spatialrecognition in ischemic rats(移植的神经干细胞忤逆缺血大鼠的受损空间识别能力).Neurosci Lett.2001Dec 4；316(1)：9-12

Umezawa A1 Maruyama T，Segawa K，Shadduck R K，Waheed A，Hata J.Multipotent marrow stromal cell line is able to induce hematopoiesis in vivo(骨髓多能基质细胞系能体内诱导血生成).J Cell Physiol.1992；151：197-205.

Vachon P，Beaudry F，Marier JF，Ste-Marie L，Montgomery J.Cyclosporin Ain blood and brain tissue following intra-carotid injections in normal andstroke-induced rats(正常和诱导中风大鼠颈动脉内注射后血液和脑组织中的环孢菌素A).Brain Res.2002；943：1-8.

Woodbury，D.，Schwarz，EJ.，Prockop，DJ.and Black，I.B.2000.Adult ratand human bone marrow stromal cells differentiate into neurons(成年大鼠和人骨髓基质细胞分化产生神经元).J.Neurosci.Res.61：364-370.

Zhang K and Terrence J.Sejnowski.A universal scaling law between graymatter and white matter of cerebral cortex(脑皮层灰质与白质之间的通用衡量规律).PNAS，2000，10：5621-5626.

Zhang RL，Zhang ZG，Zhang L，Chopp M.Proliferation and differentiation ofprogenitor cells in the cortex and the subventricular zone in the adult rat after focalcerebral ischemia(祖细胞在局部脑缺血成年大鼠皮质和室下区中的增殖和分化).Neuroscience.2001；105(1)：33-41.

Zhao LR，Duan WM，Reyes M，Keene CD，Verfaillie CM，Low WC.Humanbone marrow stem cells exhibit neural phenotypes and ameliorate neurologicaldeficits after grafting into the ischemic brain of rats(人骨髓干细胞显示神经元表型移植到大鼠缺血脑中能缓解神经缺陷).Exp Neurol.2002；174：11-20.

Claims (33)

1.一种方法，其包括：

提供神经元前体细胞；和

给予中枢神经系统损伤患者足够量的该神经元前体细胞以促进患者功能恢复。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述神经元前体细胞的局部给予的。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述神经元前体细胞给予患者的中枢神经系统损伤处。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述神经元前体细胞是实质内给予的。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述神经元前体细胞包括人神经元前体细胞。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提供神经元前体细胞包括：

提供骨髓粘附性干细胞；

使骨髓粘附性干细胞转分化产生所述神经元前体细胞。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中枢神经系统损伤是缺血性中风或出血性中风造成的。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括让所述神经元前体细胞从给予部位迁移到患者其它部位。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述患者其它部位包括中枢神经系统损伤处。

10.如权利要求1所述的方法，还包括给予患者免疫抑制剂。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述功能恢复是部分功能恢复。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述神经元前体细胞相对于患者是同种异体细胞。

13.一种移植物形成单元，其包含：

神经元前体细胞和药学上可接受的载体，所述神经元前体细胞存在的量足以在给予患者所述神经元前体细胞后促进患者中枢神经系统损伤的功能恢复。

14.如权利要求13所述的移植物形成单元，其特征在于，所述药学上可接受的载体包括溶剂、分散介质、抗菌剂或抗真菌剂。

15.如权利要求13所述的移植物形成单元，其特征在于，所述移植物包含神经元前体细胞，神经元前体细胞的数量约为1万个至约1亿个。

16.如权利要求13所述的移植物形成单元，其特征在于，所述神经元前体细胞含有标记。

17.如权利要求13所述的移植物形成单元，其特征在于，所述神经元前体细胞包括人神经元前体细胞。

18.一种方法，其包括：

提供骨髓粘附性干细胞衍生的神经元细胞；和

给予中枢神经系统损伤患者足够量的该骨髓粘附性干细胞衍生的神经元细胞以促进患者的功能恢复。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述骨髓粘附性干细胞衍生的神经元细胞是局部给予的。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述骨髓粘附性干细胞衍生的神经元细胞给予患者的中枢神经系统损伤处。

21.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述骨髓粘附性干细胞衍生的神经元细胞是实质内给予的。

22.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述骨髓粘附性干细胞衍生的神经元细胞包括人骨髓粘附性干细胞衍生的神经元细胞。

23.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述提供骨髓粘附性干细胞衍生的神经元细胞包括：

提供骨髓粘附性干细胞；和

诱导该骨髓粘附性干细胞形成骨髓粘附性干细胞衍生的神经元细胞。

24.如权利要求23所述的方法，还包括：

使骨髓粘附性干细胞转分化产生所述神经元前体细胞；和

诱导所述神经元前体细胞形成神经元细胞。

25.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述中枢神经系统损伤是缺血性中风或出血性中风造成的。

26.如权利要求18所述的方法，还包括给予患者免疫抑制剂。

27.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述功能恢复是部分功能恢复。

28.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述骨髓粘附性干细胞衍生的神经元细胞相对于患者是同种异体细胞。

29.一种移植物形成单元，其包含：

骨髓粘附性干细胞衍生的神经元细胞和药学上可接受的载体，所述骨髓粘附性干细胞衍生的神经元细胞存在量足以在给予患者所述骨髓粘附性干细胞衍生的神经元细胞后促进中枢神经系统损伤患者的功能恢复。

30.如权利要求29所述的移植物形成单元，其特征在于，所述药学上可接受的载体包括溶剂、分散介质、抗菌剂或抗真菌剂。

31.如权利要求29所述的移植物形成单元，其特征在于，所述移植物包含神经元前体细胞，神经元前体细胞的数量约为1万个至约1亿个。

32.如权利要求29所述的移植物形成单元，其特征在于，所述骨髓粘附性干细胞衍生的神经元细胞含有标记。

33.如权利要求29所述的移植物形成单元，其特征在于，所述骨髓粘附性干细胞衍生的神经元细胞包括人骨髓粘附性干细胞衍生的神经元细胞。

Images