KR20070116069A

KR20070116069A - 중추신경계 병변 치료용 뉴런성 전구체 세포의 용도

Info

Publication number: KR20070116069A
Application number: KR1020077022690A
Authority: KR
Inventors: 마리 데자와; 키이타 모리
Original assignee: 산바이오 인코포레이티드
Priority date: 2005-03-07
Filing date: 2006-03-06
Publication date: 2007-12-06
Also published as: WO2006096640A3; ES2436401T3; US20100034790A1; JP5184340B2; CN101605552A; IL185703A0; CA2599971A1; CA2599971C; AU2006220696B2; IL185703A; DK1855700T3; JP2008538103A; US8092792B2; KR101342447B1; PT1855700E; AU2006220696A1; EP1855700B1; EP1855700A2; WO2006096640A2; US20060216276A1

Abstract

본원에는 중추신경계 병변 치료 방법 및 치료용 물질이 기재된다. 바람직한 방법 및 물질은 뉴런성 전구체 세포 및/또는 골수 접착 스템 셀 유래 뉴런성 세포를 포함한다.

중추신경계 병변, 뇌졸중, 뉴런성 전구체 세포, 스템 셀

Description

중추신경계 병변 치료용 뉴런성 전구체 세포의 용도{USE OF NEURONAL PRECURSOR CELLS FOR TREATMENT OF CENTRAL NERVOUS SYSTEM LESIONS}

본 발명은 중추신경계 병변의 치료에 관한 것이고, 구체적으로는 뇌졸중의 치료에 관한 것이다.

중추신경계(central nervous system, CNS) 조직에는 여러 가지 이유로 병변이 생길 수 있다. 이러한 CNS 병변의 주된 원인 중 하나가 뇌졸중이다. 뇌졸중은 뇌의 일정 부위의 순환이 갑자기 멈추어, 그 부위에 상응하는 신경의 기능이 손실되는 결과를 초래하는 것이 특징이다. 뇌혈관 사고 또는 뇌졸중 증후군으로 불리기도 하는 뇌졸중은, 혈전성, 색전성, 출혈성 뇌졸중을 포함하는 이질적인 병원을 모두 포함하는 포괄적인 용어이다. 최근의 연구에서는 모든 유형의 뇌졸중을 통틀어 연간 500,000건을 초과하는 신규 뇌졸중 발생율을 보고한 바 있다. 뇌졸중은 사망 및 장애를 초래한다. 모든 유형의 뇌졸중을 조합했을 때, 뇌졸중은 사망에 이르는 원인으로서 세 번째에 이르고, 장애에 이르는 원인으로서 첫 번째에 이른다. 최근의 경향을 살피면 이러한 숫자는 2050년까지 해마다 백만씩 증가할 것으로 예상된다. 뇌졸중에 드는 직접적 비용(간호 및 치료) 및 간접적 비용(생산력 손실)은 모두 합쳐서 미국 사회에서 연간 433억 달러에 이르는 것으로 추산된다. 일반적으로 뇌졸중은 출혈성 뇌졸중 또는 허혈성 뇌졸중으로 분류된다. 급성 허혈성 뇌졸중은 혈전증 및 색전증에 의해 유발되는 것을 가리키고, 모든 뇌졸중 유형의 80%를 차지한다.

4가지 주요 신경해부학적 허혈성 뇌졸중 증후군은 해당되는 각각의 뇌혈관 흐름이 방해되는 것으로 인해 발생한다.

전뇌동맥 폐색은 전두엽의 기능에 주로 영향을 미치는데, 정신 상태 변화, 판단 장애, 반대쪽 하부사지 약화 및 감각저하, 그리고 보행상실 등을 유발한다.

중뇌동맥(middle cerebral artery, MCA) 폐색은 주로 반부전마비, 반신의 감각저하, 동측반맹(즉, 시야의 절반이 안보이는 현상), 및 병변쪽을 향한 응시 경향을 유발한다. 인식불능이 일반적이고, 병변이 반구 꼭대기에서 발생한 경우라면 수용성(receptive) 또는 표현성(expressive) 언어상실증도 발생할 수 있다. MCA는 상부 사지의 운동신경대를 담당하기 때문에 팔과 얼굴의 근육약화는 하지보다 보통은 더 상태가 나쁘다.

후뇌동맥 폐색은 시각과 사고에 영향을 미치는데, 즉 동측반맹, 피질성 시각상실, 시각인식불능, 정신상태 변화, 및 기억 장애를 발생시킨다.

기저동맥 폐색은 검출해내기가 힘든 것으로 악명이 높은데, 그것은 두개골 신경, 대뇌, 뇌간에 이르는 폭넓은 손상을 유발하기 때문이다. 이러한 병변에는 현기증, 안구진탕증, 복시증, 시각장애, 연하곤란, 구음장애, 안면감각퇴증, 졸도 및 수족운동상실증 등이 포함된다. 통증 및 온도 감각의 손실도 같은쪽 얼굴 또는 반대쪽 신체에서 일어난다. 반대로, 전뇌동맥 뇌졸중에서는 한쪽 신체에서만 발견되 는 통증 및 온도감각 손실 등이 발생한다.

이러한 폐색은 여러가지 이유 때문에 발생할 수 있다. 색전증은 심장, 외부 두개골 동맥, 또는 드물게는 오른쪽 순환계(기이색전증)에서 일어날 수 있다. 심장에서 발생한 색전증의 원인에는 판막 트롬비(thrombi)(예컨대, 승모판 협착, 심장내막염, 인공판막에서의 트롬비); 근육 트롬비(예컨대 심근경색(myocardial infarction[MI]), 심방세동, 팽창심근증에서의 트롬비); 및 동맥 점액종이 포함된다. MI는 색전성 뇌졸중 중 2-3% 발생율과 관련되어 있는데, 이의 85%는 MI가 일어난 후 1개월 내에 발병한다.

열공성(lacunar) 경색증은 전체 뇌경색 중 13-20%를 차지하고, 대뇌피질하부 및 뇌간에 있어서의 소형 말단 맥관구조를 포함한다. 열공성 경색증은 소혈관증, 예컨대 당뇨병 및 고혈압을 앓고 있는 환자에서 흔히 발생한다. 소형 색전증 또는 라이포하이알리노시스(lipohyalinosis)라고 불리는 인 시츄(in situ) 과정이 열공성 경색증의 원인인 것으로 생각된다. 가장 흔한 열공성 증후군에는 순수 운동, 순수 감각 및 수족운동실조성인, 혈관마비형 뇌졸중이 포함된다. 크기가 작고 그 위치가 대뇌피질하부로서 잘 알려져 있는 덕분에, 열공성 경색증은 인지, 기억, 말하기 또는 의식 정도에 대한 장애로는 이어지지 못한다.

혈전성 폐색이 일어나는 가장 흔한 부위는 뇌동맥이 갈라지는 부분, 특히 내경동맥이 갈라지는 부위이다. 동맥 협착(즉, 솟구치는 혈류), 아테롬성 동맥경화증(즉, 궤양성 플라그 형성), 및 판형 접착은 동맥을 색전 또는 폐색시키는 혈전을 형성한다. 혈전증의 원인으로서 흔한 것은 아니지만 적혈구증가증, 낫세포 빈혈증, 단백질 C 결핍증, 뇌동맥 섬유근 형성장애 및 오랜 편두통으로 인한 혈관수축이 포함되기도 한다. 뇌동맥의 절단을 유발하는 임의의 과정도 혈전성 뇌졸중을 일으킬 수 있다(예컨대, 외상, 흉부 대동맥 절단, 동맥염). 가끔, 협착 또는 폐색된 동맥 말단에 대한 저관류(hypoperfusion) 또는 두개의 뇌동맥 영역 사이에 위치한 취약한 뇌분수계 영역의 저관류가 허혈성 뇌졸중을 일으킬 수 있다.

다시 출혈성 뇌졸중으로 돌아와서, 뇌내출혈(intracerebral hemorrhage, ICH) 및 출혈성 뇌졸중이라는 용어는 본원에서 호환하여 사용되고, 허혈성 뇌졸중이 출혈성 뇌졸중으로 전환되는 것과는 다른 것으로 간주된다. ICH는 전체 뇌졸중의 대략 20%를 차지하고 뇌경색보다 더 높은 치사율을 보인다. 출혈성 뇌졸중을 앓는 환자는 유사한 국소적 신경손상을 보이지만, 허혈성 뇌졸중을 앓는 환자보다 더 아픈 경향이 있다. 뇌내출혈이 있는 환자는 두통, 정신상태 변화, 발작, 오심 및 구토, 및/또는 뚜렷한 고혈압을 더욱 가지기 쉬우나, 이러한 것들이 출혈성 뇌졸중과 허혈성 뇌졸중을 확실히 구분하게 해 주는 것은 아니다.

ICH에서 출혈은 뇌 실질(parenchyma)에 직접적으로 발생한다. 보통의 기작은 만성 고혈압에 의해 손상된 작은 뇌내동맥에서 출혈이 발생하게 되는 것으로 사료된다. 다른 기작에는 출혈 체질, 원인불명의 항응고증, 뇌아밀로이드증 및 코케인 남용이 포함된다. ICH는 시상, 핵, 소뇌 및 뇌간을 포함하는 뇌의 특정 부위에서 발견되는 경향이 있다. 출혈에 의해 상처가 난 뇌의 부위 외에도, 그 부위를 둘러싼 뇌도 혈종 부피의 영향을 받아 생긴 압력에 의해 손상될 수 있다. 일반적으로 두개내압의 상승이 일어날 수 있다. 출혈성 뇌졸중에 대한 30일 치사율은 40-80%이 다. 사망에 이르는 자 중 대략 50%는 48시간 내에 발생한다.

외상 및 CNS의 각종 질병을 포함하는, CNS 병변에 대한 다른 원인도 당업자에게 공지되어 있다.

CNS 병변 치료는 신경조직형성(neurogenesis)과 밀접한 관련이 있는데, 즉 중추신경계 병변내 손상된 뉴런을 교체해주는 것을 포함하나 이에 국한되지는 않는, 환자의 해당 조직의 일정 영역내 뉴런의 (재)발생과 관련이 있다. 불행히도 뉴런성(CNS) 조직은 수선/재생 능력이 없는 것으로 알려져 있다. 성인에서 새로운 뉴런성 세포 발생은 크게 두가지 부위, 즉 심실측면을 받치고 있는 SVZ, 및 톱니모양 이랑(dentate gyrus)의 서브그래뉼라 존(subgranular zone)으로 제한된다. SVZ로부터 이동한 내생성 전구체 스템 셀에서 유래한 뉴런성 세포 교체만이 제한적으로 발전되어 왔다.

일부 신경조직형성 방법으로 초기치료에 성공한 사례가 보고된 바 있지만, 임상적 성공을 거둔 것은 아니다. 따라서 중추신경계 병변을 치료하기 위해 당업계에 공지된 문제점을 극복하는 방법 및 조성물이 요구되고 있는 실정이다.

발명의 개요

일 측면에서, 본 발명은 뉴런성 전구체 세포를 제공하는 단계; 및 환자의 기능 회복을 촉진하기에 충분한 양으로 중추신경계 병변을 앓고 있는 환자에게 뉴런성 전구체 세포를 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 뉴런성 전구체 세포를 환자에게 투여한 후에 중추신경계 병변을 앓고 있는 환자의 기능 회복을 촉진하기에 충분한 양으로 존재하 는 뉴런성 전구체 세포; 및 약학적 수용가능한 담체를 포함하는 이식편 형성 유닛에 관한 것이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 골수 접착 스템 셀 유래 뉴런성 세포를 제공하는 단계; 및 환자의 기능 회복을 촉진하기에 충분한 양으로 중추신경계 병변을 앓고 있는 환자에게 골수 접착 스템 셀 유래 뉴런성 세포를 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 골수 접착 스템 셀 유래 뉴런성 세포를 환자에게 투여한 후에 중추신경계 병변을 앓고 있는 환자의 기능 회복을 촉진하기에 충분한 양으로 존재하는 골수 접착 스템 셀 유래 뉴런성 세포; 및 약학적 수용가능한 담체를 포함하는 이식편 형성 유닛에 관한 것이다.

도 1은 MCAo 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 MCAo 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 MCAo 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 MCAo 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 MCAo 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 MCAo 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 7은 MCAo 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 8은 MCAo 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 9는 MCAo 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 10은 MCAo 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 11은 MCMl 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 12는 MCMl 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 13은 MCMl 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 14는 MCMl 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 15는 MCMl 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 16은 MCMl 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 17은 MCMl 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 18은 MCMl 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 19는 MCMl 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 20은 MCMl 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 21은 TGI 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 22는 TGI 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 23은 TGI 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 24는 TGI 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 25는 TGI 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 26은 TGI 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 27은 TGI 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 28은 TGI 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 29는 실시예의 조직검사 결과를 나타낸 것이다.

도 30은 실시예의 조직검사 결과를 나타낸 것이다.

도 31은 기능 회복 및 이식편 생존을 묘사한 것이다.

도 32는 MCAo 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 33은 MCAo 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 34는 MCAl 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 35는 MCAl 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 36은 TGI 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 37은 TGI 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 38은 이식편 생존을 묘사한 것이다.

도 39는 이식편 생존을 묘사한 것이다.

도 40은 평균대 시험의 결과를 나타낸 것이다. 이식후 28일째에, MNC군의 평균 점수는 MASC 및 대조군에 비해 유의한 정도의 개선을 보인다. ^*:p<0.05, ^**:p<0.01

도 41은 사지 위치 시험(limb placing test)의 결과를 나타낸 것이다. 21일째 및 28일째에 대조군에 비해 NMC 및 MASC군에 대한 평균 점수는 유의하게 상이하였다. MNC 및 MASC군 사이의 유의한 차이는 없었다. ^*:p<0.05, ^**:p<0.01

도 42는 모리스 워터 메이즈 시험(Morris water maze test)의 결과를 나타낸 것이다. 최종 세트에 대해서는, MNC군에 대한 평균 지연 시간은 MASC 및 대조군에 대한 것에 비해 유의한 정도로 상이하였다.

도 43은 워터 메이즈 "공간 탐침 시도"의 결과를 나타낸 것이다. 3가지 군 중에서, MNC군에서 최상의 결과가 수득되었으며, MNC군과 다른 군 간에 통계학적 차이가 있었다. ^*:p<0.05, ^**:p<0.01

도 44는 실시예 9에서 수행한 베더슨(Bederson) 시험 결과를 나타낸다.

도 45는 실시예 9에서 수행한 EBST 결과를 나타낸다.

도 46은 실시예 9에 따른 이식편 생존을 묘사한다.

도 47은 실시예 9에 따른 이식편 생존을 나타낸다.

도 48은 실시예 9에 따른 니슬(Nissl) 염색 결과를 나타낸다.

A. 서론

본 발명자는 본원에 기재된 발명을 실시함으로써 상기 언급한 문제점 및 한계점을 극복할 수 있음을 뜻밖에 발견하였다. 특히, 본 발명자는 NPC 및/또는 MNC를 제공하는 것과, 상기의 NPC 및/또는 MNC를 환자의 기능 회복을 촉진하기에 충분한 양으로 중추신경계 병변을 앓고 있는 환자에게 투여하는 것이 가능함을 뜻밖에 발견하였다.

본원에 기재된 것은 선행 기술에 비해 몇가지 장점을 가진다. 첫째로, 환자를 기준으로 의사가 중추신경계 병변을 고치기 위한 외과적 절차를 환자에 따라 맞춤적용할 수 있도록 하는 투여량-반응 상관관계를 제공한다. 둘째로, 이식편과 동종계인(allogeneic) 생물종에 대한 접근을 가능하게 한다. 이것은 세포 뱃치 및 이식 절차의 면에서, NPC 및/또는 MNC 및/또는 이식편 형성 유닛을 특징분석하고, GFU에서 GFU로(또는 NPC 에서 NPC로, 또는 MNC에서 MNC로) 일관성을 유지하는 데 있어 유용하다. 더욱이, NPC를 사용하면 다른 다분화능 세포를 사용한 경우에 비해 중추신경계를 더욱 정확히 재조합할 수 있게 한다. 이것은 다른 유형의 다분화능 세포에 비해 뉴런성 전구체 세포의 상당 대부분이 분화시 다른 세포 유형으로 분화되는 것이 아니라 뉴런성 세포의 세포 운명을 선택하기 때문이다. 이는 과다 이식편 발현을 조절하고, 바람직하지 않은(또는 미분화된) 이식 세포 성장의 가능성을 제한하고자 하는 경우에 더욱 중요할 수 있다. 또한, MNC의 사용은, 이 세포가 개선된 기능 회복을 제공할 수 있는 더욱 분화된 다분화능 세포이기 때문에 바람직하다.

지금부터 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

정의

본원에 기재된 모든 문서는 참조의 목적으로서만 이용되는 것이며 본원에서 참조문헌으로 상세하고 개별적으로 지적된 것도 참조의 목적으로서만 이용되는 것이다.

"투여(Administering)"라는 용어는 NPC 및/또는 본 발명의 이식편을 환자에게 제공하는 것을 의미한다.

"부위(Area)"라는 용어는 어떠한 영역이나 정해진 부피를 의미한다. 예를 들면, 중추신경계의 일 부위는 중추신경계내 어떠한 영역이나 정해진 부피를 의미할 것이다.

"중추신경계 허혈성 이벤트 또는 CNS 허혈성 이벤트(Central nervous system ischemic event, 또는 CNS ischemic event)"라는 용어는 환자의 중추신경계 중 일 부위의 혈류 결핍 또는 생리학적으로 중요한 정도의 혈류 감소를 초래하는 임의의 현상을 의미한다. 바람직한 양태에서, CNS 허혈성 이벤트는 허혈성 뇌졸중을 포함한다.

"중추신경계 병변 또는 CNS 병변(Central nervous system lesion 또는 CNS lesion)"이라는 용어는 CNS 허혈성 이벤트 또는 출혈에 의해(예를 들면, 바람직한 양태에서는, 출혈성 뇌졸중에 의해) 손상받거나, 기능이 손실되었거나, 병든 중추신경계 뉴런성 조직, 또는 이렇게 CNS 허혈성 이벤트 또는 출혈에 의해 손상받거나, 기능이 손실되었거나 병든 중추신경계 뉴런성 조직을 둘러싼 경계를 의미한다.

"중추신경계 조직"이라는 용어는 중추신경계와 통상적으로 관련이 있는 조직을 의미한다. 뇌조직 및 척수조직은 중추신경계 조직의 예이며, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 일부 양태에서는, 본 발명은 허혈성 이벤트에 의해 손상받은 중추신경계 조직에 관한 것이다. 이러한 손상은 통상적으로 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이, 산소 결핍, 및 기타 이와 관련된 캐스케이드 및 이러한 산소 결핍 및 관련 캐스케이드에 의한 부산물에 의해 일어날 수 있다.

"기능 회복"이라는 용어는 해당 기능의 신경생물학적 척도의 측정(즉, CBF, EEG, 피질 확장 등), 또는 행동학적 기능의 측정(예를 들면, 쥐나 당업계에 공지되어 있거나 본원에 기술된 다른 모델을 사육하고 큰소리로 깜짝 놀래게 함)에 의해 결정되는, CNS 병변과 관련한 CNS 기능의 회복을 의미한다. 회복은 보통의 집단 또는 대조군 집단에서 관찰된 값을 가깝게 하는 측정된 변수에 대한 경향에 의해 결정된다. 기능 회복은 적당한 통계학적 방법에 의해 측정되었을 때, 완전할 수 있는데, 즉 보통 또는 대조군 집단에서 관찰된 값이 측정된 척도 값으로 회복될 수 있다. 또한 기능 회복은 불완전하거나 부분적일 수도 있다. 예를 들면, 환자는 측정된 척도의 완전한 기능 회복, 또는 75%, 또는 50%의 기능회복을 경험할 수 있다.

"중추신경계의 기능 회복된 부위"라는 용어는 병변과 관련된 CNS 조직으로서, 추후에 본 발명의 실시를 통해 기능이 회복되는 CNS 조직을 의미한다.

"이식편 형성 유닛(Graft Forming Unit 또는 GFU)"이라는 용어는 (1) 약학적 수용가능한 담체와 함께 NPC 및/또는 MNC를 포함하고, (2) 환자에게 투여되는 용도의 조성물을 의미한다. 바람직한 양태에서, NPC 및 MNC 혼합물은 함께 존재하지 않는 것으로 표현된다. 다른 바람직한 양태에서, NPC는 MNC가 실질적으로 존재하지 않는 가운데 존재한다. 다른 바람직한 양태에서, MNC는 NPC가 실질적으로 존재하지 않는 가운데 존재한다.

"골수 접착 스템 셀(Marrow adherent stem cells)"은 다양한 세포형, 즉, 골모세포(osteocyte), 연골세포(chondrocyte), 지방세포(adipocyte), 및 힘줄에서와 같은 각종 연결조직으로 분화될 수 있는 능력을 보유한, 다분화능을 가진 유형의 체세포분열기 세포를 의미한다.

"MASC 유래 뉴런성 세포(MASC-derived Neuronal Cells, MNC)"라는 용어는 (1) 골수 접착 스템 셀에서 유래한 것이고, (2) 면역조직화학적으로 뉴런 마커를 발현하며 전기영동 분석에서 뉴런의 특성을 보이는 체세포분열후 뉴런을 의미한다. 인 비트로에서 MNC를 발생시키는 적당한 방법은 PCT/JP03/01260에서 찾아볼 수 있다. 본원에 기재된 MNC의 정의를 만족시키는 한, 당업계에 공지되어 있는 다른 방법을 사용하여 생성된 MNC도 본 발명의 실시에 사용할 수 있다. 일 양태에서, 인간 MNC는 MAP-2+, 뉴로필라민트(Neurofilament)-M+, 및 베타 튜뷸린(β-tubulin) III+(즉, TuJ-1+)이다. 이들 마커는 PCT/JP03/01260에 기재된 기술을 사용하여 MNC를 제조한 다음 FACS를 사용하여 MNC를 분리하는 데 사용할 수 있다. 적당한 MNC 취급 방법은 통상적으로 당업계에 알려져 있는데, 이러한 방법에는 예를 들면 Carpenter 등의 미국 특허 제6,833,269호에 기재된 방법이 포함된다.

"MCAo"라는 용어는 중뇌동맥 폐색을 의미한다.

"MCAl"라는 용어는 중뇌동맥 연결을 의미한다.

"신경조직형성(neurogenesis)"이라는 용어는 환자의 해당 조직의 해당 영역내 뉴런 및 뉴런성 조직의 (재)발생을 의미하고, 중추신경계 병변내 손상된 뉴런의 교체를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.

"뉴런성 전구체 세포(Neuronal Precursor Cells, NPC)"라는 용어는 네스틴(nestin) 및 뉴런성 전구체/신경 전구 세포에 특이적인 다른 세포 마커를 발현하며 MASC에서 유래한 체세포분열기의 세포를 의미한다. NPC는 뉴런, 글리아, 및 올리고덴드로사이트, 및 전술한 것의 전구체로 분화될 수 있다. 일 양태에서, NPC는 PCT/JP03/01260에 기술된 방법에 따라 골수 접착 스템 셀(MASC)로부터 제조할 수 있다. 본원에 기재된 NPC의 정의를 만족시키는 한, 당업계에 공지된 다른 기술을 사용하여 제조된 NPC도 본 발명의 실시에 사용할 수 있다. 바람직하게는 NPC는 인간 NPC를 포함하지만, 다른 포유류 종의 NPC도 본 발명의 범위내에 포함된다. 일 양태에서, NPC, 바람직하게는 인간 NPC는 CD29+, CD90+, CD105+, CD31-, CD34- 및 CD45-이다. 이들 마커는 PCT/JP03/01260에 기재된 기술을 사용하여 NPC를 제조한 다음에 FACS를 사용하여 NPC, 바람직하게는 인간 NPC를 분리하는 데 사용할 수 있다. 적당한 NPC 취급 방법은 통상적으로 알려져 있는데, 이러한 방법에는 예를 들면 Goldman 등의 미국 특허 제20020012903호에 기재된 방법이 포함된다.

"뉴런(neuron)"이라는 용어는 뇌, 척주, 및 신경을 구성하는 임펄스 전도성 세포를 의미하고, 1개 이상의 수상돌기(dendrite)와 1개의 축색돌기(axon)로 구성된 핵이 있는 세포체로 구성된다. 생화학적으로는 뉴런은 Map, 뉴로필라멘트-M, 및 베타-튜뷸린 III (즉 TuJ-1)에 대한 항체와 반응하는 것이 특징이다. 또한 신경 세포의 특징은 신경전달물질 합성효소나 신경전달물질과 관련된 단백질이 존재하고, 신경전달물질, 예를 들면 뉴로펩타이드 Y 및 기질 P가 분비되는 것이다.

"뉴런성(Neuronal)"라는 용어는 뉴런, 글리아, 및 올리고덴드로사이트, 및 전술한 것의 전구체를 의미한다.

"환자"라는 용어는 질병이나 질환을 앓고 있어 치료가 요구되는 동물, 전형적으로는 포유류, 더욱 전형적으로는 인간을 의미한다.

"약학적 수용가능한 담체"라는 용어는 NPC 또는 MNC의 약학적 투여와 함께 사용가능한 임의의 모든 용매, 분산매, 코팅제, 항박테리아제, 항균제, 냉동보존용 등장액 및 흡수지연제 등을 의미한다. 이러한 매질 및 제제의 용도는 당업계에 공지되어 있다. NPC 또는 MNC와 함께 사용이 불가능한 통상의 매질 또는 제제는 제외하며, 본 발명의 GFU와 함께 사용할 수 없는 것도 제외된다.

"전신"이라는 용어는 환자 전체, 또는 환자의 실질적 전체 부분을 의미한다.

"조직"이라는 용어는 유사한 구조 및 기능을 가진 세포의 집합체로 구성된 유기체의 일부를 의미한다. 본 발명에 따른 바람직한 조직은 신경 조직이다.

"TGI"는 일과성 완전 허혈증(transient global ischemia)을 의미한다.

"이식(Transplantaion)"이라는 용어는 "이식(engraftment)"이라는 용어와 동의어로서, 환자의 일 부위를 비내생성인 세포로 교체하는 것을 의미한다. 이식은 동종계 세포, 즉 자신의 세포가 아닌 세포로 이루어질 수 있다. 이식은 또한 자기 조직 세포, 즉, 자신의 세포로 이루어질 수 있는데, 예를 들면 환자 신체의 다른 조직으로 이루어질 수 있다.

"변환분화(transdifferentiated)"라는 용어는 본래 관련된 세포 유형과 다른 계통으로 세포가 발생되는 것을 의미하는 것이다.

A. NPC 및 이의 약학적 조성물

일 양태에서, NPC는 환자에게 이식되는 GFU의 일부로서 본 발명의 실시에 사용된다. 목적은 NPC가 성장하여 환자의 중추신경계 병변내 기능 회복에 있어 중요한 역할을 하는 뉴런성 세포로 분화하도록 하는 것이다. 예를 들면 NPC는 손상받은 내생성 뉴런을 교체하는 새로운 뉴런으로 분화될 수 있다. 아니면, NPC는 글리아 세포나 성장 인자를 분비하는 뉴런으로 분화될 수도 있다. 이러한 성장 인자는 손상받은 뉴런에 대해 영양 활성을 가지고, 뉴런의 기능 회복을 돕는다. 이러한 방식으로 중추신경계 병변의 치료가 가능해지는 것이다.

바람직한 NPC 및 이러한 NPC를 제조하는 바람직한 방법은 데자와(Dezawa) 등의 PCT/JP03/01260에 기재되어 있다(발명의 명칭: Method of Differentiating/Inducing Bone Marrow Interstitial Cells Into Nerve Cells and Skeleton Muscle Cells by Transferring Notch Gene). 특히 상기 발명의 실시예 7에 기술된 "신경 전구체 세포"는 본 발명의 NPC로서 사용될 수 있다. 데자와는 MASC가 본 발명의 NPC로서 사용가능한 신경 전구체 세포로 변환분화될 수 있다고 기술하고 있다.

일 양태에서, GFU는 본 발명의 실시에 유용할 수 있다. 본 발명의 GFU에 사용하기에 유용한 약학적 수용가능한 담체에는 멸균처리된 등장완충액, FRS, 아이솔라이트(isolyte), 멸균처리된 희석제, 예컨대 물, 보통의 식염수, 고정오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제 또는 항균제, 예컨대 아스코브산, 티메로살, 트라이메토프림-설파메톡사졸, 날이디스산, 메텐아민 히푸레이트 또는 니트로퓨란토인 마크로크리스탈 등; 항산화제, 예컨대 아스코브산 또는 소듐 바이설파이트; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA; 완충액, 예컨대 아세테이트, 시트레이트, 또는 포스페이트; 그리고 건강을 위한 제제, 예컨대 소듐 클로라이드 또는 포도당이 포함될 수 있다. pH는 하이드로클로로 산이나 소듐 하이드록사이드와 같은 산이나 염기를 사용하여 조정할 수 있다.

일 양태에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 이식편 형성 유닛은 NPC를 포함하는 멸균처리한 조성물을 포함한다. 정맥내 투여를 위해서, 적당한 약학적 수용가능한 담체에는 생리식염수, 노르마졸, 아이솔라이트, 플라즈마-라이트, 또는 포스페이트 버퍼드 셀라인(PBS)이 포함될 수 있다. 모든 경우에 GFU는 멸균처리되어야 하며(NPC나 MNC외에 존재하는 것에 대해), 주사하기 쉽도록 하는 정도로 적당히 유동성을 띠어야 한다(예를 들면, 레시틴과 같은 물질을 사용함으로써, 분산액의 경우에는 특정 입자 크기를 유지함으로써, 그리고 표면활성제를 첨가함으로써, 적당한 유동성이 유지될 수 있다). GFU는 제조 및 보관 조건 하에 안정해야 하며, 상기 언급한 바와 같이 박테리아 및 균류와 같은 미생물의 오염 현상으로부터 보존될 수 있어야 한다. 특정한 경우 예를 들면, 당, 마니톨이나 소비톨과 같은 다가알콜, 소듐 클로라이드, LiCl, 소듐 부티레이트, 및 소듐 오르토바나데이트와 같은 것을 GFU에 첨가시키는 것이 바람직할 것이다. 일반적으로 본 발명의 GFU는 염기성 분산매를 함유하고, 임의로는 상기 언급한 다양한 성분을 함유하는 멸균처리된 베히클에 NPC를 혼입시킴으로써 제조될 수 있다.

투여 편의 및 투여량의 일정함을 유지하기 위한 목적으로는 이식편 형성 유닛 투여량 형태로 본 발명의 GFU를 제형하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 이식편 형성 유닛 투여량 형태란 치료되어야 할 개체에 대해 일정한 투여량으로 맞추어진 물리적으로 분리되어 있는 유닛을 가리킨다. 일 양태에서, 각 GFU 투여량 형태는 요구되는 약학적 담체와 관련하여 바람직한 치료 효과를 생성시키도록 계산된, 미리 정해진 양의 계산된 NPC를 함유한다. 본 발명의 이식편 형성 유닛 투여량 형태에 대한 자세한 사항은 NPC의 고유한 특징과, 달성되어야 할 구체적인 치료 효과 및 개체의 치료를 위해 NPC를 혼합하는 데 있어 당업계에 존재하는 제한에 따라 정해지고 직접적으로 그 영향을 받는다. 각 이식편 유닛 투여량 형태내 NPC 수는 약 1000개 내지 약 10억개 세포, 바람직하게는 약 10,000개 내지 약 1억개 세포, 더욱 바람직하게는 약 50,000개 내지 약 5000만개 세포 범위로 다양할 수 있다. 각 이식편 유닛 투여량 형태내 NPC 농도는 바람직하게는 약 100개 내지 약 100,000개 세포/㎕, 더욱 바람직하게는 약 1,000개 내지 약 50,000개 세포/㎕로 다양할 수 있다.

GFU는 용기, 팩, 또는 디스펜서에 투여 설명서와 함께 담길 수 있다. 이식편은 바람직하게는 약 37℃ 온도에서 보관한다.

특정 양태에서는 이식하기에 앞서 NPC를 레이블링 하는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 이식된 NPC의 이동, 이식된 NPC의 분화, 이식된 NPC의 생존 등을 추적하기 위해 예비임상(즉, 인간이 아닌 것) 모델에서 바람직할 수 있다. 레이블이 읽히는 예비임상 환경에 따라 각종 세포 레이블링 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 검출기가 이식된 부위 근처에 적당하게 위치할 수 있는 환경하에서는 형광 단백질(녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질 등)이 사용될 수 있다.

예비임상적 환경에서 이식된 뇌를 분석할 때에는 면역조직화학적 분석이 유용할 수 있다. 일 양태에서는 뉴런성 세포, 아스트로사이트, 글리아 세포, 또는 올리고덴드로사이트 특징을 동정하기 위해 녹색 형광 단백질(GFP)이나 다른 세포 레이블, 즉, 베타-튜뷸린 III, NeuN(뉴런 특이적 단백질), 글리아 섬유 산성 단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP), 또는 O4(올리고덴드로사이트 특이적 단백질)에 대해 뇌 절편을 이중으로 면역염색할 수 있다. 소정의 항체에 대해 양성인 것의 수와, GFP를 발현하는 세포 수를 아베크롬비(Abercrombie) 보정식에 따라 추정할 수 있다. 매 5번째 절편내에 적어도 10%의 GFP 양성(또는 다른 레이블에 양성)인 것을 함유하는 뇌의 부위를 결정한 뒤, 이것에 GFP 양성(또는 다른 레이블에 양성)인 것을 함유하는 것의 뇌의 전두부로부터의 거리를 곱하여, 분포되어 있는 부피와 GFP(또는 다른 레이블)에 양성인 총 세포수를 계산할 수 있다.

일 양태에서, GFP를 사용하여 NPC를 레이블링한 경우 하기의 물질을 사용할 수 있다:

물질: 냉동보존한 NPC, PBS (Invitrogen 14190-136), HTS-FRS (BioLife Solutions 99-609-DV), 대략 10⁷/ml 역가를 갖는 GFP-렌티바이러스 스톡 현탁액(GFP-Lentivirus stock suspension), 헥사아마이딘 브로마이드(폴리브렌) (Sigma (H-9268) - 1 또는 2 냉동 분취액(aliquot) @ 10 mg/ml), 멸균수, USP, Opti-MEM (Invitrogen), 및 페탈 보바인 세럼(Hyclone).

GFP-렌티바이러스 스톡 현탁액은 시중에서 구입할 수 있고, 그렇지 않으면 ViraPower Lentiviral Expression System(Invitrogen, Carlsbad CA)과 같은 시판용 키트를 사용하여 만들 수도 있다. 특히, pLenti6/V5 Gateway 벡터를 제조업자 지시에 따라 GFP 카셋과 결합시킴으로써 최종적으로 적당한 GFP-렌티바이러스 현탁액을 제조할 수 있다.

일 양태에서, 상기 언급된 Invitrogen System과 같이 제조업자로부터 입수가능한 트랜스펙션(transfection) 프로토콜에 따라 레이블링을 수행할 수 있다.

또다른 양태에서, GFP를 사용하여 NPC를 레이블링한 경우 다음과 같은 방법이 유용할 수 있다: 바람직하게는 원심분리 단계를 제외한 세포 취급 방법을 바이오해저드 세이프티 케비넷 레벨-2에서 수행한다. 10 mg의 폴리브렌을 1 ml의 멸균수, USP에 용해시키고, 0.25 마이크론 필터에 여과시키면 폴리브렌 스톡 솔루션을 제조할 수 있다. 만들어진 여과된 스톡 솔루션을 분취액으로 나누고, -20℃ 암소에서 보관한다.

바이러스 감염 전에, 30 ml의 세포 배양 배지를 함유하는 T225 플라스크에 NPC를 플라스크당 2백만개 세포의 밀도로 플레이팅하고; 세포를 37℃/5% 이산화탄소 인큐베이터에서 밤새 배양한다.

바이러스 감염시킨 후 하루째, 렌티바이러스 스톡을 실온에서 해동하고 폴리브렌 스톡 솔루션을 37℃의 수조에서 해동한다. 50 ml 팔콘 튜브에, 예열한(37℃)알파 MEM 중의 10% FBS 45 ml 및 해동시킨 바이러스 스톡 5 ml를 첨가하여 MOI가 대략 10인 배지를 만든다. 해동시킨 폴리브렌을 최종농도 10 ㎍/ml(1000배 희석)이 되도록 첨가한다. T225 플라스크에서 오래된 배지를 제거하고 플라스크에 바이러스 혼합물을 첨가한 뒤 플라스크를 앞뒤로 3-4회 가볍게 흔들어준다. 다시 플라스크를 37℃/5% 이산화탄소 인큐베이터에 넣는다.

다음날, 플라스크에서 바이러스 배지를 완전히 제거한다. 알파 MEM 중의 10% FBS 30 ml로 6회 세척한다. 감염 정도를 시험하기 위해 각 세척액에서 5 ml를 수집한다. 새 배지로 갈아주고, 다시 플라스크를 인큐베이터에 넣는다.

이튿날, 바이러스 감염된 세포를 모아서, 계수한 후 총 부피가 360 ㎕이 되도록 HTS-FRS 중에 재현탁시키고, 멸균처리된 DNAase 없으며 RNAase 없으며 피로젠 없는 1.5 ml 마이크로퓨지 튜브에 옮긴다. 감염된 세포 농도는 적절한 이식 용량에 맞도록 조정할 수 있다. 이어서, 이식편으로 투여될 때까지 세포를 촉촉한 얼음 위에 보관할 수 있다.

B. MNC 및 이의 약학적 조성물

일 양태에서, MNC는 환자에게 이식되는 이식편의 일부로서 본 발명의 실시에 사용된다. 목적은 MNC가 환자의 해당조직 중 일 영역의 기능 회복에 있어 중요한 역할을 하는 것이다. 이러한 방식으로 중추신경계 병변의 치료가 가능해지는 것이다.

바람직한 MNC 및 이러한 MNC를 제조하는 바람직한 방법은 데자와 등의 PCT/JP03/01260에 기재되어 있다(발명의 명칭:. Method of Differentiating/Inducing Bone Marrow Interstitial Cells Into Nerve Cells and Skeleton Muscle Cells by Transferring Notch Gene). 특히 실시예 1에 기술되어 있는 데자와의 "신경 세포"는 본 발명의 MNC로서 사용될 수 있다. 데자와는 골수 접착 스템 셀이 본 발명의 MNC로 사용가능한 뉴런성 세포로 변환분화될 수 있다고 기술하고 있다.

바람직한 양태에서, MNC는 향신경성제(neurotrophic agent)를 사용하여 NPC로부터 제조할 수 있다. 유용한 향신경성제에는 섬유아세포 성장인자(basic-fibroblast growth factor, bFGF), 및 섬모 향신경성 인자(ciliary neurotrophic factor, CNTF)가 포함되나 이에 국한되는 것은 아니다. 인 비트로에서 NPC와 함께 향신경성제를 사용하는 적당한 방법은 PCT/JP03/01260에서 찾아볼 수 있다.

일 양태에서, GFU는 본 발명의 실시에 유용할 수 있다. 본 발명의 GFU에 사용하기에 유용한 약학적 수용가능한 담체에는 멸균처리된 등장완충액, FRS, 아이솔라이트, 멸균처리된 희석제, 예컨대 물, 보통의 식염수, 고정오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제 또는 항균제, 예컨대 아스코브산, 티메로살, 트라이메토프림-설파메톡사졸, 날이디스산, 메텐아민 히푸레이트 또는 니트로퓨란토인 마크로크리스탈 등; 항산화제, 예컨대 아스코브산 또는 소듐 바이설파이트; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA; 완충액, 예컨대 아세테이트, 시트레이트, 또는 포스페이트; 그리고 건강을 위한 제제, 예컨대 소듐 클로라이드 또는 포도당이 포함될 수 있다. pH는 하이드로클로로 산이나 소듐 하이드록사이드와 같은 산이나 염기를 사용하여 조정할 수 있다.

일 양태에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 이식편 형성 유닛은 MNC를 포함하는 멸균처리한 조성물을 포함한다. 정맥내 투여를 위해서, 적당한 약학적 수용가능한 담체에는 생리식염수, Cremophor EL.TM.(BASF; Parsippany, N.J.), 노르마졸, 아이솔라이트, 플라즈마-라이트, 또는 포스페이트 버퍼드 셀라인(PBS)이 포함될 수 있다. 모든 경우에 GFU는 멸균처리되어야 하며(NPC나 MNC외에 존재하는 것에 대해), 주사하기 쉽도록 하는 정도로 적당히 유동성을 띠어야 한다(예를 들면, 레시틴과 같은 물질을 사용함으로써, 분산액의 경우에는 특정 입자 크기를 유지함으로써, 그리고 표면활성제를 첨가함으로써, 적당한 유동성이 유지될 수 있다). GFU는 제조 및 보관 조건 하에 안정해야 하며, 상기 언급한 바와 같이 박테리아 및 균류와 같은 미생물의 오염 현상으로부터 보존될 수 있어야 한다. 특정한 경우 예를 들면, 당, 마니톨이나 소비톨과 같은 다가알콜, 소듐 클로라이드, LiCl, 소듐 부티레이트, 및 소듐 오르토바나데이트와 같은 것을 GFU에 첨가시키는 것이 바람직할 것이다. 일반적으로 본 발명의 GFU는 염기성 분산매를 함유하고 임의로는 상기 언급한 기타 성분을 함유하는 멸균처리된 베히클에 NPC를 혼입시킴으로써 제조될 수 있다.

투여 편의 및 투여량의 일정함을 유지하기 위한 목적으로는 이식편 형성 유닛 투여량 형태로 본 발명의 GFU를 제형하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 이식편 형성 유닛 투여량 형태란 치료되어야 할 개체에 대해 일정한 투여량으로 맞추어진 물리적으로 분리되어 있는 유닛을 가리킨다. 일 양태에서, 각 GFU 투여량 형태는 요구되는 약학적 담체와 관련하여 바람직한 치료 효과를 생성시키도록 계산된, 미리 정해진 양의 계산된 NPC를 함유한다. 본 발명의 이식편 형성 유닛 투여량 형태에 대한 자세한 사항은 MNC의 고유한 특징과, 달성되어야 할 구체적인 치료 효과 및 개체의 치료를 위해 MNC를 혼합하는 데 있어 당업계에 존재하는 제한에 따라 정해지고 직접적으로 그 영향을 받는다. 각 이식편 유닛 투여량 형태내 MNC 수는 약 1000개 내지 약 10억개 세포, 바람직하게는 약 10,000개 내지 약 1억개 세포, 더욱 바람직하게는 약 50,000개 내지 약 5000만개 세포 범위로 다양할 수 있다. 각 이식편 유닛 투여량 형태내 MNC 농도는 바람직하게는 약 100개 내지 약 100,000개 세포/㎕, 더욱 바람직하게는 약 1,000개 내지 약 50,000개 세포/㎕로 다양할 수 있다.

GFU는 용기, 팩, 또는 디스펜서에 투여 설명서와 함께 담길 수 있다. 이식편은 바람직하게는 약 4℃ 온도에서 보관한다.

특정 비임상적 양태에서는 이식하기에 앞서 MNC를 레이블링 하는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 이식된 MNC의 이동, 이식된 MNC의 분화, 이식된 MNC의 생존 등을 추적하기 위해 바람직할 수 있다. 레이블이 읽히는 환경에 따라 각종 세포 레이블링 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 검출기가 이식된 부위 근처에 적당하게 위치할 수 있는 환경하에서는 형광 단백질(녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질 등)이 사용될 수 있다. 레이블링은 상기 언급된 Invitrogen의 GFP-렌티바이러스 시스템과 같은 통상의 방법을 사용하여 수행할 수 있다.

비임상적 환경에서 이식된 뇌를 분석할 때에는 면역조직화학적 분석이 유용할 수 있다. 일 양태에서는 뉴런, 아스트로사이트, 글리아 세포, 또는 올리고덴드로사이트 특징을 동정하기 위해 녹색 형광 단백질(GFP)이나 다른 세포 레이블, 즉, 베타-튜뷸린 III, NeuN(뉴런 특이적 단백질), 글리아 섬유 산성 단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP), 또는 O4(올리고덴드로사이트 특이적 단백질)에 대해 뇌 절편을 이중으로 면역염색할 수 있다. 소정의 항체에 대해 양성인 것의 수와, GFP를 발현하는 세포 수를 아베크롬비(Abercrombie) 보정식에 따라 추정할 수 있다. 매 5번째 절편내에 적어도 10%의 GFP 양성(또는 다른 레이블에 양성)인 것을 함유하는 뇌의 부위를 결정한 뒤, 이것에 GFP 양성(또는 다른 레이블에 양성)인 것을 함유하는 것의 뇌의 전두부로부터의 거리를 곱하여, 분포되어 있는 부피와 총 GFP(또는 다른 레이블)에 양성인 세포수를 계산할 수 있다. 일 양태에서, pBabe neo-GFP 벡터를 통해 레트로바이러스 감염을 이용하여 MNC를 형광 레이블링할 수 있다. 참조: M. Dezawa et al., "Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromal cells." Eur J Neurosci. 2001 ; 14: 1771 -6. 절차는 다른 형광 단백질이 벡터에 도입될 수 있도록 변형시킬 수 있다.

C. NPC 이식

일 양태에서, 본 발명에 따른 NPC 및/또는 GFU는 통상적인 프로토콜 및 투여 경로를 사용하여 투여될 수 있으며, 환자에게 투여되어야 할 NPC 및/또는 GFU의 양은 통상의 투여량 산출기술을 사용하여 최적화할 수 있다. 본 발명에 따른 NPC 및/또는 GFU는 단독으로, 또는 다른 물질이나 조성물과 배합하여 투여할 수 있다. 투여 경로는 당업계에 공지되어 있는 통상적인 투여 경로 중에서 선택할 수 있다.

이식은, 캐뉼러(cannula), 니들(needle) 또는 션트(shunt) 주사에 의한 혼입, 또는 담체, 예컨대 생분해성 캡슐과 함께 이식하는 것을 포함하나 이에 국한되지 않는 여러가지 방법으로 수행될 것임이 예상되고, 다른 투여 방법 또한 본 발명의 범위내에 속한다.

본 발명에 따른 NPC 및/또는 GFU는 환자에게 전신 투여될 수 있는데, 여기에서 예를 들면, 비경구 경로 예컨대 정맥내(i.v.) 또는 동맥내(예컨대 내경동맥 또는 외경동맥과 같은 경로) 투여가 바람직한 전신 투여 경로이다. 전신 투여 기술은 D Lu et al., "Intraarterial administration of marrow stromal cells in a rat model of traumatic brain injury." J Neurotrauma. 2001 Aug;18(8):813-9에서 기술된 바와 같은 전구체 세포를 투여하기 위해 사용되는 기술에서 변형시킬 수 있다.

일 양태에서, 본 발명에 따른 NPC 및/또는 GFU는 환자의 중추신경계 병변에 국소적으로 투여될 수 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 NPC 및/또는 GFU는 뇌실질내 경로로 투여될 수 있다. 환자의 중추신경계 병변에 국소적으로 NPC 및/또는 GFU를 투여하는 것의 이점은 환자의 면역계가 혈류-뇌장벽내에서 덜 활성화될 수 있다는 점이다. 따라서 면역억제제가 요구되기는 하지만 숙주에 의해 NPC가 면역거부되는 가능성이 줄어들고, 이식편이 생존하게 되는 가능성은 증가하게 된다. 국소적 적용의 또다른 이점은 CNS 병변에 NPC가 보다 정확히 표적화된다는 점이다.

중추신경계 병변에 이식되는 경우 이식은 스테레오택틱(stereotactic) 수술 절차를 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 절차에서는, 환자를 마취하여 수행한다. 환자의 머리를 MRI 호환성 스테레오택틱 프레임에 두고, 마이크로인젝터가 있는 마이크로포지셔너를 두개골 위에 둔다. 치과용 드릴이나 다른 적당한 기구를 사용하여 버(Burr) 홀을 환자의 두개골에 만들어 표적 부위 바로 위에 있는 뇌막 부분이 노출되도록 한다.

일 양태에서, 26게이지 니들 및 해밀톤(Hamilton) 마이크로주사기(또는 다른 적당한 크기의 주사기)를 사용하여 니들 통로를 만들 수 있는데, 여기에서 니들은 NPC 및/또는 GFU가 적절한 위치에 배치될 수 있도록 MRI 이미지를 사용하여 이식 부위로 수동 안내하는 역할을 한다. 바람직하게는 보울러스(bolus) 주사인 주사를 이식 부위에 할 수 있다. 주입 속도는 다양할 수 있는데, 바람직하게는 주입 속도는 약 0.1 내지 약 10 ㎕/분, 더욱 바람직하게는 약 0.5 내지 약 5 ㎕/분, 더욱 더 바람직하게는 약 1.0 내지 약 3.0 ㎕/분이다. 일 양태에서, 니들은 주입이 끝난 후 적당한 기간 동안, 바람직하게는 주입이 끝난 후 약 1 내지 약 10분, 더욱 바람직하게는 주입이 끝난 후 약 5분 동안 그 자리에 둘 수 있다. 니들을 그 자리에 둔 상기의 일정 기간이 지난 후, 니들을 약간만, 바람직하게는 약 1 내지 약 10 mm, 더욱 바람직하게는 약 2 mm 들어올려, 약간만 더, 바람직하게는 약 5 내지 약 30분, 더욱 바람직하게는 약 15분간 더 그 자리에 둘 수 있다. 이어서 환자로부터 주사기를 제거하고 상처난 부위를 생체층으로 덮은 뒤, 마취에서 회복되는지를 관찰한다.

수술중/수술후 절차 중 일부로서, 진통제(예컨대 부프레노핀) 및 항생제(예컨대 세파졸린(Cephazolin) 50 mg/kg, IM, b.i.d. x 5일)를 필요하면 투여할 수 있다. 항생제 처리는 감염 가능성을 억제하기 위해 수술후 연장된 기간 동안, 바람직하게는 수술후 30일 동안 지속할 수 있다.

그 외에도 이식 기술에 대해서는 K S Bankiewicz et al., "Technique for bilateral intracranial implantation of cells in monkeys using an automated delivery system." Cell Transplantation, 9(5):595-607 (2000)에서 찾아볼 수 있다.

특정 양태에서는, 본 발명의 이식편 및/또는 NPC와 함께 면역억제제를 투여할 수 있다. 이 면역억제제는 특히 이식편 및/또는 NPC가 전신 투여된 경우 환자의 면역계에 의해 NPC가 거부당하는 것을 억제하는 것을 도울 수 있다. 본 발명의 실시에 유용한 면역억제제의 예에는 항대사제 예컨대 아자티오프린(azathioprine), 알킬화제 예컨대 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 엽산 길항제 예컨대 메토트레제이트(methotrexate) 또는 머캅토퓨린(6-MP), 마이코페놀레이트(mycophenolate)(CellCept), 사이클로스포린-A(Cyclosporine-A) 및 타크롤리무스(Tacrolimus)(FK-506)가 포함되나 이에 국한되는 것은 아니다. 바람직한 면역억제제는 CsA이다. CsA는 Sandimmune^®, Injection(제조사: Novartis Pharma AG, Basel, Switzerland for Novartis Pharmaceuticals Corporation (Novartis), East Hanover, NJ)를 포함하는 각종 구입처로부터 입수할 수 있다.

면역억제제는 경구, i.p., i.v.를 포함하는 다양한 경로로 투여될 수 있다. 면역억제제의 투여량은 면역억제제 및 환자의 성질에 따라 다양할 수 있다. 일 양태에서 면역억제제는 이식 2일전에 투여한 이후 적당한 간격을 두고 지속적 투여할 수 있다. 일 양태에서, 면역억제제는 이식한 날(대략 이식이 끝난 후 4시간)에 투여를 시작하여 그 이후 24시간 간격으로 지속적 투여할 수 있다. 투여량 범위는 바람직하게는 약 0.5 mg/kg/일 내지 약 100 mg/kg/일, 더욱 더 바람직하게는 약 5 mg/kg/일 내지 약 75 mg/kg/일, 더욱 바람직하게는 약 5 mg/kg/일 내지 약 50 mg/kg/일로서 다양할 수 있다. 정맥내 주사는 보울러스로서, 약 0.005 내지 약 0.100 ml/분, 더욱 바람직하게는 약 0.050 ml/분의 속도로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 NPC 및/또는 GFU는 통상적인 프로토콜 및 투여 경로를 사용하여 투여될 수 있으며, 환자에게 투여되어야 할 NPC 및/또는 GFU의 양은 통상의 투여량 산출기술을 사용하여 최적화할 수 있다. 본 발명에 따른 NPC 및/또는 GFU는 단독으로, 또는 다른 물질이나 조성물과 배합하여 투여할 수 있다. 투여 경로는 당업계에 공지되어 있는 통상적인 투여 경로 중에서 선택할 수 있다.

이식은, 캐뉼러, 니들 또는 션트 주사에 의한 혼입, 또는 담체, 예컨대 생분해성 캡슐에 이식하는 것을 포함하나 이에 국한되지 않는 여러가지 방법으로 수행될 것임이 예상되고, 다른 투여 방법 또한 본 발명의 범위내에 속한다.

D. MASC 유래 뉴런성 세포 이식

일 양태에서, 본 발명에 따른 MNC 및/또는 GFU는 통상적인 프로토콜 및 투여 경로를 사용하여 투여될 수 있으며, 환자에게 투여되어야 할 MNC 및/또는 GFU의 양은 통상의 투여량 산출기술을 사용하여 최적화할 수 있다. 본 발명에 따른 MNC 및/또는 GFU는 단독으로, 또는 다른 물질이나 조성물과 배합하여 투여할 수 있다. 투여 경로는 당업계에 공지되어 있는 통상적인 투여 경로 중에서 선택할 수 있다.

이식은, 캐뉼러, 니들 또는 션트 주사에 의한 혼입, 또는 담체, 예컨대 생분해성 캡슐과 함께 이식하는 것을 포함하나 이에 국한되지 않는 여러가지 방법으로 수행될 것임이 예상되고, 다른 투여 방법 또한 본 발명의 범위내에 속한다.

일 양태에서, 본 발명에 따른 MNC 및/또는 GFU는 환자의 중추신경계 병변에 국소적으로 투여될 수 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 MNC 및/또는 GFU는 뇌실질내 경로로 투여될 수 있다. 환자의 중추신경계 병변에 국소적으로 MNC 및/또는 GFU를 투여하는 것의 이점은 환자의 면역계가 혈류-뇌장벽내에서 덜 활성화될 수 있다는 점이다. 따라서 면역억제제가 요구되기는 하지만 숙주에 의해 MNC가 면역거부되는 가능성이 줄어들고, 이식편이 생존하게 되는 가능성은 증가하게 된다. 국소적 적용의 또다른 이점은 CNS 병변에 MNC가 보다 정확히 표적화된다는 점이다.

중추신경계 병변에 이식되는 경우 이식은 스테레오택틱 수술 절차를 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 절차에서는, 환자를 마취하여 수행한다. 환자의 머리를 MRI 호환성 스테레오택틱 프레임에 두고, 마이크로인젝터가 있는 마이크로포지셔너를 두개골 위에 둔다. 치과용 드릴이나 다른 적당한 기구를 사용하여 Burr 홀을 환자의 두개골에 만들어 표적 부위 바로 위에 있는 뇌막 부분이 노출되도록 한다.

일 양태에서, 26게이지 니들 및 해밀톤(Hamilton) 마이크로주사기(또는 다른 적당한 크기의 주사기)를 사용하여 니들 통로를 만들 수 있는데, 여기에서 니들은 MNC 및/또는 GFU가 적절한 위치에 배치될 수 있도록 MRI 이미지를 사용하여 이식 부위로 수동 안내하는 역할을 한다. 바람직하게는 보울러스(bolus) 주사인 주사를 이식 부위에 할 수 있다. 주입 속도는 다양할 수 있는데, 바람직하게는 주입 속도는 약 0.1 내지 약 10 ㎕/분, 더욱 바람직하게는 약 0.5 내지 약 5 ㎕/분, 더욱 더 바람직하게는 약 1.0 내지 약 3.0 ㎕/분이다. 일 양태에서, 니들은 주입이 끝난 후 적당한 기간 동안, 바람직하게는 주입이 끝난 후 약 1 내지 약 10분, 더욱 바람직하게는 주입이 끝난 후 약 5분 동안 그 자리에 둘 수 있다. 니들을 그 자리에 둔 상기의 일정 기간이 지난 후, 니들을 약간만, 바람직하게는 약 1 내지 약 10 mm, 더욱 바람직하게는 약 2 mm 들어올려, 약간만 더, 바람직하게는 약 5 내지 약 30분, 더욱 바람직하게는 약 15분간 더 그 자리에 둘 수 있다. 이어서 환자로부터 주사기를 제거하고 상처난 부위를 생체층으로 덮은 뒤, 마취에서 회복되는 지를 관찰한다.

특정 양태에서는, 본 발명의 이식편 및/또는 MNC와 함께 면역억제제를 투여할 수 있다. 이 면역억제제는 환자의 면역계에 의해 MNC가 거부당하는 것을 억제하는 것을 도울 수 있다. 본 발명의 실시에 유용한 면역억제제의 예에는 항대사제 예컨대 아자티오프린, 알킬화제 예컨대 사이클로포스파미드, 엽산 길항제 예컨대 메토트레제이트 또는 머캅토퓨린(6-MP), 마이코페놀레이트(CellCept), 사이클로스포린-A 및 타크롤리무스(FK-506)가 포함되나 이에 국한되는 것은 아니다. 바람직한 면역억제제는 CsA이다. CsA는 Sandimmune^®, Injection(제조사: Novartis Pharma AG, Basel, Switzerland for Novartis Pharmaceuticals Corporation (Novartis), East Hanover, NJ)를 포함하는 각종 구입처로부터 입수할 수 있다.

면역억제제는 경구, i.p., i.v.를 포함하는 다양한 경로로 투여될 수 있다. 면역억제제의 투여량은 면역억제제 및 환자의 성질에 따라 다양할 수 있다. 일 양태에서 면역억제제는 이식 2일전에 투여한 이후 적당한 간격을 두고 지속적 투여할 수 있다. 일 양태에서, 면역억제제는 이식한 날(대략 이식이 끝난 후 4시간)에 투여를 시작하여 그 이후 24시간 간격으로 지속적 투여할 수 있다. 투여량 범위는 바람직하게는 약 0.5 mg/kg/일 내지 약 100 mg/kg/일, 더욱 더 바람직하게는 약 5 mg/kg/일 내지 약 75 mg/kg/일, 더욱 바람직하게는 약 5 mg/kg/일 내지 약 50 mg/kg/로 다양할 수 있다. 정맥내 주사는 보울러스로서, 약 0.005 내지 약 0.100 ml/분, 더욱 바람직하게는 약 0.050 ml/분의 속도로 투여할 수 있다.

E. 실험적 관찰 및 NPC 의 이점

NPC를 포함하는 약학적 조성물을 포함하는 NPC를 자가이식 또는 동종이식하는 것이 본 발명에서 예상되지만, 동종이식(동종이식편 형성 유닛)이 바람직하다. 일 양태에서 동종이식은 중추신경계 병변을 앓고 있는 환자에게 NPC를 동종이식할 수 있는 임상적 틀을 구현한다. 본원에 기술된 것은 본 발명에 따라 NPC를 스테레오택틱 방법으로 중뇌동맥 폐색(MCAo), 중뇌동맥 연결(MCAl) 또는 일과성 완전 허허혈증(TGI)이 있는 성장한 수컷 래트(Sprague-Dawley rats)의 뇌에 이식한 것의 결과이다. 이러한 모델은 중추신경계 병변의 치료시 본 발명의 효과를 이해하는 데 유용하다. 이러한 모델에 대해 추가적인 사항은 문헌, 특히 C. Borlongan et al., "Transplantation of cryopreserved human embryonal carcinoma-derived neurons (NT2N cells) promotes functional recovery in ischemic rats." Exp Neural. 1998;149:310-21; 및 C. Borlongan et al., "Glial cell survival is enhanced during melatonin-induced neuroprotection against cerebral ischemia." FASEB J. 2000;14:1307-17에서 찾아볼 수 있다. 각 뇌졸중 동물은 세가지 세포 투여량(약 40,000개, 100,000개 및 200,000개의 생존한 NPC) 중 한가지를 포함하는 이식편을 수여받았다(이 숫자는 후술하는 바와 같이 어림값이다). 이식은 뇌졸중 발생 후 약 6주후 수행하였고 모든 동물은 이식 후 생존한 동안 매일 사이클로스포린-A(10 mg/kg i.p.)로 면역억제제 처리하였다. 이식후 4주간 매주, 그리고 이식후 12주에 1회 더, 이식받은 쥐의 운동 수행력 및 인지 수행력을 분석하였다. 이식후 5주 및 12주째에 무작위 선택한 동물에서 뇌허혈증 정도 및 이식편 생존을 보는 조직검사를 수행하였다.

하기의 시험은 상기 기재된 뇌졸중 수술 및 이식 방법을 더 자세히 설명하기 위하여 사용된다. 이러한 시험의 수행방법은 본원에 설명되어 있고 당업자라면 쉽게 이해할 수 있을 것이다.

NPC 이식 효능의 척도
시험	목적
EBST	뇌졸중 후 운동 장애 및 이식 후 회복을 알아보기 위한 것
신경 시험	뇌졸중 후 감각-운동 장애 및 이식 후 회복을 알아보기 위한 것
모리스 워터 메이즈	뇌졸중 후 인지 장애 및 이식 후 회복을 알아보기 위한 것
TTC 조직검사	뇌경색 정도를 알아보기 위한 것
GFAP	뇌경색 정도 및 이식편에 대한 숙주 면역 반응 정도를 알아보기 위한 것
GFP 바이러스 벡터	이식된 NPC의 생존 및 이동을 알아보기 위한 것
Neu-N	이식된 NPC의 뉴런성 세포 표현형 발현을 알아보기 위한 것
주: EBST는 들어올린 상태의 스윙 시험, TTC는 트라이페닐테트라졸륨 클로라이드, GFAP는 글리아 섬유 산성 단백질을 의미함

하기의 실시예에서 얻어진 데이터에서는, 연구된 모델에서 NPC 이식된 동물은 이식전 기준 수행력에 비해, 운동 및 인지 수행력이 유의하게 개선되었음을 나타내었다. 약 100,000개 및 약 200,000개 세포의 높은 투여량으로 처리한 것은 약 40,000개 세포의 낮은 세포 투여량일 때에 비해 행동 능력 회복 효과가 더 좋았는데 이에 따라 투여량-반응 상관관계가 성립한다. 뇌졸중 유발성 행동 장애로부터 건강하게 회복된 것은 이식후 1주후 정도로 빨랐고, 이식후 4주간 지속되었다. 운동 수행력에서의 유의한 개선이 모든 3가지 뇌졸중 유형에서 관찰되었다(들어올린 상태의 스윙 시험 및 베더슨 시험을 이용). 반대로 MCAl 이식된 동물에 비해, MCAo 및 TGI 이식된 동물에서는 인지 수행력(모리스 워터 메이즈 시험 이용)의 유의한 개선이 더욱 컸고, 또한 안정하였다. 모든 뇌졸중 이식된 동물은 건강해보였고 연구 기간 동안에 별다른 부작용은 관찰되지 않았다.

뇌졸중 유형은 기능 회복에 있어 하나의 인자로 작용하는 것으로 보이는데, 모든 뇌졸중 동물이 운동 수행력에서 유의한 개선을 보이기는 하지만, MCAo 및 TGI 이식된 동물은 MCAl 이식된 동물에 비해 인지 수행력이 더 많이 회복되는 것으로 보이기 때문이다. MCAo 및 TGI 이식된 동물에서 운동 및 인지 기능이 유의한 정도로 회복된 것을 증명한 것은, 각각 기저 신경절 및 해마에 손상을 일으킨 두가지 뇌졸중 모델이 NPC 이식에 반응하였음을 추측케 한다. 임상적 적용에 이러한 관찰결과를 대입하면 고정된 기저 신경절 및 해마 뇌졸중을 앓는 환자가 NPC 이식으로 혜택받을 수 있음을 뜻한다.

이식후 5주 및 12주째의 조직검사 결과는 NPC 이식편 생존은 관찰된 기능 회복 효과와 관련이 있다는 것을 나타낸다. 데이터는 낮은 투여량의 40,000개 세포보다 100,000개 및 200,000개 NPC를 이식하였을 때 더욱 나은 행동 능력 회복을 보임을 제시한다. 이식편 생존과 행동 능력 회복간의 상관관계 분석은, 생존한 NPC가 뇌졸중 동물에서 운동 및 인지 기능 회복을 촉진한다는 것을 추가로 뒷받침한다. 놀랍게도 렌티바이러스 레이블링 방법을 사용하여 이식편 생존을 측정하였고, 이러한 전략은 이식된 NPC를 마킹하는 데 신뢰할 만한 것으로 밝혀졌다. 추가로, 이러한 방법으로 NPC 이동도 손쉽게 추적하였다.

뇌졸중 유형에 따라, MCAo 및 MCAl에서 보이는 바와 같이 더욱 심한 뇌손상이 있는 것은 NPC가 더 많이 이동되는 것으로 보인다. 반대로 TGI에 의해 유발된 경미한 뇌 손상에서는 세포가 이동을 그다지 많이 하지 않는 것으로 보인다. 관찰된, NPC가 상처 부위까지 장거리 이동할 수 있는 능력은 특정 뇌졸중 표적 부위로 이동할 수 있는 가능성과 회복능을 보유할 가능성을 암시한다. 하기의 실시예에 제공된 결과는 이동한 NPC는 뉴런성 세포 표현형으로 더 분화하기 쉽다는 견해를 뒷받침한다. 이동한 세포의 분화 경향에 기여할 수 있는 여러가지 인자가 존재하며 여기에는 숙주의 미세환경 및 뇌졸중 유형(위치 및 정도/세포사멸 유형 등)이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.

F. 실험적 관찰 및 MNC 의 이점

MNC를 포함하는 약학적 조성물을 포함하는 MNC를 자가이식 또는 동종이식하는 것이 본 발명에서 예상되지만, 동종이식(동종이식편 형성 유닛)이 바람직하다. 일 양태에서 동종이식은 중추신경계 병변을 앓고 있는 환자에 MNC를 동종이식할 수 있는 임상적 틀을 구현한다. 뇌졸중 동물 모델에게 MNC를 동종이식한 결과는 하기의 J 섹션에 제공한다. 이들 모델은 중추신경계 병변의 치료에 있어 본 발명의 효능을 이해하는데 유용하다.

H 섹션에서의 결과는 MNC군이 대조군 및 MASC군에 비해 행동 평가 시험에서 유의한 개선을 보임을 뒷받침한다. 조직검사 결과에서, MCAo 후 41일째에 측정된 경색증 부피는 3가지 군에서 유의한 차이를 보이지 않았다. MASC에 비해, MNC는 더 높은 생존율을 증명하였고, MNC 중 대부분이 숙주 뇌에서 뉴런성 마커에 양성반응하고 신경돌기를 연장시켰음을 보인다.

MASC군은 대조군에 비해서는 행동 평가 시험에서 약간 개선된 것을 보였지만, NMC군에서만큼은 아니었다.

본 발명에 따른 MNC 이식의 또다른 이점은 예를 들면, 다분화능 MASC와 비교하여 MNC의 생존율이 더 높다는 것이다. 이식 후 1개월이 지난 시점에, 이식된 MASC의 10 내지 20%만이 검출된 반면, 이식된 MNC의 경우 이의 대략 30 내지 45%가 검출되었다. MNC의 더 높은 생존율은 기능 회복에 이점을 제공할 수 있다.

최근의 연구에서는, 피질, 선조체, 및 해마에서 일부 MNC는 숙주 뇌내 신경돌기를 연장시키는 것으로 밝혀졌는데, 이는 MASC군에서는 관찰되지 않을 수 있다. 그러므로 MNC군에서의 유의한 행동 능력 개선은 이식된 MNC가 숙주 뇌에서 뉴런성 세포 특징을 보유하고 있어서, MCAo 래트 모델에서 기능 회복에 기여함을 뒷받침한다.

G. NPC 실험

하기의 실시예는 설명을 목적으로만 하는 것이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.

실험 절차. 모든 동물은 처음에 MCAo, MCAl 또는 TGI 뇌졸중 수술을 받았다. 수술 후 약 6주 후에, 들어올린 상태의 스윙 시험, 베더슨 시험 및 모리스 워터 메이즈 시험을 수행하였다. 유의한 운동 장애를 보이는 동물만을 이식 수술에 사용하고, 그 중 무작위로 추출하여 하기의 처리에 사용하였다. 연구에 사용된 각 분야의 표본 수는 표 2에 실었다.

처리조건 본 연구에 사용된 래트
이식편 유형	세포 투여량(어림값)	뇌졸중 유형	표본 크기
NPC	40,000	MCAo MCAl TGI	8 10 8
	100,000	MCAo MCAl TGI	10 10 8
	200,000	MCAo MCAl TGI	10 10 8

모든 동물에 뇌졸중 수술을 하였고, 3개 니들 통로(MCAo 및 MCAl) 또는 2개 니들 통로(TGI)로 이루어진 이식을 하였으며, 사이클로스포린-A로 매일 처리하였다(10 mg/kg, i.p.).

동물은 이식후 처음 4주간 매주 시험하였다. 동물 중 절반은 뇌경색 및 이식편 생존, 표현형 발현, 및 이동을 보기 위한 조직검사를 위해 이식후 5주째에 안락사시켰다. 나머지 동물에 대해 다시 행동 능력을 시험하고, NPC의 장기간 행동적 효능 및 조직학적 효능을 평가하기 위하여 뇌졸중 발생 12주째에 안락사시켰다. 보다 명확히 하기 위해 개략적 흐름도를 하기에 제공한다.

뇌졸중 수술 ↓ 행동 시험 (뇌졸중 후 6주째; 일정 범주에 이른 동물만을 연구에 포함시켰음) ↓ 이식(뇌졸중 후 6주째) ↓ 행동 시험( 이식후 4주째까지 매주 실시 및 12주째 실시) ↓ 이식 후 5주째 또는 12주째 안락사

GFP - 렌티바이러스 벡터 시스템을 사용한 세포 레이블링 : GFP-렌티바이러스 시스템을 제네바 대학의 Dr. Didier Trono(Geneva, Switzerland)로부터 입수하였다. 하기의 일반적 방법을 사용하여 NPC를 레이블링하였다. 본 방법에서의 경미한 변화는 가능하다.

필요한 물질

10 mg / ml 폴리브렌 스톡 솔루션/멸균 여과된 것(Sigma)

Opti-MEM 배지 (Gibco / Invitrogen)

항생제 함유 1 % 페탈 보바인 세럼 (Penicillin / Streptomycin)

약 1X10⁶ San-Bio cell이 있는 6웰 플레이트

바이러스 현탁액

상세한 방법

1. 37℃ 인큐베이터에서 세포 배지를 가열한다.

2. 10 ㎍ /ml까지 폴리브렌을 첨가한다(10 ㎕의 10 mg/ml 폴리브렌 스톡 용액을 10 ml 배지에 첨가하고 잘 혼합한다).

3. 다른 튜브에서 1 ml의 바이러스 현탁액을 1 ml 배지 함유 폴리브렌에 첨가한다.

4. San-Bio cell 분취액을 37℃ 수조에서 재빨리 해동시킨다. 70% 에탄올로 바이얼을 세척한다; 와이프로 닦아 건조시킨다.

5. 10 ml 예열된 PBS를 함유하는 15 ml 원심분리 튜브에 전체 내용물을 첨가한다; 부드럽게 혼합하고 1000 RPM에서 저속 임상 원심분리기에 실온에서 5분간 돌린다.

6. 상층액을 조심스럽게 파이펫팅하고 (3단계에서의) 바이러스를 함유하는 2 ml의 예열한 배지에 세포를 재현탁시킨다.

7. 6웰 플레이트 중 1개의 웰에 내용물을 옮기고, 37℃ 인큐베이터에 둔 후, 3시간 동안 인큐베이팅한다.

8. 10 ml의 예열한 PBS로 2회 세척한다.

9. 20 ㎕ PBS 또는 선택한 배지로 세포를 재세척한다. 1.5 ml 에펜도르프 튜브에 옮기고 얼음에 보관한다. 세포는 이제 이식될 준비가 되었다.

행동 시험: 본 발명에 따른 NPC의 약학적 연구에서 하기의 감각운동 및 인지 행동 능력 측정을 동물에 대해 수행하였다.

들어올린 상태의 스윙 시험(EBST)

모리스 워터 메이즈(MWM)

베더슨 신경 점수

들어올린 상태의 스윙 시험( EBST )

들어올린 상태의 스윙 시험(EBST)은 기본 자세 반사 및 비대칭 몸통 기능을 측정한다. EBST 시험은 설치류에서 MCAo 및 MACl 허혈증에 이은 장기지속성 장애를 증명하기 위해 수행하였다. 참조: C. Borlongan et al., "Locomotor and passive avoidance deficits following occlusion of the middle cerebral artery." Physiol Behav. 1995, 58:909-17. 참조: C. Borlongan et al., "Early assessment of motor dysfunctions aids in successful occlusion of the middle cerebral artery." Neuroreport. 1998b; 9:3615-21. 또한 만성 뇌졸중에 대한 신경 이식 패러다임에서 평가되었다. 참조: C. Borlongan et al., "Early assessment of motor dysfunctions aids in successful occlusion of the middle cerebral artery." Neuroreport. 1998; 9:3615-21.

EBST는 꼬리를 잡는 단계와 스윙의 방향을 기록하는 단계를 포함한다. 시험 장치는 투명한 플렉스글라스(Plexiglas) 박스 (40 x 40 x 35.5 cm)로 구성된다. 동물을 꼬리 기저부 쪽에서 조심스럽게 집어서, 동물의 코가 바닥에서 2인치(5cm) 높이가 될 때까지 꼬리를 들어올렸다. 신체의 정중선 위치에서 대략 10도 옆쪽으로 동물 머리가 이동하였을 때 스윙의 방향, 즉 왼쪽 또는 오른쪽을 측정하였다. 한번 스윙한 후에는, 동물을 플렉스글라스 박스안의 뒤쪽에 두고 다시 시험하기에 앞서 30초간 자유롭게 이동하도록 두었다. 이러한 단계를 각 동물마다 20회 반복하였다. 정상적으로는 전체 쥐는 50%의 스윙 편향을 보였는데, 이것은 오른쪽 및 왼쪽 스윙이 같은 수인 것을 말한다. 75%의 스윙 편향은 20회 시험 중에 한쪽 방향으로 15회 스윙을 하고, 다른 쪽 방향으로 5회 스윙한 것을 말한다. EBST로 한 이전의 실험에서는 병변이 있는 동물은 병변 후 1개월째에 75% 이상의 편향된 스윙 활동을 보였으며, 비대칭 현상은 6개월까지 안정적인 것으로 밝혀졌다.

베더슨 ( Bederson ) 신경 시험

베더슨 신경 점수는 감각운동 능력을 측정하는 것이다. 참조: J. Bederson et al., "Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination." Stroke. 1986;17:472-6; M. Altumbabic, "Intracerebral hemorrhage in the rat: effects of hematoma aspiration." Stroke. 1998;29: 1917-22. 베더슨 시험에 따르면 이전의 실험에서는 MCAo 및 MCAl 래트 뇌졸중 모델에서 시간에 따라 측정가능한 장애를 보였다.

EBST 실시 후 약 한시간 후에, 베더슨 신경 시험을 전술한 절차에 따라 수행하였다. 각 쥐에 대해 아래 (a) 내지 (d)를 포함하는 4종류 시험을 사용하여 신경 점수를 매겼다:

(a) 자발적으로 한쪽 방향 돌기 관찰, 0점(돌지 않음)부터 3점(계속 돌기)

(b) 반대쪽 방향 뒷다리 접기, 이는 2 내지 3 cm 옆으로 이동시킨 후 뒷다리가 돌아오게 하는 동물의 능력을 측정하는 것, 0점(즉시 돌아옴)부터 3점(수분 후 돌아오거나 돌아오지 않는 것)

(c) 평균대 걷기 능력, 2.4 cm 폭, 80 cm 길이의 평균대를 잘 걷는 것은 0점부터 10초간 평균대 위에 머물 수 없는 쥐는 3점

(d) 양쪽 앞발 잡기 시험, 이는 2 mm 직경의 강철 막대를 잡을 수 있는 능력을 측정하는 것으로서, 보통 앞발로 잡을 수 있는 행동을 보이는 래트는 0점부터 앞발로 잡을 수 없는 쥐는 3점.

4개 시험에 대한 점수는 해당 측정일에 약 15분간 동안 수행한 것이고, 이를 더하여 신경 장애 점수를 산출하였다(산출가능한 최고치는 12이다).

모리스 워터 메이즈( Morris Water Maze , MWM )

모리스 워터 메이즈 시험은 습득 능력 및 기억 능력, 탐색 능력 및 보존 능력을 포함하는 인지 기능을 측정한다. 워터 메이즈에서는 선조체 및 전두 피질을 포함하는 MCAo에 의해 영향받은 수개의 뇌부위에 손상을 입은 것에 대해 반응을 보일 것으로 예상된다.

베더슨 신경 시험 수행 후 약 1시간 후에, 공간 기억력을 측정하기 위해 모리스 워터 메이즈로 동물을 시험하였다. 모리스 워터 메이즈는 직경 6피트 깊이 3피트의 둥근 탱크로 구성된다. 탱크에는 12 cm 깊이로 물을 채우고, 우유 300 ml를 첨가하여 불투명하게 만든다. 둥근 표면의 직경이 10 cm인 투명 플렉시글라스로 만든 11 cm 높이의 플랫폼을 수조의 1/4 위치에 세운다. 물 표면에서 1 cm 아래에 플랫폼을 두어 물속에 있는 동물이 플랫폼을 볼 수 없게 한다. 수조를 그 표면적이 같도록 4등분한다. 시험 래트를 탱크쪽을 보도록 하여 수조에 넣고, 1/4 시작 위치(동, 서, 남, 북)에 풀어주는데, 이 위치는 무작위로 정해지고, 수조 가장자리 상에서 동일한 거리에서 임의로 배치된 것이다. 플랫폼을 수조 가장자리로부터 25 cm 떨어진 남서쪽 한가운데에 배치하였다. 시작점은 매 시도후 바꾸었다. 동물에게 약 60초를 주어 플랫폼을 찾게 하고, 약 30초 동안 플랫폼 위에서 쉬도록 한 후 다시 무작위로 정해진 시작 위치로 두는 과정을 3회 반복하였다. 만약에 쥐가 대략 60초내에 숨겨진 플랫폼을 찾는 것에 실패한 경우 플랫폼 위에 옮겨주고 대략 30초 동안 플랫폼 위에서 쉬도록 했다. 휴식 시간이 끝난 후 쥐를 탱크에 넣고 다시 2회 더 시험했다. 훈련일은 3회의 시도로 구성된다. 시험은 2일째에 수행하였다(탐침 시도를 위한 것이다, 하기 참조). 각 훈련 및 시험이 끝난 후 쥐를 위쪽에 열판이 있는 우리에 가두었다. 수영 경로를 이미지 분석기를 통해 컴퓨터와 연결된 비디오 카메라로 관찰하였다. 플랫폼에 닿기 위한 탈출 지연 시간 및 플랫폼을 찾기 위해 동물이 수영한 경로의 길이를 워터메이즈로 측정가능한 능력 중 습득 능력을 측정하기 위해 사용하였다. 수영속도=경로길이/탈출 지연 시간의 식을 이 실험에서 측정가능한 능력 중 래트의 운동 능력을 측정하기 위해 사용하였다. 플랫폼 위치를 재조정하기 위해 수조내에 플랫폼이 없이 60초간의 탐침 시도를 2일째에 시도하였다. 전회에 실험한 플랫폼의 위치에 걸리는 시간의 %를 관찰하였다.

MCAo 뇌졸중 수술: 모든 수술절차는 무균 조건하에서 수행하였다. MCAo 뇌졸중 수술절차는 문헌, 특히 C. Borlongan et al., "Chronic cyclosporine-A injection in rats with damaged blood-brain barrier does not impair retention of passive avoidance." Neurosci Res. 1998, 32:195-200에 따라 수행하였다. 각 동물에서의 성공적인 폐색의 측정은 레이저 도플러(Laser Doppler)를 사용하여 측정하였는데, 1시간 폐색 동안에 뇌혈류내 유의한 정도의 뇌혈류 감소(>75%)를 보였다. MCAo는 일관성있는 선조체 손상을 유발시켰다.

MCAl 뇌졸중 수술: MCAl 수술 절차는 Y. Wang et Ia., "Glial Cell-Derived Neurotrophic Factor Protects Against Ischemia-Induced Injury in the Cerebral Cortex." 1997, J. Neuroscience; 17 (11):4341-4348에 개괄적으로 기술되어 있다. 여기에서도 동맥 연결을 알아보기 위해 레이저 도플러를 사용하였다. MCAl은 일관성있는 피질 손상을 유발시켰다.

TGI 뇌졸중 수술: 4개 혈관 폐색 기술을 사용하였다. 깊은 마취 상태에서 동물에게 복부 정중 경부 절개술을 실시하였다. 제1경추의 알라포아미나(alar foramina)를 통해 척추 동맥을 분리하고, 마이크로클립을 사용하여 15분간 경동맥끼리 연결하였다. 이 기술은 완전 뇌허혈증을 발생시키는 데 사용되며 일관성 있는 해마 손상을 일으킨다.

뉴런성 전구체 세포: 뉴런성 전구체 세포는 SanBio, Inc. (Mountain View CA)에서 입수한 것이었다. 이 세포는 PCT/JP03/01260의 기술에 따라 일반적으로 생산된 것이다.

이식 절차: 모든 수술 절차는 무균 조건 하에서 수행하였다. 이퀴테신(3 ml/kg i.p.)으로 마취(통증반응에 대해 동물을 체크함)한 가운데, 26게이지 이식용 캐뉼러를 사용하여 MCAo에 대해서는 선조체에, MCAl에 대해서는 피질에, TGI에 대해서는 해마에 직접 NPC를 이식하였다. 참조: Y. Wang et al., "Glial Cell- Derived Neurotrophic Factor Protects Against Ischemia-Induced Injury in the Cerebral Cortex" 1997, J. Neuroscience; 17 (11):4341-4348 및 C. Borlongan et al., "Transplantation of cryopreserved human embryonal carcinoma-derived neurons (NT2N cells) promotes functional recovery in ischemic rats." Exp Neural. 1998;149:310-21. 냉동보관된 NPC를 본원에 기술된 방법을 사용하여 수득하였다. 트립토판 블루 배제법을 사용하여 생존한 세포 계수를, 이식전, 그리고 최종 수여 동물에게 이식한 직후 실시하였다. 미리 정해진 세포 투여량(40,000개, 100,000개 및 200,000개)은 생존한 세포수를 가리키는 것이다. 이식 수술은 세포 해동후 2시간 이내에 수행하였다. 주입 속도는 1분당 세포 용액 1 ㎕였다. 주입 후에 3분 동안 흡착되게 둔 다음 바늘을 빼내었다. 열판 및 직장체온계로 수술내내 그리고 마취에서 회복될 때까지 약 37℃로 체온을 유지하였다.

통계분석: 행동분석 데이터는 p < 0.05로 통계학적 유의도를 맞추어 반복측정 분산분석(repeated measures of ANOVA)을 사용하여 분석하였다. 사후검정Posthoc) 시험이 포함되었기에 처리 조건간의 유의한 차이(p's < 0.05)를 밝히기 위한 t-test는 생략되었다.

실시예 1: MCAo 결과- 이식후 4주간 매주 시험한 결과

시험 동물을 상기 기술한 MCAo 절차에 따라 처리하고, 이식후 4주간 매주 평가하였으며, 하기의 결과가 나왔다.

EBST: 이식후 4주간 매주 시험한 것에 대해 분산분석한 결과, 유의한 정도의 주요 처리 효과(F2,21 = 57.06, p < 0.0001)가 나타났다(도 1). 투여량 의존성인 유의한 효과(200,000 > 100,000 > 40,000)도 관찰되었다(p's < 0.01). 비대칭 운동은 기준에 비해 이식 후 4주동안 유의하게 감소되었는데(p's < 0.0001), 이식후 1주째에 가장 유의한 회복이 관찰되었으며(p's < 0.0001), 그 후 3주간에도 안정한 회복이 관찰되었다. 사후검정 시험 결과, 이식후 1주째 비대칭 운동의 유의한 감소는 3가지 세포 투여량 간에 서로 상이하지 않았지만, 이식후 2, 3, 및 4주째에는 투여량 의존성 효과(p's < 0.05)가 관찰되는 것으로 나타났다(도 2).

베더슨 시험: 이식후 4주간 매주 시험한 것에 대해 분산분석한 결과, 유의한 정도의 주요 처리 효과(F2,21 = 9.65, p < 0.001)가 나타났다(도 3). 200,000개 및 100,000개 세포의 높은 투여량은 40,000개 세포의 낮은 투여량보다 신경 장애 점수를 더 개선시켰다(p's < 0.01). 신경 장애 점수는 기준에 비해 이식 후 4주 동안 유의하게 감소하였는데(p's < 0.0001), 이식후 1주째에 비해 이식후 2, 3 및 4주째에 이식된 동물의 행동 능력이 더욱 나은 점으로 보아, 시간에 따라 개선되는 경향을 보인다(p's < 0.0001). 사후검정 시험 결과, 이식후 1주째 신경 장애 점수의 유의한 감소는 3가지 세포 투여량 간에 서로 상이하지 않았지만, 이식후 2주째에는 40,000개 세포의 낮은 투여량에 비해, 100,000개 및 200,000개의 높은 투여량이 더 높은 회복율을 보였으며(p's < 0.05), 투여량 의존성 효과(200,000 > 100,000 > 40,000)(p's < 0.05)가 이식 후 3주 및 4주째에 관찰되는 것으로 나타났다(도 4).

MWM 습득 능력 시험: 이식후 4주간 매주 시험한 것에 대해 분산분석한 결과, 유의한 정도의 주요 처리 효과(F2,21 = 2.87, p = 0.08)를 나타내지 않았다(도 5). 기준 및 이식후 1주째에 비해, 이식후 2, 3, 4주째에서 더욱 습득 시간이 긴 것으로 보아, 이식후 4주 동안에 MWM 습득 시간은 시간이 지날수록 더욱 길어지는 경향이 있는 것으로 보인다(p's < 0.01)(도 6).

MWM 탐침 시험: 플랫폼을 찾기 위해 걸리는 시간. 이식후 4주간 매주 시험한 것에 대해 분산분석한 결과, 유의한 정도의 주요 처리 효과(F2,21 = 61.33, p < 0.0001)를 나타내었다(도 7). 200,000개 및 100,000개 세포의 높은 투여량은 40,000개 세포의 낮은 투여량에 비해 플랫폼을 찾는 데에 걸린 시간을 상당히 단축시켰다(p's < 0.0001). 기준에 비해, 이식후 4주 동안 플랫폼을 찾는 데 걸린 시간이 유의하게 감소하였는데(p's < 0.0001), 이식후 1주째에 비해 이식후 2, 3, 4주 째에 이식된 동물의 행동 능력이 더욱 나은 것으로 보아, 시간에 따라 더욱 개선되는 경향을 가진다(p's < 0.0001). 사후검정 시험 결과, 이식 후 4주 동안 40,000개 세포의 낮은 투여량보다, 200,000개 및 100,000개의 높은 투여량이 플랫폼을 찾는 시간을 유의하게 단축시켰으며, 이식 후 1주 및 4주째에 명백한 투여량 의존성 반응(200,000 > 100,000 > 40,000)(p's < 0.05)이 관찰되는 것으로 나타났다(도 8).

MWM 탐침 시험: 플랫폼 지역에 머무는 시간. 이식후 4주간 매주 시험한 것 대해 분산분석한 결과, 유의한 정도의 주요 처리 효과(F2,21 = 15.19, p < 0.0001)가 나타났다(도 9). 200,000개 및 100,000개 세포의 높은 투여량은 40,000개 세포의 낮은 투여량에 비해 플랫폼 지역에 머무는 시간을 유의하게 연장시켰다(p's < 0.01). 기준에 비해, 이식후 4주 동안 플랫폼 지역에 머무는 시간이 유의하게 증가하였고(p's < 0.0001), 이식후 1주 및 2주째에 비해 이식후 3주 및 4주째에 이식된 동물의 행동 능력이 더 나아진 점으로 보아, 시간에 따라 더욱 개선되는 경향을 가진다(p's < 0.0001). 사후검정 시험 결과, 이식 후 4주 동안 40,000개 세포의 낮은 투여량보다, 200,000개 및 100,000개의 높은 투여량이 플랫폼 지역에 머무는 시간을 유의하게 연장시키는 것으로 나타났다(p's < 0.05)(도 10).

실시예 2: MCAl 결과- 이식후 4주간 매주 시험한 결과

시험 동물을 상기 기술한 MCAl 절차에 따라 처리하고, 이식후 4주간 매주 평가하였으며, 하기의 결과가 나왔다.

EBST: 이식후 4주간 매주 시험한 것에 대해 분산분석한 결과, 유의한 정도의 주요 처리 효과(F2,24 = 76.30, p < 0.0001)가 나타났다(도 11). 200,000개 및 100,000개 세포의 높은 투여량이 40,000개 세포의 낮은 투여량보다 비대칭 운동으로부터 더 잘 회복되었다(p's < 0.0001). 비대칭 운동은 기준에 비해 이식 후 4주 동안 유의하게 감소되었으며(p's < 0.0001), 이식후 2, 3, 4주째에 더욱 나은 회복을 보였다. 사후검정 시험 결과, 높은 투여량의 세포가 낮은 투여량에 비해서 비대칭 운동을 유의하게 감소시켰고, 투여량 의존성 효과(200,000 > 100,000 > 40,000)(p's < 0.05)가 이식후 1주째에 관찰되는 것으로 나타났다(도 12).

베더슨 시험: 이식후 4주간 매주 시험한 것에 대해 분산분석한 결과, 유의한 정도의 주요 처리 효과(F2,24 = 3.65, p < 0.05)가 나타났다(도 13). 200,000개 세포의 높은 투여량은 40,000개 세포의 낮은 투여량보다 신경 장애 점수를 더욱 개선시켰지만(p's < 0.05), 100,000개 세포의 중간 투여량과 40,000개 세포의 낮은 투여량간에는 유의한 차이가 발견되지 않았다(도 13). 신경 장애 점수는 기준에 비해 이식 후 4주 동안 유의하게 감소하였고(p's < 0.0001), 세포 투여량이 매주 측정한 신경 점수와는 유의한 차이가 없어서, 시간에 따라 안정하였다(p's > 0.005). 사후검정 시험 결과, 200,000개 세포의 가장 높은 투여량이 3주 및 4주째에 40,000개 세포의 낮은 투여량에 비해 더욱 나은 회복을 보였으며, 이식 후 초기에 세포 투여량간의 유의한 차이점은 발견되지 않는 것으로 나타났다(p's > 0.05)(도 14).

MWM 습득 능력 시험: 이식후 4주간 매주 시험한 것에 대해 분산분석한 결과, 유의한 정도의 주요 처리 효과(F2,24 = 5.78-16, p > 0.05)가 나타나지 않았다(도 15). 기준에 비해, 이식후 1, 2, 3, 4주째에서 더욱 습득 시간이 긴 것으로 보아, 이식 후 4주 동안에 MWM 습득 시간은 시간이 지날수록 더욱 길어지는 경향이 있는 것으로 보인다(p's < 0.0001)(도 16).

MWM 탐침 시험: 플랫폼을 찾기 위해 걸리는 시간. 이식후 4주간 매주 시험한 것에 대해 분산분석한 결과, 유의한 정도의 주요 처리 효과(F2,24 = 0.62, p = 0.55)가 나타나지 않았다(도 17). 이식후 시간에 따라, 플랫폼에 위치하는 데 유의하게 연장된 시간이 주목되었다(p's < 0.001)(도 18).

MWM 탐침 시험: 플랫폼 지역에 머무는 시간. 이식후 4주간 매주 시험한 것에 대해 분산분석한 결과, 유의한 정도의 주요 처리 효과(F2,24 = 2.01, p = 0.16)가 나타나지 않았다(도 19). 기준에 비해 이식후 4주간 동안 플랫폼 지역에 머무는 시간이 더 연장되는 경향이 있었지만(p's < 0.001), 일시적인 투여량 의존성 효과는 이식 후 1주에만 관찰되었으며(p's < 0.05), 시험된 다른 기간에는 관찰되지 않았다(p's > 0.05)(도 20).

실시예 3: TGI 결과- 이식후 4주간 매주 시험한 결과

시험 동물을 상기 기술한 TGI 절차에 따라 처리하고, 이식후 4주간 매주 평가하였으며, 하기의 결과가 나왔다.

베더슨 시험: 이식후 4주간 매주 시험한 것에 대해 분산분석한 결과, 유의한 정도의 주요 처리 효과(F2,23 = 47.33, p < 0.001)가 나타났다(도 21). 200,000개 세포 및 100,000개 세포의 높은 투여량은 40,000개 세포의 낮은 투여량보다 신경 장애 점수를 더욱 개선시켰다(p's < 0.0001), 신경 장애 점수는 기준에 비해 이식후 4주 동안 유의하게 감소하였다(p's < 0.0001). 사후검정 시험 결과, 이식후 1주째에 신경 장애 점수의 유의한 감소는 3가지의 세포 투여량간에 상이하지 않았지 만, 100,000개 및 200,000개의 높은 투여량은 이식후 2, 3, 4주째에는 40,000개 세포의 낮은 투여량보다 회복율이 좋았으며(p's < 0.005), 투여량 의존성 효과(200,000 > 100,000 > 40,000)(p's < 0.05)도 이식후 4주째에 관찰되는 것으로 나타났다(도 22).

MWM 습득 능력 시험: 이식후 4주간 매주 시험한 것에 대해 분산분석한 결과, 유의한 정도의 주요 처리 효과(F2,23 = 9.88, p < 0.001)가 나타났다(도 23). 그러나, 유의한 처리 효과는 200,000개 세포의 높은 투여량이 나머지 100,000개 및 40,000개 세포의 투여량에 비해 이식후 1주째에 습득 능력을 일시적으로 유의하게 개선시켰기 때문이다(p's < 0.005). 이후에는 이식후 2, 3, 4주째에 기준 및 이식후 1주째에 비해 더욱 긴 습득 시간이 관찰되었다(p's < 0.005)(도 24).

MWM 탐침 시험: 플랫폼을 찾기 위해 걸리는 시간. 이식후 4주간 매주 시험한 것에 대해 분산분석한 결과, 유의한 정도의 주요 처리 효과(F2,23 = 30.98, p < 0.0001)가 나타났다(도 25). 200,000개 및 100,000개 세포의 높은 투여량이 40,000개 세포의 낮은 투여량보다 플랫폼을 찾는 시간을 더욱 단축시켰다(p's < 0.0001). 기준에 비해서 이식후 4주 동안 플랫폼을 찾는 데 걸린 시간은 유의하게 단축되었으며(p's < 0.0001), 이식된 동물의 행동 능력이 이식후 1주 및 2주째에 비해 이식후 3주 및 4주째에 더욱 나은 것으로 보아 시간에 따라 개선되는 경향을 보인다(p's < 0.0001). 사후검정 시험 결과, 이식후 2주 및 3주째에는 200,000개 세포의 높은 투여량이 나머지 100,000개 및 40,000개 세포 투여량에 비해 플랫폼을 찾는 데 걸린 시간을 단축시키는 것으로 나타났지만(p's < 0.05), 이식후 4주째에는 낮은 세포 투여량에 비해 두개의 높은 세포 투여량이 플랫폼을 찾는 데 걸린 시간을 더욱 단축시킨 것으로 나타났다(p's < 0.05)(도 26).

MWM 탐침 시험: 플랫폼 지역에 머무는 시간. 이식후 4주간 매주 시험한 것에 대해 분산분석한 결과, 유의한 정도의 주요 처리 효과(F2,23 = 54.06, p < 0.0001)가 나타났다(도 27). 유의한 투여량 의존성 효과(200,000 > 100,000 > 40,000)가 이식후 4주 동안에 관찰되었다(p's < 0.0001). 더구나, 이식후 4주 동안에 플랫폼 지역에 머무는 시간이 더욱 연장되었다(p's < 0.0001). 사후검정 시험 결과, 200,000개 및 100,000개 세포의 높은 투여량이 이식후 3주 및 4주째에 40,000개 세포의 낮은 투여량보다 플랫폼 지역에 머무는 시간을 유의하게 연장시키는 것으로 나타났다(p's < 0.05). 이식후 2주째에, 오로지 가장 높은 세포 투여량만이 나머지 두가지 세포 투여량에 비해 플랫폼 지역에 머무는 시간을 유의하게 연장시켰다(p's < 0.05)(도 28).

실시예 4: 이식후 5주째에 조직검사한 결과

무작위로 선택한 동물을 이식후 5주째에 안락사시켰다(표 3 참조). 각 투여량 및 뇌졸중 유형에 대해 2-3가지 뇌 표본으로 한정하여 조직검사하였다. 따라서, 정량적 분석은 GFP 형광반응에 기초하여 이식편 생존 및 이동에 대해서만 수행될 수 있었다. 다른 조직학적 파라미터, 특히 표현형 발현을 검출하기 위해 상이한 항체 마커를 사용하는 것에 대해서는 개괄적으로만 서술하였다.

NPC 이식편 생존: GFP 형광분석은 3가지 유형의 뇌졸중 간에 투여량 의존성 이식편 생존(200,000 > 100,000 > 40,000)을 나타내었다(F8,32 = 33.9, p < 0.0001 )(도 29). GFP 양성 반응을 보이는 평균 세포수를 계수한 결과, 40,000개 세포의 낮은 투여량은 적은 수의 생존한 GFP 양성 반응 이식편을 생성시키는 반면, 100,000개 및 200,000개의 높은 투여량은 많은 수의 GFP 양성 이식편을 생성시키는 것으로 드러났다. 이러한 관찰결과는 MCAo, MCAl 및 TGI 이식된 동물에서도 마찬가지였다. 그러나, 각 세포 투여량에 대해 계산한 경우 이식편 생존율에 대한 유의한 차이(F8,32 = 1.67, p > 0.05)는 3가지 투여량 간에 관찰되지 않았다(도 30).

이식후 5주째 조직검사
이식편 유형	세포 투여량	뇌졸중 유형	표본 크기
NPC	40,000	MCAo MCAl TGI	4 5 4
	100,000	MCAo MCAl TGI	5 5 4
	200,000	MCAo MCAl TGI	5 5 4

이식편 생존과 기능 회복 간에는 비례적인 상관관계가 성립된다: 회귀(regression) 분석 결과, 생존한 NPC 이식편이 많을 수록 (200,000 > 100,000 > 40,000), 더욱 나은 기능 회복을 보이는 것으로 나타났다(도 31).

NPC 이식편 이동: GFP 형광분석 결과, 이식된 세포의 대부분(대략 55% 내지 85%)이 원래의 이식 부위에 남아있는 것으로 나타났다(도 32). MCAo 이식된 동물에서 몇몇 GFP 양성 세포는 원래의 이식 부위인 선조체내에서 쉽게 동정될 수 있으며(62%), MCAl 이식된 동물에서 GFP 양성 세포는 원래의 이식 부위인 피질내에 남아있으며(53%), TGI 이식된 동물에서 GFP 양성 세포는 원래의 이식 부위인 해마내에 남아있다(86%). 하지만, MCAo 및 MCAl 이식된 동물은 TGI 이식된 동물에 비해 이식된 세포를 더욱 많이 이동시키는 것으로 보인다. 물론 이동이 관찰될 때에도 이식된 세포는 일반적인 표적 부위내에 남아있는데, 즉 MCAo의 이식편 이동은 선조체 내에서, MCAl의 경우에는 피질내에서, TGI의 경우에는 해마 내에서 관찰된다. MCAo 및 MCAl에서의 이식편 이동은 각각 선조체 및 피질내 허혈성 경계를 받치고 있는 이식편 세포에 의해 특징분석된다. MCAo에 대해서는 추가로 선조체 허혈성 경계를 따라 세포가 중간에서 측면으로(1.8 mm), 그리고 배쪽에서 등쪽으로(2.3 mm) 이동하는 것이 관찰되었다. MCAl에 대해서는, 세포가 중간에서 측면으로 (4.4 mm) 이동하는 것이 관찰되었다. TGI 이식된 동물에 대해서는 이식편 이동은 CA2 및 CA3 영역(각각 원래의 CA1 이식 부위로부터 1.6 mm 및 0.7 mm 떨어져 있는 부위)에서 동정되는 GFP 양성 SBDP에 의해 특징분석되었다.

NPC 표현형 발현: 이식된 NPC 세포는 GFAP에 대해 양성반응하였고(약 5%), 매우 적은 수의 세포(하나의 뇌에 2-5개의 세포)가 NeuN에 양성반응하였다. 이러한 마커는 GFP와 같은 공간에 위치한다. 이러한 것은 모든 종류의 투여량 및 모든 유형의 뇌졸중에서도 마찬가지로 관찰된다.

실시예 5: 이식후 12주째 MCAo 수행한 결과

이식후 12주가 지난 시점에 상기와 같이 TGI 절차를 수행한 시험 동물을 평가하였으며, 다음과 같은 결과가 나왔다.

EBST: 이식후 12주 시험한 것에 대해 분산분석한 결과, 유의한 주요 처리 효과(F2,9 = 11.84, p < 0.005)가 나타났다(도 32). 사후검정 시험 결과, 기준에 비해 이식후 12주째에 비대칭 운동은 유의하게 감소된 것으로 드러났다(p < 0.001).

베더슨 시험: 이식후 12주 시험한 것에 대해 분산분석한 결과, 유의한 주요 처리 효과(F2,9 = 41.83, p < 0.001)가 나타났다(도 32). 사후검정 시험 결과, 기준에 비해 이식후 12주째에 신경 장애는 유의하게 감소된 것으로 드러났다(p < 0.001).

MWM 습득 능력 검사: 이식후 12주 시험한 것에 대해 분산분석한 결과, 유의한 주요 처리 효과(F2,9 = 0.36, p = 0.71)가 나타나지 않았다(도 33). 이러한 결과는 기준과 이식후 12주 간의 MWM 습득 능력에 유의한 차이가 없다는 것을 말한다.

MWM 탐침 시험: 플랫폼을 찾는데 걸린 시간. 이식후 12주 시험한 것에 대해 분산분석한 결과, 유의한 주요 처리 효과(F2,9 = 6.18, p < 0.05)가 나타났다(도 33). 사후검정 시험 결과, 기준에 비해 이식후 12주째에서 플랫폼을 찾는데 걸린 시간이 유의하게 단축된 것으로 나타났다(p < 0.001).

MWM 탐침 시험: 플랫폼 지역에 머무는 시간. 이식후 12주 시험한 것에 대해 분산분석한 결과, 유의한 주요 처리 효과(F2,9 = 6.18, p < 0.05)가 나타났다(도 33). 사후검정 시험 결과, 기준에 비해 이식후 12주째에서 플랫폼 지역에 머무는 시간이 유의하게 연장된 것으로 드러났다(p < 0.001).

실시예 6: 이식후 12주째 MCAl 수행한 결과

이식후 12주가 지난 시점에 상기와 같이 MCAl 절차를 수행한 시험 동물을 평가하였으며, 다음과 같은 결과가 나왔다.

EBST: 이식후 12주 시험한 것에 대해 분산분석한 결과, 유의한 주요 처리 효과(F2,9 = 23.02, p < 0.0005)가 나타났다(도 34). 사후검정 시험 결과, 기준에 비해 이식후 12주째에 비대칭 운동은 유의하게 감소된 것으로 드러났다(p < 0.0001).

베더슨 시험: 이식후 12주 시험한 것에 대해 분산분석한 결과, 유의한 주요 처리 효과(F2,9 = 9.29, p < 0.01)가 나타났다(도 34). 사후검정 시험 결과, 기준에 비해 이식후 12주째에 신경 장애는 유의하게 감소된 것으로 드러났다(p < 0.0001).

MWM 습득 능력 시험: 이식후 12주 시험한 것에 대해 분산분석한 결과, 유의한 주요 처리 효과(F2,9 = 1.37, p = 0.30)가 나타나지 않았다(도 35). 이러한 결과는 기준과 이식후 12주 간의 MWM 습득 능력에 유의한 차이가 없다는 것을 말한다.

MWM 탐침 시험: 플랫폼을 찾는데 걸린 시간. 이식후 12주 시험한 것에 대해 분산분석한 결과, 유의한 주요 처리 효과(F2,9 = 0.26, p =0.78)가 나타나지 않았다(도 35). 이러한 결과는 기준과 이식후 12주 간의 MWM 탐침 시험, 즉 플랫폼이 있는 시험에서 유의한 차이가 없다는 것을 말한다.

MWM 탐침 시험: 플랫폼 지역에 머무는 시간. 이식후 12주 시험한 것에 대해 분산분석한 결과, 유의한 주요 처리 효과(F2,9 = 0.15, p = 0.86)가 나타나지 않았다(도 35). 이러한 결과는 기준과 이식후 12주 간의 MWM 탐침 시험, 즉 플랫폼이 없는 시험에서 유의한 차이가 없다는 것을 말한다.

실시예 7: 이식후 12주째 TGI 수행한 결과

베더슨 시험: 이식후 12주 시험한 것에 대해 분산분석한 결과, 유의한 주요 처리 효과(F2,9 = 184.02, p < 0.0001)가 나타났다(도 36). 사후검정 시험 결과, 기준에 비해 이식후 12주째에 신경 장애는 유의하게 감소된 것으로 드러났다(p < 0.0001).

MWM 습득 능력 시험: 이식후 12주 시험한 것에 대해 분산분석한 결과, 유의한 주요 처리 효과(F2,9 = 0.36, p = 0.74)가 나타나지 않았다(도 37). 이러한 결과는 기준과 이식후 12주 간의 MWM 습득 능력에 유의한 차이가 없다는 것을 말한다.

MWM 탐침 시험: 플랫폼을 찾는데 걸린 시간. 이식후 12주 시험한 것에 대해 분산분석한 결과, 유의한 주요 처리 효과(F2,9 = 5.14, p < 0.05)가 나타났다(도 37). 사후검정 시험 결과, 기준에 비해 이식후 12주째에서 플랫폼을 찾는데 걸린 시간이 유의하게 단축된 것으로 나타났다(p < 0.0001).

MWM 탐침 시험: 플랫폼 지역에 머무는 시간. 이식후 12주 시험한 것에 대해 분산분석한 결과, 유의한 주요 처리 효과(F2,9 = 4.39, p < 0.05)가 나타났다(도 37). 사후검정 시험 결과, 기준에 비해 이식후 12주째에서 플랫폼 지역에 머무는 시간이 유의하게 연장된 것으로 드러났다(p < 0.0001).

실시예 8: 이식후 12주째에 조직검사한 결과

무작위로 선택한 동물을 이식후 12주째에 안락사시켰다(표 4 참조). GFP 형광분석, 그리고 다른 면역조직화학적 파라미터, 특히 표현형 발현을 검출하기 위한 각종 항체 마커를 사용하는 것에 기초한 이식편 생존과 이동의 정량분석을 수행하였다.

이식후 12주째 조직검사
이식편 유형	세포 투여량	뇌졸중 유형	표본 크기
NPC	40,000	MCAo MCAl TGI	4 4 4
	100,000	MCAo MCAl TGI	4 4 4
	200,000	MCAo MCAl TGI	4 4 4

NPC 이식편 생존: GFP 형광분석은 3가지 유형의 뇌졸중 간에 부분적인 투여량 의존성 이식편 생존(200,000 = 100,000 > 40,000)을 나타내었다(F8,27 = 14.88, p < 0.0001 )(도 38). GFP 양성 반응을 보이는 평균 세포수를 계수한 결과, 40,000개 세포의 낮은 투여량은 적은 수의 생존한 GFP 양성 반응 이식편을 생성시키는 반면, 100,000개 및 200,000개의 높은 투여량은 많은 수의 GFP 양성 이식편을 생성시키는 것으로 드러났다. 이러한 관찰결과는 MCAo, MCAl 및 TGI 이식된 동물에서도 마찬가지였다. 그러나, 각 세포 투여량에 대해 계산한 경우 3가지 투여량 간에 이식편 생존율에 대한 유의한 차이(F8,27 = 1.37, p > 0.05)는 관찰되지 않았다(도 39). 이는 낮은 투여량 및 높은 투여량에서의 이식편 생존율은 잠재적으로 CsA 면역억제제에 의해 유지되고 있음을 뒷받침한다.

NPC 이식편 이동: 이식후 5주째 시험 결과와 마찬가지로, GFP 형광분석 결과, 이식된 세포의 대부분(대략 65% 내지 90%)이 원래의 이식 부위에 남아있는 것으로 나타났다. MCAo 이식된 동물에서 몇몇 GFP 양성 세포는 원래의 이식 부위인 선조체 내에서 쉽게 동정될 수 있으며(72%), MCAl 이식된 동물에서 GFP 양성 세포는 원래의 이식 부위인 피질내에 남아있으며(64%), TGI 이식된 동물에서 GFP 양성 세포는 원래의 이식 부위인 해마내에 남아있다(91%). 하지만, MCAo 및 MCAl 이식된 동물은 TGI 이식된 동물에 비해 이식된 세포를 더욱 많이 이동시키는 것으로 보인다. 또한 이동이 관찰될 때도 이식된 세포는 일반적인 표적 부위내에 남아있는데, 즉 MCAo의 이식편 이동은 선조체 내에서, MCAl의 경우에는 피질내에서, TGI의 경우에는 해마 내에서 관찰된다. 또 MCAo 및 MCAl에서의 이식편 이동은 각각 선조체 및 피질내 허혈성 경계를 받치고 있는 이식편 세포에 의해 특징분석되었다. MCAo에 대해서는 추가로 선조체 허혈성 경계를 따라 세포가 중간에서 측면으로(2.0 mm), 그리고 배쪽에서 등쪽으로(2.5 mm) 이동하는 것이 관찰되었다. MCAl에 대해서는, 세포가 중간에서 측면으로 (4.5 mm) 이동하는 것이 관찰되었다. TGI 이식된 동물에 대해서는 이식편 이동은 CA2 및 CA3 영역(각각 원래의 CA1 이식 부위로부터 1.6 mm 및 0.8 mm 떨어져 있는 부위)에서 동정되는 GFP 양성 SBDP에 의해 특징분석되었다.

NPC 표현형 발현: 뇌졸중 유형 및 투여량을 통틀어, 대략의 생존율은 15%이다. 원래의 이식된 부위내에서, 세포 대부분은 구슬 모양으로 남아있으며, NeuN이나 GFAP에 대해 양성반응하지 않는다. 하지만, MCAo 이식된 동물에서, 이러한 세포 중 적은 수는 NeuN 및 GFAP에 대해 양성반응을 보인다. MCAo, MCAl, 및 TGI 이식된 동물의 각각 선조체 경계, 피질 경계 및 CA3 경계를 따라 이동한 GFP 양성 세포를 검출하였다. 결국에는 NeuN 면역염색 결과, 이러한 세포들이 성숙한 뉴런에 대한 마커를 발현하는 것으로 나타났다. 종합하면, 생존한 GFP 양성 세포의 약 25%는 뇌졸중 유형 및 투여량을 통틀어 NeuN 양성반응을 보이고, 이식 부위에서 멀리 이동한 세포내에서는 약 60%가 NeuN 양성이다. 이러한 세포는 뉴런성 세포 형태를 보이는데, 그 특징은 MCAo 이식된 동물에 풍부한 엘라보레이트(elaborate) 및 긴 돌기들이다. 추가로 GFP 형광분석하여 현미경으로 관찰한 결과, 각 뇌졸중 유형에서 발견되는 각각 다른 뉴런성 세포 형태 뿐 아니라, NPC 이식편 세포 대 세포의 접촉이 나타났다. 일부 세포(모든 뇌졸중 유형 및 투여량을 통틀어 약 5%)는 GFAP 염색에 의해 확인되는 글리아 세포의 형태를 보인다. 전부는 아니더라도 대부분의 GFAP 양성 세포는 혈관 근처 또는 내부에서 관찰되었다.

이식편-숙주 조직 병리검사: 선조체, 피질, 또는 해마에서 니슬 염색을 사용한 결과 종양 형성에 대한 증거는 보이지 않았다.

실시예 9: 뇌졸중 모델에서 추가의 NPC 시험

본 연구의 목적은 뇌졸중 동물에서 NPC의 치료 효과를 검사하기 위한 것이다. 이식받은 뇌졸중 동물의 운동 및 신경 기능을 검사하기 위하여 행동 시험을 사용하였다. 뇌졸중이 발생한 후 1개월 후에 이식을 수행하였고, 동물은 생존해 있는 이식후 1개월 동안 매일 사이클로스포린-A(CsA, 10 mg/kg, i.p.)로 면역억제제 처리하였다. 이식받은 래트의 운동 및 신경 기능에 대해 이식 후 7일, 14일, 및 28일째에 분석하였다. 효과적인 NPC 투여량 범위를 정함으로써, 운동 및 신경 기능을 사용하여 성공적인 이식 결과를 평가하였다.

3가지 처리 조건, 즉, 0(배지만 존재), 낮은 투여량(90k NPC), 및 높은 투여량(180k NPC)이 있었다. 각 처리 조건에 대한 동물의 수는 통계학적 분석을 위해 요구되는 표본 크기에 상응한다(n=그룹당 10). 행동 장애에 대한 기준(75%의 편향된 스윙과 신경 검사에서 2.5점의 점수)을 만족하지 못하는 동물은 본 연구에서 제외시켰다. 따라서 상기의 범주를 만족하거나 이 범주를 초과하는 동물만이 본 연구에 포함되었다. 전형적으로는 대부분의 뇌졸중 동물이 이러한 범주에 포함되었으며, 최종적인 통계 분석을 제공하기 위하여는 적어도 8마리의 개체가 요구되었다. 모든 동물은 면역억제제(10 mg/kg CsA, i.p. 매일)로 연구하는 내내 처리하였다.

모든 동물에는 처음에 MCAo 뇌졸중 수술을 하였다. 수술 후 4주가 지난 시점에 동물을 EBST로 시험한 다음에, 한 시간 후에 베더슨 신경 시험을 수행하였다. 유의한 운동 및 신경 장애를 보이는 동물만을 다음 절차의 이식 수술에 사용하였고, 하기의 처리 중 하나의 처리 조건에 무작위로 투입하였다.

처리 조건
이식편 유형	세포 투여량	뇌졸중 유형	표본 크기
NPC	90,000	MCAo	10
NPC	180,000	MCAo	10
베히클	0	MCAo	10
주: 모든 동물은 뇌졸중 수술을 하였고, 선조체(MCAo) 이식을 받았으며, CsA로 처리하였다.

이식후 7, 14 및 28일째에 행동 시험과 동일한 시험을 다시 동물에게 수행하였다. 보다 명확히 하기 위해 개략적 흐름도를 하기에 제공한다.

실험절차의 흐름도

뇌졸중 수술 ↓ 행동 시험 (뇌졸중 후 1개월째; 일정 범주에 이르거나 범주를 초과하는 동물만을 연구에 포함시켰음) ↓ 이식(뇌졸중 후 1개월째) ↓ 행동 시험( 이식후 7, 14, 및 28일째 실시)

모든 수술 절차는 무균 조건 하에 수행하였다. 동물을 이퀴테신(300 mg/kg, i.p.)으로 마취하고 통증 반사에 대해 확인하였다. 깊은 마취 상태에서, 동물에 MCA 폐색 수술을 시행하였다. MCA 폐색 기술은 경동맥 속에 수술용 필라멘트를 삽입하여 MCA 틈에 이르게 하여, 경동맥으로부터의 혈류 뿐 아니라 윌리스(Willis) 순환으로부터의 혈류를 차단하는 것을 포함한다. 우경동맥을 확인하고 복부 정중 경부 절개법을 사용하여 분리해낸다. 필라멘트 크기는 4-0이고, 멸균처리되고 비흡습성인 수술사(Ethicon, Inc)로 만들어진 것으로서 수술사 끝의 직경은 고무 시멘트를 사용하여 24 내지 26게이지 크기까지 점점 가늘어지게 만들어진 것이다. 약 15 내지 17 mm의 수술용 필라멘트를 외경동맥 및 내경동맥의 틈에 삽입하여 MCA를 차단한다. 우측 MCA를 한시간 동안 폐색한다. MCA를 한시간 동안 폐색하면 보통은 최대한의 경색증이 유발된다. 뿐만 아니라, 삽입물 길이 및 끝의 크기는 250 내지 350 g 중량의 동물에서 완전한 MCA 폐색을 유발시키는 것으로 밝혀졌다. 열판 및 직장항문계를 사용하여 체온을 정상수준으로 유지하였다. 성공적인 폐색과 관류차단을 확인하기 위해 레이저 도플러를 사용하였다. 도플러 탐침을 예상되는 경색증 부위(AP: +2.0, ML: ±2.0, 및 DV: -4.0 mm) 바로 위에 있는 뇌막에 배치하여 폐색 전, 폐색 도중, 및 폐색 후의 뇌 혈류를 측정하였다.

모든 수술 절차는 무균 조건 하에 수행하였다. 이퀴테신(3 ml/kg i.p.)으로 마취(통증 반응에 대해 동물을 체크함)한 가운데, 28게이지의 이식용 캐뉼러를 사용하여 선조체에 직접(브레그마에 대해서는 0.5 mm 앞쪽, 정중선에 대해서는 2.8 mm 옆쪽, 그리고 뇌막 표면 아래로 5.0 mmm) NPC 또는 베히클을 동물에 이식하였다. 냉동보존한 인간 NPC를 SanBio, Inc에서 입수하여 이식 수술에 사용하기 직전에 해동시켰다. 이식에 앞서, 그리고 최종적인 동물 수여체에게 이식한 직후에, 생존한 세포 수를 트립토판 블루 배제법을 사용하여 계수하였다. 미리 정해진 세포 투여량(90,000 및 180,000)은 유효 치료 투여량 범위를 결정하는 예비연구(pilot study)에 근거하여 정하여진 것이었다.

이식 수술은 세포를 해동시킨 후 2시간 이내에 수행하였다. 주입 속도는 1분당 세포 용액 1 ㎕였다. 주입 후에, 3분간의 흡착시간을 둔 다음, 니들을 빼내었다. 하나의 니들 통로가 사용되었지만, 3개의 저장소가 있고, 각 부위에는 3 ul의 세포용액이 수용된다. 수술하는 동안 그리고 마취에서 회복된 후 열판 및 직장 체온계로 체온을 약 37℃로 유지하였다.

1시간 MCAo 뇌졸중 수술은, 각각 EBST 및 베더슨 시험에서 유의하게 편향된 스윙 활동과 신경 장애에서 나타내어지는 바와 같이, 뇌졸중 전의 기능에 비해 뇌졸중 후 1개월째에 일관되는 행동 장애를 유발하였다. 뇌졸중 전과 뇌졸중 후의 동물 행동 간에 짝을 지워 비교한 결과, 본 연구에 포함된 모든 뇌졸중 동물에서는 상기의 두 시험에서 유의한 장애를 보이는 것으로 나타났다(p's < 0.0001).

뇌졸중 동물을 베히클, 낮은 용량의 90k NPC, 또는 높은 용량의 NPC로 무작위 처리한 것을 분산분석한 결과, 모든 시험에 대해 유의한 처리 효과가 나타났다(p's < 0.0001). 처리군과 짝을 지워 비교한 결과, 이식후 7일째라는 이른 시기에, NCP를 이식받은 뇌졸중 동물은 투여량에 관계없이 베히클로 처리된 뇌줄중 동물에 비해 행동 장애가 유의한 정도가 완화된 것으로 나타났다(p's < 0.05). 이러한 NPC 이식된 뇌줄중 동물의 행동 장애 회복은 이식후 14일째 및 28일째에도 유지되었으며, 이는 NPC GFU가 또한 투여량에 관계 없이 베히클 처리된 것에 비교하여 운동 및 신경 장애를 유의한 정도로 억제시킨 것으로 보인다(p's < 0.0001). 두가지 NPC 투여량을 더 자세히 시험해본 결과, 높은 투여량인 180k가 이식후 EBST를 시험한 시험일을 통틀어(p's < 0.01), 그리고 이식후 베더슨 시험한 이식후 14일째 및 28일째에(p's < 0.0005), 낮은 투여량인 90k에 비해 행동 장애를 유의한 정도로 완화시키는 것으로 드러났다. 결과를 도 44 및 45에 나타내었다.

본 행동 능력 데이터는 행동 능력 회복이 이식후 7일째라는 이른 시기에 검출되었다는 점에서 NPC의 가장 유의한 치료 효과를 증명한다. 결과를 검토한 결과 또한 NPC 이식편의 양성 효과는 이식후 28일째까지(연구가 끝난 시기까지) 안정하다는 점이 드러났다. 낮은 투여량 및 높은 투여량의 NPC 모두 기능 회복을 촉진하지만, 낮은 투여량 보다는 높은 투여량이 행동 능력 회복을 더욱 유의한 정도로 촉진한다.

본 연구에서의 모든 뇌졸중 동물은 면역억제제로 처리하였다. 베히클로 처리된 뇌줄종 동물은 관찰가능한 행동 능력 회복을 보이지 않았기 때문에, 여기에서는 뇌졸중이 걸리기 전, 뇌졸중이 진행되는 동안, 또는 뇌졸중이 걸린 직후에 약물을 전달하는 과정을 포함한 이전의 연구에서 보이는 바와 같은 면역억제제 CsA의 유리한 효과를 도입하여야 할 필요가 없다. NPC 이식된 뇌졸중 동물에 한해 행동 능력 회복이 관찰된 것은, 치료 효과의 원인이 면역억제제 때문이 아니고 이식된 세포 때문인 것을 나타낸다.

헤마톡실린 및 에오신(H & E) 및 니슬 염색을 수행하고 NIH 이미징 시스템을 사용하여 각 동물에서 최대한의 뇌경색을 보이는 부위를 측정하였다. 뇌경색을 보이는 부피를 계산하기 위하여, 2 mm(절편 두께) x (모든 뇌 절편내 뇌경색 부위의 합(mm²)의 식을 사용하였다.

이식후 1개월째에, 면역조직화학적 검사를 위해 무작위로 선택한 동물을 안락사시켰다. 조직을 하기의 절차를 사용하는 표준 ABC 방법을 사용하여 처리하였다. 20 μm의 냉동보관한 조직 절편을 4배 비율로 검사하고 PC 기반 Image Tool 컴퓨터 프로그램을 사용하여 디지털화하였다. 뇌 절편을 무작위로 암호화(blind-coded)하고 면역양성 반응을 보이는 세포의 총수를 계산하기 위해 아베크롬비 식을 사용하였다.

이식후 생존한 NPC를 모노클로날 인간 특이적 항체인 HuNu를 사용하여 측정하였는데, 이 항체는 인간 세포 표면 마커로서 설치류 세포 표면이나 다른 설치류 단백질과는 크로스 반응하지 않는 것이 특징이다. 뉴런성, 글리아 및 올리고덴드로사이트 표현형을 세포 이식편내에서 발현하는지 검출하기 위하여, 면역조직화학적 분석인 Neu-N 및 GFAP를 각각 사용하였다. 이러한 세포 표면 마커는 또한 이식된 NPC의 이동을 나타내기도 한다.

일반적으로, 이식후 1개월째 MAP2 발현에 양성반응을 보이는 적은 수의 뉴런을 통해 보면, NPC는 선조체에서 비교적 잘 생존한다. 이식편 생존은 두가지 용량의 NPC 간에 유의한 차이는 없었다. NPC는 뇌졸중 경계내에서 허혈증을 보이는 세포를 감소시켰다. 상기의 두가지 용량은 신경치료 효과 면에서 거의 동일한 수준을 보였다. 이러한 분석으로부터의 데이터는 도 46 내지 48에 나타내었다.

H. MNC 실시예

하기의 실시예는 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실험 절차

MASC 배양 및 뉴런성 세포로 유도

MASC를 S. Azizi et al. "Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats-similarities to astrocyte grafts." Proc Natl Acad Sci U S A, 1998;95:3908-13에 일반적으로 기술된 바와 같이 Wistar 래트로부터 분리하였다. MASC를 M. Dezawa et al., "Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromal cells." Eur J Neurosci. 2001;14:1771-6에 일반적으로 기술된 바와 같이 pBabe neo-GFP 벡터를 사용하여 레트로바이러스 감염에 의해 녹색 형광 단백질(GFP)로 레이블링하였다.

MASC로부터의 뉴런성 세포로의 유도는 일반적으로 M. Dezawa et al., "Specific induction of neuronal cells from bone-marrow stromal cells and application for autologous transplantation J Clin Invest. 2004; 113:1701-10에 기술되어 있다. 간단히 말하면, 노치 인터셀룰라 도메인(Notch intracellular domain (NICD))함유 벡터(pCI neo-NICD)를 리포펙타민(Lipofectamin)2000 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)를 사용하여 MASC에 트랜스펙션시켰다. G418을 사용하여 11일 후에 세포를 선별하였다. MNC로의 유도를 위해, NICD-트랜스펙션된 MASC를 1회 계대배양하고(60-70% 컨플루언스), 10% FBS, 5μM FSK(Calbiochem, La JoIIa, California), 10 ng/ml bFGF (Peprotech, London, UK) 및 10 ng/ml CNTF (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota)를 함유하는 알파-MEM 배지에서 인큐베이팅하였다. 5일 후에, 세포를 MCAo 래트 모델에 이식하였다. 유도된 MNC를 인 비트로에서 특징분석하기 위하여 면역세포화학적 분석을 실시하였다. 항-MAP-2ab(Sigma, St. Louis, Missouri), 뉴로필라멘트-M(NF-M)(Chemicon Temecular, California) 및 베타-튜뷸린 아이소타입 3(β-튜뷸린3)(Sigma, St. Louis, Missouri)를 뉴런성 세포 마커로 사용하였는데, MNC의 90-95%가 마커에 대해 면역양성반응을 보였다.

MCAo 래트 모델:

체중이 200-250g인 수컷 Wistar 래트를 실온에서(24℃) 12시간의 암명 주기를 주고, 먹이와 물을 자유롭게 공급하면서 사육하였다. MCAo 절차는 J. Koizumi et al., "Experimental studies of ischemic brain edema. 1. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area." Jpn J Stroke. 1986;8:1- 8; 및 E. Longa et al., "Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats." Stroke. 1989;20:84-91에 기재된 방법을 변형시킨 것이었다. 간단히 말하면, 1.0-1.5% 할로테인, 10% 산소 및 공기의 혼합물에 의한 깊은 마취 상태에서, 정중 경부 절개를 수행한 다음에, 좌측 경동맥 분기점을 찾아내었다. 직경 0.3 mm의 실리콘 고무 코팅된 헤드를 갖는 4-0 나일론사로 만들어진 탐침을 연결된 외경동맥에 삽입하여 분기점으로부터 16-18 mm 떨어진 위치까지 내경동맥 쪽으로 밀었다. 수술 동안에, 직장 체온은 피드백-열판(BWT-100, Bio Research Center Co. Ltd., Tokyo, Japan)을 사용하여 37.5 내지 38.0 ℃로 유지하였다. 동맥혈 기체 분석을 실시하여 산소분압을 마취장치내에서 85-1200 mmHg로 유지하였다. 폐색 4시간 후에 탐침을 10 mm 빼내어 다시 혈류가 통하도록 하였다.

이식

MCAo 절차를 실시한 후 7일째에 50 mg/kg 소듐 펜토바비탈을 비경구 주사하여 마취하고 스테레오택식 프레임에 두었다. 예비 실험에서 경색증 부위를 정중선에서 대략 3.5 mm 옆쪽으로 떨어진 측면 부위에 만들어놓았다. 괴저가 생기지 않게 뇌 실질에 이식 하기 위해, 3 ㎕ 포스페이트 버퍼드 셀라인(PBS, pH 7.4) 중의 8000 내지 16000개의 배양된 세포로 구성된 세포 현탁액을 다음 3 위치의 왼쪽 전두에 주사하였다: 브레그마 앞쪽 +2 mm, 0 mm 및 -2 mm, 정중선 옆쪽 2 mm, 및 각 경우에 피질 표면으로부터 1.2 mm 깊이. 이식된 세포의 총수는 24000 내지 48000개였다.

동물은 세가지 군으로 준비하였으며, 대조군은 PBS만(세포 이식 하지 않은 것) 수여받은 것(n=7), MASC군은 처리하지 않은 경색증 MASC만 이식받은 것(n=10), NMC군은 MNC를 이식받은 것(n=10)것이었다.

행동 능력 시험

평균대 시험, 사지 위치 시험 및 모리스 워터 메이즈 시험을 사용하여 신경 손상의 심각도를 평가하였다. 평균대 시험 및 사지 위치 시험은 MCAo 실시후 7(이식후 바로), 14, 21, 28, 및 35일째에 실시하였다. 모리스 워터 메이즈 시험은 MCAo 시행 후 36일 내지 40일째에 실시하였다.

평균대 시험

평균대 시험은 전반적인 운동 기능을 측정하기 위한 것이며, C. Dixon et al., "A fluid percussion model of experimental brain injury in the rat." J Neurosurg. 1987;67:110-9에 기술된 바에 따라 수행하였다. 점수매기기는 다음과 같은 기준에 따라 수행하였다: 평균대 위에서 앞발로 안정적인 자세를 유지하며 균형잡는 것은 0점, 평균대 가장자리를 붙잡고/붙잡거나 흔들거리며 이동하는 것은 1점, 평균대에서 1 또는 그 이상의 앞발이 미끄러지는 것은 2점, 그리고 평균대에서 균형을 잡으려고 애쓰나 떨어지는 것은 3점, 균형을 잡으려고 노력하지 않거나 매달리려고 노력하지 않아서 평균대에서 떨어지는 것은 4점.

사지 위치 시험

사지 위치 시험은 시각적, 촉각적, 및 자기수용적 자극에 대해 반응하여 사지를 두는 것에서 감각운동 능력을 시험하는 것으로서, M. De Ryck et al. "Photochemical stroke model: flunarizine prevents sensorimotor deficits after neocortical infarcts in rats." Stroke, 1989;20: 1383-1390에 기술된 바에 따라 일반적으로 수행하였다. 자기수용적 시험도 수행하였으며, 이것도 일반적으로 De Ryck 등의 논문에 기재된 절차에 따라 수행하였다. 각 시험에서 점수매기기는 다음과 같은 기준에 따라 수행하였다: 사지를 즉시 및 완전히 이동하는 것은 0점, 불완전 및/또는 지연된(2초 이상) 위치(여기저기로 사지흔들기(interspersed flailing) 포함)는 1점, 이동하지 않는 것은 2점. 시각적, 앞쪽 촉각 및 옆쪽 촉각 및 자기수용적 자극을 오른쪽 앞발에 주었다. 앞쪽 촉각 및 옆쪽 촉각 및 자기수용적 자극을 오른쪽 뒷발에 주었다. 자기수용적 시험은 앞발 및 뒷발 모두에 대해 실시하였다. 총점수는 0내지 18점이었다.

모리스 워터 메이즈 시험

모리스 워터 메이즈 시험은 인지 기능을 측정하는데 유용한 방법이다. 이러한 시험에서 약간씩 변형시키는 것도 보고된 바 있다. 일반적으로 A. Fukunaga et al., "Differentiation and angiogenesis of central nervous system stem cells implanted with mesenchyme into ischemic rat brain." Cell Transplant. 1999;8:435-41에 보고되어 있는 바와 같은 시험 버젼이 사용되었다. 이 시험은 MCAo 수행 후 36일 내지 40일째에 수행하였다. 수조(직경 150 cm, 깊이 35 cm)를 준비하였다. 탈출 플랫폼(직경 10 cm)을 불투명하고 우윳빛을 띠는 물 표면 1 cm 아래에 두었다. 수조 가장자리를 따라 4가지 시작점을 동, 서, 남, 북으로 배치하였다. 플랫폼을 4등분 중 한가운데에 두는데, 이 위치는 수조 가장자리 및 중앙에서 같은 거리에 위치한다. 래트를 물 속 각 시작점에 풀어주고, 플랫폼에 도착할때까지 수영하게 하며, 플랫폼에 도착하는데 걸린 시간을 기록하였다(최대 120초). 연속 5일 4회 시험하는 것을 2세트 사용하여 래트를 훈련시켰다. 5일째 1세트 시험을 한 후에는 2세트 시험 대신에 공간 탐침 시험을 수행하였다. 이 시험은 단기 기억 보존 정도를 측정하기 위한 것이다. 플랫폼을 치우고 래트를 60초간 수영하게 하였다. 플랫폼이 있던 위치까지 걸리는 시간을 각 동물에 대해 측정하였다. 플랫폼이 있던 4등분 위치에 머무는 시간을 또한 측정하였다.

조직검사 분석

41일째에, 펜토바비탈을 과량 투여하여 래트를 희생시킨 다음, I. McLean et al., "Periodate-lysine-paraformaldehyde fixative. A new fixation for immunoelectron microscopy." J Histochem Cytochem. 1974;22: 1077-83에 일반적으로 기술된 바와 같이 페리오데이트-라이신-파라폼알데하이드 고정액 이후 0.9% 식염수를 심장내 주입하였다. Brain Matrix (BAS Inc. Warwickshire, UK)를 사용하여 뇌를 2 mm 두께의 코로날 블록(coronal block)으로 절단하였다. 각 블록으로부터 10 μm 두께의 냉동보존 절편으로 만들었다. 절편을 헤마톡실린 및 에오신(H & E)으로 염색하여 경색증 부위를 나타나게 하였다. 절편의 이미지를 광학현미경 하에서 1배 대물렌즈를 사용하여 캡쳐하고, 병변 부위를 Scion Image (Scion Corporation, Frederick, MD)를 사용하여 추적하였다. 경색증을 보이는 부피를 R. Swanson et al., "A semiautomated method for measuring brain infarct volume." J Cereb Blood Flow Metab. 1990; 10:290-29에 일반적으로 기술된 바와 같이 계산하였는데, 반대쪽 뇌 반구 중 경색증을 보이는 부피로서 표현하였다.

면역 염색을 위해 절편을 MAP-2(1 :100, Boehringer Mannheim, Germany), 베타-튜뷸린3 (1:400, Sigma, Missouri), NF-M (1:200, Boehringer Mannheim, Germany), Tuj-1 (1:100, BAbCO, CA), 또는 GFAP (1:400, Dako, CA)에 대한 1차 항체와 함께 밤새 4℃에서 인큐베이팅하였다. 2차 항체로 Alexa Fluor 546-컨쥬게이트 마우스 IgG (Molecular Probes, Eugene, OR) (MAP-2용) 또는 토끼 IgG (Molecular Probes, Eugene, OR) (베타-튜뷸린3, NF-M, Tuj-1 및 GFAP용)를 사용하였다. 핵 염색을 위해서는 TOTO-3를 사용하였다. 표본을 공초점 레이저 주사 현미경(CLMS) (Radiance 2000, Bio-Rad, Hertfordshire, UK)을 사용하여 조사하였다.

각 래트에서 전뇌중 GFP로 레이블링된 세포 총수를 계산하였다. 해마중 GFP로 레이블링된 세포의 총수도 같은 방식으로 계산하였다.

통계학적 분석

행동 능력 평가 결과 및 경색증 부피 데이터를 비반복 측정 분산분석을 이용하여 분석하였다. 결과가 유의도(p<0.05)를 보이는 경우에는, 스튜던트-뉴먼-컬즈(Student-Newman-Keuls) 사후 검정 절차를 95% 유의도 수준에서 사용하였다. 수치들은 다른 언급이 없는 한 평균 ± 표준편차로서 표현된다.

실시예 10: 행동 능력 시험

MCAo를 수행한 후 1주일째, 이식 직전에 심각한 오른쪽 신경 장애가 뚜렷이 보였고, 각 행동 능력 시험의 평균 점수는 세가지 군간에 유의한 통계학적 차이를 보이지 않았다.

평균대 시험

7일째 및 21일째에, 평균 점수는 세가지 군 간에 통계학적으로 상이하지 않았다. 28일째 및 35일째에, NMC군의 평균 점수는 대조군(28일: p=0.0041, 35일: p=0.0001) 및 MASC군(각각 p=0.0471, 0.0007)에 비하여 유의한 개선을 보였다. MASC군이 대조군에 비해 약간 개선된 것을 보이긴 하였지만, 통계학적 유의도의 차이는 28일째 및 35일째에 검출되지 않았다(도 40).

사지 위치 시험

7일 내지 21일간에 세가지 군 사이에 평균 점수의 통계학적 차이는 없었다. 28일째 및 35일째, NMC군과 MASC군은 대조군에 비하여 유의한 개선을 보였다(각각 28일: p=0.0022 및 0.085, 35일: p=0.0022 및 0.0211). 하지만 전체 기간 동안에 NMC 및 MASC군 간에 평균 점수의 통계학적 차이는 없었다(도 41).

모리스 워터 메이즈 시험

아래에 감추어진 탈출 플랫폼을 찾는 4회의 시도로 구성된 각 세트의 실험에서 기록된 평균 지연 시간을 세가지 군에 대하여 각각 도 42에 나타내었다. NMC군이 대조군과 MASC군에 비하여 가장 짧은 지연 시간을 보였다. 39일째에서의 2번째 세트 및 40일째에서 첫번째 세트에 대한 평균 지연 시간을 보면, NMC군과 대조군 간의 유의한 차이를 보여준다(각각 p=0.0339 및 0.0492) (도 42). NMC군이 MASC군보다는 탈출 플랫폼에 이르는 시간이 짧은 경향을 보였지만, 통계학적 유의한 차이는 존재하지 않았다.

공간 탐침 시도에서, NMC군의 래트는 대조군(p=0.0419)과 MASC군(p=0.0453) 에 비하여 유의한 개선도를 보였다(도 43). 플랫폼이 위치했던 4등분에 머무는 평균 시간은 세가지 군 중에서 NMC군에서 가장 길었다. NMC군과 대조군 간에 유의한 차이가 있었다(p=0.0339)(도 43).

실시예 11: 조직학적 연구

피질, 선조체 및 해마를 포함하는 좌측 반구의 옆쪽 가운데 경색증 부위가 위치하였고, 가장 병변이 심한 뇌에서는 결정의 형성이나 흔적이 관찰되었다. 병변쪽의 해마는 모양이 위축되었고 반대쪽에 비해서 뉴런이 부분적으로 불규칙하게 배열되었거나 손실된 것이 관찰되었다. 모든 MCAo 모델에서 경색증 부피를 측정하였다. NMC, MASC, 및 대조군에서의 평균 경색증 부피는 33일째에 각각 50.7+-10.9%, 51.0+-10.2% 및 50.9+-11.1%였다. 세가지 군 사이에 통계학적으로 유의한 차이는 없었다.

이식된 GFP로 레이블링된 MASC 및 MNC는 주로 동측 피질, 뇌량, 선조체 및 해마를 포함하는 경색증 조직과 경색증 부위 사이 경계에서 발견되었다. 염증 세포가 경색증 덩어리에 들어가 있는 것이 관찰되었다. MNC군과 MASC 군 간에는, 경색증 덩어리에 들어가 있는 염증 세포수의 차이는 없는 것으로 보인다.

다수의 GFP로 레이블링된 MNC가 MAP-2에 면역양성반응을 보였고 숙주 뇌에서 신경절 발생을 보였다. Tuj-1 및 베타-튜뷸린3에 대해서도 면역양성반응을 보였다. 동측 해마에서, GFP로 레이블링된 MNC의 다수의 세포체와 신경절이 NF-M 양성반응을 보였다. GFP로 레이블링된 이식 MNC의 대부분이 MAP-2에 대해 양성이었던 반면(84.0+-8.1 %), GFAP에 대해서는 소수의 세포만이 양성이었다(1.0+-0.2%).

반대로, 숙주 뇌에서 MASC의 대부분은 뉴런성(MAP-2, Tuj1 , 베타-튜뷸린3 및 NF-M) 및 글리아(GFAP) 마커에 대해 음성이었다.

GFP로 레이블링된 세포 사이에서 MAP-2 및 GFAP 양성 반응을 보이는 세포의 %는 각각 1.4+-0.2% 및 4.8+-1.0%이었다. MAP-2 양성 MASC 중의 신경절 형성은 관찰되지 않았다.

숙주의 전뇌 중 MNC 및 MASC의 평균 숫자는 각각 13250±1126 및 5850±997이었다. 이식 1개월 후 이식된 MNC 중 대략 30-45%가 검출된 반면, 이식된 MASC의 10-20%가 검출되었다. 허혈증 뇌에서 MNC가 생존한 비율은 실질적으로 MASC보다는 높았다. 해마에서 MNC의 평균 숫자는 790±160이었고, 이들 중 89%는 MAP-2에 양성반응을 보였다. 반대로 MASC의 평균 숫자는 470±66이었고, 0.6%가 MAP-2에 양성반응을 보였는데, 이는 이식된 MASC의 대부분이 뉴런성 및 글리아 마커에 대해서는 음성반응이었음을 보이는 것이다.

모든 군에서, MCAo 후 41일째까지 뇌 실질내에서 종양 형성은 관찰되지 않았다.

참고문헌:

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Claims

뉴런성 전구체 세포를 제공하는 단계; 및

환자의 기능 회복을 촉진하기에 충분한 양으로 중추신경계 병변을 앓고 있는 환자에게 뉴런성 전구체 세포를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 뉴런성 전구체 세포를 국소적으로 투여하는 것이 특징인 방법.
제 2 항에 있어서, 뉴런성 전구체 세포를 환자의 중추신경계 병변에 투여하는 것이 특징인 방법.
제 1 항에 있어서, 뉴런성 전구체 세포를 뇌실질내에 투여하는 것이 특징인 방법.
제 1 항에 있어서, 뉴런성 전구체 세포는 인간 뉴런성 전구체 세포를 포함하는 것이 특징인 방법.
제 1 항에 있어서, 뉴런성 전구체 세포를 제공하는 단계는

골수 접착 스템 셀을 제공하는 단계; 및

골수 접착 스템 셀을 뉴런성 전구체 세포로 변환분화하는 단계를 포함하는 것이 특징인 방법.
제 1 항에 있어서, 중추신경계 병변은 허혈성 뇌졸중 또는 출혈성 뇌졸중에 의해 유발되는 것이 특징인 방법.
제 1 항에 있어서, 뉴런성 전구체 세포가 환자의 투여 부위에서 다른 부위로 이동하는 것을 허여하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
제 8 항에 있어서, 환자의 다른 부위는 중추신경계 병변을 포함하는 것이 특징인 방법.
제 1 항에 있어서, 환자에게 면역억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
제 1 항에 있어서, 기능 회복은 부분적인 기능 회복인 것이 특징인 방법.
제 1 항에 있어서, 뉴런성 전구체 세포는 환자와 동종계인 것이 특징인 방법.
뉴런성 전구체 세포를 환자에게 투여한 후에 중추신경계 병변을 앓고 있는 환자의 기능 회복을 촉진하기에 충분한 양으로 존재하는 뉴런성 전구체 세포; 및

약학적 수용가능한 담체를 포함하는 이식편 형성 유닛.
제 13 항에 있어서, 약학적 수용가능한 담체는 용매, 분산매, 항박테리아제, 또는 항균제를 포함하는 것이 특징인 이식편 형성 유닛.
제 13 항에 있어서, 이식편은 약 10,000개 내지 약 1억개 범위 뉴런성 전구체 세포 범위의 양으로 뉴런성 전구체 세포를 포함하는 것이 특징인 이식편 형성 유닛.
제 13 항에 있어서, 뉴런성 전구체 세포는 레이블을 포함하는 것이 특징인 이식편 형성 유닛.
제 13 항에 있어서, 뉴런성 전구체 세포는 인간 뉴런성 전구체 세포를 포함하는 것이 특징인 이식편 형성 유닛.
골수 접착 스템 셀 유래 뉴런성 세포를 제공하는 단계; 및

환자의 기능 회복을 촉진하기에 충분한 양으로 중추신경계 병변을 앓고 있는 환자에게 골수 접착 스템 셀 유래 뉴런성 세포를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제 18 항에 있어서, 골수 접착 스템 셀 유래 뉴런성 세포를 국소적으로 투여하는 것이 특징인 방법.
제 19 항에 있어서, 골수 접착 스템 셀 유래 뉴런성 세포를 환자의 중추신경계 병변에 투여하는 것이 특징인 방법.
제 18 항에 있어서, 골수 접착 스템 셀 유래 뉴런성 세포를 뇌실질내에 투여하는 것이 특징인 방법.
제 18 항에 있어서, 골수 접착 스템 셀 유래 뉴런성 세포는 인간 골수 접착 스템 셀 유래 뉴런성 세포를 포함하는 것이 특징인 방법.
제 18 항에 있어서, 골수 접착 스템 셀 유래 뉴런성 세포를 제공하는 단계는

골수 접착 스템 셀을 제공하는 단계; 및

골수 접착 스템 셀이 골수 접착 스템 셀 유래 뉴런성 세포를 형성하도록 유도하는 단계를 포함하는 것이 특징인 방법.
제 23 항에 있어서, 골수 접착 스템 셀을 뉴런성 전구체 세포로 변환분화하는 단계; 및

뉴런성 전구체 세포가 뉴런성 세포를 형성하도록 유도하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
제 18 항에 있어서, 중추신경계 병변은 허혈성 뇌졸중 또는 출혈성 뇌졸중에 의해 유발되는 것이 특징인 방법.
제 18 항에 있어서, 환자에게 면역억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
제 18 항에 있어서, 기능 회복은 부분적인 기능 회복인 것이 특징인 방법.
제 18 항에 있어서, 골수 접착 스템 셀 유래 뉴런성 세포는 환자와 동종계인 것이 특징인 방법.
골수 접착 스템 셀 유래 뉴런성 세포를 환자에게 투여한 후에 중추신경계 병변을 앓고 있는 환자의 기능 회복을 촉진하기에 충분한 양으로 존재하는 골수 접착 스템 셀 유래 뉴런성 세포; 및

약학적 수용가능한 담체를 포함하는 이식편 형성 유닛.
제 29 항에 있어서, 약학적 수용가능한 담체는 용매, 분산매, 항박테리아제, 또는 항균제를 포함하는 것이 특징인 이식편 형성 유닛.
제 29 항에 있어서, 이식편은 약 10,000개 내지 약 1억개 뉴런성 전구체 세포 범위의 양으로 뉴런성 전구체 세포를 포함하는 것이 특징인 이식편 형성 유닛.
제 29 항에 있어서, 골수 접착 스템 셀 유래 뉴런성 세포는 레이블을 포함하는 것이 특징인 이식편 형성 유닛.
제 29 항에 있어서, 골수 접착 스템 셀 유래 뉴런성 세포는 인간 골수 접착 스템 셀 유래 뉴런성 세포를 포함하는 것이 특징인 이식편 형성 유닛.