PT1855700E

PT1855700E - Utilização de materiais para tratamento de lesões do sistema nervoso central

Info

Publication number: PT1855700E
Application number: PT67371328T
Authority: PT
Inventors: Mari Dezawa; Keita Mori
Original assignee: Sanbio Inc
Priority date: 2005-03-07
Filing date: 2006-03-06
Publication date: 2013-12-10
Also published as: WO2006096640A2; EP1855700A2; DK1855700T3; IL185703A; JP2008538103A; KR20070116069A; EP1855700B1; US20100034790A1; JP5184340B2; US8092792B2; CA2599971C; US20060216276A1; KR101342447B1; CA2599971A1; AU2006220696A1; AU2006220696B2; IL185703A0; WO2006096640A3; ES2436401T3; CN101605552A

Description

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DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS PERCURSORAS NEURONAIS PARA TRATAMENTO DE LESÕES DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL"

Descrição

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO DOMÍNIO DA INVENÇÃO A invenção refere-se ao tratamento de lesões do sistema nervoso central, particularmente ao tratamento de acidente vascular cerebral.

DESCRIÇÃO DA ESPECIALIDADE RELACIONADA

Podem-se formar lesões no tecido do sistema nervoso central ("CNS") por várias razões. Uma das causas principais de lesões no CNS é o acidente vascular cerebral. 0 acidente vascular cerebral é caracterizado por uma perda súbita de circulação numa área do cérebro, resultando na perda correspondente de função neurológica. Também chamado de acidente vascular cerebral ou sindrome de acidente vascular cerebral, o acidente vascular cerebral é um termo não especifico que abrange um grupo heterogéneo de causas patofisiológicas, incluindo trombose, embolismo, e hemorragia. Relatórios recentes indicam uma incidência excedendo 500.000 novos acidentes vasculares cerebrais de todos os tipos por ano. O acidente vascular cerebral é o principal assassino e incapacitante. Combinando todos os tipos de acidente vascular cerebral, é a terceira principal causa de morte e a primeira causa principal de incapacidade. Ao ritmo atual, é projetado este número 2 saltar para um milhão por ano até 2050. Quando os custos diretos (cuidados e tratamento) e os custos indiretos (perda de produtividade) dos acidentes vasculares cerebrais são considerados em conjunto, os acidentes vasculares cerebrais custam à sociedade americana $43,3 biliões por ano. Os acidentes vasculares cerebrais são classificados como hemorrágicos ou isquémicos. O acidente vascular cerebral isquémico agudo refere-se a acidentes vasculares cerebrais causados por trombose ou embolismo e é responsável por 80% de todos os acidentes vasculares cerebrais.

As quatro sindromes dos acidentes vasculares cerebrais isquémicos neuroanatómicos principais são causadas por perturbação das suas distribuições cerebrovasculares respetivas.

Oclusões da artéria cerebral anterior afetam principalmente a função do lobo frontal, produzindo estado mental alterado, capacidade de julgamento afetada, fraqueza e hipoestesia contralateral das extremidades inferiores, e apraxia da marcha.

Oclusões da artéria cerebral média (MCA) normalmente produzem hemiparesia contralateral, hipoestesia contralateral, hemianopsia ipsilateral (cegueira numa metade do campo visual), e olhar fixo com preferência na direção do lado da lesão. Agnosia é comum, e afasia recetiva e de expressão podem ocorrer se a lesão ocorrer no hemisfério dominante. Uma vez que a MCA irriga a extremidade motora do trem superior, fraqueza do braço e face é normalmente pior do que a da extremidade inferior.

Oclusões da artéria cerebral posterior afetam a visão e o pensamento, produzindo hemianopsia homónima, cegueira 3 cortical, agnosia visual, estado mental alterado, e memória afetada.

As oclusões da artéria vertebrobasilar são notoriamente dificeis de detetar porque causam uma larga variedade de défices do nervo craniano, do cerebelo, e tronco cerebral. Estes incluem vertigem, nistagmo, diplopia, défices do campo visual, disfagia, disartria, hipoestesia facial, sincope e ataxia. Perda de sensação de dor e de temperatura ocorre na face ipsilateral e corpo contralateral. Em contraste, acidentes vasculares cerebrais anteriores produzem manifestações clinicas apenas num lado do corpo.

Estas oclusões podem ocorrer por uma variedade de razões. Podem surgir êmbolos do coração, das artérias extracranianas ou, raramente, da circulação do lado direito (embolia paradoxal). As fontes de embolias cardiogénicas incluem trombos valvulares (p.ex. na estenose mitral, endocardite, válvulas prostética); trombos murais (p.ex. no enfarte do miocárdio [MI], fibrilação auricular, cardiomiopatia dilatada); e mixomas atriais. MI está associado com uma incidência de 2-3% da incidência do acidente vascular cerebral embólico, do qual 85% ocorre no primeiro mês após MI. sensonais

Enfartes lacunares são responsáveis por 13-20% de todos os enfartes cerebrais e normalmente envolvem a vasculatura terminal pequena do cérebro subcortical e tronco cerebral. Os enfartes lacunares geralmente ocorrem em doentes com doença dos pequenos vasos, tal como diabetes e hipertensão. Pequenos êmbolos ou um processo in situ chamado de lipohialinose pensa-se que causam enfartes lacunares. As sindromes lacunares mais comuns incluem acidentes vasculares cerebrais puramente motores, puramente , e atáxicos hemiparéticos. Em virtude do seu 4 pequeno tamanho e localização subcortical bem definida, os enfartes lacunares não levam a deficiências na cognição, memória, fala, ou nível de consciência.

Os locais mais comuns de oclusão trombótica são locais de ramificação das artérias cerebrais, especialmente na distribuição da artéria carótida interna. A estenose arterial (i.e. fluxo sanguíneo turbulento), ateroesclerose (i.e., placas ulceradas), e aderência das plaquetas causam a formação de trombos sanguíneos que ou embolizam ou ocluem a artéria. Causas menos comuns de trombose incluem policitémia, anemia falciforme, deficiência de proteína C, displasia fibromuscular das artérias cerebrais, e vasoconstrição prolongada de distúrbios de dor de cabeça como enxaquecas. Qualquer processo que causa a dissecação das artérias cerebrais também pode causar acidente vascular cerebral trombótico (p.ex. trauma, dissecação da aorta torácica, artrite). Ocasionalmente, a hipoperfusão distai de uma artéria estenótica ou ocluída ou a hipoperfusão de uma região cinzenta vulnerável entre dois territórios arteriais cerebrais pode causar acidente vascular cerebral isquémico.

Voltando para o acidente vascular cerebral hemorrágico, os termos hemorragia intracerebral (ICH) e acidente vascular cerebral hemorrágico são utilizados sem distinção nesta discussão e são considerados como uma entidade separada da transformação hemorrágica do acidente vascular cerebral isquémico. ICH representa aproximadamente 20% de todos os acidentes vasculares cerebrais e está associado com taxas de mortalidade mais elevadas que enfartes cerebrais. Doentes com acidente vascular cerebral hemorrágico apresentam défices neurológicos focais similares mas tendem a estar mais doentes que doentes com acidente vascular cerebral isquémico. Doentes com hemorragias intracerebrais 5 têm maior probabilidade de ter dor de cabeça, estado mental alterado, convulsões, náusea e vómitos, e/ou hipertensão marcada; no entanto, nenhumas destas manifestações clinicas distinguem de forma fiável entre acidentes vasculares cerebrais hemorrágicos e isquémicos.

Na ICH, a hemorragia ocorre diretamente no parênquima cerebral. Pensa-se que o mecanismo normal é um extravasamento de pequenas artérias intracerebrais danificadas por hipertensão crónica. Outros mecanismos incluem diáteses hemorrágicas, coagulação iatrogénica, amiloidose cerebral, e abuso de cocaina. ICH tende a ser encontrada em certos locais do cérebro, incluindo o tálamo, putâmen, cerebelo, e tronco cerebral. Adicionalmente à área do cérebro lesionado pela hemorragia, o cérebro circundante pode ser danificado pela pressão produzida pelo efeito de massa do hematoma. Pode ocorrer um aumento geral da pressão intracraniana. A taxa de mortalidade aos 30-dias para acidente vascular cerebral hemorrágico é de 40-80%. Aproximadamente 50% de todas as mortes ocorrem no espaço das primeiras 48 horas.

Outras causas de lesões no CNS são convencionalmente conhecidas, incluindo trauma e várias doenças do CNS.

Tratar as lesões do CNS implica neurogénese, i.e. a (re) geração de neurónios numa região do tecido do doente que é de interesse, incluindo, mas não limitado a, substituição dos neurónios danificadas numa lesão do sistema nervoso central. Infelizmente, o tecido neuronal (CNS) é bem conhecido pela sua capacidade de reparação/regeneração limitada. A geração de novos neurónios no adulto está grandemente restringida a duas regiões, a limitante SVZ dos ventrículos laterais, e a zona subgranular do giro dentado. Substituição neuronal limitada foi demonstrada ser 6 resultante de precursores endógenos de células estaminais que migraram do SVZ.

Algum sucesso inicial foi reportado com certos métodos de neurogénese mas estes métodos não foram clinicamente bem-sucedidos. Consequentemente, existe uma necessidade para métodos e composições que superem problemas verificados na especialidade do tratamento de lesões do sistema nervoso central.

Jin et al. ("Comparison of ischemia-directed migration of neural precursor cells after intrastriatal, intraventricular, or intravenous transplantation in the rat", Neurobiology of Disease, vol. 18, Março 2005, pág. 366-374) divulga uma comparação de diferentes vias de administração de células percursoras neuronais que ocorrem naturalmente, obtidas do córtex cerebral embriónico.

Sakanaka, M. (English Abstract of JP 2004-129561) divulga o isolamento ou produção de células estaminais neurais, ou células percursoras neuronais obtidas por cultura de micróglia.

Num aspeto, a invenção refere-se a células percursoras neuronais para utilização no tratamento de uma lesão do sistema nervoso central, em que as células percursoras neuronais são obtidas por transdiferenciação de células estaminais da medula óssea aderentes em células percursoras neuronais ao transfetar as células estaminais da medula óssea aderentes com um vetor contendo sequências que codificam o dominio intracelular de Notch, e em que a lesão do sistema nervoso central é causada por acidente vascular cerebral isquémico ou acidente vascular cerebral hemorrágico. 7

Num outro aspeto, a invenção refere-se a uma unidade formadora de enxerto para utilização no tratamento de uma lesão do sistema nervoso central compreendendo células percursoras neuronais, em que as células percursoras neuronais são obtidas por transdiferenciação de células estaminais da medula óssea aderentes em células percursoras neuronais ao transfetar as células estaminais da medula óssea aderentes com um vetor contendo sequências que codificam o dominio intracelular de Notch, e um veiculo farmaceuticamente aceitável, em que a lesão do sistema nervoso central é causada por acidente vascular cerebral isquémico ou acidente vascular cerebral hemorrágico.

Num outro aspeto, a invenção refere-se a células neuronais derivadas de células estaminais da medula óssea aderentes (MNCs) para utilização no tratamento de uma lesão do sistema nervoso central que é causada por acidente vascular cerebral isquémico ou acidente vascular cerebral hemorrágico; em que as MNCs são obtidas por (i) providenciar células estaminais da medula óssea aderentes; (ii) transdiferenciar as células estaminais da medula óssea aderentes em células percursoras neuronais ao transfetar as células estaminais da medula óssea aderentes com um vetor contendo sequências que codificam o dominio intracelular de Notch; e (iii) induzir as células percursoras neuronais a formar células neuronais através da cultura das células na presença de 5 μΜ forscolina (FSK), 10 ng/mL fator de crescimento básico dos fibroblastos (bFGF), e 10 ng/mL fator neurotrófico ciliar (CNTF).

Num outro aspeto, a invenção refere-se a uma unidade formadora de enxerto para utilização no tratamento de uma lesão do sistema nervoso central compreendendo células neuronais derivadas de células estaminais da medula óssea aderentes, em que as células neuronais derivadas de células estaminais da medula óssea aderentes são obtidas por (i) providenciar células estaminais da medula óssea aderentes; (ii) transdiferenciar as células estaminais da medula óssea aderentes em células percursoras neuronais ao transfetar as células estaminais da medula óssea aderentes com um vetor contendo sequências que codificam o domínio intracelular de Notch; e (iii) induzir as células percursoras neuronais a formar células neuronais através da cultura forscolina das células percursoras neuronais na presença de 5 μΜ forscolina (FSK), 10 ng/mL fator de crescimento básico dos fibroblastos (bFGF), e 10 ng/mL fator neurotrófico ciliar (CNTF), e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que a lesão do sistema nervoso central é causada por acidente vascular cerebral isquémico ou acidente vascular cerebral hemorrágico.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura 1 mostra os resultados do procedimento MCAo. 2 mostra os resultados do procedimento MCAo. 3 mostra os resultados do procedimento MCAo. 4 mostra os resultados do procedimento MCAo. 5 mostra os resultados do procedimento MCAo. 6 mostra os resultados do procedimento MCAo. 7 mostra os resultados do procedimento MCAo. 8 mostra os resultados do procedimento MCAo. A Figura 9 mostra os resultados do procedimento MCAo. A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura 10 mostra os resultados do procedimento MCAo 11 mostra os resultados do procedimento MCAI 12 mostra os resultados do procedimento MCAI 13 mostra os resultados do procedimento MCAI 14 mostra os resultados do procedimento MCAI 15 mostra os resultados do procedimento MCAI 16 mostra os resultados do procedimento MCAI 17 mostra os resultados do procedimento MCAI 18 mostra os resultados do procedimento MCAI 19 mostra os resultados do procedimento MCAI 20 mostra os resultados do procedimento MCAI 21 mostra os resultados do procedimento TGI . 22 mostra os resultados do procedimento TGI . 23 mostra os resultados do procedimento TGI . 24 mostra os resultados do procedimento TGI . 25 mostra os resultados do procedimento TGI . 26 mostra os resultados do procedimento TGI . 10 A Figura 27 mostra os resultados do procedimento TGI. A Figura 28 mostra os resultados do procedimento TGI. A Figura 29 mostra os resultados histológicos dos Exemplos. A Figura 30 mostra os resultados histológicos dos Exemplos. A Figura 31 ilustra a recuperação funcional e sobrevivência do enxerto. A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura 32 mostra os resultados do procedimento MCAo. 33 mostra os resultados do procedimento MCAo. 34 mostra os resultados do procedimento MCAI. 35 mostra os resultados do procedimento MCAI. 36 mostra os resultados do procedimento TGI. 37 mostra os resultados do procedimento TGI. 38 ilustra a sobrevivência do enxerto. 39 ilustra a sobrevivência enxerto. A Figura 40 mostra os resultados de um teste de equilíbrio na viga. No dia 28 após transplante, a classificação média para o grupo MNC mostrou uma melhoria significativa, em comparação com os grupos MASC e controlo. *: p<0,05, **: p<0,01. A Figura 41 mostra os resultados de um teste de colocação do membro. As classificações médias para o grupo NMC e o 11 grupo MASC eram significativamente diferentes daquelas do grupo controlo no dia 21 e dia 28. Não houve diferença significativa entre os grupos MNC e MASC. *: p<0,05, **: p<0,01. A Figura 42 mostra os resultados de um teste do labirinto de água de Morris. Para o grupo final, o tempo de latência médio para o grupo MNC era significativamente diferente daqueles dos grupos MASC e controlo. A Figura 43 mostra os resultados de um teste do labirinto de água "ensaio de sondagem espacial". Entre os três grupos, os melhores resultados foram obtidos no grupo MNC, e foram obtidas diferenças estatísticas entre o grupo MNC e os outros grupos. *: p<0,05, **: p<0,01. A Figura 44 mostra resultados do teste de Bederson realizado no Exemplo 9. A Figura 45 mostra os resultados do EBST realizado no Exemplo 9. A Figura 46 ilustra a sobrevivência do enxerto de acordo com o Exemplo 9. A Figura 47 mostra a sobrevivência do enxerto de acordo com o Exemplo 9. A Figura 48 mostra os resultados da coloração de Nissl de acordo com o Exemplo 9.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A. INTRODUÇÃO 12

Os inventores descobriram inesperadamente e surpreendentemente que os problemas e limitações mencionados anteriormente podem ser superados utilizando a invenção aqui divulgada. Em particular, os inventores descobriram inesperadamente que é possivel pôr à disposição NPCs e/ou MNCs e administrar estas NPCs e/ou MNCs a um doente que sofre de uma lesão do sistema nervoso central numa quantidade suficiente para facilitar a recuperação funcional do doente. A abordagem aqui divulgada tem várias vantagens relativamente ao estado da técnica. Primeiro, providencia uma relação dose-resposta que pode permitir a um médico adaptar o procedimento cirúrgico para reparar a lesão do sistema nervoso central individualmente a cada doente. Segundo, providencia uma abordagem alogénica ao enxerto. Isto é útil para caracterizar as NPCs e/ou MNCs e/ou unidades formadoras de enxerto e providenciar consistência de GFU para GFU (ou NPC para NPC, ou MNC para MNC) , ambos em termos dos lotes de células e procedimento de transplante. Além disso, a utilização de NPCs permite uma reconstrução mais precisa do sistema nervoso central, em comparação com a utilização de outras células multipotentes. Isto porque uma maioria significativa de células percursoras neuronais, mais do que outros tipos de células multipotentes, irão adotar um destino celular de células neuronais quando se diferenciarem, em vez de se diferenciarem em outros tipos de células. Isto pode ser importante quando se tenta providenciar controlo sobre o resultado do transplante e limita as possibilidades de crescimento de células transplantadas indesejáveis (ou indiferenciadas). Adicionalmente, a utilização de MNCs é desejável porque as células são células multipotentes mais diferenciadas que podem providenciar uma melhor recuperação funcional. 13

A presente invenção irá ser agora descrita em mais detalhe. DEFINIÇÕES "Administração" significa providenciar NPCs e/ou enxertos inovadores a um doente. "Área" significa uma região ou volume definido. Por exemplo, uma área do sistema nervoso central será uma região ou volume definido localizado no sistema nervoso central. "Evento isquémico no sistema nervoso central" ou "evento isquémico CNS " significa qualquer ocorrência que resulta numa falta ou redução fisiologicamente significativa do fluxo sanguíneo para uma área do sistema nervoso central de um doente. Numa forma de realização preferida, um evento isquémico CNS compreende um acidente vascular cerebral isquémico. "Lesão do sistema nervoso central" ou "lesão CNS" significa uma área de tecido do sistema nervoso central danificado, com mau funcionamento, ou doente, ou a penumbra que envolve um tal tecido neuronal do sistema nervoso central danificada, com mau funcionamento, ou doente, danificado por um evento isquémico CNS ou por uma hemorragia (p.ex., numa forma de realização preferida, acidente vascular cerebral hemorrágico). "Tecido do sistema nervoso central" significa um tecido convencionalmente associado ao sistema nervoso central. Tecido cerebral e tecido da espinal medula são exemplos não limitativos do tecido do sistema nervoso central. Certas formas de realização da presente invenção dizem respeito ao 14 tecido do sistema nervoso central, em que o tecido do sistema nervoso central foi danificado por um evento isquémico. Um tal dano pode ocorrer como entendido convencionalmente, através da deprivação de oxigénio, e outras cascadas e subprodutos associados a tal deprivação e cascadas associadas. "Recuperação funcional" significa a recuperação da função do CNS respetivamente a uma lesão do CNS como determinado ou por medição de parâmetros neurobiológicos caracteristicos de tal função (i.e. CBF, EEG, expansão cortical, etc.), ou por medição da função comportamental (p.ex. criação de sobressalto ou sobressalto auditivo em modelos murinos, ou outros modelos divulgados aqui ou do conhecimento da especialidade). A recuperação é determinada pela tendência das variáveis medidas de se aproximarem dos valores observados na população normal ou controlo. A recuperação funcional pode ser completa, i.e. a recuperação restitui o valor dos parâmetros medidos ao valor observado na população normal ou controlo, como determinado através de metodologia estatística apropriada. A recuperação funcional pode também ser incompleta ou parcial. Por exemplo, um doente pode verificar recuperação funcional completa de um parâmetro medido, ou recuperação de 75%, ou recuperação de 50%, etc. "Área recuperada funcionalmente do sistema nervoso central" significa um tecido do CNS anteriormente envolvido numa lesão e que subsequentemente recuperou funcionalmente através da utilização da presente invenção. "Unidade formadora de enxerto" ou "GFU" significa uma composição que (1) compreende NPCs e/ou MNCs juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável, (2) é destinado para administração num doente. Numa forma de realização 15 preferida, as misturas de NPCs e MNCs são expressamente contempladas. Em outras formas de realização preferidas NPCs estão presentes substancialmente sem MNCs. Em ainda outras formas de realização preferidas MNCs estão presentes substancialmente sem NPCs. "Células estaminais da medula óssea aderentes" significa um tipo de célula multipotente mitótica que dá origem a uma variedade de tipos celulares: células sanguíneas (osteócitos), células da cartilagem (condrócitos), células adiposas (adipócitos), e outros tipos de células do tecido conjuntivo tal como aquelas em tendões. "Células neuronais derivadas de MASC (MNCs) " significa neurónios após a mitose que (1) são derivados de células estaminais da medula óssea aderentes, e (2) que expressam imunohistoquimicamente marcadores neuronais e exibem propriedades neuronais na análise eletrofisiológica. MNCs são obtidas por (i) providenciar células estaminais da medula óssea aderentes; (ii) transdiferenciar as células estaminais da medula óssea aderentes em células percursoras neuronais por transfeção das células estaminais da medula óssea aderentes com um vetor contendo sequências que codificam o domínio intracelular de Notch; e (iii) induzir as células percursoras neuronais a formarem células neuronais através da cultura das células na presença de 5 μΜ forscolina (FSK), 10 ng/mL fator de crescimento básico dos fibroblastos (bFGF) e 10 ng/mL fator neurotrófico ciliar (CNTF). Métodos apropriados para gerar MNCs in vitro podem ser encontrados na PCT/JP03/01260. MNCs produzidas utilizando outras técnicas do conhecimento da especialidade podem também ser utilizadas na utilização desta invenção, desde que elas correspondam à definição de MNCs aqui estipulada. Numa forma de realização, MNCs humanas são MAP-2+, neurofilamento-M+, e beta tubulina III+ (i.e. TuJ-l+). 16

Estes marcadores podem ser utilizados para isolar MNCs utilizando FACS a seguir à produção de MNCs utilizando as técnicas divulgadas em PCT/JP03/01260. Métodos apropriados para manusear as MNCs são convencionalmente conhecidos, incluindo aqueles métodos divulgados, por exemplo, na patente dos Estados Unidos 6, 833, 269 de Carpenter. "MCAo" significa oclusão da artéria cerebral média. "MCAI" significa ligação da artéria cerebral média. "Neurogénese" significa a (re) geração de neurónios e tecido neuronal numa região do tecido do doente que é de interesse, incluindo mas não limitado à substituição dos neurónios danificados numa lesão do sistema nervoso central. "Células percursoras neuronais (NPCs)" significam células que são mitóticas, expressam nestina e outros marcadores específicos para células percursoras neuronais/progenitoras neuronais, e são derivadas de MASCs. NPCs podem diferenciar-se em neurónios, glia, e oligodendrócitos, e percursores de qualquer dos supracitados. NPCs são obtidas por transdiferenciação de células estaminais da medula óssea aderentes para células percursoras neuronais ao transfetar as células estaminais da medula óssea aderentes com um vetor contendo sequências que codificam o domínio intracelular de Notch. Numa forma de realização, NPCs podem ser produzidas de células estaminais da medula óssea aderentes (MASCs) de acordo com métodos divulgados na PCT/JP03/01260. NPCs produzidas utilizando outras técnicas do conhecimento da especialidade podem ser utilizadas na utilização desta invenção, desde que elas correspondam à definição de NPCs aqui estipulada. Preferivelmente, NPCs compreendem NPCs humanas, embora NPCs de outras espécies de 17 mamíferos também são abrangidas no âmbito desta invenção. Numa forma de realização, NPCs, preferivelmente NPCs humanas são CD29+, CD90+, CD105+, CD31-, CD34- e CD45-. Estes marcadores podem ser utilizados para isolar NPCs, preferivelmente NPCs humanas, utilizando FACS a seguir à produção de NPCs utilizando as técnicas divulgadas na PCT/JP03/01260. Métodos apropriados para manusear as NPCs são convencionalmente conhecidos, incluindo aqueles métodos divulgados, por exemplo, no pedido de patente dos Estados Unidos publicado 20020012903 de Goldman et al. "Neurónio(s)" significa qualquer uma das células que conduzem impulsos que constituem o cérebro, espinal medula, e nervos, consistindo num corpo celular nucleado com uma ou mais dendrites e um único axónio. Bioquimicamente, neurónios são caracterizados por reação com anticorpos para Map, neurofilamento-M, e beta-tubulina III (i.e. TuJ-1). Células neuronais são também caracterizadas pela presença de sintetases de neurotransmissores ou proteínas relacionadas com neurotransmissores e pela secreção de neurotransmissores, por exemplo neuropeptídeo Y e substância P. "Neuronal" significa neurónios, glia, e oligodendrócitos, e percursores de qualquer dos supracitados. "Doente" significa um animal, tipicamente um mamífero, e mais tipicamente, um humano, com necessidade de tratamento de uma doença ou distúrbio. "Veículo farmaceuticamente aceitável" significa qualquer um e todos os solventes, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, crioprotectores isotónicos e agentes retardadores da absorção, e semelhantes, que são compatíveis com a 18 administração farmacêutica de NPCs ou de MNCs. A utilização de tais meios e agentes é bem conhecida na especialidade. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional seja incompatível com NPCs ou com MNCs, é contemplada a utilização deles nas GFUs inovadoras. "Sistemicamente" significa em toda a parte, ou em toda a parte de porções substanciais, do doente. "Tecido" significa uma parte de um organismo consistindo num agregado de células com uma estrutura e função similar. Um tecido preferido, de acordo com a invenção, é tecido nervoso. "TGI" significa isquémia transitória global. "Transplante", que é utilizado como sinónimo de "enxertagem", significa a colocação de células não- endógenas numa área de um doente. 0 transplante pode ser alogénico, ou células non-self sendo transplantadas. 0 transplante também pode ser autólogo, ou células self sendo transplantadas, p.ex. de um tecido para outro no mesmo doente. "Transdiferenciado" significa o desenvolvimento de uma célula ao longo de uma linhagem diferente daquela classicamente associada com aquele tipo de célula.

A. NPCs, E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS DESTES

Numa forma de realização, NPCs são empregues na utilização desta invenção como parte de GFUs que são transplantadas em doentes. 0 intuito é que as NPCs cresçam e se diferenciem em células neuronais que têm um papel na recuperação funcional de uma lesão do sistema nervoso num doente. Por 19 exemplo, NPCs podem diferenciar-se em neurónios que substituem neurónios endógenos danificados. Alternativamente, NPCs podem diferenciar-se em células glia ou neurónios que secretam fatores de crescimento. Estes fatores de crescimento podem ter uma atividade trófica em neurónios danificados e ajudar na sua recuperação funcional. Deste modo, é possivel o tratamento de lesões do sistema nervoso central. NPCs preferidas e métodos preferidos para providenciar tais NPCs são divulgados na PCT/JP03/01260, de Dezawa et al., entitulado "Method of Differentiating/Inducing Bone Marrow Interstitial Cells Into Nerve Cells and Skeleton Muscle Cells by Transferring Notch Gene" ("Dezawa"). Em particular, as "células percursoras neuronais" de Dezawa, como descrito ao longo de Dezawa e em particular no Exemplo 7, podem ser utilizadas como as NPCs da presente invenção. Dezawa divulga que MASCs podem ser transdiferenciadas em células percursoras neuronais que são então úteis como as NPCs da presente invenção.

Em formas de realização, GFUs podem ser úteis na utilização desta invenção. Veiculos farmaceuticamente aceitáveis úteis nas GFUs da presente invenção podem incluir: tampões isotónicos estéreis, FRS, isolyte, diluentes estéreis como água, solução salina normal, óleos fixos, polietileno glicóis, glicerina, propileno glicol, ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos ou antifúngicos tal como ácido ascórbico, timerosal, trimetoprima-sulfametoxazol, ácido nalidixico, metenamina hipurato ou macrocristais de nitrofurantoina e semelhantes; agentes antioxidantes tal como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes tal como EDTA; tampões tal como acetatos, citratos, ou fosfatos; e agentes para o ajustamento da tonicidade tal como cloreto de sódio ou 20 dextrose. O pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tal como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio.

Numa forma de realização, as unidades formadoras de enxerto apropriadas para utilização na presente invenção compreendem composições estéreis que compreendem as NPCs. Para administração intravenosa, veículos farmaceuticamente aceitáveis podem incluir solução salina fisiológica, normasol, isolyte, plasma-lyte, ou tampão fosfato salino (PBS) . Em todos os casos, a GFU tem de ser estéril (ao contrário de quaisquer NPCs ou MNCs que estão presentes) e deve ser de tal forma fluído que exista fácil seringabilidade (fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, utilizando materiais tal como lecitina, mantendo um certo tamanho das partículas no caso de dispersão, e incluindo agentes tensioativos). A GFU deve ser estável sob condições de produção e armazenamento e deve ser preservado contra a ação contaminante de microrganismos tal como bactérias e fungos, como anteriormente descrito. Em certos casos, será preferível incluir, por exemplo, açúcares, poliálcoois tal como manitol ou sorbitol, cloreto de sódio, LiCl, butirato de Na, e ortovanadato de sódio na GFU. Em geral, as GFUs inovadoras podem ser preparadas incorporando as NPCs num veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e opcionalmente outros ingredientes entre aqueles enumerados anteriormente. É especialmente vantajoso formular as GFUs da invenção em formas de dosagem das unidades formadoras de enxerto para facilidade de administração e uniformidade da dosagem. A forma de dosagem da unidade formadora de enxerto como utilizado aqui refere-se a unidades fisicamente discretas apropriadas como dosagens unitárias para o sujeito a ser tratado. Numa forma de realização cada forma de dosagem de GFU contém uma quantidade pré-determinada de NPCs calculada 21 produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veiculo farmaceuticamente necessário. A especificação da forma de dosagem da unidade formadora de enxerto da invenção é ditada pela e diretamente dependente das caracteristicas únicas das NPCs, o efeito terapêutico particular a ser alcançado, e as limitações inerentes à especialidade de formulação de NPCs para o tratamento de indivíduos. 0 número de NPCs em cada forma de dosagem de unidades enxerto preferivelmente pode variar entre cerca de 1000 células a cerca de 1 bilhão de células, preferivelmente de cerca de 10.000 células a cerca de 100 milhões de células, mais preferivelmente de cerca de 50.000 células a cerca de 50 milhões de células. A concentração de NPCs em cada forma de dosagem da unidade de enxerto preferivelmente pode variar de cerca de 100 células/yL a cerca de 100.000 células/pL, e mais preferivelmente de cerca de 1.000 células/yL a cerca de 50.000 células/pL.

As GFUs podem ser incluídas num recipiente, pacote, ou dispensador juntamente com instruções para a administração. Os enxertos são preferivelmente guardados a aproximadamente 37 °C.

Em certas formas de realização pode ser desejável marcar as NPCs antes do transplante. Isto pode ser desejável em modelos pré-clínicos (i.e. não-humanos) de forma a seguir o rastro da migração das NPCs transplantadas, a diferenciação das NPCs transplantadas, a sobrevivência das NPCs transplantadas, e assim por adiante. Vários métodos de marcação de células podem ser empregues dependendo das circunstâncias pré-clínicas nas quais os marcadores são para serem lidos. Por exemplo, proteínas fluorescentes (proteína fluorescente verde, proteína fluorescente vermelha, etc.) podem ser utilizadas em circunstâncias em 22 que um detetor pode ser adequadamente colocado perto do local de transplante.

Quando analisando cérebros enxertados em situações não-clínicas, a análise imunohistoquímica pode ser útil. Numa forma de execução, seções do cérebro podem ser duplamente-imunomarcadas com proteína fluorescente verde (GFP) ou outros marcadores celulares, β-tubulina III, NeuN (uma proteína especifica de neurónios), proteína glial fibrilar ácida (GFAP) , ou 04 (uma proteína especifica de oligodendrócitos) para identificar perfis neuronais, dos astrócitos, da glia, ou dos oligodendrócitos. O número de perfis positivos para um dado anticorpo e o número de células que expressam GFP pode ser estimulado de acordo com a fórmula de correção Abercrombie. O volume de distribuição e os perfis positivos de GFP total (ou outro marcador) pode ser calculado através da determinação da área do cérebro contendo pelo menos perfis 10% GFP-positivo (ou outro marcador-positivo) em cada quinta seção e multiplicando pela distância dos aspetos anteriores do cérebro que contêm perfis GFP-positivo (ou outro marcador-positivo).

Numa forma de realização, quando se marca NPCs utilizando GFP, os seguintes materiais podem ser úteis:

Materiais: NPCs criopreservados, PBS (Invitrogen 14190- 136), HTS-FRS (Soluções BioLife 99-609-DV), suspensão-mãe GFP-Lentivirus com um título de aproximadamente 107/mL, brometo de hexamidina (polibreno) (Sigma (H-9268)-l ou 2 alíquotas congeladas Θ 10 mg/mL) , água estéril, USP, Opti-MEM (Invitrogen), e soro fetal bovino (Hyclone).

Uma suspensão-mãe GFP-Lentivirus pode ser obtida comercialmente, ou produzida utilizando kits comercialmente disponíveis tal como o sistema de expressão ViraPower 23

Lentiviral (disponível de Invitrogen, Carlsbad CA). Em particular, o vetor Gateway pLenti6/V5 pode ser combinado com uma cassete GFP, de acordo com as indicações do fabricante, para eventualmente produzir suspensões GFP-lentivirus adequadas.

Numa forma de realização, a marcação pode ser realizada de acordo com os protocolos de transfeção disponíveis no fabricante, tal como o sistema Invitrogen referido anteriormente.

Numa outra forma de realização, quando se marca NPCs utilizando GFP, os seguintes métodos podem ser úteis: os procedimentos de manuseio de células, exceto os passos de centrifugação, preferivelmente são realizados num "Biohazard Safety Cabinet" nível-2. Uma solução-mãe polibreno pode ser preparada dissolvendo 10 mg de polibreno em 1 mL de água estéril, USP, e filtrando através de um filtro de 0,25 mícron. A solução-mãe filtrada, resultante, pode ser dividida em alíquotas e guardada protegida da luz a -20 °C.

No dia anterior à infeção virai, plaquear as NPCs num balão T225 contendo 30 mL do meio de cultura celular a uma densidade de 2 milhões de células por balão; e cultivar as células numa incubadora a 37°C/5% CO2 durante a noite.

No dia da infeção virai, descongelar o lote lentivirus a RT e a solução-mãe polibreno num banho de água a 37°C. Num 50mL tubo falcon, adicionar 45mL de 10% FBS pré-aquecido (37°C) em alfa MEM e 5mL do lote virai descongelado para obter um meio com um MOI à volta de 10. Adicionar o polibreno descongelado a uma concentração final de lOyg/mL (1.000 X diluição). Remover o meio antigo do balão T225, e adicionar a mistura virai no balão e gentilmente balançar 24 para a frente e para trás 3-4 vezes. Tornar a colocar o balão na incubadora a 37°C/5% CO2.

No dia seguinte, remover completamente o meio virai do balão. Lavar 6 x 30mL com 10% FBS em alfa MEM. Recolher 5mL de cada lavagem para testar relativamente à infecciosidade. Substituir com meio de cultura fresco, e colocar o balão de volta na incubadora.

No dia seguinte, colher as células infetadas com o vírus, contar e re-suspendê-las num volume total de 360 yL em HTS-FRS e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL estéril, isento de DNAse, isento de RNAse, isento de pirogénio. A concentração de células infetadas pode ser definida para corresponder a um volume de transplante apropriado. As células podem ser mantidas em gelo molhado até à utilização para administração do enxerto.

B. MNCs, E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS DESTES

Numa forma de realização, MNCs são empregues na utilização desta invenção como parte de enxertos que são transplantados em doentes. O intuito é que as MNCs tenham um papel na recuperação funcional de uma região de um tecido de um doente que é de interesse. Deste modo, é possível o tratamento de lesões do sistema nervoso num doente. MNCs preferidas e métodos preferidos para providenciar tais MNCs são divulgados na PCT/JP03/01260, de Dezawa et al., intitulado "Method of Differentiating/Inducing Bone Marrow Interstitial Cells Into Nerve Cells and Skeleton Muscle Cells by Transferring Notch Gene" ("Dezawa"). Em particular, as "células neuronais" de Dezawa, como descrito ao longo de Dezawa e em particular no Exemplo 1, podem ser 25 utilizadas como as MNCs da presente invenção. Dezawa divulga que células estaminais da medula óssea aderentes podem ser transdiferenciadas em células neuronais que são então úteis como as MNCs da presente invenção.

Numa forma de realização preferida, MNCs podem ser produzidas de NPCs utilizando agentes neurotróficos. Agentes neurotróficos úteis são fator de crescimento básico dos fibroblastos (bFGF), e fator neurotrófico ciliar (CNTF). Métodos apropriados para utilizar agentes neurotróficos com NPCs in vitro podem ser encontrados na PCT/JP03/01260.

Em formas de realização, GFUs podem ser úteis na utilização desta invenção. Veículos farmaceuticamente aceitáveis úteis nas GFUs da presente invenção podem incluir: tampões isotónicos estéreis, FRS, isolyte, diluentes estéreis como água, solução salina normal, óleos fixos, polietileno glicóis, glicerina, propileno glicol, ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos ou antifúngicos tal como ácido ascórbico, timerosal, trimetoprima-sulfametoxazol, ácido nalidíxico, metenamina hipurato ou macrocristais de nitrofurantoína e semelhantes; agentes antioxidantes tal como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes tal como EDTA; tampões tal como acetatos, citratos, ou fosfatos; e agentes para o ajustamento da tonicidade tal como cloreto de sódio ou dextrose. 0 pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tal como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio.

Numa forma de realização, as unidades formadoras de enxerto apropriadas para utilização na presente invenção compreendem composições estéreis que compreendem as MNCS. Para administração intravenosa, veículos farmaceuticamente aceitáveis podem incluir solução salina fisiológica, 26

Cremofor EL.TM. (BASF; Parsippany, N.J.), normasol, isolyte, plasma-lyte, ou tampão fosfato salino (PBS) . Em todos os casos, a GFU tem de ser estéril (ao contrário de quaisquer NPCs ou MNCs que estão presentes) e deve ser de tal forma fluido que exista fácil serinqabilidade (fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, utilizando materiais tal como lecitina, mantendo um certo tamanho das partículas no caso de dispersão, e incluindo agentes tensioativos) . A GFU deve ser estável sob condições de produção e armazenamento e deve ser preservado contra a ação contaminante de microrganismos tal como bactérias e fungos, como anteriormente descrito. Em certos casos, será preferível incluir, por exemplo, açúcares, poliálcoois tal como manitol ou sorbitol, cloreto de sódio, LiCl, butirato de Na, e ortovanadato de sódio na GFU. Em geral, as GFUs inovadoras podem ser preparadas incorporando as NPCs num veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e opcionalmente outros ingredientes entre aqueles enumerados anteriormente. É especialmente vantajoso formular as GFUs da invenção em formas de dosagem das unidades formadoras de enxerto para facilidade de administração e uniformidade da dosagem. A forma de dosagem da unidade formadora de enxerto como utilizado aqui refere-se a unidades fisicamente discretas apropriadas como dosagens unitárias para o sujeito a ser tratado. Numa forma de realização cada forma de dosagem de GFU contém uma quantidade pré-determinada de MNCs calculada produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmaceuticamente necessário. A especificação da forma de dosagem da unidade formadora de enxerto da invenção é ditada pela e diretamente dependente das características únicas das MNCs, o efeito terapêutico particular a ser alcançado, e as limitações inerentes à especialidade de formulação de MNCs para o tratamento de 27 indivíduos. 0 número de MNPs em cada forma de dosagem de unidades enxerto preferivelmente pode variar entre cerca de 1000 células a cerca de 1 bilhão de células, preferivelmente de cerca de 10.000 células a cerca de 100 milhões de células, mais preferivelmente de cerca de 50.000 células a cerca de 50 milhões de células. A concentração de MNCs em cada forma de dosagem de unidade de enxerto preferivelmente pode variar de cerca de 100 células/yL a cerca de 100.000 células/yL, e mais preferivelmente de cerca de 1.000 células/yL a cerca de 50.000 células/pL.

As GFUs podem ser incluídas num recipiente, pacote, ou dispensador juntamente com instruções para a administração. Os enxertos são preferivelmente guardados a aproximadamente 4 °C.

Em certas formas de realização não-clínicas pode ser desejável marcar as MNCs antes do transplante. Isto pode ser desejável de forma a seguir o rastro da migração das MNCs transplantadas, as alterações adicionais das MNCs transplantadas, a sobrevivência das MNCs transplantadas, e assim por adiante. Vários métodos de marcação das células podem ser empregues dependendo das circunstâncias nas quais os marcadores são para serem lidos. Por exemplo, proteínas fluorescentes (proteína fluorescente verde, proteína fluorescente vermelha, etc.) podem ser utilizadas em circunstâncias em que um detetor pode ser adequadamente colocado perto do local de transplante. A marcação pode ser realizada utilizando métodos convencionais, tal como o sistema Invitrogen GFP-lentiviral indicado anteriormente.

Quando analisando cérebros enxertados em situações não-clínicas, a análise imunohistoquímica pode ser útil. Numa forma de execução, seções do cérebro podem ser duplamente-immunomarcadas com proteína fluorescente verde (GFP) ou 28 outros marcadores celulares, β-tubulina III, NeuN (uma proteína especifica de neurónios), proteína glial fibrilar ácida (GFAP) , ou 04 (uma proteína especifica de oligodendrócitos) para identificar perfis neuronais, dos astrócitos, da glia, ou dos oligodendrócitos. O número de perfis positivos para um dado anticorpo e o número de células que expressam GFP pode ser estimado de acordo com a fórmula de correção Abercrombie. O volume de distribuição e os perfis positivos de GFP total (ou outro marcador) pode ser calculado através da determinação da área do cérebro contendo pelo menos perfis 10% GFP-positivo (ou outro marcador-positivo) em cada quinta seção e multiplicando pela distância dos aspetos anteriores do cérebro que contêm perfis GFP-positivo (ou outro marcador-positivo). Numa forma de realização, MNCs podem ser marcadas fluorescentemente utilizando infeção retroviral mediante o vetor pBabe neo-GFP. M. Dezawa et al., "Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromal cells." Eur J Neurosci. 2001;14:1771-6. O procedimento pode ser modificado de tal forma que outras proteínas fluorescentes podem ser incorporadas no vetor.

C. TRANSPLANTE DE NPC

Numa forma de realização, NPCs e/ou GFUs de acordo com a invenção podem ser administradas utilizando protocolos e vias de administração convencionais, e quantidades de NPCs e/ou GFUs a serem administradas a doentes podem ser otimizadas utilizando técnicas de intervalo de doses convencionais. NPCs e/ou GFUs de acordo com a presente invenção podem ser administradas isoladamente ou em combinação com outras substâncias ou composições. Vias de administração podem ser escolhidas entre as vias de 29 administração convencionais do conhecimento do perito na especialidade. É contemplado que o transplante irá ser realizado através de uma variedade de métodos, incluindo mas não limitado a infusão através de uma cânula de injeção, agulha ou shunt, ou por implante dentro de um veiculo, p.ex., uma cápsula biodegradável, mas outras vias de administração estão também dentro do âmbito da invenção. NPCs e/ou GFUs de acordo com a invenção podem ser administradas sistemicamente a um doente, no qual por exemplo a administração por via parentérica tal como intravenosa (i.v.), ou intra-arterial (tal como através das artérias carótidas internas ou externas) são vias preferidas de administração sistémica. Técnicas de administração sistémica podem ser adaptadas das técnicas utilizadas para administrar em geral células percursoras, tal como aquelas divulgadas em D Lu et al.r "Intraarterial administration of marrow stromal cells in a rat model of traumatic brain injury." J Neurotrauma. 2001 Aug;18(8) :813-9.

Em formas de realização, NPCs e/ou GFUs de acordo com a invenção podem ser administradas localmente a uma lesão do sistema nervoso central de um doente. Numa forma de realização preferida, as NPCs e/ou GFUs da presente invenção podem ser administradas através de uma via intraparenquimal. Uma vantagem de administrar as NPCs e/ou GFUs localmente numa lesão do sistema nervoso central de um doente é que o sistema imunitário do doente pode ser menos ativo dentro da barreira hematoencefálica. Por conseguinte, as hipóteses de imuno-rejeição das NPCs pelo hospedeiro podem ser reduzidas, e as hipóteses da sobrevivência do enxerto podem ser aumentadas mesmo que todavia possam ser 30 necessários imunossupressores. Outra vantagem da administração local é direcionar mais precisamente as NPCs à lesão do CNS.

Quando transplantando numa lesão do sistema nervoso central, o transplante pode ser realizado utilizando procedimentos cirúrgicos estereotáticos. Em tais procedimentos, o doente está anestesiado. A cabeça do doente é colocada numa estrutura estereotática compatível com MRI e o microposicionador com micro-injetor colocado sobre o crânio. Podem ser feitos buracos de trepanação no crânio do doente utilizando uma broca dentária ou outro instrumento apropriado para expor áreas da dura mesmo sobre os locais alvo.

Numa forma de realização, pode ser feita uma passagem para a agulha utilizando uma agulha de calibre 26 e uma micro-seringa Hamilton (ou uma outra seringa com tamanho apropriado) , na qual a agulha é manualmente guiada para os locais de enxerto utilizando imagens de MRI para assegurar a colocação adequada das NPCs e/ou GFU. Injeções, preferivelmente sob a forma de injeções em bólus, podem ser feitas no(s) local (is) de enxerto. As taxas das infusões podem variar, preferivelmente volumes de infusão são de cerca 0,1 a cerca de 10 pL/min, mais preferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 5 yL/min, e ainda mais preferencialmente de cerca de 1,0 a cerca de 3,0 pL/min. Numa forma de realização, a agulha pode permanecer no local por um periodo de tempo, preferivelmente variando entre cerca de 1 a cerca de 10 minutos, mais preferivelmente entre cerca de 5 minutos, a seguir à infusão. A seguir ao periodo em que a agulha é mantida no local, a agulha pode ser erguida uma pequena distância, preferivelmente cerca de 1 mm a cerca de 10 mm, mais preferivelmente cerca de 2 mm e depois mantida no local por um periodo de tempo adicional, 31 preferivelmente variando entre cerca de 5 minutos a cerca de 30 minutos, mais preferivelmente cerca de 15 minutos. A seringa pode então ser removida do doente, o local da ferida pode ser fechado em camadas anatómicas, e o doente monitorizado relativamente à recuperação da anestesia.

Analgésicos, (p.ex., buprenorfina) e antibióticos (p.ex., cefazolina, 50 mg/kg, IM, b.i.d. x 5 dias) podem ser administrados, consoante necessário, como parte dos procedimentos cirúrgicos/pós-cirúrgicos. O tratamento com antibióticos pode ser continuado pós-cirurgia por um período de tempo prolongado, preferivelmente até 30 dias a seguir á cirurgia, para suprimir infeções oportunistas. Técnicas adicionais para implantação podem ser encontrados em K S Bankiewicz et al.r "Technique for bilateral intracranial implantation of cells in monkeys using an automated delivery system." Cell Transplantation, 9(5) :595-607 (2000) .

Em certas formas de realização, agentes imunossupressores podem ser administrados juntamente com os enxertos inovadores e/ou NPCs. Estes agentes podem ajudar a suprimir a rejeição das NPCs pelo sistema imunitário do doente, particularmente quando o enxerto e/ou NPCs são administrados sistemicamente. Exemplos de imunossupressores úteis na utilização desta invenção incluem, mas não estão limitados a antimetabolitos tal como azatioprina, agentes alquilantes tal como ciclofosfamida, antagonistas do ácido fólico tal como metotrexato ou mercaptopurina (6-MP), micofenolato (CellCept), ciclosporina-A e tacrolímus (FK-506) . Um agente imunossupressor preferido é CsA. CsA pode ser obtido de uma variedade de fontes, incluindo como Sandimmune®, Injection; produzido por Novartis Pharma AG, 32

Basel, Switzerland for Novartis Pharmaceuticals Corporation (Novartis), East Hanover, NJ.

Os imunossupressores podem ser administrados por uma variedade de vias, incluindo oral, i.p., e i.v. A dosagem dos imunossupressores pode variar de acordo com a natureza do imunossupressor e o doente. Numa forma de realização, o imunossupressor pode ser doseado dois dias antes do transplante e continuado em intervalos apropriados posteriormente. Numa forma de realização, o imunossupressor pode ser doseado iniciando no dia da enxertagem (aproximadamente quatro horas após o procedimento) e continuando a intervalos de 24-horas posteriormente. Intervalos de dosagem preferivelmente podem variar de cerca de 0,5 mg/kg/dia a cerca de 100 mg/kg/dia, mais preferivelmente de cerca de 5 mg/kg/dia a cerca de 75 mg/kg/dia, ainda mais preferivelmente de cerca de 5 mg/kg/dia a cerca de 50 mg/kg/dia. As injeções intravenosas podem ser administradas como um bólus, a uma taxa que varia preferivelmente de cerca de 0,005 a cerca de 0,100 mL/minuto, mais preferivelmente a cerca de 0,050 mL/minuto. NPCs e/ou GFUs de acordo com a invenção podem ser administradas utilizando protocolos e vias convencionais de administração, e quantidades de NPCs e/ou GFUs a serem administradas a doentes podem ser otimizadas utilizando técnicas de intervalo de doses convencionais. NPCs e/ou GFUs de acordo com a presente invenção podem ser administradas isoladamente ou em combinação com outras substâncias ou composições. Vias de administração podem ser escolhidas entre as vias convencionais de administração do conhecimento do perito na especialidade. É contemplado que o transplante irá ser realizado por uma variedade de métodos, incluindo mas não limitado a infusão 33 através de uma cânula de injeção, agulha ou shunt, ou através de implantação dentro de um veiculo, p.ex., uma cápsula biodegradável, mas outras vias de administração estão também dentro do âmbito da invenção.

Em formas de realização, NPCs e/ou GFUs de acordo com a invenção podem ser administradas localmente a uma lesão do sistema nervoso central de um doente. Numa forma de realização preferida, as NPCs e/ou GFUs da presente invenção podem ser administradas através de uma via intraparenquimal. Uma vantagem de administrar as NPCs e/ou GFUs localmente numa lesão do sistema nervoso central de um doente é que o sistema imunitário do doente pode ser menos ativo dentro da barreira hematoencefálica. Por conseguinte, as hipóteses de imuno-rejeição das NPCs pelo hospedeiro podem ser reduzidas, e as hipóteses de sobrevivência do enxerto podem ser aumentadas mesmo que todavia possam ser necessários imunossupressores. Outra vantagem de administração local é direcionar mais precisamente as NPCs à lesão do CNS.

D. TRANSPLANTE DE CÉLULAS NEURONAIS DERIVADAS DE MASC

Numa forma de realização, MNCs e/ou GFUs de acordo com a invenção podem ser administradas utilizando protocolos e vias de administração convencionais, e quantidades de MNCs e/ou GFUs a serem administradas a doentes podem ser otimizadas utilizando técnicas de intervalo de doses convencionais. MNCs e/ou GFUs de acordo com a presente invenção podem ser administradas isoladamente ou em combinação com outras substâncias ou composições. Vias de administração podem ser escolhidas entre as vias de administração convencionais do conhecimento do perito na especialidade. 34 É contemplado que o transplante irá ser realizado através de uma variedade de métodos, incluindo mas não limitado a infusão através de uma cânula de injeção, agulha ou shunt, ou por implante dentro de um veiculo, p.ex., uma cápsula biodegradável, mas outras vias de administração estão também dentro do âmbito da invenção.

Em formas de realização, MNCs e/ou GFUs de acordo com a invenção podem ser administradas localmente a uma lesão do sistema nervoso central de um doente. Numa forma de realização preferida, as MNCs e/ou GFUs da presente invenção podem ser administradas através de uma via intraparenquimal. Uma vantagem de administrar as MNCs e/ou GFUs localmente numa lesão do sistema nervoso central de um doente é que o sistema imunitário do doente pode ser menos ativo dentro da barreira hematoencefálica. Por conseguinte, as hipóteses de imuno-rejeição das MNCs pelo hospedeiro podem ser reduzidas, e as hipóteses de sobrevivência do enxerto podem ser aumentadas mesmo que todavia possam ser necessários imunossupressores. Outra vantagem de administração local é direcionar mais precisamente as MNCs à lesão do CNS.

Quando transplantando numa lesão do sistema nervoso central, o transplante pode ser realizado utilizando procedimentos cirúrgicos estereotáticos. Em tais procedimentos, o doente está anestesiado. A cabeça do doente é colocada numa estrutura estereotática compatível com MRI e o microposicionador com micro-injetor colocado sobre o crânio. Podem ser feitos buracos de trepanação no crânio do doente utilizando uma broca dentária ou outro instrumento apropriado para expor áreas da dura mesmo sobre os locais alvo. 35

Numa forma de realização, pode ser feita uma passagem para a agulha utilizando uma agulha de calibre 26 e uma micro-seringa Hamilton (ou uma outra seringa com tamanho apropriado), no qual a agulha é manualmente guiada para os locais de enxerto utilizando imagens de MRI para assegurar a colocação adequada das MNCs e/ou GFU. Injeções, preferivelmente sob a forma de injeções em bólus, podem ser feitas no (s) local (is) de enxerto. As taxas das infusões podem variar, preferivelmente volumes de infusão são de cerca 0,1 a cerca de 10 yL/min, mais preferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 5 yL/min, e ainda mais preferencialmente de cerca de 1,0 a cerca de 3,0 pL/min. Numa forma de realização, a agulha pode permanecer no local por um periodo de tempo, preferivelmente variando entre cerca de 1 a cerca de 10 minutos, mais preferivelmente cerca de 5 minutos, a seguir à infusão. A seguir ao período em que a agulha é mantida no local, a agulha pode ser erguida uma pequena distância, preferivelmente cerca de 1 mm a cerca de 10 mm, mais preferivelmente cerca de 2 mm e depois mantida no local por um período de tempo adicional, preferivelmente variando entre cerca de 5 minutos a cerca de 30 minutos, mais preferivelmente cerca de 15 minutos. A seringa pode então ser removida do doente, o local da ferida pode ser fechado em camadas anatómicas, e o doente monitorizado relativamente à recuperação da anestesia.

Analgésicos, (p.ex., buprenorfina) e antibióticos (p.ex., cefazolina, 50 mg/kg, IM, b.i.d. x 5 dias) podem ser administrados, consoante necessário, como parte dos procedimentos cirúrgicos/pós-cirúrgicos. O tratamento com antibióticos pode ser continuado pós-cirurgia por um período de tempo prolongado, preferivelmente até 30 dias a seguir á cirurgia, para suprimir infeções oportunistas. 36 Técnicas adicionais para implantação podem ser encontrados em K S Bankiewicz et al., "Technique for bilateral intracranial implantation of cells in monkeys using an automated delivery system." Cell Transplantation, 9(5) :595-607 (2000).

Em certas formas de realização, agentes imunossupressores podem ser administrados juntamente com os enxertos inovadores e/ou MNCs. Estes agentes podem ajudar a suprimir a rejeição das MNCs pelo sistema imunitário do doente. Exemplos de imunossupressores úteis na utilização desta invenção incluem, mas não estão limitados a antimetabolitos tal como azatioprina, agentes alquilantes tal como ciclofosfamida, antagonistas do ácido fólico tal como metotrexato ou mercaptopurina (6-MP), micofenolato (CellCept), ciclosporina-A e tacrolimus (FK-506). Um agente imunossupressor preferido é CsA. CsA pode ser obtido de uma variedade de fontes, incluindo como Sandimmune®, Injection; produzido por Novartis Pharma AG, Basel, Switzerland for Novartis Pharmaceuticals Corporation (Novartis), East Hanover, NJ.

Os imunossupressores podem ser administrados por uma variedade de vias, incluindo oral, i.p., e i.v. A dosagem dos imunossupressores pode variar de acordo com a natureza do imunossupressor e o doente. Numa forma de realização, o imunossupressor pode ser doseado dois dias antes do transplante e continuado em intervalos apropriados posteriormente. Numa forma de realização, o imunossupressor pode ser doseado iniciando no dia da enxertagem (aproximadamente quatro horas após o procedimento) e continuando a intervalos de 24-horas posteriormente. Intervalos de dosagem preferivelmente podem variar de cerca de 0,5 mg/kg/dia a cerca de 100 mg/kg/dia, mais preferivelmente de cerca de 5 mg/kg/dia a cerca de 75 37 mg/kg/dia, ainda mais preferivelmente de cerca de 5 mg/kg/dia a cerca de 50 mg/kg/dia. As injeções intravenosas podem ser administradas como um bólus, a uma taxa que varia preferivelmente de cerca de 0,005 a cerca de 0,100 mL/minuto, mais preferivelmente a cerca de 0,050 mL/minuto. E. OBSERVAÇÕES EXPERIMENTAIS E VANTAGENS DE NPCs

Embora ambos os transplantes autólogos e alogénicos de NPCs, incluindo composições farmacêuticas que compreendem NPCs, sejam contempladas por esta invenção, o transplante alogénico (unidades formadoras de enxerto da mesma espécie) é preferível. Numa forma de realização, o transplante alogénico imita o cenário clinico no qual pode ser realizado o transplante alogénico de NPCs em doentes que sofrem de uma lesão do sistema nervoso central. Aqui divulgado são os resultados de transplante estereotaxicamente de NPCs, de acordo com a invenção, nos cérebros de ratos machos adultos Sprague-Dawley que foram submetidos a oclusão da artéria cerebral média (MCAo), ligação da artéria cerebral média (MCAI) ou isquémia transitória global (TGI). Estes modelos são úteis na compreensão da eficácia da presente invenção no tratamento de lesões do sistema nervoso central. Discussão adicional destes modelos pode ser encontrada na literatura, particularmente C. Borlongan et al., "Transplantation of cryopreserved human embryonal carcinoma-derived neurons (NT2N cells) promotes functional recovery in ischemic rats." Exp Neurol. 1998;149:310-21; e C. Borlongan et al., "Glial cell survival is enhanced during melatonin-induced neuroprotection against cerebral ischemia." FASEB J. 2000;14:1307-17. Cada animal com acidente vascular cerebral recebeu um enxerto compreendendo uma de três doses de células: cerca de 40.000, 100.000 e 200.000 NPCs viáveis (estes números são compreendidos serem aproximados aos 38 utilizados posteriormente). 0 transplante foi realizado às cerca de 6 semanas pós acidente vascular cerebral, e os animais foram imunossuprimidos diariamente com ciclosporina-A (10 mg/kg, i.p.) ao longo do tempo de sobrevivência pós transplante. O desempenho locomotor e cognitivo dos ratos transplantados foi caraterizado semanalmente ao longo de um período de 4 semanas pós transplante, e uma outra vez às 12 semanas pós transplante. O exame histológico da extensão da isquémia cerebral e sobrevivência do enxerto foi realizado em animais selecionados aleatoriamente às 5 semanas e às 12 semanas pós transplante.

Os seguintes testes foram utilizados na determinação do resultado de tanto a operação de acidente vascular cerebral como dos procedimentos de transplante como definidos abaixo em mais detalhe. A forma de realizar estes testes é definida aqui noutro local, e irá também ser compreendida por um perito na especialidade.

TABELA 1: PARÂMETROS DA EFICÁCIA DO TRANSPLANTE NPC

Teste EBST

Exame neurológico Labirinto de água de Morris Histologia TTC GFAP

Obj etivo

Revela os défices locomotores após o acidente vascular cerebral e a recuperação após transplante

Revela anomalias sensório-motoras após o acidente vascular cerebral e a recuperação após transplante

Revela défices cognitivos após o acidente vascular cerebral e a recuperação após transplante

Revela a extensão do enfarte cerebral Revela a extensão do enfarte cerebral e a 39 resposta imunitária do hospedeiro ao transplante

Vetor virai Revela a sobrevivência e migração das NPCs GFP enxertadas

Neu-N Revela a expressão fenotipica neuronal das NPCs enxertadas

Legenda: EBST, "elevated body swing te st"; TTC, cloreto de trifeniltetrazólio; GFAP, proteina glial fibrilar ácida

Os dados obtidos nos Exemplos abaixo revelaram que, nos modelos estudados, os animais transplantados com NPCs revelaram melhorias significativas em ambos os desempenhos locomotores e cognitivos em comparação com os seus desempenhos à entrada no estudo, pré-transplante. As duas doses mais elevadas de cerca de 100.000 e cerca de 200.000 células promoveram melhores efeitos comportamentais em comparação com a dose de células mais baixa de cerca de 40.000 células, sugerindo assim uma relação dose-resposta. A recuperação robusta de défices comportamentais induzidos pelo acidente vascular cerebral foi verificada tão cedo quanto uma semana pós transplante e mantida ao longo do periodo pós-transplante de quatro semanas. Melhorias significativas no desempenho motor (utilizando o "elevated body swing te st" e o teste de Bederson) foram observadas em todos os três tipos de acidente vascular cerebral. Em contraste, melhorias significativas no desempenho cognitivo (utilizando o labirinto de água de Morris) foram mais robustas e estáveis em animais MCAo e TGI transplantados em comparação com animais MCAI transplantados. Todos os animais com acidente vascular cerebral transplantados tinham uma aparência saudável e não houveram nenhuns efeitos adversos evidentes observáveis durante o periodo de estudo. 40 O tipo de acidente vascular cerebral parece ser um fator na recuperação funcional, em que enquanto todos os animais com acidente vascular cerebral revelaram melhorias significativas no desempenho motor, os animais MCAo e TGI transplantados apresentaram melhor recuperação no desempenho cognitivo em comparação com os animais MCAI transplantados. A demonstração da recuperação significativa de ambas as funções motoras e cognitivas em animais MCAo e TGI transplantados sugere que estes dois modelos de acidente vascular cerebral que produziram danos nos gânglios basais e no hipocampo, respetivamente, respondem ao transplante de NPC. A extrapolação destas observações para a aplicação clinica iria indicar que doentes com acidente vascular cerebral fixado nos gânglios basais e no hipocampo poderão beneficiar de transplante NPC.

Os resultados histológicos às 5 e 12 semanas pós transplante indicam que a sobrevivência do enxerto NPC mediou os efeitos funcionais observados. Os dados sugerem que o transplante de 100.000 e 200.000 NPCs produzem uma melhor recuperação comportamental do que a dose mais baixa de 40.000 células. As análises de correlação entre a sobrevivência do enxerto e efeitos comportamentais suportam adicionalmente que as NPCs sobreviventes promoveram a recuperação motora e cognitiva em animais com acidente vascular cerebral. De notar, a sobrevivência do enxerto foi determinada utilizando a abordagem de marcação com lentivirus, e foi mostrado esta estratégia ser fiável para marcar NPCs enxertadas. Além disso, com este método, a migração NPC foi facilmente localizada.

Dependendo do tipo de acidente vascular cerebral, parece que quanto mais severo o dano cerebral, como visto em ambos MCAo e MCAI, melhor a migração de NPCs. Em contraste, o dano cerebral ligeiro causado por TGI parece ter resultado 41 em menor migração das células. A capacidade observada das NPCs de percorrerem longas distâncias para o local lesionado indica o seu potencial de migrar e exercer efeitos reparadores em locais alvo específicos do acidente vascular cerebral. Os resultados providenciados nos Exemplos abaixo suportam o ponto de vista de que NPCs que migram são mais prováveis de se diferenciarem em fenótipos neuronais. Existem muitos fatores que poderão ter contribuído para esta diferenciação preferencial das células migradas, incluindo mas não limitado ao micro-ambiente no hospedeiro e tipo de acidente vascular cerebral (localização e grau/tipo de morte celular). F. OBSERVAÇÕES EXPERIMENTAIS E VANTAGENS DE MNCs

Embora ambos os transplantes autólogos e alogénicos de MNCs, incluindo composições farmacêuticas que compreendem MNCs, sejam contempladas por esta invenção, o transplante alogénico (unidades formadoras de enxerto da mesma espécie) é preferível. Numa forma de realização, o transplante alogénico imita o cenário clínico no qual pode ser realizado o transplante alogénico de MNCs em doentes que sofrem de lesões do sistema nervoso central. Os resultados de ensaios em animais de transplante alogénico de MNCs em animais modelo de acidente vascular cerebral estão providenciados na seção J abaixo. Estes modelos são úteis para compreender a eficácia da presente invenção no tratamento de lesões do sistema nervoso central.

Os resultados na seção H sugerem que o grupo MNC apresentou melhorias significativas nos testes de avaliação comportamental em comparação com o grupo controlo e o MASC. Na análise histológica, o volume do enfarte medido aos 41 dias após MCAo não mostrou diferenças significativas entre os três grupos. Em comparação com MASCs, MNCs demonstraram 42 uma proporção de sobrevivência mais elevada e proporções maiores de MNCs mostraram positividade para marcadores neuronais e extensão das projeções dos neurónios no cérebro do hospedeiro. 0 grupo MASC demonstrou ligeiras melhorias nos testes de avaliação comportamental em comparação com o grupo controlo, mas não tanto quanto o grupo NMC.

Outra vantagem do transplante de MNC de acordo com a invenção é a maior taxa de sobrevivência de MNC em comparação, por exemplo, com as MASCs multipotentes. Um mês após o transplante, aproximadamente 30-45% das MNCs transplantadas foram detetadas enquanto apenas 10-20% das MASCs transplantadas foram detetadas. A maior taxa de sobrevivência das MNCs pode providenciar uma vantagem na recuperação funcional.

No presente estudo, algumas MNCs no córtex, corpo estriado e hipocampo demonstraram extensão das projeções dos neurónios no cérebro hospedeiro, o que não pôde ser observado no grupo MASC. Portanto as melhorias comportamentais significativas no grupo MNC sugerem que as MNCs transplantadas mantiveram caracteristicas neuronais no cérebro hospedeiro, e contribuíram para a recuperação funcional no modelo do rato MCAO.

G. EXEMPLOS NPC

Os Exemplos definidos aqui pretendem ser ilustrativos, e de forma nenhuma limitativos, do âmbito da presente invenção.

Procedimentos experimentais. Todos os animais inicialmente foram submetidos a cirurgia de acidente vascular cerebral MCAo, MCAI ou TGI. Aproximadamente às seis semanas após a 43 cirurgia, os animais foram testados no "elevated body swing test", teste de Bederson, e tarefa do labirinto de água de Morris. Apenas os animais que revelaram défices motores significativos foram subsequentemente utilizados para a cirurgia de transplante e atribuídos aleatoriamente a um dos seguintes tratamentos. 0 tamanho da amostra para cada braço do estudo é indicado na Tabela 2.

TABELA 2. CONDIÇÕES DO TRATAMENTO

Ratos totais utilizados neste estudo

Tipo de Dose de Tipo de Tamanho da enxerto células acidente amostra (aprox.) vascular cerebral NPC 40.000 MCAo 8 MCAI 10 TGI 8 100.000 MCAo 10 MCAI 10 TGI 8 200.000 MCAo 10 MCAI 10 TGI 8

Todos os animais foram submetidos a cirurgia de acidente vascular cerebral, receberam transplantes de 3 passagens para a agulha (MCAo e MCA1) ou 2 passagens para a agulha (TG1), e foram tratados diariamente com ciclosporina-A (10 mg/kg, i.p.) diária.

Os animais foram submetidos semanalmente a testes durante as primeiras 4 semanas pós transplante. Metade dos animais sofreram eutanásia às 5 semanas pós transplante para análise histológica do enfarte cerebral e sobrevivência do 44 enxerto, expressão fenotípica, e migração. 0 resto dos animais foram outra vez testados a nivel comportamental e posteriormente sofreram eutanásia às 12 semanas pós acidente vascular cerebral de forma a avaliar os efeitos comportamentais e histológicos a longo prazo de NPCs. Para efeitos de clareza, é providenciado um diagrama esquemático abaixo.

Cirurgia de acidente vascular cerebral 1 Testes comportamentais (seis semanas pós acidente vascular cerebral; apenas animais que atingiram os critérios foram incluídos no estudo 1 Transplante (seis semanas pós acidente vascular cerebral) l Testes comportamentais (semanalmente ao longo de 4 semanas e às 12 semanas pós transplante) l Eutanásia às 5 ou 12 semanas pós transplante [0157] Marcação de células utilizando o sistema vetor GFP-Lentiviral: 0 sistema GFP-lentivirus foi fornecido pelo Dr. Didier Trono da Universidade de Genebra (Genebra, Suiça). NPCs foram marcadas utilizando o seguinte esquema geral. Variações menores no método eram toleradas.

Materiais necessários 10 mg/mL solução-mãe de polibreno / estéril filtrada (Sigma)

Meio Opti-MEM (Gibco / Invitrogen) 1 % soro fetal bovino com antibióticos (penicilina / estreptomicina) 45

Placa de 6 poços aproximadamente 1X106 células San-Bio Suspensão virai

Procedimento detalhado 1. Aquecer meio celular numa incubadora a 37°C.

2. Adicionar polibreno a 10 mg/mL (Adicionar 10 pL de uma 10 mg/mL solução-mãe de polibreno a 10 mL meio. Agitar bem.) 3. Num tubo separado, adicionar 1 mL suspensão virai a 1 mL meio contendo polibreno. 4. Descongelar rapidamente uma aliquota celular SanBio num banho de água a 37°C. Passar o vial com 70% etanol; secar. 5. Adicionar o conteúdo completo a um tubo de centrifugação de 15 mL contendo 10 mL PBS pré-aquecido; agitar suavemente e centrifugar a 1000 RPMs numa centrífuga clinica de baixa velocidade, temperatura ambiente, 5 minutos. 6. Cuidadosamente tirar com uma pipeta o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 2 mL meio pré-aquecido contendo virus. (do passo 3) 7. Transferir os conteúdos para um poço de uma placa de 6 poços; colocar na incubadora a 37°C; Incubar durante 3-horas. 8. Lavar as células em 10 mL PBS pré-aquecido, duas vezes. 9. Ressuspender as células em 20 pL PBS ou meio de escolha. Transferir para um tubo Eppendorf de 1,5 mL. Manter em gelo. As células estão prontas para transplantar.

Testes comportamentais: Os animais foram sujeitos às seguintes medidas sensório-motoras e cognitivas comportamentais nos estudos farmacológicos de NPCs de acordo com a invenção: "Elevated body swing te st" (EBST)

Labirinto de água de Morris (MWM) 46

Escala neurológica de Bederson "Elevated body swing te st" (EBST) 0 "elevated body swing test" (EBST) mede os reflexos posturais básicos e a função assimétrica do corpo. 0 teste EBST foi demonstrado mostrar um défice duradouro a seguir à isquémia MCAo e MCAI no roedor. C. Borlongan et al., "Locomotor and passive avoidance déficits following occlusion of the middle cerebral artery." Physiol Behav. 1995, 58:909-17. Ver também C. Borlongan et al., "Early assessment of motor dysfunctions aids in successful occlusion of the middle cerebral artery." Neuroreport. 1998b; 9:3615-21. Também foi avaliado em paradigmas de transplante neuronal para acidente vascular cerebral crónico. C. Borlongan et al., "Early assessment of motor dysfunctions aids in successful occlusion of the middle cerebral artery." Neuroreport. 1998; 9:3615-21. isto é EBST envolve manusear o animal pela sua cauda e registar a direção das oscilações. O equipamento de ensaio consistia numa caixa de plexiglas transparente (40 x 40 x 35,5 cm). O animal foi gentilmente pegado pela base da cauda, e elevado pela cauda até o nariz do animal estar a uma altura de 2 polegadas (5 cm) acima da superfície. A direção da oscilação, ou esquerda ou direita, foi contada quando a cabeça dos animais se moveu lateralmente aproximadamente 10 graus da linha média do corpo. Após uma única oscilação, o animal é colocado de volta na caixa plexiglas e foi-lhe permitido mover livremente durante 30 segundos antes de re-testar. Estes passos são repetidos 20 vezes para cada animal. Normalmente, ratos intactos revelam uma tendência de oscilação de 50%, isto é, o mesmo número de oscilações 47 para a esquerda e para a direita. Uma tendência de oscilação de 75% irá indicar 15 oscilações numa direção e 5 na outra durante 20 ensaios. O trabalho prévio com o EBST verificou que animais lesionados revelam atividade com tendência de oscilação >75% ao um mês após uma lesão nigroestriatal; a assimetria é estável durante até seis meses.

Exame neurológico de Bederson A escala neurológica de Bederson mede as tarefas sensório-motoras. J. Bederson et al., "Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination." Stroke. 1986;17:472-6; M. Altumbabic, "Intracerebral hemorrhage in the rat: effects of hematoma aspiration." Stroke. 1998;29:1917-22. O trabalho prévio mostrou défices mensuráveis ao longo do tempo conforme medido pelo modelo de Bederson em ambos os modelos de acidente vascular cerebral MCAo e o MCAI no rato.

Cerca de uma hora após o EBST, foi realizado o exame neurológico de Bederson seguindo os procedimentos previamente descritos. Uma classificação neurológica para cada rato é obtida utilizando 4 testes que incluem: (a) observação de fazer circulos espontâneos ipsilateral, classificado de 0 (nenhumas voltas) a 3 (dar voltas continuamente); (b) retração do membro posterior contralateral, que mede a capacidade do animal de substituir o membro posterior após este ter sido deslocado lateralmente 2 a 3 cm, classificado de 0 (substituição imediata) a 3 (substituição após minutos ou nenhuma substituição); 48 (c) capacidade de andar na viga, classificado 0 para um rato que atravessa prontamente uma viga de 2,4-cm-largura, 80-cm-comprimento a 3 para um rato incapaz de permanecer na viga durante 10 segundos; e (d) preensão das patas dianteiras bilateral, que mede a capacidade de se agarrar a uma vara metálica de 2-mm-diâmetro, classificado 0 para um rato com comportamento de preensão das patas dianteiras normal a 3 para um rato incapaz de se agarrar com as patas dianteiras.

As classificações de todos os 4 testes, que são realizados durante um período de cerca de 15 minutos em cada dia de avaliação, são adicionadas para se obter a classificação de défice neurológico (classificação máxima possível, 12).

Labirinto de água de Morris (MWM) 0 labirinto de água de Morris avalia vários aspetos do funcionamento cognitivo, incluindo aquisição e retenção de tarefas, estratégias de procura, e preservação. A tarefa no labirinto de água é considerada ser sensível a danos em várias áreas cerebrais afetadas por MCAo incluindo corpo estriado e córtex frontal.

Cerca de uma hora após o exame neurológico de Bederson, os animais foram introduzidos ao labirinto de água de Morris de forma a avaliar a memória espacial. O labirinto de água de Morris consiste num tanque insuflável, 6 pés de diâmetro e 3 pés de profundidade. O tanque foi enchido com 12 cm de água e tornado opaco através da adição de 300 mL de leite. Uma plataforma com uma altura de 11-cm feita de plexiglass transparente com uma superfície circular de 10 cm em diâmetro foi colocada em 1 de 4 posições na piscina. A plataforma está 1 cm abaixo da superfície de água e assim 49 escondida da vista de um animal na água. A piscina está dividida em quatro quadrantes de igual área de superfície. 0 rato teste foi colocado na piscina virado para o lado do tanque e libertado em 1 de 4 posições de partida (norte, sul, este, ou oeste), que foi determinado aleatoriamente, e foi colocado arbitrariamente a iguais distâncias da borda da piscina. A plataforma foi colocada no meio do quadrante sudoeste 25 cm da borda da piscina. 0 ponto de partida foi alterado após cada ensaio. Foi dado ao animal aproximadamente 60 segundos para encontrar a plataforma e foi-lhe permitido descansar na plataforma durante aproximadamente 30 segundos e colocado de novo na posição de partida, num total de 3 testes de posições de partida determinadas aleatoriamente. Se o rato falhava em encontrar a plataforma escondida no espaço de aproximadamente 60 segundos, ele foi colocado na plataforma e foi-lhe permitido descansar na plataforma durante aproximadamente 30 segundos. Após o período de descanso, o rato foi colocado de volta no tanque e foi testado outra vez em 2 outros ensaios. O dia de treino consistiu em 3 ensaios. O dia de teste foi realizado no dia 2 (para ensaio de sondagem, ver abaixo) . Após cada ensaio de treino e de teste, o rato foi então colocado numa jaula sobre um tapete aquecido. Os trajetos nadados foram monitorizados através de uma camara de vídeo ligada a um computador através de um analisador de imagem. O tempo de latência de fuga para alcançar a plataforma e o comprimento do trajeto que o animal nadou para encontrar a plataforma foi utilizado para avaliar a aquisição da tarefa labirinto-água. Velocidade ao nadar = comprimento do trajeto/latência de escape foi utilizado para avaliar a capacidade motora dos ratos nesta tarefa. Para avaliar a recordação da posição da plataforma, foi realizado um ensaio de sondagem de 60-segundos sem plataforma na piscina no dia 2; a percentagem de tempo 50 despendido na posição anterior da plataforma foi monitorizada.

Cirurgia de acidente vascular cerebral MCAo: Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob condições assépticas. Os procedimentos de acidente vascular cerebral MCAo foram retirados da literatura, em particular de C. Borlongan et al., "Chronic cyclosporine-A injection in rats with damaged blood-brain barrier does not impair retention of passive avoidance." Neurosci Res. 1998, 32:195-200. A determinação em cada animal de oclusão bem-sucedida foi obtida utilizando um laser Doppler gue revelou redução significativa (>75%) do fluxo sanguineo cerebral durante a oclusão de 1-hora. MCAo produziu danos no corpo estriado consistentes.

Cirurgia de acidente vascular cerebral MCAI: O procedimento cirúrgico MCAI é descrito em geral em Y. Wang et al., "Glial Cell-Derived Neurotrophic Factor Protects Against Ischemia-Induced Injury in the Cerebral Córtex." 1997, J. Neuroscience; 17 (1): 4341-4348. O laser Doppler foi também utilizado para verificar a ligação arterial. MCAI produz danos corticais consistentes.

Cirurgia de acidente vascular cerebral TGI: Foi utilizada uma técnica de oclusão de 4-vasos. Sob anestesia profunda, foi feita aos animais uma incisão cervical ventral na linha média. As artérias vertebrais foram isoladas através do alar foramina da primeira vértebra cervical e foram utilizados microclips para ligar ambas as artérias carótidas comuns durante 15 minutos. Foi mostrado que esta técnica produz isquémia global cerebral, com danos do hipocampo consistentes. 51 Células percursoras neuronais: Células percursoras neuronais foram providenciadas por SanBio, Inc. (Mountain View CA). Estas células foram produzidas em geral de acordo com os ensinamentos de PCT/JP03/01260.

Procedimentos de enxertagem; Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob condições assépticas. Sob anestesia com equithesin (3 ml/kg i.p.) (verificado nos animais existência de reflexos à dor), os animais foram implantados com NPCs diretamente no corpo estriado para MCAo, no córtex para MCAI ou no hipocampo para TGI, utilizando uma cânula de implantação de calibre 26. Ver em geral Y. Wang et al., "Glial Cell-Derived Neurotrophic Factor Protects Against Ischemia-Induced Injury in the Cerebral Córtex" 1997, J. Neuroscience; 17 (11) :4341-4348 e C. Borlongan et al., "Transplantation of cryopreserved human embryonal carcinoma-derived neurons (NT2N cells) promotes functional recovery in ischemic rats." Exp Neurol. 1998;149:310-21. NPCs crio-preservadas foram obtidas utilizando os métodos aqui divulgados. Foram realizadas contagens de células viáveis, utilizando o método de exclusão de azul de tripano, antes do transplante e imediatamente após o transplante no último animal recipiente. As doses de células pré-determinadas (40.000, 100.000 e 200.000) referem-se ao número de células viáveis. A cirurgia de transplante foi realizada no espaço de 2 horas após descongelar as células. A taxa de infusão foi de 1 μΐ de solução de células por minuto. A seguir à infusão, foi permitido um periodo de absorção de 3-minutos antes da agulha ser retirada. Um tapete aquecido e um termómetro rectal mantiveram a temperatura corporal a cerca de 37°C ao longo da cirurgia e até recuperação da anestesia.

Análise estatística: Os dados comportamentais foram analisados utilizando ANOVA de medidas repetidas com a 52 significância estatística ajustada para p < 0,05. Testes post-hoc incluíram testes ajustados para revelar diferenças significativas (p's < 0,05) entre as condições de tratamento.

Exemplo 1: Resultados MCAo - Semanalmente durante quatro semanas pós transplante

Os animais teste foram submetidos ao procedimento MCAo como anteriormente descrito, e foram avaliados semanalmente durante quatro semanas pós transplante com os seguintes resultados. EBST: Para os testes semanais ao longo de quatro semanas pós transplante, ANOVA global revelou efeitos principais de tratamento significativos (F2, 21 = 57,06, p < 0,0001) (Figura 1). Efeitos significativos dependentes da dose (200.000 > 100.000 > 40.000) foram também observados (p's < 0,01). A assimetria motora foi significativamente reduzida em cada uma das quatro semanas pós transplante em comparação com à entrada no estudo (p's < 0,0001), com a recuperação mais robusta vista à uma semana pós transplante (p' s < 0, 0001), e com recuperação estável revelada para as subsequentes três semanas pós transplante. Testes post-hoc revelaram que a redução significativa na assimetria motora à 1 semana pós transplante não diferia entre as três doses de células, mas efeitos dependentes da dose foram vistos às 2, 3 e 4 semanas pós transplante (p's < 0,05) (Figura 2).

Teste de Bederson: Para os testes semanais ao longo de quatro semanas pós transplante, ANOVA global revelou efeitos principais de tratamento significativos (F2, 21 = 9,65, p < 0,001) (Figura 3). As doses mais elevadas de 200.000 e 100.000 células promoveram uma melhor melhoria nas classificações de défice neurológico que a dose mais 53 baixa de 40.000 células (p' s < 0,01). As melhorias nas classificações de défice neurológico foram significativamente reduzidas em cada uma das quatro semanas pós transplante em comparação com à entrada no estudo (p's < 0,0001), com uma tendência para uma melhor melhoria ao longo do tempo em que animais transplantados desempenharam melhor na 2, 3 e 4 semanas pós transplante em comparação com 1 semana pós transplante (p' s < 0,0001). Testes post-hoc revelaram que a redução significativa nas classificações de défice neurológico na 1 semana pós transplante não diferia entre as três doses de células, mas as doses mais elevadas 100.000 e 200.000 produziram uma melhor recuperação do que a dose baixa de 40.000 células às 2 semanas (p's < 0,05), e efeitos dependente da dose (200.000 > 100.000 > 40.000) foram vistos às 3 e 4 semanas pós transplante (p's < 0,05) (Figura 4).

Aquisição de MWM: Para os testes semanais ao longo de quatro semanas pós transplante, ANOVA global não revelou nenhuns efeitos principais de tratamento significativos (F2, 21 = 2,87, p = 0,08) (Figura 5). Parece haver uma tendência para um tempo de aquisição MWM mais longo ao longo do periodo de 4 semanas pós transplante como revelado pelos tempos de aquisição mais longos às 2, 3 e 4 semanas em comparação com à entrada no estudo e 1 semana pós transplante (p's < 0,01) (Figura 6).

Teste de sondagem MWM: Tempo para encontrar a plataforma. Para os testes semanais ao longo de quatro semanas pós transplante, ANOVA global revelou efeitos principais de tratamento significativos (F2, 21 = 61,33, p < 0,0001) (Figura 7). As doses mais elevadas de 200.000 e 100.000 células promoveram um tempo de localização da plataforma significativamente mais curto que a dose baixa de 40.000 células (p's < 0,0001). Melhorias no tempo para encontrar a 54 plataforma eram significativamente reduzidos em cada uma das quatro semanas pós transplante em comparação com à entrada no estudo (p's < 0,0001), com uma tendência para melhor melhoria ao longo do tempo em que os animais transplantados desempenharam melhor à 2, 3 e 4 semanas pós transplante em comparação com 1 semana pós transplante (p's < 0,0001). Testes post-hoc revelaram que doses mais elevadas de 200.000 e 100.000 produziram tempos significativamente mais curtos para encontrar a plataforma que a dose baixa de 40.000 células ao longo do período de 4-semanas pós transplante, com uma clara resposta dependente da dose (200.000 > 100.000 > 40.000) observada à 1 e 4 semanas pós transplante (p's < 0,05) (Figura 8).

Teste de sondagem MWM: Tempo despendido na área da plataforma. Para os testes semanais ao longo de quatro semanas pós transplante, ANOVA global revelou efeitos principais de tratamento significativos (F2, 21 = 15,19, p < 0,0001) (Figura 9). As doses mais elevadas de 200.000 e 100.000 células promoveram tempos significativamente mais longos despendidos na área da plataforma que a dose baixa de 40.000 células (p's < 0,01). O tempo despendido na área da plataforma era significativamente aumentado em cada uma das quatro semanas pós transplante em comparação com à entrada no estudo (p's < 0,0001), com uma tendência para melhor melhoria ao longo do tempo em que os animais transplantados desempenharam melhor à 3 e 4 semanas pós transplante em comparação com 1 e 2 semanas pós transplante (p's < 0,0001) . Testes post-hoc revelaram que as doses mais elevadas de 200.000 e 100.000 produziram tempos significativamente mais longos despendidos na área da plataforma que a dose baixa de 40.000 células ao longo do periodo de 4-semanas pós transplante (p' s < 0,05) (Figura 10) . 55

Exemplo 2: Resultados MCAI - Semanalmente durante quatro semanas pós transplante

Os animais teste foram submetidos ao procedimento MCAI como anteriormente descrito, e foram avaliados semanalmente durante quatro semanas pós transplante com os seguintes resultados. EBST: Para os testes semanais ao longo de quatro semanas pós transplante, ANOVA global revelou efeitos principais de tratamento significativos (F2, 24 = 76,30, p < 0,0001) (Figura 11). As doses mais elevadas de 200.000 e 100.000 células produziram uma melhor recuperação da assimetria motora que a dose baixa de 40.000 células (p's < 0, 0001) . A assimetria motora foi significativamente reduzida em cada uma das quatro semanas pós transplante em comparação com à entrada no estudo (p's < 0,0001), com melhor recuperação revelada às 2, 3 e 4 semanas pós transplante. Testes post-hoc revelaram que as doses mais elevadas significativamente reduziram a assimetria motora melhor que a dose baixa, com efeitos dependentes da dose (200.000 > 100.000 > 40.000) observados à 1 semana pós transplante(p's < 0,05) (Figura 12) .

Teste de Bederson: Para os testes semanais ao longo de quatro semanas pós transplante, ANOVA global revelou efeitos principais de tratamento significativos (F2, 24 = 3,65, p < 0,05) (Figura 13). A dose mais elevada de 200.000 células promoveu uma melhor melhoria nas classificações de défice neurológico que a dose baixa de 40.000 células (p's < 0,05); não foram encontradas diferenças significativas entre a dose média de 100.000 células e a dose baixa de 40.000 células (Figura 13). Melhorias nas classificações de défice neurológico foram significativamente reduzidas em 56 cada uma das quatro semanas pós transplante em comparação com à entrada no estudo (p's < 0,0001), e estáveis ao longo do tempo uma vez que não houve diferenças significativas entre as doses de células ao longo das classificações neurológicas semanais (p's > 0,005). Testes post-hoc revelaram que a dose mais elevada de 200.000 células produziu melhor recuperação que a dose baixa de 40.000 células às 3 e 4 semanas (p's < 0,01); não foram encontradas mais nenhumas diferenças significativas entre as doses de células em alturas mais cedo pós transplante (p's > 0,05) (Figura 14).

Aquisição de MWM: Para os testes semanais ao longo de quatro semanas pós transplante, ANOVA global não revelou nenhuns efeitos principais de tratamento significativos (F2, 24 = 5,78-16, p > 0,05) (Figura 15). Parece haver uma tendência para um tempo de aquisição MWM mais longo ao longo das 4 semanas pós transplante como revelado pelos tempos de aquisição mais longos às 1, 2, 3 e 4 semanas pós transplante em comparação com à entrada no estudo (p' s < 0,0001) (Figure 16).

Teste de sondagem MWM: Tempo para encontrar a plataforma. Para os testes semanais ao longo de quatro semanas pós transplante, ANOVA global não revelou nenhuns efeitos principais de tratamento significativos (F2, 24 = 0,62, p = 0,55) (Figura 17). Ao longo do tempo pós transplante, foram verificados tempos para a localização da plataforma mais longos (p's < 0,001) (Figura 18).

Teste de sondagem MWM: Tempo despendido na área da plataforma. Para os testes semanais ao longo de quatro semanas pós transplante, ANOVA global não revelou nenhuns efeitos principais de tratamento significativos (F2, 24 = 2,01, p = 0,16) (Figura 19). Embora uma tendência para 57 tempos despendidos na área da plataforma mais longos ao longo do período de 4-semanas pós transplante em comparação com à entrada no estudo (p's < 0,01), efeitos dependentes da dose transitórios foram apenas vistos à 1 semana pós transplante (p's < 0,05), e não nos outros períodos teste semanais (p's > 0,05) (Figura 20).

Exemplo 3: Resultados TGI- Semanalmente durante quatro semanas pós transplante

Os animais teste foram submetidos ao procedimento TGI como anteriormente descrito, e foram avaliados semanalmente durante quatro semanas pós transplante com os seguintes resultados.

Teste de Bederson: Para os testes semanais ao longo de quatro semanas pós transplante, ANOVA global revelou efeitos principais de tratamento significativos (F2, 23 = 47,33, p < 0,001) (Figura 21). As doses mais elevadas de 200.000 e 100.000 células promoveram uma melhor melhoria das classificações de défice neurológico que a dose baixa de 40.000 células (p's < 0,0001). As melhorias nas classificações de défice neurológico eram significativamente reduzidas em cada uma das quatro semanas pós transplante em comparação com à entrada no estudo (p's < 0,0001). Testes post-hoc revelaram que a redução significativa nas classificações de défice neurológico na 1 semana pós transplante não diferia entre as três doses de células, mas as doses mais elevadas 100.000 e 200.000 produziram uma melhor recuperação do que a dose baixa de 40.000 células às 2, 3 e 4 semanas (p's < 0,005), e efeitos dependentes da dose (200.000 > 100.000 > 40.000) foram observados às 4 semanas pós transplante (p's < 0,05) (Figura 22) . 58

Aquisição de MWM: Para os testes semanais ao longo de quatro semanas pós transplante, ANOVA global revelou efeitos principais de tratamento significativos (F2, 23 = 9,88, p < 0,001) (Figura 23). No entanto, este efeito de tratamento significativo foi alcançado apenas porque a dose mais elevada de 200.000 células produziu uma melhoria significativa transitória na aquisição da tarefa à 1 semana pós transplante em comparação com as outras duas doses de 100.000 e 40.000 células (p's < 0.005). Depois disso, foram verificados tempos de aquisição mais longos às 2, 3 e 4 semanas pós transplante em comparação com à entrada no estudo e 1 semana pós transplante (p' s < 0,005) (Figura 24) .

Teste de sondagem MWM: Tempo para encontrar a plataforma. Para os testes semanais ao longo de quatro semanas pós transplante, ANOVA global revelou efeitos principais de tratamento significativos (F2, 23 = 30,98, p < 0,0001) (Figura 25). As doses mais elevadas de 200.000 e 100.000 células promoveram um tempo de localização da plataforma significativamente mais curto que a dose baixa de 40.000 células (p's < 0,0001). Melhorias no tempo para encontrar a plataforma eram significativamente reduzidos em cada uma das quatro semanas pós transplante em comparação com à entrada no estudo (p's < 0.0001), com uma tendência para melhor melhoria ao longo do tempo em que os animais transplantados desempenharam melhor às 3 e 4 semanas pós transplante em comparação com 1 e 2 semanas pós transplante (p's < 0,0001. Testes post-hoc revelaram que a dose mais elevada de 200.000 produziu tempos significativamente mais curtos para encontrar a plataforma que as duas outras doses de 100.000 e 40.000 células no periodo 2 e 3 semanas pós transplante(p's < 0,05), enquanto as duas doses mais elevadas exerceram melhor melhoria na 59 procura da plataforma em comparação com a dose de células baixa às 4 quatro semanas pós transplante (p's < 0,05) (Figura 26).

Teste de sondagem MWM: Tempo despendido na área da plataforma. Para os testes semanais ao longo de quatro semanas pós transplante, ANOVA global revelou efeitos principais de tratamento significativos (F2, 23 = 54,06, p < 0,0001) (Figura 27). Efeitos dependentes da dose significativos (200.000 > 100.000 > 40.000) foram observados ao longo do período de 4-semanas pós transplante (p' s < 0,0001). Além disso, ao longo do período de 4- semanas pós transplante, tempos mais longos foram despendidos na área da plataforma (p' s < 0,0001). Testes post-hoc revelaram que as doses mais elevadas de 200.000 e 100.000 produziram tempos significativamente mais longos despendidos na área da plataforma que a dose baixa de 40.000 células no período 3 e 4 semanas pós transplante (p's < 0,05). Às 2 semanas pós transplante, apenas a dose de células mais elevada produziu tempos significativamente mais longos despendidos na área da plataforma em comaparação com as outras duas doses de células (p's < 0,05) (Figura 28).

Exemplo 4: Exame histológico às 5 semanas pós transplante

Animais selecionados aleatoriamente sofreram eutanásia às 5 semanas pós transplante (ver Tabela 3). Exames histológicos foram limitados a 2-3 amostras cerebrais para cada dose e tipo de acidente vascular cerebral. Consequentemente, análises quantitativas apenas puderam ser realizadas na sobrevivência do enxerto e migração baseada na epifluorescência GFP. Para os outros parâmetros histológicos, especificamente na utilização de diferentes 60 anticorpos marcadores para detetar expressão fenotipica, apenas é providenciado uma descrição geral.

Sobrevivência do enxerto NPC: A epifluorescência GFP revelou sobrevivência do enxerto dependente da dose (200.000 > 100.000 > 40.000) em todos os três tipos de acidente vascular cerebral (F8, 32 = 33,9, p < 0,0001) (Figura 29) . As contagens de células médias de células positivas para GFP revelou que a dose mais baixa de 40.000 células resultou em números baixos de enxertos sobreviventes positivos para GFP, enquanto ambas as doses mais elevadas de 100.000 e 200.000 resultaram em números mais elevados de enxertos sobreviventes positivos para GFP. Estas observações eram consistentes para animais MCAo, MCAI e TGI transplantados. No entanto, quando foram calculadas as percentagens para cada dose de células, não foram obtidas nenhumas diferenças significativas (F8, 32 = 1,67, p > 0,05) (Figura 30) na percentagem de sobrevivência do enxerto entre as 3 doses.

Tabela 3. Histologia às cinco semanas pós transplante

Tipo de Dose de Tipo de Tamanho da enxerto células acidente amostra vascular cerebral NPC 40.000 MCAo 4 MCAI 5 TGI 4 100.000 MCAo 5 MCAI 5 TGI 4 61 200.000 MCAo 5 MCAI 5 TGI 4

Correlações positivas entre sobrevivência do enxerto e recuperação funcional: Análises de regressão revelaram que quanto mais elevado o número de enxertos NPC sobreviventes (200.000 > 100.000 > 40.000), tanto melhor a melhoria funcional (Figura 31).

Migração do enxerto NPC: Epifluorescência GFP revelou que a maioria (aprox. 55%-85%) das células transplantadas permaneceu dentro do local de transplante original (Figura 32). Em animais MCAo transplantados, várias células positivas para GFP puderam ser facilmente identificadas dentro dos locais de transplante no corpo estriado originais (62%); em animais MCAI transplantados, células positivas para GFP permaneceram dentro dos locais de transplante corticais originais (53%), e; em animais TGI transplantados, células positivas para GFP permaneceram dentro dos locais do hipocampo originais (86%). No entanto, parece que ambos os animais MCAo e MCAI transplantados revelaram mais migração das células enxertadas em comparação com animais TGI transplantados. Todavia, quando foi observado migração, as células enxertadas permaneceram dentro da área alvo em geral, em que a migração do enxerto em MCAo foi observada dentro do corpo estriado, em MCAI dentro do córtex, e em TGI dentro do hipocampo. A migração do enxerto em ambos MCAo e MCAI foi caracterizada por células enxertadas na limitante da penumbra isquémica do corpo estriado e córtex, respetivamente. Além do mais para MCAo, foi observado uma migração de células ao longo da penumbra isquémica do corpo estriado de medial para lateral (1,8 mm) e dorsal para ventral (2,3 mm). Para MCAI, foi observada uma migração de células de medial para lateral 62 (4,4 mm). Para animais TGI transplantados, a migração do enxerto foi caracterizada por SBDPs positivas para GFP identificadas nas regiões CA2 e CA3 (1,6 mm e 0,7 mm de distância, respetivamente, do local de transplante original CAI) .

Expressão fenotipica NPC: Células NPC enxertadas eram positivas para GFAP (cerca de 5%) e muito poucas células (2-5 células por cérebro) eram também positivas para NeuN. Ambos estes marcadores estavam co-localizados com GFP. Estas observações eram consistentes para todas as doses e todos os três tipos de acidente vascular cerebral.

Exemplo 5: Resultados MCAo às doze semanas pós transplante Às doze semanas pós transplante, os animais teste que foram submetidos ao procedimento TGI como descrito anteriormente foram avaliados com os seguintes resultados. EBST: Para os testes às 12 semanas pós transplante, ANOVA global revelou efeitos principais de tratamento significativos (F2, 9 = 11,84, p < 0,005) (Figura 32). Teste post-hoc revelou assimetria motora significativamente reduzida às 12 semanas pós transplante em comparação com à entrada no estudo (p < 0,001) .

Teste Bederson: Para os testes às 12 semanas pós transplante, ANOVA global revelou efeitos principais de tratamento significativos (F2, 9 = 41,83, p < 0,001) (Figura 32). Teste post-hoc revelou défices neurológicos significativamente reduzidos às 12 semanas pós transplante em comparação com à entrada no estudo (p < 0,001). 63

Aquisição MWM: Para os testes às 12 semanas pós transplante, ANOVA global não revelou nenhuns efeitos principais de tratamento significativos (F2, 9 = 0,36, p = 0,71) (Figura 33). Estes resultados indicam que não há nenhuma diferença significativa na aquisição MWM entre à entrada no estudo e 12 semanas pós transplante.

Teste de sondagem MWM: Tempo para encontrar a plataforma. Para os testes às 12 semanas pós transplante, ANOVA global revelou efeitos principais de tratamento significativos (F2, 9 = 6,18, p < 0,05) (Figura 33). Teste post-hoc revelou tempo para encontrar a plataforma significativamente reduzido às 12 semanas pós transplante em comparação com à entrada no estudo (p < 0,001) .

Teste de sondagem MWM: Tempo despendido na área da plataforma. Para os testes às 12 semanas pós transplante, ANOVA global revelou efeitos principais de tratamento significativos (F2, 9 = 6,18, p < 0,05) (Figura 33). Teste post-hoc revelou tempo na área da plataforma significativamente aumentado às 12 semanas pós transplante em comparação com à entrada no estudo (p < 0,001).

Exemplo 6: Resultados MCAI às doze semanas pós transplante Às doze semanas pós transplante, os animais teste que foram submetidos ao procedimento MCAI como descrito anteriormente foram avaliados com os seguintes resultados. EBST: Para os testes às 12 semanas pós transplante, ANOVA global revelou efeitos principais de tratamento significativos (F2, 9 = 23,02, p < 0,0005) (Figura 34). Teste post-hoc revelou assimetria motora significativamente reduzida às 12 semanas pós transplante em comparação com à entrada no estudo (p < 0,0001). 64

Teste Bederson: Para os testes às 12 semanas pós transplante, ANOVA global revelou efeitos principais de tratamento significativos (F2, 9 = 9,29, p < 0,01) (Figura 34) . Teste post-hoc revelou défices neurológicos significativamente reduzidos às 12 semanas pós transplante em comparação com à entrada no estudo (p < 0,0001) .

Aquisição MWM: Para os testes às 12 semanas pós transplante, ANOVA global não revelou nenhuns efeitos principais de tratamento significativos (F2, 9 = 1,37, p = 0,30) (Figura 35). Estes resultados indicam que não há nenhuma diferença significativa na aquisição MWM entre à entrada no estudo e 12 semanas pós transplante.

Teste de sondagem MWM: Tempo para encontrar a plataforma. Para os testes às 12 semanas pós transplante, ANOVA global não revelou nenhuns efeitos principais de tratamento significativos (F2, 9 = 0,26, p = 0,78) (Figura 35). Estes resultados indicam que não há nenhuma diferença significativa no teste de sondagem MWM, i.e., com a plataforma acessível, entre à entrada no estudo e 12 semanas pós transplante.

Teste de sondagem MWM: Tempo despendido na área da plataforma. Para os testes às 12 semanas pós transplante, ANOVA global não revelou nenhuns efeitos principais de tratamento significativos (F2, 9 = 0,15, p = 0,86) (Figura 35) . Estes resultados indicam que não há nenhuma diferença significativa no teste de sondagem MWM, i.e., sem a plataforma, entre à entrada no estudo e 12 semanas pós transplante.

Exemplo 7: Resultados TGI às 12 semanas pós transplante 65 Às doze semanas pós transplante, os animais teste que foram submetidos ao procedimento TGI como descrito anteriormente foram avaliados com os seguintes resultados.

Teste de Bederson: Para os testes às 12 semanas pós transplante, ANOVA global revelou efeitos principais de tratamento significativos (F2, 9 = 184,02, p < 0,0001) (Figura 36) . Teste post-hoc revelou défices neurológicos significativamente reduzidos às 12 semanas pós transplante em comparação com à entrada no estudo (p < 0,0001).

Aquisição MWM: Para os testes às 12 semanas pós transplante, ANOVA global não revelou nenhuns efeitos principais de tratamento significativos (F2, 9 = 0,31, p = 0,74) (Figura 37). Estes resultados indicam que não há nenhuma diferença significativa na aquisição MWM entre à entrada no estudo e 12 semanas pós transplante.

Teste de sondagem MWM: Tempo para encontrar a plataforma. Para os testes às 12 semanas pós transplante, ANOVA global revelou efeitos principais de tratamento significativos (F2, 9 = 5.14, p < 0.05) (Figure 37). Teste post-hoc revelou tempo para encontrar a plataforma significativamente reduzido às 12 semanas pós transplante em comparação com à entrada no estudo (p < 0,0001).

Teste de sondagem MWM: Tempo despendido na área da plataforma. Para os testes às 12 semanas pós transplante, ANOVA global revelou efeitos principais de tratamento significativos (F2, 9 = 4.39, p < 0.05) (Figure 37) . Teste post-hoc revelou tempo na área da plataforma significativamente aumentado às 12 semanas pós transplante em comparação com à entrada no estudo (p < 0, 0001) .

Exemplo 8: Exame histológico às 12 semanas pós transplante 66

Todos os animais restantes sofreram eutanásia às 12 semanas pós transplante (ver Tabela 4) . Foram realizadas análises quantitativas da sobrevivência do enxerto e migração baseada na epifluorescência GFP e outros parâmetros imunohistoquimicos, especificamente na utilização de diferentes anticorpos marcadores para detetar expressão fenotipica.

Tabela 4. Histologia às doze semanas pós transplante Tipo de Dose de Tipo de Tamanho da enxerto células acidente amostra (aprox.) vascular cerebral NPC 40.000 MCAo 4 MC AI 4 TGI 4 100.000 MCAo 4 MCAI 4 TGI 4 200.000 MCAo 4 MCAI 4 TGI 4

Sobrevivência do enxerto NPC: Epifluorescência GFP revelou sobrevivência do enxerto parcialmente dependente da dose (200.000 = 100.000 > 40.000) nos três tipos de acidente vascular cerebral (F8, 27 = 14, 88, p < 0, 0001) (Figura 38). As contagens de células médias de células positivas para GFP revelaram que a dose mais baixa de 40.000 células resultou em baixos números de enxertos sobreviventes positivos para GFP, enquanto ambas as doses mais elevadas de 100.000 e 200.000 resultaram em números mais elevados de 67 enxertos sobreviventes positivos para GFP. Estas observações eram consistentes para animais MCAo, MCAI e TGI transplantados. No entanto, quando foram calculadas as percentagens para cada dose de células, não foram obtidas diferenças estatisticas (F8, 27 = 1,37, p > 0,05) (Figura 39) na percentagem da sobrevivência de enxertos nas 3 doses. Isto sugere que a percentagem de sobrevivência dos enxertos em ambas as doses baixas e elevadas foi mantida, potencialmente através de imunossupressão com CsA.

Migração do enxerto NPC: Em concordância com os resultados histológicos às 5 semanas, a epifluorescência GFP revelou que a maioria (aprox. 65%-90%) das células transplantadas permaneceu dentro do local de transplante original. Em animais MCAo transplantados, várias células positivas para GFP puderam ser facilmente identificadas dentro dos locais de transplante no corpo estriado originais (72%); em animais MCAI transplantados, células positivas para GFP permaneceram dentro dos locais de transplante corticais originais (64%), e; em animais TGI transplantados, células positivas para GFP permaneceram dentro dos locais do hipocampo originais (91%). Parece que ambos os animais MCAo e MCAI transplantados revelaram mais migração das células enxertadas em comparação com animais TGI transplantados. Além disso, quando foi observado migração, as células enxertadas permaneceram dentro da área alvo em geral, em que a migração do enxerto em MCAo foi observada dentro do corpo estriado, em MCAI dentro do córtex, e em TGI dentro do hipocampo. Além disso, a migração do enxerto em ambos MCAo e MCAI foi caraterizada por células enxertadas na limitante da penumbra isquémica no corpo estriado e córtex, respetivamente. Além do mais para MCAo, foi observado migração de células ao longo da penumbra isquémica do corpo estriado de medial para lateral (2,0 mm) e dorsal para ventral (2,5 mm). Para MCAI, foi vista uma migração de 68 células de medial para lateral (4,5 mm). Para animais TGI transplantados, a migração do enxerto foi caracterizada por SBDPs positivas para GFP identificadas nas regiões CA2 e CA3 (1,6 mm e 0,8 mm de distância, respetivamente, do local de transplante original CAI).

Expressão fenotípica NPC: Em todos os tipos de acidente vascular cerebral e doses, a taxa de sobrevivência aproximada é de 15%. Dentro destes locais de transplante originais, a maioria das células conservam a sua aparência esférica, e não são positivas para NeuN ou GFAP. No entanto, em animais MCAo transplantados, algumas destas células exibem NeuN e GFAP. Foram detetadas células positivas para GFP que migraram ao longo da penumbra do corpo estriado, penumbra cortical e CA3 de animais MCAo, MCAI, e TGI transplantados. De facto, a immunocoloração NeuN revelou que estas células expressam tal marcador para neurónios maduros. No geral, cerca de 25% das células sobreviventes positivas para GFP são positivas para NeuN em todos os tipos de acidente vascular cerebral e doses; em células que migraram para fora do local de transplante, cerca de 60% são positivas para NeuN. Estas células revelaram morfologia neuronal, caracterizada por processos elaborados e longos, que são abundantes em animais MCAo transplantados. Microscopia de epifluorescência GFP adicional revelou a distinta morfologia neuronal encontrada em cada tipo de acidente vascular cerebral, assim como contato célula com célula no enxerto NPC. Algumas células (cerca 5% de todos os tipos de acidente vascular cerebral e doses) exibiram a morfologia de células gliais, o que foi confirmado por coloração GFAP. A maioria, se não todas, as células positivas para GFAP foram encontradas perto ou em vasos sanguíneos. 69

Patologia do tecido enxerto-hospedeiro: Não houve evidência de formação de tumor utilizando Nissl no corpo estriado; córtex; ou hipocampo.

Exemplo 9: Testes adicionais NPC em modelos de acidente vascular cerebral 0 objetivo deste estudo era de analisar os benefícios terapêuticos de NPCs em animais com acidente vascular cerebral. Testes comportamentais foram utilizados para revelar as funções motoras e neurológicas de animais com acidente vascular cerebral transplantados. 0 transplante foi realizado ao 1 mês pós acidente vascular cerebral, e os animais foram imunossuprimidos diariamente com ciclosporina-A (CsA, 10 mg/kg, i.p.) ao longo do um-mês de tempo de sobrevivência pós transplante. O desempenho locomotor e neurológico de ratos transplantados foi caracterizado ao dia 7, 14 e 28 pós transplante. O resultado do transplante bem-sucedido, como revelado por determinação de um intervalo de dose de NPC eficaz, foi avaliado utilizando o desempenho locomotor, comportamental e neurológico.

Havia 3 regimes de tratamento: 0 (meio isoladamente), dose baixa 90k NPC, e dose elevada 180k NPC. O número de animais para cada regime de tratamento correspondeu ao tamanho da amostra necessário para análises estatísticas (n=10 por grupo) . Os animais que não atingiam os critérios para défice comportamental (75% atividade de tendência de oscilação e uma classificação de 2,5 no exame neurológico) não foram incluídos no estudo. Assim, os animais que atingiram estes critérios e aqueles que excederam estes critérios foram incluídos no estudo. Tipicamente, a maioria dos animais atingiu o tal critério, com pelo menos 8 70 animais necessários para providenciar análises estatísticas conclusivas. Todos os animais foram imunossuprimidos (10 mg/kg CsA, i.p., diariamente) ao longo do estudo.

Todos os animais inicialmente foram submetidos a cirurgia de acidente vascular cerebral MCAo. Às quatro semanas depois da cirurgia, os animais foram testados com EBST, seguido uma hora depois pelo exame neurológico de Bederson. Apenas animais que revelaram défices motores e neurológicos significativos foram subsequentemente utilizados para a cirurgia de transplante e aleatoriamente atribuídos a um dos seguintes tratamentos:

TABELA 5: REGIMES DE TRATAMENTO

Tipo de enxerto Dose de células Tipo de acidente vascular cerebral Tamanho da amostra NPC 90.000 MCAo 10 NPC 180.000 MCAo 10 Veiculo 0 MCAo 10 Legenda: Todos os animais foram submetidos a cirurgia de acidente vascular cerebral, receberam transplantes no corpo estriado (MCAo), e foram tratados com CsA cronicamente.

Os animais foram outra vez submetidos à mesma bateria de testes comportamentais aos dias 7, 14 e 28 pós transplante. Para claridade, abaixo é providenciado um diagrama esquemático. 71

Tabela 6: CRONOGRAMA DOS PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

Cirurgia de acidente vascular cerebral 1 Testes comportamentais (um mês pós acidente vascular cerebral; apenas animais que atingiram e excederam o critério serão posteriormente incluidos no estudo) 1 Transplante (1 mês pós acidente vascular cerebral) 1 Testes comportamentais (dias 7, 14 e 28 pós transplante)

Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob condições assépticas. Os animais foram anestesiados com equithesin (300 mg/kg, i.p.) e verificado a existência de reflexos à dor. Sob anestesia profunda, os animais foram submetidos a cirurgia de oclusão MCA. A técnica de oclusão MCA envolve a inserção de um filamento de sutura através da artéria carótida para chegar à junção da MCA, bloqueando assim o fluxo sanguíneo da artéria carótida comum, assim como do poligono de Willis. A artéria carótida comum foi identificada e isolada através de uma incisão cervical ventral na linha média. O tamanho do filamento era 4-0, feito de sutura estéril, não-absorvivel (Ethicon, Inc.), com o diâmetro da ponta da sutura afunilado para um diâmetro de calibre 24 a 26 utilizando uma cola de borracha. Cerca de 15 a 17 mm do filamento de sutura foi inserido da junção das artérias carótidas externa e interna para bloquear a MCA. A MCA direita foi ocluida durante uma hora; uma oclusão de uma hora da MCA geralmente resulta em enfarte máximo. Além disso, foi verificado o comprimento e tamanho da ponta do êmbolo produzir oclusão MCA completa em animais que pesam entre 250 a 350g. Um tapete aquecedor e um termómetro rectal promovem a manutenção da temperatura corporal dentro de limites normais. Para determinar a 72 oclusão e reperfusão bem-sucedida, foi utilizado um laser Doppler. A sonda Doppler foi colocada ao nivel da dura diretamente acima da região do corpo estriado de enfarte esperado (AP: +2,0, ML: 62,0, e DV: -4,0 mm) para medir o fluxo sanguíneo cerebral antes, durante, e após a oclusão.

Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob condições assépticas. Sob anestesia equithesin (3 ml/kg i.p.) (verificado nos animais existência de reflexos à dor) , os animais foram implantados com NPCs ou veiculo diretamente no corpo estriado (0,5 mm anterior a bregma, 2,8 mm lateral à linha média e 5,0 mm abaixo da superfície da dura) utilizando uma cânula de implantação de calibre 28. NPCs humanas crio-preservadas foram obtidas de SanBio, Inc. e descongeladas mesmo antes da cirurgia de transplante. A contagem de células viáveis, utilizando o método de exclusão azul de tripano, foi realizada antes do transplante e imediatamente após o transplante no último animal recipiente. As dosagens de células pré-determinadas (90.000 e 180.000) foram baseadas em estudos piloto demonstrando que estas dosagens estão dentro do intervalo de dosagem terapeuticamente eficaz. A cirurgia de transplante foi realizada no espaço de 2 horas após descongelar as células. A taxa de infusão era de 1 μΐ de solução de células por minuto. A seguir à infusão, foi permitido um periodo de absorção de 3 minutos antes de a agulha ser retirada. Foi utilizada uma passagem para a agulha, mas houve 3 depósitos dorsoventrais, com cada local recebendo 3-μ1 de uma solução de células. Um tapete aquecedor e um termómetro rectal permitiram a manutenção da temperatura corporal a cerca de 37°C ao longo da cirurgia e posterior recuperação da anestesia. 73 A cirurgia de acidente vascular cerebral MCAo de uma hora produziu incapacidades comportamentais consistentes ao um mês pós acidente vascular cerebral como revelado pela atividade de tendência de oscilação significativa e défices neurológicos no EBST e teste de Bederson, respetivamente, em comparação com o desempenho pré acidente vascular cerebral dos animais em ambos os testes. Comparações de pares entre desempenho pré acidente vascular cerebral e pós acidente vascular cerebral dos animais revelou incapacidades significativas em ambos os testes (p's < 0,0001) em todos os animais com acidente vascular cerebral incluídos neste estudo. A seguir às atribuições aleatórias dos animais com acidente vascular cerebral a ou veiculo, dose baixa 90k NPCs, ou dose elevada 180k NPCs, ANOVA revelou efeitos de tratamento significativos para ambos os testes (p's < 0,0001). Comparações de pares entre os grupos de tratamento revelou que tão cedo quanto o dia 7 pós transplante, os animais com acidente vascular cerebral que foram transplantados com NPCs, independentemente da dose, exibiram melhoria significativa dos défices comportamentais em comparação com os animais com acidente vascular cerebral tratados com veiculo (p's < 0,05). Esta recuperação comportamental dos animais com acidente vascular cerebral transplantados com NPC foi mantida no dia 14 e dia 28 pós transplante, em que NPC GFUs outra vez independentemente da dose promoveram atenuação significativa de ambos as incapacidades motoras e neurológicas em comparação com o tratamento com veiculo (p's < 0,0001). Exame mais detalhado das duas doses NPC revelou que a dose elevada 180k produziu uma significativamente melhor melhoria dos défices comportamentais em comparação com a dose baixa 90k ao longo de todos os dias teste pós transplante para EBST (p' s < 0,01), e aos dias teste 14 e 28 pós transplante para 74

Bederson (p's < 0,0005). Os resultados estão mostrados nas Figuras 44-45.

Os dados comportamentais presentes demonstraram os benefícios terapêuticos robustos de NPCs em que a recuperação comportamental foi detetada tão cedo quanto o dia 7 pós transplante. Os resultados revelaram além disso que o resultado positivo de enxertos NPC era estável até ao dia 28 pós transplante (o período limite do estudo). Embora ambas as doses baixa e elevada de NPCs tenham promovido benefícios funcionais, a dose elevada providenciou significativamente melhor recuperação comportamental que a dose baixa.

Todos os animais com acidente vascular cerebral neste estudo eram imunossuprimidos. Como os animais com acidente vascular cerebral tratados com veículo não revelaram qualquer recuperação comportamental observável, isto eliminou os possíveis efeitos benéficos do imunossupressor CsA que confundem, como visto previamente em estudos que incorporavam a administração do fármaco no período pré acidente vascular cerebral, durante ou imediatamente após o acidente vascular cerebral. A recuperação comportamental observada sendo limitada aos animais com acidente vascular cerebral transplantados com NPC indica que a fonte dos efeitos terapêuticos não é provável ser da imunossupressão em si, mas das células enxertadas.

Foi realizada coloração de hematoxilina e eosina (H&E) e de Nissl para medir a área enfartada máxima em cada animal utilizando um sistema de imagem NIH. Para calcular o volume do enfarte, foi utilizada a seguinte fórmula = 2 mm (espessura do corte) x [soma da área de enfarte em todos os cortes do cérebro (mm2) ] . 75

Ao um mês pós transplante, animais aleatoriamente selecionados sofreram eutanásia para imunohistoquimica. Os tecidos foram processados utilizando método padrão ABC utilizando os seguintes procedimentos. Tecidos seccionados por crióstato de 20 ym foram examinados com uma ampliação de 4X e digitalizados utilizando um programa de computador "PC-based Image Tools". As seções de cérebro foram codificadas de forma cega e a fórmula de Abercrombie foi utilizada para calcular o número total de células imunopositivas. A sobrevivência de NPC a seguir ao transplante foi avaliada utilizando o anticorpo monoclonal especifico humano HuNu, marcadores de superfície celular humanos que não apresentam reação cruzada com marcadores de superfície celular de roedores ou outras proteínas de roedores. Para detetar a expressão do fenótipo neuronal, da glia e de oligodendrócitos em enxertos celulares, foi utilizada a análise imunohistoquimica, Neu-N e GFAP, respectivamente. Estes marcadores da superfície celular também revelaram migração das NPCs enxertadas.

Em geral, as NPCs sobreviveram bem no corpo estriado com alguns poucos neurónios positivos para a expressão de MAP2 ao 1 mês pós transplante. A sobrevivência do enxerto não diferiu significativamente entre os dois níveis de dose de NPCs. NPCs reduziu as perdas de células isquémicas na penumbra do acidente vascular cerebral. Os dois níveis de dose mostraram quase a mesma extensão de efeitos de salvamento neuronal. Os dados destas análises são apresentados nas figuras 46-48.

H. EXEMPLOS MNC 76

Os Exemplos abaixo apresentados têm o propósito de serem ilustrativos, e em nenhuma forma limitativos, do âmbito da presente invenção.

Procedimentos experimentais.

Cultura de MASCs e indução neuronal

Foram isoladas MASCs de ratos Wistar em geral como descrito previamente em S. Azizi et al. "Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats-similarities to astrocyte grafts." Proc Natl Acad Sei USA, 1998;95:3908-13. As MASCs foram marcadas com proteína fluorescente verde (GFP) através de infeção retroviral utilizando o vetor pBabe neo-GFP em geral como descrito em M. Dezawa et al., "Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromal cells." Eur J Neurosci. 2001;14:1771-6. A indução neuronal de MASCs é em geral como descrito em M. Dezawa et al., "Specific induction of neuronal cells from bone-marrow stromal cells and application for autologous transplantation J Clin Invest. 2004;113:1701-10. Resumidamente, um vetor (pCI neo-NICD) contendo o domínio intracelular de Notch (NICD) foi transfetado em MASCs utilizando Lipofectamin2000 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). As células foram selecionadas através de G418 após 11 dias. Para a indução de MNCs, foram feitas uma vez subculturas das MASCs transfetadas com NICD (60-70% confluência) e foram incubadas em alfa-MEM contendo 10% FBS, 5μΜ FSK (Calbiochem, La Jolla, Califórnia), lOng/mL bFGF (Peprotech, Londres, UK) e lOng/mL CNTF (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) . Cinco dias mais tarde, as células 77 foram transplantadas no modelo de rato MCAO. Para caracterizar in vitro as MNCs induzidas, foi realizado imunohistoquimica. Anti-MAP-2ab (Sigma, St. Louis, Missouri), neurofilamento-M (NF-M) (Chemicon, Temecula, Califórnia) e isotipo 3 beta-tubulina (P~tubulin3) (Sigma, St. Louis, Missouri) foram utilizados como marcadores neuronais, e 90-95% de MNCs foram verificados serem imunopositivos para estes marcadores.

Modelo do rato MCAO:

Ratos machos Wistar pesando 200-250g foram mantidos a temperatura ambiente (24°C) com um ciclo de luz-escuridão de 12-h, e foi-lhes dado alimentos e água livremente. O procedimento MCAO foi uma modificação dos métodos descritos em J. Koizumi et al., "Experimental studies of ischemic brain edema. 1. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area." Jpn J Stroke. 1986;8:1-8; e E. Longa et al., "Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats." Stroke. 1989;20:84-91. Resumidamente, sob anestesia profunda induzida por uma mistura de 1,0-1,5% halotano, 10% 02 e ar, foi realizada uma incisão cervical na linha média, e foi identificada a bifurcação da carótida esquerda. Uma sonda feita de fio nylon 4-0 com uma cabeça revestida com borracha de silicone com um diâmetro de 0,3mm foi inserida na artéria carótida externa ligada e avançada para a artéria carótida interna para uma posição 16-18mm da bifurcação. Durante a cirurgia, a temperatura rectal foi mantida entre 37,5-38,0°C utilizando um tapete aquecedor por feedback (BWT-100, Bio Research Center Co. Ltd., Tóquio, Japão). Foi realizada a gasometria arterial e o p02 foi mantido a 85-120mmHg através de controlo do dispositivo de anestesia. Foi 78 realizada a reperfusão 4 horas após a oclusão através da retirada em lOmm da sonda.

Transplante

No dia 7 após o procedimento MCAO, os ratos foram anestesiados com injeção intraperitoneal de 50mg/kg pentobarbital sódico e colocados numa estrutura estereotática. Numa experiência preliminar, a área de enfarte foi produzida na área lateral de aproximadamente 3,5mm lateral à linha média. Para o transplante no parênquima cerebral não necrótico, a suspensão celular, composta por 8000-16000 células cultivadas em 3μ1 de tampão fosfato salino (PBS, pH 7,4), foi injetada estereotaxicamente no cérebro anterior esquerdo nas seguintes 3 localizações: +2mm, Omm e -2mm anterior ao bregma, e 2mm lateral à linha média e a l,2mm de profundidade da superfície cortical em cada caso. Os números totais das células transplantadas eram de 24000-48000 .

Foram preparados três grupos de animais; o grupo controlo, que recebeu apenas PBS (sem transplante de células) (n=7) , o grupo MASC, que foi submetido a transplante de MASCs intactas não tratadas (n=10), e o grupo NMC, no qual MNCs foram transplantadas (n=10).

Teste comportamental A severidade dos danos neurológicos foi avaliada utilizando os seguintes testes: teste de equilíbrio na viga, teste de colocação do membro e teste do labirinto de água de Morris. O teste de equilíbrio na viga e o teste de colocação do membro foram realizados no dia 7 (mesmo antes do transplante), 14, 21, 28 e 35 após MCAO. O teste do 79 labirinto de água de Morris foi realizado do dia 36 ao 40 a seguir ao procedimento MCAO.

Teste de equilíbrio na viga O teste de equilíbrio na viga é utilizado para avaliar a função vestibulomotora grosseira, e foi realizado em geral como descrito previamente em C. Dixon et al., "A fluid percussion model of experimental brain injury in the rat." J Neurosurg. 1987;67:110-9. A classificação foi baseada nos seguintes critérios: equilibrar com uma postura firme com patas no topo da viga: uma classificação de 0; agarrar os lados da viga e/ou movimento inseguro: 1; uma ou mais pata(s) escorregando da viga: 2; tentativa de equilibrar na viga, mas caindo: 3; e cair da viga sem tentar equilibrar ou segurar-se: 4.

Teste de colocação do membro O teste de colocação do membro analisa a integração sensório-motora das respostas de colocação do membro a estímulos visuais, tácteis e propriocetivos, e foi realizado em geral como descrito previamente em M. De Ryck et al. "Photochemical stroke model: flunarizine prevents sensorimotor déficits after neocortical infarcts in rats." Stroke, 1989;20:1383-1390. Um teste de adução propriocetivo foi também realizado, outra vez em geral de acordo com os procedimentos definidos no artigo de De Ryck et al. Para cada teste, a classificação foi baseada nos seguintes critérios: colocação do membro imediata e completa: uma classificação de 0; colocação incompleta e/ou atrasada (>2 segundos), incluindo instabilidade intercalada: 1; e nenhuma colocação: 2. Estímulos visuais, tácteis frontais e tácteis laterais, e propriocetivos foram dados ao membro anterior direito. Os estímulos tácteis frontais e tácteis 80 laterais e propriocetivos foram dados no membro posterior direito. O teste de adução propriocetiva foi realizado em ambos os membros anteriores e posteriores. Intervalo da classificação total 0-18.

Teste do labirinto de água de Morris O teste do labirinto de água de Morris é um método útil para avaliar a função cognitiva. Foram reportadas várias modificações a este teste. Foi utilizada a versão do teste em geral como descrito em A. Fukunaga et al., "Differentiation and angiogenesis of central nervous system stem cells implanted with mesenchyme into ischemic rat brain." Cell Transplant. 1999;8: 435-41. Este teste foi realizado do dia 36 ao dia 40 após MCAO. Foi preparada uma piscina (diâmetro 150cm, profundidade 35cm). Foi colocada uma plataforma de escape (diâmetro lOcm) 1 cm abaixo da superfície da água tornada opaca e branca leitosa. Foram designados quatro pontos de partida ao longo da borda da piscina como N, E, S e W. A plataforma foi mantida no meio de um quadrante, equidistante do centro e da borda da piscina. Foi libertado um rato na água de cada ponto de partida e permitido nadar até alcançar a plataforma, e o tempo necessário para alcançar a plataforma foi registado (no máximo 120 segundos). Os ratos foram treinados na tarefa utilizando dois grupos de quatro ensaios em cada um de 5 dias consecutivos. Após o primeiro grupo no quinto dia, em vez do segundo grupo, foi realizado um ensaio de sondagem. Este teste é para estimar a retenção da memória a curto prazo. A plataforma foi removida e foi permitido ao rato nadar durante 60 segundos. Foi medido o número de vezes que cada animal atravessou a área em que a plataforma estava localizada. Foi também medido o tempo despendido no quadrante onde a plataforma estava localizada. 81

Análise histológica

No dia 41, os ratos foram sacrificados com administração de uma sobredosagem de pentobarbital, e perfundidos transcardiacamente com 0.9% solução salina seguido por uma solução fixadora de periodato-lisina-paraformaldeido como em geral descrito em I. McLean et al., "Periodate-lysine-paraformaldehyde fixative. A new fixation for immunoelectron microscopy." J Histochem Cytochem. 1974;22:1077-83. O cérebro foi cortado em blocos coronais de 2mm de espessura utilizando Brain Matrix (BAS Inc. Warwickshire, UK). Foram feitas seções com 10pm por crióstato de cada bloco. Foi feita a coloração das seções com hematoxilina e eosina (H&E) para avaliar a área de enfarto. As imagens das seções foram capturadas utilizando uma lente objetiva 1 x sob um microscópio ótico, e as áreas lesionadas foram rastreadas utilizando Scion Image (Scion Corporation, Frederick, MD). O volume de enfarte foi calculado em geral como descrito previamente em R. Swanson et al., "A semiautomated method for measuring brain infarct volume." J Cereb Blood Flow Metab. 1990;10:290-29, e expresso como a percentagem do volume do hemisfério contralateral.

Para immunocoloração, as seções foram incubadas com anticorpos primários para MAP-2 (1:100, Boehringer Mannheim, Alemanha), β-tubulina 3 (1:400, Sigma, Missouri), NF-M (1:200, Boehringer Mannheim, Alemanha), Tuj-1 (1:100, BAbCO, CA), ou GFAP (1:400, Dako, CA) a 4°C durante a noite. IgG anti-ratinho conjugado com Alexa Fluor 546 (Molecular Probes, Eugene, OR) (for MAP-2) ou IgG anti-coelho (Molecular Probes, Eugene, OR) (para β-tubulina 3, NF-M, Tuj-1 e GFAP) foi utilizado como o anticorpo secundário. TOTO-3 foi utilizado para coloração nuclear. Os espécimes foram inspecionados utilizando microscópio 82 confocal de varrimento laser (CLMS) (Radiance 2000, Bio-Rad, Hertfordshire, UK).

Em cada rato foi calculado o número total de células GFP-marcadas em todo o cérebro anterior. O número de células GFP-marcadas no hipocampo foi também calculado da mesma forma.

Análise estatística

Os dados de avaliação comportamental e os dados do volume de enfarte foram analisados utilizando ANOVA de medidas não repetidas. Quando os resultados eram significativos (p<0,05), foi utilizado o procedimento post-hoc de Student-Newman-Keuls a um nivel de 95% de significância. Os valores são apresentados como média ± desvio padrão, salvo indicação em contrário.

Exemplo 10: Teste comportamental

Uma semana após ter sido realizado MCAO, e mesmo antes do transplante, eram aparentes severos défices neurológicos do lado direito, e a classificação média para cada teste comportamental não mostrou nenhumas diferenças estatísticas entre os três grupos.

Teste de equilíbrio na viga

Do dia 7 ao dia 21, a classificação média não era estatisticamente diferente entre os três grupos. No dia 28 e 35, a classificação média do grupo NMC mostrou uma melhoria significativa, em comparação com os grupos controlo (dia 28: p=0,0041, dia 35: p=0,0001) e MASC (p=0,0471, 0,0007 respetivamente). Embora o grupo MASC apresentasse ligeira melhoria em comparação com o controlo, 83 não pode ser detetado diferença estatisticamente significativa no dia 28 e 35 (Fig.40).

Teste de colocação do membro Não houve diferenças estatísticas entre a classificação média dos três grupos do dia 7 ao dia 21. No dia 28 e 35, os grupos NMC e MASC apresentaram uma melhoria significativa, em comparação com o grupo controlo (day28: p=0,0022 e 0,085, day35: p=0,0022 e 0,0211 respetivamente). No entanto, a classificação média não mostrou nenhuma diferença significativa entre os grupos NMC e MASC ao longo de todo o período (Fig.41).

Teste do labirinto de água de Morris O tempo de latência médio registado em cada grupo de quatro ensaios para localizar a plataforma de escape submersa é mostrado na Fig. 42 para cada um dos três grupos. O grupo NMC apresentou o tempo de latência mais curto em comparação com o grupo controlo e MASC. O tempo de latência médio para o segundo grupo no dia 39 e o primeiro grupo no dia 40 demonstrou diferença significativa entre os grupos NMC e controlo (p=0,0339 e 0,0492 respetivamente) (Fig.42). Embora o grupo NMC tenha apresentado uma tendência para um tempo de latência médio mais curto até à plataforma de escape que o grupo MASC, não houve uma diferença estatisticamente significativa.

No ensaio de sondagem espacial, os ratos no grupo NMC mostraram uma melhoria significativa em comparação com o grupo controlo (p=0,0419) e MASC (p=0,0453) (Fig.43). O tempo médio despendido no quadrante onde se localizava a plataforma era o mais longo no grupo NMC entre os três 84 grupos. Houve diferença significativa entre NMC e o controlo (p=0,0339) (Fig.43).

Exemplo 11: Estudo histológico A área de enfarte era localizada na metade lateral do hemisfério esquerdo incluindo córtex, corpo estriado e hipocampo, e foi observada a formação de cistos e cicatrizes na maioria dos cérebros lesionados. 0 hipocampo do lado lesionado era atrófico e apresentava uma disposição parcialmente irregular ou perda de neurónios em comparação com o lado contralateral. Os volumes de enfarte foram medidos em todos os modelos MCAO. 0 volume de enfarte médio nos grupos NMC, MASC e controlo no dia 33 era de 50,7±10,9%, 51,0110,2% e 50,9111,1% respetivamente. Não havia nenhuma diferença estatisticamente significativa entre os três grupos.

As MASCs e MNCs transplantadas GFP-marcadas estavam localizadas principalmente na área limite entre o tecido intacto e a área do enfarte incluindo o córtex ipsilateral, corpo caloso, corpo estriado e hipocampo. Foi observada a infiltração de células inflamatórias no foco do enfarte. Parece não haver diferença no número de células inflamatórias que infiltraram na localização do enfarte entre os grupos MNC e MASC.

Um grande número de MNCs GFP-marcadas eram imunopositivas para MAP-2 e apresentaram desenvolvimento de projeções dos neurónios no cérebro hospedeiro. Elas também eram imunopositivas para Tuj-1 e β-tubulina 3. No hipocampo ipsilateral, foi verificado que muitos corpos celulares e projeções dos neurónios de MNCs GFP-marcadas eram também positivos para NF-M. Uma grande fração de MNCs transplantadas GFP-marcadas eram positivas para MAP-2 85 (84,0±8,1%), enquanto que apenas um pequeno número de células eram positivas para GFAP (1,010,2%).

Em contraste, a qrande maioria de MASCs no cérebro hospedeiro era neqativa para ambos os marcadores neuronais (MAP-2, Tu j 1, β-tubulin 3 e NF-M) e da glia (GFAP). As percentagens de células positivas para MAP-2- e para GFAP entre as células GFP-marcadas eram 1,410,2% e 4,811,0%, respetivamente. Não pôde ser encontrada a formação de projeções dos neurónios em MASC positivo para MAP-2. 0 número médio de MNCs e MASCs no cérebro anterior hospedeiro era 1325011126 e 58501997. Aproximadamente 30-45% das MNCs transplantadas eram detetadas e, por outro lado, 10-20% das MASCs transplantadas eram detetadas um mês após o transplante. A taxa de sobrevivência de MNCs no cérebro isquémico foi substancialmente mais elevada que MASCs. No hipocampo, o número médio de MNCs era 7901160 e 89% destes eram positivas para MAP2. O número médio de MASCs, em contraste, era 470166 e 0,6% eram positivas para MAP2, mostrando que a maior parte das MASCs transplantadas eram negativas para ambos os marcadores neuronais e da glia.

Em todos os grupos, não foi observado a formação de tumor no parênquima cerebral até aos 41 dias após MCAO.

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Lisboa, 03 de Dezembro de 2013

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Células percursoras neuronais para utilização no tratamento de uma lesão do sistema nervoso central, em que as células percursoras neuronais são obtidas por transdiferenciação de células estaminais da medula óssea aderentes em células percursoras neuronais ao transfetar as células estaminais da medula óssea aderentes com um vetor contendo sequências que codificam o domínio intracelular de Notch, e em que a lesão do sistema nervoso central é causada por acidente vascular cerebral isquémico ou acidente vascular cerebral hemorráqico.

2. Células percursoras neuronais como definidas na reivindicação 1 para a utilização de acordo com a reivindicação 1, em que as células percursoras neuronais compreendem células percursoras neuronais humanas.

3. Células percursoras neuronais como definidas na reivindicação 1 para a utilização de acordo com a reivindicação 1, em que as células percursoras neuronais são alogénicas relativamente a um doente.

4. Uma unidade formadora de enxerto para utilização no tratamento de uma lesão do sistema nervoso central compreendendo: células percursoras neuronais como definido na reivindicação 1; e um veículo farmaceuticamente aceitável; 2 em que a lesão do sistema nervoso central é causada por acidente vascular cerebral isquémico ou acidente vascular cerebral hemorrágico.

5. 0 veiculo farmaceuticamente aceitável compreende um solvente, um meio de dispersão, um agente antibacteriano, ou um agente antifúngico.

6. A unidade formadora de enxerto como definida na reivindicação 4 para a utilização de acordo com a reivindicação 4, em que o enxerto compreende células percursoras neuronais numa quantidade que varia entre 10.000 a 100 milhões de células percursoras neuronais.

7. A unidade formadora de enxerto como definida na reivindicação 4 para a utilização de acordo com a reivindicação 4, em que as células percursoras neuronais compreendem um marcador.

8. A unidade formadora de enxerto como definida na reivindicação 4 para a utilização de acordo com a reivindicação 4, em que as células percursoras neuronais compreendem células percursoras neuronais humanas.

9. Células neuronais derivadas de células estaminais da medula óssea aderentes (MNCs) para utilização no tratamento de uma lesão do sistema nervoso central que é causada por acidente vascular cerebral isquémico ou acidente vascular cerebral hemorrágico; em que as MNCs são obtidas por (i) providenciar células estaminais da medula óssea aderentes; 3 (ii) transdiferenciar as células estaminais da medula óssea aderentes em células percursoras neuronais ao transfetar as células estaminais da medula óssea aderentes com um vetor contendo sequências que codificam o domínio intracelular de Notch; e (iii) induzir as células percursoras neuronais a formar células neuronais através da cultura das células na presença de 5 μΜ forscolina (FSK), 10 ng/mL fator de crescimento básico dos fibroblastos (bFGF), e 10 ng/mL fator neurotrófico ciliar (CNTF).

10. Células neuronais derivadas de células estaminais da medula óssea aderentes como definido na reivindicação 9 para a utilização de acordo com a reivindicação 9, em que as células neuronais derivadas de células estaminais da medula óssea aderentes compreendem células neuronais derivadas de células estaminais da medula óssea aderentes humanas;

11. Células neuronais derivadas de células estaminais da medula óssea aderentes como definido na reivindicação 9 para a utilização de acordo com a reivindicação 9, em que as células neuronais derivadas de células estaminais da medula óssea aderentes são alogénicas relativamente a um doente.

12. Uma unidade formadora de enxerto para utilização no tratamento de uma lesão do sistema nervoso central compreendendo: As células neuronais derivadas de células estaminais da medula óssea aderentes como definido na reivindicação 9; e um veículo farmaceuticamente aceitável; 4 em que a lesão do sistema nervoso central é causada por acidente vascular cerebral isquémico ou acidente vascular cerebral hemorráqico.

13. A unidade formadora de enxerto como definida na reivindicação 12 para a utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o veículo farmaceuticamente aceitável compreende um solvente, um meio de dispersão, um agente antibacteriano, ou um agente antifúngico.

14. A unidade formadora de enxerto como definida na reivindicação 12 para a utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o enxerto compreende células neuronais derivadas de células estaminais da medula óssea aderentes numa quantidade que varia entre 10.000 a 100 milhões de células neuronais derivadas de células estaminais da medula óssea aderentes.

15. A unidade formadora de enxerto como definida na reivindicação 12 para a utilização de acordo com a reivindicação 12, em que as células neuronais derivadas de células estaminais da medula óssea aderentes compreendem um marcador.

16. A unidade formadora de enxerto como definida na reivindicação 12 para a utilização de acordo com a reivindicação 12, em que as células neuronais derivadas de células estaminais da medula óssea aderentes compreendem células neuronais derivadas de células estaminais da medula óssea aderentes humanas. Lisboa, , 03 de Dezembro de 2013