KR101277310B1

KR101277310B1 - 뉴런의 전구 세포 특징들을 나타내는 세포

Info

Publication number: KR101277310B1
Application number: KR1020067021240A
Authority: KR
Inventors: 마리 데자와
Original assignee: 산바이오 인코포레이티드
Priority date: 2004-04-12
Filing date: 2005-04-07
Publication date: 2013-06-25
Also published as: US20110229442A1; US9441199B2; JP5756039B2; EP1737950B9; EP2314674A1; EP1737950B1; WO2005100552A3; US20090324561A1; JP2012130348A; ES2372501T3; PT1737950E; ATE523587T1; CN1973031B; KR20130062359A; AU2005233582B2; CA2929754A1; DK1737950T3; AU2005233582A1; WO2005100552A2; US20150267169A1

Abstract

본 발명은 뉴런의 전구 세포 특징들을 나타내는 세포들 및 골수 부착 줄기 세포들의 신경교 이행 분화와 관련이 있는 골수 부착 줄기 세포들에 있어서 세포 경로를 조절함으로써 골수 부착 줄기 세포로부터 그것들을 만드는 방법을 개시하고 있다.

뉴런, 골수 부착 줄기 세포, 신경교 이행 분화

Description

뉴런의 전구 세포 특징들을 나타내는 세포{CELLS EXHIBITING NEURONAL PROGENITOR CELL CHARACTERISTICS}

본 발명은 뉴런의 전구 세포 특징을 나타내는 세포 및 골수 부착 줄기 세포 (marrow adherent stem cells)에서 골수 부착 줄기 세포의 신경교의(glial) 이행분화능(trnasdifferentiation)과 관련이 있는 세포 경로를 조절함으로써 골수 부착 줄기 세포로부터 뉴런의 전구 세포 특징을 나타내는 세포를 만드는 방법에 관한 것이다.

중추신경계(Central Nervous System, CNS) 또는 말초신경계(Peripheral Nervous System, PNS) 질병의 연구 및 치료에 있어서의 한계는 최종적으로 분화되는 뉴런들의 증식 능력이 현저하게 제한되어 있다는 전통적인 인식이다. 따라서, 최종적으로 분화되는 뉴런들의 이식이 요구되는 CNS 또는 PNS 질병의 치료는 성취되기 어렵다.

이러한 어려움을 극복하는 한가지 제안되는 접근은 뉴런의 전구 세포 특징(neuronal progenitor cell characteristics)을 나타내는 수많은 유사분열 세포들("CPC")을 배양하는 것이다. 그런 세포들은 이론적으로 in vivo에서 CNS 및/또는 PNS 질병 치료의 기능을 할 수 있는 뉴런으로 분화될 수 있다. 또는, CPC는 in vitro에서 뉴런으로 분화되어, 환자에 이식될 수도 있다. 그러나, 이러한 CPC는 드물고, 공여자로부터 이를 분리해 내는 것은 어렵다. 그러므로, 전통적으로 연구자들은 처치된 배아 및 태아 줄기 세포(이하, 배아 줄기 세포라 한다)로부터 CPC를 획득하려는 시도를 하였다.

다전능 세포(pluripotent cells)인 배아 줄기 세포(embryonic stem cells)는 매우 다양한 조직 타입을 생성시키는데 이용되어 왔고, CPC의 원천이 될 수 있다 (I. Weissman, Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution (Review)., Cell 100, 157-168, 2000). 그러나, 배아 줄기 세포의 이용은 수많은 윤리적인 문제를 일으켜서, CPC 생산을 위한 줄기 세포의 원천으로 기피되고 있다. 추가적으로, 배아 줄기 세포는 발암성이 될 수 있어서, 이는 배아 줄기 세포로부터 CPC 이식편의 생성과 같이 환자에게 잠재적으로 배아줄기세포의 수송을 초래할 수 있는 어떤 이식 과정이기 때문에 안전성에 대한 관심을 발생시킨다.

몇몇 연구자들은 CPC의 생산에 있어서 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cells)와 같이 줄기 세포의 다른 타입들을 이용하려는 시도를 하고 있다. 미국특허출원 20030003090 (Prockop, 등., 2003년 1월 2일 출원, "골수 줄기 세포들의 신경세포 전구체체들로의 in viro에서의 직접적인 분화")는 NSE 및 비멘틴(vimentin)의 발현 수준은 0.5 millimolar IBMX 및 1 millimolar dbcAMP로 인큐베이션시킨 후에 인간 중간엽 줄기 세포에서 증가되었음을 개시하고 있다. NSE 및 비멘틴 mRNAs에서의 증가는 배양에서의 신경 세포의 외관과 일치하였다. 그러나, Prockop 등은 MAP1 B 또는 TuJ-1의 발현 수준에 있어서 어떠한 변화가 없었음을 보고하였다. NSE, MAP1 B, 및 TuJ-1은 초기 뉴런-특징적인 마커들이고, 비멘틴은 신경교(glia)의 초기 마커이기 때문에, Prockop 등은 hMSCs는 in vitro에서 뉴런 또는 신경교의 몇몇 초기 전구체들로 이행분화(transdifferentiation)된다고 제안하였다. 그러나, Prockop의 초기 전구 세포들을 이용하는 것은 바람직하지 못한데, 이는 임상적 효능이 잘 이해되지 않는 매우 미성숙한 뉴런 표현형을 나타내는 것으로 보이기 때문이다.

따라서, 예를 들어 CNS 또는 PNS 질병의 연구 및 치료에 있어서 전통적으로 이용 가능한 적절한 CPC의 원천이 결핍되어 있다. 게다가, 적절한 이용 방법에 있어서 이러한 CPC를 생산하는데 이용될 수 있는 방법이 결핍되어 있다. 전술한 문제들을 극복하는 방법 및 조성물이 요망된다.

발명의 요약

한 측면에 있어서, 본 발명은 골수 부착 줄기 세포들을 포함하는 물질로부터 뉴런의 전구 세포 특징들을 나타내는 세포를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 그 방법은 골수 부착 줄기 세포에 있어서 골수 부착 줄기 세포의 신경교의 이행분화능과 관련된 세포 경로를 조절하는 것을 포함하고, 여기에서 상기 세포 경로는 골수 부착 줄기 세포의 적어도 일부가 뉴런의 전구 세포 특징들을 나타내는 세포들로 이행분화하는 것을 유발하도록 충분히 조절하는 것이되, 다만 상기 조절은 골수 부착 줄기세포을 노치 세포내 도메인(notch intracellular domain)으로 트랜스펙션시키는 것을 포함하지 않는 것을 전제로 한다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 뉴런의 전구 세포 특징을 나타내는 세포를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 그 방법은 골수 부착 줄기 세포의 적어도 일부가 뉴런의 전구 세포 특징을 나타내는 세포로 이행 분화하는 것을 유발하는데 충분한 양의 신경교 조절제와 함께 골수 부착 줄기 세포를 인큐베이션하는 것을 포함하되, 다만 상기 상호작용은 골수 부착 줄기 세포의 노치 세포내 도메인(notch intracellular domain)으로의 트랜스펙션을 포함하지 않는 것을 전제로 한다.

발명의 상세한 설명

본 발명자들은 기대치않게 그리고 놀랍게도 상기에서 인식된 문제점들 및 한계들이 여기에서 개시된 발명을 실천함으로써 극복될 수 있음을 발견하였다. 본 발명은 MASC (marrow adherent stem cells)에서의 MASC의 신경교의 이행분화능과 관련이 있는 세포 경로를 조절함으로써 MASC로부터 CPC의 생산을 청구한다. 여기에는 본 발명의 제조 및 이용하는 방법이 개시되어 있다.

여기에서 인용된 모든 참고문헌들은 온전히 참고문헌으로서 여기에 통합되어 있고, 각각의 개별적인 공개 또는 특허 또는 특허출원처럼 동일한 범위로 모든 목적들을 위해 온전히 참고문헌에 의해 통합됨을 특별하게 그리고 개별적으로 지시되어 있다. 여기의 참고문헌들의 논의는 단지 그것들의 저자들에 의한 주장들을 요약하는 것으로 간주되고 어떤 참고문헌도 선행 기술을 구성하는 것으로 승인되지 않는다.

출원인들은 인용된 참고문헌들의 정확성 및 타당성을 의심할 권리를 보유한다.

본 발명의 목적을 위해서, 뉴런의 전구 세포 특징을 나타내는 세포들("CPC")는 유사분열하고 네스틴(nestin) 및 신경의 전구체(precursor)/신경의 전구(progenitor) 세포들에 특이적인 다른 세포 마커들을 표현하는 세포로서 정의되고, MASC로부터 유래된다. CPC는 뉴런, 신경교 및 희소돌기교세포(oligodendrocytes), 이들의 어느 하나의 전구체로 분화할 수 있다. CPC는 여기에서 개시된 방법들에 따라 MASC로부터 유래될 수 있다. 하나의 실시 상태에 있어서, 인간 CPC는 EfnB2+, CD90- 및 PDGF 수용체 베타-이다. 이들 마커들은 본 발명에 따른 MASC의 신경교의 이행분화를 이끄는 FACS를 이용하여 MASC로부터 CPC를 분리하는데 사용된다. 적절한 CPC 취급 방법은 예를 들어 공개된 미국특허출원 20020012903(Goldman et al.)에 개시된 방법들을 비롯하여 전통적으로 알려져 있다.

일반적으로, 본 발명에 따른 CPC는 MASC에서 MASC의 신경교의 이행분화와 관련이 있는 세포 경로를 조절함으로써 생산되는데, 상기 세포 경로는 MASC의 적어도 일부가 CPC로 이행분화되는 것을 유발시키도록 충분히 조절되는 조건이다.

매우 다양한 조절 방법들이 본 발명의 실시에 유용하다. 이들은 ex vivo에서 성장하는 경우 세포들이 성장하는 배지 및 조건들을 변형시키는 것, in vivo에서 성장하는 경우 MASC가 존재하는 조직 환경을 변형시키는 것, 또는 신경교 조절제와 함께 MASC를 인큐베이션하는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. MASC의 신경교의 이행분화가 효과적으로 조절되어 MASC가 CPC로 분화가 되는 것이라면, 정확히 어떠한 조절 방법인지는 본 발명의 목적을 위해 중요하지 않다. 일반적으로, MASC에서의 MASC의 신경교의 이행분화와 관련이 있는 세포 경로 조절은 유사분열 상태 및 생존가능한 상태에서 여하한 MASC 또는 CPC라도 유지하는데 적절한 조건하에서 일어난다. 그런 조건들은 당업자에게 알려져 있고, 예를 들면 칼로스 등(Kallos et al., Large-scale expansion of mammalian neural stem cells: a review. Med Biol Eng Comput. 2003 May;41 (3):271-82)에서 발견된다. 적절한 조건들 및 기술도 역시 세포 배양 및 in vivo 환경에 대한 저서에서 찾을 수 있다.

본 발명의 양호한 실시 상태에 있어서, MASC에서의 MASC의 신경교의 이행분화와 관련이 있는 세포 경로 조절은 신경교 조절제와 함께 MASC를 인큐베이션함으로써 성취된다. 더욱 양호한 실시 상태에 있어서, MASC에서의 MASC의 신경교의 이행분화와 관련이 있는 세포 경로 조절은 MASC의 적어도 일부의 CPC로의 이행분화를 유도할 만큼의 충분한 양의 신경교 조절제와 함께 MASC를 인큐베이션함으로써 성취된다. 본 발명에서의 인큐베이션이라 함은, 신경교 조절제가 MASC 세포 표면 수용체들과 상호작용하거나 내부의 세포 경로들과 상호 작용하는 MASC의 내부로 수송되는 것을 목적으로 MASC를 신경교 조절제의 존재하에서 인큐베이션하는 것을 포함한다.

이러한 수송은 확산 수송 등의 경우와 같이 수동적이거나, 능동 수송체를 통하는 경우와 같이 능동적이거나 또는 상기 두 경우 모두에 해당될 수 있다. in vitro 인큐베이션은 통상의 방법으로 수행되고, 예를 들어 신경교 조절제(들)가 첨가된 α-MEM 또는 이와 유사한 배지에서 MASC의 배양액을 인큐베이션하는 것이다. 적절한 인큐베이션 기술은 예를 들어 M 칼로스 등의 저서(M Kallos et al., Large-scale expansion of mammalian neural stem cells: a review. Med Biol Eng Comput. 2003 May;41(3):271-82)를 비롯한 문헌에서 일반적으로 볼 수 있다. 인큐베이션은 또한 본 발명에 따른 신경교 조절제가 전신적으로 또는 국소적으로 투여되는 경우에 in vivo 환경에서 통상의 방법을 이용하여 일어난다.

본 발명의 바람직한 실시 상태에 있어서, 만약 신경교 조절제가 단백질 또는 펩티드인 경우, 인큐베이션 방법은 그 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 DNA를 MASC로 트랜스펙션(transfection)하는 것이 된다. 트랜스펙션은 상업적으로 입수할 수 있는 트랜스펙션 프로토콜, 이를테면 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 입수되는 리포펙타민^TM 2000 시스템(Lipofectamine^TM 2000 system) 또는 퀴아젠(Qiagen)으로부터 입수되는 이펙틴^TM 트랜스펙션 시스템(Effectene^TM transfection system) 또는 다른 상업적인 트랜스펙션 프로토콜을 이용하여 수행된다.

다른 한 가지의 양호한 인큐베이션의 실시 상태에 있어서, 신경교 조절제가 단백질 또는 펩티드인 경우, 인큐베이션 방법은 상업적인 바이러스 벡터들, 이를테면 적절한 발현을 위한 렌티바이러스의 벡터 시스템(Lentiviral vector systems, BLOCK-iT^TM Lentiviral RNAi Expression System, Invitrogen) 및 일시적인 발현을 위한 아데노바이러스의 벡터 시스템(BLOCK-iT^TM Adenoviral RNAi Expression System, Invitrogen)을 이용하는 신경교 조절제의 바이러스 수송이 된다.

인큐베이션은 다양한 시간대로 일어날 수 있다. 즉, 다양한 신경교 조절제(들)와 MASC의 연속적 인큐베이션, 병행 인큐베이션, 연속 및 병행을 조합한 인큐베이션일 수 있다.

본 발명의 실시 상태에 있어서, MASC에서의 MASC의 신경교의 이행분화와 관련이 있는 세포 경로 조절은 노치 유전자(Notch gene)의 세포내 도메인을 이용하여 MASC를 트랜스펙션시키지 않는 것을 조건으로 한다. 본 발명의 실시 상태에 있어서, 신경교 조절제와 함께 MASC를 인큐베이션하는 것은 노치 유전자의 세포내 도메인으로 MASC를 트랜스펙션시키는 것을 포함하지 않는 것을 전제로 한다.

본 발명의 목적상, 골수 부착 줄기 세포(MASC)는 연결 조직에서 일차적으로 발견되는 골모세포(osteoblasts), 지방세포(adipocytes), 연골세포(chondrocytes) 및 근육세포(myocyte)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 몇 가지 세포 타입으로 분화되는 것으로 통상 인식되어 있는 줄기 세포들을 의미한다.

MASC에는 특히 배아줄기세포 및 태아줄기세포가 제외된다. MASC는 인간 및 다른 포유류들, 이를테면, 래트, 마우스, 영장류(primates), 돼지, 소, 및 양을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 종류의 동물로부터 수득된다. MASC는 다양한 조직에서 수득되고, 바람직한 원천은 골수 및 제대혈(cord blood)을 포함한다. MASC를 위한 유용한 원천 및 그들을 수득하는 방법들은 하기의 실시예 1 및 본 명세서의 다른 곳에서 기재하고 있다.

한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명의 수행에 있어서 유용한 인간 MASC는 CD29 및 CD90을 발현하지만 CD15, CD34, CD11b/c, CD31, CD45 및 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand Factor)는 발현하지 않는다.

하나의 실시 상태에 있어서, MASC는 문헌들에 기재된 기술을 이용하여 제대혈로부터 분리된다. 예를 들어 C. 캠파그놀리 등의 문헌(C. Campagnoli et al., Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood, liver, and bone marrow. 1: Blood. 2001 Oct 15;98 (8):2396-402)은 태아 혈액으로부터 MASC를 수득하는데 유용한 방법들을 기재하고 있다. A. 에리스 등의 문헌(A. Erices et al., Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. 1: Br J Haematol. 2000 Apr;109(1):235-42)은 제대혈로부터 MASC를 수득하는데 있어서 일반적으로 유용한 방법들이 기재되어 있다. L.휴 등의 문헌(L. Hou et al., Induction of umbilical cord blood mesenchymal stem cells into neuron-like cells in vitro. Int J Hematol. 2003 Oct;78(3):256-61)에는 정제되고 증가된 인간 제대혈 MASC를 수득하는데 일반적으로 유용한 방법들을 기재하고 있다.

본 발명의 목적상, 신경교 조절제라 함은 다른 특징들 중에서도 신경교세포로의 MASC의 이행분화를 억제하고 CPC로의 이행분화능을 촉진하는 특징을 소유하는 물질로서 정의된다. 신경교 조절제들은 신경교 운명에서 MASC로 향하게 하는 다양한 메카니즘을 통해 행동한다. 예를 들어, 프로-신경의 bHLH(basic helix-loop-helix) 트랜스펙션 인자들, 이를테면 Mash 1, Math 1 및 뉴로게닌 1(neurogenin 1)은 뉴런 유전자 발현의 활성제인 것으로 믿어진다.

프로뉴럴 유전자들(proneural genes)은 신경교의 이행분화를 억제하는 동안 MASC의 뉴런의 이행분화를 조종하는 것으로 믿어진다. 신경교의 이행분화를 억제시키는 하나의 메카니즘은 STAT-매개된 신호 도입의 조절을 통하는 것이다. STAT에 의한 신호 도입은 티로신 키나아제의 야누스 패밀리(JAK)에 의해 촉매되는 것으로 믿어지는 인산화에 의해 촉발되는 것으로 믿어진다. 그러므로 JAK-STAT 신호 도입의 억제가 신경교의 이행분화 경로를 조절하고 MASC의 뉴런의 운명을 촉진시킨다.

본 발명에 따른 신경교 조절제는 아교세포발생 인자들(gliogenic factors)을 위한 신호 경로를 방해하는 억제제들 또는 안타고니스트들(antogonists) 또는 작용제들을 포함한다. 신경교 조절제들은 또한 신경 신생(neurogenesis)을 위한 아고니스트(agonists)를 포함하는데, 여기에는 신경성 인자(neurogenic factors)가 있다. 이들 아고니스트들 또는 인자들의 이용은 본 발명의 실행에 있어서 MASC의 아교세포발생(gliogenesis)을 음성 조절한다. 본 발명의 실행에 따른 신경교 조절제들은 작은 분자들, 펩티드들, 및 유전자 산물의 전체 또는 부분을 포함하나 이에 제한되지 않는 통상의 형태의 치료 분자를 포함한다.

하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 신경교 조절제들은 STAT1 및 STAT3의 억제제들을 포함하는 JAK/STAT 억제제들을 포함하나 여기에 제한되지 않는다.

특정 실시 상태에 있어서, 이러한 JAK/STAT 억제제들은 JAK/STAT 경로의 유전자 침묵을 위한 RNAi, JAK/STAT 경로를 하향 조절하는 안티센스 올리고뉴클레오티드들, 또는 소분자 JAK 억제제 4-(4'-하이드록시페닐)아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린(4-(4'- hydroxyphenyl) amino-6,7-dimethoxyquinazoline)을 포함한다. 추가적인 JAK/STAT 억제제들은 2004년 10월 21일자로 공개된 조지 바시오스의 미국특허출원 20040209799 및 2004년 3월 18일자에 공개된 후아 유 등의 미국특허출원 20040052762 에 개시되어 있다.

하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 신경교 조절제들은 BMP2 또는 7(골 형태발생 단백질)의 안타고니스를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

이러한 안타고니스트들은 노긴(Noggin), 초르딘(Chordin), 폴리스타틴(Follistatin), 소닉 헤지호그(sonic hedgehog, SHH)를 발현시키는 유전자로부터의 유전자 산물의 전체 또는 부분 또는 이들 유전자들의 아고니스트들을 포함할 수 있다.

한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 신경교 조절제들은 Hes1 및/또는 Hes5 억제제들을 포함하나, 이에 제한되지 않는 Hes 억제제들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시 상태에 있어서, 이러한 Hes 억제제들은 Hes의 유전자 침묵을 위한 RNAi 또는 Hes를 하향 조절하는 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 포함한다.

한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 신경교 조절제들은 Id-1의 억제제들을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. S. 트젠그 등(S. Tzeng et al., Id1, Id2, and Id3 gene expression in neural cells during development. Glia., 1998 Dec;24(4):372- 81)을 참조할 것. 특정 실시 상태에 있어서, 이러한 Id-1 억제제들은 Id-1의 유전자 침묵을 위한 RNAi 또는 Id-1를 하향조절하는 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 포함한다.

한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 신경교 조절제로는 Gcm1(쥣과) 또는 GCMB(인간)을 포함하나 이에 제한되지 않는 초파리 glide/gcm (glial cells missing)의 포유류의 유사체의 억제제들이 있지만, 이에 한정되지 않는다. Y. 이와사키 등(Y. Iwasaki et al., The potential to induce glial differentiation is conserved between Drosophila and mammalian glial cells missing genes., Development. 2003 Dec;130(24):6027-35. Epub 2003 Oct 22) 및 M. 카멜에르 등(M. Kammerer et al., GCMB, a second human homolog of the fly glide/gcm gene. Cytogenet Cell Genet. 1999;84(1-2):43-7)을 참조할 것. 특정 실시 상태에 있어서, 이러한 glide/gcm 유사체(homolog) 억제제들은 glide/gcm 유사체들(이를테면 Gcm1(쥣과) 또는 GCMB(인간))의 유전자 침묵을 위한 RNAi 또는 glide/gcm 유사체들(이를테면 Gcm1(쥣과) 또는 GCMB(인간))을 하향 조절하는 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 포함한다.

한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 신경교 조절제로는 희소돌기아교세포(oligodendrocyte) 계통을 위한 전사인자인 Sox9의 억제제들이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. C. 스톨트 등의 문헌(C. Stolt et al., The Sox9 transcription factor determines glial fate choice in the developing spinal cord., Genes Dev. 2003 Jul1;17(13):1677-89)을 참조할 것. 특정 실시 상태에 있어서, 이러한 Sox9 억제제들은 Sox9의 유전자 침묵을 위한 RNAi 또는 Sox9을 하향 조절하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 신경교 조절제로는 아교세포발생(gliogenesis)을 위한 전사인자인 뉴로게닌3(Neurogenin3)의 억제제들이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 실시 상태에 있어서, 이러한 뉴로게닌3 억제제들은 뉴로게닌3의 유전자 침묵을 위한 RNAi 또는 뉴로게닌3을 하향 조절하는 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 포함한다.

한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 신경교 조절제들은 섬모 향신경성 인자(ciliary neurotrophic, CNTF)의 억제제들이 있으나, 이에 한정되는 것은아니다. 특정 실시 상태에 있어서, 이러한 CNTF 억제제들은 CNTF의 유전자 침묵을 위한 RNAi 또는 CNTF를 하향 조절하는 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 포함한다.

특정 실시 상태에 있어서, 신경교 조절제들은 아교생성을 강하제 억제하는 Wnt1을 발현하는 유전자들로부터의 유전자 산물의 전체 또는 부분을 포함한다. K. 탕 등의 문헌(K. Tang et al., Wnt-1 promotes neuronal differentiation and inhibits gliogenesis in P19 cells., Biochem Biophys Res Commun. 2002 Apr 26;293(1 ):167- 73)을 참조할 것. Wnt1을 발현하는 유전자로부터 유전자 산물들의 전체 또는 부분들은 트랜스펙션 또는 다른 전통적인 방법들, 이를테면 바이러스 벡터들을 비롯한 유전자 치료법에 의해 투여된다.

특정 실시 상태에 있어서, 신경교 조절제들은 신경이 신생되는 동안 유익한 역할을 하거나 증식하는 CPC에서 발현되는 신경의 bHLH(basic helix-loop- helix) 인자들의 서브세트를 발현하는 유전자로부터의 유전자 산물의 전체 또는 부분을 포함한다. 이러한 신경교 조절제들은 뉴로게닌1(Neurogenin1), Mash1, Math1 또는 뉴로D(NeuroD)를 발현하는 유전자로부터의 유전자 산물들의 전체 또는 부분들을 포함한다.

뉴로게닌1(Neurogenin1), Mash1, Math1 또는 뉴로D(NeuroD)를 포함하나 이에 한정되지 않는 신경의 bHLH 인자들의 서브세트를 발현하는 유전자로부터의 유전자 산물들의 전체 또는 부분들은 트랜스펙션 또는 다른 전통적인 방법들, 이를테면 바이러스 벡터들을 비롯한 유전자 치료법에 의해 투여된다.

추가적으로, 신경교 조절제들은 단일 또는 조합하여 투여된다. 양호한 실시 상태에 있어서, 만약 신경교 조절제들의 조합이 본 발명의 실행에서 이용된다면, 다양한 신경교 조절 경로에 작용하는 신경교 조절제들이 선택된다. 이는 신경교 조절제들의 신경교 조절효과를 전반적으로 강화시킨다.

본 발명의 목적상, CPC 분리는 CPC로 이행분화되지 않은 MASC와 같은 샘플 중의 비-CPC 세포들로부터 CPC를 분리하는 것을 포함한다. 이러한 분리는 단일 분리 또는 다중 분리들을 포함한다. 만약 다중 분리들이 수행된다면, 다양한 유형 또는 기술의 분리법이 이용되는데, 이러한 다양한 유형 또는 기술의 분리법은 분리 결과를 강화시킨다. 다양한 분리들이 본 발명의 실행에 있어서 유용하다. 그런 분리 방법의 예들은 유세포측정법(flow cytometry, aka FACS sorting), 자기 분리 기술(magnetic separation techniques), 및 시각적인 솔팅(visual sorting)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 면역세포화학(Immunocytochemistry)이 세포 생존능은 중요하지 않은 경우에 이용된다.

FACS 솔팅 (sorting)은 전통적인 FACS 장비 및 CPC의 하나 이상의 특징들과 관련이 있는 에피토프에 특이적인 항체를 가진 프로토콜을 이용하여 수행될 수 있다. 이러한 에피토프로는 인간 CPC의 경우 EfnB2가 있다(N. Ivanova et al., A stem cell molecular signature. Science 298(5593):601-4, Oct 18,2002). 본 발명의 실행에 있어서 추가적으로 유용한 항체들은 비록 FACS 솔팅을 위해서는 필수적이 아니지만 항-CD15, 항-CD29, 항-CD34, 항-CD90, 항-CD31, 항-CD45, 항-CD11b/c 및 항-폰 빌레브란트 인자(von Willebrand Factor)를 포함한다. 본 발명의 실행에 있어서 유용한 세포 파풀레이션 FACS 장비는 CellQuest^TM 소프트웨어를 구비한 FACScalibur^TM 분석기(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), 또는 구아바 기술(Guava Technologies, Hayward, California)로부터 입수할 수 있는 FACS 장비가 있지만 이에 한정되지는 않는다.

대안으로, 분리는 자기 분리 기술, 이를 테면 퀴아젠(Qiagen)으로부터 키트 형태로 입수할 수 있는 BioMag^TM 프로토콜 및 시약들을 이용하여 수행된다. 면역세포화학은 본 발명의 실행에 있어서 유용한 또다른 분리 기술이다; 유용한 면역세포화학은 M. 데자와 등(Dezawa et al., Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromal cells. Eur , J. Neurosci., 14, 1771-1776, 2001)에 기재되어 있다.

면역세포화학적인 정밀검사는 공초첨 레이져 스캐닝 현미경, 이를테면 Radians 2000 (Bio-Rad, Hertfordshire, UK)하에서 수행된다. 상업적인 시각적 세포 솔팅 기술들이 본 발명의 실행에서 이용된다.

본 발명의 목적상 뉴런은 뇌, 척주(spinal column), 신경을 구성하는 충격-전달 세포들 중의 하나로서, 하나 이상의 가지돌기(dendrites) 및 단일 액손을 가진 핵 세포체로 구성되는 것으로서 정의된다.

생화학적으로, 뉴런은 신경섬유-M, β-3-투불린 및 TuJ-1에 대한 항체와 반응하는 것에 의해 특징된다. 이들 반응들은 FACS 솔팅과 같은 기술을 이용하여 뉴런 또는 하나 이상의 뉴런의 특징들을 나타내는 세포를 분리하는데 이용된다. 신경 세포들은 또한 신경전달물질(neurotransmitters), 신경전달물질 합성효소 또는 신경전달물질-관련 단백질들, 예를 들어 뉴로펩티드 Y 및 물질 P를 분비하는 것이 특징이다.

본 발명의 목적상, 향신경성제(Neurotrophic agents)들은 다른 특징들 중에서도 CPC의 뉴런 또는 뉴런의 하나 이상의 특징을 나타내는 세포들로의 분화를 야기 또는 촉진시키는 특징을 가지는 물질로서 정의된다. 본 발명의 실시에 있어서 유용한 향신경성제들로는 섬유아세포 성장인자(basic-fibroblast growth factor, bFGF), 섬모 향신경성 인자(ciliary neurotrophic factor, CNF) 및 포스콜린(forskolin)가 있지만 이에 제한되지는 않는다. 향신경성제들은 당업계에 알려진세포 취급 기술을 이용하여 본 발명의 CPC와 결합된다. 양호한 방법들은 일반적으로 데자와 등의 PCT/JP03/01260에서 일반적으로 볼 수 있다. 양호한 실시 상태에 있어서, bFGF, CNTF 및 FSK는 CPC의 뉴런 또는 뉴런의 하나 이상의 특징을 나타내는 세포들로의 분화를 야기 또는 촉진시키는데 효과적인 양으로 세포 배양액에서 CPC와 결합된다.

본 발명의 목적상, 교세포들(Glial cells)은 중추 신경계의 조직을 뒷받침하는 파생된 세포들 및 섬유들의 네트워크를 구성하는 세포들 중 하나를 의미한다. 교세포들은 별아교세포(astrocytes), 신경집세포(Schwann cells), 희소돌기아교세포(oligodendrocytes) 및 미세아교세포(microglia)를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 목적상 유전자는 연결된 전사체의 세트로 정의되고, 여기에서 전사체는 전사 및 (임의적인 ) 프리-mRNA 스플라이싱에 의해 생산되는 엑손의 세트이다. 본 발명의 목적상 유전자 산물은 유전자로부터 번역된 단백질로 정의된다. 본 발명의 목적상 유전자의 부분이라 함은 유전자의 서브세트로서 정의된다.

본 발명의 목적상 유전자 산물의 부분이라 함은 유전자 산물의 서브세트로서 정의된다.

환자는 의료 진찰 또는 연구의 주체인 동물, 전형적으로 포유류, 더욱 전형적으로는 인간을 의미한다.

본 발명에 따라 생산된 CPC는 환자에게 다양한 방법들을 통해 투여되는데, 캐뉼러(cannula), 바늘, 단락(shunt) 주사를 통한 주입, 또는 담체, 예로 생분해성 캡슐과 같이 피하주사를 통해 투여되는데 이에 한정되는 것은 아니며, 다른 투여 경로도 역시 본 발명의 범위 내에 있다. 투여의 창의적인 경로는 국소 또는 전신적인 경로를 포함한다. 국소 투여는 바람직하게 CNS 또는 PNS의 표적된 부위의 투여를 포함하고, 바람직하게는 실질내(intraparenchymal) 경로를 포함한다.

전신 투여 경로에는, 전신적인 투여의 바람직한 경로로서 정맥(intravenous, i.v.) 또는 동맥내(intra-arterial, 이를테면 내부 또는 외부의 목동맥) 투여와 같은 비경구적(parenteral) 경로가 있다. 전신적 투여 기술은 일반적으로 전구 세포들을 투여하기 위해 이용되는 기술들(D Lu et al. , Intraarterial administration of marrow stromal cells in a rat model of traumatic brain injury. J Neurotrauma. 2001 Aug;18(8):813-9)로부터 변형 사용될 수 있다.

환자에게 투여되는 CPC의 양은 전통적인 일회 투여량 범위 기술 및 특정 환자의 질병의 임상적인 진단을 이용하여 임상적으로 결정된다.

본 발명은 본 출원에서 개시되어 있는 발명의 개별적인 측면들의 단일 기술로서 의도된 특정 구체예들의 용어에 제한되지 않는다. 본 발명의 많은 변형들 및 다양성이 그것의 정신 및 범위로부터 벗어남 없이 만들어질 수 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다. 본원에 열거된 것들에 추가하여 본 발명의 범위 내의 기능적으로 등가의 방법들은 전술한 발명의 상세한 설명으부터 당업자에게 명백할 것이다. 그런 변형들 및 변화는 청구의 범위 내인 것으로 간주된다. 본 발명은 이러한 청구항들이 청구하는 것과 균등인 범위와 함께 오직 청구항의 용어에 의하여만 제한된다.

아래의 실시예들은 본 발명의 범위를 설명하는 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

물질들 및 방법들:

MASC: 래트 MASC (Wistar strain)를 M. 데자와 등의 문헌 (M. Dezawa et al., Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromal cells., Eur. J. Neurosci., 14, 1771-1776, 2001)에서 설명된 것과 같이 분리하여 배양하였다. 인간 MASC로는, 상업적으로 구입한 MASC(PT-2501, BioWhittaker. Walkersville, MD) 및 건강한 공여자로부터 획득한 MASC를 사용하였다.

세포는 10% 소태아 혈청(FBS)을 함유한 α-MEM(Sigma, M-4526)에서 유지하였다.

건강한 공여자로부터 MASC를 수득하는 경우에, 초기 단계는 통상의 흡인 기술을 이용하여 건강한 공여자로부터 골수 흡인물(aspirate)을 수득하는 것이다. 이어서, 세포 흡인물을 50㎖ 튜브로 옮긴다. 10㎖ 피펫을 이용하여 13㎖ 히스토파크(Histopaque)를 조심스럽게 아래에 놓는다. 그 튜브를 20분 동안 2000rpm으로 원심분리한다. 계면에서의 세포를 수확한다.

PBS를 적어도 계면의 3× 부피로 첨가하고, 그 혼합물은 1200rpm에서 원심분리한다. 그 세포를 PBS로 두번이상 세척한다.

이어서, 세포 펠릿을 DMEM 및 10% FCS 중에 재현탁하고, 세포들을 계수한다. 5×10⁶ 세포들을 T-75 조직 배양 플라스크마다 다시 도말하여 3일 동안 인큐베이션한다. 4일째 날, 비-부착 세포들을 제거하고 플라스크를 배지로 3회 세척하였다. 부착된 세포들은 플라스크에서 성장하도록 하였다. 세포들이 20-30% 컨플루언스(confluence)에 도달하였을 때, 2-3 플라스크의 내용물을 모으고 (pooled) 하나의 T-75 플라스크에 재도말하였다.

이렇게 모아진 세포들이 컨플루언스에 도달하였을 때, 그 세포들을 0.05% 트립신 및 0.02% EDTA를 이용하여 트립신화하였다. 이어서, 그 세포들을 세척하고 계수하였다. 그 세포들은 시그마 α MEM + 10% FBS (M-4526)에 재현탁시켰다. 리포펙션(lipofection)이 사용되는 실험에 있어서, 배지가 I-glu를 포함하지 않도록 하는 것이 중요하다. 글루타민은 첨가하지 않았다. 그 세포들을 2-4주 동안 수를 불리고, 초기 계대시 냉동시켰다.

래트 및 인간 MASC에 있는 세포 표면 마커들을 FACS(fluorescence activated cell analysis)로 분석하였다. 한 가지 실시 상태에 있어서, MASC는 CD29 및 CD90을 발현하지만, CD34, CD31, CD45, CD11b/c, 및 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand Factor)는 발현하지 않았고, 이는 M. 피텐게르 등의 문헌(M. Pittenger et al., Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284, 143-147, 1999) 및 J. 코햐마 등의 문헌(J. Kohyama et al., Brain from bone: efficient "meta-differentiation" of marrow stroma-derived mature osteoblasts to neurons with Noggin or a demethylating agent. Differentiation 68, 235-244, 2001)의 내용과 일치된다 (도 1A). 동일한 결과가 면역 세포 화학에 의해 수득된다. 래트 및 인간 MASC 모두의 지방형성(Adipogenic), 연골발생(chondrogenic) 및 골원성(osteogenic) 분화는 M. 피텐게르 등(M. Pittenger et al., Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284, 143-147)에 의해 기재된 방법에 따라 확인된다.

FACS 분석

1×10⁷/㎖의 최종 농도의 세포들을 PBS(phosphate buffered saline)에서 1 ㎎의 모노클로날 항체와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션은 비특이적 항체 결합을 막기 하여 마우스의 면역 글로불린 항체 10mg의 존재에서 수행된다. 래트 MASC에서, 마우스 항-CD34(Santa Cruz Antibodies) 및 햄스터 항-CD29(PharMingen, San Diego, CA)를 FITC로 표지하고, 대조군들은 FITC-표지된 항-마우스 또는 햄스터 IgG와 함께 배양하였다.

마우스 항-CD54 및 CD11b/c는 모두 PharMingen에서 구입할 수 있다. 본 발명의 실시에서 필요로 하는 마우스 항-폰 빌레브란트 인자 및 다른 항체들은 구입 가능하다. 대조군에는 비-면역 마우스 혈청으로 염색된 세포들이 포함된다. 이들 항체들이 FITC에 컨쥬게이팅되면, 이어서, 그 세포들을 1 mg의 FITC-컨쥬게이팅된 항-마우스 IgG와 함께 인큐베이션하였다. 인간 MASC에서, 피코에리트린(phycoerythrin)으로 표지된 마우스 항-CD34, CD29, CD54, CD11b/c 및 폰 빌레브란트 인자가 이용되고, 대조군은 피코에리트린으로 표지된 항-마우스 IgG로 염색된 세포들을 포함한다. 데이터를 획득하여 CeilQuest 소프트웨어를 구비한 FACScalibur(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)로 분석하였다.

면역세포화학

일반적인 과정은 M. 데자와 등의 문헌 (M. Dezawa et al., Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromal cells. Eur. J. Neurosci. 14, 1771-1776, 2001)에 기재되어 있다.

PBS에서 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 세포들을 고정한 후에, 4℃에서 밤새도록 제1 항체로 인큐베이션한다. 네스틴에 대한 항체들은 PharMingen에서 상업적으로 구입할 수 있다. 세포들을 Alexa Fluor 488 또는 546 컨쥬게이팅된 항-마우스 IgG, IgM, 또는 토끼 IgG (Molecular Probes, Eugene, OR)에 대한 제2 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였고, TOTO-3 요오드화물 (Molecular Probes) 카운터 염색을 수행하는 것도 가능하다. 공초점 레이져 스캐닝 현미경(Radians 2000, Bio-Rad, Hertfordshire, UK)으로 정밀 검사를 수행하였다.

실시예 1:

인간 MASC (PT-2501, BioWhittaker, Walkersville, MD)는 일반적으로 E. 슈드벡 등의 문헌 (Sudbeck et al., Structure-based design of specific inhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents. Clin. Cancer Res. 5, 1569-1582, 1999)에 따른 10% FBS를 함유하는 α-MEM에서 배양액에서 성장시켰다. MASC는 40 ug/㎖ 4- (4'-하이드록시페닐)아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린(WHI - 131, Calbiochem, San Diego, CA)와 함께 2일 동안 인큐베이션하였다. WHI-131는 2일 후에 세척하였다.

실시예 2:

물질들 및 방법들 섹션에 따라 준비된 인간 MASC를 E. 슈드벡 등의 문헌 (E. Sudbeck et al., Structure-based design of specific inhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents. Clin. Cancer Res. 5, 1569- 1582, 1999)에 따라 일반적으로 10% FBS를 함유한 α-MEM에서 배양액에서 성장시켰다.

배양액이 90% 컨플루언스에 도달하였을 때, BLOCK-iT^TM RNAi 디자이너 (Invitrogen)을 이용하여 디자인된 몇몇 RNAs를 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 입수할 수 있는 BLOCK-iT^TM프로토콜을 이용하여 Sox9 발현이 침묵될 정도로 충분한 시간동안 배양액과 함께 인큐베이션하였다.

생성된 CPC는 항-EfnB2 (CPC에 대한 양성 선택), 항-CD90 (CPC에 대한 음성 선택), 및 항-PDGF 수용체 베타(CPC에 대한 음성 선택)와 같은 적절한 항체들로 코팅된 자기 비즈를 이용하여 순차적인 선별에 의해 비이행분화된 MASC로부터 분리한다. 항체 및 코팅된 비즈들은 시판 공급업자들로부터 입수할 수 있다. PBS 중의 세포를 1시간 동안 실온에서 코팅된 비즈와 함께 인큐베이션한다. 세포와 결합된 비즈들은 자석을 이용하여 제거한다. CPC는 유리 항체가 없도록 세척하고, 10% FBS를 함유한 α-MEM 중에 재현탁시키고 증식시킨다.

실시예 3:

물질들 및 방법들 섹션에 따라 준비된 인간 MASC를 E. 슈드벡 등의 문헌 (E. Sudbeck et al., Structure-based design of specific inhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents. Clin. Cancer Res. 5, 1569- 1582, 1999)에 따라 일반적으로 10% FBS를 포함하는 α-MEM 중의 배양액에서 성장시켰다.

Hes1에 대한 안티센스 올리고머들은 H. 뮬톤 등의 문헌 (H. Moulton et al., Peptide-assisted delivery of steric-blocking antisense oligomers. Curr Opin Mol Ther., 2003Apr; 5(2): 123-32), C. 스테인 등의 문헌(Stein et al., Antisense oligonucleotides as therapeutic agents--is the bullet really magical? Science. 1993 Aug 20; 261(5124): 1004-12), C. 헬렌의 문헌 (C. Helene, The anti-gene strategy: control of gene expression by triplex-forming-oligonucleotides. Anticancer Drug Des. 1991 Dec;6(6):569-84) 중 어느 하나에서 개시된 기술들에 따라 생성시켰다. MASC 배양액이 90% 컨풀루언스에 도달하고, Hes-1 안티센스 올리고머들이 Hes-1 발현의 하향 조절이 되도록 충분한 시간 동안 이 실시예에서 인용된 세가지 논문들 중 어느 하나에서 개시된 기술들에 따라 MASC로 인큐베이션한다. 생성된 CPC를 항-EfnB2(CPC에 대한 양성 선별), 항- CD90(CPC에 대한 음성 선별), 및 항-PDGF 수용체 베타(CPC에 대한 음성 선별)과 같은 적절한 항체들로 코팅된 자석 비즈를 이용하여 순차적 선별에 의해 비이행분화된 MASC로부터 분리한다. 항체들 및 코팅된 비즈들은 시판 공급업자로부터 구입 가능하다. PBS 중의 세포들을 1시간 동안 실온에서 코팅된 비즈와 함께 인큐베이션한다. 세포와 결합된 비즈들을 자석을 이용하여 제거한다. CPC는 유리 항체가 없도록 세척하고 10% FBS를 함유한 α-MEM 중에 재현탁시키고 증식시킨다.

실시예 4:

Wnt-1 발현 플라스미드들을 M. 센 등의 문헌 (M. Sen et al., Regulation of fibronectin and metalloproteinase expression by Wnt signaling in rheumatoid arthritis synoviocytes. Arthritis Rheum. 2002 Nov;46(11):2867-77)에 따라 생성시켰다.

물질들 및 방법들 섹션에 따라 제조된 인간 MASC들을 E. 슈드벡 등의 문헌 (E. Sudbeck et al., Structure-based design of specific inhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents. Clin. Cancer Res. 5, 1569-1582, 1999)에 따라 일반적으로 10% FBS를 함유한 α-MEM 중의 배양액에서 성장시켰다.

배양액이 90% 컨플루언스에 도달했을 때, MASC를 37℃에서, 5% CO₂에서 2일 동안 인비트로젠(Invitrogen)에서 입수가능한 리포펙타민^TM 2000 시약 및 프로토콜을 이용하여 Wnt-1 발현 플라스미드와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 이틀 후에, 배양액을 10일의 기간 동안 전통적인 선별 기술들을 이용하여 트랜스펙트된 세포들에 대하여 선별하였다. 생성된 CPC를 항-EfnB2(CPC에 대한 양성 선별), 항-CD90(CPC에 대한 음성 선별), 및 항-PDGF 수용체 베타(CPC에 대한 음성 선별)과 같은 적절한 항체들로 코팅된 자석 비즈를 이용하여 순차적 선별에 의해 비이행분화된 MASC로부터 분리하였다. 항체들 및 코팅된 비즈들은 시판 공급업자로부터 입수 가능하다. PBS 중의 세포들을 1시간 동안 실온에서 코팅된 비즈와 함께 인큐베이션한다. 세포와 결합된 비즈들은 자석을 이용하여 제거한다. CPC는 유리 항체가 없도록 세척하고 10% FBS를 함유한 α-MEM 중에 재현탁시키고 증식시킨다.

실시예 5:

실시예 1에 따라 생산된 세포들을 20% FBS(14-501 F, Lot #61-1012, BioWhittaker Co.)를 함유한 최소 필수 배지 알파 이글 변형(Minimum Essential Mediam Alpha Eagle Modification, M4526, Sigma Co.)에 두었다. 5μM의 포스콜린(forskolin, 344273, Calbiochem, La Jolla, CA), 10 ng/㎖의 재조합 인간 섬유아세포 성장인자(bFGF, 100-18B, Peprotech EC, Ltd. , London, UK) 및 10 ng/㎖의 섬모 향신경성 인자(557-NT, R&D Systems, Minneapolis, MN)를 첨가하였다. 배양액을 3일 동안 성장시킨 결과, 뉴런의 전구 세포 특징들을 나타내는 포인트 세포들이 인식되었고, 그 결과는 MAP-2ab-양성 세포들의 29.46+/-3.0%였다. MAP-2ab는 웨스턴 블럿팅을 이용하여 인큐베이션된 세포들로부터 준비된 세포 용해물 및 5%와 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동된 용해물 단백질 50 ug로 분석하였다.

MAP-2에 대한 항원들은 (1:500, Chemicon)은 알칼라인 포스파타제를 이용하여 측정하였다.

실시예 6:

실시예 5의 뉴런의 전구 세포 특징들을 나타내는 세포들을 수확하고, E. 슈드벡 등(E. Sudbeck et al., Structure-based design of specific inhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents. Clin. Cancer Res. 5, 1569-1582, 1999)에 따라 일반적으로 10% FBS를 함유하는 α-MEM 중의 배양액에서 90% 컨풀루언스가 되도록 성장시킨다.

다음, 포스콜린 5mM(344273, Calbiochem), 10 ng/㎖의 섬유아세포 성장인자(bFGF, 100-18B, Peprotech EC, Ltd. , London, UK) 및 50 ng/㎖의 섬모 향신경성 인자(557-NT, R&D Systems, Minneapolis, MN)를 세포 배양액에 첨가한다.

세포들은 향신경성제의 존재하에서 10일 동안 성장시키고, 이어서, 신경 세포들의 특징적인 형태학과 MAP-2(MAB364, Chemicon), 신경섬유(814342,Boehringer Manheim) 및 네스틴(BMS4353, Bioproducts)에 대한 항체들에 대한 양성 반응을 분석한다.

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Claims

중간엽 줄기 세포들의 적어도 일부가 네스틴을 발현하는 뉴런 전구 세포들로 이행분화하도록, JAK3(Janus kinase 3) 억제제를 포함하는 조성물과 함께 중간엽 줄기 세포들을 인큐베이션하는 단계를 포함하는,

중간엽 줄기 세포들로부터 네스틴을 발현하는 뉴런 전구 세포들을 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기 세포들은 래트의 중간엽 줄기 세포들, 마우스의 중간엽 줄기 세포들, 영장류의 중간엽 줄기 세포들, 돼지의 중간엽 줄기 세포들, 소의 중간엽 줄기 세포들 및 양의 중간엽 줄기 세포들로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 줄기 세포들은 인간의 중간엽 줄기 세포들인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 JAK3 억제제는 4-(4'-하이드록시페닐)아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린(4-(4'-hydroxyphenyl)amino-6,7-dimethoxyquinazoline)인 것인 방법.
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제1항에 있어서, 상기 JAK3 억제제는 RNAi 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 것인 방법.
제1항에 있어서, 네스틴을 발현하는 뉴런 전구 세포들을 분리하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기 세포들은 제대혈(cord blood)로부터 유래되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기 세포들은 골수로부터 유래되는 것인 방법.
제1항의 방법에 의하여 네스틴을 발현하는 뉴런 전구 세포들을 생산하는 단계; 및

상기 뉴런 전구 세포들을 섬유아세포 성장인자(basic-fibroblast growth factor), 섬모 향신경성 인자(ciliary neurotrophic factor) 및 포스콜린(forskolin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 향신경성 인자와 접촉시키는 단계를 포함하고,

여기에서 적어도 하나의 향신경성 인자는 뉴런 전구 세포들이 뉴런 세포들로 분화되는 것을 촉진시키는데 효과적인 양으로 존재하는 것인 방법.
제10항에 있어서, 뉴런 세포들을 분리하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
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