JP5756039B2 - ニューロン始原細胞特性を示す細胞 - Google Patents
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Description
本発明は、ニューロン始原細胞特性を示す細胞に、ならびに骨髄付着幹細胞の神経膠トランス分化と関連する骨髄付着幹細胞中の細胞経路を調節することにより骨髄付着幹細胞からそれらを作製する方法に関する。
中枢神経系(CNS)または末梢神経系(PNS)疾患の研究および治療における制限は、最終分化ニューロンが、増殖するそれらの能力を有意に制限されることである、と慣用的に認識されている。したがって最終分化ニューロンの移植片を要するCNSまたはPNSの任意の治療は、成し遂げるのが困難である。
一態様において、本発明は、骨髄付着幹細胞を含む物質からのニューロン始原細胞特性を示す細胞の産生方法であって、以下の:骨髄付着幹細胞の神経膠トランス分化(trans differentiation)と関連する骨髄付着幹細胞中の細胞経路を調節し;この場合、細胞経路はニューロン始原細胞特性を示す細胞にトランス分化するために骨髄付着幹細胞の少なくとも一部を誘導するのに十分に調節されるが;但し調節はノッチ細胞内ドメインによる骨髄付着幹細胞のトランスフェクションを包含しない、ということを包含する方法に関する。
上記の問題および制限は本明細書中に開示された本発明を実施することにより克服され得るということを、本発明人は、予期せぬことにそして意外にも、発見した。本発明は、骨髄付着幹細胞(MASC)の神経膠トランス分化に関連するMASC中の細胞経路を調節することによりMASCからのCPCの産生を取り扱う。本発明の製造および使用方法が本明細書中で開示される。
材料および方法
MASC:
M. Dezawa et al., Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromal cells. Eur. J. Neurosci. 14, 1771-1776 (2001)に記載されているように、ラットMASC(ウィスター系)を単離し、培養する。ヒトMASCに関する場合と同様に、市販MASC(PT‐2501、BioWhittaker. Walkersville, MD)および健常ドナーから得られるMASCを用いる。10%ウシ胎仔血清(FBS)を含有するα‐MEM(Sigma、M‐4526)中に、細胞を保持し得る。
最終濃度1×107個/mlの最終濃度の細胞を、リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)中の1 mgのモノクローナル抗体とともにインキュベートする。非特異的抗体結合を防止するために、10 mgのマウス免疫グロブリンの存在下でインキュベーションを実施し得る。ラットMASCでは、マウス抗CD34(Santa Cruz Antibodies)およびハムスター抗CD29(PharMingen, San Diego, CA)をFITCで標識し、対照をFITC標識抗マウスまたはハムスターIgGとともにインキュベートし得る。マウス抗CD54およびCD11b/cはすべて、PharMingenから購入し得る。本発明の実行に際して必要とされるマウス抗フォン・ビレブランド因子およびその他の抗体は、商業的に入手可能であり得る。対照としては、何れかの非免疫マウス血清で染色される細胞が挙げられ得る。これらの抗体がFITCと接合される場合、細胞はその後、1 mgのFITC接合抗マウスIgGとともにインキュベートされ得る。ヒトMASCでは、フィコエリトリン標識マウス抗CD34、CD29、CD54、CD11b/cおよびフォン・ビレブランド因子を用い得るし、対照としては、フィコエリトリン標識抗マウスIgGで染色される細胞が挙げられ得る。CellQuestソフトウエア(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)を用いてFACScaliburで、データを獲得し、分析し得る。
一般的手法は、M. Dezawa et al., Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromal cells. Eur. J. Neurosci. 14, 1771-1776 (2001)に記載されている。リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)中の4%パラホルムアルデヒドで細胞を固定後、それらを4℃で一晩、第一抗体とともにインキュベートする。ネスチンに対する抗体は、PharMingenから購入し得る。次に細胞を、Alexa Fluor488または546接合抗マウスIgG、IgMまたはウサギIgGに対する第二抗体(Molecular Probes, Eugene, OR)とともに室温で1時間インキュベートし、TOTO‐3ヨウ化物(Molecular Probes)対比染色を実施し得る。共焦点レーザー走査顕微鏡(Radians 2000, Bio-Rad, Hertfordshire, UK)下で,検査をなし得る。
一般的にE. Sudbeck et al., Structure-based design of specific inhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents. Clin. Cancer Res. 5, 1569-1582 (1999)に従って、ヒトMASC(PT‐2501、BioWhittaker. Walkersville, MD)を、10%FBSを含有するα‐MEM中で増殖させた。MASCを、40 ug/mlの4‐(4’‐ヒドロキシフェニル)アミノ‐6,7‐ジメトキシキナゾリン(WHI‐131、Calbiochem, San Diego, CA)とともに2日間インキュベートした。2日後に、WHI‐131を洗い落とした。
材料および方法の節に従って調製したヒトMASCを、一般的にE. Sudbeck et al., Structure-based design of specific inhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents. Clin. Cancer Res. 5, 1569-1582 (1999)に従って、10%FBSを含有するα‐MEM中で増殖させる。一旦培養が集密度90%に達したら、BLOCK‐iTTMRNAiデザイナー(Invitrogen)を用いて設計されるいくつかのRNAを、Invitrogenから利用可能なBLOCK‐iTTMを用いて、Sox9発現をサイレンシングするのに十分な時間、培養とともにインキュベートする。その結果生じるCPCを、適切な抗体、例えば抗EfnB2(CPCに関して陽性選択)、抗CD90(CPCに関して陰性選択)および抗PDGF受容体ベータ(CPCに関して陰性選択)で被覆された磁気ビーズを用いて、逐次選択により、非トランス分化化MASCから単離する。抗体および被覆ビーズは、商業的供給元から入手し得る。PBS中の細胞を、被覆ビーズとともに@室温で1時間インキュベートする。細胞結合ビーズを、磁気を用いて除去する。CPCを抗体なしで洗浄し、10%FBSを含有するα‐MEM中に再懸濁して、増殖させる。
材料および方法の節に従って調製したヒトMASCを、一般的にE. Sudbeck et al., Structure-based design of specific inhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents. Clin. Cancer Res. 5, 1569-1582 (1999)に従って、10%FBSを含有するα‐MEM中で増殖させる。H. Moulton et al., Peptide-assisted delivery of steric-blocking antisense oligomers. Curr Opin Mol Ther. 2003 Apr; 5(2): 123-32;C. Stein et al., Antisense oligonucleotides as therapeutic agents−is the bullet really magical? Science. 1993 Aug 20; 261(5124): 1004-12またはC. Helene, The anti-gene strategy: control of gene expression by triplex-forming-oligonucleotides. Anticancer Drug Des. 1991 Dec; 6(6): 569-84のいずれか一つに開示された技法に従って、Hes 1に対するアンチセンスオリゴマーを生成する。一旦MASC培養が集密度90%に達したら、本実施例中に引用した3つの参考文献のいずれかに開示された技法に従って、Hes‐1発現を下向き調節するのに十分な期間、MASCとともにHes‐1アンチセンスオリゴマーをインキュベートする。その結果生じるCPCを、適切な抗体、例えば抗EfnB2(CPCに関して陽性選択)、抗CD90(CPCに関して陰性選択)および抗PDGF受容体ベータ(CPCに関して陰性選択)で被覆された磁気ビーズを用いて、逐次選択により、非トランス分化化MASCから単離する。抗体および被覆ビーズは、商業的供給元から入手し得る。PBS中の細胞を、被覆ビーズとともに@室温で1時間インキュベートする。細胞結合ビーズを、磁気を用いて除去する。CPCを抗体なしで洗浄し、10%FBSを含有するα‐MEM中に再懸濁して、増殖させる。
M. Sen et al., Regulation of fibronectin and metalloproteinase expression by Wnt signaling in rheumatoid arthritis synoviocytes. Arthritis Rheum. 2002 Nov; 46(11): 2867-77に従って、Wnt‐1発現プラスミドを生成する。材料および方法の節に従って調製したヒトMASCを、一般的にE. Sudbeck et al., Structure-based design of specific inhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents. Clin. Cancer Res. 5, 1569-1582 (1999)に従って、10%FBSを含有するα‐MEM中で増殖させる。一旦培養が集密度90%に達したら、リポフェクタミンTM2000試薬およびプロトコール(Invitrogenから入手可能)を用いて、37℃で5%CO2で2日間、Wnt‐1発現プラスミドとともにMASCをインキュベートする。2日間のインキュベーション後、10日間の期間中、慣用的選択技法を用いてトランスフェクト化細胞に関して、培養を選択する。その結果生じるCPCを、適切な抗体、例えば抗EfnB2(CPCに関して陽性選択)、抗CD90(CPCに関して陰性選択)および抗PDGF受容体ベータ(CPCに関して陰性選択)で被覆された磁気ビーズを用いて、逐次選択により、非トランス分化化MASCから単離する。抗体および被覆ビーズは、商業的供給元から入手し得る。PBS中の細胞を、被覆ビーズとともに@室温で1時間インキュベートする。細胞結合ビーズを、磁気を用いて除去する。CPCを抗体なしで洗浄し、10%FBSを含有するα‐MEM中に再懸濁して、増殖させる。
実施例1に従って産生した細胞を、20%ウシ胎仔血清(14‐501F、ロット番号61-1012、BioWhittaker Co.)を含有する最小必須培地α‐イーグル変法溶液(M4526、Sigma Co.)中に入れた。5 μMのフォルスコリン(344273, Calbiochem, La Jolla, CA)、10 ng/mlの組換えヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子(100‐18B、Peprotech EC, Ltd., London, UK)および10 ng/mlの毛様体神経栄養因子(557‐NT、R&D Systems, Minneapolis, MN)を付加した。培養を3日間増殖させて、この時点で、29.46+/−3.0%のMAP‐2ab陽性細胞の結果を用いて、ニューロンの1つ又は複数の特性を示す細胞を認識した。インキュベート細胞から調製した細胞溶解物、ならびに5%および10%SDS‐ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動処理した溶解物タンパク質50 ugとともに、ウエスタンブロッティングを用いて、MAP‐2abを分析した。アルカリ性ホスファターゼを用いて、MAP‐2(1:500, Chemicon)に対する抗原を検出した。
実施例5のニューロンの1つ又は複数の特性を示す細胞を収穫し、一般的にE. Sudbeck et al., Structure-based design of specific inhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents. Clin. Cancer Res. 5, 1569-1582 (1999)に従って、10%FBSを含有するα‐MEM中の培養中で集密度90%に増殖させる。次に5 mMのフォルスコリン(344273, Calbiochem)、10 ng/mlの塩基性繊維芽細胞増殖因子(100‐18B、Peprotech EC, Ltd.)および50 ng/mlの毛様体神経栄養因子(557‐NT、R&D Systems)を細胞培養に付加する。
Claims (13)
- 中枢又は抹消神経系の疾患の治療のための細胞をインビトロで生産する方法であって、該細胞は、以下のステップ:
培養中の骨髄付着幹細胞(MASCs)を、JAK/STATシグナル伝達の阻害剤とともにインキュベートする、ここで、該MASCsは、ノッチ細胞内ドメインをコードするポリヌクレオチドでトランスフェクションされていない、
により得られる前記方法。 - 前記骨髄付着幹細胞が、ヒト骨髄付着幹細胞、ラット骨髄付着幹細胞、マウス骨髄付着幹細胞、霊長類骨髄付着幹細胞、ブタ骨髄付着幹細胞、ウシ骨髄付着幹細胞、及びヒツジ骨髄付着幹細胞からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記骨髄付着幹細胞が、ヒト骨髄付着幹細胞である、請求項2に記載の方法。
- 前記JAK/STATシグナル伝達の阻害剤は、STAT1又はSTAT3の阻害剤を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記JAK/STAT阻害剤はポリペプチドである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記インキュベーションは、前記JAK/STAT阻害剤をコードするポリヌクレオチドで前記MASCsをトランスフェクションすることを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記JAK/STAT阻害剤は、4−(4’−ヒドロキシフェニル)アミノ−6,7−ジメトキシキナゾリンである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記MASCsが、骨髄から得られる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記MASCsが、臍帯血から得られる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記培養物から、以下の:
(i)有糸分裂性であり、
(ii)EfnB2を発現し、
(iii)ネスチンを発現し、そして
(iv)PDGF受容体ベータを発現しない、
である1以上の細胞を、単離するステップをさらに含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。 - 以下の:
(i)有糸分裂性であり、
(ii)EfnB2を発現し、
(iii)ネスチンを発現し、そして
(iv)PDGF受容体ベータを発現しない、
である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法により得られた単離細胞。 - 骨髄付着幹細胞の子孫である単離細胞集団であって、該集団は、以下の:
(i)有糸分裂性であり、
(ii)EfnB2を発現し、
(iii)ネスチンを発現し、そして
(iv)PDGF受容体ベータを発現しない、
である複数の細胞を含み、そしてさらに、該骨髄付着幹細胞は、ノッチ細胞内ドメインをコードするポリヌクレオチドでトランスフェクションされていない、前記単離細胞集団。 - 請求項11に記載の1以上の細胞又は請求項12に記載の細胞集団を含む、中枢神経系の疾患又は末梢神経系の疾患の治療用医薬組成物。
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