PT1737950E - Células exibindo características de células progenitoras neuronais - Google Patents

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Description

ΕΡ 1 737 950/PT
DESCRIÇÃO "Células exibindo caracteristicas de células progenitoras neuronais"
CAMPO DO INVENTO O invento refere-se a métodos para produção de células exibindo caracteristicas de células progenitoras neuronais a partir de células estaminais mesenquimais por regulação de percursos celulares nas células estaminais mesenquimais que estão associados a transdiferenciação glial das células estaminais mesenquimais.
ANTECEDENTES DO INVENTO
Uma limitação na investigação e no tratamento de doenças do Sistema Nervoso Central (SNC) ou do Sistema Nervoso Periférico (SNP) é o reconhecimento convencional de que neurónios diferenciados terminalmente estão significativamente limitados na sua capacidade para proliferar. Por conseguinte, qualquer tratamento de doenças do SNC ou do SNP que requeira transplante de neurónios diferenciados terminalmente é difícil de conseguir.
Uma abordagem proposta para ultrapassar esta dificuldade tem sido cultivar grandes números de células mitóticas exibindo caracteristicas de células progenitoras neuronais ("CPCs"). Estas células poderão teoricamente diferenciar-se in vivo em neurónios que poderão funcionar no tratamento de doenças do SNC e/ou do SNP. Alternativamente, as CPCs poderão ser diferenciadas in vitro em neurónios e depois transplantadas para pacientes. No entanto, estas CPCs são raras e difíceis de isolar a partir de dadores. Deste modo, convencionalmente, investigadores têm tentado obter CPCs a partir de células estaminais embrionárias e fetais (aqui depois referidas colectivamente como "células estaminais embrionárias") tratadas. Têm-se utilizado células estaminais embrionárias, que são células pluripotentes, para gerar uma grande variedade de tipos de tecidos, e poderão ser uma fonte de CPCs. I. 2 ΕΡ 1 737 950/ΡΤ
Weissman, Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution (Review), Cell 100, 157-168 (2000) . Contudo, a utilização de células estaminais embrionárias levanta várias questões éticas, e assim é uma fonte desfavorável de células estaminais para produção de CPCs. Adicionalmente, as células estaminais embrionárias podem ser tumorigénicas, o que gera preocupações de segurança uma vez que qualquer procedimento de transplante poderá resultar potencialmente na entrega de células estaminais embrionárias a um paciente, tal como na criação de um enxerto de CPC a partir de células estaminais embrionárias.
Alguns investigadores têm tentado utilizar outros tipos de células estaminais, tais como células estaminais mesenquimais na produção de CPCs. O Pedido de patente dos Estados Unidos da América 20030003090 de Prockop, et al., depositado em 2 de Janeiro de 2003, e intitulado "Directed in vitro differentiation of marrow stromal cells into neural cell progenitors" revela que os niveis de expressão tanto de NSE como de vimentina estavam aumentados em células estaminais mesenquimais humanas após a sua incubação com IBMX 0,5 milimolar e dbcAMP 1 milimolar. O aumento em ARNm de NSE e vimentina coincidiu com o aparecimento de células neurais nas culturas. No entanto, Prockop et al. relataram que não existiu qualquer alteração no nivel de expressão quer de MAP1B quer de TuJ-1. Uma vez que NSE, MAP1B e TuJ-1 são marcadores precoces caracteristicos de neurónios e que a vimentina é um marcador precoce de glia, Prockop et al. sugeriram que as hMSCs se transdiferenciaram in vitro em alguns progenitores precoces quer de neurónios quer de glia. No entanto, as células progenitoras precoces de Prockop podem ser indesejáveis para utilização porque parecem exibir um fenótipo neuronal muito imaturo cuja eficácia clinica não é bem compreendida. A WO 03/066856 revela a produção de células estaminais neurais a partir de células estaminais mesenquimais após transfecção com o domínio intracelular de Notch. As células estaminais neurais poderão ser adicionalmente diferenciadas em células neurais expressando MAP-2ab e TuJ-1 após indução de factor trófico. 3
ΕΡ 1 737 950/PT
Por conseguinte, existe uma escassez de fontes adequadas e disponíveis convencionalmente de CPCs para utilização, por exemplo, na pesquisa e no tratamento de doenças do SNC ou do SNP. Adicionalmente, existe uma escassez de métodos que possam ser utilizados de um modo adequado para produzir estas CPCs adequadas para utilização. São necessários métodos e composições que ultrapassem estes problemas.
SUMÁRIO DO INVENTO
Num aspecto, o invento refere-se a um método para produção de células exibindo características de células progenitoras neuronais a partir de material compreendendo células estaminais mesenquimais, o método compreendendo: regulação de percursos celulares nas células estaminais mesenquimais que estão associados a transdiferenciação glial das células estaminais mesenquimais; onde os percursos celulares são suficientemente regulados para induzir pelo menos uma parte das células estaminais mesenquimais a transdiferenciarem-se em células exibindo características de células progenitoras neuronais; caracterizado por a regulação compreender a inibição de transdução de sinal de JAK/STAT.
Noutro aspecto, o invento refere-se a um método para produção de células exibindo características de células progenitoras neuronais compreendendo: incubação de células estaminais mesenquimais com um inibidor de JAK/STAT numa quantidade suficiente para induzir pelo menos uma parte das células estaminais mesenquimais a transdiferenciarem-se em células exibindo características de células progenitoras neuronais; com a condição de a interacção não compreender transfecção das células estaminais mesenquimais com domínio intracelular de Notch.
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO O inventor constatou inesperadamente e surpreendentemente que os problemas e limitações acima salientados podem ser ultrapassados pela prática do invento aqui revelado. O presente invento é dirigido à produção de CPCs a partir de células estaminais mesenquimais (MSCs) por regulação de percursos celulares em MSCs que estão associados 4 ΕΡ 1 737 950/ΡΤ a transdiferenciação glial das MSCs. São aqui revelados modos de realizar e utilizar o invento.
Para os propósitos deste invento, células exibindo caracteristicas de células progenitoras neuronais ("CPCs") são definidas como sendo células que são mitóticas, expressam nestina e outros marcadores celulares específicos para células precursoras neurais/progenitoras neurais, e são derivadas de MSCs. As CPCs podem diferenciar-se em neurónios, glia e oligodendrócitos, e em precursores de quaisquer das anteriores. As CPCs podem ser derivadas de MSCs de acordo com métodos aqui revelados. Numa concretização, as CPCs humanas são EfnB2+, CD90- e receptor beta de PDGF-. Estes marcadores podem ser utilizados para separar CPCs de MSCs utilizando FACS após transdiferenciação glial das MSCs de acordo com. o presente invento. Métodos adequados de manipulação de CPCs são conhecidos convencionalmente, incluindo os métodos revelados, por exemplo, no Pedido de Patente dos Estados Unidos publicado 20020012903 de Goldman et al.
Em geral, de acordo com o invento, as CPCs podem ser produzidas por regulação de percursos celulares em MSCs que estão associados a transdiferenciação glial das MSCs, os percursos celulares estando suficientemente regulados para induzir pelo menos uma parte das MSCs a transdiferenciarem-se em CPCs.
Pode ser útil uma ampla variedade de métodos de regulação. Estes incluem, mas não estão limitados a, modificação do meio e das condições nas quais as células são cultivadas, se cultivadas ex vivo; modificação do ambiente do tecido no qual as MSCs estão presentes, se cultivadas in vivo; ou incubação das MSCs com agentes de regulação glial. O modo exacto de regulação não é importante, desde que a transdiferenciação glial das MSCs seja eficazmente regulada, permitindo assim a diferenciação das MSCs em CPCs. Geralmente, a regulação de percursos celulares em MSCs que estão associados a transdiferenciação glial das MSCs ocorre sob condições que são apropriadas para manter quaisquer MSCs ou CPCs num estado mitótico e viável. Estas condições são conhecidas de um perito na especialidade, e podem ser encontradas, por exemplo, em M. Kallos et al. , Large-scale 5
ΕΡ 1 737 950/PT expansion of mammalian neural stem cells: a review. Med. Biol. Eng. Comput. Maio de 2003; 41(3):271-82. Condições e técnicas podem também ser encontradas noutros locais na literatura tanto para cultura de células como para ambientes in vivo. A regulação dos percursos celulares em MSCs que estão associados a transdiferenciação glial das MSCs pode ser realizada por incubação das MSCs com agentes de regulação glial. A regulação dos percursos celulares em MSCs que estão associados a transdiferenciação glial das MSCs pode ser realizada por incubação das MSCs com agentes de regulação glial em quantidades suficientes para induzir pelo menos uma parte das MSCs a transdiferenciarem-se em CPCs. As incubações podem envolver a cultura das MSCs na presença de agentes de regulação glial com a intenção de os agentes de regulação glial ou interactuarem com receptores de superfície celular de MSC ou serem transportados para o interior das MSCs para interactuarem com percursos celulares internos. Este transporte pode ser passivo, tal como transporte difusivo, ou activo, tal como através de transportadores activos, ou uma mistura dos dois. As incubações in vitro podem ser realizadas de um modo convencional, por exemplo por incubação de culturas de MSCs em alfa-MEM, ou meios similares, aos quais se adiciona(m) agente(s) de regulação glial. Técnicas de incubação adequadas podem ser encontradas em geral na literatura, incluindo por exemplo M. Kallos et al., Large-scale expansion of mammalian neural stem cells: a review. Med. Biol. Eng. Comput. Maio de 2003; 41(3):271-82. As incubações podem também ocorrer num ambiente in vivo, caso em que se podem administrar agentes de regulação glial de acordo com o invento quer sistemicamente quer localmente, e utilizando métodos convencionais.
Se o agente de regulação glial é uma proteína ou péptido, o método de incubação pode ser uma transfecção do ADN codificando essa proteína ou péptido nas MSCs. As transfecções podem ser realizadas utilizando protocolos de transfecção disponíveis comercialmente, tais como o sistema Lipofectamine™ 2000 disponível na Invitrogen, o sistema de transfecção Effectene™ disponível na Qiagen, ou outros protocolos de transfecção convencionais. 6
ΕΡ 1 737 950/PT
Se o agente de regulação glial é uma proteína ou péptido, o método de incubação pode ser entrega virai do agente de regulação glial, utilizando vectores virais convencionais, tais como sistemas de vector lentiviral (sistema de expressão de ARNi lentiviral BLOCK-iT™, Invitrogen) para expressão estável e sistemas de vector adenoviral (sistema de expressão de ARNi lentiviral BLOCK-iT™, Invitrogen) para expressão transiente.
As incubações podem ocorrer em vários momentos: em série, em paralelo ou em combinações de incubações em série e em paralelo, das MSCs com vário(s) agente(s) de regulação glial.
Em concretizações do invento, existe a condição de a regulação de percursos celulares nas MSCs, que estão associados a transdiferenciação glial das MSCs, não compreender transfecção das MSCs com o domínio intracelular do gene Notch. Em concretizações do invento, existe a condição de a incubação das MSCs com agentes de regulação glial não compreender transfecção das MSCs com o domínio intracelular do gene Notch.
Para os propósitos deste invento, células estaminais mesenquimais (MSCs) são definidas como sendo células estaminais que são reconhecidas convencionalmente como diferenciando-se em vários tipos de células encontradas principalmente em tecidos conjuntivos, incluindo mas não limitadas a, osteoblastos, adipócitos, condrócitos e miócitos. As MSCs excluem especificamente células estaminais embrionárias e células estaminais fetais. As MSCs podem ser obtidas a partir de uma ampla variedade de animais, incluindo mas não limitadas a humanos, e outros mamíferos tais como ratos, ratinhos, primatas, porcos, vacas e ovelhas. As MSCs podem ser obtidas a partir de uma variedade de tecidos; fontes preferidas compreendem medula óssea (células estaminais aderentes de medula) e sangue do cordão. Fontes úteis de MSCs e métodos para a sua obtenção são descritos no Exemplo 1 abaixo, e aqui noutros locais. Numa concretização, MSCs humanas úteis na prática deste invento expressam CD29 e 7
ΕΡ 1 737 950/PT CD90, mas são negativas em relação a CD15, CD34, CDllb/c, CD31, CD45 e Factor de von Willebrand.
Numa concretização, podem-se isolar MSCs a partir de sangue do cordão utilizando técnicas descritas na literatura. Por exemplo, C. Campagnoli et al., Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood, liver, and bone marrow, 1: Blood, 15 de Outubro de 2001; 98(8):2396-402, descrevem métodos geralmente úteis para obtenção de MSCs a partir de sangue fetal. Em A. Erices et al., Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. 1: Br. J. Haematol. Abril de 2000; 109(1):235-42, descrevem-se métodos geralmente úteis para obtenção de MSCs a partir de sangue do cordão. L. Hou et al. , Induction of umbilical cord blood mesenchymal stem cells into neuron-like cells in vitro, Int. J. Hematol. Outubro de 2003; 78(3):256-61, descrevem métodos geralmente úteis para obtenção, purificação e expansão de MSCs de sangue de cordão umbilical de humano.
Agentes de regulação glial são definidos como substâncias que, entre outras caracteristicas, possuem a caracteristica de inibir a transdiferenciação de MSCs em células gliais e promover a sua transdiferenciação em CPCs. Agentes de regulação glial podem actuar através de uma variedade de diferentes mecanismos para afastar as MSCs do destino glial. Por exemplo, crê-se que factores de transcrição de hélice-laço-hélice básicos pró-neurais tais como Mash 1, Math 1 e Neurogenina 1 são activadores da expressão génica neuronal.
Crê-se que genes pró-neurais guiam a transdiferenciação neuronal de MSCs inibindo ao mesmo tempo a transdiferenciação glial. Um mecanismo pelo qual a transdiferenciação glial pode ser inibida é através da regulação da transdução de sinal mediada por STAT. Crê-se que a transdução de sinal por STAT é desencadeada por fosforilação que se crê ser catalisada pela família de tirosina-quinases Janus (JAK). A inibição da transdução de sinal JAK-STAT pode por isso regular os percursos de transdiferenciação glial e promover o destino neuronal de MSCs. 8
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Agentes de regulação glial aqui utilizados podem compreender inibidores ou antagonistas ou agentes que interferem com os percursos de sinalização para factores gliogénicos. Agentes de regulação glial podem também compreender agonistas para neurogénese, incluindo factores neurogénicos. A utilização destes agonistas ou factores pode controlar negativamente a gliogénese de MSCs na prática deste invento. Agentes de regulação glial podem compreender formas convencionais de moléculas terapêuticas, incluindo mas não limitadas a moléculas pequenas, péptidos e produtos genéticos inteiros ou porções.
Agentes de regulação glial utilizados no invento incluem inibidores JAK/STAT, incluindo inibidores de ST ATI e STAT3. Em certas concretizações, estes inibidores de JAK/STAT podem compreender ARNi para silenciamento génico do percurso JAK/STAT, oligonucleótidos anti-sentido para regular de modo descendente o percurso JAK/STAT, ou a molécula pequena inibidora de JAK 4-(4'-hidroxifenil)amino-6,7- dimetoxiquinazolina. Inibidores de JAK/STAT adicionais podem ser revelados no Pedido de Patente dos Estados Unidos da América 20040209799 de George Vasios, publicado em 21 de Outubro de 2004; e no Pedido de Patente dos Estados Unidos da América 20040052762 de Hua Yu et al. , publicado em 18 de Março de 2004.
Agentes de regulação glial alternativos incluem, mas não estão limitados a, antagonistas de BMP2 ou 7 (proteína morfogénica óssea). Estes antagonistas podem compreender produtos genéticos, inteiros ou porções, de genes expressando nogina, cordina, folistatina, porco-espinho sónico (SHH, sonic hedgehog), ou agonistas destes genes.
Outros agentes de regulação glial alternativos incluem, mas não estão limitados a, inibidores de Hes, incluindo mas não limitados a inibidores de Hes 1 e/ou Hes 5. Estes inibidores de Hes podem compreender ARNi para silenciamento génico de Hes, ou oligonucleótidos anti-sentido para regular de modo descendente Hes.
Agentes de regulação glial alternativos adicionais incluem, mas não estão limitados a, inibidores de Id-1. Ver 9
ΕΡ 1 737 950/PT S. Tzeng et al., Idl, Id2, and Id3 gene expression in neural cells during development, Glia, Dezembro de 1998; 24(4):372-81. Estes inibidores de Id-1 podem compreender ARNi para silenciamento génico de Id-1, ou oligonucleótidos anti-sentido para regular de modo descendente Id-1.
Outros agentes de regulação glial incluem, mas não estão limitados a, inibidores de homólogos de mamífero glide/gcm (glial cells missing) de Drosophila, incluindo mas não limitados a Gcml (murino) ou GCMB (humano). Ver Y. Iwasaki et ai., The potential to induce glial differentiation is conserved between Drosophila and mammalian glial cells missing genes, Development, Dezembro de 2003; 130(24):6027-35, Epub 22 de Outubro de 2003; e M. Kammerer et al., GCMB, a second human homolog of the fly glide/gcm gene, Cytogenet Cell Genet. 1999; 84(1-2):43-7. Estes inibidores de homólogos de glide/gcm podem compreender ARNi para silenciamento génico de homólogos de glide/gcm (tais como Gcml (murino) ou GCMB (humano)), ou oligonucleótidos anti-sentido para regular de modo descendente homólogos de glide/gcm (tais como Gcml (murino) ou GCMB (humano)).
Agentes de regulação glial adicionais incluem, mas não estão limitados a, inibidores de Sox9, que pode ser um factor de transcrição para a linhagem de oligodendrócitos. Ver C. Stolt et al., The Sox9 transcription factor determines glial fate choice in the developing spinal cord, Genes Dev., 1 de Julho de 2003; 17(13):1677-89). Estes inibidores de Sox9 podem compreender ARNi para silenciamento génico de Sox9, ou oligonucleótidos anti-sentido para regular de modo descendente Sox9.
Ainda outros agentes de regulação glial incluem, mas não estão limitados a, inibidores de Neurogenina 3, que podem ser um factor de transcrição para gliogénese. Estes inibidores de Neurogenina 3 podem compreender ARNi para silenciamento génico de Neurogenina 3, ou oligonucleótidos anti-sentido para regular de modo descendente Neurogenina 3.
Outros agentes de regulação glial incluem, mas não estão limitados a, inibidores de factor neurotrófico ciliar (CNTF). Em certas concretizações, estes inibidores de CNTF podem 10
ΕΡ 1 737 950/PT compreender ARNi para silenciamento génico de CNTF, ou oligonucleótidos anti-sentido para regular de modo descendente CNTF.
Agentes de regulação glial podem também compreender produtos genéticos, inteiros ou porções, de genes expressando Wntl, que inibe fortemente a gliogénese. Ver K. Tang et al., Wnt-1 promotes neuronal differentiation and inhibits gliogenesis in P19 cells, Biochem. Biophys. Res. Commun. 26 de Abril de 2002; 293(1):167-73. Produtos genéticos inteiros ou porções de genes expressando Wntl podem ser administrados por transfecção ou por outros métodos convencionais, tais como métodos de terapia génica incluindo vectores virais.
Alternativamente, agentes de regulação glial podem compreender produtos genéticos, inteiros ou porções, de genes expressando um subconjunto de factores de hélice-laço-hélice neurais básicos (bHLH) que desempenham papéis instrutivos durante a neurogénese ou são expressos em CPCs proliferantes. Estes agentes de regulação glial podem compreender produtos genéticos, inteiros ou porções, de genes expressando Neurogenina 1, Mashl, Mathl, Math6 ou NeuroD. Produtos genéticos, inteiros ou porções, de genes expressando o subconjunto de factores de hélice-laço-hélice neurais básicos (bHLH), incluindo mas não limitados a Neurogenina 1, Mashl, Mathl, Math6 ou NeuroD, podem ser administrados por transfecção ou por outros métodos convencionais, tais como métodos de terapia génica incluindo vectores virais.
Adicionalmente, agentes de regulação glial podem ser administrados individualmente ou em combinação. Numa concretização preferida, se se utiliza uma combinação de agentes de regulação glial na prática do invento, então podem-se seleccionar agentes de regulação glial que actuam sobre diferentes percursos de regulação glial. Isto pode servir para melhorar o efeito global de regulação glial dos agentes de regulação glial.
Para os propósitos deste invento, o isolamento de CPCs compreende isolar as CPCs de células não CPC numa amostra, tais como MSCs que não se transdiferenciaram em CPCs. Este isolamento pode compreender um isolamento simples ou 11
ΕΡ 1 737 950/PT múltiplos isolamentos. Se se pretendem realizar múltiplos isolamentos, podem-se utilizar preferivelmente diferentes tipos ou técnicas de isolamento, uma vez que estes diferentes tipos ou técnicas de isolamento podem melhorar os resultados do isolamento. Uma ampla variedade de métodos de isolamento é útil na prática deste invento. Exemplos destes métodos de isolamento incluem, mas não estão limitados a, citometria de fluxo (também conhecida como classificação FACS), técnicas de separação magnética e classificação visual. Pode-se também utilizar imunocitoquimica em casos onde a viabilidade celular não é critica. A classificação FACS pode ser realizada utilizando equipamento FACS convencional e protocolos com anticorpos que são específicos de epítopos associados a uma ou mais características de CPCs. Um destes epítopos pode ser EfnB2 no caso de CPCs humanas. N. Ivanova et al., A stem cell molecular signature, Science 298(5593):601-4 (18 de Outubro de 2002) . Anticorpos adicionalmente úteis na prática do invento, ainda que não necessariamente para classificação FACS, compreendem anti-CD15, anti-CD29, anti-CD34, anti-CD90, anti-CD31, anti-CD45, anti-CDllb/c e anti-factor de von Willebrand. Equipamentos FACS de populações de células úteis na prática deste invento incluem, mas não estão limitados a, um analisador FACScalibur™ com software CeliQuest™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) , ou equipamento FACS disponível na Guava Technologies (Hayward, Califórnia).
Alternativamente, o isolamento pode ser realizado utilizando técnicas de separação magnética, tais como os protocolos e reagentes BioMag™, disponíveis em forma de kit na Qiagen. A imunocitoquimica pode ser outra técnica de separação útil na prática deste invento; métodos imunocitoquimicos úteis são descritos em M. Dezawa et al. , Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromal cells, Eur. J. Neurosci. 14, 1771-1776 (2001). As inspecções imunocitoquimicas podem ser efectuadas com um microscópio confocal de varrimento por laser, tal como o Radians 2000 (Bio-Rad, Hertfordshire, Reino Unido) . Na prática deste invento, podem-se utilizar técnicas convencionais de classificação visual de células. 12
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Para os propósitos deste invento, os neurónios são definidos como sendo qualquer das células condutoras de impulsos que constituem o cérebro, a coluna espinal e os nervos, consistindo de um corpo celular nucleado com uma ou mais dendrites e um único axão. Bioquimicamente, os neurónios são caracterizados por reacção com anticorpos para neurofilamento M, beta3-tubulina e TuJ-1. Estas reacções podem ser utilizadas para isolar neurónios ou células exibindo uma ou mais caracteristicas de neurónios utilizando técnicas tais como classificação FACS. As células neurais são também caracterizadas por segregarem neurotransmissores, sintetases de neurotransmissor ou proteínas relacionadas com neurotransmissores, por exemplo neuropéptido Y e substância P.
Para os propósitos deste invento, agentes neurotróficos são definidos como substâncias que, entre outras caracteristicas, possuem a caracteristica de causar ou promover a diferenciação de CPCs em neurónios ou células que exibem uma ou mais caracteristicas de neurónios. Agentes neurotróficos úteis na prática deste invento compreendem mas não estão limitados a factor de crescimento fibroblástico básico (bFGF), factor neurotrófico ciliar (CNTF) e forscolina (FSK). Podem-se combinar agentes neurotróficos com as CPCs do presente invento utilizando técnicas de manipulação de células conhecidas na especialidade. Métodos preferidos podem ser encontrados em geral na PCT/JP03/01260 de Dezawa et al. Numa concretização preferida, bFGF, CNTF e FSK são combinados com CPCs em cultura de células em quantidades eficazes para causar ou promover a diferenciação de CPCs em neurónios ou células que exibem uma ou mais caracteristicas de neurónios.
Para os propósitos deste invento, células gliais são definidas como quaisquer das células que constituem a rede de células ramificadas e fibras que suportam o tecido do sistema nervoso central. As células gliais incluem, mas não estão limitados a astrócitos, células de Schwann, oligodendrócitos e microglia.
Para os propósitos deste invento, genes são definidos como um conjunto de transcritos relacionados, onde um transcrito é um conjunto de exões produzido através de 13
ΕΡ 1 737 950/PT transcrição seguida (opcionalmente) por montagem (splicing) de pré-ARNm. Para os propósitos deste invento, os produtos genéticos são definidos como proteínas traduzidas a partir de genes. Para os propósitos deste invento, porções de genes são definidas como um subconjunto de um gene. Para os propósitos deste invento, as porções de produtos genéticos são definidas como sendo um subconjunto de um produto genético.
Paciente significa um animal, tipicamente um mamífero, e mais tipicamente, um humano, que é o sujeito de observação médica ou estudo.
As CPCs produzidas de acordo com o invento podem ser administradas a pacientes através de uma variedade de métodos, incluindo mas não limitados a perfusão através de uma cânula, agulha ou shunt de injecção, ou por implantação num transportador, e.g., uma cápsula biodegradável, mas estão também no âmbito do invento outras vias de administração. As vias de administração do invento compreendem as vias local e sistémica. A administração local pode incluir preferivelmente a administração a porções pretendidas do SNC ou do SNP, e inclui preferivelmente as vias intraparenquimais. Vias de administração sistémica compreendem as vias parentéricas, com a administração intravenosa (i.v.) ou intra-arterial (tal como através das artérias carótidas interna ou externa) sendo as vias preferidas de administração sistémica. As técnicas de administração sistémica podem ser adaptadas a partir de técnicas utilizadas para administrar células precursoras em geral, tais como as reveladas em D. Lu et al., Intraarterial administration of marrow stromal cells in a rat model of traumatic brain injury, J. Neurotrauma, Agosto de 2001; 18(8) :813-9.
As quantidades de CPCs administradas a um paciente podem ser determinadas clinicamente, utilizando técnicas com intervalos de dose convencionais, e avaliações clínicas da doença de um paciente particular. 14
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EXEMPLOS
Materiais e métodos: MSCs: As MSCs de rato (estirpe Wistar) são isoladas e cultivadas como descrito em M. Dezawa et al., Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromal cells, Eur. J. Neurosci. 14, 1771-1776 (2001) . No que se refere às MSCs humanas, utilizam-se MSCs adquiridas comercialmente (PT-2501, BioWhittaker, Walkersville, MD) e MSCs obtidas a partir de dadores saudáveis. As células podem ser mantidas em alfa-MEM (Sigma, M-4526) com 10% de soro fetal de bovino (FBS).
No caso da obtenção de MSCs a partir de dadores saudáveis, um passo inicial consiste em obter aspirado de medula óssea a partir de dadores saudáveis utilizando técnicas de aspiração convencionais. O aspirado celular é depois transferido para um tubo de 50 ml. Adicionam-se depois cuidadosamente na base 13 ml de Histopaque, utilizando uma pipeta de 10 ml. Centrifuga-se depois o tubo a 2000 rpm durante 20 minutos. Colhem-se depois as células na interfase. Adiciona-se então PBS (pelo menos 3χ o volume da interfase) e centrifuga-se a mistura a 1200 rpm. Lavam-se as células duas vezes mais com PBS. Ressuspende-se depois o sedimento celular em DMEM + 10% de FCS, e contam-se as células. Replaqueiam-se 5χ106 células por balão de cultura de tecidos T-75, e incuba-se durante 3 dias. Ao dia 4, removem-se as células não aderentes e lava-se o balão três vezes com meio. Deixam-se as células aderentes desenvolver no balão. Quando as células atingem 20-30% de confluência, junta-se o conteúdo de 2-3 balões e replaqueia-se num balão T-75. Quando as células nesta fracção atingem a confluência, as células são tripsinizadas utilizando tripsina a 0,05% e EDTA a 0,02%. Lavam-se depois as células e contam-se. Ressuspendem-se então as células em alfa-MEM Sigma + 10% de FBS (M-4526) . Nas experiências onde se pretende utilizar lipofecção, é importante assegurar que o meio não contém qualquer I-glu. Não se adiciona glutamina. Expandem-se as células durante 2-4 semanas e congelam-se em passagens iniciais. 15
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Analisam-se marcadores da superfície celular em MSCs de rato e humano por análise de células activadas por fluorescência (FACS). Numa concretização, as MSCs expressam CD29 e CD90, mas são negativas em relação a CD34, CD31, CD45, CDllb/c e factor de von Willebrand consistente com M. Pittenger et al., Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells, Science 284, 143-147 (1999); e J. Kohyama et al., Brain from bone: efficient "metha-differentiation" of marrow stroma-derived mature osteoblasts to neurons with Noggin or a demethylating agent, Differentiation 68, 235-244 (2001) (Fig. IA) . O mesmo resultado é obtido por imunocitoquímica. As diferenciações adipogénica, condrogénica e osteogénica de ambas as MSCs de rato e humano são confirmadas de acordo com o método descrito por M. Pittenger et al. , Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells, Science 284, 143-147.
Análise FACS. Incubam-se as células numa concentração final de 1 x 107/ml com 1 mg de um anticorpo monoclonal em solução salina tamponada com fosfato (PBS). As incubações podem ser realizadas na presença de 10 mg de imunoglobulina de ratinho para prevenir a ligação de anticorpo não específica. Em MSCs de rato, anti-CD34 de ratinho (Santa Cruz Antibodies) e anti-CD29 de hamster (PharMingen, San Diego, CA) podem ser marcados com FITC, e podem-se incubar controlos com IgG anti-ratinho ou hamster marcada com FITC. Anti-CD54 e CDllb/c de ratinho podem ser ambos comprados na PharMingen. Anticorpos anti-factor de von Willebrand de ratinho e outros anticorpos necessários na prática deste invento podem ser obtidos comercialmente. Os controlos podem incluir células coradas com soro de ratinho não imune. Se estes anticorpos estão conjugados com FITC, as células podem ser subsequentemente incubadas com 1 mg de IgG anti-ratinho conjugada com FITC. Em MSCs humanas, podem-se utilizar anti-CD34, CD29, CD54, CDllb/c e factor de von Willebrand de ratinho marcados com ficoeritrina, e os controlos podem incluir células coradas com IgG anti-ratinho marcada com ficoeritrina. Os dados podem ser adquiridos e analisados num FACScalibur com software CellQuest (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). 16
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Imunocitoquímica. O procedimento geral é descrito em M. Dezawa et al., Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromal cells, Eur. J. Neurosci. 14, 1771-1776 (2001). Após a fixação de células com paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS), estas são incubadas com anticorpos primários de um dia para o outro a 4°C. Os anticorpos para nestina podem ser adquiridos comercialmente na PharMingen. As células podem depois ser incubadas com anticorpos secundários para IgM, IgG anti-ratinho ou IgG de coelho conjugados com Alexa Fluor 488 or 546 (Molecular Probes, Eugene, OR) durante 1 hora à temperatura ambiente, e pode-se realizar a contrastação com iodeto TOTO-3 (Molecular Probes). As inspecções podem ser efectuadas com um microscópio confocal de varrimento por laser (Radians 2000, Bio-Rad, Hertfordshire, Reino Unido).
Exemplo 1:
Deixam-se desenvolver MSCs humanas (PT-2501, BioWhittaker, Walkersville, MD) em cultura em alfa-MEM contendo 10% de FBS em geral de acordo com E. Sudbeck et al., Structure-based design of specific inhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents, Clin. Câncer
Res. 5, 1569-1582 (1999). Incubam-se as MSCs com 40 pg/ml de 4-(4'-hidroxifenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina (WHI-P131,
Calbiochem, San Diego, CA) durante 2 dias. Remove-se o WHI-P131 por lavagem após 2 dias.
Exemplo 2:
Deixam-se desenvolver MSCs humanas, preparadas de acordo com a secção Materiais e Métodos, em cultura em alfa-MEM contendo 10% de FBS em geral de acordo com E. Sudbeck et al., Structure-based design of specific inhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents, Clin. Câncer
Res. 5, 1569-1582 (1999). Assim que a cultura atinge 90% de confluência, incubam-se com a cultura vários ARN, desenhados utilizando o BLOCK-iT™ RNAi Designer (Invitrogen) durante um período de tempo suficiente para silenciar a expressão de Sox9, utilizando protocolos BLOCK-iT™ disponíveis na Invitrogen. Isolam-se as CPCs resultantes das MSCs não 17 ΕΡ 1 737 950/ΡΤ transdiferenciadas por selecção sequencial utilizando pérolas magnéticas revestidas com anticorpos apropriados tais como anti-EfnB2 (selecção positiva para CPCs), anti-CD90 (selecção negativa para CPCs) e anti-receptor beta de PDGF (selecção negativa para CPCs). Os anticorpos e pérolas revestidas podem ser obtidos em fornecedores comerciais. Incubam-se as células em PBS com pérolas revestidas durante 1 h à temperatura ambiente. Removem-se as pérolas com células ligadas utilizando um iman. Lavam-se as CPCs para remover o anticorpo e ressuspendem-se em alfa-MEM contendo 10% de FBS e deixam-se proliferar.
Exemplo 3:
Deixam-se desenvolver MSCs humanas, preparadas de acordo com a secção Materiais e Métodos, em cultura em alfa-MEM contendo 10% de FBS em geral de acordo com E. Sudbeck et al., Structure-based design of specific inhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents, Clin. Câncer Res. 5, 1569-1582 (1999). Oligonucleótidos anti-sentido para Hes 1 são gerados de acordo com técnicas reveladas em qualquer uma de H. Moulton et al., Peptide-assisted delivery of steric-blocking antisense oligomers, Curr. Opin. Mol. Ther. Abril de 2003; 5(2) :123-32,- C. Stein et al., Antisense oligonuleotides as therapeutic agents-is the bullet really magicai? Science, 20 de Agosto de 1993; 261(5124):1004-12,- ou C. Helena, The anti-gene strategy: control of gene expression by triplex-forming-oligonucleotides, Anticancer Drug Des. Dezembro de 1991; 6(6):569-84. Assim que a cultura atinge 90% de confluência, incubam-se os oligómeros anti-sentido de Hes-1 com as MSCs durante um período suficiente para regular de modo descendente a expressão de Hes-1, de acordo com. técnicas reveladas em qualquer das referências citadas neste exemplo. Isolam-se as CPCs resultantes das MSCs não transdiferenciadas por selecção sequencial utilizando pérolas magnéticas revestidas com anticorpos apropriados tais como anti-EfnB2 (selecção positiva para CPCs), anti-CD90 (selecção negativa para CPCs) e anti-receptor beta de PDGF (selecção negativa para CPCs). Os anticorpos e pérolas revestidas podem ser obtidos em fornecedores comerciais. Incubam-se as células em PBS com pérolas revestidas durante 1 h à temperatura ambiente. Removem-se as pérolas com células ligadas 18
ΕΡ 1 737 950/PT utilizando um íman. Lavam-se as CPCs para remover o anticorpo e ressuspendem-se em alfa-MEM contendo 10% de FBS e deixam-se proliferar.
Exemplo 4:
Plasmídeos de expressão de Wnt-1 são gerados de acordo com M. Sen et al., Regulation of fibronectin and metalloproteinase expression by Wnt signaling in rheumatoid arthritis synoviocytes, Arthritis Rheum. Novembro 2002; 46(11):2867-77. Deixam-se desenvolver MSCs humanas, preparadas de acordo com a secção Materiais e Métodos, em cultura em alfa-MEM contendo 10% de FBS em geral de acordo com E. Sudbeck et al. , Structure-based design of specific inhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents. Clin. Câncer Res. 5, 1569-1582 (1999).
Assim que a cultura atinge 90% de confluência, incubam-se as MSCs com os plasmídeos de expressão de Wnt-1 durante dois dias a 37°C e 5% de CO2 utilizando o reagente Lipofectamine™ 2000 e protocolos disponíveis na Invitrogen. Após os dois dias de incubação, a cultura é seleccionada em relação a células transfectadas utilizando técnicas de selecção convencionais durante um período de 10 dias. Isolam-se as CPCs resultantes das MSCs não transdiferenciadas por selecção sequencial utilizando pérolas magnéticas revestidas com anticorpos apropriados tais como anti-EfnB2 (selecção positiva para CPCs), anti-CD90 (selecção negativa para CPCs) e anti-receptor beta de PDGF (selecção negativa para CPCs). Os anticorpos e pérolas revestidas podem ser obtidos em fornecedores comerciais. Incubam-se as células em PBS com pérolas revestidas durante 1 h à temperatura ambiente. Removem-se as pérolas com células ligadas utilizando um íman. Lavam-se as CPCs para remover o anticorpo e ressuspendem-se em alfa-MEM contendo 10% de FBS e deixam-se proliferar.
Exemplo 5:
Colocaram-se as células produzidas de acordo com. o Exemplo 1 em Meio Essencial Mínimo com Modificação de Eagle Alfa (M4526, Sigma Co.) contendo 20% de soro fetal de bovino (14-501 F, Lote #61-1012, BioWhittaker Co.). Adicionaram-se 5 μΜ de forscolina (344273, Calbiochem, La Jolla, CA), 10 ng/ml 19 ΕΡ 1 737 950/ΡΤ de factor de crescimento fibroblástico básico humano recombinante (100-18B, Peprotech EC, Ltd., Londres, Reino Unido) e 10 ng/ml de factor neurotrófico ciliar (557-NT, R&D Systems, Minneapolis, MN). Desenvolveu-se a cultura durante 3 dias, tempo após o qual foram reconhecidas células exibindo caracteristicas neuronais, com o resultado de 29,46+/-3,0% de células positivas em relação a MAP-2ab. Analisou-se o MAP-2ab utilizando Western blotting, com lisados de células preparados a partir de células incubadas, e submeteram-se a electroforese 50 pg de proteínas de lisado sobre 5% e 10% de SDS-gel de poliacrilamida. Os antigénios para MAP-2 (1:500, Chemicon) foram detectados utilizando fosfatase alcalina.
Exemplo 6:
Colhem-se as células exibindo caracteristicas neuronais do Exemplo 5, e cultivam-se até à 90% de confluência em cultura em alfa-MEM contendo 10% de FBS em geral de acordo com E. Sudbeck et al., Structure-based design of specific inhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents, Clin. Câncer Res. 5, 1569-1582 (1999). A seguir, adicionam-se a cultura de células 5 mM de forscolina (344273, Calbiochem), 10 ng/ml de factor de crescimento fibroblástico básico (100-18B, Peprotech EC, Ltd.) e 50 ng/ml de factor neurotrófico ciliar (557-NT, R&D Systems).
Cultivam-se as células durante dez dias na presença dos agentes neurotróficos, e depois analisam-se em relação à morfologia característica de células neurais e em relação a reacção positiva para anticorpos contra MAP-2 (MAB364, Chemicon), neurofilamento (814342, Boehringer Manheim) e nestina (BMS4353, Bioproducts).
PUBLICAÇÕES
Bishop, A.E., Buttery, L.D. & Polak, J.M. Embryonic stem cells (Review) . J. Pathol. 197, 424-429 (2002) .
Weissman, I.L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution (Review). Cell 100, 157-168 (2000). 20
ΕΡ 1 737 950/PT
Pittenger, M.F. et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284, 143-147 (1999).
Dezawa, M. et al. Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromal cells. Eur. J. Neurosci. 14, 1771-1776 (2001).
Jiang, Y. et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature 418, 41-49 (2002) .
Eglitis, M.A., Dawson, D., Park, K.W. & Mouradian, M.M. Targeting of marrow-derived astrocytes to the ischemic brain. Neuroreport 10, 1289-1292 (1999).
Kopen, G.C., Prockop, D.J. & Phinney, D.G. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96, 10711-10716 (1999).
Terada, N. et al. Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion. Nature 416, 542-545 (2002).
Wagers, A.J., Sherwood, R.I., Christensen, J.L. & Weissman, I.L. Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells. Science 297, 2256-2259 (2002).
Woodbury, D., Schwarz, E.J., Prockop, D.J. & Black, I.B. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J. Neurosci. Res. 61, 364-370 (2000).
Kohyama, J. et al. Brain from bone: efficient "meta-differentiation" of marrow stroma-derived mature osteoblasts to neurons with Noggin or a demethylating agent. Differentiation 68, 235-244 (2001).
Sanchez-Ramos, JR. Neural cells derived from adult bone marrow and umbilical cord blood. J. Neurosci. Res. 69, 880-893 (2002).
Lundkvist, J. & Lendahl, U. Notch and the birth of glial cells (Review). Trends Neurosci. 24, 492-494 (2001). 21
ΕΡ 1 737 950/PT
Morrison, S.J. et al. Transient Notch activation initiates an irreversible switch from neurogenesis to gliogenesis by neural crest stem cells. Cell 101, 499-510 (2000).
Gaiano, N., Nye, J.S. & Fishell, G. Radial glial identity is promoted by Notchl signaling in the murine forebrain. Neuron 26, 395-404 (2000).
Nye, J.S., Kopan, R. & Axel, R. An activated Notch regulates neurogenesis and myogenesis but not gliogenesis in mammalian cells. Development 120, 2421-2430 (1994).
Yamamoto, N. et al. Role of Deltex-1 as a transcriptional regulator downstream of the Notch receptor. J. Biol. Chem. 276, 45031-45040 (2001).
Shibata, T. et al. Glutamate transporter GLAST is expressed in the radial glia-astrocyte lineage of developing mouse spinal cord. J. Neurosci. 17, 9212-9219 (1997).
Yamasaki, M. et al. 3-Phosphoglycerate dehydrogenase, a key enzyme for I-serine biosynthesis, is preferentially expressed in the radial glia/astrocyte lineage and olfactory ensheathing glia in the mouse brain. J. Neurosci. 21, 7691- 7704 (2001).
Gregg, C.T., Chojnacki, A.K. & Weiss, S. Radial glial cells as neuronal precursors: the next generation? J. Neurosci. Res. 69, 708-713 (2002).
Roy, N.S. et al. In vitro neurogenesis by progenitor cells isolated from the adult human hippocampus. Nat. Med. 6, 271-277 (2000).
Ip, N.Y. The neurotrophins and neuropoietic cytokines: two families of growth factors acting on neural and hematopoietic cells (Review). Ann. N. Y. Acad. Sei. 840, 97-106 (1998).
Grosse, G. et al. Expression of Kvl potassium channels in mouse hippocampal primary cultures: development and activity-dependent regulation. J. Neurosci. 20, 1869-1882 (2000). 22
ΕΡ 1 737 950/PT
Morrison, S.J. Neuronal differentiation: proneural genes inhibit gliogenesis (Review). Curr. Biol. 11, R349-351 (2001).
Sun, Y. et al. Neurogenin promotes neurogenesis and inhibits glial differentiation by independent mechanisms. Cell 104, 365-376 (2001).
Ishibashi, M. et al. Persistent expression of helix-loop-helix factor HES-1 prevents mammalian neural differentiation in the central nervous system. EMBO J. 13, 1799-1805 (1994).
Furukawa, T. et al. rax, Hesl, and notchl promote the formation of Muller glia by postnatal retinal progenitor cells. Neuron 26, 383-394 (2000) .
Kahn, M.A. et al. Ciliary neurotrophic factor activates JAK/Stat signal transduction cascade and induces transcriptional expression of glial fibrillary acidic protein in glial cells. J. Neurochem. 68, 1413-1423 (1997).
Seidel, H.M., Lamb, P. & Rosen, J. Pharmaceutical intervention in the JAK/STAT signaling pathway (Review). Oncogene 19, 2645-2656 (2000).
Burdon, T., Smith, A. & Savatier, P. Signalling, cell cycle and pluripotency in embryonic stem cells. Trends Cell Biol. 12, 432-438 (2002).
Nakashima, K. et al. BMP2-mediated alteration in the developmental pathway of fetal mouse brain cells from neurogenesis to astrocytogenesis. Proc. Natl. Acad. Sei. U S A. 98, 5868-5873 (2001).
Stork, P.J. & Schmitt, J.M. Crosstalk between cAMP and MAP kinase signaling in the regulation of cell proliferation. Trends Cell Biol. 12, 258-266 (2002) .
Neufeld, B. et al. Serine/Threonine kinases 3pK and MAPK-activated protein kinase 2 interact with the basic helix-loop-helix transcription factor E47 and repress its 23 ΕΡ 1 737 950/ΡΤ transcriptional activity. J. Biol. Chem. 275, 20239-20242 (2000).
Shimazaki, T., Shingo, T. & Weiss, S. The ciliary neurotrophic factor/leukemia inhibitory factor/gpl30 receptor complex operates in the maintenance of mammalian forebrain neural stem cells. J. Neurosci. 21, 7642-7653 (2001).
Kurooka, H., Kuroda, K. & Honjo, T. Roles of the ankyrin repeats and C-terminal region of the mouse notchl intracellular region. Nucleic Acids Res. 26, 5448-5455 (1998).
Franklin, J.L. et al. Autonomous and non-autonomous regulation of mammalian neurite development by Notchl and Deitai. Curr. Biol. 9, 1448-1457 (1999).
Akerud, P. et al. Differential effects of glial cell line-derived neurotrophic factor and neurturin on developing and adult substantia nigra dopaminergic neurons. J. Neurochem. 73, 70-78 (1999)
Sakurada, K., Ohshima-Sakurada, M., Palmer, T.D. & Gage, F.H. Nurrl, an orphan nuclear receptor, is a transcriptional activator of endogenous tyrosine hydroxylase in neural progenitor cells derived from the adult brain. Development 126, 4017-4026 (1999).
Kim, J.H. et al. Dopamine neurons derived from embryonic stem cells function in an animal model of Parkinson's disease. Nature 418, 50-56 (2002) .
Song, H.J., Stevens, C.F. & Gage, F.H. Neural stem cells from adult hippocampus develop essential properties of functional CNS neurons. Nat. Neurosci. 5, 438-445 (2002) .
Weinmaster, G., Roberts, V.J. & Lemke, G. A homolog of Drosophila Notch expressed during mammalian development. Development 113, 199-205 (1991).
Peyton, M. et al. BETA3, a novel helix-loop-helix protein, can act as a negative regulator of BETA2 and MyoD-responsive genes. Mol. Cell Biol. 16, 626-33 (1996) . 24
ΕΡ 1 737 950/PT
Rozovsky, 1. et al. Estradiol (E2) enhances neurite outgrowth by repressing glial fibrillary acidic protein expression and reorganizing laminin. Endocrinology 143, 636-646 (2002).
Sudbeck, E.A. et al. Structure-based design of specific inhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents. Clin. Câncer Res. 5, 1569-1582 (1999).
Seta, Y., Toyono, T., Takeda, S. & Toyoshima, K. Expression of Mashl in basal cells of rat circumvallate taste buds is dependent upon gustatory innervation. FEBS Lett. 444, 43-46 (1999).
Schwaiger, F.W. et al. Peripheral but not central axotomy induces changes in Janus kinases (JAK) and signal transducers and activators of transcription (STAT). Eur. J. Neurosci. 12, 1165-1176 (2000) .
Kawasaki, H. et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron 28, 31-40 (2000).
Tanaka, H. et al. Role of serotonergic neurons in L-DOPA-derived extracellular dopamine in the striatum of 6-OHDA-lesioned rats. Neuroreport 10, 631-634 (1999).
Lisboa, 2011-12-05

Claims (8)

  1. ΕΡ 1 737 950/PT 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Método para produção de células exibindo caracteristicas de células progenitoras neuronais a partir de material compreendendo células estaminais mesenquimais, o método compreendendo: regulação de percursos celulares nas células estaminais mesenquimais que estão associados a transdiferenciação glial das células estaminais mesenquimais; onde os percursos celulares são suficientemente regulados para induzir pelo menos uma parte das células estaminais mesenquimais a transdiferenciarem-se em células exibindo caracteristicas de células progenitoras neuronais; caracterizado por a regulação compreender a inibição da transdução de sinal de JAK/STAT e não compreender a transfecção das células estaminais mesenquimais com domínio intracelular de Notch.
  2. 2. Método da reivindicação 1, onde a regulação compreende incubação de um inibidor de JAK/STAT com as células estaminais mesenquimais.
  3. 3. Método para produção de células exibindo caracteristicas de células progenitoras neuronais compreendendo: incubação de células estaminais mesenquimais com um inibidor de JAK/STAT numa quantidade suficiente para induzir pelo menos uma parte das células estaminais mesenquimais a transdiferenciarem-se em células exibindo caracteristicas de células progenitoras neuronais; caracterizado por o método não compreender transfecção das células estaminais mesenquimais com domínio intracelular de Notch.
  4. 4. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, onde as células estaminais mesenquimais são seleccionadas entre o grupo consistindo de células estaminais mesenquimais humanas, células estaminais mesenquimais de rato, células estaminais mesenquimais de ratinho, células estaminais mesenquimais de primata, células estaminais mesenquimais de porco, células estaminais mesenquimais de vaca e células estaminais mesenquimais de ovelha. ΕΡ 1 737 950/PT 2/2
  5. 5. Método de qualquer uma das reivindicações 2 a 4, onde a incubação compreende transfecção do inibidor de JAK/STAT nas células estaminais mesenquimais.
  6. 6. Método de qualquer uma das reivindicações precedentes, onde as células estaminais mesenquimais são obtidas a partir de sangue de cordão.
  7. 7. Método de qualquer uma das reivindicações precedentes, onde as células estaminais mesenquimais são obtidas a partir de medula óssea.
  8. 8. Método de qualquer uma das reivindicações 2 a 7, onde o inibidor de JAK/STAT é seleccionado entre: ARNi para silenciamento de genes do percurso JAK/STAT; oligonucleótidos anti-sentido para regular de modo descendente o percurso JAK/STAT; inibidores de STATl e STAT3; a molécula pequena inibidora de JAK 4-(4'-hidroxifenil)amino-6,7-dimetoxiquinazolina. Lisboa, 2011-12-05
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2562198C (en) * 2004-04-12 2017-05-30 Sanbio Inc. Cells exhibiting neuronal progenitor cell characteristics
US20060110440A1 (en) * 2004-10-22 2006-05-25 Kiminobu Sugaya Method and system for biasing cellular development
AU2006220696B2 (en) * 2005-03-07 2010-08-19 Sanbio, Inc. Use of neuronal precursor cells for treatment of central nervous system lesions
AU2007308716B2 (en) 2006-10-27 2013-06-06 The University Of Western Ontario Inhibition of SOX9 function fn the treatment of proteogl ycan-associated pathophysiological conditions
US8945919B2 (en) * 2007-08-15 2015-02-03 San Bio, Inc. Methods and composition for treating neural degeneration
EP2985341B1 (en) 2007-12-03 2020-04-01 SanBio, Inc. Methods and compositions for modulating differentiation of pluripotential cells
US10702554B2 (en) * 2007-12-03 2020-07-07 Sanbio, Inc. Extracellular matrix from pluripotent cells
ES2594229T3 (es) 2008-04-30 2016-12-16 Sanbio, Inc. Células de regeneración nerviosa con alteraciones en la metilación del ADN
CN103547275B (zh) 2011-04-06 2016-12-28 桑比欧公司 用于调节外周免疫功能的方法和组合物
JP6023218B2 (ja) 2012-01-27 2016-11-09 サンバイオ，インコーポレイティド 血管新生及び血管発生を調節するための方法及び組成物
CN109718250B (zh) 2012-05-16 2022-08-30 桑比欧公司 用于治疗创伤性脑损伤和用于调节神经原性细胞迁移的方法和组合物
CA2885414C (en) 2012-10-09 2018-05-01 Sanbio, Inc. Methods and compositions for treatment of retinal degeneration
AU2014256876B2 (en) 2013-04-26 2020-11-12 Cornell, University Cortical interneurons and other neuronal cells produced by the directed differentiation of pluripotent and multipotent cells
WO2016161290A1 (en) 2015-04-01 2016-10-06 Sanbio, Inc. Methods and compositions for stimulation of cell proliferation and provision of biologically active mixtures of fgf2 isoforms
EP3487989B1 (en) 2016-07-21 2022-05-18 SanBio, Inc. Msc growth predictor assays
CA3047329A1 (en) 2016-12-28 2018-07-05 Sanbio, Inc. Cell delivery system and methods of operation thereof

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5276204A (en) 1988-11-09 1994-01-04 Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien Fatty alcohol mixtures and ethoxylates thereof showing improved low-temperature behavior
JPH031260A (ja) 1989-05-30 1991-01-07 Hitachi Ltd 計算機方式
US6653134B2 (en) 1995-03-28 2003-11-25 Cp Hahnemann University Isolated stromal cells for use in the treatment of diseases of the central nervous system
US6395205B1 (en) * 1996-07-17 2002-05-28 Chemical Lime Company Method of manufacturing an aerated autoclaved concrete material
JP2002513545A (ja) 1998-05-07 2002-05-14 ザ ユニヴァーシティー オブ サウス フロリダ 脳および脊髄修復のためのニューロン源としての骨髄細胞
US7105150B2 (en) * 1999-02-12 2006-09-12 Stemcells California, Inc. In vivo screening methods using enriched neural stem cells
US6080747A (en) * 1999-03-05 2000-06-27 Hughes Institute JAK-3 inhibitors for treating allergic disorders
US7015037B1 (en) * 1999-08-05 2006-03-21 Regents Of The University Of Minnesota Multiponent adult stem cells and methods for isolation
AU2913801A (en) 1999-12-23 2001-07-03 Cornell Research Foundation Inc. A method for isolating and purifying multipotential neural progenitor cells and multipotential neural progenitor cells
EP1250137B1 (en) * 2000-01-24 2007-08-15 Genzyme Corporation Jak/stat pathway inhibitors and the use thereof for the treatment of primary generalized osteoarthritis
US20040052762A1 (en) * 2001-09-10 2004-03-18 Hua Yu Stat3 agonists and antagonists and therapeutic uses thereof
KR100449141B1 (ko) * 2001-04-19 2004-09-21 (주)라이프코드 간엽 간세포를 신경세포로 분화시키는 방법
US20030003090A1 (en) 2001-05-31 2003-01-02 Prockop Darwin J. Directed in vitro differentiation of marrow stromal cells into neural cell progenitors
ATE443758T1 (de) * 2001-08-08 2009-10-15 Levesque Biosciences Inc Zusammensetzungen und verfahren zur isolierung, vermehrung und differenzierung nicht-embryonale menschlicher stammzellen und deren verwendungen
US7682825B2 (en) * 2002-02-06 2010-03-23 Sanbio, Inc. Differentiation of bone marrow stromal cells to neural cells or skeletal muscle cells by introduction of notch gene
US20040062753A1 (en) * 2002-09-27 2004-04-01 Alireza Rezania Composite scaffolds seeded with mammalian cells
CA2562198C (en) * 2004-04-12 2017-05-30 Sanbio Inc. Cells exhibiting neuronal progenitor cell characteristics

Also Published As

Publication number Publication date
CA2562198C (en) 2017-05-30
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