JP2007532112A - ニューロン始原細胞特性を示す細胞 - Google Patents

ニューロン始原細胞特性を示す細胞 Download PDF

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Abstract

ニューロン始原細胞特性を示す細胞、ならびに骨髄付着幹細胞の神経膠トランス分化と関連する骨髄付着幹細胞中の細胞経路を調節することにより骨髄付着幹細胞からそれらを作製する方法が開示される。

Description

本発明の分野
本発明は、ニューロン始原細胞特性を示す細胞に、ならびに骨髄付着幹細胞の神経膠トランス分化と関連する骨髄付着幹細胞中の細胞経路を調節することにより骨髄付着幹細胞からそれらを作製する方法に関する。
発明の背景
中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）疾患の研究および治療における制限は、最終分化ニューロンが、増殖するそれらの能力を有意に制限されることである、と慣用的に認識されている。したがって最終分化ニューロンの移植片を要するＣＮＳまたはＰＮＳの任意の治療は、成し遂げるのが困難である。
この困難を克服するために提唱された一アプローチは、ニューロン始原細胞特性を示す多数の有糸分裂細胞（「ＣＰＣ」）を培養することであった。このような細胞は、理論的に、ＣＮＳおよび／またはＰＮＳ疾患の治療において機能し得るニューロンにin vivoで分化し得る。あるいはＣＰＣは、in vitroでニューロンに分化され、次に患者に移植され得る。しかしながらこのようなＣＰＣはまれであり、そしてドナーから単離するのが難しい。したがって慣用的には、処置胚および胎児幹細胞（本明細書中では以後、集合的に「胚性幹細胞」と呼ばれる）からＣＰＣを得るための研究が試みられてきた。
多能性細胞である胚性幹細胞は、多数の種々の組織型を生じるために用いられてきており、そしてＣＰＣの供給源であり得る（I. Weissman, Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution (Review). Cell 100, 157-168 (2000)）。しかしながら胚性幹細胞の使用は多数の倫理的問題を提起し、それゆえＣＰＣの産生のための幹細胞の好ましくない供給源である。さらに胚性幹細胞は腫瘍形成性であり、このことは、胚性幹細胞からのＣＰＣ移植片の作製といったような患者への胚性幹細胞の送達を潜在的に生じ得る任意の移植片手法に関して安全性問題を引き起こし得る。
いくつかの研究は、ＣＰＣの産生において、他の種類の幹細胞、例えば間葉幹細胞を利用することを試みてきた。米国特許出願第20030003090号（Prockop等、2003年1月2日提出、表題「Directed in vitro differentiation of marrow stromal cells into neural cell progenitors」）は、0.5ミリモルのＩＢＭＸおよび1ミリモルのｄｂｃＡＭＰとのそれらのインキュベーション後に、ＮＳＥおよびビメンチンの両方の発現レベルがヒト間葉幹細胞中で増大された、ということを開示する。ＮＳＥおよびビメンチンｍＲＮＡにおける増大は、培養中の神経細胞の出現と一致する。しかしながら、ＭＡＰ１ＢまたはＴｕＪ‐１のいずれかの発現レベルにおける変化は認められなかった、とProckop等は報告した。ＮＳＥ、ＭＡＰ１ＢおよびＴｕＪ‐１は早期ニューロン特性マーカーであり、そしてビメンチンは神経膠に関する早期マーカーであるため、ｈＭＳＣはin vitroでニューロンまたは神経膠のいくつかの早期始原細胞にトランス分化する、ということをProckop等は示唆した。しかしながらProckopの早期始原細胞は、それらがその臨床効能が十分には理解されていない極未熟ニューロン表現型を表示すると思われるため、使用が望ましくない可能性がある。
したがって、例えばＣＮＳまたはＰＮＳ疾患の研究および治療に用いるためのＣＰＣの慣用的に利用可能な且つ適切な供給源の不足が認められる。さらに使用するのに適した適切な方法でこのようなＣＰＣを産生するために用いられ得る方法の不足が認められる。必要とされるのは、このような問題を克服する方法および組成物である。
発明の要約
一態様において、本発明は、骨髄付着幹細胞を含む物質からのニューロン始原細胞特性を示す細胞の産生方法であって、以下の：骨髄付着幹細胞の神経膠トランス分化（trans differentiation）と関連する骨髄付着幹細胞中の細胞経路を調節し；この場合、細胞経路はニューロン始原細胞特性を示す細胞にトランス分化するために骨髄付着幹細胞の少なくとも一部を誘導するのに十分に調節されるが；但し調節はノッチ細胞内ドメインによる骨髄付着幹細胞のトランスフェクションを包含しない、ということを包含する方法に関する。
別の態様では、本発明は、ニューロン始原細胞特性を示す細胞の産生方法であって、以下の：ニューロン始原細胞特性を示す細胞にトランス分化するよう骨髄付着幹細胞の少なくとも一部を誘導するのに十分な量の神経膠調節剤とともに骨髄付着幹細胞をインキュベートするが；但し相互作用がノッチ細胞内ドメインによる骨髄付着幹細胞のトランスフェクションを含まないことを包含する方法に関する。
発明の詳細な説明
上記の問題および制限は本明細書中に開示された本発明を実施することにより克服され得るということを、本発明人は、予期せぬことにそして意外にも、発見した。本発明は、骨髄付着幹細胞（ＭＡＳＣ）の神経膠トランス分化に関連するＭＡＳＣ中の細胞経路を調節することによりＭＡＳＣからのＣＰＣの産生を取り扱う。本発明の製造および使用方法が本明細書中で開示される。
本明細書中で引用される参考文献はすべて、個々の出版物または特許または特許出願の各々が特定的におよび個別に全目的のためにその記載内容中の参考文献によりこれらの記載内容が各々、参照により本明細書中で援用されるよう示されたのと同程度に、それらの記載内容が参照によりならびに全目的のために本明細書中で援用される。本明細書中での参考文献の考察は、それらの著者等によりなされる主張を単に要約するよう意図するに過ぎず、任意の参考文献が従来技術を構成するということを認めるものではない。出願人等は、引用参考文献の正確性および関連性に異議申し立てをする権利を保有する。
ニューロン始原細胞特質を示す細胞（「ＣＰＣ」）は、本発明の目的のために、有糸分裂性であり、神経前駆細胞／神経始原細胞に特異的なネスチンおよびその他の細胞マーカーを発現し、そしてＭＡＳＣから得られる細胞であると定義される。ＣＰＣは、ニューロン、神経膠および乏突起膠細胞ならびに前述のいずれかの前駆体に分化し得る。ＣＰＣは、本明細書中に開示される方法に従って、ＭＡＳＣから得られる。一実施形態では、ヒトＣＰＣはＥｆｎＢ２＋、ＣＤ９０‐およびＰＤＧＦ受容体ベータである。これらのマーカーは、本発明によるＭＡＳＣの神経膠トランス分化後にＦＡＣＳを用いてＭＡＳＣからＣＰＣを分離するために用いられ得る。ＣＰＣの適切な取扱い方法は慣用的に既知であり、例としては公開済み米国特許出願第20020012903号（Goldman等）に開示された方法が挙げられる。
一般に本発明によるＣＰＣは、ＭＡＳＣの神経膠トランス分化に関連するＭＡＳＣ中の細胞経路を調節することにより産生され、細胞経路はＣＰＣにトランス分化するためにＭＡＳＣの少なくとも一部を誘導するよう十分に調節される。
広範な種々の調節方法は、本発明の実施において有用であり得る。これらの例としては、ex-vivoで増殖される場合、細胞が増殖される培地および条件の修正；in vivoで増殖される場合、ＭＡＳＣが存在する組織環境の修正；あるいは神経膠調節剤を伴うＭＡＳＣのインキュベーションが挙げられるが、これらに限定されない。ＭＡＳＣの神経膠トランス分化が有効に調節され、したがってＣＰＣへのＭＡＳＣの分化を可能にする限り、調節の的確な方法は本発明の目的のために問題ではない。一般にＭＡＳＣの神経膠トランス分化に関連するＭＡＳＣ中の細胞経路の調節は、有糸分裂性および生育可能状態で任意のＭＡＳＣまたはＣＰＣを保持するのに適している条件下で起こる。このような条件は当業者に既知であり、例えばM. Kallos et al., Large-scale expansion of mammalian neural stem cells: a review. Med Boil Eng Comput. 2003 May; 41 (3): 271-82に見出され得る。適切な条件および技法は、細胞培養およびin vivo環境の両方に関して文献中の他の箇所でも見出され得る。
本発明の好ましい実施形態では、ＭＡＳＣの神経膠トランス分化に関連するＭＡＳＣ中の細胞経路の調節は、神経膠調節剤とともにＭＡＳＣをインキュベートすることにより成し遂げられ得る。さらに好ましい実施形態では、ＭＡＳＣの神経膠トランス分化に関連するＭＡＳＣ中の細胞経路の調節は、ＣＰＣにトランス分化するようＭＡＳＣの少なくとも一部を誘導するのに十分な量の神経膠調節剤とともにＭＡＳＣをインキュベートすることにより成し遂げられ得る。神経膠調節剤がＭＡＳＣ細胞表面受容体と相互作用するかまたはＭＡＳＣの内部に輸送されて内部細胞経路と相互作用するという意図で、本発明の情況におけるインキュベーションは、神経膠調節剤の存在下でＭＡＳＣを培養する。このような輸送は、受動的、例えば拡散輸送であるか、または能動的、例えば能動輸送体によるか、あるいは2つの混合物であり得る。in vitroインキュベーションは、慣用的方法により、例えば神経膠調節剤（単数または複数）を付加されるα‐ＭＥＭまたは類似の培地中のＭＡＳＣの培養をインキュベートすることにより実施され得る。適切なインキュベーション技法は、一般に文献中に、例えばM. Kallos et al., Large-scale expansion of mammalian neural stem cells: a review. Med Boil Eng Comput. 2003 May; 41 (3): 271-82中に見出され得る。インキュベーションはin vivo環境においても起こり得るが、この場合、本発明による神経膠調節剤は全身的にまたは局所的に、そして慣用的方法を用いて投与され得る。
インキュベーションの好ましい実施形態では、神経膠調節剤がタンパク質またはペプチドである場合、インキュベーションの方法は、そのタンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡのＭＡＳＣへのトランスフェクションであり得る。トランスフェクションは、商業的に利用可能なトランスフェクションプロトコール、例えばリポフェクタミンTM2000系（Invitrogenから入手可能）またはエフェクテンTMトランスフェクション系（Qiagenから入手可能）、あるいはその他の慣用的トランスフェクションプロトコールを用いて実施され得る。インキュベーションの別の好ましい実施形態では、神経膠調節剤がタンパク質またはペプチドである場合、インキュベーション方法は、慣用的ウイルスベクター、例えば安定発現のためのレンチウイルスベクター系（ＢＬＯＣＫ‐ｉＴTMレンチウイルスＲＮＡｉ発現系、Invitrogen）および一過性発現のためのアデノウイルスベクター系（ＢＬＯＣＫ‐ｉＴTMアデノウイルスＲＮＡｉ発現系、Invitrogen）を用いた、神経膠調節剤のウイルス送達であり得る。
インキュベーションは、種々の時点で、即ち逐次的に、平行してまたは種々の神経膠調節剤（単数または複数）を伴うＭＡＳＣの逐次および平行インキュベーションの組合せで、起こり得る。
本発明の実施形態では、ＭＡＳＣの神経膠トランス分化に関連するＭＡＳＣ中の細胞経路の調節がノッチ遺伝子の細胞内ドメインによるＭＡＳＣのトランスフェクションを含まない、という但し書きが存在する。本発明の実施形態では、神経膠調節剤とともにＭＡＳＣをインキュベートすることがノッチ遺伝子の細胞内ドメインによるＭＡＳＣのトランスフェクションを含まない、という但し書きが存在する。
骨髄付着幹細胞（ＭＡＳＣ）は、本発明の目的のために、主に結合組織中に見出されるいくつかの種類の細胞、例えば骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞および筋細胞（これらに限定されない）に分化すると慣用的に認識されている幹細胞であると定義される。ＭＡＳＣは、胚性幹細胞および胎児幹細胞を特定的に除外する。ＭＡＳＣは、広範な種々の動物、例えばヒト、ならびにその他の哺乳類、例えばラット、マウス、霊長類、ブタ、ウシおよびヒツジ（これらに限定されない）から得られる。ＭＡＳＣは、種々の組織から得られる：好ましい供給源は、骨髄および臍帯血を包含する。ＭＡＳＣのための有用な供給源、ならびにそれらを得るための方法は、以下の実施例１に、そして本明細書中の他の箇所に記載されている。一実施形態では、本発明の実施において有用なヒトＭＡＳＣはＣＤ２９およびＣＤ９０を発現するが、しかしＣＤ１５、ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ／ｃ、ＣＤ３１、ＣＤ４５およびフォン・ビレブランド因子に対しては陰性である。
一実施形態では、ＭＡＳＣは、文献中に記載された技法を用いて臍帯血から単離され得る。例えばC. Campagnoli等（Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood, liver, and bone marrow. 1: Blood. 2001 Oct 15; 98 (8): 2396-402）は、胎児血液ＭＡＳＣを得るのに一般的に有用な方法を記載する。A. Erices等（Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. 1: Br J Haematol. 2000 Apr; 109 (1): 235-42）においては、臍帯血からＭＡＳＣを得るのに一般的に有用な方法が記載されている。L. Hou等（Induction of umbilical cord blood mesenchymal stem cells into neuron-like cells in vitro. Int J Hematol. 2003 Oct; 78 (3): 256-61）は、ヒト臍帯血ＭＡＳＣを採取し、精製し、そして増幅するのに一般的に有用な方法を記載する。
神経膠調節剤は、本発明の目的のために、神経膠細胞へのＭＡＳＣのトランス分化を抑制し、そして他の特性の中でも特にそれらのＣＰＣへのトランス分化を促すという特性を保有する物質、と定義される。神経膠調節剤は、神経膠の運命とは別の方向にＭＡＳＣを向けるための種々の異なるメカニズムにより作用し得る。例えば前神経塩基性へリックス・ループ・へリックス転写因子、例えばＭａｓｈ １、Ｍａｔｈ １およびニューロゲニン１は、ニューロン遺伝子発現の活性剤であると考えられる。
前神経遺伝子は、神経膠トランス分化を抑制しながら、ＭＡＳＣのニューロン・トランス分化を推し進める、と考えられる。神経膠トランス分化が抑制され得る一メカニズムは、ＳＴＡＴ媒介性シグナル伝達の調節によるものである。ＳＴＡＴによるシグナル伝達は、ヤヌス・ファミリーのチロシンキナーゼ（ＪＡＫ）により触媒されると考えられるリン酸化により誘発されると思われる。したがってＪＡＫ‐ＳＴＡＴシグナル伝達の抑制は、神経膠トランス分化経路を調節し、ＭＡＳＣのニューロン運命を促進し得る。
本発明による神経膠調節剤は、神経膠形成因子に関するシグナル伝達経路を妨害する阻害剤またはアンタゴニストまたは作用物質を含み得る。神経膠調節剤は、神経形成のためのアゴニスト、例えば神経形成因子も含み得る。これらのアゴニストまたは因子の使用は、本発明の実施においてＭＡＳＣの神経膠形成を陰性制御し得る。本発明の実施による神経膠調節剤は、慣用的形態の治療用分子、例えば小分子、ペプチド、ならびに全部または一部の遺伝子産物（これらに限定されない）を含み得る。
一実施形態では、本発明による神経膠調節剤としては、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤、例えばＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３の阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。ある種の実施形態では、このようなＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の遺伝子サイレンシングのためのＲＮＡｉ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を下向き調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、あるいは小分子ＪＡＫ阻害剤４‐（４’‐ヒドロキシフェニル）アミノ‐６，７‐ジメトキシキナゾリンを含み得る。付加的ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤は、米国特許出願第20040209799号（George Vasios、2004年10月21日公開）；および米国特許出願第20040052762号（Hua Yu等、2004年3月18日公開）に開示されている。
一実施形態では、本発明による神経膠調節剤としては、ＢＭＰ２または７（骨形態形成タンパク質）のアンタゴニストが挙げられるが、これらに限定されない。このようなアンタゴニストは、ノギン、コルジン、フォリスタチン、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）を発現する遺伝子からの全部または一部の遺伝子産物、あるいはこれらの遺伝子のアゴニストを含み得る。
一実施形態では、本発明による神経膠調節剤としては、Ｈｅｓ阻害剤、例えばＨｅｓ １および／またはＨｅｓ ５阻害剤（これらに限定されない）が挙げられる。ある種の実施形態では、このようなＨｅｓ阻害剤は、Ｈｅｓの遺伝子サイレンシングに関するＲＮＡｉ、あるいはＨｅｓを下向き調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る。
一実施形態では、本発明による神経膠調節剤としては、Ｉｄ‐１の阻害剤が挙げられるが、これに限定されない（S. Tzeng et al., Id1, Id2, and Id3 gene expression in neural cells during development. Glia. 1998 Dec; 24(4): 372-81参照）。ある種の実施形態では、このようなＩｄ‐１阻害剤は、Ｉｄ‐１の遺伝子サイレンシングのためのＲＮＡｉ、あるいはＩｄ‐１を下向き調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る。
一実施形態では、本発明による神経膠調節剤としては、ショウジョウバエｇｌｉｄｅ／ｇｃｍ（神経膠細胞喪失）の哺乳類相同体、例えばＧｃｍ１（ネズミ）またはＧＣＭＢ（ヒト）（これらに限定されない）の阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない（Y. Iwasaki et al., The potential to induce glial differentiation is conserve between Drosophila and mammalian glial cells missing genes. Development. 2003 Dec; 130 (24): 6027-35. Epub 2003 Oct 22およびM. Kammerer et al., GCMB, a second human homolog of the fly glide/gcm gene. Cytogene Cell Genet. 1999; 84 (1-2): 43-7参照）。ある種の実施形態では、このようなｇｌｉｄｅ／ｇｃｍ相同体阻害剤は、ｇｌｉｄｅ／ｇｃｍ相同体（例えばＧｃｍ１（ネズミ）またはＧＣＭＢ（ヒト））の遺伝子サイレンシングのためのＲＮＡｉ、あるいはｇｌｉｄｅ／ｇｃｍ相同体（例えばＧｃｍ１（ネズミ）またはＧＣＭＢ（ヒト））を下向き調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る。
一実施形態では、本発明による神経膠調節剤としては、乏突起膠細胞系列のための転写因子であり得るＳｏｘ９の阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない（C. Stolt et al., The Sox9 transcription factor determines glial fate choice in the developing spinal cord. Genes Dev. 2003 Jul 1; 17 (13): 1677-89参照）。ある種の実施形態では、このようなＳｏｘ９阻害剤は、Ｓｏｘ９の遺伝子サイレンシングのためのＲＮＡｉ、あるいはＳｏｘ９を下向き調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る。
一実施形態では、本発明による神経膠調節剤としては、神経膠形成のための転写因子であり得るニューロゲニン３の阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。ある種の実施形態では、このようなニューロゲニン３阻害剤は、ニューロゲニン３の遺伝子サイレンシングのためのＲＮＡｉ、あるいはニューロゲニン３を下向き調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る。
一実施形態では、本発明による神経膠調節剤としては、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）の阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。ある種の実施形態では、このようなＣＮＴＦ阻害剤は、ＣＮＴＦの遺伝子サイレンシングのためのＲＮＡｉ、あるいはＣＮＴＦを下向き調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る。
ある種の実施形態では、神経膠調節剤は、神経膠形成を強力に抑制するＷｎｔ１を発現する遺伝子からの全部または一部の遺伝子産物を含み得る（K. Tang et al., Wnt-1 promotes neuronal differentiation and inhibits gliogenesis in P19 cells. Biochem Biophys Res Commun. 2002 Apr 26; 293 (1): 167-73参照）。Ｗｎｔ１を発現する遺伝子からの全部または一部の遺伝子産物は、トランスフェクションあるいはその他の慣用的方法により、例えばウイルスベクターを含めた遺伝子療法により投与され得る。
ある種の実施形態では、神経膠調節剤は、神経形成中に構成的役割を演じるか、あるいはＣＰＣを増殖するに際して発現される神経塩基性へリックス・ループ・へリックス（ｂＨＬＨ）因子を発現する遺伝子からの全部または一部の遺伝子産物を含み得る。このような神経膠調節剤は、ニューロゲニン１、Ｍａｓｈ１、Ｍａｔｈ１、Ｍａｔｈ６またはニューロＤを発現する遺伝子からの全部または一部の遺伝子産物を含み得る。ニューロゲニン１、Ｍａｓｈ１、Ｍａｔｈ１、Ｍａｔｈ６またはニューロＤ（これらに限定されない）を含めた神経塩基性へリックス・ループ・へリックス（ｂＨＬＨ）因子のサブセットを発現する遺伝子からの全部または一部の遺伝子産物は、トランスフェクションあるいはその他の慣用的方法により、例えばウイルスベクターを含めた遺伝子療法により投与され得る。
さらに神経膠調節剤は、単一でまたは組合せて投与され得る。好ましい実施形態では、神経膠調節剤の組合せが本発明の実施において用いられる場合には、異なる神経膠調節経路に作用する神経膠調節剤が選択され得る。これは、神経膠調節剤の全体的神経膠調節作用を増強するのに役立ち得る。
本発明の目的のために、ＣＰＣを単離することは、ＣＰＣにトランス分化しなかったＭＡＳＣのような試料中の非ＣＰＣ細胞からＣＰＣを単離することを包含する。このような単離は、1回単離または多数回単離を含み得る。多数回単離が実施されるべきものである場合、異なる種類または技法の単離が好ましくは用いられ得るが、これはこのような異なる種類または技法の単離が単離結果を増強し得るからである。広範な種々の単離方法は、本発明の実行において有用である。このような単離方法の例としては、フローサイトメトリー（akaＦＡＣＳ分類）、磁気分離技法および視覚的分類が挙げられるが、これらに限定されない。免疫細胞化学も、例えば細胞成育可能性が重要でない場合に用いられ得る。
ＦＡＣＳ分類は、ＣＰＣの1つまたは複数の特性に関連するエピトープに特異的である抗体を用いる慣用的ＦＡＣＳ装置およびプロトコールを用いて実施され得る。このような一エピトープは、ヒトＣＰＣの場合はＥｆｎＢ２であり得る（N. Ivanova et al., A stem cell molecular signature. Science 298 (5593): 601-4 (Oct 18, 2002)）。本発明の実行（必ずしもＦＡＣＳ分類のためではないが）に付加的に有用な抗体は、抗ＣＤ１５、抗ＣＤ２９、抗ＣＤ３４、抗ＣＤ９０、抗ＣＤ３１、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ１１ｂ／ｃおよび抗フォン・ビレブランド因子を含む。本発明の実行に有用な細胞集団ＦＡＣＳ装置としては、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔTMソフトウエア（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）を用いたＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒTM分析機、あるいはGuava Technologies（Hayward, California）から入手可能なＦＡＣＳ装置が挙げられるが、これらに限定されない。
あるいは単離は、磁気分離技法、例えばQiagenからのキット形態で利用可能であるＢｉｏＭａｇTMプロトコールおよび試薬を用いて、実施され得る。免疫細胞化学は、本発明の実行に有用な別の分離技法である；有用な免疫細胞化学的方法は、M. Dezawa et al., Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromal cells. Eur. J. Neurosci. 14, 1771-1776 (2001)に記載されている。免疫細胞化学的検査は、例えばRadians 2000（Bio-Rad, Hertfordshire, UK）のような共焦点レーザー走査顕微鏡下でなされ得る。慣用的視覚的細胞分類技法は、本発明の実行に用いられ得る。
ニューロンは、本発明の目的のために、1つまたは複数の樹状突起および単一軸索を有する有核細胞体からなる脳、脊柱および神経を構成するインパルス伝達細胞のいずれかである、と定義される。生化学的にはニューロンは、神経細繊維‐Ｍ、ベータ３‐チューブリンおよびＴｕＪ‐１に対する抗体との反応により特性化される。これらの反応は、ＦＡＣＳ分類のような技法を用いて、ニューロン、あるいはニューロンの1つまたは複数の特性を示す細胞を単離するために用いられ得る。神経細胞は、神経伝達物質、神経伝達物質合成酵素または神経伝達物質関連タンパク質、例えば神経ペプチドＹおよびサブスタンスＰを分泌することによっても特性化される。
神経栄養因子作用物質は、本発明の目的のために、他の特性の中でも特に、ニューロン、あるいはニューロンの1つまたは複数の特性を示す細胞へのＣＰＣの分化を引き起こすかまたは促進するという特性を保有する。本発明の実行に有用な神経栄養因子作用物質は、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）およびフォルスコリン（ＦＳＫ）を含むが、これらに限定されない。神経栄養因子作用物質は、当該技術分野で既知の細胞取扱い技法を用いて本発明のＣＰＣと併合され得る。好ましい方法は、PCT/JP03/01260（Dezawa等）中に一般に見出され得る。好ましい実施形態では、ｂＦＧＦ、ＣＮＴＦおよびＦＳＫは、ニューロンあるいはニューロンの1つまたは複数の特性を示す細胞へのＣＰＣの分化を引き起こすかまたは促すのに有効な量で、細胞培養中でＣＰＣと併合される。
神経膠細胞は、本発明の目的のために、中枢神経系の組織を支持する分枝化細胞および繊維の網目構造を作り上げる細胞のいずれかである、と定義される。神経膠細胞としては、星状細胞、シュワン細胞、乏突起膠細胞および小神経膠細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
遺伝子は、本発明の目的のために、一組の結合転写物と定義されるが、この場合、転写物は転写と（任意に）その後の前ｍＲＮＡスプライシングにより産生される一組のエキソンである。遺伝子産物は、本発明の目的のために、遺伝子から翻訳されるタンパク質であると定義される。遺伝子の部分は、本発明の目的のために、遺伝子の一サブセットであると定義される。遺伝子産物の部分は、本発明の目的のために、遺伝子産物の一サブセットであると定義される。
患者は、医学的観察または研究の被験者である動物、典型的には哺乳類、さらに典型的にはヒトを意味する。
本発明に従って産生されるＣＰＣは、種々の方法により、例えば注射カニューレ、針またはシャントにより、あるいはキャリヤー内の埋め込み、例えば生分解性カプセルにより（これらに限定されない）患者に投与され得るが、しかし他の投与経路も本発明の範囲内である。本発明の投与経路は、局所および全身経路を包含する。局所投与としては、好ましくはＣＮＳまたはＰＮＳの標的化部分への投与が、そして好ましくは実質組織内経路が挙げられる。全身投与経路は、非経口経路を含み、静脈内（i.v.）または動脈内（例えば内頚動脈または外頚動脈を通しての）投与が全身投与の好ましい経路である。全身投与技法は、一般的には前駆細胞を投与するために用いられる技法、例えばD Lu et al., Intraarterial administration of stromal cells in a rat model of traumatic brain injury. J Neurotrauma. 2001 Aug; 18 (8): 813-9に開示された技法から適合され得る。
患者に投与されるＣＰＣの量は、慣用的用量変動技法ならびに特定患者の疾患の臨床的査定を用いて臨床的に確定され得る。
本発明は、本発明の個々の態様の単独例証として意図される本出願に記載された特定の実施形態に関して限定されるべきものでない。当業者に明らかであるように、その本質および範囲を逸脱しない限り、本発明の多数の修正および変更がなされ得る。本発明の範囲内の機能的に等価の方法は、本明細書中に列挙されたもののほかに、前記の説明から当業者に明らかになる。このような修正および変更は、添付の特許請求の範囲内に入るよう意図される。このような特許請求の範囲が権利を授与される等価物の全範囲とともに、添付の特許請求の範囲の条項によってのみ、本発明は限定されるべきである。
下記の実施例は例証的であるよう意図され、いかなる点でも本発明の範囲を限定するものではない。
実施例
材料および方法
ＭＡＳＣ： M. Dezawa et al., Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromal cells. Eur. J. Neurosci. 14, 1771-1776 (2001)に記載されているように、ラットＭＡＳＣ（ウィスター系）を単離し、培養する。ヒトＭＡＳＣに関する場合と同様に、市販ＭＡＳＣ（ＰＴ‐2501、BioWhittaker. Walkersville, MD）および健常ドナーから得られるＭＡＳＣを用いる。10％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するα‐ＭＥＭ（Sigma、Ｍ‐4526）中に、細胞を保持し得る。
健常ドナーからＭＡＳＣを得る場合、第一段階は、慣用的吸引技法を用いて健常ドナーから骨髄吸引液を得ることである。次に細胞吸引液は、50 ml試験管中に移される。次に10 mlピペットを用いて、13 ml Histopaqueを注意深く下に敷く。次に試験管を＠2000 rpmで20分間遠心分離する。次に中間期の細胞を収穫する。次にＰＢＳを付加し（中間期の容積の少なくとも3倍）、混合物を＠1200 rpmで遠心分離する。細胞をＰＢＳで2回以上洗浄する。次に細胞ペレットをＤＭＥＭ＋10％ＦＣＳ中に再懸濁し、細胞を計数する。5×106個の細胞をＴ‐７５組織培養フラスコ当たりで再プレート化し、3日間インキュベートする。4日目に、非付着細胞を除去し、フラスコを培地で3回洗浄する。付着細胞をフラスコ中で増殖させる。細胞が集密度20〜30％に達したら、2〜3本のフラスコの内容物をプールし、1つのＴ‐７５フラスコ中で再プレート化する。プールされたこの中の細胞が集密に達したら、0.05％トリプシンおよび0.02％ＥＤＴＡを用いて細胞をトリプシン処理する。次に細胞を洗浄し、計数する。次に細胞をSigmaアルファＭＥＭ＋10％ＦＢＳ（Ｍ‐4526）中に再懸濁する。リポフェクチンが用いられるべき実験では、培地はＩ‐ｇｌｕを含有しない、ということを保証することが重要である。グルタミンを付加しない。細胞を2〜4週間増幅して、早期継代で凍結する。
蛍光活性化細胞分析（ＦＡＣＳ）を用いて、ラットおよびヒトＭＡＳＣにおける細胞表面マーカーを分析する。一実施形態では、ＭＡＳＣは、M. Pittenger et al., Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284, 143-147 (1999)およびJ. Kohyama et al., Brain from bone: efficient “meta-differentiation” of marrow stroma-derived mature osteoblasts to neurons with Noggin or a demethylating agent. Differentiation 68, 235-244 (2001)と一致して、ＣＤ２９およびＣＤ９０を発現するが、しかしＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ／ｃおよびフォン・ビレブランド因子に対しては陰性である（図１Ａ）。免疫細胞化学により、同一結果が得られる。M. Pittenger et al., Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284, 143-147により記載された方法に従って、ラットおよびヒトＭＡＳＣの脂肪原性、軟骨原性および骨原性分化を確証する。
ＦＡＣＳ分析： 最終濃度1×107個／mlの最終濃度の細胞を、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の1 mgのモノクローナル抗体とともにインキュベートする。非特異的抗体結合を防止するために、10 mgのマウス免疫グロブリンの存在下でインキュベーションを実施し得る。ラットＭＡＳＣでは、マウス抗ＣＤ３４（Santa Cruz Antibodies）およびハムスター抗ＣＤ２９（PharMingen, San Diego, CA）をＦＩＴＣで標識し、対照をＦＩＴＣ標識抗マウスまたはハムスターＩｇＧとともにインキュベートし得る。マウス抗ＣＤ５４およびＣＤ１１ｂ／ｃはすべて、PharMingenから購入し得る。本発明の実行に際して必要とされるマウス抗フォン・ビレブランド因子およびその他の抗体は、商業的に入手可能であり得る。対照としては、何れかの非免疫マウス血清で染色される細胞が挙げられ得る。これらの抗体がＦＩＴＣと接合される場合、細胞はその後、1 mgのＦＩＴＣ接合抗マウスＩｇＧとともにインキュベートされ得る。ヒトＭＡＳＣでは、フィコエリトリン標識マウス抗ＣＤ３４、ＣＤ２９、ＣＤ５４、ＣＤ１１ｂ／ｃおよびフォン・ビレブランド因子を用い得るし、対照としては、フィコエリトリン標識抗マウスＩｇＧで染色される細胞が挙げられ得る。CellQuestソフトウエア（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）を用いてＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒで、データを獲得し、分析し得る。
免疫細胞化学： 一般的手法は、M. Dezawa et al., Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromal cells. Eur. J. Neurosci. 14, 1771-1776 (2001)に記載されている。リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定後、それらを4℃で一晩、第一抗体とともにインキュベートする。ネスチンに対する抗体は、PharMingenから購入し得る。次に細胞を、Alexa Fluor４８８または５４６接合抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭまたはウサギＩｇＧに対する第二抗体（Molecular Probes, Eugene, OR）とともに室温で1時間インキュベートし、ＴＯＴＯ‐３ヨウ化物（Molecular Probes）対比染色を実施し得る。共焦点レーザー走査顕微鏡（Radians 2000, Bio-Rad, Hertfordshire, UK）下で，検査をなし得る。
実施例１：
一般的にE. Sudbeck et al., Structure-based design of specific inhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents. Clin. Cancer Res. 5, 1569-1582 (1999)に従って、ヒトＭＡＳＣ（ＰＴ‐2501、BioWhittaker. Walkersville, MD）を、10％ＦＢＳを含有するα‐ＭＥＭ中で増殖させた。ＭＡＳＣを、40 ug/mlの４‐（４’‐ヒドロキシフェニル）アミノ‐６，７‐ジメトキシキナゾリン（ＷＨＩ‐１３１、Calbiochem, San Diego, CA）とともに2日間インキュベートした。2日後に、ＷＨＩ‐１３１を洗い落とした。
実施例２：
材料および方法の節に従って調製したヒトＭＡＳＣを、一般的にE. Sudbeck et al., Structure-based design of specific inhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents. Clin. Cancer Res. 5, 1569-1582 (1999)に従って、10％ＦＢＳを含有するα‐ＭＥＭ中で増殖させる。一旦培養が集密度90％に達したら、ＢＬＯＣＫ‐ｉＴTMＲＮＡｉデザイナー（Invitrogen）を用いて設計されるいくつかのＲＮＡを、Invitrogenから利用可能なＢＬＯＣＫ‐ｉＴTMを用いて、Ｓｏｘ９発現をサイレンシングするのに十分な時間、培養とともにインキュベートする。その結果生じるＣＰＣを、適切な抗体、例えば抗ＥｆｎＢ２（ＣＰＣに関して陽性選択）、抗ＣＤ９０（ＣＰＣに関して陰性選択）および抗ＰＤＧＦ受容体ベータ（ＣＰＣに関して陰性選択）で被覆された磁気ビーズを用いて、逐次選択により、非トランス分化化ＭＡＳＣから単離する。抗体および被覆ビーズは、商業的供給元から入手し得る。ＰＢＳ中の細胞を、被覆ビーズとともに＠室温で1時間インキュベートする。細胞結合ビーズを、磁気を用いて除去する。ＣＰＣを抗体なしで洗浄し、10％ＦＢＳを含有するα‐ＭＥＭ中に再懸濁して、増殖させる。
実施例３：
材料および方法の節に従って調製したヒトＭＡＳＣを、一般的にE. Sudbeck et al., Structure-based design of specific inhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents. Clin. Cancer Res. 5, 1569-1582 (1999)に従って、10％ＦＢＳを含有するα‐ＭＥＭ中で増殖させる。H. Moulton et al., Peptide-assisted delivery of steric-blocking antisense oligomers. Curr Opin Mol Ther. 2003 Apr; 5(2): 123-32；C. Stein et al., Antisense oligonucleotides as therapeutic agents−is the bullet really magical? Science. 1993 Aug 20; 261(5124): 1004-12またはC. Helene, The anti-gene strategy: control of gene expression by triplex-forming-oligonucleotides. Anticancer Drug Des. 1991 Dec; 6(6): 569-84のいずれか一つに開示された技法に従って、Ｈｅｓ １に対するアンチセンスオリゴマーを生成する。一旦ＭＡＳＣ培養が集密度90％に達したら、本実施例中に引用した3つの参考文献のいずれかに開示された技法に従って、Ｈｅｓ‐１発現を下向き調節するのに十分な期間、ＭＡＳＣとともにＨｅｓ‐１アンチセンスオリゴマーをインキュベートする。その結果生じるＣＰＣを、適切な抗体、例えば抗ＥｆｎＢ２（ＣＰＣに関して陽性選択）、抗ＣＤ９０（ＣＰＣに関して陰性選択）および抗ＰＤＧＦ受容体ベータ（ＣＰＣに関して陰性選択）で被覆された磁気ビーズを用いて、逐次選択により、非トランス分化化ＭＡＳＣから単離する。抗体および被覆ビーズは、商業的供給元から入手し得る。ＰＢＳ中の細胞を、被覆ビーズとともに＠室温で1時間インキュベートする。細胞結合ビーズを、磁気を用いて除去する。ＣＰＣを抗体なしで洗浄し、10％ＦＢＳを含有するα‐ＭＥＭ中に再懸濁して、増殖させる。
M. Sen et al., Regulation of fibronectin and metalloproteinase expression by Wnt signaling in rheumatoid arthritis synoviocytes. Arthritis Rheum. 2002 Nov; 46(11): 2867-77に従って、Ｗｎｔ‐１発現プラスミドを生成する。材料および方法の節に従って調製したヒトＭＡＳＣを、一般的にE. Sudbeck et al., Structure-based design of specific inhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents. Clin. Cancer Res. 5, 1569-1582 (1999)に従って、10％ＦＢＳを含有するα‐ＭＥＭ中で増殖させる。一旦培養が集密度90％に達したら、リポフェクタミンTM2000試薬およびプロトコール（Invitrogenから入手可能）を用いて、37℃で5％ＣＯ2で2日間、Ｗｎｔ‐１発現プラスミドとともにＭＡＳＣをインキュベートする。2日間のインキュベーション後、10日間の期間中、慣用的選択技法を用いてトランスフェクト化細胞に関して、培養を選択する。その結果生じるＣＰＣを、適切な抗体、例えば抗ＥｆｎＢ２（ＣＰＣに関して陽性選択）、抗ＣＤ９０（ＣＰＣに関して陰性選択）および抗ＰＤＧＦ受容体ベータ（ＣＰＣに関して陰性選択）で被覆された磁気ビーズを用いて、逐次選択により、非トランス分化化ＭＡＳＣから単離する。抗体および被覆ビーズは、商業的供給元から入手し得る。ＰＢＳ中の細胞を、被覆ビーズとともに＠室温で1時間インキュベートする。細胞結合ビーズを、磁気を用いて除去する。ＣＰＣを抗体なしで洗浄し、10％ＦＢＳを含有するα‐ＭＥＭ中に再懸濁して、増殖させる。
実施例５：
実施例１に従って産生した細胞を、20％ウシ胎仔血清（１４‐５０１Ｆ、ロット番号61-1012、BioWhittaker Co.）を含有する最小必須培地α‐イーグル変法溶液（Ｍ4526、Sigma Co.）中に入れた。5 μMのフォルスコリン（344273, Calbiochem, La Jolla, CA）、10 ng/mlの組換えヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子（１００‐１８Ｂ、Peprotech EC, Ltd., London, UK）および10 ng/mlの毛様体神経栄養因子（５５７‐ＮＴ、R&D Systems, Minneapolis, MN）を付加した。培養を3日間増殖させて、この時点で、29.46＋／−3.0％のＭＡＰ‐２ａｂ陽性細胞の結果を用いて、ニューロン始原細胞特性を示す細胞を認識した。インキュベート細胞から調製した細胞溶解物、ならびに5％および10％ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動処理した溶解物タンパク質50 ugとともに、ウエスタンブロッティングを用いて、ＭＡＰ‐２ａｂを分析した。アルカリ性ホスファターゼを用いて、ＭＡＰ‐２（1:500, Chemicon）に対する抗原を検出した。
実施例６：
実施例５のニューロン始原細胞特性を示す細胞を収穫し、一般的にE. Sudbeck et al., Structure-based design of specific inhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents. Clin. Cancer Res. 5, 1569-1582 (1999)に従って、10％ＦＢＳを含有するα‐ＭＥＭ中の培養中で集密度90％に増殖させる。次に5 mMのフォルスコリン（344273, Calbiochem）、10 ng/mlの塩基性繊維芽細胞増殖因子（１００‐１８Ｂ、Peprotech EC, Ltd.）および50 ng/mlの毛様体神経栄養因子（５５７‐ＮＴ、R&D Systems）を細胞培養に付加する。
神経栄養性作用物質の存在下で細胞を10日間増殖させて、次に神経細胞の特徴的形態学に関して、ならびにＭＡＰ‐２（ＭＡＢ３６４、Chemicon）、神経細繊維（814342、Boehringer Manheim）およびネスチン（ＢＭＳ4353、Bioproducts）に対する抗体に関する陽性反応に関して、分析する。
参考文献
Figure 2007532112
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Claims (33)

  1. 骨髄付着幹細胞を含む物質からのニューロン始原細胞特性を示す細胞の産生方法であって、以下のステップ：
    骨髄付着幹細胞の神経膠トランス分化と関連する骨髄付着幹細胞中の細胞経路を調節し；
    ここで、細胞経路はニューロン始原細胞特性を示す細胞にトランス分化するために骨髄付着幹細胞の少なくとも一部を誘導するのに十分に調節され；
    を含み、
    但し前記調節はノッチ細胞内ドメインによる骨髄付着幹細胞のトランスフェクションを含まない
    前記方法。
  2. 骨髄付着幹細胞が、ヒト骨髄付着幹細胞、ラット骨髄付着幹細胞、マウス骨髄付着幹細胞、霊長類骨髄付着幹細胞、ブタ骨髄付着幹細胞、ウシ骨髄付着幹細胞およびヒツジ骨髄付着幹細胞からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
  3. 前記調節が神経膠調節剤を骨髄付着幹細胞とともにインキュベートすることを包含する、請求項１記載の方法。
  4. 前記インキュベーションが骨髄付着幹細胞への神経膠調節剤のトランスフェクションを包含する、請求項３記載の方法。
  5. 前記神経膠調節剤が神経膠原性因子のためのシグナル伝達経路を妨害する阻害剤またはアンタゴニストまたは作用物質を含む、請求項３記載の方法。
  6. 前記神経膠調節剤が神経形成のためのアゴニストを含む、請求項３記載の方法。
  7. 前記神経膠調節剤が、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤；ＳＴＡＴ１またはＳＴＡＴ３の阻害剤；４‐（４’‐ヒドロキシフェニル）アミノ‐６，７‐ジメトキシキナゾリン；骨形態形成タンパク質２または骨形態形成タンパク質のアンタゴニスト；ノギン、コルジン、フォリスタチン、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）を発現する遺伝子からの全部または一部の遺伝子産物、あるいはこれらの遺伝子のアゴニスト；Ｈｅｓ遺伝子；Ｈｅｓ１またはＨｅｓ５阻害剤；Ｉｄ‐１の阻害剤；ショウジョウバエｇｌｉｄｅ／ｇｃｍの哺乳類相同体の阻害剤；Ｓｏｘ９の阻害剤；ニューロゲニン３の阻害剤；ＣＮＴＦの阻害剤；Ｗｎｔ１、ニューロゲニン１、Ｍａｓｈ１、Ｍａｔｈ１、Ｍａｔｈ６またはニューロＤを発現する遺伝子からの全部または一部の遺伝子産物、あるいはそれらのアゴニストを含む、請求項３記載の方法。
  8. 以下の：
    ニューロン始原細胞特性を示す細胞を単離し；そして
    それらを患者に投与する
    ことをさらに包含する、請求項１記載の方法。
  9. 骨髄付着幹細胞が臍帯血から得られる、請求項１記載の方法。
  10. 骨髄付着幹細胞が骨髄から得られる、請求項１記載の方法。
  11. ニューロン始原細胞特性を示す細胞の産生方法であって、以下のステップ：
    ニューロン始原細胞特性を示す細胞にトランス分化するために骨髄付着幹細胞の少なくとも一部を誘導するのに十分な量の神経膠調節剤とともに骨髄付着幹細胞をインキュベートする；
    を含み、
    但し相互作用がノッチ細胞内ドメインによる骨髄付着幹細胞のトランスフェクションを包含しない
    前記方法。
  12. 骨髄付着幹細胞が、ヒト骨髄付着幹細胞、ラット骨髄付着幹細胞、マウス骨髄付着幹細胞、霊長類骨髄付着幹細胞、ブタ骨髄付着幹細胞、ウシ骨髄付着幹細胞およびヒツジ骨髄付着幹細胞からなる群から選択される、請求項１１記載の方法。
  13. 前記インキュベーションが骨髄付着幹細胞への神経膠調節剤のトランスフェクションを包含する、請求項１１記載の方法。
  14. 前記神経膠調節剤が神経膠原性因子のためのシグナル伝達経路を妨害する阻害剤またはアンタゴニストまたは作用物質を含む、請求項１１記載の方法。
  15. 前記神経膠調節剤が神経形成のためのアゴニストを含む、請求項１１記載の方法。
  16. 前記神経膠調節剤が、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤；ＳＴＡＴ１またはＳＴＡＴ３の阻害剤；４‐（４’‐ヒドロキシフェニル）アミノ‐６，７‐ジメトキシキナゾリン；骨形態形成タンパク質２または骨形態形成タンパク質のアンタゴニスト；ノギン、コルジン、フォリスタチン、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）を発現する遺伝子からの遺伝子産物の全部または一部、あるいはこれらの遺伝子のアゴニスト；Ｈｅｓ遺伝子；Ｈｅｓ１またはＨｅｓ５阻害剤；Ｉｄ‐１の阻害剤；ショウジョウバエｇｌｉｄｅ／ｇｃｍの哺乳類相同体の阻害剤；Ｓｏｘ９の阻害剤；ニューロゲニン３の阻害剤；ＣＮＴＦの阻害剤；Ｗｎｔ１、ニューロゲニン１、Ｍａｓｈ１、Ｍａｔｈ１、Ｍａｔｈ６またはニューロＤを発現する遺伝子からの遺伝子産物の全部または一部、あるいはそれらのアゴニストを含む、請求項１１記載の方法。
  17. 以下の：
    ニューロン始原細胞特性を示す細胞を単離し；そして
    それらを患者に投与する
    ことをさらに包含する、請求項１１記載の方法。
  18. 骨髄付着幹細胞が臍帯血から得られる、請求項１１記載の方法。
  19. 骨髄付着幹細胞が骨髄から得られる、請求項１１記載の方法。
  20. 請求項１記載の方法に従って作製されるニューロン始原細胞特性を示す細胞。
  21. 請求項１１記載の方法に従って作製されるニューロン始原細胞特性を示す細胞。
  22. 以下の：
    請求項２０記載のニューロン始原細胞特性を示す細胞を患者に投与する
    ことを包含する方法。
  23. 以下の：
    請求項２１記載のニューロン始原細胞特性を示す細胞を患者に投与する
    ことを包含する方法。
  24. 以下の：
    請求項１記載のニューロン始原細胞特性を示す細胞を提供し；そして
    ニューロン始原細胞特性を示す細胞を少なくとも1つの神経栄養因子と併合するが、この場合、ニューロンの1つまたは複数の特性を示す細胞へのニューロン始原細胞特性を示す細胞の分化を促すのに有効な量で少なくとも1つの神経栄養因子が存在する
    ことを包含する方法。
  25. 以下の：
    ニューロンの1つまたは複数の特性を示す細胞を単離する
    ことをさらに包含する、請求項２４記載の方法。
  26. 少なくとも1つの神経栄養因子が塩基性繊維芽細胞増殖因子、毛様体神経栄養因子またはフォルスコリンを含む、請求項２４記載の方法。
  27. 請求項２４記載の方法に従って産生されるニューロンの1つまたは複数の特性を示す細胞。
  28. 以下の：
    請求項２４記載のニューロンの1つまたは複数の特性を示す細胞を患者に投与する
    ことを包含する方法。
  29. 以下の：
    請求項１１記載のニューロン始原細胞特性を示す細胞を提供し；そして
    ニューロン始原細胞特性を示す細胞を少なくとも1つの神経栄養因子と併合するが、この場合、ニューロンの1つまたは複数の特性を示す細胞へのニューロン始原細胞特性を示す細胞の分化を促すのに有効な量で少なくとも1つの神経栄養因子が存在する
    ことを包含する方法。
  30. 以下の：
    ニューロンの1つまたは複数の特性を示す細胞を単離する
    ことをさらに包含する、請求項２９記載の方法。
  31. 少なくとも1つの神経栄養因子が塩基性繊維芽細胞増殖因子、毛様体神経栄養因子またはフォルスコリンを含む、請求項２９記載の方法。
  32. 請求項２９記載の方法に従って産生されるニューロンの1つまたは複数の特性を示す細胞。
  33. 以下の：
    請求項２９記載のニューロンの1つまたは複数の特性を示す細胞を患者に投与する
    ことを包含する方法。
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