KR20070015542A

KR20070015542A - 뉴런의 전구 세포 특징들을 나타내는 세포

Info

Publication number: KR20070015542A
Application number: KR1020067021240A
Authority: KR
Inventors: 마리 데자와
Original assignee: 산바이오 인코포레이티드
Priority date: 2004-04-12
Filing date: 2005-04-07
Publication date: 2007-02-05
Also published as: WO2005100552A2; PT1737950E; ATE523587T1; CA2562198A1; CN1973031B; US9441199B2; DK1737950T3; CA2562198C; EP1737950B1; PL1737950T3; CA2929754A1; US20110229442A1; KR20130062359A; CN1973031A; JP5756039B2; US20150267169A1; EP1737950A2; US20060251624A1; JP2012130348A; WO2005100552A3

Abstract

본 발명은 뉴런의 전구 세포 특징들을 나타내는 세포들 및 골수 부착 줄기 세포들의 신경교 이행 분화와 관련이 있는 골수 부착 줄기 세포들에 있어서 세포 경로를 조절함으로써 골수 부착 줄기 세포로부터 그것들을 만드는 방법을 개시하고 있다.

뉴런, 골수 부착 줄기 세포, 신경교 이행 분화

Description

뉴런의 전구 세포 특징들을 나타내는 세포{CELLS EXHIBITING NEURONAL PROGENITOR CELL CHARACTERISTICS}

본 발명은 뉴런의 전구 세포 특징을 나타내는 세포 및 골수 부착 줄기 세포(marrow adherent stem cells)의 신경교의(glial) 이행분화능(trnasdifferentiation)과 관련이 있는 골수 부착 줄기 세포에서 세포 경로를 조절함으로써 골수 부착 줄기 세포로부터 그것을 만드는 방법에 관한 것이다.

중추신경계(Central Nervous System, CNS) 또는 말초신경계(Peripheral Nervous System, PNS) 질병의 연구 및 치료에 있어서의 한계는 최종적으로 분화되는 뉴런들의 증식 능력이 현저하게 제한되어 있다는 전통적인 인식이다. 따라서, 최종적으로 분화되는 뉴런들의 이식이 요구되는 CNS 또는 PNS 질병의 치료는 성취되기 어렵다.

이러한 어려움을 극복하는 한가지 제안되는 접근은 뉴런의 전구 세포 특징(neuronal progenitor cell characteristics)을 나타내는 수많은 유사분열 세포들("CPCs")을 배양하는 것이다. 그런 세포들은 이론적으로 in vivo에서 CNS 및/또는 PNS 질병 치료의 기능을 할 수 있는 뉴런으로 분화될 수 있다. 그 대신에, CPCs는 in vitro에서 뉴런으로 분화될 수 있었다. 그러므로, 전통적으로 연구자들은 처 치된 배아 및 태아 줄기 세포(여기서부터는 배아 줄기 세포라 부릅니다)로부터 CPCs를 획득하려는 시도를 하였다.

다전능 세포(pluripotent cells)인 배아 줄기 세포(embryonic stem cells)는 매우 다양한 조직 타입을 생성시키는데 이용되어 왔고, CPCs의 원천이 될 수 있다 (Weissman, Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution (Review)., Cell 100, 157-168, 2000). 그러나, 배아 줄기 세포의 이용은 수많은 윤리적인 문제를 일으켜서, CPCs 생산을 위한 줄기 세포의 원천으로 기피되고 있다. 추가적으로, 배아 줄기 세포는 발암성이 될 수 있어서, 이는 배아 줄기 세포로부터 CPC 이식의 생성과 같이 환자에게 잠재적으로 배아줄기세포의 수송을 초래할 수 있는 어떤 이식 과정이기 때문에 안전성에 대한 관심이 발생된다.

몇몇 연구자들은 CPCS의 생산에 있어서 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cells)와 같이 줄기 세포의 다른 타입들을 이용하려는 시도를 하고 있다. 미국특허출원 20030003090 (Prockop, 등., 2003년 1월 2일 출원, "골수 줄기 세포들의 신경세포 전구체체들로의 in viro에서의 직접적인 분화")는 NSE 및 비멘틴(vimentin)의 발현 수준은 0.5 millimolar IBMX 및 1 millimolar dbcAMP로 배양시킨 후에 인간 중간엽 줄기 세포에서 증가되었음을 개시하고 있다. NSE 및 비멘틴 mRNAs에서의 증가는 배양에서의 신경 세포의 외관과 일치하였다. 그러나, Prockop 등은 MAP1 B 또는 TuJ-1의 발현 수준에 있어서 어떠한 변화가 없었음을 보고하였다. NSE, MAP1 B, 및 TuJ-1은 초기 뉴런-특징적인 마커들이며, 비멘틴은 신경교(glia)의 초기 마커이며, Prockop 등은 hMSCs는 in vitro에서 뉴런 또는 신경교의 몇몇 초기 전구체들로 이행분화(transdifferentiation)된다고 제안하였다. 그러나, Prockop의 초기 전구 세포들을 이용하는 것은 바람직하지 못한데, 이는 임상적 효능이 잘 이해되지 않는 매우 미성숙한 뉴런 표현형을 나타내는 것 같기 때문이다.

따라서, 이용을 위한, 예를 들어 CNS 또는 PNS 질병의 연구 및 치료에 있어서 전통적으로 이용가능하고 적절한 CPCs의 원천이 결핍되어 있다. 게다가, 이용을 하기위한 적절한 방법에 있어서 그런 CPCs를 생산하는데 이용될 수 있는 방법이 결핍되어 있다. 필요한 것은 그런 문제들을 극복하는 방법 및 조성물이다.

발명의 요약

한 측면에서, 본 발명은 골수 부착 줄기 세포들을 포함하는 물질로부터 뉴런의 전구 세포 특징들을 나타내는 세포를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 그 방법은 다음을 포함한다: 골수 부착 줄기 세포의 신경교의 이행분화능과 관련된 골수 부착 줄기 세포에 있어서 세포 경로를 조절하는 것; 여기에서 세포 경로는 골수 부착 줄기 세포의 적어도 한 부분이 뉴런의 전구 세포 특징들을 나타내는 세포들로의 이행분화를 유발하도록 충분히 조절되는 것이고; 그 조절은 골수 부착 줄기세포의 노치 세포내 도메인(notch intracellular domain)으로의 트랜스펙션을 포함하지 않는 조건이다.

다른 측면에서, 본 발명은 뉴런의 전구 세포 특징을 나타내는 세포를 생산하는 방법에 관한 것으로 다음을 포함한다: 골수 부착 줄기 세포의 적어도 한 부분이 뉴런의 전구 세포 특징을 나타내는 세포로의 이행분화를 유발하는데 충분한 양으로 신경교 조절제로 골수 부착 줄기 세포를 배양하는 것; 그 상호작용은 골수 부착 줄기 세포가 노치 세포내 도메인(notch intracellular domain)으로의 트랜스펙션을 포함하지 않는 조건이 있다.

발명의 상세한 설명

본 발명자들은 기대치않게 그리고 놀랍게도 상기에서 인식된 문제점들 및 한계들이 여기에서 개시된 발명을 실천함으로써 극복될 수 있음을 발견하였다. 본 발명은 MASCs(marrow adherent stem cells)의 신경교의 이행분화능과 관련이 있는 MASCs에서의 세포 경로를 조절함으로써 MASCs로부터 CPCs의 생산을 청구한다. 여기에는 본 발명의 제조 및 이용하는 방법이 개시되어 있다.

여기에서 인용된 모든 참고문헌들은 온전히 참고문헌으로서 여기에 통합되어 있고, 각각의 개별적인 공개 또는 특허 또는 특허출원처럼 동일한 범위로 모든 목적들을 위해 온전히 참고문헌에 의해 통합됨을 특별하게 그리고 개별적으로 지시되어 있다. 여기의 참고문헌들의 논의는 단지 그것들의 저자들에 의한 주장들을 요약하는 것으로 간주되고 어떤 참고문헌도 선행 기술을 구성하는 것으로 승인되지 않는다.

출원인들은 인용된 참고문헌들의 정확성 및 타당성을 의심할 권리를 보유한다.

본 발명의 목적을 위해서, 뉴런의 전구 세포 특징을 나타내는 세포들("CPCs")는 유사분열하고 네스틴(nestin) 및 신경의 전구체(precursor)/신경의 전구(progenitor) 세포들에 특이적인 다른 세포 마커들을 표현하는 세포로서 정의되고, MASCs로부터 유래된다. CPCs는 뉴런, 신경교 및 희소돌기교세포(oligodendrocytes), 이들의 어느 하나의 전구체로 분화할 수 있다. CPCs는 여기에서 개시된 방법들에 따라 MASCs로부터 유래될 수 있다. 하나의 구체예에서, 인간 CPCs는 EfnB2+, CD90- 및 PDGF 수용체 베타-이다. 이들 마커들은 본 발명에 따른 MASCs의 신경교의 이행분화를 이끄는 FACS를 이용하여 MASCs로부터 CPCs를 분리하기는데 사용된다. CPCs를 다루는데 적절한 방법은 예를 들어 공개된 미국특허출원 20020012903(Goldman et al.)에 개시된 방법들을 포함하여 전통적으로 알려져있다.

일반적으로, 본 발명에 따른 CPCs는 MASCs의 신경교의 이행분화와 관련이 있는 MASCs에서 세포 경로를 조절함으로써 생산되는데, 상기 세포 경로는 MASCs의 적어도 한 부분이 CPCs로 이행분화를 유발시키도록 충분히 조절되는 조건이다.

매우 다양한 조절 방법들이 본 발명의 실시에 유용하다. 이들은 만약 ex vivo에서 자란다면, 세포들이 자라는 배지 및 조건들을 변형시키고; 만약 in vivo에서 자란다면 MASCs가 존재하는 조적 환경을 변형시키고; 또는 신경교 조절제들로 MASCs의 배양을 포함하고 여기에 제한되지는 않는다. MASCs의 신경교의 이행분화가 효과적으로 조절되어 MASCs가 CPCs로 분화가 된다면 조절의 정확한 방법은 본 발명의 목적을 위해 중요하지 않다. 일반적으로, MASCs의 신경교의 이행분화와 관련이 있는 MASCs에서의 세포 경로 조절은 유사분열 및 생존가능한 상태에서 어느 MASCs 또는 CPCs라도 유지하는데 적절한 조건하에서 일어난다. 그런 조건들은 당업자에게 알려져있고, 예를 들면 칼로스 등(Kallos et al., Large-scale expansion of mammalian neural stem cells: a review. Med Biol Eng Comput. 2003 May;41 (3):271-82)에서 발견된다. 적절한 조건들 및 기술들은 또한 세포 배양 및 in vivo 환경에 대한 저서 어디에서도 찾을 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, MASCs의 신경교의 이행분화와 관련이 있는 MASCs에서의 세포 경로 조절은 신경교 조절제들로 MASCs를 배양함으로써 성취된다. 더욱 바람직한 구체예에서, MASCs의 신경교의 이행분화와 관련이 있는 MASCs에서의 세포 경로 조절은 MASCs의 적어도 한 부분이 CPCs로 이행분화를 유도할 만큼의 충분한 양으로 신경교 조절제들로 MASCs를 배양함으로써 성취된다. 본 발명에서의 배양은 신경교 조절제의 존재하에서 신경교 조절제가 MASC 세포표면 수용체들과 상호작용하거나 내부의 세포 경로들과 상호작용하는 MASCs의 내부로 수송되는 것을 목적으로 MASCs를 배양하는 것을 포함한다.

그런 수송은 확산 수송과 같이 수동적이거나 능동 수송체를 통하는 것과 같이 능동적이거나 그 둘 모두이다. in vitro 배양은 전통적인 방법으로 수행되고, 예를 들어 신경교 조절제(들)가 첨가되는 α-MEM 또는 그 유사한 배지에서 MASCs의 컬쳐를 배양하는 것이다. 적절한 배양 기술은 예를 들어 M 칼로스 등(M Kallos et al., Large-scale expansion of mammalian neural stem cells: a review. Med Biol Eng Comput . 2003 May;41(3):271-82)을 포함한 저서에서 일반적으로 볼 수 있다. 배양은 또한 본 발명에 따른 신경교 조절제가 전신적으로 또는 국소적으로 투여되는 경우에 in vivo 환경에서 일반적인 방법을 이용하여 일어난다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 만약 신경교 조절제가 단백질 또는 펩티드라면, 배양의 방법은 그 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 DNA의 MASCs로의 트랜스펙션(transfection)이된다. 트랜스펙션은 상업적으로 입수할 수 있는 트랜스펙션 프로토콜, 이를테면 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 입수되는 리포펙타민^TM 2000 시스템(Lipofectamine^TM 2000 system) 또는 퀴아젠(Qiagen)으로부터 입수되는 이펙틴^TM 트랜스펙션 시스템(Effectene^TM transfection system) 또는 다른 상업적인 트랜스펙션 프로토콜을 이용하여 수행된다.

배양의 또 다른 바람직한 구체예에 있어서, 만약 신경교 조절제가 단백질 또는 펩티드라면, 배양 방법은 상업적인 생존 벡터들, 이를테면 적절한 발현을 위한 렌티바이러스의 벡터 시스템(Lentiviral vector systems, BLOCK-iT^TM Lentiviral RNAi Expression System, Invitrogen) 및 일시적인 발현을 위한 아데노바이러스의 벡터 시스템(BLOCK-iT^TM Adenoviral RNAi Expression System, Invitrogen)을 이용하여 신경교 조절제의 바이러스 수송이 된다.

배양은 다양한 시간에서 일어날 수 있다: 다양한 신경교 조절제(들)로 MASCs의 연속적으로, 병행하거나 연속 및 병행 배양의 조합.

본 발명의 구체예에서, MASCs의 신경교의 이행분화와 관련이 있는 MASCs에서의 세포 경로 조절은 노치 유전자(Notch gene)의 세포내 도메인으로 MASCs의 트랜스펙션을 포함하지 않는 조건이 있다. 본 발명의 구체예에서, 신경교 조절제로 MASCs를 배양하는 것은 노치 유전자의 세포내 도메인으로 MASCs의 트랜스펙션을 포함하지않는 조건이 있다.

본 발명의 목적을 위하여, 골수 부착 줄기 세포(MASCs)는 연계 조직에서 일차적으로 발견되는 골모세포(osteoblasts), 지방세포(adipocytes), 연골세포(chondrocytes) 및 근육세포(myocyte)을 포함하는, 그러나 여기에 제한되지 않는 세포들의 몇몇 타입으로 분화되는 것으로 상업적으로 인식되는 줄기세포들을 의미한다.

MASCs는 특별하게 배아줄기세포 및 태아줄기세포를 제외한다. MASCs는 인간 및 다른 포유류들, 이를테면, 쥐, 생쥐, 영장류(primates), 돼지, 소, 및 양을 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는 다양한 종류의 동물로부터 수득된다. MASCs는 다양한 조직에서 수득된다; 바람직한 원천은 골수 및 제대혈(cord blood)을 포함한다. MASCs를 위한 유용한 원천 및 그들을 수득하는 방법들은 하기의 실시예 1 및 여기의 다른 곳에서 기재하고 있다.

하나의 구체예에서, 본 발명의 수행에 있어서 유용한 인간 MASCs는 CD29 및 CD90을 발현하지만 CD15, CD34,CD11b/c, CD31, CD45 및 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand Factor)는 부정적이다.

하나의 구체예에서, MASCs는 저서에서 기재한 기술을 이용하여 제대혈로부터 분리된다. 예를 들어 C. 캠파그놀리 등(C. Campagnoli et al., Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood, liver, and bone marrow. 1: Blood. 2001 Oct 15;98 (8):2396-402)은 태아 혈액으로부터 MASCs를 수득하는데 유용한 방법들을 기재하고 있다. A. 에리스 등(A. Erices et al., Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. 1: Br J Haematol. 2000 Apr;109(1):235-42)은 제대혈로부터 MASCs를 수득하는데 있어서 일반적으로 유용한 방법들이 기재되어 있다. L.휴 등(L. Hou et al., Induction of umbilical cord blood mesenchymal stem cells into neuron-like cells in vitro. Int J Hematol . 2003 Oct;78(3):256-61)에는 정제되고 증가된 인간 제대혈 MASCs를 수득하는데 일반적으로 유용한 방법들을 기재하고 있다.

본 발명의 목적을 위한 신경교 조절제들은 다른 특징들 중에서 신경교세포로의 MASCs의 이행분화를 억제하고 CPCs로 그들의 이행분화능을 촉진하는 특징을 소유하는 물질로서 정의된다. 신경교 조절제들은 신경교 운명에서 MASCs로 향하게하는 다양한 메카니즘을 통해 행동한다. 예를 들어, 프로-신경의 bHLH(basic helix-loop-helix) 트랜스펙션 인자들, 이를테면 Mash 1, Math 1 및 뉴로게닌 1(neurogenin 1)은 뉴런의 유전자 발현의 활성제인 것으로 믿어진다.

프로뉴럴 유전자들(proneural genes)은 신경교의 이행분화를 억제하는 동안 MASCs의 뉴런의 이행분화를 조종하는 것으로 믿어진다. 신경교의 이행분화를 억제시키는 하나의 메카니즘은 STAT-매개된 신호 도입의 조절을 통하는 것이다. STAT에 의한 신호 도입은 티로신 키나아제의 야누스 패밀리(JAK)에 의해 촉매되는 것으로 믿어지는 인산화에 의해 촉발되는 것으로 믿어진다. 그러므로 JAK-STAT 신호 도입의 억제가 신경교의 이행분화를 조절하고 MASCs의 뉴런의 운명을 촉진시킨다.

본 발명에 따른 신경교 조절제는 아교세포발생 인자들(gliogenic factors)을 위한 신호 경로를 방해하는 억제제들 또는 안타고니스트들(antogonists) 또는 작용제들을 포함한다. 신경교 조절제들은 또한 신경조직발생(neurogenesis)을 위한 신경성 인자들(neurogenic factors)을 포함한 아고니스트(agonists)를 포함한다. 이들 아고니스트들 또는 인자들의 이용은 본 발명의 실행에 있어서 MASCs의 아교세포발생(gliogenesis)을 부정적으로 조절한다. 본 발명의 실행에 따른 신경교 조절제들은 작은 분자들, 펩티드들, 및 유전자 산물의 전체 또는 부분을 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는 치료적인 물질의 상업적 형태를 포함한다.

하나의 구체예에서, 본 발명에 따른 신경교 조절제들은 STAT1 및 STAT3의 억제제들을 포함하는 JAK/STAT 억제제들을 포함하나 여기에 제한되지 않는다.

명백한 구체예에서, 그러한 JAK/STAT 억제제들은 JAK/STAT 경로의 유전자 침묵을 위한 RNAi, JAK/STAT 경로를 하향 조절하는 안티센스 올리고뉴클레오티드들, 또는 소분자 JAK 억제제 4-(4'-하이드록시페닐)아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린(4-(4'- hydroxyphenyl) amino-6,7-dimethoxyquinazoline)을 포함한다. 추가적인 JAK/STAT 억제제들은 2004년 10월 21일자로 공개된 조지 바시오스의 미국특허출원 20040209799 및 2004년 3월 18일자에 공개된 후아 유 등의 미국특허출원 20040052762 에 개시되어 있다.

하나의 구체예에서, 본 발명에 따른 신경교 조절제들은 BMP2 또는 7(골 형태발생 단백질)의 안타고니스를 포함하지만, 여기에 제한되지 않는다.

그런 안타고니스트들은 노긴(Noggin), 초르딘(Chordin), 폴리스타틴(Follistatin), 소닉 헤지호그(sonic hedgehog, SHH)를 발현시키는 유전자로부터의 유전자 산물의 전체 또는 부분 또는 이들 유전자들의 아고니스트들을 포함한다.

하나의 구체예에서, 본 발명에 따른 신경교 조절제들은 Hes1 및/또는 Hes5 억제제들을 포함하지만 이에 제한되지 않는 Hes 억제제들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 명백한 구체예에서, 그런 Hes 억제제들은 Hes의 유전자 침묵을 위한 RNAi 또는 Hes 하향 조절하는 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 포함한다.

하나의 구체예에서, 본 발명에 따른 신경교 조절제들은 Id-1의 억제제들을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. S. 트젠그 등(S. Tzeng et al., Id1, Id2, and Id3 gene expression in neural cells during development. Glia., 1998 Dec;24(4):372- 81)을 보라. 명백한 구체예에서, 그런 Id-1 억제제들은 Id-1의 유전자 침묵을 위한 RNAi 또는 Id-1를 하향조절하는 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 포함한다.

하나의 구체예에서, 본 발명에 따른 신경교 조절제는 Gcm1(쥣과) 또는 GCMB(인간)을 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는 노파리 glide/gcm (glial cells missing)의 포유류의 유사체의 억제제들을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. Y. 이와사키 등(Y. Iwasaki et al., The potential to induce glial differentiation is conserved between Drosophila and mammalian glial cells missing genes., Development. 2003 Dec;130(24):6027-35. Epub 2003 Oct 22) 및 M. 카멜에르 등(M. Kammerer et al., GCMB, a second human homolog of the fly glide/gcm gene. Cytogenet Cell Genet. 1999;84(1-2):43-7)을 보라. 명백한 구체예에서, 그런 glide/gcm 유사체(homolog) 억제제들은 glide/gcm 유사체들(이를테면 Gcm1(쥣과) 또는 GCMB(인간))의 유전자 침묵을 위한 RNAi 또는 glide/gcm 유사체들(이를테면 Gcm1(쥣과) 또는 GCMB(인간))을 하향 조절하는 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 포함한다.

하나의 구체예에서, 본 발명에 따른 신경교 조절제들은 희소돌기아교세포(oligodendrocyte) 계통을 위한 전사인자인 Sox9의 억제제들을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. C. 스톨트 등(C. Stolt et al., The Sox9 transcription factor determines glial fate choice in the developing spinal cord., Genes Dev . 2003 Jul1;17(13):1677-89)을 보라. 명백한 구체예에서, 그런 Sox9 억제제들은 Sox9의 유전자 침묵을 위한 RNAi 또는 Sox9을 하향조절하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

하나의 구체예에서, 본 발명에 따른 신경교 조절제들은 아교세포발생(gliogenesis)을 위한 전사인자인 뉴로게닌3(Neurogenin3)의 억제제들을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 명백한 구체예에서, 그런 뉴로게닌3 억제제들은 뉴로게닌3의 유전자 침묵을 위한 RNAi 또는 뉴로게닌3을 하향조절하는 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 포함한다.

하나의 구체예에서, 본 발명에 따른 신경교 조절제들은 섬모 향신경성 인자(ciliary neurotrophic, CNTF)의 억제제들을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 명백한 구체예에서, 그러한 CNTF 억제제들은 CNTF의 유전자 침묵을 위한 RNAi 또는 CNTF를 하향조절하는 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 포함한다.

명백한 구체예에서, 신경교 조절제들은 아교생성을 강하제 억제하는 Wnt1을 발현하는 유전자들로부터의 유전자 산물의 전체 또는 부분을 포함한다. K. 탕 등(K. Tang et al., Wnt-1 promotes neuronal differentiation and inhibits gliogenesis in P19 cells., Biochem Biophys Res Commun. 2002 Apr 26;293(1 ):167- 73)을 보라. Wnt1을 발현하는 유전자로부터 유전자 산물들의 전체 또는 부분들은 트랜스펙션 또는 다른 전통적인 방법들, 이를테면 바이러스 벡터들을 포함한 유전자 치료법에 의해 투여된다.

명백한 구체예에서, 신경교 조절제들은 신경조직을 형성하는 동안 유익한 역할을 하거나 CPCS를 증식으로 발현되는 신경의 bHLH(basic helix-loop- helix) 인자들의 서브세트를 발현하는 유전자로부터 유전자 산물의 전체 또는 부분을 포함한다. 그러한 신경교 조절제들은 뉴로게닌1(Neurogenin1), Mash1, Math1 또는 뉴로D(NeuroD)를 발현하는 유전자로부터 유전자 산물들의 전체 또는 부분들을 포함한다.

뉴로게닌1(Neurogenin1), Mash1, Math1 또는 뉴로D(NeuroD)를 포함하나 이에 한정되지 않는 신경의 bHLH 인자들의 서브세트를 발현하는 유전자로부터 유전자 산물들의 전체 또는 부분들은 트랜스펙션 또는 다른 전통적인 방법들, 이를테면 바이러스 벡터들을 포함하는 유전자 치료법에 의해 투여된다.

추가적으로, 신경교 조절제들은 단일 또는 조합하여 투여된다. 바람직한 구체예에서, 만약 신경교 조절제들의 조합이 본 발명의 실행에서 이용된다면, 그때 다양한 신경교 조절 경로에서 행동하는 신경교 조절제들이 선택된다. 이는 신경교 조절제들의 신경교 조절효과를 전반적으로 강화시킨다.

본 발명의 목적을 위하여 CPCs 분리는 CPCS로 이행분화되지 않은 MASCs와 같은 샘플에서 비-CPC 세포들로부터 CPCs를 분리하는 것을 포함한다. 그런 분리는 단일 분리 또는 다중 분리들을 포함한다. 만약 다중 분리들이 수행된다면, 분리의 다양한 타입들 또는 기술들이 이용되는데, 이는 그러한 분리의 다양한 타입 또는 기술들이 분리 결과를 강화시킨다. 다양한 분리방법들이 본 발명의 실행에 있어서 유용하다. 그런 분리 방법의 예들은 유체 세포측정법(flow cytometry, aka FACS sorting), 자기 분리 기술(magnetic separation techniques), 및 시각적인 솔팅(visual sorting)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 면역세포화학(Immunocytochemistry)이 세포 생존능이 위험하지 않은 경우에 이용된다.

FACS 솔팅은 전통적인 FACS 장비 및 CPCS의 하나 이상의 특징들과 관련이 있는 에피토프에 특이적인 항체를 가진 프로토콜을 이용하여 수행될 수 있다. 하나의 그러한 에피토프는 인간 CPCS의 경우에는 EfnB2이다(N. Ivanova et al., A stem cell molecular signature. Science 298(5593):601-4, Oct 18,2002). 본 발명의 실행에 있어서 추가적으로 유용한 항체들은 비록 FACS 솔팅을 위해서는 필수적이 아니지만 항-CD15, 항-CD29, 항-CD34, 항-CD90, 항-CD31, 항-CD45, 항-CD11b/c 및 항-폰 빌레브란트 인자(von Willebrand Factor)를 포함한다. 본 발명의 실행에 있어서 유용한 세포 파풀레잉션 FACS 장비는 CellQuest^TM 소프트웨어를 가진 FACScalibur^TM 분석기(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), 또는 구아바 기술(Guava Technologies, Hayward, California)로부터 입수할 수 있는 FACS 장비가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.

대안으로, 분리는 자기 분리 기술, 이를 테면 퀴아젠(Qiagen)으로부터 키트 형태로 입수할 수 있는 BioMag^TM 프로토콜 및 시약들을 이용하여 수행된다. 면역세포화학은 본 발명의 실행에 있어서 유용한 또다른 분리 기술이다; 유용한 면역세포화학은 M. 데자와 등(Dezawa et al., Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromal cells. Eur , J. Neurosci., 14, 1771-1776, 2001)에 기재되어 있다.

면역세포화학적인 정밀검사는 공초첨 레이져 스캐닝 현미경, 이를테면 Radians 2000 (Bio-Rad, Hertfordshire, UK)하에서 수행된다. 상업적인 시각적 세포 솔팅 기술들은 본 발명의 실행에서 이용된다.

본 발명의 목적을 위한 뉴런은 뇌, 척주(spinal column), 신경을 구성하는 충격-전달 세포들 중의 하나로서, 하나 이상의 가지돌기(dendrites) 및 단일 액손으로 핵 세포체로 구성되는 것으로서 정의된다.

생화학적으로, 뉴런은 신경섬유-M, β-3-투불린 및 TuJ-1을 위한 항체와 반응하는 것에 의해 특징된다. 이들 반응들은 FACS 솔팅과 같은 기술을 이용하여 뉴런 또는 하나 이상의 뉴런의 특징들을 나타내는 세포를 분리하는데 이용된다. 신경 세포들은 또한 신경전달물질(neurotransmitters), 신경전달물질 합성효소 또는 신경전달물질-관련 단백질들, 예를들어 뉴로펩티드 Y 및 물질 P를 분비하는 것에 의해 특징지어진다.

본 발명의 목적을 위한, 향신경성제(Neurotrophic agents)들은 다른 특징들중에서 CPCs의 뉴런 또는 뉴런의 하나 이상의 특징을 나타내는 세포들로의 분화를 야기 또는 촉진시키는 특징을 가지는 물질로서 정의된다. 본 발명의 실시에 있어서 유용한 향신경성제들은 섬유아세포 성장인자(basic-fibroblast growth factor, bFGF), 섬모 향신경성 인자(ciliary neurotrophic factor, CNF) 및 포스콜린(forskolin)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 향신경성제들은 당업계에 알려진 기술을 다루는 세포를 이용하여 본 발명의 CPCs와 결합된다. 바람직한 방법들은 일반적으로 데자와 등의 PCT/JP03/01260에서 일반적으로 볼 수 있다. 바람직한 구체예에서, bFGF, CNTF 및 FSK는 CPCs의 뉴런 또는 뉴런의 하나 이상의 특징을 나타내는 세포들로의 분화를 야기 또는 촉진시키는데 효과적인 양으로 세포 배양에서 CPCs와 결합된다.

본 발명의 목적을 위한, 교세포들(Glial cells)은 중추 신경계의 조직을 뒷받침하는 파생된 세포들 및 섬유들의 네트워크를 구성하는 세포들 중 하나를 의미한다. 교세포들은 별아교세포(astrocytes), 신경집세포(Schwann cells), 희소돌기아교세포(oligodendrocytes) 및 미세아교세포(microglia)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 목적을 위한 유전자는 연결된 전사체의 세트로 정의되고, 여기에서 전사체는 프리-mRNA 스플라이싱에 의해 (임의적으로) 뒤따르는 전사를 통해 생산되는 엑손의 세트이다. 본 발명의 목적을 위한 유전자 산물은 유전자로부터 번역된 단백질로 정의된다. 본 발명의 목적을 위한 유전자의 부분은 유전자의 서브세트로 정의된다.

본 발명의 목적을 위한 유전자 산물의 부분들은 유전자 산물의 서브세트로 정의된다.

환자는 의료 진찰 또는 연구의 주체인 동물, 전형적으로 포유류, 더욱 전형적으로는 인간을 의미한다.

본 발명에 따라 생산된 CPCs는 환자에게 다양한 방법들을 통해 투여되는데, 캐뉼러(cannula), 바늘, 단락(shunt) 주사를 통한 주입, 또는 담체, 예로 생분해성 캡슐과 같이 피하주사를 통해 투여되는데 이에 제한되지는 않고, 그러나 투여의 다른 경로들은 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 투여의 창의적인 경로는 국소 또는 전신적인 경로를 포함한다. 국소 투여는 바람직하게 CNS 또는 PNS의 표적된 부위의 투여를 포함하고, 바람직하게는 실질내(intraparenchymal) 경로를 포함한다.

투여의 전신적인 경로는 전신적인 투여의 바람직한 경로로서 정맥(intravenous, i.v.) 또는 동맥내(intra-arterial, 이를테면 내부 또는 외부의 목동맥) 투여와 같은 비경구적(parenteral) 경로를 포함한다. 전신적 투여 기술은 일반적으로 전구 세포들을 투여하기 위해 이용되는 기술들(D Lu et al. , Intraarterial administration of marrow stromal cells in a rat model of traumatic brain injury. J Neurotrauma . 2001 Aug;18(8):813-9)로부터 습득될 수 있다.

환자에게 투여되는 CPCs의 양은 전통적인 일회 투여량 범위 기술 및 특정 환자의 질병의 임상적인 진단을 이용하여 임상적으로 결정된다.

본 발명은 본 출원에서 개시되어 있는 발명의 개별적인 측면들의 단일 기술로서 의도된 특정 구체예들의 용어에 제한되지 않는다. 본 발명의 많은 변형들 및 다양성이 그것의 정신 및 범위로부터 출발됨 없이 만들어질 수 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다. 여기에서 열거된 것들에 추가하여 본 발명의 범위 내의 기능적으로 등가의 방법들은 상위의 기재들로부터 당업자에게 명백할 것이다. 그런 변형들 및 다양화들은 청구항들의 범위 내인 것으로 간주된다. 본 발명은 그런 청구항들에 주어진 권리에 등가의 전체 범위와 함께 오직 청구항들의 용어에 의해 제한된다.

하기에서 밝히는 실시예들은 본 발명의 범위를 설명하지만 이에 제한하지 않는다.

물질들 및 방법들:

MASCs: 쥐 MASCs (Wistar strain)은 M. 데자와 등(M. Dezawa et al., Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromal cells., Eur . J. Neurosci ., 14, 1771-1776, 2001)에서 기재된 것과 같이 분리되어 배양되었다. 인간 MASCs는 상업적으로 구입된 MASCs(PT-2501, BioWhittaker. Walkersville, MD) 및 건강한 공여자로부터 획득한 MASCs가 이용되었다.

세포는 10% 소태아 혈청(FBS)을 갖는 α-MEM(Sigma, M-4526)에서 유지되었다.

건강한 공여자로부터 MASCs를 수득하는 경우에, 초기 단계는 전통적인 흡인 기술을 이용하여 건강한 공여자로부터 골수 흡인물(aspirate)을 수득한다. 세포 흡인물은 그때 50㎖ 튜브로 옮겨진다. 10㎖ 피펩을 이용하여 13㎖ 히스토파크(Histopaque)를 조심스럽게 아래에 놓는다. 그 튜브는 20분 동안 2000rpm으로 원심분리된다. 간기에서의 세포가 수확된다.

PBS가 적어도 간기의 3× 부피로 첨가되고 그 혼합물은 1200rpm에서 원심분리된다. 그 세포들은 PBS로 두번이상 세척한다.

세포 펠릿은 그때 DMEM 및 10% FCS 재현탁되고, 그리고 세포들을 카운팅하였다. 5×10⁶ 세포들이 T-75 조직 배양 플라스크마다 다시 도말하여 3일 동안 배양하였다. 4일째 날, 비-부착 세포들을 제거하고 플라스크를 배지로 3회 세척하였다. 부착된 세포들은 플라스크에서 성장하도록 하였다. 세포들이 20-30% 컨플루언스(confluence)에 도달하였을 때, 2-3 플라스크의 내용물을 채우고 하나의 T-75 플라스크에 재도말하였다.

이렇게 채워진 세포들이 컨플루언스에 도달하였을 때, 그 세포들은 0.05% 트립신 및 0.02% EDTA를 이용하여 트립신화하였다. 그 세포들은 그리고 나서 세척하였고 세포수를 세었다. 그 세포들은 시그마 α MEM + 10% FBS (M-4526)에서 재현탁되었다. 리포펙션(lipofection)이 사용되는 실험에 있어서, 배지가 I-glu를 포함하지 않도록 하는 것이 중요하다. 글루타민은 첨가되지 않았다. 그 세포들은 2-4주 동안 확장되고 초기 경과에서 냉동되었다.

쥐 및 인간 MASCs에 있는 세포 표면 마커들은 FACS(fluorescence activated cell analysis)로 분석하였다. 구체예에서, MASCs는 CD29 및 CD90을 표현하지만, CD34, CD31, CD45, CD11b/c, 및 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand Factor)를 위해서는 부정적이고, 이는 M. 피텐게르 등(M. Pittenger et al., Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284, 143-147, 1999) 및 J. 코햐마 등(J. Kohyama et al., Brain from bone: efficient "meta-differentiation" of marrow stroma-derived mature osteoblasts to neurons with Noggin or a demethylating agent. Differentiation 68, 235-244, 2001)과 일치된다 (도 1A). 동일한 결과가 면역 세포 화학에 의해 수득된다. 쥐 및 인간 MASCs 모두의 지방형성(Adipogenic), 연골발생(chondrogenic) 및 골원성(osteogenic) 분화는 M. 피텐게르 등(M. Pittenger et al., Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284, 143-147)에 의해 기재된 방법에 따라 확인된다.

FACS 분석

1×10⁷/㎖의 최종 농도에서 세포들은 PBS(phosphate buffered saline)에서 1㎎의 모노클로날 항체로 배양되었다. 배양은 비특이적 항체 결합을 막기 하여 쥐의 면역 글로불린 항체 10mg의 존재에서 수행된다. 쥐 MASCs에서, 쥐 항-CD34(Santa Cruz Antibodies) 및 햄스터 항-CD29(PharMingen, San Diego, CA)는 FITC로 표지되 고, 대조군들은 FITC-표지된 항-쥐 또는 햄스터 IgG로 배양되었다.

쥐 항-CD54 및 CD11b/c는 모두 PharMingen에서 구입할 수 있다. 본 발명의 실시에서 필요로 하는 쥐 항-폰 빌레브란트 인자 및 다른 항체들은 비-면역 마우스 혈청으로 염색된 세포들을 포함한다. 만약 이들 항체들이 FITC로 결합되면, 그 세포들은 1mg의 FITC-결합된 항-쥐 IgG로 그 후에 배양되었다. 인간 MASCs에서, 피코에리트린(phycoerythrin)으로 표지된 쥐 항-CD34, CD29, CD54, CD11b/c 및 폰 빌레브란트 인자가 이용되고, 대조군은 피코에리트린으로 표지된 항-마우스 IgG로 염색된 세포들을 포함한다. 데이터가 획득되고 CeilQuest 소프트웨어를 가진 FACScalibur(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)로 분석하였다.

면역세포화학

일반적인 과정은 M. 데자와 등(M. Dezawa et al. , Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromal cells. Eur . J. Neurosci . 14, 1771-1776, 2001)에 기재되어 있다.

PBS에서 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 세포들을 고정한 후에, 4℃에서 밤새도록 제1항체로 배양하였다. 네스틴에 대한 항체들은 PharMingen에서 상업적으로 구입할 수 있다. 세포들은 제2 항체들 Alexa Fluor 488 또는 546 결합된 항-쥐 IgG, IgM, 또는 토끼 IgG (Molecular Probes, Eugene, OR)로 실온에서 1시간 동안 배양하였고, TOTO-3 요오드화물 (Molecular Probes) 카운터 염색이 수행 되었다. 정밀 검사는 공초점 레이져 스캐닝 현미경(Radians 2000, Bio-Rad, Hertfordshire, UK)으로 수행하였다.

실시예 1:

인간 MASCs (PT-2501, BioWhittaker, Walkersville, MD)는 일반적으로 E. 슈드벡 등(Sudbeck et al., Structure-based design of specific inhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents. Clin . Cancer Res. 5, 1569-1582, 1999)에 따른 10% FBS를 함유하는 α-MEM에서 배양액에서 성장시켰다. MASCs는 40 ug/㎖ 4- (4'-하이드록시페닐)아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린(WHI - 131, Calbiochem, San Diego, CA)으로 2일 동안 배양하였다. WHI-131는 2일 후에 세척되었다.

실시예 2:

물질들 및 방법들 섹션에 따라 준비된 인간 MASCs은 E. 슈드벡 등(E. Sudbeck et al., Structure-based design of specific inhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents. Clin . Cancer Res . 5, 1569- 1582, 1999)에 따라 일반적으로 10% FBS를 포함한 α-MEM에서 배양액에서 성장시켰다.

배양액이 90% 컨풀루언스에 도달하였을 때, BLOCK-iT^TM RNAi 디자이너 (Invitrogen)을 이용하여 디자인된 몇몇 RNAs가 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 입수할 수 있는 BLOCK-iT^TM 프로토콜을 이용하여 Sox9 발현이 침묵될 정도로 충분한 시간동안 배양액으로 배양하였다.

CPCs는 항-EfnB2 (CPCs를 위한 포지티브 선택), 항-CD90 (CPCs를 위한 네거티브 선택), 및 항-PDGF 수용체 베타(CPCs를 위한 네거티브 선택)와 같은 적절한 항체들로 코팅된 자기 비즈를 이용하여 순차적인 선별에 의해 비이행분화된 MASC's로부터 분리하였다. 항체 및 코팅된 비즈들은 상업적 공급자들로부터 입수할 수 있다. PBS에서의 세포들은 1시간 동안 실온에서 코팅된 비즈로 배양되었다. 세포-둘러쌓인 비즈들은 자석을 이용하여 제거되었다. CPCs는 유리 항체로 세척되고, 10% FBS를 함유한 α-MEM에서 재현탁시키고 증식시켰다.

실시예 3:

물질들 및 방법들 섹션에 따라 준비된 인간 MASCs는 E. 슈드벡 등(E. Sudbeck et al., Structure-based design of specific inhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents. Clin . Cancer Res . 5, 1569- 1582, 1999)에 따라 일반적으로 10% FBS를 포함하는 α-MEM에서 배양액에서 성장시켰다.

Hes1에 대한 안티센스 올리고머들은 H. 뮬톤 등(H. Moulton et al., Peptide-assisted delivery of steric-blocking antisense oligomers. Curr Opin Mol Ther ., 2003Apr; 5(2): 123-32), C. 스테인 등(Stein et al., Antisense oligonucleotides as therapeutic agents--is the bullet really magical? Science. 1993 Aug 20; 261(5124): 1004-12), C. 헬렌 (C. Helene, The anti-gene strategy: control of gene expression by triplex-forming-oligonucleotides. Anticancer Drug Des. 1991 Dec;6(6):569-84) 중 어느 하나에서 개시된 기술들에 따라 생성시켰다. MASC 배양액이 90% 컨풀루언스에 도달하고, Hes-1 안티센스 올리고머들이 Hes-1 발현의 하향조절이 되도록 충분한 시간 동안 이 실시예에서 인용된 세가지 논문들 중 어느 하나에서 개시된 기술들에 따라 MASCs로 배양하였다. 초래된 CPCs는 항-EfnB2(CPCs를 위한 포지티브 선별), 항- CD90(CPCs를 위한 네거티브 선별), 및 항-PDGF 수용체 베타(CPCs를 위한 네거티브 선별)과 같은 적절한 항체들로 코팅된 자석 비즈를 이용하여 연속적 선별에 의해 비이행분화된 MASC's로부터 분리하였다. 항체들 및 코팅된 비즈들은 상업적 공급자로부터 수득된다. PBS에서의 세포들은 1시간 동안 실온에서 코팅된 비즈들로 배양되었다. 세포-둘러쌓인 비즈들은 자석을 이용해 제거되었다. CPCs는 유리 항체로 세척하고 10% FBS를 함유한 α-MEM에서 재현탁되고 증식되었다.

실시예 4:

Wnt-1 발현 플라스미드들은 M. 센 등(M. Sen et al., Regulation of fibronectin and metalloproteinase expression by Wnt signaling in rheumatoid arthritis synoviocytes. Arthritis Rheum . 2002 Nov;46(11):2867-77)에 따라 생성되었다.

물질들 및 방법들 섹션에 따라 제조된 인간 MASCs들은 E. 슈드벡 등(E. Sudbeck et al., Structure-based design of specific inhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents. Clin . Cancer Res. 5, 1569-1582, 1999)에 따라 일반적으로 10% FBS를 함유한 α-MEM에서 배양액에서 성장시켰다.

배양액이 90% 컨풀루어슨에 도달했을 때, MASCs는 37℃에서, 5% CO₂에서 2일 동안 인비트로젠(Invitrogen)에서 입수가능한 리포펙타민^TM 2000 시약 및 프로토콜을 이용하여 Wnt-1 발현 플라스미드로 배양하였다. 배양 이틀 후에, 배양액은 10일의 기간 동안 전통적인 선별 기술들을 이용하여 트랜스펙트된 세포들을 선택하였다. CPCs는 항-EfnB2(CPCs를 위한 포지티브 선별), 항-CD90(CPCs를 위한 네거티브 선별), 및 항-PDGF 수용체 베타(CPCs를 위한 네거티브 선별)과 같은 적절한 항체들로 코팅된 자석 비즈를 이용하여 연속적 선별에 의해 비이행분화된 MASC's로부터 분리하였다. 항체들 및 코팅된 비즈들은 상업적 공급자로부터 수득된다. PBS에서의 세포들은 1시간 동안 실온에서 코팅된 비즈들로 배양되었다. 세포-둘러쌓인 비즈들은 자석을 이용해 제거되었다. CPCs는 유리 항체로 세척하고 10% FBS를 함유한 α-MEM에서 재현탁되고 증식되었다.

실시예 5:

실시예 1에 따라 생산된 세포들은 20% FBS(14-501 F, Lot #61-1012, BioWhittaker Co.)를 함유한 최소 필수 배지 알파 이글 변형(Minimum Essential Mediam Alpha Eagle Modification, M4526, Sigma Co.)에 두었다. 5μM의 포스콜 린(forskolin, 344273, Calbiochem, La Jolla, CA), 10ng/㎖의 재조합 인간 섬유아세포 성장인자(bFGF, 100-18B, Peprotech EC, Ltd. , London, UK) 및 10ng/㎖의 섬모 향신경성 인자(557-NT, R&D Systems, Minneapolis, MN)가 첨가되었다. 배양액은 3일 동안 성장시켰고 뉴런의 전구 세포 특징들을 나타내는 포인트 세포들이 인식되었고, MAP-2ab-포지티브 세포들의 29.46+/-3.0%였다. MAP-2ab는 웨스턴 블럿팅을 이용하여 배양된 세포들로부터 준비된 세포 용해물 및 5%와 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동된 용해물 단백질 50ug로 분석하였다.

MAP-2에 대한 항원들은 (1:500, Chemicon)은 알칼린 포스파타제를 이용하여 측정하였다.

실시예 6:

실시예 5의 뉴런의 전구 세포 특징들을 나타내는 세포들이 수확되고, E. 슈드벡 등(E. Sudbeck et al., Structure-based design of specific inhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents. Clin . Cancer Res. 5, 1569-1582, 1999)에 따라 일반적으로 10% FBS를 포함한 α-MEM에서 배양액에서 90% 컨풀루언스가 되도록 성장시켰다.

다음, 포스콜린 5mM(344273, Calbiochem), 10ng/㎖의 섬유아세포 성장인자(bFGF, 100-18B, Peprotech EC, Ltd. , London, UK) 및 50ng/㎖의 섬모 향신경성 인자(557-NT, R&D Systems, Minneapolis, MN)가 세포 배양액에 첨가되었다.

세포들은 향신경성제의 존재하에서 10일 동안 성장시켰고, 그 후 신경 세포 들의 특징적인 형태학과 MAP-2(MAB364, Chemicon), 신경섬유(814342,Boehringer Manheim) 및 네스틴(BMS4353, Bioproducts)에 대한 항체들에 대한 포지티브 반응을 분석하였다.

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Claims

골수 부착 줄기 세포들을 포함하는 물질로부터 뉴런의 전구 세포 특징들을 나타내는 세포들을 생산하는 방법으로서, 다음을 포함하는 것인 방법:

골수 부착 줄기 세포들의 신경교의 이행분화능과 관련이 있는 골수 부착 줄기 세포들에 있어서 세포 경로를 조절하고;

여기에서 세포 경로는 골수 부착 줄기 세포들의 적어도 한 부분이 뉴런의 전구 세포 특징들을 나타내는 세포들로의 이행분화를 유발하도록 충분히 조절되고;

그 조절은 골수 부착 줄기 세포들이 노치(notch) 세포내 도메인으로의 트랜스펙션은 포함되지 않는 조건을 가지는 것.
제1항에 있어서, 골수 부착 줄기 세포들은 인간의 골수 부착 줄기 세포들, 쥐의 골수 부착 줄기 세포들, 생쥐의 골수 부착 줄기 세포들, 영장류의 골수 부착 줄기 세포들, 돼지의 골수 부착 줄기 세포들, 소의 골수 부착 줄기 세포들 및 양의 골수 부착 줄기 세포들로 구성된 그룹에서 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 그 조절은 골수 부착 줄기 세포들로 신경교 조절제의 배양인 것인 방법.
제3항에 있어서, 그 배양은 신경교 조절제의 골수 부착 줄기 세포들로의 트 랜스펙션을 포함하는 것인 방법.
제3항에 있어서, 신경교 조절제는 아교세포발생인자들(gloigenic factors)을 위한 신호 경로를 방해하는 억제제들 또는 안타고니스트들 또는 작용제들을 포함하는 것인 방법.
제3항에 있어서, 신경교 조절제는 신경조직형성(neurogenesis)을 위한 아고니스트를 포함하는 것인 방법.
제3항에 있어서, 신경교 조절제는 JAK/STAT 억제제; STAT1 또는 STAT3의 억제제; 4-(4'-하이드록시페닐)아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린; 골 형태 발생 단백질 2 또는 골 형태 발생 단백질의 안타고니스트들; 노긴(Noggin), 초르딘(Chordin), 폴리스타틴(Follistatin), 소닉 헤지호그(sonic hedgehog, SHH)를 발현하는 유전자로부터의 유전자 산물의 전체 또는 부분들 또는 이들 유전자들의 아고니스트들; Hes 억제제들; Hes 1 또는 Hes 5 억제제들; Id-1의 억제제들; 초파리 glide/gcm의 포유류의 유사체들의 억제제들; Sox9의 억제제들; 뉴로게닌3(Neurogenin3)의 억제제들; CNTF의 억제제들; Wnt1, 뉴로게닌1, Mash1, Math1, Math6, 또는 뉴로D를 발현하는 유전자들로부터의 유전자 산물들의 전체 또는 부분들 또는 그들의 아고니스트들을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 뉴런의 전구 세포 특징들을 나타내는 세포들을 분리하고; 및 그것들을 환자에게 투여하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 골수 부착 줄기 세포들은 제대혈(cord blood)로부터 유래되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 골수 부착 줄기 세포들은 골수로부터 유래되는 것인 방법.
다음을 포함하는 뉴런의 전구 세포 특징들을 나타내는 세포들을 생산하는 방법;

골수 부착 줄기 세포들을 신경교 조절제로 골수 부착 줄기 세포들의 적어도 한 부분이 뉴런의 전구 세포의 특징들을 나타내는 세포들로 이행분화되도록 유발시킬 수 있는 충분한 양으로 배양하고;

그 상호작용은 골수 부착 줄기 세포들을 노치 세포내 도메인으로의 트랜스펙션을 포함하지 않는 조건을 가지는 것.
제11항에 있어서, 골수 부착 줄기 세포들은 인간의 골수 부착 줄기 세포들, 쥐의 골수 부착 줄기 세포들, 생쥐의 골수 부착 줄기 세포들, 영장류의 골수 부착 줄기 세포들, 돼지의 골수 부착 줄기 세포들, 소의 골수 부착 줄기 세포들 및 양의 골수 부착 줄기 세포들로 구성된 그룹에서 선택되는 것인 방법.
제11항에 있어서, 그 배양은 신경교 조절제의 골수 부착 줄기 세포들로의 트랜스펙션을 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 신경교 조절제는 아교세포발생인자들을 위한 신호 경로를 방해하는 것인 억제제들 또는 안타고니스트들 또는 아고니스트들을 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 신경교 조절제는 신경조직형성을 위한 아고니스트들을 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 신경교 조절제는 JAK/STAT 억제제; STAT1 또는 STAT3의 억제제; 4-(4'-하이드록시페닐)아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린; 골 형태 발생 단백질 2 또는 골 형태 발생 단백질의 안타고니스트들; 노긴(Noggin), 초르딘(Chordin), 폴리스타틴(Follistatin), 소닉 헤지호그(sonic hedgehog, SHH)를 발현하는 유전자로부터의 유전자 산물의 전체 또는 부분들 또는 이들 유전자들의 아고니스트들; Hes 억제제들; Hes 1 또는 Hes 5 억제제들; Id-1의 억제제들; 초파리 glide/gcm의 포유류의 유사체들의 억제제들; Sox9의 억제제들; 뉴로게닌3(Neurogenin3)의 억제제들; CNTF의 억제제들; Wnt1, 뉴로게닌1, Mash1, Math1, Math6, 또는 뉴로D를 발현하는 유전자들로부터의 유전자 산물들의 전체 또는 부분들 또는 그들의 아고니스트들을 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 뉴런의 전구 세포 특징들을 나타내는 세포들을 분리하고; 및 그들을 환자에게 투여하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 골수 부착 줄기 세포들은 제대혈로부터 유래된 것인 방법.
제11항에 있어서, 골수 부착 줄기 세포들은 골수로부터 유래된 것인 방법.
제1항의 방법에 따라 제조된 뉴런의 전구 세포 특징들을 나타내는 세포들.
제11항의 방법에 따라 제조된 뉴런의 전구 세포 특징들을 나타내는 세포들.
제20항의 뉴런의 전구 세포 특징들을 나타내는 세포들을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
제21항의 뉴런의 전구 세포 특징들을 나타내는 세포들을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
제1항의 뉴런의 전구 세포 특징들을 나타내는 세포들을 제공하고; 뉴런의 전 구 세포 특징들을 나타내는 세포들을 적어도 하나의 향신경성 인자와 결합하는 것을 포함하는 방법으로서, 여기에서 적어도 하나의 향신경성 인자는 뉴런의 전구 세포 특징들을 나타내는 세포들이 뉴런의 하나 이상의 특징들을 나타내는 세포들로의 분화를 촉진시키는데 효과적인 양으로 존재하는 것인 방법.
제24항에 있어서, 뉴런의 하나 이상의 특징들을 나타내는 세포들을 분리하는 것을 더 포함하는 방법.
제24항에 있어서, 적어도 하나의 향신경성 인자는 섬유아세포 성장인자(basic-fibroblast growth factor), 섬모 향신경성 인자(ciliary neurotrophic factor) 또는 포스콜린(forskolin)을 포함하는 것인 방법.
제24항의 방법에 따라 생산된 뉴런의 하나 이상의 특징들을 나타내는 세포들.
제24항의 뉴런의 하나 이상의 특징들을 나타내는 세포들을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
제11항의 뉴런의 전구 세포 특징들을 나타내는 세포를 제공하고; 뉴런의 전구 세포 특징들을 나타내는 세포를 적어도 하나의 향신경성 인자와 결합시키는 것 을 포함하는 방법으로서, 여기에서 적어도 하나의 향신경성 인자는 뉴런의 전구 세포 특징들을 나타내는 세포들이 뉴런의 하나 이상의 특징들을 나타내는 세포들로의 분화를 촉진시키는데 효과적인 양으로 존재하는 것인 방법.
제29항에 있어서, 뉴런의 하나 이상의 특징들을 나타내는 세포들을 분리하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
제29항에 있어서, 여기에서 적어도 하나의 향신경성 인자는 섬유아세포 성장인자(basic-fibroblast growth factor), 섬모 향신경성 인자(ciliary neurotrophic factor) 또는 포스콜린(forskolin)을 포함하는 것인 방법.
제29항의 방법에 따라 생산된 뉴런의 하나 이상의 특징들을 나타내는 세포들.
제29항의 뉴런의 하나 이상의 특징들을 나타내는 세포들을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.