ES2551356T3 - Métodos y composiciones para modular la diferenciación de células pluripotenciales - Google Patents

Abstract

Un método para restringir el potencial de una célula estromal adherente de médula para diferenciarse en una célula del linaje mesenquimal, comprendiendo el método: (a) transfectar células estromales adherentes de médula con un ácido nucleico que comprende secuencias que codifican un dominio intracelular de Notch (NICD); (b) someter a las células a una selección en cuanto al ácido nucleico de la etapa (a); (c) retirar la selección después de un lapso de tiempo previamente determinado; y (d) expandir las células de la etapa (c).

Description

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DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para modular la diferenciación de células pluripotenciales

Esta solicitud reivindica el beneficio de las solicitudes de patente provisionales de los Estados Unidos de América Nºs 61/005.211 presentada el 3 de Diciembre del 2007; 61/125.941, presentada el 30 de Abril del 2008; y 61/131.577, presentada el 10 de Junio del 2008.

CAMPO

La presente divulgación está situada en los campos de la biología del desarrollo y de la terapia celular.

ANTECEDENTES

Las células madre mesenquimales, también conocidas como células estromales adherentes de médula son, tal como su nombre lo sugiere, una clase de células pluripotenciales, encontradas en la médula ósea, que pueden dar lugar a un cierto número de diferentes tipos de células de tejido conjuntivo que incluyen, p.ej. osteocitos, condrocitos, adipocitos, células endoteliales, fibroblastos y células de músculos lisos.

Las células madre mesenquimales se pueden aislar y purificar a partir de muestras de médula ósea en virtud de su adherencia a la superficie plástica de los recipientes de cultivo. De esta manera, unas poblaciones enriquecidas de células madre mesenquimales, que están esencialmente libres de células progenitoras hematopoyéticas y de estroma de médula, se pueden obtener a partir de la médula ósea de individuos adultos. Véase la referencia de A. J. Friedenstein y colaboradores (1976) Exp. Hematol. 4:276 (1976). Dichas poblaciones enriquecidas de células madre mesenquimales se pueden inducir, mediante la elección de unas condiciones de cultivo, a diferenciarse en diversos tipos de tejidos conjuntivos, que incluyen hueso, cartílago y tejido adiposo. Véanse, p.ej. las referencias de Prockop (1997) Science 276:71-74 y de Pittenger y colaboradores (1999) Science 284:143-147.

Las células madre mesenquimales no se desarrollan, en el curso de la ontogenia normal, a la forma de células del sistema nervioso. Sin embargo, se ha mostrado que varios métodos de tratar a las células madre mesenquimales en cultivo desplazan su potencial de desarrollo por lo menos parcialmente en dirección a las células neuronales y gliales. Véanse, por ejemplo, la referencia de Dezawa y colaboradores (2004) J. Clin. Invest. 113:1701-1710; las patentes de los Estados Unidos de América 6.528.245 (presentada el 4 de Marzo del 2003), 6.989.271 (presentada el 24 de Enero del 2006) y 7.129.034 (presentada el 31 de Octubre del 2006); y las publicaciones de solicitudes de patente de los Estados Unidos de América 2003/0003090 (presentada el 2 de Enero del 2003), 2003/0203484 (presentada el 30 de Octubre del 2003), 2004/0235165 (presentada el 25 de Noviembre del 2004), 2006/0166362 (presentada el 27 de Julio del 2006) y 2006/0251624 (presentada el 9 de Noviembre del 2006). Las divulgaciones de todos los documentos más arriba citados proporcionan unos métodos de convertir a las células madre mesenquimales en unas células que tienen un potencial neurogénico.

Ciertos de los métodos antes mencionados para desplazar el potencial de desarrollo de las células madre mesenquimales hacia células neuronales implican una manipulación del sistema de señalización de Notch. En un aspecto de la señalización de Notch, una célula cebadora, a la que se ha encomendado diferenciarse en un linaje neuronal, señaliza a una segunda célula adyacente, que contiene el receptor transmembranal de Notch en su superficie, de manera tal que se impide la diferenciación de la segunda célula en un linaje neuronal. La señal es transmitida por intermedio de un Ligando de Notch (p.ej. Delta, Serrate, Jagged) situado en la superficie de la célula cebadora y da como resultado una disociación de la proteína de Notch y una translocación de su dominio intracelular al núcleo de la segunda célula. Para una recopilación, la referencia de Artavanis-Tsakonas y colaboradores (1999) Science 284:770-776, divulga ciertos aspectos del sistema de señalización de Notch.

Por lo tanto, en la ontogenia normal, la disociación de la proteína de Notch y la liberación de su dominio intracelular desde el interior de la superficie de una célula pueden bloquear la diferenciación neural de esa célula. Sin embargo, la transfección de un plásmido que codifica el dominio intracelular de Notch dentro de las células madre mesenquimales (también conocidas como células estromales adherentes de médula) puede provocar que los descendientes de las células transfectadas se desarrollen en la forma de linajes neurales y miogénicos. La referencia de Dezawa y colaboradores (2004) J. Clin. Invest. 113:1701-1710; y la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos de América Nº 2006/0166362 (presentada el 27 de Julio del 2006) describen unos métodos de inducir a las células madre mesenquimales a desarrollarse en la forma de unas células que tienen un potencial neurogénico y miogénico mediante la transfección de las células madre mesenquimales con un ácido nucleico que codifica un dominio intracelular de Notch.

Shindo y colaboradores (2003) Exp. Cell Res. 290(2):370-380 describen que, después de una transfección estable de unos linajes de células osteogénicas (KusaA y KusaO) con un ácido nucleico que codifica el dominio intracelular de Notch, se observó una supresión de la expresión de marcadores osteogénicos.

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Siguen siendo desconocidos muchos detalles de los procesos más arriba mencionados, mediante los cuales se redirige la capacidad de diferenciación de las células madre mesenquimales. Por ejemplo, no se ha entendido el mecanismo mediante el cual la transfección de unas secuencias que codifican el dominio intracelular de Notch desplaza el potencial de desarrollo de las células madre mesenquimales. Además de ello, no se ha determinado el potencial de las células madre mesenquimales para retener la capacidad de diferenciarse en sus descendientes normales (p.ej. adipocitos, osteocitos, condrocitos), después de que ellas han sido sometidas a unos tratamientos que alteran su repertorio de desarrollo para incluir unos linajes neurales y miogénicos. Una mayor comprensión de esta cuestión tiene una importante implicación para el uso terapéutico potencial de las células madre mesenquimales y sus derivados en unos sectores tales como los trastornos neurodegenerativos, los trastornos musculoesqueléticos, la reparación de cartílagos y la cicatrización de heridas.

SUMARIO

Se ha determinado ahora, y se divulga aquí, que unos tratamientos que alteran el potencial de desarrollo de las células estromales adherentes de médula (MASCs, también conocidas como células madre mesenquimales) permitiendo que ellas se diferencien en unos linajes no mesenquimales, también restringen la capacidad de tales células tratadas para diferenciarse en células del linaje mesenquimal. Esto quiere decir que el potencial normal de desarrollo de las células estromales adherentes de médula ha sido tanto expandido como reducido.

Correspondientemente, se divulgan en el presente caso unos métodos y unas composiciones para redirigir el potencial de desarrollo de las células estromales adherentes de médula. También se proporcionan unas células estromales adherentes de médula y sus descendientes con un potencial de desarrollo redirigido, tal como se ilustra a modo de ejemplo por las siguientes formas de realización.

1. Un método de restringir el potencial de una célula estromal adherente de médula para diferenciarse en una célula del linaje mesenquimal, comprendiendo el método:

(a)

transfectar unas células estromales adherentes de médula con un ácido nucleico que comprende unas secuencias que codifican un dominio intracelular de Notch (NICD);

(b)

someter a las células a una selección en cuanto al ácido nucleico de la etapa (a);

(c)

retirar la selección después de un lapso de tiempo previamente determinado; y

(d)

expandir las células de la etapa (c).

En ciertas formas de realización, la transfección es transitoria, de manera tal que el ácido nucleico transfectado no persiste en los descendientes de la célula transfectada. Esto puede dar como resultado una expresión transitoria del NICD.

En unas formas de realización adicionales, se produce una expresión estable de un NICD, durante un limitado lapso de tiempo, en las células transfectadas. Esto quiere decir que las células transfectadas se someten a una selección en cuanto al ácido nucleico que codifica el NICD, pero la selección se retira después de un lapso de tiempo previamente determinado (p.ej. uno o más días, una semana o varias semanas).

2.

El método de acuerdo con la forma de realización 1, en el que se reduce el desarrollo de la célula estromal adherente de médula a la forma de un linaje osteogénico.

3.

El método de acuerdo con la forma de realización 1, en el que se reduce el desarrollo de la célula estromal adherente de médula a la forma de un linaje adipogénico.

4.

El método de acuerdo con la forma de realización 1, en el que se reduce el desarrollo de la célula estromal adherente de médula a la forma de unos linajes tanto osteogénicos como adipogénicos.

5.

El método de acuerdo con la forma de realización 1, en el que el NICD es un NICD humano.

6.

El método de acuerdo con la forma de realización 5, en el que el NICD comprende los aminoácidos 1703-2504 de la proteína de Notch humana.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las Figuras 1A y 1B muestran los niveles de ADN (Figura 1A) y de ARNm (Figura 1B) que codifican un NICD en células restringidas en cuanto a la diferenciación (DRCs) a lo largo de seis pasadas. Figura 1A muestra las copias 3

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por célula de secuencias exógenas transfectadas que codifican un NICD, para las pasadas 0 hasta 6. La Figura 1B muestra los niveles de ARNm transcrito a partir de las secuencias exógenas transfectadas que codifican un NICD, que han sido normalizados para los niveles de ARNm de GAPDH. Los datos para la pasada 0 muestran los niveles de ADN y ARN después de una selección durante una semana en G418 seguida por un cultivo durante dos semanas después de la retirada del G418. El acrónimo "MSC" designa a células estromales adherentes de médula no transfectadas. El acrónimo "NTC" designa a un testigo que no es un molde; es decir, a una reacción de amplificación realizada con todos los componentes excepto un ADN o ARN celular.

La Figura 2 muestra los niveles de Alizarin Red extraído a partir de unas células que habían sido transfectadas con diferentes vectores que codifican un NICD y con unos testigos. Las células fueron transfectadas con el vector indicado, dejadas crecer durante dos pasadas en la presencia de 100 µg/ml del G418 (excepto para unas DRCs, marcadas como "SB623" en la Figura), y luego cultivadas en un medio de diferenciación osteogénico (que incluye 500 ng/ml de BMP6) durante seis días. Las células fueron fijadas, teñidas y el Alizarin Red fue extraído y cuantificado midiendo la absorbancia a 450 nm. Véase el Ejemplo 9 acerca de los detalles.

La Figura 3 muestra los niveles de ARNm de NICD en unas MASCs que habían sido transfectadas con diferentes vectores, seleccionadas en 100 µg/ml del G418 durante dos pasadas y luego cultivadas durante tres días adicionales en la presencia del G418. Las MASCs testigos no fueron transfectadas y tampoco sometidas a una selección ("MSC"). Las DRCs (indicadas como "SB" en la figura) fueron ensayadas después de una transfección, de una selección durante una semana en el G418 y de tres pasadas. Los niveles de ARN transcrito a partir de las secuencias que codifican un NICD en el vector fueron normalizados a unos niveles endógenos de ARNm de GAPDH en las células. Los resultados son expresados en relación con este valor normalizado en las DRCs.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Los términos "células estromales de médula ósea", "células estromales adherentes de médula", "células madre adherentes de médula", "células madre de médula", "células madre mesenquimales" y "MASCs" se refieren a unas células pluripotentes mitóticas, que se han obtenido a partir de una médula ósea que, en el curso de un desarrollo normal, son capaces de dar lugar a un cierto número de tipos de células diferenciadas tales como, por ejemplo, osteocitos, y a unas células que normalmente son encontradas en un tejido conjuntivo, que incluyen, pero no se limitan a, condrocitos y adipocitos. Las MASCs pueden ser unas células humanas o unas células procedentes de otros mamíferos o vertebrados.

Los términos "célula precursora neural", "célula progenitora neural”, "NPC" y "célula progenitora neural derivada de médula ósea" se usan de una manera intercambiable para referirse a unas células mitóticas, que descienden de unas células estromales adherentes de médula, que tienen la capacidad de diferenciarse en neuronas, células gliales o sus precursoras. Ellas, por lo tanto, son distintas de las células precursoras neurales primarias, tales como las que se pueden obtener a partir de fetos o tejidos de individuos adultos, tales como el hipocampo y la zona subependimal periventricular. Las NPCs pueden ser unas células humanas o unas células procedentes de otros mamíferos o vertebrados.

Para las finalidades de esta divulgación, los términos "célula restringida en cuanto a la diferenciación" y "DRC" se refieren a una célula que desciende de una célula madre mesenquimal, cuya especificación normal de linaje (a linajes mesenquimales tales como osteocitos, condrocitos y adipocitos) ha sido restringida. Esto quiere decir que es reducida la capacidad de dicha célula para introducir un linaje que dé como resultado una diferenciación a la forma de osteocitos, adipocitos y/o condrocitos. Una célula restringida en cuanto a la diferenciación puede adquirir opcionalmente uno o más nuevos potenciales de desarrollo, que incluyen, pero no se limitan a, la capacidad de introducir un linaje neural y diferenciarse en neuronas y/o células gliales, y/o la capacidad de introducir un linaje miogénico. Una célula restringida en cuanto a la diferenciación puede también adquirir la capacidad, o ganar una capacidad aumentada de secretar unos factores solubles y/o insolubles que favorecen la regeneración y/o el crecimiento de un tejido neural (p.ej. neuronas, astrocitos, oligodendrocitos, microglia, células de Schwann), y/o impedir la muerte de un tejido neural.

La presente divulgación proporciona unos métodos y unas composiciones que se destinan, entre otras cosas, a restringir el potencial de diferenciación de unas células estromales adherentes de médula. Esto quiere decir que es restringido el potencial ontogénico normal de unas células estromales de médula para introducir unos linajes mesenquimales y dar lugar a, p.ej., condrocitos, osteocitos y adipocitos; y su desarrollo puede ser redirigido a otros linajes, p.ej. neurales y miogénicos, haciendo que ellas sean útiles para diversos tipos de terapias celulares, p.ej. en el tratamiento de la una degeneración neural, un ictus, una distrofia muscular, etc.

Unas células estromales adherentes de médula son extraídas con facilidad por aspiración de médula ósea sobre la base de un paciente no hospitalizado y, debido a su naturaleza altamente proliferativa, ellas pueden ser cultivadas en grandes cantidades dentro de un período de tiempo relativamente corto. Por lo demás, una ventaja adicional de su uso como material de partida para diversos tipos de terapias celulares reside en que ellas permiten que se lleve a

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cabo un trasplante autólogo (p.ej. se puede formar un nuevo tejido muscular y/o neural a partir de unas células que se derivan de unas células madre de médula ósea propias del paciente). La consiguiente carencia de rechazo inmunológico exime de la necesidad de administrar unos agentes inmunosupresores, haciendo posible por lo tanto un tratamiento seguro. Además de ello, puesto que las células madre de médula ósea se pueden obtener a partir de un banco de médula ósea, este método es también ventajoso desde un punto de vista de suministro.

Unas células estromales adherentes de médula se pueden obtener a partir de unos materiales aspirados de médula ósea cultivando durante tres días en un αMEM + 10 % de FBS + L-glutamina, y luego separando por aspiración las células no adherentes. Véase el Ejemplo 1, descrito más abajo, de un método ilustrativo para la extracción y la expansión de unas células estromales adherentes de médula.

En ciertas formas de realización, unas células restringidas en cuanto a la diferenciación se obtienen por medio de unos métodos que comprenden una transfección de células estromales adherentes de médula con un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica un dominio intracelular de Notch (NICD) tal como se describió, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente de los EE.UU. Nº 2006-0166362 (presentada el 27 de Julio del 2006), y en la referencia de Dezawa y colaboradores (2004) J. Clin. Invest. 113:1701-1710. En ciertas de estas formas de realización, el dominio intracelular de Notch se compone de los aminoácidos 1703-2504 de la proteína Notch-1 humana. Ellison y colaboradores (1991) Cell 66:649-661. En unas formas de realización adicionales, unas células restringidas en cuanto a la diferenciación se obtienen tal como se describió en la publicación de solicitud de patente de los EE.UU. Nº 2006-0251624 (presentada el 9 de Noviembre del 2006). Alternativamente, tales células se pueden obtener tal como se describió en la publicación de solicitud de patente de los EE.UU. Nº 2003-0003090 (presentada el 2 de Enero del 2003).

El Ejemplo 2 describe un método ilustrativo para la preparación de unas DRCs.

Los métodos y las composiciones que aquí se divulgan implican el uso de unos procesos reconocidos en los sectores de biología molecular, biología celular y cultivo celular. Tales métodos son conocidos por los que poseen experiencia en la especialidad y han sido divulgados, p.ej., en las referencias de Sambrook y colaboradores "Clonación molecular: Un manual de laboratorio", Tercera Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; de Ausubel y colaboradores, "Protocolos actuales en biología molecular", John Wiley & Sons, New York, 1987 y actualizaciones periódicas; y de R. I. Freshney "Cultivo de células de animales: Un manual de técnica básica" Quinta Edición, Wiley, New York, 2005.

Ciertos de los ejemplos muestran que los tratamientos de unas MASCs (obtenidas a partir de dos diferentes donantes), que dan como resultado su capacidad para diferenciarse en linajes no mesenquimales, también restringen la capacidad de dichas células tratadas para conseguir su potencial de desarrollo normal (esto quiere decir que dichos tratamientos restringen su capacidad de diferenciarse en células mesenquimales tales como osteocitos y adipocitos). Las MASCS obtenidas a partir de seis donantes adicionales se han ensayado de una manera similar y, en todos los 8 casos, las células tratadas mostraron coherentemente una capacidad reducida, en comparación con las MASCs, para diferenciarse en adipocitos y osteocitos.

Este restringido potencial de desarrollo de estas "células restringidas en cuanto a la diferenciación (DRCs)" estimula el uso de las DRCs y sus descendientes en diversos tipos de terapias celulares. Por ejemplo, las DRCs pueden ser inducidas a diferenciarse en células neurales y en precursoras de células neurales en unas apropiadas condiciones de cultivo. Véanse, por ejemplo, la referencia de Dezawa y colaboradores (2004) J. Clin. Invest. 113:1701-1710 y publicación de solicitud de patente de los EE.UU. Nº 2006-0166362 (presentada el 27 de Julio del 2006). El uso de tales células neurales y precursoras de células neurales para el tratamiento de lesiones neurales, por trasplante dentro de unas regiones en las que ellas pueden ser expuestas potencialmente a señales osteogénicas y/o adipogénicas (p.ej. alrededor de unas lesiones del sistema nervioso periférico) es preferible con relación al uso de las MASCs, puesto que se reduce o elimina la capacidad del anterior tipo de células para diferenciarse en linajes osteocíticos y adipocíticos. De una manera similar, para el uso en unas terapéuticas celulares que se trasplantan al cerebro o al sistema nervioso central, el desplazamiento en el potencial de desarrollo fuera de los linajes mesenquimales aumenta la seguridad y la eficacia de las DRCs, en comparación con las MASCs y unos tipos relacionados de células. Por lo tanto, las DRCs tienen un mejor perfil de seguridad que otros tipos de células que se pueden usar para un trasplante.

Ciertos de los ejemplos muestran que la regulación de la expresión de genes es alterada en unas células restringidas en cuanto a la diferenciación. En particular, son aumentados los niveles del ARNm codificado por los genes Hey1 y de ciclina D1; mientras que son disminuidos los niveles del ARNm codificado por los genes Hes1, HR y Wisp1, en unas DRCs en comparación con sus MASCs progenitoras. Por lo tanto, las DRCs se distinguen, con respecto de sus MASC progenitoras y de otras células, en virtud de esta diferente expresión de genes. Por lo tanto, unos métodos de regular en sentido creciente de una manera artificial la expresión de Hey 1 y/o de ciclina D1, y/o de regular en sentido decreciente de una manera artificial la expresión de Hes1, HR y/o Wisp1, se pueden usar también para generar unas células restringidas en cuanto a la diferenciación. Por ejemplo, tal como se conoce en la especialidad, la expresión de genes puede ser regulada en sentido creciente por inserción de un ADNc que codifica

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el producto génico dentro de una célula; y la expresión de genes puede ser regulada en sentido decreciente insertando dentro de una célula un ARN pequeño de interfencia, un ARN de horquilla corta, un micro ARN y/o un ARN antisentido, de una manera complementaria con el gen que interesa. Por lo demás, se pueden usar unos factores de transcripción artificiales tanto para la activación como para la represión de la expresión de genes en una célula. Véanse, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. 6.534.261 y 6.933.113; que describen la síntesis y los usos de unos factores de transcripción artificiales.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Preparación de unas células estromales adherentes de médula (MASCs)

Unos materiales aspirados de médula ósea, obtenidos a partir de donantes humanos, se dividieron en partes alícuotas de 12,5 ml dentro de unos tubos de 50 ml, y se añadieron a cada tubo 12,5 ml de un medio de crecimiento (10 % de FBS en un αMEM, suplementado con penicilina/estreptomicina y 2 mM de L-glutamina). Los contenidos de los tubos se mezclaron por inversión y los tubos se centrifugaron a 200 x g durante 8 minutos. La fase transparente superior se desechó, el volumen de la fase inferior se ajustó a 25 ml con un medio de crecimiento fresco (= de nueva aportación), y los tubos se mezclaron y centrifugaron de nuevo. La capa superior se retiró de nuevo. El volumen de la fase inferior en cada tubo se ajustó de nuevo a 25 ml y los contenidos de todos los tubos se agruparon en un tubo de 250 ml. Después de una determinación de la concentración de células por exclusión de Trypan Blue y determinación del cómputo de células nucleadas, las células se sembraron en placas dentro de unos matraces T225, a razón de 40 ml por matraz del medio de crecimiento con una densidad de 100 x 106 de células nucleadas totales por matraz. Los matraces se incubaron a 37°C durante 3 días en una incubadora con CO2, durante cuyo período de tiempo las MASCs se fijaron al matraz.

Después de 3 días, las células no fijadas se retiraron haciendo oscilar los matraces y retirando el medio de cultivo. Cada matraz se lavó tres veces con 40 ml de un αMEM suplementado con penicilina/estreptomicina; luego se añadieron a cada matraz 40 ml del medio de crecimiento previamente calentado (a 37°C) y las células se cultivaron a 37°C en una incubadora con CO2. Durante este período de tiempo, el medio se reemplazó por 40 ml de un medio de crecimiento fresco cada 3-4 días, y las células se vigilaron en cuanto al crecimiento de colonias y la densidad de células.

Cuando los cultivos alcanzaron una confluencia de 25-30 % (usualmente 10.000 – 20.000 células por colonia y en el lapso de 10-14 días), las MASCs (en la pasada M0) se cosecharon para una pasada ulterior. Las MASCs se cosecharon a partir de hasta 10 matraces T-225 de una sola vez. El medio se retiró desde los matraces y las células adherentes se enjuagaron 2 veces con 20 ml de DPBS sin Ca/Mg (DPBS -/-, de HyClone). Diez ml del medio 0,25 % de tripsina/EDTA (de Invitrogen, Carlsbad, CA) se añadieron a cada matraz y los matraces se incubaron durante aproximadamente 5 min. a la temperatura ambiente. Cuando las células se hubieron desprendido y las colonias se hubieron dispersado a la forma de células individuales, la tripsina se desactivó por una adición de 10 ml del medio de crecimiento seguida por una suave mezcladura. Las suspensiones de células se retiraron desde los matraces, y se agruparon en unos tubos de 250 ml. Los tubos se sometieron a una centrifugación a 200 x g durante 8 minutos. Los materiales sobrenadantes se retiraron cuidadosamente y los sedimentos celulares húmedos se volvieron a suspender en el medio de crecimiento hasta obtener una concentración estimada de células de aproximadamente 1x106 células/ml. Se determinó el cómputo de células viables y las células se sembraron en placas dentro de unos matraces T225 con una concentración de 2 x 106 células por matraz en el medio de crecimiento (en la pasada M1). Las células se dejaron crecer durante 3-5 días, o hasta ser confluentes en 85-90 %, cambiando de medio cada 2 a 3 días. Con una confluencia de 85-90 %, las células de la pasada M1 se cosecharon por tripsinización y se volvieron a sembrar en placas a razón de 2 x 106 células por matraz T225 tal como se ha descrito más arriba, para generar cultivos de la pasada M2. Los cultivos de M2 se alimentaron con medio fresco cada tres días, si fuese necesario. Cuando los cultivos de la pasada M2 hubieron alcanzado una confluencia de 85-90 % (usualmente en el lapso de 3-5 días), ellos fueron o bien cosechados para una transfección con el fin de generar unas DRCs (Ejemplo 2 siguiente), o congelados para un futuro uso (Ejemplo 3 siguiente).

Ejemplo 2: Preparación de unas células restringidas en cuanto a la diferenciación (DRCs)

Las DRCs se prepararon o bien directamente a partir de las MASCs cosechadas a partir de unos cultivos de la pasada M2, o a partir de las MASCs de la pasada M2 que habían sido congeladas tal como se describirá en el Ejemplo 3, y descongeladas y revivificadas tal como se describirá en el Ejemplo 4.

A. Preparación de mezcla de transfección Unas células restringidas en cuanto a la diferenciación se prepararon por transfección de MASCs de la pasada M2 con un plásmido que codifica el dominio intracelular de Notch. El plásmido (pN2) comprendía una cadena principal de pCI-neo (de Promega, Madison, WI) en la que unas secuencias que codifican los aminoácidos 1703-2504 de la proteína Notch-1 humana, que codifica el dominio intracelular, se introdujeron dentro del sitio de clonación múltiple. En este vector, unas secuencias que codifican el NICD están bajo el control por transcripción del promotor del CMV,

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que es un promotor constitutivo fuerte. El pN2 también contiene un gen de neomicina fosfotransferasa (que codifica resistencia al G418) bajo el control por transcripción del promotor temprano e intensificador del SV40.

Para cada matraz con MASCs, se usaron 5 ml de la mezcla de transfección, que contenía 40 µg de un plásmido y 0,2 ml de una solución de Fugene 6®. Para preparar la mezcla de transfección, la cantidad apropiada de la solución de Fugene® (dependiendo del número de matraces con células que se habían de transfectar) se añadió a un αMEM en un tubo estéril de 250 ml, usando una pipeta de vidrio. La solución se mezcló suavemente e incubó durante 5 min. a la temperatura ambiente. La cantidad apropiada de un ADN plasmídico se añadió luego gota a gota a la mezcla de Fugene® y αMEM, se mezcló suavemente, y se incubó durante 30 min. a la temperatura ambiente.

Antes de la adición del ADN de pCI-Notch a la mezcla de Fugene® y MEM, se retiraron 5 ml y se colocaron dentro de un tubo de 15 ml al que se habían añadido 40 µg del plásmido pEGFP. Esta solución se usó para transfectar un matraz con células, como un testigo de la eficiencia de transfección. Para ciertos experimentos, se prepararon también unas "DRCs ficticias", transfectando unas MASCs de M2 con un derivado del vector pCI-Notch, a partir del que se habían retirado las secuencias que codifican Notch. Todos los otros procesos fueron idénticos.

B. Transfección

Para realizar la transfección, unas MASCs de la pasada M2 se cosecharon por tripsinización (tal como se describió en el Ejemplo 1) y se sembraron en placas con una densidad de 2,5 x 106 células en 40 ml de un medio de crecimiento por matraz T225. Cuando las células hubieron alcanzado una confluencia de 50-70 % (usualmente en el lapso de 18-24 horas) ellas fueron preparadas para la transfección, reemplazando su medio de crecimiento por 35 ml por matraz del medio de transfección (αMEM +10 % de FBS sin penicilina/estreptomicina).

A las tres horas después de la introducción de un medio de transfección, se añadieron 5 ml de la mezcla de transfección (Sección A anterior) a cada matraz T-225, pipeteándolos directamente dentro del medio, sin entrar en contacto con la superficie de crecimiento, seguido por una suave mezcladura. Un matraz T-225 testigo fue transfectado con 40 µg del plásmido pEGFP, para efectuar la determinación de la eficiencia de transfección.

Después de haber incubado los cultivos a 37°C en un medio de transfección durante 24 horas, el medio de transfección se reemplazó por el medio αMEM +10 % de FBS + penicilina/estreptomicina.

C. Selección de células transfectadas

La selección de células que habían incorporado un ADN plasmídico se comenzó a las 48 horas después de la transfección reemplazando el medio por 40 ml por matraz de un medio de selección (un medio de crecimiento que contenía 100 µg/ml de G-418). Se proporcionó un medio de selección fresco a los 3 días, y de nuevo a los 5 días después de que hubo comenzado la selección. Después de 7 días, se retiró el medio de selección y las células se alimentaron con 40 ml de un medio de crecimiento. Los cultivos se dejaron luego crecer durante aproximadamente 3 semanas (intervalo de 18 a 21 días), siendo alimentados de nuevo con un medio de crecimiento fresco cada 2-3 días.

Aproximadamente a las 3 semanas después de que hubo comenzado la selección, cuando las células supervivientes comenzaron a formar colonias, las células se cosecharon. El medio se retiró desde los matraces usando una pipeta aspiradora y se añadieron a cada matraz 20 ml de DPBS sin Ca2+/Mg2+, a la temperatura ambiente. La superficie de cultivo se enjuagó suavemente, la solución de lavado se retiró por aspiración y se repitió la etapa de enjuague. Luego se añadieron a cada matraz 10 ml de la mezcla de 0,25 % de tripsina/EDTA, se enjuagó sobre la superficie de crecimiento, y los matraces se incubaron durante 5-10 min. a la temperatura ambiente. Los cultivos se vigilaron con un microscopio para asegurarse del desprendimiento completo de las células. Cuando el desprendimiento estuvo completo, la tripsina fue desactivada por una adición de 10 ml del medio de crecimiento por matraz. La mezcla se enjuagó sobre la superficie de cultivo, se mezcló pipeteando 4-5 veces con una pipeta de 10 ml, y la suspensión se transfirió dentro de un tubo cónico de centrífuga de 50 ml estéril. Las células cosechadas a partir de varios matraces podrían ser agrupadas en un único tubo. Si estuviesen presentes cualesquiera grumos, ellas se dejaron sedimentar y la suspensión se retiró a un tubo fresco.

Las suspensiones de células se centrifugaron a 800 rpm = revoluciones por minuto (200 x g) durante 8 min a la temperatura ambiente. Los materiales sobrenadantes se retiraron por aspiración. Los sedimentos de células se descohesionaron golpeando ligeramente el tubo, se añadieron a cada tubo aproximadamente 10 ml de DPBS sin Ca2+/Mg2+ y las células se volvieron a suspender pipeteando suavemente 4-5 veces con una pipeta de 10 ml, para obtener una suspensión uniforme.

D. Expansión de células transfectadas El número de células se determinó para la suspensión de células transformadas seleccionadas, y las células se sembraron en placas dentro de unos matraces T-225 a razón de 2 x 106 células por matraz (proporcionando una siembra de aproximadamente 30 % de células viables). Este cultivo se designa como M2P1 (pasada #1). Unos

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cultivos M2P1 se alimentaron con un medio fresco cada 2-3 días, y cuando las células hubieron alcanzado una confluencia de 90-95 % (usualmente a los 4-7 días después de la pasada), ellas se cosecharon y se volvieron a sembrar en placas a razón de 2 x 106 células por matraz para generar la pasada M2P2. Cuando los cultivos de M2P2 hubieron alcanzado una confluencia de 90-95 %, ellos se cosecharon para una conservación criogénica (Ejemplo 3) o para un ulterior ensayo.

Ejemplo 3: Conservación criogénica

Las MASCs y DRCs fueron congeladas para sul almacenamiento de acuerdo con el siguiente proceso. Las MASCs fueron típicamente congeladas después de la pasada M2, y las DRCs fueron típicamente congeladas después de pasada M2P2. Tratando 4-5 matraces de una sola vez, el medio fue aspirado desde los matraces de cultivo, se añadieron a cada matraz 10 ml de una mezcla de 0,25 % de tripsina y EDTA (a la temperatura ambiente), se enjuagó suavemente sobre la superficie de cultivo durante un lapso de tiempo no más largo que 30 segundos, y se retiraron por aspiración. Luego se añadieron a cada matraz 10 ml de una mezcla de 0,25 % de tripsina y EDTA calentada (a 37°C), se enjuagó sobre la superficie de crecimiento, y los matraces se incubaron durante 5-10 min a la temperatura ambiente. Los cultivos se vigilaron por medio de un examen con microscopio para asegurarse del desprendimiento completo de las células.

Cuando el desprendimiento estuvo completo, se añadieron a cada matraz 10 ml del medio de crecimiento MEM, se enjuagó sobre la superficie de cultivo, y las células desprendidas se mezclaron pipeteando 4-5 veces con una pipeta de 10 ml. La suspensión de células se transfirió a un tubo cónico de centrífuga de 250 ml estéril, y se retiraron cualesquiera grandes grumos de células. Las células cosechadas a partir de 15-20 matraces fueron agrupadas dentro de un tubo de 250 ml.

El tubo se sometió a una centrifugación a 800 rpm (200 x g) durante 8 min a la temperatura ambiente. El material sobrenadante se retiró por aspiración. El sedimento se descohesionó golpeando ligeramente el tubo, y se añadieron a cada tubo aproximadamente 25 ml de DPBS (-/-). Las células fueron vueltas a suspender pipeteando suavemente 4-5 veces con una pipeta de 10 ml para obtener una suspensión uniforme. Cualesquiera grumos presentes en la suspensión se retiraron pipeteando cada muestra a través de un tamiz estéril de 70 µm que estaba colocado en el cuello de un tubo de 50 ml.

Las suspensiones de células se agruparon en un tubo de centrífuga de 250 ml y se retiraron cualesquiera grumos remanentes. El volumen final se ajustó a 200 ml con DPBS (-/-) y la muestra se sometió a centrifugación a 800 rpm (200 x g) durante 8 min a la temperatura ambiente. El material sobrenadante se retiró por aspiración. El sedimento de células se descohesionó golpeando ligeramente, se añadieron al tubo 20 ml de DPBS (-/-) y las células se volvieron a suspender mezclando bien y pipeteando suavemente con una pipeta de 10 ml. El volumen final se ajustó con DPBS (-/-) para dar una concentración estimada de aproximadamente 0,5 -1,0 x 106 células/ml, de modo usual aproximadamente 4-5 ml por matraz T225 cosechado, o aproximadamente 200 ml para una cosecha de 40 matraces.

Un cómputo de células viables se realizó en la suspensión, que luego fue sometida a una centrifugación a 800 rpm (200 x g) durante 8 minutos. El material sobrenadante se aspiró, y el sedimento de células se volvió a suspender en una solución Cryo Stor fría (de BioLife Solutions, Bothell, WA) en una concentración de 12 x 106 células/ml. Unas partes alícuotas de un ml se dispensaron dentro de unos viales, que fueron cerrados herméticamente y colocados a 4°C en un Cryo Cooler. Los viales fueron transferidos a un estante de un aparato congelador CryoMed (de Thermo Forma) y congelados.

Ejemplo 4: Descongelación y recuperación

Unas células (MASCs o DRCs) congeladas se almacenaron en nitrógeno líquido. Cuando se las necesitó para los experimentos, ellas fueron descongeladas rápidamente y cultivadas de la siguiente manera. Un tubo con células congeladas se colocó en un baño a 37ºC hasta descongelarlas. La suspensión de células descongeladas (1 ml) se colocó inmediatamente en 10 ml de un medio de crecimiento y se volvió a suspender suavemente. La suspensión se centrifugó a 200 x g, el material sobrenadante se retiró, y las células se volvieron a suspender en el medio de crecimiento en una concentración estimada de 106 células/ml. Las células vivas recontaron por exclusión de Trypan Blue y las células se sembraron en placas con una densidad de 2 x 106 células por matraz T225. Las células se cultivaron a 37°C en una incubadora con CO2 durante 3-4 días hasta que se reanudase el crecimiento de las células. Ellas se usaron luego en los ensayos de diferenciación osteogénica y adipogénica que se describirán en los Ejemplos 5 y 6.

Ejemplo 5: Restricción del potencial de diferenciación osteogénica de unas células estromales adherentes de médula

Para el ensayo del potencial de diferenciación osteogénica, unas células (MASCs, DRCs o DRCs ficticias) se sembraron en placas a razón de 104 células/pocillo en unas placas de 96 pocillos en un αMEM (de Mediatech, 8 15

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Herndon, VA) suplementado con 10 % de suero de bovino fetal (FBS, de HyClone, Logan UT) y se cultivaron durante una noche.

Al día siguiente, el medio de cultivo se reemplazó por un DMEM (de Mediatech, Herndon, VA) que tenía un alto contenido de glucosa, piruvato, glutamina y 10 % de FBS suplementado con 50 µg/ml de ácido ascórbico (L-ácido ascórbico 2-fosfato, de Wako Chemical, Ltd., Japón, añadido recientemente antes del uso), 10 mM de β-glicerofosfato (de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), y 100 nM de dexametasona (de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Este "medio de diferenciación osteogénica" se cambió cada 3-4 días.

Los ensayos de diferenciación osteogénica se realizaron en la ausencia o presencia de la proteína morfogenética ósea 6 humana recombinante (BMP-6; de R&D Systems, Minneapolis, MN), en una concentración de 500 ng/ml.

En el día 14 o 17 después de la transferencia de las células al medio de diferenciación osteogénica, los cultivos se ensayaron en cuanto a la presencia de osteocitos por tinción con Alizarin Red. Las células se fijaron añadiendo metanol al 100 % a los pocillos e incubando sobre hielo durante 3 min. Los pocillos se enjuagaron luego con agua, y se añadieron 40 mM de Alizarin Red S (de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), de pH 4,2. Después de 2 min a la temperatura ambiente, los pocillos se enjuagaron con agua, la placa se colocó sobre la platina de un microscopio Zeiss Axiovert 40C y las células que estaban en los pocillos se fotografiaron con un Canon PC1049.

Los resultados de estos experimentos indicaron que, tanto en la presencia como en la ausencia de BMP-6, las MASCs mostraron una extensión mucho mayor de diferenciación osteogénica que las DRCs. Además de esto, se determinó que la inhibición de diferenciación osteogénica en las DRCs es debida a la presencia del dominio intracelular de Notch (NICD) en estas células, por cuanto que las MASCs que habían sido transfectadas con un vector que carecía de secuencias que codifican un NICD (DRCs ficticias) revelaron un grado de tinción con Alizarin Red similar al de las MASCs. En todos los casos, la BMP-6 aumentó el grado de diferenciación osteogénica que se observó.

Ejemplo 6: Restricción del potencial de diferenciación adipogénica de unas células estromales adherentes de médula

Para el ensayo del potencial de diferenciación adipogénica, unas células se sembraron en placas a razón de 104 células/pocillo en unas placas de 96 pocillos en un αMEM (de Mediatech, Herndon, VA) suplementado con 10 % de suero de bovino fetal (FBS, de HyClone, Logan UT) y se cultivaron durante una noche.

Al día siguiente, el medio de cultivo se reemplazó por un DMEM (de Mediatech, Herndon, VA) que tenía un alto contenido de glucosa, piruvato, glutamina y 10 % de PBS suplementado con 1 µM de dexametasona, 0,5 µM de 1-metil-3 isobutilxantina, 100 µM de indometacina y 10 µg/ml de insulina (todos los suplementos son procedentes de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Este "medio de diferenciación adipogénica" se cambió cada 3-4 días.

Los ensayos de diferenciación adipogénica se realizaron en la ausencia o presencia de la proteína morfogenética ósea 6 humana recombinante (BMP-6; de R&D Systems, Minneapolis, MN), en una concentración de 100 ng/ml.

En el día 17-21 después de la transferencia de las células a un medio de diferenciación adipogénica, las células se ensayaron en cuanto a la diferenciación adipocítica por tinción con Oil Red O. Las células se fijaron añadiendo formalina al 10 % a los pocillos e incubando durante 30-60 min a la temperatura ambiente. Luego los pocillos se lavaron con isopropanol al 60 % y se dejaron secar por completo. La solución de trabajo de Oil Red O se había preparado recientemente a partir de una solución original de Oil Red (3,5 mg/ml en isopropanol) diluyéndola a 3:2 en agua y filtrando. La tinción se realizó durante 10 min; y luego los pocillos se lavaron extensamente con agua. Después de una breve contratinción con una solución de hematoxilina Accustain Harris (de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), la placa se colocó sobre la platina de un microscopio Zeiss Axiovert 40C y las células que estaban en los pocillos se fotografiaron con un Canon PC1049.

Los resultados de estos experimentos indicaron que las MASCs eran capaces de diferenciarse en adipocitos, tal como se evidencia por unas células con vacuolos rellenos con grasa que habían sido teñidos por Oil Red O, y que la diferenciación adipocítica de las MASCs era aumentada por la BMP-6. En contraste con ello, pocos adipocitos se formaron por las DRCs, si es que se formó alguno, o bien en la presencia o en la ausencia de BMP-6; y los que se habían formado contenían unos vacuolos mucho más pequeños. Unos experimentos testigos mostraron que la inhibición de la diferenciación adipogénica en las DRCs es debida a la presencia del dominio intracelular de Notch (NICD) en estas células, por cuanto que las MASCs que habían sido transfectadas con un vector que carecía de secuencias que codifican un NICD (DRCs ficticias) revelaron un grado de tinción con Oil Red O similar al de las MASCs.

Ejemplo 7: El potencial osteogénico de unas MASCs es aumentado por activación con una Jagged, que es un ligando de Notch

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La proteína Jagged1 humana es un ligando de la proteína Notch1 humana. Por lo tanto, una célula que expresa una Jagged sobre su superficie, cuando se ponga en contacto con una célula que expresa la Notch, inducirá la disociación de la Notch transmembranal y la generación de un NICD citoplasmático en la célula que expresa la Notch. El efecto de una activación prolongada por la Notch en unas MASCs, por la proteína Jagged, se investigó en el sistema de diferenciación osteogénica que se describió en el Ejemplo 5.

Unas MASCs (preparadas esencialmente tal como se describió en el Ejemplo 1) se sembraron en placas a razón de 104 células/pocillo en unas placas de 96 pocillos en un αMEM (de Mediatech, Herndon, VA) suplementado con 10 % de suero de bovino fetal (FBS, HyClone, Logan UT) y se cultivaron durante una noche. Al día siguiente, las células fueron transferidas a un medio de diferenciación osteogénica (con la composición que se describió en el Ejemplo 5).

Durante el proceso de diferenciación, ciertas tandas de células se sometieron a una activación con la Notch por intermedio del ligando de Notch Jagged. Una fusión entre el dominio extracelular de la proteína Jagged1 de rata y la región Fc de una IgG humana (Jag1/Fc) se obtuvo a partir de R&D Systems (Minneapolis, MN; Nº de catálogo 599-JG), y la preparación liofilizada se reconstituyó a una concentración de 1 mg/ml en un PBS que contiene 0,1 % (en peso/volumen) de albúmina de suero bovino.

La proteína quimérica Jag1/Fc fue "arracimada" por una incubación previa con exceso de peso diez veces mayor de Fc anti-humana de cabra (de Sigma, St. Louis MO). Antes del uso, la solución de anticuerpos (2 mg/ml) fue dializada durante una noche, con tres cambios, frente a PBS para retirar el aziduro de sodio. El volumen de la solución de anticuerpos no fue cambiado por diálisis. Para el arracimamiento, la Jag1/Fc (1 mg/ml en PBS + 0,1 % de BSA) y la Fc anti-humana (2 mg/ml en PBS) se mezclaron e incubaron a la temperatura ambiente durante 40 min antes de la adición a los cultivos de células.

La Jag1/Fc arracimada se añadió a unos cultivos en una concentración final de 5 µg/ml de Jag1/Fc y 50 µg/ml de un anticuerpo. Unos cultivos testigos recibieron solamente el anticuerpo. Unos adicionales cultivos recibieron la Jag1/Fc y la anti-Fc como anteriormente, junto con 5 µM del éster t-butílico de N-[N-(3,5-difluorofenacetil-L-alanil]-Sfenilglicina (DAPT), que es un agente inhibidor de la γ-secretasa. Unas soluciones originales de 2 mM de DAPT en DMSO se obtuvieron a partir de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. La γ-secretasa es una proteasa que, al realizarse una activación de la proteína de Notch transmembranal por un ligando de Notch, disocia a la proteína de Notch en un sitio que permite la liberación del dominio intracelular de Notch. Ciertos cultivos también incluían la BMP-6 (en una concentración final de 500 ng/ml), tal como se describió en el Ejemplo 5.

Después de 10 días en cultivo, las células se fijaron en metanol, se tiñeron con Alizarin Red y se examinaron por un microscopio tal como se describió en el Ejemplo 5. Cuando la proteína de Notch endógena fue activada en las MASCs por el ligando Jagged1 soluble, concomitantemente con una estimulación osteogénica, la osteogénesis fue fuertemente aumentada. El efecto fue observado o bien en la ausencia o en la presencia de la BMP6. Unos adicionales experimentos mostraron que la estimulación de la osteogénesis por el Jagged era dependiente de la dosis.

La estimulación de la osteogénesis por el Jagged es invertida completamente por el DAPT en la ausencia de la BMP6 y es fuertemente reducida en su presencia.

Estos experimentos también confirmaron el reducido potencial osteogénico de las DRCs en comparación con el de las MASCs, y mostraron que el pequeño grado de potencial osteogénico exhibido por las DRCs en la presencia de la BMP6 es reducido por el DAPT.

La estimulación de la diferenciación osteogénica de las MASCs por el Jagged, y la inversión de esta estimulación por el agente inhibidor de la γ-secretasa DAPT, sugieren que la liberación del NICD en una MASC favorece su diferenciación a lo largo de un linaje osteogénico.

Ejemplo 8: Niveles de ADN y ARNm que codifican un NICD en unas DRCs durante una pasada

La observación de que parece ser que la liberación de un NICD endógeno en unas MASCs estimula su diferenciación a lo largo de una ruta osteogénica (Ejemplo 7) está en contradicción con la observación de que la transfección de las MASCs con un ácido nucleico que codifica un NICD exógeno bloquea una diferenciación osteogénica (Ejemplo 5). Para obtener una información adicional, se determinaron los niveles de ADN y de ARN que codifican un NICD en unas MASCs transfectadas (es decir, unas DRCs). Con esta finalidad, después de la preparación de unas DRCs esencialmente tal como se describió en el Ejemplo 2, se retiraron muestras en cada pasada (es decir, después de que un cultivo hubo alcanzado una confluencia de 90 % y justamente antes de la tripsinización y de la siembra renovada en placas) para el análisis de ADN y ARN.

Para aislar un ADN celular, se recogieron aproximadamente 2 x 106 células por tripsinización. Las células se lavaron en DPBS (Hyclone, Logan, UT) y se recogieron por centrifugación. Las células se volvieron a suspender en 0,2 ml

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de DPBS por 2 x 106 células y se lisaron por medio de la adición de proteinasa K (de Qiagen, Valencia, CA). El ADN se purificó a partir de unas células lisadas usando a mini estuche QiAmp DNA (de Qiagen, Valencia, CA).

El ADN celular se ensayó en cuanto a la presencia de secuencias de Notch exógenos por una QPCR usando un sistema de PCR en tiempo real Roche LightCycler® 480. Las secuencias de los cebadores fueron como sigue:

F6: TTGGTCTTACTGACATCCACTTTG (SEQ ID NO: 1) R4: GCTAGCCTATAGTGAGTCGTATT (SEQ ID NO: 2)

La secuencia de la sonda fue: 5'CCCAGTTCAATTACAGCTCTTAAGGCTAGAG-3' (SEQ ID NO: 3)

Esta sonda contenía el fluoróforo 6-FAM en el extremo 5’ y el extintor BHQ1® (de Biosearch Technologies, Novato, CA) en el extremo 3'. Los oligonucleótidos se obtuvieron de Operon Technologies (Huntsville, AL).

100 ng de un ADN celular estaban presentes en cada tanda de reacción de amplificación de 20 µl. Las concentraciones de los cebadores fueron de 900 nM de cada uno y la concentración de la sonda fue de 200 nM. La reacción de amplificación se realizó en una mezcla LightCycler® 480 Master Mix (de Roche, Mannheim, Alemania) con una incubación previa durante 1 min. a 95°C; seguida por 40 ciclos de 5 min. a 95°C. El formato de detección usado fue una sonda de hidrólisis mono color.

Para el análisis de los niveles de ARNm de NICD, un ARN celular fue aislado usando a Mini Estuche Qiagen RNeasy® Mini Kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen, Valencia, CA), seguido por tratamiento con la DNase (de Ambion, Austin, TX).

El ARN celular aislado se ensayó en cuanto a la presencia de secuencias de Notch exógenos por una QRT-PCR usando un sistema de PCR en tiempo real Roche LightCycler® 480. Las secuencias de los cebadores fueron como sigue:

F1: CACTGGGCAGGTGTCCAC (SEQ ID NO: 4)

R2: CCATGGTGGCGCTCGAG (SEQ ID NO: 5)

La secuencia de la sonda fue la misma que se usó para el análisis del ADN (SEQ ID NO: 3, más arriba).

100 ng de ARN celular estaban presentes en cada tanda de reacción de amplificación de 20 µl. El cebador F1 estaba presente en una concentración final de 100 nM; el cebador R2 estaba presente en una concentración final de 900 nM, y la sonda estaba presente en una concentración final de 200 nM. Las tandas de reacción también contenían 10 Unidades de la transcriptasa inversa M-MuLV (de New England Biolabs, Ipswich, MA) y 6 Unidades de ARNsin® (de Promega, Madison, WI). La reacción de transcripción inversa/amplificación se realizó en una mezcla LightCycler® 480 Master Mix (de Roche, Mannheim, Alemania) con una incubación previa durante 30 min. a 48°C; seguida por 45 ciclos de 5 min. a 95°C. El formato de detección usado fue una sonda de hidrólisis mono color.

Los resultados, que se muestran en la Figura 1, indican que, por la primera pasada (es decir, a continuación de la transfección con unas secuencias que codifican un NICD, una semana de selección y dos semanas de cultivo adicional después de la retirada del agente selectivo), la selección de células supervivientes contenía menos de una copia por célula del ADN que codifica un NICD transfectado (basado en unos patrones producidos por una dilución en serie de pN2 en agua), y la cantidad continuó disminuyendo constantemente después de ello (Figura 1A). De una manera similar, las secuencias de ARNm que codifica un NICD exógeno disminuyen continuamente a lo largo de la pasada (Figura 1B). Estos resultados son compatibles con la posibilidad de que unas concentraciones iniciales más altas de un NICD exógeno, que luego disminuyen en el transcurso del tiempo, estén implicadas en bloquear el potencial osteogénico de las DRCs.

Ejemplo 9: Una expresión estable de un NICD exógeno aumenta el potencial osteogénico de unas MASCs

Una posible interpretación de estos resultados es que la presencia continua del NICD conduce a una diferenciación osteogénica de unas MASCs; pero que para la conversión de unas MASCs en unas DRCs, se requiere una expresión más transitoria del NICD, en un estadio temprano del proceso de conversión (es decir como resulta de a período de selección de una semana). Para ensayar esta posibilidad, las MASCs fueron transfectadas con unos vectores que codifican un NICD cuya expresión fue estabilizada por una selección continua, y su potencial osteogénico fue ensayado tal como se describió en el Ejemplo 5.

Dos diferentes vectores que codifican un NICD se usaron en estos estudios. El vector pN2 es el mismo vector quese usó en los precedentes experimentos. Él contiene unas secuencias que codifican un NICD bajo el control por transcripción del promotor del CMV, y unas secuencias que codifican la neomicina fosfotransferasa bajo el control

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por transcripción del promotor temprano e intensificador del SV40. El vector pNFK contiene un promotor del CMV que impulsa la transcripción de una unidad de transcripción multicistrónica que incluye unas secuencias que codifican el NICD Notch 1 humano, una marca inmunitaria Flag, unas secuencias del péptido 2A y un gen de neomicina fosfotransferasa. A continuación de la transcripción y de la traducción, la secuencia del péptido 2A en la resultante poliproteína es disociada por unas proteasas celulares para generar unas cantidades equimolares del NICD y de la neomicina fosfotransferasa.

El vector pN0 se usó como un testigo. Él contiene unas secuencias que codifican la neomicina fosfotransferasa (NPT) bajo el control por transcripción del promotor temprano e intensificador del SV40, y no contiene unas secuencias que codifican un NICD.

Unas MASCs, que se habían preparado esencialmente tal como se describió en el Ejemplo 1, fueron transfectadas por separado con los vectores que se describieron más arriba. Las transfecciones se realizaron esencialmente tal como se describió para las transfecciones con el pN2 en el Ejemplo 2. A continuación de la transfección, las células se mantuvieron en una selección continua con 100 µg/ml de G418 durante dos pasadas; requiriendo cada pasada el crecimiento de células hasta una confluencia de 90 % (en comparación con una selección durante una semana para generar las DRCs). Este proceso de selección y propagación necesitó aproximadamente dos meses. Las células se transfirieron luego a un medio de diferenciación osteogénica (Ejemplo 5) que contenía 100 µg/ml de G418 y se cultivaron durante otros seis días, después de que ellas se fijaron, tiñeron y examinaron tal como se describió en el Ejemplo 5.

Los resultados del ensayo de osteogénesis indicaron que, en unas condiciones de selección continua (en que las células crecieron más lentamente), las MASCs transfectadas establemente con los vectores pNFK y pN2 que codifican un NICD muestran una tinción con Alizarin Red mucho más fuerte que unas MASCs transfectadas establemente con un vector que codifica solamente la NPT (pN0), tanto en la presencia como en la ausencia de 500 ng/ml de BMP6. Una comparación de las células que no habían sido sometidas a una selección continua mostró que unas DRCs, que se sometieron a una selección durante solamente una semana después de la transfección con un vector que codifica un NICD, tenían un potencial osteogénico más débil (como se pone en evidencia por una tinción con Alizarin Red) que unas MASCs no transfectadas.

Para cuantificar la extensión de la diferenciación osteogénica, el Alizarin Red fue extraído a partir de unos duplicados de las muestras analizadas tal como se describió más arriba, y los niveles del Alizarin Red extraído se determinaron por espectrofotometría. Las muestras se extrajeron con una mezcla de HCl 0,5 N y SDS al 5 % y el extracto se transfirió a un micropocillo nuevo para la determinación de la absorbancia a 450 nm. La Figura 2 muestra que los niveles de Alizarin Red (y por lo tanto el potencial osteogénico) eran altísimos en unas células que habían sido transfectadas establemente con pNFK y pN2, y bajísimos en unas DRCs (marcadas como SB623 en la figura) y en unas células transfectadas con un vector que carece de secuencias de NICD (pN0).

En un experimento separado, se determinaron los niveles de un ARNm que codifica un NCID transcrito a partir de un ADN exógeno en unas células transfectadas establemente. En el momento en que los diversos cultivos de células transfectadas establemente fueron transferidos a un medio de diferenciación, unas muestras separadas de 0,5 ml de unas suspensiones de células se sembraron en unos platos de 10 cm y se cultivaron durante tres días. Unos ARNm que codifican un NCID en estas muestras de células se determinaron tal como se describió en el Ejemplo 8. Los niveles de ARNm de NICD se normalizaron a unos niveles de ARNm de GAPDH, y el valor normalizado en DRCs se ajustó arbitrariamente a 1,0. La Figura 3 muestra los resultados, expresados como niveles de ARNm de NICD normalizado a GAPDH en relación con el que se presenta en unas DRCs (marcadas como "SB" en la Figura). Los niveles más altos de un ARNm que codifica un NCID se encontraron en unas células transfectadas establemente con pN2-y pNFK. Puesto que estas células también muestran también los más altos niveles de tinción con Alizarin Red (p.ej. véase la Figura 2), estos resultados son compatibles con la idea de que unos altos niveles de NICD en posteriores momentos después de una transfección estimulaban a la diferenciación osteogénica.

Ejemplo 10: El potencial adipogénico de unas MASCs es inhibido por activación con el Jagged, que es unligando de Notch

Este ejemplo muestra que, aunque la generación de NICD intracelular por activación de células con el Jagged1 estimulaba el potencial osteogénico de las MASCs, él inhibía su potencial adipogénico.

Las MASCs se prepararon esencialmente tal como se describió en el Ejemplo 1. El cultivo en un medio de diferenciación adipogénica fue tal como se describió en el Ejemplo 6. El tratamiento de las células con Anti-Fc y la Jag1/Fc Arracimada fue tal como se describió en el Ejemplo 7. La fijación, la tinción con Oil Red O y el análisis de la diferenciación adipogénica fueron tal como se describió en el Ejemplo 6.

Los resultados de este experimento indicaron que se observó desde poca a ninguna diferenciación adipogénica en la ausencia del DAPT o de la BMP6; aunque la poca adipogénesis que se realizó fue bloqueada por la Jag. El DAPT (que inhibe la generación del NICD) aumentaba ligeramente la adipogénesis. La presencia de la BMP6 en el medio

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de diferenciación aumentaba fuertemente la adipogénesis; y este efecto es invertido por la Jag. La estimulación de la adipogénesis por la BMP6 es aumentada por el DAPT; y la Jag no tiene ningún efecto en este caso. Las DRCs exhibían desde poco a ningún potencial adipogénico en cualquiera de estas condiciones. Estos resultados indican que la activación de la Notch por el Jagged inhibe la adipogénesis en MASCs; mientras que el bloqueo de la generación del NICD con el DAPT estimula la adipogénesis, especialmente en la presencia de la BMP6.

Ejemplo 11: Efecto de la expresión prolongada del NICDsobre la adipogénesis

En unos adicionales experimentos, se determinó el efecto de la expresión prolongada del NICD sobre la adipogénesis, en unos cultivos de células transfectadas establemente. Los resultados de estos experimentos mostraron que, después de una selección continua en G418, no se observó ninguna adipogénesis (ensayad por tinción con Oil Red O) en unas células transfectadas establemente con pNFK o pN2; mientras que las células transfectadas establemente con pN0 exhiben una adipogénesis en la presencia de la BMP. Tal como se mostró con anterioridad, las MASCs son aptas para ser sometidas a una diferenciación adipogénica; mientras que el potencial de diferenciación adipogénica de las DRCs está ausente o ha sido reducido grandemente en comparación con las MASCs. Estos resultados indican que la expresión tanto transitoria como estable de un NICD exógeno da como resultado una inhibición de la adipogénesis.

Ejemplo 12: Alteraciones en la expresión de genes en unas células restringidas en cuanto a la diferenciación

Con el fin de determinar si unos cambios en la expresión de genes acompañan a las restricciones en el potencial de desarrollo que resulta a partir de una transfección de las MASCs con unas secuencias que codifican un NICD, la expresión de genes seleccionados en las MASCs fue comparada con una expresión de los mismos genes en unas DRCs, por medición de sus niveles de ARNm.

En el primer experimento, se analizaron dos dianas directas de la acción del NICD, los genes Hes1 y Hey1. En condiciones normales, la activación por la Notch unida a una membrana da como resultado una disociación del dominio intracelular (NICD), que se transloca al núcleo y se fija a un agente inhibidor de la transcripción de Hes1 y Hey1. El resultado es que se activa la transcripción de los genes Hes1 y Hey1.

De manera correspondiente, los niveles de los ARNms de Hes1 y Hey1 se midieron en varios conjuntos apareados de DRCs y MASCs (es decir, se obtuvieron unas MASCs a partir de un donante y una parte de estas MASCs se convirtió en unas DRCs). El ARN total se purificó y usó como un molde para una RT-PCR, usando unos cebadores de la PCR que son específicos para Hes1 y Hey1. Los niveles del ARNm de GAPDH se midieron también en las mismas células, para su uso como un patrón de normalización.

Tal como se muestra en la Tabla 1, los niveles de ARNm de Hey 1 se aumentaron en unas DRCs en comparación con sus MASCs parentales, lo que es compatible con las anteriores observaciones a continuación de la activación por Notch in vivo. Sorprendentemente, sin embargo, los niveles de ARNm de Hes 1 disminuyeron en las DRCs. Sin desear estar vinculado por ninguna teoría, el autor del invento señala que, durante la conversión de las MASCs en las DRCs, se realizó una selección en cuanto a la presencia del NICD durante un período de tiempo de una semana. Por lo tanto, la extensión y/o la duración de la actividad del NICD pueden diferir de las que se presentan durante una activación fisiológica por el NICD, y esto puede dar como resultado diferentes efectos corriente abajo en comparación con los que se presentan a continuación de la activación normal por Notch. Por lo demás, el producto del gen Hes1 autorregula negativamente su expresión; por lo tanto, activación inicial del Hes1 por el NICD en unas DRCs puede ser seguida por su auto-represión.

Tabla 1: Niveles relativos de ARNm de unos genes activados por NICD en unas DRCs en comparación consus MASCs parentales *

Donante

Hes 1 Hey 1

D33

0,09 imagen1

D36

0,21 imagen2

D38

0,25 imagen3

D41

0,55 2,1

D51

0,64 3,52

Promedio

0,37 2,82

Desviaciones típicas

0,27 1,0

* Se midieron los niveles de Hes 1 y se compararon en cinco diferentes conjuntos de pares de DRC/MASC emparejadas y se da la relación de niveles en DRCs/niveles en MASCs. En dos de estos pares de donantes, se midieron también los niveles de Hey. Las relaciones promedias y las desviaciones típicas se presentan en las dos

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Donante

Hes 1 Hey 1

filas inferiores.

Ejemplo 13: Análisis de adicionales dianas de Notch, miembros de la ruta de Notch y miembros de la ruta de Wnt

La expresión de un cierto número de genes que están implicados en una señalización por Notch, y en unas rutas de señalización que interactúan con la ruta de Notch (Wnt, Shh), fue comparada en DRCs y MASCs, usando un conjunto comercial (placa RT2 Profiler PCR Array Human Notch Signalling Pathway, de SA Biosciences Nº PAHS059F). Los genes que se analizaron se muestran en la Tabla 2 (tomada del catálogo online de SA Biosciences). Los miembros de la ruta de Notch incluyen unos genes que codifican unos ligandos de Notch, unas enzimas que modifican a la proteína de Notch y diversas proteínas reguladoras de la transcripción que controlan la expresión de los miembros de la ruta de Notch. Las dianas de la ruta de Notch son unos genes cuya expresión es regulada o bien directamente o indirectamente por activación con Notch. Los miembros de la ruta de Wnt son unos ligandos o unas proteínas Wnt que participan en unas rutas de señalización mediadas por WNT. La ruta de Wnt se investigó a causa del conocido solapamiento entre las rutas de señalización de Notch y Wnt, y a causa de que ella está implicada en una diferenciación osteogénica, que es inhibida en las DRCs.

Tabla 2: Genes implicados en, o relacionados con, una señalización de Notch

Ruta de Señalización de Notch:

Fijación de Notch: DLL1 (DELTA1), DTX1, JAG1, JAG2.

Procesamiento de Receptores de Notch: ADAM10, PSEN1, PSEN2, PSENEN (PEN2). Genes Dianas de la Ruta de Señalización de Notch::

Genes de Apóptosis: CDKN1A, CFLAR (CASH), IL2RA, NFKB1.

Reguladores del Ciclo Celular: CCND1 (Ciclina D1), CDKN1A (P21), IL2RA.

Proliferación de Células: CDKN1A (P21), ERBB2, FOSL1, IL2RA.

Genes que Regulan la Diferenciación de Células: DTX1, PPARG.

Neurogénesis: HES1, HEY1.

Regulación de la Transcripción: DTX1, FOS, FOSL1, HES1, HEY1, NFKB1, NFKB2, NR4A2, PPARG, STAT6.

Otros Genes Diana con Funciones No Especificadas: CD44, CHUK, IFNG, IL17B, KRT1, LOR, MAP2K7, PDPK1,

PTCRA.

Otros Genes Implicados en la Ruta de Señalización de Notch:

Genes de Apóptosis: AXIN1, EP300, HDAC1, NOTCH2, PSEN1, PSEN2.

Reguladores del Ciclo Celular: AXIN1, CCNE1, CDC16, EP300, FIGF, JAG2, NOTCH2, PCAF.

Proliferación de Células: CDC16, FIGF, FZD3, JAG1, JAG2, LRP5, NOTCH2, PCAF, STIL (SIL).

Genes que Regulan la Diferenciación de Células: DLL1, JAG1, JAG2, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4,

PAX5, SHH. Neurogénesis: DLL1, EP300, HEYL, JAG1, NEURL, NOTCH2, PAX5, RFNG, ZIC2 (HPE5). Regulación de la Transcripción: AES, CBL, CTNNB1, EP300, GLI1, HDAC1, HEYL, HOXB4, HR, MYCL1, NCOR2,

NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, PAX5, PCAF, POFUT1, RUNX1, SNW1 (SKIIP), SUFU, TEAD1, TLE1.

Otros Genes con Funciones No Especificadas: ADAM17, GBP2, LFNG, LMO2, MFNG, MMP7, NOTCH2NL, NUMB, SEL1L, SH2D1A. Otras Rutas de Señalización que se Solapan con la Ruta de Señalización de Notch:

Ruta de Sonic Hedgehog (Shh): GLI1, GSK3B, SHH, SMO, SUFU.

Ruta de Señalización de Receptores de Wnt: AES, AXIN1, CTNNB1, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD6, FZD7, GSK3B, LRP5, TLE1, WISP1, WNT11.

Otros Genes Implicados en la Respuesta Inmunitaria: CXCL9, FAS (TNFRSF6), G1P2, GBP1, IFNG, IL2RA, IL2RG, IL4, IL4R, IL6ST, IRF1, ISGF3G, OAS1, OSM, STAT5A, STUB1.

Unas MASCs y DRCs, preparadas y congeladas tal como se describió en los Ejemplos 1-3, fueron descongeladas (Ejemplo 4), dejadas crecer durante 4-7 días en un medio alfa-MEM/10 % de PBS/pen-strep, luego se volvieron a sembrar en placas dentro de unos platos de Petri de 10 cm en una concentración de 0,5 x 106 células/plato, por duplicado. Después de volver a sembrar, las células se dejaron crecer durante 4 días para permitir que los niveles intracelulares de NICD endógeno, activados por tripsinización, volviesen a los basales. Al final de este período de

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tiempo, el medio de cultivo fue aspirado cuidadosamente, las células se lisaron en 400 µl del tampón RLT Buffer (Qiagen, Valencia, CA), y el material lisado fue separado por raspadura desde la placa.

Como un testigo, unas MASCs que habían sido expuestas a la proteína Jagged1 soluble arracimada, con el fin de activar a la ruta de señalización de Notch (véase el Ejemplo 7), se analizaron también y se compararon con otras MASCs.

El material lisado fue homogeneizado usando un QiaShredder (de Qiagen, Valencia, CA). El material homogeneizado fue mezclado con etanol, y la mezcla fue aplicada a una columna RNeasy (de Qiagen, Valencia, CA) y tratada de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El material eluido fue tratado con un estuche ADN-free™ kit (de Ambion, Austin, TX), de acuerdo con el protocolo del fabricante, para la eliminación del ADN genómico.

La concentración y la pureza del ARN se ensayaron en un espectrofotómetro Nanodrop (de Thermo Scientific, Wilmington, DE). Si una muestra del ARN tenía una relación OD260/OD280 >2 y una relación OD260/OD230 >1,7, las muestras del ARN se usaron para un ulterior análisis. Si una muestra del ARN no cumplía con estos criterios, ella fue purificada de nuevo usando una columna RNeasy (como anteriormente) y fue vuelta a ensayar por espectrofotometría. Cuando se obtuvo la requerida pureza, las muestras del ARN se convirtieron en un ADNc usando el estuche Superarray RT2 First Strand (de SA Biosciences, Frederick, MD, Cat # C-03), usando 0,5 g del molde de ARN. Una síntesis de la primera hebra se realizó en paralelo para las muestras de MASCs y DRCs procedentes del mismo donante.

Las muestras del ADNc, sintetizadas tal como se describió más arriba, se diluyeron y añadieron a una RT2 SYBR Green qPCR Master Mix (de SA Biosciences) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las muestras se aplicaron luego a la placa de RT2 Profiler PCR Array Human Notch Signalling Pathway (de SA Biosciences Nº PAHS-059F), de acuerdo con el protocolo del fabricante. La placa contiene, en cada pocillo, un par de cebadores que es específico para un gen particular (véase la Tabla 2 para una lista de genes que se ensayaron). Una PCR en tiempo real se realizó en un Light Cycler R (de Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y usando a programa recomendado por SA Biosciences para ensayar sus conjuntos de RT2. Según se produce y se autoreanilla el producto de la amplificación, el tinte verde de SYBR se fija al material de doble hebra. La fluorescencia del verde de SYBR, normalizada para testigos, que también estaba presente en el conjunto, se usa como una medida del nivel del ARNm.

Los resultados se analizaron usando unas herramientas de análisis proporcionadas por SA Biosciences, asignando los resultados de MASCs al campo "Testigo" y los resultados de DRCs al campo "Ensayo" campo, para obtener unos valores para los cambios relativos en expresión para los genes ensayados. Este análisis fue realizado para cada de uno de tres pares de donantes de MASCs y DRCs, y los resultados se promediaron.

La Tabla 3 muestra una lista de genes (entre los 84 ensayados en el conjunto) cuya expresión fue alterada en al menos dos veces en unas MASCs activadas por la Jag. Las MASCs activadas por la Jag se ensayaron para proporcionar unos resultados para células en las que la activación por Notch y la liberación de NICD se realizan a través del mecanismo fisiológico de contacto entre un ligando de Notch y un receptor de Notch en la superficie de las células. Además de ello, los niveles de expresión de ciertos genes se compararon en unas DRCs y sus MASCs progenitoras. Las relaciones de sus niveles de ARNm en DRCs a sus niveles de ARNm en las MASCs (promediados a lo largo de tres pares de MASCs y DRCs, siendo obtenido cada par a partir del mismo donante), se dan en la Tabla 4.

Los criterios para los cambios en la expresión de genes, para ambos tipos de análisis, se establecieron de la siguiente manera. Cualquier gen cuyos niveles de ARNm aumentaron en dos veces o más en unas DRCs en comparación con unas MASCs, o en unas MASCs activadas por la Jag en comparación con unas MASCs, fue calificado como activado; y cualquier gen cuyos niveles de ARNm disminuyeron en dos veces o más en unas DRCs o en unas MASCs activadas por Jag, en comparación con unas MASCs (es decir.los niveles fueron de 50 % o menos en unas DRCs o unas MASCs activadas por la Jag, en comparación con unas MASCs) fue calificado como reprimido.

Usando estos criterios, 18 genes exhibieron una expresión aumentada, y tres genes mostraron una expresión reducida, en unas MASCs activadas por la Jag, en comparación con unas MASCs. De estos 21 genes, solamente cuatro genes (HR, Hes1, Hey1 y Wisp1) exhibieron cambios en su expresión, en más de dos veces en cualquiera de las direcciones, en las DRCs (véase la Tabla 4). La expresión de Hey1 fue activada, y la de HR, Hes1 y Wisp1 fue reprimida. Como detalle interesante, mientras que la expresión de HR, Hes1 y Wisp1 fue reprimida en las DRCs; la expresión de estos genes fue regulada en sentido ascendente en unas MASCs activadas por la Jag. Por lo demás, la expresión de CCND1 (ciclina D1, un agente regulador del ciclo celular), fue activada en las DRCs en comparación con las MASCs; mientras que su expresión no fue alterada en unas MASCs activadas por la Jag, de acuerdo con los criterios que se han expuesto más arriba.

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Estos cambios en la expresión de genes sirven para distinguir a las DRCs con respecto de sus células progenitoras (MASCs) y pueden influir sobre su potencial de desarrollo alterado.

Tabla 3: Genes cuya expresión fue alterada después de una activación de la ruta de Notch en unas MASCs por activación de las MASCs con el ligando Jagged arracimado

Abreviatura

Nombre del Gen Información adicional

DLL1

Delta-like 1 (parecido a delta 1) Homólogo de un ligando de Notch de Drosophila

HR

Hairless (sin pelo) Homólogo de un represor de la transcripción murino

JAG1

Jagged (dentado) 1 Homólogo de un ligando de Notch de Drosophila

LFNG

LFNG-O-fucosilpéptido 3-beta-N-acetilglucosaminiltransferasa Proteína de Notch

NEURL

Homólogo Neuralized Ubiquitinación de proteínas de la familia Delta/serrate/lag -2

NOTCH3

Homólogo de Notch 3 Receptor de Notch

PCAF

Factor asociado con p300/CBP Proteína reguladora de la transcripción

CD44

Cluster of differentiation (racimo de diferenciación) 44 Marcador de la superficie de células hematopoyéticas

CDKN1A

Agente inhibidor de la cinasa dependiente de la ciclina A 1 Regulador del ciclo celular

FOSL1

FOS-like antígeno 1 Factor de transcripción; regula la proliferación de células

HES1

Hairy and enhancer of split (peludo e intensificador de la disociación) 1 Factor de diferenciación neural

HEY1

Hairy/enhancer of split -relacionado con el motivo 1 de YRPW Factor de diferenciación neural

MAP2K7

Proteína cinasa 7 activada por mitógenos Mediador de la transducción de señales

PDPK1

Proteína cinasa 1 dependiente del 3-fosfoinositido Mediador de la señalización del factor de crecimiento

PPARγ

Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (Receptor gamma activado por el proliferador de peroxisomas) Receptor nuclear; factor de transcripción

FZD3

Frizzled (ensortijado) homólogo 3 Receptor de Wnt

FZD4

Frizzled homólogo 4, CD344 Receptor de Wnt

FZD6

Frizzled homólogo 6 Receptor de Wnt

WISP1

Proteína 1 de la ruta de señalización inducible por Wnt1 Mediador de Wnt

WNT 11

Miembro de la familia del sitio de integración 11 MMTV tipo Wingless (sin alas) Homólogo Wnt

GLI1

Homólogo 1 de un oncogén asociado con un glioma Proteína de dedo de zinc

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Tabla 4: Análisis de conjunto de la expresión de genes en DRCs en comparación con MASCs

Gen‡

Relación DRC/MASC* Desv. Tipic.

Miembros de la ruta de Notch

DLL1 0,86 0,08

HE

0,38 0,27

JAG1

0,86 0,09

LFNG

0,57 0,9

NEURL

1,68 1,9

NOTCH3

0,86 0,4

PCAF

1,32 0,79

Dianas de la ruta de Notch

CCND1 2,1 0,42

CD44

0,81 0,74

CDKN1A

1,04 0,37

FOSL1

1,07 0,09

HES1

0,49 0,21

HEY1

2,85 1,09

MAP2K7

0,95 0,86

PDPK1

1,3 0,5

PPARγ

0,82 0,40

Miembros de la ruta de Wnt

FZD3 1,74 2,44

FZD4

1,51 0,5

FZD6

1,0 0,29

WISP1

0,40 0,1

WNT11

1,96 2,22

‡ Véase la Tabla 2 para la identificación de los genes * Promediado a partir de pares de MASC/DRC apareadas procedentes de tres donantes

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para restringir el potencial de una célula estromal adherente de médula para diferenciarse en una célula del linaje mesenquimal, comprendiendo el método:

   5 (a) transfectar células estromales adherentes de médula con un ácido nucleico que comprende secuencias que codifican un dominio intracelular de Notch (NICD);

   (b)

   someter a las células a una selección en cuanto al ácido nucleico de la etapa (a);

   (c)

   retirar la selección después de un lapso de tiempo previamente determinado; y

   (d)

   expandir las células de la etapa (c).

   10 2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se reduce el desarrollo de la célula estromal adherente de médula a la forma de un linaje osteogénico.
2. 3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se reduce el desarrollo de la célula estromal adherente de

   médula a la forma de un linaje adipogénico. 15
3. 4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se reduce el desarrollo de la célula estromal adherente de médula a la forma de unos linajes tanto osteogénicos como adipogénicos.
4. 5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el NICD es un NICD humano. 20

5. 6.

   El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el NICD comprende los aminoácidos 1703-2504 de la proteína de Notch humana.

6. 7.

   El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el lapso de tiempo predeterminado es de siete días.

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