CN104797264A - 用于治疗视网膜变性的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本文公开了使用骨髓贴壁干细胞治疗例如发生在色素性视网膜炎和年龄相关性黄斑变性中的视网膜变性的方法和组合物，所述骨髓贴壁干细胞已经被改造以表达外源性Notch胞内结构域。

Description

用于治疗视网膜变性的方法和组合物
相关申请的交叉参考
本申请要求2012年10月9日提交的美国临时申请号US61/711,665的利益，将该文献的公开内容完整地引入本文参考。
关于联邦政府支持的声明
不适用。
领域
本申请属于用于视网膜变性的细胞疗法领域，所述视网膜变性例如发生在色素性视网膜炎和年龄相关性黄斑变性(AMD)中。
背景
例如，因脉络膜新血管生成(“湿AMD”)或视网膜与脉络膜之间的细胞碎片累积(“干AMD”)导致的视网膜变性是当今世界中失明的主要原因。Cai等人(2012)Front Biosci.17:1976-95。类似地，当色素性视网膜炎发生时，感光细胞(视杆和视锥)变性和死亡也可以导致视力退化和/或视盲。因此，在恢复感光细胞功能的具体治疗中阻断和/或逆转视网膜变性的疗法是需要的。
概述
本文公开了使用由骨髓贴壁干细胞(MASCs)传代的细胞治疗视网膜变性的方法和组合物，所述骨髓贴壁干细胞已经被改造以表达外源性Notch胞内结构域。这样的细胞称作用于本公开目的的SB623细胞。
在一个方面中，本文公开了通过对需要的受试者眼施用SB623细胞治疗视网膜变性的方法。
在另一个方面中，本文公开了增加受试者眼中感光细胞活性的方法，所述方法包含对受试者眼施用SB623细胞，使得感光细胞活性增加。
在另一个方面中，本文公开了增强受试者眼中感光细胞功能的方法，所述方法包含对受试者眼施用SB623细胞，使得感光细胞功能增强。
在另一个方面中，本文公开了增强视觉信号从视网膜到脑视觉皮质传送的方法，所述方法包含对受试者眼施用SB623细胞，使得视觉信号从视网膜到脑视觉皮质的传送增强。
在本文所述的任意方法中，可以通过任意递送方法施用所述细胞，包括直接注射、局部施用等。在一些实施方案中，例如，将SB623细胞作为包含该细胞与一种或多种药用载体的组合物(或制剂)施用。此外，所述方法可以包括以相同或不同制剂的形式反复施用SB623细胞。
因此，本公开特别提供了如下实施方案：
1.对需要的受试者治疗视网膜变性的方法，该方法包含对所述受试者施用SB623细胞。
2.实施方案1的方法，其中将SB623细胞移植入受试者眼。
3.实施方案1或2任一项的方法，其中所述移植是玻璃体内移植。
4.实施方案1或2任一项的方法，其中所述移植是视网膜下移植。
5.实施方案1-4任一项的方法，其中所述视网膜变性发生在色素性视网膜炎中。
6.实施方案1-4任一项的方法，其中所述视网膜变性发生在年龄相关性黄斑变性(AMD)中。
对本领域技术人员而言，这些和其它方面根据作为整体的公开内容显而易见。
附图简述
图1显示来自出生后4周(治疗前，上部组群)、出生后8周(治疗后4周，来自上部第二组群)和出生后12周(治疗后8周，来自上部的第三组群)时RCS大鼠眼的有代表性的视网膜电流图(ERG)痕迹。在出生后4周时通过玻璃体内注射1.5x 105SB623细胞(右侧的组)或PBS(左侧的组)治疗大鼠。下部的组群显示，对于出生后4周时通过玻璃体内注射1.5x 105SB623细胞(右侧的组)或PBS(左侧的组)治疗的大鼠，在出生后12周时(治疗后8周)如根据叠氮化物响应测定的感光细胞活性。
图2，A和B组，其显示描述来自出生后4、5、6、8和12周时(即治疗前和治疗后1、2、4和8周时)取得的RCS大鼠的视网膜电流图a-波(图2A)与b-波(图2B)之间的相对振幅的一组示意图。对于每一组的棒形图，最左侧的棒形图代表首次用于实验的(即未治疗的)动物的值。继续向右，其余的棒形图代表通过玻璃体内注射媒介物、0.375x 105SB623细胞、0.75x 105SB623细胞和1.5x 105SB623细胞治疗的动物的值。括号内的数字表示所分析的眼数量。将治疗前的值设定为100％。
图3是显示出生后12周时(治疗后8周)RCS大鼠眼中叠氮化物响应的振幅(以微伏计)的示意图。未进行治疗(“首次用于实验的动物”)得动物或对4周龄动物进行玻璃体内注射PBS(“媒介物”)、0.375x 105SB623细胞、0.75x 105SB623细胞或1.5x 105SB623细胞。括号内的数字表示所分析的眼数量。
图4，A和B组，其显示在治疗后9周时RCS大鼠视网膜的苏木素和曙红(H&E)-染色的切片。图4B显示来自出生后4周时通过玻璃体内注射1.5x 105SB623细胞治疗的大鼠眼的切片。图4A显示来自出生后4周时通过玻璃体内注入PBS的对照大鼠眼的切片。发育良好的外核层(图中显示的“ONL”)存在于SB623-治疗的眼中，但在媒介物治疗的眼中不存在。
图5，A-D组，其显示来自玻璃体内注射1.5x 105SB623细胞后9周(出生后13周)的RCS大鼠视网膜的切片。图5A和5C显示H&E-染色的切片；图5B和5D显示用抗-人线粒体抗体染色(绿色)并用核-特异性染料DAPI复染(蓝色)的切片。两个上面的组显示包含玻璃体内SB623细胞团的切片。两个下面的组显示视网膜切片，其中可以在视网膜的内界膜上观察到SB623细胞。
图6显示来自出生后4周(治疗前，上部组群)、出生后8周(治疗后4周，来自上部第二组群)和出生后28周(治疗后24周，来自上部的第三组群)时RCS大鼠眼的有代表性的视网膜电流图(ERG)痕迹。在出生后4周时通过视网膜下注射1.5x 105SB623细胞(右侧的组)或PBS(左侧的组)治疗大鼠。下部的组群显示，对于出生后4周时通过视网膜下注射1.5x 105SB623细胞(右侧的组)或PBS(左侧的组)治疗的大鼠，在出生后28周时(治疗后24周)如根据叠氮化物响应测定的感光细胞活性。
图7，A和B组，其显示描述来自治疗前和治疗后4、8、12、16、20和24周时取得的RCS大鼠的视网膜电流图a-波(图7A)与b-波(图7B)之间的相对振幅的一组示意图。对于每一组的棒形图，最左侧的棒形图代表首次用于实验的(即未治疗的)动物的值；中间的棒形图代表通过视网膜下注射媒介物治疗的动物的值；且最右侧的棒形图代表通过视网膜下注射1.5x 105SB623细胞治疗的动物的值。括号内的数字表示所分析的眼数量。将治疗前的振幅设定为100％。
图8是显示治疗后4、8、12、16、20和24周时RCS大鼠眼中叠氮化物响应的振幅(以微伏计)的示意图。对于每组3个棒形图，最左侧的棒形图代表首次用于实验的(即未治疗的)动物的值；中间的棒形图代表通过视网膜下注射媒介物治疗的动物的值；且最右侧的棒形图代表通过视网膜下注射1.5x 105SB623细胞治疗的动物的值。括号内的数字表示所分析的眼数量。
图9显示来自首次用于实验的、媒介物治疗的和SB623细胞治疗的RCS大鼠的视网膜下移植后26周取得的视觉诱发电位(VEP)痕迹。
图10，A和B组，其显示在治疗后27周时RCS大鼠视网膜的苏木素和曙红(H&E)-染色的切片。图10B显示来自出生后4周时通过视网膜下注射1.5x 105SB623细胞治疗的大鼠眼的切片。图10A显示来自出生后4周时通过视网膜下注入PBS的对照大鼠眼的切片。发育良好的外核层(图中显示的“ONL”)存在于SB623-治疗的眼中，但在媒介物治疗的眼中不存在。
图11，A和B组，其显示来自视网膜下注射1.5x 105SB623细胞后27周(出生后31周)的RCS大鼠视网膜的切片。图11A显示H&E-染色的切片；图11B显示用抗-人线粒体抗体染色(绿色)并且用核-特异性染料DAPI复染(蓝色)的切片。移植的SB623细胞在图11A中可见(箭头)。
详细描述
本文公开了用于治疗视网膜变性和视网膜变性病症的方法和组合物。特别地，将SB623细胞(通过用编码Notch胞内结构域的序列转染间充质干细胞得到的细胞)移植入发生视网膜变性(或患有视网膜变性病症)的受试者眼可以预防视网膜变性并且导致视网膜功能长期恢复。
除非另有指示，否则本公开的实施使用细胞生物学、毒理学、分子生物学、生物化学、细胞培养、免疫学、肿瘤学、重组DNA领域和相关领域的标准方法和常规技术。这样的技术描述在文献中且由此为本领域技术人员可以得到。例如，参见：Alberts,B.等人,“Molecular Biologyof the Cell,”第5版,Garland Science,New York,NY,2008；Voet,D.等人“Fundamentals of Biochemistry：Life at the MolecularLevel,”第3版,John Wiley&Sons,Hoboken,NJ,2008；Sambrook,J.等人,“Molecular Cloning：A Laboratory Manual,”第3版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,2001；Ausubel,F.等人,“CurrentProtocols in Molecular Biology,”John Wiley&Sons,New York,1987和最新期刊杂志；Freshney,R.I.,“Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique,”第4版,John Wiley&Sons,Somerset,NJ,2000；和系列丛书“Methods in Enzymology,”Academic Press,San Diego,CA。
视网膜变性
最常见发生的视网膜变性疾病的两种是色素性视网膜炎(RP)和年龄相关性黄斑变性(AMD)。色素性视网膜炎因视网膜感光细胞、也称作视杆和视锥变性导致。黄斑是对视网膜中心部分给出的名称并且负责与周围相对的中心视力。存在两种AMD形式。更常见的形式干AMD因视网膜与脉络膜(眼睛视网膜下的一层)之间的细胞碎片(玻璃疣)累积导致，从而造成感光细胞萎缩。AMD的另一种形式湿AMD因脉络膜中血管异常生长导致。这些血管可能渗漏，导致损伤脉络膜和视网膜。AMD的其它术语包括脉络膜新血管生成、视网膜下新生血管形成、渗出性形式和盘状变性。
视网膜变性病症的其它类型包括乌斯赫尔综合征(特征在于听力丧失和来自RP的进行性视盲的遗传性病症)、Stargardt病(遗传性青少年黄斑变性)、利伯先天性黑矇(特征在于出生时视盲的遗传病)、无脉络膜(因脉络膜和视网膜变性导致的进行性视力丧失的遗传性病症)、巴-比二氏综合征(包括视网膜变性且还可以包括多指趾畸形和肾脏病的障碍复合体)和雷夫叙姆病(因不能代谢特别地以RP为特征的植烷酸导致的障碍)。例如，参见Goodwin(2008)Curr Opin Ophthalmol19(3):255-62；Bonnet等人(2012)Curr Opin Neurol.25(1):42-9；Coussa等人(2012)Ophthalmic Genet.33(2):57-65。
可以使用本文所述的方法和组合物治疗的其它罕见视网膜变性病症包括Best’s disease、视锥-视杆视网膜营养性萎缩、环状萎缩、先天性夜盲症、青年性视网膜劈裂症、巴-科病(无β脂蛋白血症)、蓝色锥体性全色盲、显性玻璃疣(dominant drusen)、Goldman-Favre玻璃体视网膜变性(增强的S-椎体综合征)、基-塞二氏综合征、劳-穆二氏综合征、视乳头周围脉络膜营养不良、色素型营养不良(包括蝴蝶形色素区色素营养不良、北卡罗来纳黄斑营养不良、大网格营养不良、蜘蛛痣营养不良和Sjogren网状色素上皮营养不良)、Sorsby黄斑营养不良、Stickler综合征和Wagner综合征(玻璃体视网膜变性)。
SB623细胞
本公开提供了用于治疗视网膜变性的方法，通过对有此需要的受试者眼植入SB623细胞来进行，所述受试者即其中发生视网膜变性的受试者。SB623细胞得自骨髓贴壁间充质细胞(MASCs)，也称作间充质干细胞(MSCs)，通过表达MASCs中的Notch蛋白的胞内结构域来进行。通过从骨髓中选择贴壁细胞得到MASCs。
在一个实施方案中，使MASCs培养物接触包含编码NICD的序列的多核苷酸(例如通过转染)，随后通过药物选择和进一步培养富集转染的细胞。例如，参见美国专利US7,682,825(2010年3月23日颁布)；美国专利申请公开号US2010/0266554(2010年10月21日)；和WO2009/023251(2009年2月19日)；将这些公开文献的全部内容完整地引入，目的在于描述间充质干细胞的分离和间充质干细胞转化成SB623细胞(在那些文献中称作“神经前体细胞”和“神经再生细胞”)。另外参见下文的实施例1。
在这些方法中，可以使用编码Notch胞内结构域的任意多核苷酸(例如载体)，并且可以使用用于选择和富集转染细胞的任意方法。例如，在一些实施方案中，用包含编码Notch胞内结构域的序列并且还包含编码抗药性标记(例如耐受G418)的序列的载体转染MASCs。在另外的实施方案中，两种载体(即一种包含编码Notch胞内结构域的序列，而另一种包含编码抗药性标记的序列)用于转染MASCs。在这些实施方案中，在用载体转染细胞培养物后，通过向细胞培养物中添加足以杀伤不包含载体的细胞、而几乎不杀伤包含载体的细胞的用量的选择剂(例如G418)，实现了选择。不存在选择需要除去所述选择剂或将其浓度降至不杀伤不含载体的细胞的水平。在选择后(例如7天)，除去选择剂并且进一步培养细胞(例如2代)。
SB623细胞的制备由此包括MSC中外源性Notch胞内结构域的瞬时表达。为了达到这一目的，可以用包含编码Notch胞内结构域的序列的载体转染MSCs，其中所述序列不编码全长Notch蛋白。所有这样的序列均为众所周知的且易于被本领域技术人员得到。例如，Del Amo等人(1993)Genomics 15:259-264提供了小鼠Notch蛋白的完整氨基酸序列；而Mumm和Kopan(2000)Devel.Biol.228:151-165提供了来自小鼠Notch蛋白的氨基酸序列，围绕所谓的S3裂解位点，它们释放胞内结构域。这些参考文献一起为本领域技术人员提供了包含非全长Notch蛋白的Notch胞内结构域的各自和每一种肽；由此还为本领域技术人员提供了每一种多核苷酸，其包含编码Notch胞内结构域的序列，所述Notch胞内结构域不编码全长Notch蛋白。将上述文献(Del Amo和Mumm)完整性地引入参考，目的在于分别公开全长Notch蛋白的氨基酸序列和Notch胞内结构域的氨基酸序列。
对于来自另外种类的Notch蛋白和核酸可以得到类似的信息，包括大鼠、爪蟾属(Xenopus)、果蝇属(Drosophila)和人。例如，参见Weinmaster等人(1991)Development 113:199-205；Schroeter等人(1998)Nature 393:382-386；NCBI参比序列号NM_017167(和其中引述的参考文献)；SwissProt P46531(和其中引述的参考文献)；SwissProt Q01705(和其中引述的参考文献)；和GenBank CAB40733(和其中引述的参考文献)。将上述文献完整性地引入参考，目的在于公开大量不同种类中的全长Notch蛋白的氨基酸序列和Notch胞内结构域的氨基酸序列。
在另外的实施方案中，通过将包含编码Notch胞内结构域的序列的核酸导入MSCs、使得MSCs不表达外源性Notch胞外结构域来制备SB623细胞。例如，可以通过用包含编码Notch胞内结构域的序列的载体转染MSCs达到这一的目的，其中所述序列不编码全长Notch蛋白。
有关SB623细胞的制备和制备具有与可以用于本文公开方法的SB623细胞的那些类似特性细胞的方法的另外详细内容可以在如下文献中找到：美国专利US7,682,825；和美国专利申请公开号US2010/0266554和US2011/0229442；将这些公开文献引入本文参考，目的在于提供有关SB623细胞制备的另外的详细内容，并且提供制备具有与SB623细胞的那些类似特性细胞的方法。另外参见Dezawa等人(2004)J.Clin.Invest.113:1701-1710。
制剂、药盒和施用途径
还提供了包含如本文公开的SB623细胞的治疗组合物。这样的组合物典型地包含SB623细胞和药学上可接受的载体。
本文公开的治疗组合物特别地用于减缓视网膜变性进程、逆转视网膜变性和/或恢复感光细胞功能。因此，包含SB623细胞的组合物的“治疗有效量”可以是预防或逆转视网膜变性和/或恢复感光细胞功能的任意用量。例如，剂量可以在约100；500；1,000；2,500；5,000；10,000；20,000；50,000；100,000；500,000；1,000,000；5,000,000至10,000,000细胞或以上之间改变(或其中之间的任意整数值)；其中施用频率为，例如每天1次、每周2次、每周1次、每个月2次、每个月1次，这取决于例如体重、施用途径、疾病严重性等。
不同的药物组合物及其制备技术和用途是本领域技术人员根据本公开的内容已知的。对于适合的药物组合物及其施用技术的详细清单，可以参照教科书，例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版.1985；Brunton等人,“Goodman和Gilman的The PharmacologicalBas is of Therapeutics,”McGraw-Hill,2005；University of theSciences in Philadelphia(eds.),“Remington：The Science和Practice of Pharmacy,”Lippincott Williams&Wilkins,2005；和University of the Sciences in Philadelphia(eds.),“Remington：The Principles of Pharmacy Practice,”Lippincott Williams&Wilkins,2008。
可以将本文所述的细胞混悬于用于移植的生理学相容性载体。本文所用的术语“生理学相容性载体”是指与制剂的其它成分相容且对其接受者而言无害的载体。本领域技术人员熟知生理学相容性载体。适合的载体的实例包括细胞培养基(例如Eagle最小必需培养基)、磷酸缓冲盐水、Hank平衡盐溶液+/-葡萄糖(HBSS)和多电解质溶液例如Plasma-LyteTM A(Baxter)。
施用于受试者的SB623细胞混悬液体积取决于移植部位、治疗目标和溶液中的细胞数量。典型地，所施用的细胞量是治疗有效量。本文所用的“治疗有效量”或“有效量”是指对特定障碍进行有效治疗所需的移植细胞的数量；即产生与该障碍相关的症状数量和/或严重性降低。例如，就治疗AMD而言，移植治疗有效量的SB623细胞典型地导致预防或逆转视网膜变性和/或恢复感光细胞功能。治疗有效量根据视网膜变性的类型和程度的不同而改变，且还可以根据受试者总体病情的不同而改变。
所公开的治疗组合物还可以包括药学上可接受的材料、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包囊材料即载体。例如，这些载体可以稳定SB623细胞和/或有利于SB623细胞在体内存活。每种载体应是“可接受的”含义在于与制剂的其它成分相容并且对受试者无损伤。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；西黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，例如丙二醇；多元醇类，例如甘油、山梨醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原水；等渗盐水；林格液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；和其它用于药物制剂的无毒性相容性物质。在组合物中还可以存在湿润剂、乳化剂和润滑剂，例如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁；和着色剂、脱膜剂、包衣衣料、甜味剂、矫味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。
示例性制剂包括、但不限于适合于胃肠外施用的那些，例如肺内、静脉内、动脉内、眼内、颅内、硬膜下(sub-meningial)或皮下施用，包括包囊在胶束、脂质体或释药胶囊中的制剂(掺入为缓释设计的生物相容性包衣衣料的活性剂)；可摄取的制剂；局部应用的制剂，例如滴眼剂、霜剂、软膏剂和凝胶；和其它制剂，例如吸入剂、气雾剂和喷雾剂。本公开的组合物的剂量将根据对治疗需求的程度和严重性、所给药组合物的活性、受试者的一般健康状况和本领域技术人员众所周知的其它考量的不同而改变。
在另外的实施方案中，通过局部递送本文所述的组合物。局部递送能够通过非全身的方式递送组合物，由此与全身递送相比减少组合物的身体负担。例如，可以通过使用各种医疗植入的装置，包括但不限于支架和导管或可以通过吸入、静脉切开术、注射或手术实现这样的局部递送。用于涂敷、植入、包埋和另外使期望的活性剂结合医疗装置例如支架和导管的方法是本领域充分建立的并且是本文所关注的。例如，还可以通过眼内注射或通过施用滴眼剂实现局部递送。
本公开的另一个方面涉及用于实施将SB623细胞施用于受试者的药盒。在一个实施方案中，药盒包含如果适合(例如用适合的药用载体)配制为一种或多种单独的药物制剂的SB623细胞组合物。
施用
为了用SB623细胞治疗视网膜变性(例如AMD)，可以使用本领域已知用于将物质递送至眼的任意方法。就本公开的目的而言，“移植”是指通过任意方法将SB623细胞转入受试者眼。例如，直接注入眼可以用于递送SB623细胞混悬液。在一些实施方案中，将SB623细胞混悬液注入玻璃体液。在另外的实施方案中，使用视网膜下注射。在另外的实施方案中，使用局部施用；例如，可以将治疗组合物配制成用作滴眼液的溶液。在其它实施方案中，局部施用混悬液、凝胶等可以用于施用SB623细胞。
实施例
感光细胞的适当功能包括连续合成和脱落感光细胞外段。视网膜色素上皮(RPE细胞)细胞通过吞噬流出的外段并且通过重复利用维A酸和膜脂类有助于该过程。
皇家外科医师学会(The Royal College of Surgeons)大鼠(“RCS大鼠”)是遗传性视网膜变性的动物模型，其中视网膜变性因不能吞噬感光细胞外段的缺陷RPE细胞导致。D'Cruz等人(2000)HumanMolecular Genetics 9(4):645-651。在组织学上，RCS大鼠视网膜的特征在于感光细胞外段层与视网膜色素上皮之间的外节碎片异常蓄积。蓄积在感光细胞死亡前和与之同时发生。RCS大鼠经历感光细胞的进行性出生后损耗和附带视盲。
视网膜电描记术是这样一种方法，其中将电极置于角膜上，用闪光刺激眼并且用电极测定感光细胞的电活动性。Odom JV,Leys M,Weinstein GW.Clinical visual electrophysiology.：Tasman W,Jaeger EA,eds.Duane's Ophthalmology.第15版.Philadelphia,Pa：Lippincott Williams&Wilkins；2009:chap 5；Baloh RW,Jen J.Neuro-ophthalmology.：Goldman L,Schafer AI,eds.Cecil Medicine.第24版.Philadelphia,PA：Saunders Elsevier；2011:chap 432；Cleary TS,Reichel E.Electrophysiology.：Yanoff M,Duker JS,eds.Ophthalmology.第3版.St.Louis,Mo：Mosby Elsevier；2008:chap 6.9。
可以通过视网膜照像术测定的感光细胞功能的另一种测量值为全身导入叠氮化钠后0.05－50Hz之间的电活动性峰值，称作叠氮化物响应。
实施例1：SB623细胞混悬液的制备
通过用编码人Notch蛋白的胞内结构域的DNA转染人骨髓贴壁干细胞(MASCs)得到SB623细胞。MASCs如下得自人骨髓。成年人骨髓抽吸物购自Lonza(Walkersville,MD)。将细胞洗涤1次，并且铺展在CorningT225烧瓶(Corning,Inc.Lowell,MA.)中的生长培养基中：α-MEM(Mediatech,Herndon,VA)，其补充了10％胎牛血清(FBS)(Hyclone,Logan,UT)、2mM L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素(均来自Invitrogen,Carlsbad,CA)。3天后，除去未贴壁的细胞；并且将MASC培养物维持在生长培养基中约2周。在此期间，使用0.25％胰蛋白酶/EDTA使细胞传代两次。
为了制备SB623细胞，用pN-2质粒、使用Fugene6(RocheDiagnostics,Indianapolis,IN)、根据制造商的说明转染MASCs，所述pN-2质粒包含编码人Notch1胞内结构域(在CMV启动子的转录控制下)和新霉素抗性基因(在SV40启动子的转录控制下)的序列。简言之，将细胞与Fugene6/质粒DNA复合物一起温育24小时。用包含100ug/mlG418(Invitrogen,Carlsbad,CA)的生长培养基(上述成分)替代培养基并且持续筛选7天。在除去G418选择培养基后，将培养物维持在生长培养基中并且扩展2代。使用胰蛋白酶/EDTA收集SB623细胞，用冷冻培养基以7.5x 103、1.5x 104和3x 104细胞/ml的细胞密度配制，并且冷冻保存。将冷冻的SB623细胞储存在液N2的蒸气相中至需要时为止。
实施例2：玻璃体内移植
通过在出生后第2天开始施用口服环胞菌素A(在饮用水中200mg/l)并且持续至移植对RCS大鼠实施免疫抑制。通过注射移植SB623细胞在出生后4周时进行。在移植前，用盐酸赛拉嗪(BayerMedical,Ltd.)和盐酸氯胺酮(Daiichi Sankyo Co.,Ltd.)的混合物对动物实施全身麻醉，且典型地用0.4％盐酸oxybupurocaine(Santen Pharmaceutical Co.,Ltd.)局部麻醉。用托吡卡胺和盐酸去氧肾上腺素(Santen Pharmaceutical Co.,Ltd.)散瞳，然后将5ul SB623细胞混悬液注入玻璃体腔。使用带有30-号针头的汉密尔顿氏注射器进行注射。给对照组注射媒介物(PBS)或不进行注射(首次用于实验的)。实验设计如表1中所示。
表1
组 治疗 细胞数量(每只眼) 动物数量
1 首次用于实验的动物 - 5
2 媒介物(PBS) - 5
3 SB623 3.75x 104 5
4 SB623 7.5x 104 5
5 SB623 1.5x 105 7
在4周龄时移植SB623细胞后，在5、6、8和12周龄时(即移植后1、2、4和8周)通过视网膜电描记术测试动物并且在12周龄时(移植后8周)测试叠氮化物响应。在13周龄时(治疗后9周)，处死动物，并且取出其眼用于组织学检查。
为了进行视网膜电描记术，对大鼠实行暗适应1小时，然后用盐酸赛拉嗪(Bayer Medical,Ltd.)和盐酸氯胺酮(Daiichi Sankyo Co.,Ltd.)的混合物实施全身麻醉。用托吡卡胺和盐酸去氧肾上腺素(Santen Pharmaceutical Co.,Ltd.)散瞳。用置于角膜上的接触电极和放入鼻内的接地电极记录视网膜电流图(ERGs)。用白LED闪光(3,162cd/m2,10ms期限)引起响应并且用Neuropack S1NEB9404(Nihon Kohden Corp.)记录。
图1(上部的3个组对)显示对于媒介物治疗的动物(左侧的组)和每只眼用1.5x 105SB623细胞治疗的动物(右侧的组)的有代表性的ERG痕迹，它们恰好在移植前(出生后4周时)和在移植后4和8周时得到。在治疗后4-和8-周时在媒介物治疗的动物中既没有观察到a-波，也没有观察到b-波；而在SB623-治疗的动物中，在这些时间点处均保持了电活动性。根据ERG,确定的受体细胞电活动性的定量评价如图2中所示。在全部测试时间点处，SB623-治疗的动物保持了比首次用于实验的动物或媒介物治疗的动物更大的感光细胞电活动性。
为了测定移植后8周时的叠氮化物响应，对大鼠实行暗适应1小时，然后用盐酸赛拉嗪(Bayer Medical,Ltd.)和盐酸氯胺酮(Daiichi Sankyo Co.,Ltd.)的混合物实施全身麻醉，且典型地用0.4％盐酸oxybupurocaine(Santen PharmaceuticalCo.,Ltd.)局部麻醉。将接触电极置于角膜上，并且将0.1ml 0.1％叠氮化钠(NaN3)注入尾静脉。用在0.05-50Hz区间放大的Neuropack S1NEB9404(Nihon Kohden Corp.)记录响应。测定从基线到正峰的振幅，其在注射叠氮化物溶液后约4秒显现。
图1下部的组对显示，在治疗后8周时，通过玻璃体内注射1.5x105SB623细胞治疗的RCS大鼠眼中保持了叠氮化物响应(下部右侧的组)，而注射PBS的大鼠响应缺失(下部左侧的组)。图3显示在SB623-治疗的眼和对照眼中响应的振幅测量值。正如所示的，注射1.5x 105SB623细胞导致治疗后8周时的叠氮化物响应振幅具有统计学显著性地增加。
为了进行组织学分析，处死大鼠，并且取出其眼。在固定于4％低聚甲醛中后，根据制造商的说明将眼包埋在8100树脂(Heraeus Kulzer,Werheim,Germany)中。简言之，用包含6.8％蔗糖的PBS在4℃将眼洗涤过夜，用100％丙酮脱水，并且包埋在(EMS,Hatfield,PA)中。用胶粘剂将聚合的块固定在木块上并且使用带有一次性刀具的滑动切片机(HM440E,MICROM International GmbH,Walldorf,Germany)切片。3-微米切片用于使用抗-线粒体抗体(Millipore MAB1273)的免疫染色。
组织学分析揭示出，在媒介物治疗的眼中，截止到治疗后9周，视网膜外核层的大部分细胞不存在(图4A)。相反，在SB623-治疗的眼中，外核层的细胞保留良好(图4B)。在玻璃体中观察到移植的SB623细胞团(图5A和5B)，并且在视网膜的内界膜上观察到SB623细胞(图5C和5D)。在另外的实施方案中，观察到玻璃体内移植SB623细胞在治疗后达25周防止了外核层细胞缺失，且此时SB623细胞持续保持在玻璃体内。
上面提供的电生理学和形态分析结果表明玻璃体内移植SB623细胞保持了视网膜功能。
实施例3：视网膜下移植
如实施例1中所述制备SB623细胞并且混悬于PBS至3x 104细胞/ul密度。RCS大鼠的免疫抑制、全身和局部麻醉以及散瞳均如实施例2中所述进行。在出生后4周时，通过使用带有30-号针头的汉密尔顿氏注射器将5ul SB623细胞混悬液经玻璃体内注入视网膜下间隙进行SB623细胞移植。给对照组注射媒介物(PBS)或不进行注射(首次用于实验的)。实验设计如表2中所示。在本实验中，在治疗后持续分析较长期限：将视网膜电描记和叠氮化物响应测量持续24周，并且对治疗后27周得到的样本进行组织学和免疫组织化学分析。
表2
组 治疗 细胞数量(每只眼) 动物数量
1 首次用于实验的动物 - 4
2 媒介物(PBS) - 10
3 SB623 1.5x 105 10
视网膜电描记和叠氮化物响应测量如实施例2中所述进行。有代表性的结果如图6中所示。在大部分媒介物治疗的大鼠中，在治疗后4周时不能记录到ERG(图6，左侧的组)。然而，在SB623-治疗的动物中，在治疗后24周时保留了ERGs和叠氮化物响应(图6，右侧的组)。
图7显示在移植后达24周的4周间隔时ERG振幅改变的时程。截止到移植后8周，在来自首次用于实验的和媒介物治疗的大鼠中既不能检测到a-波，也不能检测到b-波；但在接受视网膜下注射SB623细胞的大鼠中，在治疗后达24周，a-和b-波都得以保留。
图8显示在移植后达24周的4周间隔时叠氮化物响应改变的时程。该响应在所有时间点时在首次用于实验的和媒介物治疗的动物中均减少。在接受视网膜下注射SB623细胞的大鼠中，与首次用于实验的和媒介物注射的大鼠相比，在治疗后达24周的所有时间点处均观察到了具有统计学显著性的叠氮化物响应增加。
这些电生理学检查结果表明移植SB623细胞可以长期保持视网膜功能。
为了测定视觉信号是否从视网膜传送至脑视觉皮质，测定治疗和未治疗RCS大鼠在治疗后26周时的视觉诱发电位(VEPs)。在VEP记录前7天，将螺旋电极置于硬膜外冠矢点后面6.8mm的头的两侧和中线3.2mm侧边，并且将参比电极置于硬膜外冠矢点后面11.8mm的中线上。在VEP记录的当天，对大鼠实行暗适应1小时，然后用盐酸赛拉嗪(Bayer Medical,Ltd.)和盐酸氯胺酮(Daiichi Sankyo Co.,Ltd.)的混合物实施全身麻醉。用托吡卡胺和盐酸去氧肾上腺素(Santen Pharmaceutical Co.,Ltd.)散瞳。用白LED闪光(3,162cd/m2,10ms期限)引起VEP响应并且用Neuropack S1 NEB9404(Nihon Kohden Corp.)记录。测定100次响应并且求结果的平均值。有代表性的结果如图9中所示。在首次用于实验的和媒介物注射的动物中，不能检测到VEPs。相反，在治疗后26周时，在视网膜下注射SB623细胞的大鼠中，VEP响应保留良好。这些结果表明用SB623细胞治疗恢复了将视觉信号传送至视觉皮质的能力。
对治疗后27周得到的样本的组织学和免疫化学分析如实施例2中所述进行。正如图10中所示，截止到移植后27周，在媒介物治疗的大鼠中几乎不存在外核层(ONL)细胞(如果有的话)。然而，在SB623-治疗的大鼠中，在27周时ONL的细胞保留良好。此外，在视网膜下间隙中观察到移植的SB623细胞，其可以通过使用抗-人线粒体抗体的免疫染色检测到(图11)。
这些结果表明在视网膜下注射后SB623细胞长期保留，并且显示移植的SB623细胞能够预防感光细胞死亡。

Claims (6)

1.对需要的受试者治疗视网膜变性的方法，该方法包含对所述受试者施用SB623细胞。
2.权利要求1的方法，其中将SB623细胞移植入受试者眼中。
3.权利要求2的方法，其中所述移植是玻璃体内移植。
4.权利要求2的方法，其中所述移植是视网膜下移植。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述视网膜变性发生在色素性视网膜炎中。
6.权利要求1-4任一项的方法，其中所述视网膜变性发生在年龄相关性黄斑变性(AMD)中。
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