KR20150075082A - 망막 변성의 치료 방법 및 치료용 조성물 - Google Patents

망막 변성의 치료 방법 및 치료용 조성물 Download PDF

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KR20150075082A KR1020157008284A KR20157008284A KR20150075082A KR 20150075082 A KR20150075082 A KR 20150075082A KR 1020157008284 A KR1020157008284 A KR 1020157008284A KR 20157008284 A KR20157008284 A KR 20157008284A KR 20150075082 A KR20150075082 A KR 20150075082A
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Abstract

본원에서, 예를 들어 망막색소변성증 및 노인성 황반 변성에서 발생하는 망막 변성의 치료 방법 및 치료용 조성물이 개시되고, 상기 치료는 외인성 노치 세포내 도메인을 발현하도록 조작된 골수 부착성 줄기 세포의 자손을 사용한다.

Description

망막 변성의 치료 방법 및 치료용 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF RETINAL DEGENERATION}
관련 출원의 교차참조
본원은 미국 임시출원 번호 제61/711,665호(2012년 10월 9일 출원)의 혜택을 주장하고, 상기 개시내용은 전체가 본원에 참조로 편입되었다.
연방지원 관련 명시
해당사항 없음.
본 출원은 예를 들어, 망막색소변성증 및 노인성 황반 변성(age-related macular degeneration: AMD)에서 발생하는 망막 변성에 대한 세포 치료 분야에 속한다.
예를 들어, 맥락막 신생혈관("습성 AMD") 또는 망막과 맥락막 사이의 세포 찌꺼기의 축적("건성 AMD")으로 인한 망막 변성은, 오늘날 전세계 실명의 주요 원인 중 하나이다. Cai 등의 (2012) Front Biosci. 17: 1976-95. 이와 유사하게, 망막색소변성증에서 나타나는, 광수용체 세포(간상체 및 추상체)의 변성 및 사멸이 또한 시력 악화 및/또는 시력 상실을 초래할 수 있다. 이에 따라서, 망막 변성을 차단 및/또는 역전시키는 치료, 특히 광수용체 기능을 회복시키는 치료가 필요하다.
본원에는 외인성 노치(Notch) 세포내 도메인을 발현하도록 조작된 골수 부착성 줄기 세포(marrow adherent stem cells: MASCs)에서 유래된 세포를 사용하여, 망막 변성을 치료하는 방법 및 치료용 조성물이 개시된다. 상기 세포는 본 개시의 목적에 따라 SB623 세포라 칭한다.
한 측면에서, 본원에 SB623 세포를 필요로 하는 피실험자의 눈에 상기 세포를 투여함으로써 망막 변성을 치료하는 방법이 개시된다.
또 다른 측면에서, 본원에 한 피실험자의 눈에서 광수용체 기능을 증가시키는 방법이 개시되고, 상기 방법은 광수용체 기능이 증가되도록 상기 피실험자의 눈에 SB623 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본원에 한 피실험자의 눈에서 광수용체 기능을 향상시키는 방법기 개시되고, 상기 방법은 광수용체 기능이 향상되도록 상기 피실험자의 눈에 SB623 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본원에 망막에서 뇌의 시각피질로 시각적 신호의 전송을 향상시키는 방법이 개시되고, 상기 방법은 망막에서 뇌의 시각피질로 시각적 신호의 전송이 향상되도록 상기 피실험자의 눈에 SB623 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 기술된 모든 방법에서, 상기 세포는 모든 전달 방법, 예컨대 직접 주입, 국소 투여 등에 의해 투여될 수 있다. 어떤 구현예에서, SB623 세포는 예를 들어 1가지 이상의 약제학적 담체와 조합하여 상기 세포를 포함하는 조성물(또는 제형)로 투여된다. 뿐만 아니라, 상기 방법은 동일한 또는 상이한 제형으로, SB623 세포의 반복적인 투여를 수반할 수 있다.
이에 따라서, 본 개시는, 그 중에서도 하기 구현예를 제공한다: 1. 망막 변성의 치료를 필요로 하는 피실험자에게 SB623 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 피실험자에서의 망막 변성을 치료하기 위한 방법. 2. 구현예 1에 있어서, SB623 세포가 상기 피실험자의 눈에 이식되는 방법. 3. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 상기 이식이 유리체내에 이루어지는 방법. 4. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 상기 이식이 망막하에 이루어지는 방법. 5. 구현예 1 내지 구현예 4 중 어느 구현예에 있어서, 상기 망막 변성이 망막색소변성증에서 발생하는 것인 방법. 6. 구현예 1 내지 구현예 4 중 어느 구현예에 있어서, 상기 망막 변성이 노인성 황반 변성(AMD)에서 발생하는 것인 방법.
상기 및 기타 측면들은 개시내용 전체의 측면에서 당해 기술분야의 숙련가에게 쉽게 이해될 것이다.
도 1은 생후 4주(처리 전, 맨 위 패널들), 생후 8주(처리 후 4주, 위에서 두 번째 패널들) 및 생후 12주(처리 후 8주, 위에서 세 번째 패널)된 RCS 래트의 눈의 대표적인 망막 전도(electroretinogram: ERG) 정보를 나타낸다. 생후 4주된 래트에 1.5 x 105　SB623 세포(오른쪽 패널) 또는 PBS(왼쪽 패널) 중 하나를 유리체내에 주입하여 처리하였다. 맨 아래 패널은 생후 4주에 1.5 x 105　SB623 세포(오른쪽 패널) 또는 PBS(왼쪽 패널) 중 하나를 유리체내에 주입하여 처리한 래트에 대해 출생 후 12주(처리 후 8주)에 아지드 반응(azide response)으로 분석한 광수용체 활성을 나타낸다.
도 2의 패널 A 및 B는 생후 4주, 5주, 6주, 8주 및 12주(즉, 처리 전 그리고 처리 후 1주, 2주, 4주 및 8주)에 취득한 RCS 래트의 망막 전도에서의 a-파(도 2A) 및 b-파(도 2B)의 상대적 진폭을 묘사한 일련의 그래프들을 나타낸다. 일련의 막대들 각각의 경우, 가장 왼쪽 막대는 무처리(naive)(즉, 처리하지 않은) 동물에 대한 값을 나타낸다. 오른쪽으로 진행하면서, 다른 막대들은 비히클, 0.375 x 105　SB623 세포, 0.75 x 105　SB623 세포 및 1.5 x 105　SB623 세포를 유리체내로 주입하여 처리한 동물들에 대한 값들을 나타낸다. 괄호 안의 숫자들은 분석된 눈의 개수를 표시한다. 처리 전 값은 100%로 설정하였다.
도 3은 생후 12주(처리 후 8주)된 RCS 래트의 눈에서의 아지드 반응의 진폭(마이크로볼트)을 나타내는 그래프이다. 4주령 동물들에게 처리를 하지 않거나("무처리") 또는 PBS("비히클"), 0.375 x 105　SB623 세포, 0.75 x 105　SB623 세포, 또는 1.5 x 105　SB623 세포로 유리체내 주입을 수행하였다. 괄호 안의 숫자는 분석된 눈의 개수를 표시한다.
도 4의 패널 A 및 B는 처리 후 9주에 RCS 래트 망막의 헤마톡실린 및 에오진 (hematoxylin and eosin: H&E)-염색 절편을 나타낸다. 도 4B는 생후 4주에 1.5 x 105　SB623 세포를 유리체내로 주입하여 처리한 래트의 눈에서 채취한 절편을 나타낸다. 도 4A는 생후 4주에 PBS를 주입한 대조군 래트의 눈에서 채취한 절편을 나타낸다. 잘 발달된 외과립층(도면에서 "ONL"로 표시)이 SB623-처리 눈에 존재하지만, 비히클-처리 눈에는 존재하지 않는다.
도 5의 패널 A 내지 D는 1.5 x 105　SB623 세포의 유리체내 주입 후 9주(생후 13주)된 RCS 래트에서 채취한 망막의 절편을 나타낸다. 도 5A 및 5C는 H&E-염색 절편을 나타내고; 도 5B 및 5D는 항-인간 미토콘드리아 항체(초록)로 염색한 절편 및 핵-특이적 염색 DAPI(파랑)로 대비 염색한 절편들을 나타낸다. 위 2개 패널은 유리체에 SB623 세포 무더기를 함유하는 절편을 나타낸다. 아래 2개 패널은 SB623 세포가 망막의 내경계막 상에 보일 수 있는 망막의 절편을 나타낸다.
도 6은 생후 4주(처리 전, 맨 위 패널), 생후 8주(처리 후 4주, 위에서 두 번째 패널들) 및 생후 28주(처리 후 24주, 위에서 세 번째 패널들)된 RCS 래트의 눈에서의 대표적인 망막 전도(ERG) 정보를 나타낸다. 생후 4주된 래트에 1.5 x 105　SB623 세포(오른쪽 패널) 또는 PBS(왼쪽 패널) 중 하나를 망막하로 주입하여 처리하였다. 맨 아래 패널은 생후 4주에 1.5 x 105　SB623 세포(오른쪽 패널) 또는 PBS(왼쪽 패널) 중 하나를 망막하로 주입하여 처리한 래트에 대해 생후 28주(처리 후 24주)에 아지드 반응에 의해 측정한 광수용체 활성을 나타낸다.
도 7의 패널 A 및 B는 처리 전, 그리고 처리 후 4주, 8주, 12주, 16주, 20주 및 24주에 획득된 RCS 래트의 망막 전도에서의 a-파(도 7A) 및 b-파(도 7B)의 상대적 진폭을 묘사하는 일련의 그래프를 나타낸다. 일련의 막대 각각의 경우, 가장 왼쪽 막대는 무처리(즉, 처리하지 않은) 동물들에 대한 값을 나타내고; 중간 막대는 비히클을 망막하로 주입하여 처리한 동물들에 대한 값들을 나타내고; 가장 오른쪽 막대는 1.5 x 105　SB623 세포를 망막하로 주입하여 처리한 동물들에 대한 값을 나타낸다. 괄호 안의 숫자는 분석된 눈의 개수를 표시한다. 처리 전 진폭은 100%로 설정하였다.
도 8은 처리 후 4주, 8주, 12주, 16주, 20주 및 24주에 RCS 래트의 눈에서의 아지드 반응의 진폭(마이크로볼트)을 나타내는 그래프이다. 일련의 막대 3개 각각에 대해, 가장 왼쪽 막대는 무처리(즉, 처리하지 않은) 동물들에 대한 값을 나타내고; 중간 막대는 비히클을 망막하로 주입하여 처리한 동물들에 대한 값들을 나타내고; 가장 오른쪽 막대는 1.5 x 105　SB623 세포를 망막하로 주입하여 처리한 동물들에 대한 값들을 나타낸다. 괄호 안의 숫자들은 분석된 눈의 개수를 표시한다.
도 9는 무처리, 비히클-처리 및 SB623 세포-처리 RCS 래트에서 망막하 이식 후 26주에 획득한 시각유발전위(visually evoked potential: VEP) 정보를 나타낸다.
도 10의 패널 A 및 B는 처리 후 27주에 RCS 래트 망막의 헤마톡실린-에오진(H&E)-염색 절편을 나타낸다. 도 10B는 생후 4주에 1.5 x l05　SB623 세포를 망막하로 주입하여 처리한 래트의 눈에서 채취한 절편을 나타낸다. 도 10A는 생후 4주에 PBS를 주입한 대조군 래트의 눈에서 채취한 절편을 나타낸다. 잘 발달된 외과립층(도면에서 "ONL"로 표시)이 SB623-처리 눈에는 존재하지만, 비히클-처리 눈에는 존재하지 않는다.
도 11의 패널 A 및 B는 1.5 x 105　SB623 세포의 망막하 주입 후 27주(생후 31주)에 RCS 래트에서 채취한 망막의 절편을 나타낸다. 도 11A는 H&E-염색 절편을 나타내고; 도 11B는 항-인간 미토콘드리아 항체(초록)로 염색하고 핵-특이적 염색 DAPI(파랑)로 대비염색한 절편을 나타낸다. 이식된 SB623 세포는 도 11A(화살표)에 나타나 있다.
본원에는 망막 변성 및 망막 변성 질환의 치료 방법 및 치료용 조성물이 개시된다. 특히, SB623 세포(노치 세포내 도메인을 코드하는 서열을 중간엽 줄기 세포에 형질주입하여 수득한 세포)를 망막 변성이 진행 중인(또는 망막 변성 질환을 앓는) 피실험자의 눈에 이식함으로써 망막 변성을 방지하여 장기적으로 망막 기능을 구제한다.
본 개시의 실현은, 달리 지시되지 않는 한, 당해 기술분야에 속하는 세포 생물학, 독물학, 분자 생물학, 생화학, 세포 배양, 면역학, 종양학, 재조합 DNA 분야 및 관련 분야의 표준 방법 및 종래 기술들을 활용한다. 이와 같은 기술들이 문헌에 기재되었고, 이것은 당해 기술분야의 숙련가가 쉽게 이용할 수 있다. 예를 들어, Alberts, B. 등의 "Molecular Biology of the Cell," 5th　edition, Garland Science, New York, NY, 2008; Voet, D. 등의 "Fundamentals of Biochemistry: Life at the Molecular Level," 3rd　edition, John Wiley & Sons, Hoboken, NJ, 2008; Sambrook, J. 등의 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 3　rd　edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; Ausubel, F. 등의 "Current Protocols in Molecular Biology," John Wiley & Sons, New York, 1987 및 주기적 업데이트; Freshney, R.I., "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique," 4th　edition, John Wiley & Sons, Somerset, NJ, 2000; 및 시리즈 "Methods in Enzymology," Academic Press, San Diego, CA 참조.
망막 변성
가장 일반적으로 나타나는 망막 변성 질환 2가지는 망막색소변성증(retinitis pigmentosa: RP)과 노인성 황반 변성(AMD)이다. 망막색소변성증은 망막의 광수용체 세포(간상체 및 추상체라고도 알려짐)의 변성에서 기인한다. 황반은 망막의 중심부의 명칭으로, 주변부 시각과 대비적으로 중심부 시각을 담당한다. AMD는 2가지 형태가 있다. 좀 더 일반적인 형태는 건성 AMD로, 망막과 맥락막(망막 아래 위치한 눈의 층) 사이의 세포 찌꺼기(드루젠)의 축적에 의해 야기되어, 광수용체 세포의 위축을 초래한다. 또다른 형태의 AMD는 습성 AMD로 맥락막 내 혈관의 비정상적인 성장에서 기인한다. 이와 같은 혈관은 누수되어 맥락막과 망막을 손상시킬 수 있다. AMD와 관련된 또 다른 용어에는 맥락막 신생혈관, 망막하 신생혈관, 삼출성 형태(exudative form) 및 원판상 변성이 포함된다.
망막 변성 질환의 기타 유형에는 어셔 증후군(청력 상실 및 RP에서 기인한 진행성 시력 상실이 특징인 유전성 질환), 스타르카르트 병(유전성 소아 황반 변성증), 레베르 선천성 흑암시(선천성 시력 상실을 특징으로 하는 유전성 질환), 맥락막 결손 (맥락막 및 망막의 변성으로 인한 진행성 시력 상실을 야기하는 유전성 질환), 바데트-비들 증후군(망막 변성을 포함하는 복합 장애로, 다지증 및 신장병을 포함할 수 있음) 및 레프섬 질병(피탄산의 대사 작용의 불능에 의해 야기되는 장애로, 그 중에서 RP를 특징으로 함)이 포함된다. 예를 들어, Goodwin (2008) Curr Opin Ophthalmol 19(3):255-62; Bonnet 등의 (2012) Curr Opin Neurol. 25(1):42-9; Coussa 등의 (2012) Ophthalmic Genet. 33(2):57-65 참조.
본원에 기술된 방법 및 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 기타 희귀 망막 변성 질환에는 베스트 병, 추상체-간상체 망막 이영양증, 뇌회형(gyrate) 위축, 오구치 병, 연소망막층간분리, 바센-코른즈웨이그병(무베타지질단백혈증), 청색 추상체 흑백시 병(blue cone monochromatism disease), 우성 드루젠, 골드만-파브레 유리체망막 이영양증(Goldman-Favre vitreoretinal dystrophy)(향상된 S-추상체 증후군), 컨스-세르 증후군, 로렌스-문 증후군, 시유두 주위(peripapillary) 맥락막 이영양증, 색소 무늬 이영양증[중심와(fovea)의 나비-형태 색소 이영양증, 노스캐롤라이나 황반 이영양증, 거대-세망 이영양증(macro-reticular dystrophy), 스파이더 이영양증(spider dystrophy) 및 쇼그렌 망상 색소 상피 이영양증(Sjogren reticular pigment epithelium dystrophy) 포함], 소르스비 황반 이영양증(Sorsby macular dystrophy), 스티클러 증후군 및 바그너 증후군(유리체망막 이영양증)이 포함된다.
SB623 세포
본 개시는 치료를 필요로 하는 피실험자, 즉 망막 변성이 발생한 피실험자의 눈에 SB623 세포를 이식함으로써 망막 변성을 치료하는 방법을 제공한다. SB623 세포는 골수 부착성 기질 세포(marrow adherent stromal cells: MASCs)[중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cells: MSCs)라고도 알려짐]에서 수득된 것으로, MASCs에서 노치 단백질의 세포내 도메인을 발현시킴으로써 수득된다. MASCs는 골수에서 부착성 세포를 선별함으로써 수득된다.
한 구현예에서, MASC 배양액이 NICD를 코드하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 접촉하고(예컨대, 형질주입에 의해), 이어서 약물 선별 및 추가 배양에 의해 형질주입된 세포가 증강된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제7,682,825호(2010년 3월 23일 발행); 미국 특허출원 공개 번호 제2010/0266554호(2010년 10월 21일); 및 WO 2009/023251(2009년 2월 19일) 참조; 상기 개시내용은 모두 전체가 중간엽 줄기 세포의 단리 및 중간엽 줄기 세포의 SB623 세포[상기 특허문헌들에서 "신경 전구체 세포(neural precursor cells)" 및 "신경 재생 세포(neural regenerating cells)”로 불림]로의 전환을 기술하기 위해, 본원에 참조로 편입되었다. 또한 하기 실시예 1 참조.
이와 같은 방법에서, 노치 세포내 도메인을 코드하는 모든 폴리뉴클레오티드(예컨대, 벡터)가 사용될 수 있고, 형질주입된 세포의 선별 및 증강을 위한 모든 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 어떤 구현예에서, MASCs는 노치 세포내 도메인을 코드하는 서열을 함유하고, 또한 약물 저항성 표지(예컨대 G418에 내성)를 코드하는 서열을 함유하는 벡터로 형질주입된다. 부가적인 구현예에서, 2가지 벡터, 즉 노치 세포내 도메인을 코드하는 서열을 함유하는 하나의 벡터와 약물 저항성 표지를 코드하는 서열을 함유하는 다른 하나의 벡터가 MASCs의 형질주입을 위해 사용된다. 이와 같은 구현예에서, 선별은, 상기 벡터 또는 벡터들을 세포 배양액에 형질주입한 후, 상기 벡터를 포함하는 세포는 남겨두지만 상기 벡터를 포함하지 않는 세포는 사멸할 정도의 충분한 양으로 상기 세포 배양액에 선택제(selective agnet)(예컨대, G418)를 첨가함으로써, 달성된다. 선별의 부재는 상기 선택제의 제거 또는 상기 벡터를 포함하지 않는 세포를 사멸하지 않는 수준으로의 농도 감소를 필요로 한다. 선별(예컨대, 7일 동안)에 이어서, 선택제가 제거되고, 상기 세포는 추가로 배양된다(예컨대, 두 차례 계대배양 동안).
SB623 세포의 제조는 따라서 MSC에서의 외인성 노치 세포내 도메인의 일시적 발현을 수반한다. 이를 위해서, MSCs는 노치 세포내 도메인을 코드하는 서열을 포함하는 벡터로 형질주입될 수 있고 여기에서 상기 노치 세포내 도메인을 코드하는 서열은 전장 노치 단백질을 코드하지 않는다. 이와 같은 모든 서열이 잘 알려져 있고, 당해 기술분야의 숙련가는 쉽게 활용할 수 있다. 예를 들어, Del Amo 등의 (1993) Genomics 15:259-264는 마우스 노치 단백질의 완전한 아미노산 서열을 제공하고; 한편 Mumm and Kopan의 (2000) Devel. Biol. 228:151-165는, 마우스 노치 단백질에서, 상기 세포내 도메인을 방출하는 소위 S3 절단 부위(cleavage site)를 둘러싼 아미노산 서열을 제공한다. 종합해 보면, 이와 같은 참고 문헌들은 당해 기술분야의 숙련가에게 전장 노치 단백질이 아닌 노치 세포내 도메인을 함유하는 각각의 모든 펩티드를 제공하고; 이로써 또한 당해 기술분야의 숙련가에게 전장 노치 단백질을 코드하지 않고 노치 세포내 도메인을 코드하는 서열을 포함하는 모든 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 문헌들(Del Amo 및 Mumm)은 각각 전장 노치 단백질의 아미노산 서열 및 노치 세포내 도메인의 아미노산 서열을 개시하기 위해 전체가 본원에 참조로 편입되었다.
예컨대 래트, 제노푸스, 초파리 및 인간을 포함하는 추가의 종에서 유래된 노치 단백질 및 핵산에 대해 유사한 정보가 이용가능하다. 예를 들면, Weinmaster 등의 (1991) Development 113:199-205; Schroeter 등의 (1998) Nature 393:382-386; NCBI Reference Sequence No. NM_017167(및 상기에 인용된 참조문헌들); SwissProt P46531(및 상기에 인용된 참조문헌들); SwissProt Q01705(및 상기에 인용된 참조문헌들); 및 GenBank CAB40733(및 상기에 인용된 참조문헌들) 참조. 상기 참조문헌들은 수많은 상이한 종에서 전장 노치 단백질의 아미노산 서열 및 노치 세포내 도메인의 아미노산 서열을 개시하기 위해 전체가 참조로 편입되었다.
부가적 구현예에서, SB623 세포는 MSCs에 노치 세포내 도메인을 코드하는 서열을 포함하는 핵산을 도입함으로써 MSCs가 외인성 노치 세포외 도메인을 발현하지 않도록 하여 제조된다. 이는 예를 들어 노치 세포내 도메인을 코드하는 서열을 포함하는 벡터를 MSCs에 형질주입함으로써 달성될 수 있으며 여기에서 상기 노치 세포내 도메인을 코드하는 서열은 전장 노치 단백질을 코드하지 않는다.
SB623 세포의 제조, 및 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있는, SB623 세포의 특성과 유사한 특성을 갖는 세포를 만드는 방법에 대한 부가적인 상세내용이 미국 특허 번호 제7,682,825호; 및 미국 특허출원 공개 번호 제2010/0266554호 및 제2011/0229442호에서 발견되며; 상기 개시내용은 SB623 세포의 제조에 대한 부가적 상세내용을 제공하고, SB623 세포의 특성과 유사한 특성들을 갖는 세포를 만드는 방법을 제공하기 위해, 본원에 참조로 편입되었다. 또한 Dezawa 등의 (2004) J. Clin. Invest. 113:1701-1710 참조.
제형, 키트 및 투여 경로
본원에 개시된 SB623 세포를 포함하는 치료용 조성물이 또한 제공된다. 이와 같은 조성물은 전형적으로 SB623 세포 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
본원에 개시된 치료용 조성물은, 특히 망막 변성의 진행을 감소시키고, 망막 변성을 역전시키고 그리고/또는 광수용체 기능을 회복시키는데 유용하다. 이에 따라, SB623 세포를 포함하는 조성물의 "치료학적 유효량"은 망막 변성을 방지하거나 또는 역전시키고 그리고/또는 광수용체 기능을 회복시키는 어떤 양이든 가능하다. 예를 들어, 복용량은 예컨대 체중, 투여 경로, 질병의 중증도 등에 따라, 약 100; 500; 1,000; 2,500; 5,000; 10,000; 20,000; 50,000; 100,000; 500,000; 1,000,000; 5,000,000 내지 10,000,000개의 세포 또는 그 이상일 수 있고(또는 이들 사이의 모든 정수 값일 수 있고); 투여 빈도는 예컨대 1일 1회, 1주 2회, 1주 1회, 1개월 2회, 1개월 1회로 다를 수 있다.
다양한 약제학적 조성물 및 이들의 제조 기술은 본 개시의 측면에서 당해 기술분야의 숙련가에게 알려져 있다. 적합한 약리학적 조성물 및 이들의 투여 기술의 상세한 목록을 위해, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985; Brunton 등의 "Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics," McGraw-Hill, 2005; University of the Sciences in Philadelphia (eds.), "Remington: The Science and Practice of Pharmacy," Lippincott Williams & Wilkins, 2005; 및 University of the Sciences in Philadelphia (eds.), "Remington: The Principles of Pharmacy Practice," Lippincott Williams & Wilkins, 2008과 같은 텍스트를 참조할 수 있을 것이다.
본원에 기술된 세포는 이식을 위한 생리학적으로 양립가능한 담체에 현탁될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "생리학적으로 양립가능한 담체(physiologically compatible carrier)"는 제형의 다른 성분들과 양립가능하며 이의 수용자에게 유해하지 않은 담체를 가리킨다. 당해 기술분야의 숙련가는 생리학적으로 양립가능한 담체에 대해 잘 알고 있다. 적합한 담체의 예에는 세포 배양배지(예컨대, 이글의 최소필수배지), 인산완충식염수, 행크의 균형잡힌 염 용액 +/-글루코오스(Hank's balanced salt solution: HBSS), 및 다중 전해질 용액, 예컨대 Plasma-Lyte™ A (Baxter)가 포함된다.
한 피실험자에 투여되는 SB623 세포 현탁액의 부피는 이식 부위, 치료 목적 및 용액내 세포수에 따라 달라진다. 전형적으로, 투여되는 세포의 양은 치료학적 유효량일 것이다. 본원에서 사용되는 "치료학적 유효량(therapeutically effective amount)" 또는 "유효량(effective amount)"은 특정 장애의 치료에 효과를 발휘하기 위해(즉, 상기 장애와 관련된 증상의 양 및/또는 중증도의 감소를 야기시키기 위해) 필요한 이식된 세포의 개수를 가리킨다. 예를 들어, AMD를 치료하려는 경우, 치료학적 유효량의 SB623 세포의 이식은 전형적으로 망막 변성의 방지 또는 역전 및/또는 광수용체 기능의 회복을 야기한다. 치료학적 유효량은 망막 변성의 유형 및 범위에 따라 다양하고, 또한 피실험자의 전체적인 상태에 따라 달라질 수 있다.
개시된 치료용 조성물에는 또한 약제학적으로 허용가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐용 물질, 즉 담체가 포함될 수 있다. 이와 같은 담체는, 예를 들어 SB623 세포를 안정화하고 그리고/또는 체내에서 SB623 세포의 생존을 촉진할 수 있다. 각각의 담체는 제형의 다른 성분들과 양립할 수 있으며 피실험자에 유해하지 않다는 관점에서 "허용가능한”것이어야 한다. 약제학적으로-허용가능한 담체로서 역할을 수행할 수 있는 물질들의 몇몇 예에는 당, 예컨대 락토오스, 글루코오스 및 수크로오스; 전분, 예컨대 옥수수전분 및 감자전분; 셀룰로오스 및 이것의 유도체, 예컨대 소듐 카복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트; 분말형 트래거캔스; 엿기름; 젤라틴; 활석; 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌약용 왁스; 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수 기름 및 콩기름; 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 한천; 완충 제제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; 알긴산; 발열성 물질 무함유 물(pyrogen-free water); 등장액; 링거액; 에틸 알코올; 인산 완충 용액; 및 약제학적 제형에 활용되는 기타 무독성 양립가능한 물질이 포함된다. 습윤제, 유화액 및 윤활제, 예컨대 소듐 라우릴 설페이트 및 스테아르산 마그네슘뿐만 아니라, 착색제, 방출제, 피막제, 감미제, 풍미제 및 향기제(perfuming agents), 보존제 및 항산화제 또한 상기 조성물에 존재할 수 있다.
예시적 제형은, 비제한적으로, 비경구 투여에 적합한 것들, 예컨대 폐내, 정맥내, 동맥내, 안구내, 두개내, 수막하(sub-meningial), 또는 피하 투여에 적합한 것으로, 미셀, 리포좀 또는 약물-방출 캡슐(활성 제제가 느린-방출을 위해 고안된 생체적합 코팅내에 병합됨)에 캡슐화된 제형; 삼키는 제형; 국소 사용을 위한 제형, 예컨대 점안약, 크림, 연고 및 겔; 및 기타 제형들, 예컨대 흡입제, 에어로졸 및 스프레이를 포함한다. 상기 개시의 조성물의 복용량은 치료가 필요한 정도 및 중증도, 투여된 조성물의 활성, 피실험자의 전반적인 건강상태 및 숙련된 전문가에게 잘 알려진 기타 고려사항들에 따라 달라진다.
부가적 구현예에서, 본원에 기술된 조성물은 국소적으로 전달된다. 국소 전달은 조성물의 비-전신 전달을 가능하게 함으로써, 전신 전달에 비해 조성물의 신체적 부담을 감소시킨다. 이와 같은 국소 전달은, 예를 들어 의학적으로 이식된(implanted) 다양한 장치, 예컨대 비제한적으로 스텐트 및 카테터를 통해 달성될 수 있고, 또는 흡입, 사혈(phlebotomy), 주입 또는 외과수술을 통해 달성될 수 있다. 원하는 제제를 예컨대 스텐트 및 카테터와 같은 의료 장치에 코팅, 이식(implanting), 함침 및 그것도 아니면 부착하는 방법들이 당해 기술분야에서 확립되어 있고, 본원에서 고려되었다. 국소 전달은 또한 예를 들어, 안구내 주입 또는 점안약의 사용에 의해 달성될 수 있다.
본 개시의 또 다른 측면은 피실험자에게 SB623 세포의 투여를 수행하기 위한 키트에 관한 것이다. 한 구현예에서, 키트는 1가지 이상의 개별 약제학적 제제에, 적절하게 제형화된(예컨대, 약제학적 담체에) SB623 세포 조성물을 포함한다.
투여
SB623 세포로 망막 변성(예컨대, AMD)을 치료하기 위해, 당해 기술분야에서 눈에 약물를 전달하는 것으로 알려진 모든 방법이 활용될 수 있다. 이와 같은 개시에 따르면, "이식(transplantation)"이란 모든 방법을 동원해, 피실험자의 눈에 SB623 세포를 이동시키는 것을 말한다. 예를 들어, SB623 세포의 현탁액의 전달을 위해 눈에 직접 주입하는 방법이 사용될 수 있다. 어떤 구현예에서는, SB623 세포 현탁액이 눈의 유리액에 주입된다. 다른 구현예에서는, 망막하 주입이 사용된다. 부가적인 구현예에서, 국소 투여가 사용되는데; 예를 들어, 치료용 조성물이 용액으로 제형화되어 점안약으로 사용된다. 그 밖의 다른 구현예에서는, 현탁액, 겔 등의 국소 적용이 SB623 세포의 투여에 활용될 수 있다.
실시예
광수용체 세포의 적절한 기능은 광수용체 바깥 분절의 연속적인 합성 및 허물벗기(shedding)를 포함한다. 망막 색소상피의 세포[RPE(retinal pigmented epithelium) 세포]는 벗겨진 바깥 분절을 식균하고, 레티노이드 및 막지질을 재생함으로써, 상기 프로세스를 돕는다.
Royal College of Surgeons 래트("RCS 래트")는 유전성 망막 변성의 동물 모델로, 여기서 망막 변성은 광수용체 바깥 분절을 식균할 수 없는 결함 있는 RPE 세포에서 기인한다. D'Cruz 등의 (2000) Human Molecular Genetics 9(4):645-651. 조직학적으로, RCS 래트의 망막은 광수용체 세포 바깥 분절층과 망막 색소상피 사이에 바깥 분절 찌꺼기의 비정상적인 축적을 특징으로 한다. 이와 같은 축적은 광수용체 세포의 사멸 전에 그리고 사멸에 수반하여 발생한다. RCS 래트는 광수용체 세포의 생후 진행성 손실 및 그에 따른 시력 상실을 경험한다.
망막전도검사는 전극이 각막에 설치되고, 눈이 섬광에 자극을 받아, 광수용체 세포의 전기적 활성이 상기 전극에 의해 측정되는 검사법이다. Odom JV, Leys M, Weinstein GW. Clinical visual electrophysiology. In: Tasman W, Jaeger EA, eds. Duane's Ophthalmology. 15th ed. Philadelphia, Pa: Lippincott Williams & Wilkins;2009:chap 5; Baloh RW, Jen J. Neuro-ophthalmology. In: Goldman L, Schafer AI, eds. Cecil Medicine. 24th ed. Philadelphia, PA: Saunders Elsevier;2011:chap 432; Cleary TS, Reichel E. Electrophysiology. In: Yanoff M, Duker JS, eds. Ophthalmology. 3rd ed. St. Louis, Mo: Mosby Elsevier;2008:chap 6.9.
망막조영법에 의해 측정될 수 있는 광수용체 기능의 또 다른 측정치는 아지드 반응으로 알려진 아지드 나트륨의 전신 유입 후 0.05 내지 50 Hz 사이의 전기 활성의 피크이다.
SB623 세포 현탁액 제조
SB623 세포는 인간 노치 단백질의 세포내 도메인을 코드하는 DNA를 인간 골수 부착성 줄기 세포(MASCs)에 형질주입함으로써 수득하였다. MASCs는 하기와 같이 인간 골수에서 수득하였다. 인간 성인 골수 천자액(aspirates)을 Lonza(Walkersville, MD)에서 구입하였다. 세포를 1회 세척하고, 10% 소태아혈청(FBS)(Hyclone, Logan, UT), 2mM L-글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신(둘 다 Invitrogen, Carlsbad, CA에서 구입)으로 보충된 증식배지: 알파-MEM(Mediatech, Herndon, VA) 중의 Corning T225 플라스크(Corning, Inc. Lowell, MA.)에 플레이팅하였다. 3일 후, 부착되지 않은 세포를 제거하고; 상기 MASC 배양액을 대략 2주 동안 증식배지에 유지시켰다. 이 기간 동안, 0.25%트립신/EDTA를 사용하여, 세포를 2회 계대배양(passage)하였다.
SB623 세포를 만들기 위해, 제조업체의 지시에 따라 Fugene6(Roche Diagnostics, Indianapolis, IΝ)를 사용하여, (CMV 프로모터의 전사 조절 하에) 인간 노치1 세포내 도메인을 코드하는 서열 및 (SV40 프로모터의 전사 조절 하에) 네오마이신-저항성 유전자를 함유하는 pN-2 플라스미드를 MASCs에 형질주입하였다. 플라스미드 pN-2는 pCI-neo 백본(Promega, 메디슨, WI)으로 이루어졌고, 세포내 도메인을 코드하는 인간 노치-1 단백질의 아미노산 1703-2504를 코드하는 서열이 다중 클로닝 부위에 도입되었다. 간단하게, 세포를 Fugene6/플라스미드 DNA 복합체와 함께 24시간 동안 배양하였다. 그 다음 날, 배지를 100 ug/ml의 G418(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 함유하는 증식배지(상기 기재된 구성성분들)로 교체하고, 7일 동안 선별을 계속하였다. G418 선별 배지의 제거 후, 배양액을 증식배지에 유지시켜, 2회 계대배양 하는 동안 증식시켰다. 트립신/EDTA를 사용하여 SB623 세포를 수확하고, 세포 밀도 7.5 x 103, 1.5 x 104　및 3 x 104　세포/ml로 동결 배지에 제형화한 후, 극저온냉동시켰다. 동결된 SB623 세포를 필요할 때까지 액체 N2　유닛의 기체상에 보관하였다.
유리체내 이식
RCS 래트를, 생후 2일에 시작하여 이식할 때까지 계속, 경구 시클로스포린 A(식용수 중 200 mg/1)의 투여로 면역억제를 시켰다. 주입에 의한 SB623 세포의 이식은 생후 4주에 시행하였다. 이식 전에, 동물을 염화수소 자일라진(Celactal®, Bayer Medical, Ltd.)과 염화수소 케타민(Ketalar®, Daiichi Sankyo Co., Ltd.)의 혼합물로 전신 마취시키고, 0.4% 염화수소 옥시부푸로카인(oxybupurocaine hydrochloride)(Benoxyl®, Santen Pharmaceutical Co., Ltd.)으로 국소 마취시켰다. 유리체 동공에 SB623 세포 현탁액 5ul를 주입하기 전, 동공을 트로피카미드 및 페닐레프린 하이드로클로라이드(Mydrin-P®, Santen Pharmaceutical Co., Ltd.)로 확장시켰다. 상기 주입은 30-게이지 바늘이 있는 해밀턴 주사기를 사용하여 수행하였다. 대조군 코호트(cohort)에 비히클 (PBS)을 주입하거나 또는 아무것도 주입하지 않았다(무처리). 실험 설계를 표 1에 나타내었다.
Figure pct00001
4주령에 SB623 세포를 이식한 후, 5주령, 6주령, 8주령 및 12주령(즉, 이식 후 1주, 2주, 4주 및 8주)에 동물에 망막전도검사을 실시하였고, 12주령(이식 후 8주)에 아지드 반응을 수행하였다. 13주령(처리 후 9주)에, 동물을 희생시켜, 조직학적 검사를 위해 눈을 떼어냈다.
망막전도검사를 위해, 래트를 1시간 동안 암순응시키고, 이어서 염화수소 자일라진(Celactal®, Bayer Medical, Ltd.)과 염화수소 케타민(Ketalar®, Daiichi Sankyo Co., Ltd.)의 혼합물로 전신 마취시켰다. 트로피카미드와 페닐레프린 하이드로클로라이드(Mydrin-P®, Santen Pharmaceutical Co., Ltd.)로 동공을 확장시켰다. 각막에 설치한 접촉 전극과 코에 설치한 접지 전극으로 망막 전도(ERGs)를 기록하였다. 백색 LED 섬광(3,162 cd/m2, 10 ms 동안)으로 반응을 유발시키고, Neuropack S1 NEB9404 (Nihon Kohden Corp.)에 기록하였다.
도 1(위 3쌍의 패널)은, 이식 바로 전(생후 4주), 그리고 이식 후 4주 및 8주에 수득한, 비히클-처리 동물(왼쪽 패널) 및 눈 1개당 1.5 x 105　SB623 세포로 처리한 동물(오른쪽 패널)에 대한 대표적인 ERG 정보를 나타낸다. a-파나 b-파 모두 처리 후 4주 및 8주된 비히클-처리 동물에서 관찰되지 않았고; 한편, SB623-처리 동물에서는, 이와 같은 시점에 전기 활성이 유지되었다. ERG에 의해 측정된, 수용체 세포 전기 활성의 정량적 분석을 도 2에 나타내었다. 실험을 실시한 모든 시점에, SB623-처리 동물은 무처리 동물 또는 비히클-처리 동물보다 큰 광수용체 세포 전기 활성을 유지하였다.
이식 후 8주에 아지드 반응을 측정하기 위해, RCS 래트를 1시간 동안 암순응시킨 후, 염화수소 자일라진(Celactal®, Bayer Medical, Ltd.)과 염화수소 케타민(Ketalar®, Daiichi Sankyo Co., Ltd.)의 혼합물로 전신 마취시키고, 0.4% 염화수소 옥시부푸로카인(Benoxyl®, Santen Pharmaceutical Co., Ltd.)으로 국소 마취시켰다. 접촉 전극을 각막에 설치하고, 0.1% 아지드화 나트륨(NaN3) 0.1 ml를 미정맥에 주입하였다. 0.05 내지 50 Hz 사이의 영역에서 증폭시켜, Neuropack S1 NEB9404 (Nihon Kohden Corp.)에서 반응을 기록하였다. 기준선에서 양성 피크(positive peak)까지의 진폭을 측정하였으며, 이는 아지드 용액의 주입 후 대략 4초간 나타났다.
도 1의 아래 한 쌍의 패널은 1.5 x 105　SB623 세포의 유리체내 주입으로 처리된 RCS 래트의 눈에서, 처리 후 8주에 아지드 반응이 유지되었으나(오른쪽 아래 패널), PBS를 주입한 래트에서는 상실되었음(왼쪽 아래 패널)을 나타낸다. 도 3은 SB623-처리군 및 대조군의 눈에서의 반응의 진폭의 측정값을 나타낸다. 나타난 바와 같이, 1.5 x 105　SB623 세포의 주입은 처리 후 8주에 아지드 반응의 진폭에 통계적으로 상당한 증가를 야기하였다.
조직학적 분석을 위해, 래트를 희생시키고 눈을 떼어내었다. 4% 파라포름알데하이드에 고정시킨 후, 제조업체의 지시에 따라 떼어낸 눈을 Technovit®　8100 수지(Heraeus Kulzer, Werheim, Germany)에 함침시켰다. 간단하게, 눈을 밤새 4℃에서 6.8% 수크로오스를 함유하는 PBS에 세척하고, 100% 아세톤에서 탈수시킨 후, Cryomold®　(EMS, Hatfield, PA)에 함침시켰다. 중합된 블록을 접착제로 나무 블록에 고정시키고, 일회용 나이프가 달린 슬라이딩 마이크로톰(HM440E, MICROM International GmbH, Walldorf, Germany)을 사용하여 절단하였다. 인간 항-미토콘드리아 항체(Millipore MAB1273)로 면역염색하기 위해 마이크로미터 절편 3개를 사용하였다.
조직학적 분석은 비히클-처리 눈에서, 망막의 외과립층의 세포가 처리 후 9주에는 대부분 부재하였음(도 4A)을 보여준다. 반면에, SB623-처리 눈에서는, 외과립층의 세포들이 잘 보존되었다(도 4B). 이식된 SB623 세포 무더기를 유리체에서 관찰하였고(도 5A 및 5B), SB623 세포를 또한 망막의 내경계막에서 관찰하였다(도 5C 및 5D). 부가적 실험에서, SB623 세포의 유리체내 이식이 처리 후 25주까지 외과립층 세포의 손실을 방지하였으며, SB623 세포가 이 시기에 유리체내에 지속되었음을 관찰하였다.
상기 제공된 전기생리학 및 형태학 분석의 결과는 SB623 세포의 유리체내 이식이 망막 기능을 유지시켰음을 나타낸다.
망막하 이식
실시예 1에 기술된 바와 같이 SB623 세포를 제조하고, 3 x 104　세포/ul의 밀도로 PBS에 현탁시켰다. 실시예 2에 기술된 바와 같이, RCS 래트의 면역 억제, 전신 및 국소 마취 그리고 동공의 확장을 모두 수행하였다. 생후 4주에, 30-게이지 바늘이 달린 해밀턴 주사기를 사용하여 망막하 공간에 SB623 세포 현탁액 5ul를 유리체내에 주입함으로써, SB623 세포가 이식되었다. 대조군 코호트에 비히클(PBS)을 주입하거나 또는 아무것도 주입하지 않았다(무처리). 실험 설계를 표 2에 나타내었다. 이 실험에서, 처리 후 좀 더 긴 기간 동안 분석을 계속하였다: 망막전도검사 및 아지드 반응 측정을 24주 동안 지속하였고, 처리 후 27주에 수득한 시료에 조직학 및 면역조직화학을 수행하였다.
Figure pct00002
망막전도검사 및 아지드 반응의 측정은 실시예 2에 기술된 바와 같이 수행하였다. 대표적인 결과를 도 6에 나타내었다. 대부분의 비히클-처리 래트에서, ERG는 처리 후 4주에 기록될 수 없었다(도 6, 왼쪽 패널들). 하지만, SB623-처리 동물에서는, ERG 및 아지드 반응 모두 처리 후 24주에도 유지되었다(도 6, 오른쪽 패널들).
도 7은 이식 후 24주까지 4주 간격으로 ERG 진폭의 시간 경과에 따른 변화를 나타낸다. 이식 후 8주경, a-파와 b-파 모두 무처리 및 비히클-처리 래트의 눈에서는 검출될 수 없었으나; SB623 세포의 망막하 주입을 받은 래트에서는, a-파 및 b-파 모두 처리 후 24주까지 유지되었다.
도 8은 이식 후 24주까지 4주 간격으로 아지드 반응의 시간 경과에 따른 변화를 나타낸다. 무처리 및 비히클-주입 동물의 경우, 모든 시점에서 상기 반응이 감소되었다. SB623 세포의 망막하 주입을 받은 래트의 경우, 무처리 및 비히클-주입 래트와 비교해, 처리 후 24주까지 모든 시점에서 아지드 반응에서 통계학적으로 상당한 증가를 관찰하였다.
이와 같은 전기생리학 조사의 결과는 SB623 세포의 이식이 좀 더 장기적으로 망막 기능을 유지시킨다는 것을 나타낸다.
시각적 신호가 망막에서 뇌의 시각피질로 전송되었는지를 판단하기 위해, 처리 후 26주에, 처리한 RCS 래트와 처리하지 않은 RCS 래트에서 시각유발전위(VEPs)를 측정하였다. VEP 기록 7일 전, 스크류 전극을 시상 봉합과 관상 봉합의 접합점(bregma) 뒤 6.8 mm, 정중선 옆으로 3.2 mm 떨어진 머리의 양측 각각에 경막외 설치하고, 참조 전극을 시상 봉합과 관상 봉합의 접합점 뒤 11.8mm 떨어진 정중선 상에 경막외 설치하였다. VEP 기록 당일, 래트를 1시간 동안 암순응시킨 후, 염화수소 자일라진(Celactal®, Bayer Medical, Ltd.)과 염화수소 케타민(Ketalar®, Daiichi Sankyo Co., Ltd.) 혼합물로 전신 마취시켰다. 트로피카미드 및 페닐레프린 하이드로클로라이드(Mydrin-P®, Santen Pharmaceutical Co., Ltd.)로 동공을 확장시켰다. 백색 LED 섬광(3,162 cd/m2, 10 ms 동안)으로 VEP 반응을 유발시키고, Neuropack S1 NEB9404(Nihon Kohden Corp.)에 기록하였다. 100회 반응을 측정하고, 결과를 평균내었다. 대표적인 결과를 도 9에 나타내었다. 무처리 및 비히클-주입 동물의 경우, VEPs가 검출될 수 없었다. 대조적으로, SB623 세포를 망막하에 주입한 래트의 경우, 처리 후 26주에, VEP 반응이 잘 유지되었다. 이와 같은 결과는 SB623 세포로의 처리가 시각적 신호를 시각피질에 전달하는 능력을 회복시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 2에 기술된 바와 같이, 처리 후 27주에 획득한 시료에 조직학 및 면역화학을 수행하였다. 도 10에 나타난 바와 같이, 이식 후 27주 경, 비히클-처리 래트에서는 외과립층(outer nuclear layer: ONL)의 세포가 거의 존재하지 않았다. 하지만, SB623-처리 래트에서는, ONL의 세포가 27주에도 잘 보존되었다. 뿐만 아니라, 망막하 공간에서 항-인간 미토콘드리아 항체로 면역염색함으로써 검출된, 이식된 SB623 세포를 관찰하였다(도 11).
이와 같은 결과는 망막하 주입 후 SB623 세포의 장기적 지속을 입증하고, 이식된 SB623 세포가 광수용체 세포의 사멸을 방지할 수 있었음을 보여준다.

Claims (6)

  1. 망막 변성의 치료를 필요로 하는 피실험자에게 SB623 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 피실험자에서의 망막 변성을 치료하기 위한 방법.
  2. 제1항에 있어서, SB623 세포들이 상기 피실험자의 눈에 이식되는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 이식이 유리체내에 이루어지는 것인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 이식이 망막하에 이루어지는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 항에 있어서, 상기 망막 변성이 망막색소변성증에서 발생하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 항에 있어서, 상기 망막 변성이 노인성 황반 변성(age-related macular degeneration: AMD)에서 발생하는 것인 방법.
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