ES2582559T3 - Factor trófico para el tratamiento de las enfermedades degenerativas de la retina - Google Patents

Factor trófico para el tratamiento de las enfermedades degenerativas de la retina Download PDF

Info

Publication number
ES2582559T3
ES2582559T3 ES08857986.7T ES08857986T ES2582559T3 ES 2582559 T3 ES2582559 T3 ES 2582559T3 ES 08857986 T ES08857986 T ES 08857986T ES 2582559 T3 ES2582559 T3 ES 2582559T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
polypeptide
nucleic acid
antibody
antibodies
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES08857986.7T
Other languages
English (en)
Inventor
Thierry Leveillard
José-Alain Sahel
Valérie FONTAINE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM filed Critical Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Application granted granted Critical
Publication of ES2582559T3 publication Critical patent/ES2582559T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 3, 4 o 5 o una variante de la misma, en el que dicha variante tiene una identidad de al menos 80 % con la SEQ ID NO: 3, 4 o 5 y dicho polipéptido o variante exhiben actividad de rescate de los conos y dicho polipéptido o variante tiene menos de 100 aminoácidos.

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
5
15
25
35
45
55
65
preferiblemente aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 o 400 nucleótidos consecutivos de la secuencia sentido o antisentido de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.
Las sondas basadas en la secuencia de una molécula de ácido nucleico de la invención pueden utilizarse para detectar transcritos o secuencias genómicas que codifican la misma molécula de proteína codificada por una molécula de ácido nucleico seleccionada. La sonda comprende un grupo marcador unido a ella, por ejemplo, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor enzimático. Tales sondas se pueden utilizar como parte de un kit de prueba de diagnóstico para identificar células o tejidos que expresan o no la proteína, tales como midiendo los niveles de una molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína en una muestra de células de un sujeto, por ejemplo, detectando los niveles de ARNm o determinando si un gen que codifica para la proteína ha sido mutado o suprimido.
La divulgación abarca además moléculas de ácido nucleico que difieren de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 debido a la degeneración del código genético y por lo tanto codifican para la misma proteína que la codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2
Además de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, los expertos en la técnica apreciarán que dentro de una población pueden existir polimorfismos de la secuencia de ADN que conducen a cambios en la secuencia de aminoácidos (por ej., la población humana). Tales polimorfismos genéticos pueden existir entre individuos dentro de una población debido a la variación alélica natural. Un alelo es uno de un grupo de genes que ocurren alternativamente en un locus genético dado. Tales variaciones alélicas naturales pueden tener como resultado generalmente del 1-5 % de variación en la secuencia de nucleótidos de un gen dado. Los alelos alternativos se pueden identificar mediante secuenciación del gen de interés en diferentes individuos. Esto se puede llevar a cabo fácilmente utilizando sondas de hibridación para identificar el mismo locus genético en una variedad de individuos. Todas y cada una de tales variaciones de nucleótidos y polimorfismos de aminoácidos resultantes o variaciones que son el resultado de la variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional se divulgan en la presente memoria.
En un aspecto, los polimorfismos que están asociados con una enfermedad degenerativa de la retina se utilizan como marcadores para diagnosticar dicha enfermedad o trastorno.
Por otra parte, se divulgan también moléculas de ácido nucleico que codifican para proteínas de la invención de otras especies (homólogas), que tienen una secuencia de nucleótidos que difiere de la de la proteína de rata descrito en la presente memoria.
Las moléculas de ácido nucleico correspondientes a variantes alélicas naturales y homólogas de un ADNc de la invención pueden aislarse basándose en su identidad con la molécula de ácido nucleico humana divulgada en este documento usando los ADNc humanos, o una porción de los mismos, como una sonda de hibridación de acuerdo con técnicas estándar de hibridación en condiciones de hibridación rigurosas.
En consecuencia, en otro aspecto una molécula de ácido nucleico aislada de la divulgación tiene al menos 100, 200, 300, 400 o 500 nucleótidos contiguos de longitud e hibrida en condiciones rigurosas con la molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos, preferiblemente la secuencia codificante, de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o un complemento de la misma.
Además de las variantes alélicas de origen natural de una molécula de ácido nucleico de la secuencia de invención que pueden existir en la población, el experto en la técnica apreciará además que pueden introducirse cambios por mutación conduciendo con ello a cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada, sin alterar la actividad biológica de la proteína. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones de nucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos “no esenciales”. Un residuo de aminoácido “no esencial” es un residuo que puede ser alterado a partir de la secuencia de tipo silvestre sin alterar la actividad biológica, mientras que un residuo de aminoácido “esencial” es requerido para la actividad biológica. Por ejemplo, los residuos de aminoácidos que no están conservados o están sólo semi- conservados entre los homólogos de diferentes especies pueden ser no esenciales para la actividad y por lo tanto serían posibles objetivos para alteración. Como alternativa, los residuos de aminoácidos que se conservan entre los homólogos de diferentes especies (por ejemplo, ratón y ser humano) pueden ser esenciales para la actividad y por lo tanto no serían posibles objetivos para alteración.
Las mutaciones pueden introducirse por técnicas estándar, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Preferiblemente, las sustituciones conservadoras de aminoácidos se hacen en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales predichos.
Una “sustitución conservadora de aminoácidos” es una en la que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico,
7 5
15
25
35
45
55
65
ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Como alternativa, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante, tal como por mutagénesis de saturación y los mutantes resultantes se pueden seleccionar en cuanto a la actividad biológica para identificar mutantes que retienen la actividad.
Después de la mutagénesis, la proteína codificada puede expresarse recombinantemente y se puede determinar la actividad de la proteína.
En un aspecto preferido un polipéptido mutante que es una variante de la invención se puede ensayar en cuanto a su capacidad para exhibir actividad de rescate de los conos.
La presente divulgación abarca moléculas de ácido nucleico antisentido, es decir, moléculas que son complementarias con un ácido nucleico sentido que codifica para un polipéptido de la invención, por ejemplo, complementarias con la cadena codificante de una molécula de ADNc de doble cadena o complementarias con una secuencia de ARNm. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario con una cadena codificante entera, o sólo con una parte de la misma, por ejemplo, con toda o parte de la región codificante de la proteína (o marco de lectura abierto). Una molécula de ácido nucleico antisentido puede ser antisentido en toda o parte de una región no codificante de la cadena codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de la invención. Las regiones no codificantes (“regiones 5' y 3' no traducidas”) son las secuencias 5' y 3' que flanquean la región codificante y no se traducen en aminoácidos.
Un oligonucleótido antisentido puede tener, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleótidos o más de longitud. Un ácido nucleico antisentido de la invención puede construirse usando síntesis química y reacciones de ligamiento enzimático utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido) se puede sintetizar químicamente utilizando nucleótidos de origen natural o se pueden utilizar nucleótidos modificados de varias maneras diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y sentido, por ej., derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. Ejemplos de nucleótidos modificados que pueden utilizarse para generar el ácido nucleico antisentido incluyen 5fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5(carboxihidroxilmetil)-uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltioN6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w y 2,6-diaminopurina. Como alternativa, el ácido nucleico antisentido puede ser producido biológicamente utilizando un vector de expresión en el que un ácido nucleico se ha subclonado en una orientación antisentido (es decir, el ARN transcrito a partir del ácido nucleico insertado será de una orientación antisentido respecto a un ácido nucleico diana de interés, descrito más detalladamente en la siguiente subsección).
Vectores de expresión recombinantes y células hospedadoras:
Otro aspecto de la invención se refiere a vectores, preferiblemente vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la invención como se define en las reivindicaciones.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un “plásmido”, que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que segmentos de ADN adicionales se pueden ligar en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedadora en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episomales de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamíferos) son vectores integrados en el genoma de una célula hospedadora tras la introducción en la célula hospedadora que de ese modo se replican junto con el genoma del hospedador. Además, ciertos vectores, vectores de expresión, son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente. En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de plásmidos (vectores). Sin embargo, la invención pretende incluir dichas otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y adenovirus asociados), que sirven para funciones equivalentes.
Los vectores de expresión recombinante descritos en la presente memoria comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora. Esto significa
8
imagen6
imagen7
imagen8
imagen9
5
15
25
35
45
55
65
Los anticuerpos de acuerdo con la invención pueden producirse por cualquier técnica conocida en la técnica, tales como, sin limitación, cualquier técnica química, biológica, genética o enzimática, ya sea sola o en combinación.
Los anticuerpos policlonales se pueden preparar mediante la inmunización de un sujeto adecuado con un polipéptido de la invención como un inmunógeno. Las composiciones de anticuerpos policlonales preferidas son las que han sido seleccionadas para anticuerpos dirigidos contra un polipéptido o polipéptidos de la invención. Particularmente las preparaciones de anticuerpos policlonales preferidas son las que contienen solamente anticuerpos dirigidos contra un polipéptido o polipéptidos de la invención. Composiciones de inmunógeno particularmente preferidas son aquellas que no contienen otras proteínas humanas tales como, por ejemplo, composiciones de inmunógeno fabricadas utilizando una célula hospedadora no humana para la expresión recombinante de un polipéptido de la invención. De esta manera, el único epítopo humano o epítopos reconocidos por las composiciones de anticuerpos resultantes generadas contra este inmunógeno estarán presentes como parte de un polipéptido o polipéptidos de la invención.
El título de anticuerpos en el sujeto inmunizado se puede controlar a lo largo del tiempo mediante técnicas estándar, tales como con un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) utilizando el polipéptido inmovilizado. Si se desea, las moléculas de anticuerpo se pueden aislar del mamífero (por ejemplo, de la sangre) y purificarse adicionalmente mediante técnicas bien conocidas, tales como cromatografía de proteína A para obtener la fracción IgG. Como alternativa, los anticuerpos específicos para una proteína o polipéptido de la invención se pueden seleccionar para (por ejemplo, purificar parcialmente) o purificar por, por ejemplo, cromatografía de afinidad. Por ejemplo, una proteína recombinantemente expresada y purificada (o parcialmente purificada) de la invención se produce como se describe en la presente memoria y se une de forma covalente o no covalentemente a un soporte sólido tal como, por ejemplo, una columna de cromatografía. La columna puede utilizarse a continuación para purificar por afinidad anticuerpos específicos para las proteínas de la invención a partir de una muestra que contiene anticuerpos dirigidos contra un gran número de epítopos diferentes, generando de ese modo una composición de anticuerpo sustancialmente purificada, es decir, una que está sustancialmente libre de anticuerpos contaminantes. Por una composición de anticuerpos sustancialmente purificada se entiende, en este contexto, que la muestra de anticuerpo contiene a lo sumo solamente 30 % (en peso seco) de anticuerpos contaminantes dirigidos contra epítopos distintos de aquellos que están en la proteína o polipéptido deseados de la invención y preferiblemente a lo sumo 20 %, aún más preferiblemente a lo sumo 10 % y lo más preferiblemente a lo sumo 5 % (en peso seco) de la muestra es de anticuerpos contaminantes. Una composición de anticuerpo purificado significa que al menos 99 % de los anticuerpos en la composición están dirigidos contra la proteína o polipéptido deseados de la invención.
En un momento apropiado después de la inmunización, por ejemplo, cuando los títulos de anticuerpos específicos son más altos, las células productoras de anticuerpos pueden obtenerse del sujeto y utilizarse para preparar anticuerpos monoclonales mediante técnicas estándar, tales como la técnica de hibridoma descrita originalmente por Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495-497, la técnica del hibridoma de linfocitos B humanos (Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4:72), la técnica del hibridoma del EBV (Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) o las técnicas del trioma. La tecnología para producir hibridomas es bien conocida (véase en general Current Protocols in Immunology (1994) Coligan et al. (eds.) John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, N.Y.). Las células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de la invención se detectan mediante el cribado de los sobrenadantes del cultivo de hibridoma para anticuerpos que se unen al polipéptido de interés, por ejemplo, usando un ensayo ELISA estándar.
Como alternativa a la preparación de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales, un anticuerpo monoclonal dirigido contra un polipéptido de la invención puede ser identificado y aislado mediante cribado de una biblioteca combinatoria recombinante de inmunoglobulinas (por ejemplo, una biblioteca de presentación de fagos de anticuerpos) con el polipéptido de interés. Los kits para generar y cribar bibliotecas de presentación de fagos están disponibles comercialmente (por ejemplo, el Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, número de catálogo 27-9400-01 y el Stratagene SurfZAP (TM) Phage Display Kit, número de catálogo 240612). Además, ejemplos de métodos y reactivos particularmente susceptibles para su uso en la generación y cribado de bibliotecas de presentación de anticuerpos se pueden encontrar en, por ejemplo, la patente US-5.223.409; la publicación PCT N.º WO 92/18619; la publicación PCT N.º WO 91/17271; la publicación PCT N.º WO 92/20791; la publicación PCT N.º WO 92/15679; la publicación PCT N.º WO 93/01288; la publicación PCT N.º WO 92/01047; la publicación PCT N.º WO 92/09690; la publicación PCT N.º WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO
J. 12:725-734.
Adicionalmente, los anticuerpos recombinantes, tales como anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden tanto porciones humanas como no humanas, que se pueden producir utilizando técnicas de ADN recombinante convencionales, están dentro del alcance de la invención. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes porciones se derivan de diferentes especies animales, tales como los que tienen una región variable derivada de un mAb murino y una región constante de inmunoglobulina humana. (Véase, por ejemplo, Cabilly et al., patente US-4.816.567 y Boss et al., patente US-4.816.397). Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo de especies no humanas que tienen una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de las especies no humanas y una región marco de una molécula de inmunoglobulina
13 5
15
25
35
45
55
65
humana. (Véase, por ejemplo, Queen, Patente US-5.585.089). Tales anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados pueden ser producidos por técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica, por ejemplo, utilizando métodos descritos en la publicación PCT N.º WO 87/02671; Solicitud de Patente Europea 184.187; Solicitud de Patente Europea 171.496; Solicitud de Patente Europea 173.494; la publicación PCT N.º WO 86/01533; Patente US-4.816.567; Solicitud de Patente Europea 125.023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449 y Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) Bio/Techniques 4:214; Patente US-5.225.539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534 y Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060.
Los anticuerpos completamente humanos se pueden producir, por ejemplo, utilizando ratones transgénicos que son incapaces de expresar los genes de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas endógenas, pero que pueden expresar genes de cadena pesada y ligera humanas. Los ratones transgénicos se inmunizan de la manera normal con un antígeno seleccionado, por ejemplo, con todo o con una porción de un polipéptido de la invención. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno pueden obtenerse usando tecnología del hibridoma convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana albergados por los ratones transgénicos se reordenan durante la diferenciación de los linfocitos B y posteriormente sufren un cambio de clase y mutación somática. Por lo tanto, usando una técnica de este tipo, es posible producir anticuerpos terapéuticamente útiles IgG, IgA e IgE. Para una visión general de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, véase Lonberg y Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13: 65-93). Para una discusión detallada de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir tales anticuerpos, véase, por ejemplo, la patente US5.625.126; patentes US-5.633.425; US-5.569.825; US-5.661.016 y US-5.545.806. Además, empresas como Abgenix, Inc. (Fremont, Calif.) pueden proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado usando tecnología similar a la descrita anteriormente.
Un anticuerpo dirigido contra un polipéptido de la invención (por ejemplo, anticuerpo monoclonal) se puede utilizar para aislar el polipéptido mediante técnicas estándar, tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Además, un anticuerpo de este tipo puede ser utilizado para detectar la proteína (por ejemplo, en un lisado celular o sobrenadante celular) con el fin de evaluar la abundancia y patrón de expresión del polipéptido. Los anticuerpos también se pueden utilizar para diagnóstico para controlar los niveles de proteína en tejido como parte de un procedimiento de ensayo clínico, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede facilitarse por acoplamiento del anticuerpo a una sustancia detectable. Ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina, y aequorina, y ejemplos de materiales radiactivos adecuados incluyen 125I, 131I, 31S o 3H.
La presente divulgación abarca los fragmentos de anticuerpo de los anticuerpos de la invención. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, diacuerpos y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
El término “Fab” indica un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50.000 y actividad de unión al antígeno, en el que aproximadamente una mitad del lado N-terminal de la cadena H y toda la cadena L, entre los fragmentos obtenidos tratando IgG con una proteasa, papaína, están unidas a través de un enlace disulfuro.
El término “F(ab')2” se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente
100.000 y actividad de unión al antígeno, que es ligeramente mayor que la del Fab unido a través de un enlace disulfuro de la región bisagra, entre los fragmentos obtenidos tratando IgG con una proteasa, pepsina.
El término “Fab” se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50.000 y una actividad de unión al antígeno, que se obtiene cortando un enlace disulfuro de la región bisagra del F(ab')2.
Un polipéptido de cadena sencilla Fv (“scFv”) es un heterodímero VH::VL unido covalentemente que se expresa habitualmente a partir de una fusión de genes que incluyen los genes que codifican para VH y VL unidos por un enlazador que codifica para el péptido. El fragmento scFv humano de la invención incluye CDR que se mantienen en conformación apropiada, preferiblemente mediante el uso de técnicas de recombinación génica. “dsFv” es un heterodímero VH::VL estabilizado por un enlace disulfuro. Los fragmentos de anticuerpo divalentes y multivalentes se pueden formar ya sea espontáneamente por asociación de scFv monovalentes, o se pueden generar mediante el acoplamiento de los scFv monovalentes por un enlazador peptídico, tales como sc(Fv)2 divalente.
14 5
15
25
35
45
55
65
El término “diacuerpos” se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión al antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Mediante el uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno.
Aptámeros:
En otro aspecto la divulgación se refiere a un aptámero dirigido contra un polipéptido de la invención.
Los aptámeros son una clase de molécula que representa una alternativa a los anticuerpos en términos de reconocimiento molecular. Los aptámeros son secuencias de oligonucleótidos o de oligopéptidos con la capacidad de reconocer virtualmente cualquier clase de moléculas diana con alta afinidad y especificidad. Tales ligandos pueden ser aislados a través del sistema Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX) de una biblioteca de secuencia aleatoria, como se describe en Tuerk C. 1997. La biblioteca de secuencia aleatoria puede obtenerse mediante síntesis química combinatoria de ADN. En esta biblioteca, cada miembro es un oligómero lineal, eventualmente químicamente modificado, de una secuencia única. Posibles modificaciones, usos y ventajas de esta clase de moléculas han sido revisados en Jayasena S.D., 1999. Los aptámeros peptídicos consisten en las regiones variables de anticuerpos conformacionalmente restringidos mostrados por una proteína plataforma, tales como tiorredoxina A de E. coli, que se seleccionan a partir de bibliotecas combinatorias mediante dos métodos híbridos (Colas et al., 1996).
Métodos terapéuticos y composiciones farmacéuticas:
Los polipéptidos, moléculas de ácidos nucleicos, vectores, células hospedadoras, anticuerpos y aptámeros de la invención pueden ser particularmente adecuados para fines terapéuticos. Por ejemplo, los polipéptidos, moléculas de ácido nucleico, vectores, células hospedadoras de la invención pueden ser adecuados para el tratamiento de una enfermedad degenerativa de la retina.
Generalmente dicha enfermedad degenerativa de la retina se selecciona del grupo que consiste en retinitis pigmentosa, degeneración macular asociada a la edad, síndrome de Bardet-Biedel, síndrome de Bassen-Kornzweig, enfermedad de Best, coroideremia, atrofia girada, amaurosis congénita de Leber, enfermedad de Refsum, enfermedad de Stargardt o síndrome de Usher.
En una realización preferida dicha enfermedad degenerativa es la retinitis pigmentosa.
En un aspecto, la invención proporciona un método para el tratamiento de enfermedades degenerativas de la retina que comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula de polipéptido o ácido nucleico de la invención.
Por una “cantidad terapéuticamente eficaz” del polipéptido o molécula de ácido nucleico de la invención se entiende una cantidad suficiente de la molécula de ácido nucleico o polipéptido para el tratamiento de enfermedades degenerativas de la retina en una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. Se entenderá, sin embargo, que el uso diario total de los polipéptidos o moléculas de ácido nucleico y las composiciones de la presente invención será decidido por el médico dentro del alcance del juicio médico. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específico para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de factores incluyendo el trastorno a tratar y la gravedad del trastorno; actividad del polipéptido específico empleado; la composición específica empleada, la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el tiempo de administración, vía de administración y velocidad de excreción del polipéptido específico empleado; la duración del tratamiento; fármacos utilizados en combinación o coincidential con el polipéptido específico empleado y factores como bien conocidos en las técnicas médicas. Por ejemplo, está bien dentro de la experiencia de la técnica comenzar con dosis del compuesto a niveles inferiores a los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosificación hasta que se consiga el efecto deseado.
Los polipéptidos o moléculas de ácido nucleico de la invención pueden combinarse con excipientes farmacéuticamente aceptables y opcionalmente matrices de liberación sostenida, tales como polímeros biodegradables, para formar composiciones terapéuticas.
“Farmacéuticamente” o “farmacéuticamente aceptable” se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción no deseada cuando se administra a un mamífero, especialmente un ser humano, según sea apropiado. Un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable se refiere a una carga sólida, semisólida o líquida no tóxica, diluyente, material de encapsulación o auxiliar de formulación de cualquier tipo.
En las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación para la administración oral, sublingual, subcutánea, intramuscular, intravenosa, transdérmica, local o rectal, el principio activo, solo o en combinación con otro principio
15
imagen10
imagen11
imagen12
5
15
25
35
45
55
65
La expresión “muestra biológica” se pretende que incluya tejidos, células y fluidos biológicos aislados de un sujeto, así como tejidos, células y fluidos presentes dentro de un sujeto.
El método de detección de la divulgación se puede utilizar para detectar ARNm, proteína o ADN genómico en una muestra biológica in vitro así como in vivo. Por ejemplo, las técnicas in vitro para la detección de ARNm incluyen hibridaciones Northern e hibridaciones in situ. Las técnicas in vitro para la detección de un polipéptido de la invención incluyen ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), transferencias Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Las técnicas in vitro para la detección de ADN genómico incluyen hibridaciones Southern. Además, las técnicas in vivo para la detección de un polipéptido de la invención incluyen la introducción en un sujeto de un anticuerpo marcado dirigido contra el polipéptido. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con un marcador radiactivo cuya presencia y localización en un sujeto puede detectarse mediante técnicas de imagen estándar.
En un aspecto, la muestra biológica contiene moléculas de proteína del sujeto de ensayo. Como alternativa, la muestra biológica puede contener moléculas de ARNm del sujeto de ensayo o moléculas de ADN genómico del sujeto de ensayo.
En otro aspecto, los métodos implican además obtener una muestra biológica de control de un sujeto de control, poner en contacto la muestra de control con un compuesto o agente capaz de detectar un polipéptido de la invención
o ARNm o ADN genómico que codifica para un polipéptido de la invención, de tal modo que la presencia del polipéptido o ARNm o ADN genómico que codifica el polipéptido se detecta en la muestra biológica y comparar la presencia del polipéptido o ARNm o ADN genómico que codifica para el polipéptido en la muestra de control con la presencia del polipéptido o ARNm o ADN genómico que codifica para el polipéptido en la muestra de ensayo.
La invención también abarca un kit como se define en las reivindicaciones que se puede utilizar para detectar la presencia de un polipéptido o ácido nucleico de la invención en una muestra biológica (una muestra de ensayo). Tales kits se pueden utilizar para determinar si un sujeto padece o está en mayor riesgo de desarrollar un trastorno asociado con la expresión aberrante de un polipéptido de la invención (por ejemplo, enfermedades degenerativas de la retina). El kit, por ejemplo, puede comprender un compuesto o agente marcado capaz de detectar el polipéptido o ARNm que codifica para el polipéptido en una muestra biológica y medios para determinar la cantidad del polipéptido
o ARNm en la muestra (por ejemplo, un anticuerpo que se une al polipéptido o una sonda de oligonucleótidos que se une a ADN o ARNm que codifica para el polipéptido). Los kits también pueden incluir instrucciones para observar que el sujeto ensayado padece o está en riesgo de desarrollar un trastorno asociado con la expresión aberrante del polipéptido si la cantidad del polipéptido o ARNm que codifica para el polipéptido está por encima o por debajo de un nivel normal.
El kit puede comprender, por ejemplo: (1) un primer anticuerpo (por ejemplo, unido a un soporte sólido) que se une a un polipéptido de la invención y, opcionalmente, (2) un segundo anticuerpo diferente que se une o bien al polipéptido
o al primer anticuerpo y que está conjugado con un agente detectable.
El kit puede comprender, por ejemplo: (1) un oligonucleótido, por ejemplo, un oligonucleótido marcado de forma detectable, que hibrida con una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la invención o (2) un par de cebadores útiles para amplificar una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la invención.
El kit también puede comprender, por ejemplo, un agente tampón, un conservante, o un agente estabilizante de proteínas. El kit también puede comprender componentes necesarios para detectar el agente detectable (por ejemplo, una enzima o un sustrato). El kit también puede contener una muestra de control o una serie de muestras de control que pueden ensayarse y compararse con la muestra de ensayo contenida. Cada componente del kit está generalmente encerrado dentro de un envase individual y todos los diversos envases están dentro de un solo paquete junto con las instrucciones para observar si el sujeto ensayado padece o está en riesgo de desarrollar un trastorno asociado con la expresión aberrante del polipéptido
Los métodos descritos en la presente memoria además pueden ser utilizados como ensayos de diagnóstico o pronóstico para identificar sujetos que tienen o están en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante de un polipéptido de la invención (por ejemplo, enfermedades degenerativas de la retina). Por ejemplo, los ensayos descritos en la presente memoria, tales como los ensayos de diagnóstico precedentes o los siguientes ensayos, se pueden utilizar para identificar un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar un trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante de un polipéptido de la invención. Como alternativa, los ensayos de pronóstico pueden utilizarse para identificar un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno.
Por lo tanto, la presente divulgación proporciona un método en el que se obtiene una muestra de ensayo de un sujeto y se detecta un polipéptido o ácido nucleico (por ejemplo, ARNm, ADN genómico) de la invención, en el que la presencia del polipéptido o ácido nucleico es diagnóstica de que un sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante del polipéptido. Como se usa en la presente
19
imagen13
imagen14
imagen15

Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
ES08857986.7T 2007-12-06 2008-12-05 Factor trófico para el tratamiento de las enfermedades degenerativas de la retina Active ES2582559T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07301634 2007-12-06
EP07301634 2007-12-06
PCT/EP2008/066878 WO2009071659A1 (en) 2007-12-06 2008-12-05 Trophic factor for the treatment of retinal degenerative diseases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2582559T3 true ES2582559T3 (es) 2016-09-13

Family

ID=39137760

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES08857986.7T Active ES2582559T3 (es) 2007-12-06 2008-12-05 Factor trófico para el tratamiento de las enfermedades degenerativas de la retina

Country Status (5)

Country Link
US (1) US8193153B2 (es)
EP (1) EP2231177B1 (es)
JP (1) JP5710265B2 (es)
ES (1) ES2582559T3 (es)
WO (1) WO2009071659A1 (es)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2870241B1 (fr) * 2004-05-13 2015-02-27 Novartis Ag Facteur de viabilite des cones derive des batonnets ou rdcvf et applications
EP2027889A1 (en) * 2007-06-05 2009-02-25 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) New neuronal viability factor and use thereof
ES2677564T3 (es) * 2009-06-19 2018-08-03 Inserm (Institut National De La Santé Et De La Recherche Medicale) Método y composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos
US9265813B2 (en) * 2011-10-27 2016-02-23 Wellstat Ophthalmics Corporation Vectors encoding rod-derived cone viability factor
KR101906756B1 (ko) * 2012-10-09 2018-12-05 산바이오 인코포레이티드 망막 변성의 치료 방법 및 치료용 조성물
KR102549909B1 (ko) 2020-10-08 2023-06-29 중앙대학교 산학협력단 Smug1 유전자 또는 단백질을 포함하는 망막질환 예방 또는 치료용 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
US20100267646A1 (en) 2010-10-21
WO2009071659A1 (en) 2009-06-11
EP2231177B1 (en) 2016-04-27
US8193153B2 (en) 2012-06-05
EP2231177A1 (en) 2010-09-29
JP5710265B2 (ja) 2015-04-30
JP2011505797A (ja) 2011-03-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6863893B2 (ja) 抗突然変異ｋｒａｓ ｔ細胞受容体
McCarl et al. ORAI1 deficiency and lack of store-operated Ca2+ entry cause immunodeficiency, myopathy, and ectodermal dysplasia
KR102271635B1 (ko) 미오스타틴 억제제의 용도 및 조합 요법
JP2022058360A (ja) 抗ヒトパピローマウイルス１６ ｅ７ ｔ細胞受容体
EP2732823B1 (en) Modulation of the TrpV : Vps10p-domain receptor system for the treatment of pain
Lekszas et al. Biallelic TANGO1 mutations cause a novel syndromal disease due to hampered cellular collagen secretion
JP6920818B2 (ja) 心不全の治療のための標的としてのｂａｇ３
KR101813482B1 (ko) 루푸스의 치료 또는 예방을 위한 조성물 및 방법
ES2582559T3 (es) Factor trófico para el tratamiento de las enfermedades degenerativas de la retina
Xu et al. Internally deleted human tRNA synthetase suggests evolutionary pressure for repurposing
JP4659736B2 (ja) スクリーニング方法
BR112013033175A2 (pt) sequência de peptídeo, subsequência, composição, composição farmacêutica, molécula de ácido nucleico, vetor, célula transformada ou hospedeira, método de tratamento de um indivíduo, método para melhorar o metabolismo da glicose em um indivíduo e método para identificar uma sequência peptédica
ES2696348T3 (es) Anticuerpos anti CD84, composiciones que comprenden los mismos y usos de los mismos
KR101092173B1 (ko) Ａ33 항원 및 ｊａｍ-ｉｔ의 용도
CN107001480A (zh) 用于人c‑maf的结合成员
Skeie et al. Autoimmunity against the ryanodine receptor in myasthenia gravis
Soares et al. Neuronal and glial expression of the adhesion molecule TAG‐1 is regulated after peripheral nerve lesion or central neurodegeneration of adult nervous system
JP2010131022A (ja) Ｄｎａマクロアレイプロテオミクスプラットフォームに基づく前立腺癌関連組成物、方法およびキット
DK2298799T3 (en) Gene encoding a human multi-resistance β-glycoprotein homolog on chromosome 7p15-21, and uses thereof
TWI252314B (en) Collapsin response mediator protein-1 (CRMP-1) as an indicator for tumor metastatic diagnosis and treatment
WO2017143036A1 (en) Modulators of ms4a activity
JP2008502307A (ja) 抗肥満活性及び他の関連用途を有するペプチド
JP2007534305A (ja) サル免疫グロブリン配列
US20200339671A1 (en) Heterotopic ossification and method of treatment
US20070128157A1 (en) Tumour suppressor protein