ES2609006T3 - Procedimeinto de tratamiento de lesión crónica de tejido nervioso usando una estrategia de terapia celular - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende células madre adherentes de médula ósea suspendidas en un líquido farmacéuticamente aceptable para su uso en el tratamiento de una lesión degenerativa o traumática en un tejido nervioso o en el cerebro, en la que dichas células se pueden obtener mediante: (a) cultivar una muestra biológica que comprende células madre adultas de médula ósea sobre un sustrato recubierto con poli-L-lisina durante 2 a 72 horas, de manera que una capa de células madre de médula ósea se adhiere a dicho sustrato sin expandir las células en cultivo; (b) lavar las células no adherentes de dicho sustrato y recoger las células madre adherentes de la médula ósea; y (c) suspender las células madre adherentes de médula ósea en un líquido farmacéuticamente aceptable; y en la que dicho tratamiento comprende: administrar dicha composición en o cerca del sitio de la lesión en una cantidad eficaz para provocar regeneración axonal o remielinización en el sitio de dicha lesión.

Description

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DESCRIPCION

Procedimeinto de tratamiento de lesion cronica de tejido nervioso usando una estrategia de terapia celular Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a composiciones que comprenden celulas madre adherentes de medula osea suspendidas en un lfquido farmaceuticamente aceptable para su uso en el tratamiento de una lesion degenerativa o traumatica en un tejido nervioso o en el cerebro.

Antecedentes de la invencion

Las lesiones nerviosas y cerebrales, incluidas las lesiones traumaticas y degenerativas de los nervios perifericos y/o la medula espinal (SCI), permanecen aun sin tratamiento curativo. Con respecto a la SCI por ejemplo, incluso una contusion leve a la medula espinal puede dar lugar a la perdida masiva neuronal y de celulas gliales, desmielinizacion, cavitacion, y cicatrizacion glial. Cambios patologicos como estos tienen efectos funcionales perjudiciales que causan perdida de la percepcion sensorial, paralisis motora distal y deterioro funcional severo, con un resultado final que depende del reemplazo axonal, remielinizacion y posiblemente regeneracion neural. Tambien se observan efectos similares con muchos trastornos neurodegenerativos que incluyen, entre otros, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis multiple, la esclerosis lateral amiotrofica, degeneraciones multisistemicas, degeneracion cerebelar y similares. Por consiguiente, son deseables una o mas estrategias para reparar o regenerar tejido danado con el resultado final de restaurar dicho tejido y efectos funcionales perdidos.

Una estrategia propuesta es el uso de celulas pluripotentes o celulas madre con el fin de tratar el area afectada. Las celulas estromales de la medula, en particular, son candidatos atractivos para tales propositos porque tienen muchas de las caracterfsticas de las celulas madre y se ha demostrado que se diferencian en osteoblastos, condrocitos, adipocitos e incluso mioblastos. Por lo tanto, existe un potencial para su uso en la regeneracion de tejido nervioso o cerebral danado en un paciente.

Una de las principales dificultades es que los tipos de celulas de la medula osea son relativamente raros y diffciles de identificar. Para este fin, gran parte de la investigacion actual se ha centrado en aislar tipos particulares de celulas de interes y explorar metodologfas para lograr la diferenciacion de celulas neurales. La publicacion de la solicitud de patente estadounidense N° 2007/0031387, por ejemplo, divulga el aislamiento de celulas mononucleares a partir de granulocitos dentro de una poblacion de celulas de medula osea. La patente estadounidense N° 7.098.027 afsla alternativamente celulas mononucleares usando centrifugacion en gradiente de densidad, es decir, aislamiento de celulas que tienen una gravedad especffica dentro del intervalo de 1,07 y 1,08 g/ml. En cualquiera de los dos casos, se contemplan las celulas mononucleares aisladas para su administracion para el tratamiento de la lesion espinal u otros trastornos neurologicos.

Ademas del aislamiento celular, se han realizado numerosos intentos para diferenciar celulas de la BM antes de la administracion en un medio in vitro o despues de la administracion in vivo. La patente N° 5.197.985, por ejemplo, ilustra procedimientos para regenerar tejidos mesenquimales y neuroectodermicos usando celulas de medula osea (BM) adultas. La diferenciacion celular se lleva a cabo utilizando una composicion ceramica porosa de fosfato tricalcico o hidroxiapatita o combinaciones de los dos, como vehfculo o portador para celulas mesenquimales derivadas de la medula, las cuales, cuando se implantan en defectos esqueleticos, promueven la diferenciacion de las celulas en tejido esqueletico.

La patente estadounidense N° 6.528.245 divulga un procedimiento para seleccionar especfficamente celulas estromales de medula osea en una poblacion de celulas de medula osea incubando las celulas en un medio de cultivo plastico y retirando las celulas estromales que se adhieren al plastico. Estas celulas se diferencian entonces in vitro en presencia de acido retinoico, factores de crecimiento y celulas neuronales fetales y se administran para tratar trastornos neurodegenerativos. La publicacion de la solicitud de patente estadounidense N° 2006/0275272 ensena igualmente procedimientos de tratamiento aislando y cultivando celulas estromales de medula osea que se usan para tales propositos. Finalmente, la patente estadounidense N° 7.279.331, ensena procedimientos similares de aislamiento de celulas estromales de medula osea, las cuales son luego diferenciadas previamente in vitro en una celula neuronal usando antioxidantes y/o diversos factores de crecimiento.

La publicacion de la solicitud de patente estadounidense N° 2006/0029580 ensena ademas un procedimiento para generar celulas progenitoras neurales incubando celulas de medula osea en un cultivo suplementado con factor 2 de crecimiento de fibroblastos (FGF-2) y factor de crecimiento epidermico (EGF). Las celulas progenitoras pueden entonces administrarse a un paciente que presenta una afeccion neuropatologica.

Ademas de las celulas de la BM, tambien se han explorado las celulas derivadas de tejido placentario u otro tejido postnatal para propositos regenerativos neurales. La publicacion de la solicitud de patente estadounidense N°

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2006/0147426 se refiere a condiciones de cultivo celular para aislar celulas inducibles postnatales de linaje multiple. Tales condiciones de cultivo incluyen sustrato extracelular de matriz, tension de oxfgeno, factores de crecimiento y vitaminas, densidad celular o cocultivo de celulas. La publicacion de la solicitud de patente estadounidense N° 2005/0032209 ensena procedimientos y composiciones para regenerar o reparar tejido neural utilizando celulas derivadas del postparto. Estas celulas se derivan del tejido de la placenta o del cordon umbilical y se cultivan en un medio de L-valina en un ambiente de oxfgeno al 5%.

Lo anterior presenta evidencia definitiva de que tipos de celulas pluripotentes de medula osea y similares pueden diferenciarse en celulas mesenquimales, e ilustra adicionalmente la viabilidad y promesa de aplicacion de estos tipos de celulas para el tratamiento de lesiones traumaticas o degenerativas a tejido nervioso o cerebral, tales como remielinizacion o regeneracion del tejido axonal danado. Sin embargo, incluso teniendo en cuenta las metodologfas propuestas anteriormente, sigue existiendo la necesidad de poblaciones de celulas alternativas y estrategias novedosas para una diferenciacion celular mas predecible. Ademas, es necesario sortear las numerosas limitaciones eticas y tecnicas que ahora limitan el uso generalizado del trasplante neural.

La presente invencion a traves de sus realizaciones y ejemplos responde a estas necesidades.

Sumario de la invencion

La presente invencion se refiere a composiciones para uso como se define en las reivindicaciones 1 a 9. Como se menciona en la presente memoria, la presente invencion se basa en el descubrimiento de que las celulas adherentes de medula osea (ABMC) pueden diferenciarse en y/o provocar la produccion de tipos celulas neurales progenitoras, celulas formadoras de mielina, astrocitos, oligodendrocitos, neuronas maduras, axones mielinizados y similares. Mas especfficamente, se descubrio sorprendentemente que cuando se introducen ABMC aisladas en una lesion de un mamffero que padece una lesion nerviosa, tal como de la SCI, las celulas conducen tanto a la remielinizacion como a la regeneracion axonal del tejido neural danado en el sitio de la lesion. Tambien se observo una coordinacion motora mejorada y/o una reduccion de la afeccion neurodegenerativa objetivo, particularmente cuando se combina con terapia ffsica.

Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la presente invencion, se proporciona una composicion que comprende celulas madre adherentes de medula osea suspendidas en un lfquido farmaceuticamente aceptable para uso en el tratamiento de una lesion degenerativa o traumatica de un tejido nervioso o del cerebro, en donde dichas celulas se pueden obtener mediante: a) el cultivo de una muestra biologica que comprende celulas madre de medula osea adulta sobre un sustrato recubierto de poli-L-lisina durante 2 a 72 horas, de manera que una capa de celulas madre de medula osea se adhiere a dicho sustrato sin expandir las celulas en el cultivo; b) el lavado de las celulas no adherentes de dicho sustrato y recoger las celulas madre adherentes de medula osea; y c) suspender las celulas madre adherentes de medula osea en un lfquido farmaceuticamente aceptable; y en donde dicho tratamiento comprende: administrar dicha composicion en o cerca del sitio de la lesion en una cantidad eficaz para provocar regeneracion axonal o remielinizacion en el sitio de dicha lesion. Segun una realizacion de este aspecto de la invencion, la lesion es en el cerebro o en la medula espinal y se administran las celulas madre de medula osea mediante inyeccion intratecal a traves de puncion lumbar en el lfquido cefalorraqufdeo, en o cerca del sitio de la lesion. De acuerdo con otra realizacion de este aspecto de la invencion, la lesion es en un nervio periferico y las celulas madre de medula osea se administran por sonograffa local guiada aplicada a la rafz del nervio periferico.

En otra realizacion de la invencion, las celulas madre adherentes de la medula osea provocan regeneracion axonal y remielinizacion en el sitio de la lesion. En otra realizacion de la invencion, las celulas madre de medula osea se derivan de aspirados de sangre de cordon umbilical o de la medula osea.

Se administra una cantidad terapeuticamente eficaz de celulas al paciente para tratar la lesion nerviosa o cerebral. En una realizacion, una cantidad terapeuticamente eficaz se refiere a la cantidad de celulas necesarias para provocar remielinizacion y/o regeneracion axonal del tejido neural danado en un sitio de lesion o bien para reparar el tejido nervioso o cerebral danado. Esto a su vez puede facilitar una coordinacion motora mejorada y/o una reduccion de la afeccion neurodegenerativa objetivo. Una dosificacion terapeuticamente eficaz esta entre aproximadamente 104 hasta aproximadamente 107 ABMC/kg. Como se ejemplifica a continuacion, en una realizacion no limitante, una dosificacion terapeuticamente eficaz es de aproximadamente 2 X 106 ABMC/kg.

Dicha dosis terapeuticamente eficaz puede proporcionarse al paciente como una administracion unica o administraciones acumulativas multiples y puede incluir tambien uno o mas aditivos farmaceuticamente aceptables siempre y cuando no afecte adversamente la accion o diferenciacion de las ABMC. En una realizacion, la dosificacion acumulativa de dichas celulas madre de medula osea se administra periodicamente en una serie de dos o mas inyecciones. En una realizacion mas especffica, las inyecciones periodicas se realizan mensualmente.

La subpoblacion aislada de ABMC es positiva para uno o mas grupos de diferenciacion (CD) de marcadores de la superficie de las celulas indicativos del potencial de diferenciacion en linajes multiples, en particular diferenciacion

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neural. En una realizacion de la invencion, las celulas madre de medula osea incluyen celulas positivas para uno o mas marcadores seleccionados de CD44, CD73, CD90, CD105, CD166 y CD271. De acuerdo con una realizacion mas especffica, las celulas madre de medula osea son negativas para los marcadores CD34, CD38 y CD45. La presencia (o ausencia) de estos marcadores se puede confirmar usando uno o mas procedimientos discutidos en la presente memoria o bien conocidos en la tecnica.

En otra realizacion, que se ejemplifica a continuacion, las ABMC incluyen o dan como resultado la produccion de una o mas celulas formadoras de mielina, celulas precursoras de astrocitos, astrocitos, celulas progenitoras neurales, celulas precursoras de oligodendrocitos, celulas oligodendrocitos, axones mielinizados, neuronas maduras, y similares. Con este fin, se encontro que las celulas recien formadas eran positivas para uno o mas marcadores asociados con estos tipos de celulas tales como, pero sin limitarse a, NF70, Nestina, PDGFR, GFAP o TuJ1.

En la presente invencion, las muestras biologicas que contienen celulas madre de medula osea se obtienen primero usando procedimientos estandar conocidos en la tecnica y como se discute en la presente memoria, por ejemplo, a partir de aspirados de sangre de cordon umbilical o de la medula osea.

Como se ha indicado anteriormente, se proporciona una composicion que comprende celulas madre adherentes de medula osea suspendidas en un lfquido farmaceuticamente aceptable para uso en el tratamiento de una lesion degenerativa o traumatica en un tejido nervioso o en el cerebro, por lo que dichas celulas pueden obtenerse mediante:

(a) cultivo de una muestra biologica que contiene celulas madre de medula osea adulta sobre un sustrato recubierto con poli-L-lisina durante 2 a 72 horas, de manera que una capa de celulas madre de medula osea se adhiere al sustrato sin expandir las celulas en cultivo;

(b) lavado de las celulas no adherentes del sustrato y recoleccion de las celulas madre de medula osea; y

(c) suspension de las celulas madre adherentes de medula osea en un lfquido farmaceuticamente aceptable;

donde dicho tratamiento comprende: administrar dicha composicion en o cerca del sitio de la lesion en una cantidad efectiva para provocar regeneracion axonal o remielinizacion en el sitio de la lesion.

En una realizacion, la etapa de cultivo se lleva a cabo durante aproximadamente 72 horas. En otra realizacion, despues de la incubacion, se eliminan las celulas no adherentes lavando el sustrato recubierto usando una o multiples etapas de lavado. Las celulas adherentes se separan entonces del sustrato recubierto con poli-L-lisina.

A continuacion, se administran las ABMC al paciente en o aproximadamente en el sitio de la lesion/dano usando cualquier modo de administracion entendido en la tecnica. En una realizacion no limitante, las ABMC pueden formularse para inyeccion directa, en o cerca del sitio de la lesion. Con este fin, se pueden suspender las celulas en una solucion esteril, que puede incluir una o mas de una solucion salina fisiologica, agua destilada, fluido espinal u otros lfquidos farmaceuticamente aceptables. Para el tratamiento de una lesion de la medula espinal, la administracion es por inyeccion intratecal. Tambien se proporcionan en la presente memoria realizaciones alternativas para modos de administracion, o bien aquellas entendidas por un experto en la tecnica.

Las ABMC y composiciones de la presente invencion son ventajosas ya que contribuyen a la regeneracion axonal y remielinizacion en una lesion de la medula espinal o de un nervio periferico. Son ademas ventajosas tambien para reparar el tejido nervioso o cerebral danado/lesionado. Con respecto a los pacientes con lesion de la medula espinal, es decir, paralisis motora o perdida sensorial, el trasplante de ABMC es eficaz para promover regeneracion axonal y remielinizacion e inducir la reparacion, particularmente cuando se combina con el entrenamiento funcional mediante fisioterapia. Tambien se observo la regeneracion de las fibras del tracto corticoespinal y fue acompanada de una mejorfa funcional. Ademas, las ABMC produjeron factores neurotroficos y mediadores antiinflamatorios que dieron soporte al tejido del nervio huesped creando nuevas vfas neuronales en los tejidos fibrosos de cicatrizacion, o expandiendo el brote o generando fibras neuronales regeneradas cortas.

Ventajas adicionales de la presente invencion seran apreciadas por un experto en la tecnica con base en las ensenanzas y ejemplos proporcionados en la presente memoria.

Breve descripcion de los dibujos

La Fig. 1 ilustra los hallazgos histopatologicos a las 16 semanas despues de la terapia con celulas ABMC en el modelo SCI severo canino. (A) El epicentro de la medula espinal canina lesionada en el grupo de control tenido con H&E, mostro formacion marcada de vacuolas (Inerte) y cicatrizacion glial. (B) El epicentro de la medula espinal lesionada de un perro en el grupo B tratado con ABMC autologa, que revela remielinizacion y menos cavitacion. (C)

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Analisis cuantitativo de areas de cavidad que muestran una disminucion significativa en cavidades en perros tratados con ABMC autologa. (D-F) Inmunotincion de protema basica de mielina de medula espinal intacta en perros no lesionados (D), perro con SCI de control (E) y perro tratado con ABMC autologa (F). (G) Recuperacion de la tincion de protema basica de mielina hasta niveles casi normales en perros intactos despues del tratamiento con ABMC autologa. (H) Puntajes locomotores base de los perros y 1, 4, 8, 12 y 16 semanas despues de SCI demostrando una mejora significativa en perros tratados con ABMC autologa tan pronto como 4 semanas despues del trasplante. (I) Aumento de los movimientos de los miembros posteriores en perros tratados con ABMC autologa en comparacion con los controles.

La Fig. 2 ilustra la tincion con inmunofluorescencia multicolor de secciones de SCI de perros tratados con ABMC autologa. (A) Seccion transversal de la lesion de la medula espinal que muestra un tejido bien organizado que puentea la brecha de la medula espinal (flechas) que solo se observo en secciones de perros tratados con ABMc autologa. La seccion es una superposicion de baja potencia de imagenes brillantes e imagenes fluorescentes del marcador nuclear DAPI (azul), GFP (verde) como marcador para ABMC trasplantada, y NF70 (rojo) como un marcador neuronal. La expresion de las GFP fue generalizada tanto en la materia gris como en la blanca y en las rames nerviosas circundantes. Zona cuadrada 1 en la materia gris de la medula espinal mostrando GFP colocalizada y tincion con NF70. Zona cuadrada 2 de seccion transversal en tractos corticoespinales ventrales mostrando mayor aumento de la expresion de GFP (derecha), y axones con GFP colocalizada con NF70. Barra de escala, 200 pm. (B) Distribucion de las celulas positivas para GFP de acuerdo con la distancia desde el epicentro. (C-F) Secciones transversales de tractos corticoespinales ventrales que demuestran la inmunoreactividad a GFP y NF70. (C) Tracto corticoespinal ventral mostrando GFP colocalizada y NF70 y que ilustra la diferenciacion neuronal sustancial de los derivados de celulas con GFP. (D) Superposicion de la seccion en C en campo brillante. (E) Ampliacion mayor que muestra axones remielinizados positivos para GFP con expresion estructural de NF70 (inerte). (F) Superposicion de la seccion en E en campo brillante. (G) GFP colocalizada y tincion con Nestina. (H) GFP colocalizada y tincion con PDGFR, recuadro que muestra ampliacion de la zona cuadrada. (I) GFP colocalizada y tincion con GFAp, recuadro que muestra la ampliacion de la zona cuadrada. La flecha en inerte indica el axon positivo para GFP, mientras que la punta de flecha apunta a un axon que carece de expresion de GFP. (J) GFP colocalizada y tincion con GRM1, GAD, A2B5 y AE en areas de materia gris cerca del canal central. DAPI se utiliza para la tincion nuclear en todas las secciones. Barras de escala en A, 200 pm, en D y F, 10 pm.

La Fig. 3 ilustra el diseno del estudio de trasplante autologo intratecal de ABMC en pacientes cronicos de lesion medular completa. El diagrama muestra la inscripcion, los criterios de inclusion y los criterios de seguimiento.

La Fig. 4 ilustra la recuperacion de pacientes con SCI cronica medida a los 18 meses despues del trasplante de ABMC autologa. (A) Niveles neurologicos mejorados en pacientes tratados con ABMC autologa en comparacion con los controles. Los pacientes de control mantuvieron un nivel neurologico toracico entre los niveles toracicos 1 y 12 (T1-T12), mientras que los pacientes tratados con ABMC autologa alcanzaron niveles neurologicos lumbares y sacros hasta S5. (B) Cambios en las puntuaciones ASIA (eje izquierdo) y escalas ASIA (eje derecho) en los pacientes tratados en comparacion con los controles. Tres pacientes de control teman puntuaciones ASIA mas bajas despues de 18 meses que sus puntuaciones de lmea base, mientras que los pacientes tratados con terapia celular mostraron puntuaciones mejoradas. (C) imagenes de RM antes y 12 meses despues del trasplante autologo de ABMC (paciente 6 con SCI cervical) mostrando compresion y edema de la medula espinal a nivel C6-C7, mientras que la imagen un ano despues del tratamiento demostro una zona curada con gliosis minima.

La Fig. 5 ilustra la tripotencia de ABMC canina y la induccion neural. (A) Celulas caninas adherentes de BM aisladas despues de 72 horas (ABMC) y tenidas con giemsa. Inerte muestra una imagen de mayor potencia de las celulas. (B) ABMC canina transfectada con GFP con un 95% de eficacia (todas las celulas en este campo son positivas para GFP). (C) Induccion neuronal de cABMC despues de una semana que muestra la morfologfa neuronal (inerte superior) y neuroesfera (inerte inferior). (D) cABMC inducida por adipocitos y tenida con Oil Red. (E) diferenciacion de osteocitos con tincion de Von Kossa (inerte superior) y tincion con fosfatasa alcalina (inerte inferior). (F) Tincion azul alcian de cABMC inducida por condrocitos ya sea en placas de cultivo de tejidos (inerte superior) o como agregados de sulfato de condroitina (flecha) en un cultivo en tubo tridimensional (inerte inferior). (G-I) imagenes brillantes y de GFT de cABMC inducida por la diferenciacion neuronal y tenidas por Nestina.

La Fig. 6 ilustra las celulas de BM adherentes humanas aisladas despues de 72 horas de pluripotencia (ABMC) que muestran transdiferenciacion de triple linaje en adipocitos, osteocitos y condrocitos, asf como induccion de neuroesferas y diferenciacion neural. (A) tincion con Oil red de hABMC inducida por la diferenciacion de los adipocitos. (B) diferenciacion de osteocitos con tincion con fosfatasa alcalina. (C) tincion azul alcian de hABMC inducida para condrocitos. (D-F) Induccion neuronal de hABMC despues de 4 dfas mostrando morfologfa neuronal. (G-I) Induccion de celulas neurales a partir de la formacion de neuroesfera despues de una semana.

La Fig. 7 ilustra celulas de BM humanas adherentes aisladas despues de 72 horas (ABMC) de diferenciacion neural. (A) Imagen de campo brillante de hABMC antes de la induccion. (B) hABMC transfectadas con GFP. (C) Expresion de Nestina en hABMC. (D) Induccion neuronal de hABMC despues de 4 dfas mostrando morfologfa neuronal. (E) La misma neurona en D expresa NF70. (F) La misma neurona en D expresa TuJ1. (G) Morfologfa similar a los

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astrocitos y expresion de PDGFR (recuadro) despues de la induccion neural. (H) La expresion de TuJ1 en hABMC inducida (el recuadro superior muestra una mayor ampliacion), mientras que la inerte inferior muestra celulas positivas para TuJ1 con dendritas largas. (I) Porcentaje de Nestina, PDGFR y celulas TuJ1 en hABMC en el paso 0 (P0) en comparacion con las celulas del mismo paciente despues del paso 6. Barras de escala en A, 20 mm, en D y G, 10 mm.

La Fig. 8 ilustra la tincion por inmunofluorescencia de secciones del tracto corticoespinal a las 16 semanas en trasplante de control y de ABMC. (A-D) Secciones de tractos corticoespinales de los perros de control. (E-H) Seccion de tractos corticoespinales de perros tratados con ABMC autologa. (A) Seccion de campo brillante de los tractos corticoespinal laterales. (B) Imagenes fluorescentes del marcador nuclear DAPI (azul), gFp (verde) y del marcador neuronal NF70 (rojo). No se detecto expresion de GFP, aunque se detecto expresion leve de NF-70. (C) Campo brillante de los tractos corticoespinales ventrales. (D) Imagenes fluorescentes de tractos corticoespinales ventrales en C tenidos con DAPI, GFP y NF-70. (E) Tracto corticoespinal lateral de un perro de control. (F) Seccion fluorescentes de los tractos corticoespinal laterales mostrando GFP colocalizada y NF-70. (G) Superposicion de imagenes fluorescentes en F en el campo brillante en E. (H) Aumento mas alto del cuadrado en G mostrando axones remielinizados positivos para GFP con expresion de NF70 colocalizada (amarillo). Barras de escala 100 pm.

La Fig. 9 ilustra celulas derivadas de BM positivas para GFP y PDGFR que rodeaban el canal central y estaban asociadas con pequenos vasos dentro de la medula espinal. (A) Imagenes fluorescentes del marcador nuclear DAPI (azul), GFP (verde) como marcador para ABMC canino trasplantado, y marcador del PDGFR (rojo). Los nucleos DAPI alinean el canal central en la parte inferior izquierda de la imagen. (B) Superposicion de las imagenes fluorescentes en el campo brillante que muestran axones positivos para GFP y pequenos vasos de la medula espinal. Barras graduadas, 50 pm.

La Fig. 10 ilustra la obtencion de imagenes por microscopfa electronica de secciones de SCI en perros de control que demuestran una marcada formacion de vacuolas y un reemplazo axonal mfnimo que reconstituyo menos del 1% de las secciones. (A) marcada formacion de vacuolas y un unico axon reemplazado en campo de baja potencia de perro de control de SCI. (B) Axon reemplazado con mielinizacion normal. (C) Celula formadora de mielina con cicatrizacion glial. (D) Excesiva formacion de vacuolas y cicatrizacion alrededor de la celula formadora de mielina sin evidencia de remielinizacion. (E) Imagen de alta potencia de D. Barras de escala, 1 pm.

La Fig. 11 ilustra la formacion de imagenes con microscopio electronico de secciones de perros de SCI tratados con ABMC que demuestran una regeneracion axonal extensa. (A) Los axones regenerados eran de menor diametro, y axones multiples se asociaron con celulas multinucleadas formadoras de mielina lo que sugiere mielinizacion lateral. La limitada formacion de vacuolas y un unico axon reemplazado en campo de baja potencia de perro de control de SCI. (B) Axones remielinizados con borde grueso. (C) Multiples axones pequenos que rodean un axon remielinizado mayor. (D) Celulas formadoras de mielina que se acoplan con axones multiples. (E) Celula formadora de mielina con nucleos de multiple lobulos. (F) Celula formadora de mielina grande con multiples nucleos y una membrana basal circundante. Barras de escala, 1 pm.

La Fig. 12 ilustra el analisis FISH de secciones de SCI tratadas con MSC en perros que demuestran celulas diploides normales (flecha) marcadas con sonda de cromosoma canino 35 sin evidencia de fusion. (A) nucleo tenido con DAPI que mostraba un cromosoma 35 diploide tenido con una sonda marcada con rojo (Flechas). (B) Aumento mayor del nucleo diploide tenido con sonda roja de cromosoma 35 y en una celula positiva para GFP.

La Fig. 13 ilustra las respuestas potenciales evocadas motoras registradas en el musculo tibial posterior en un paciente tratado con ABMC y un paciente de control (registros representativos de un paciente de cada grupo). (A) Registros del paciente de control con actividad plana. (B) Paciente tratado con ABMC con registros realizados un ano despues de la terapia. La recuperacion fue evidente en el paciente tratado con ABMC mediante respuesta evocada electricamente con una latencia de 20-30 ms registrada para el musculo tibial posterior.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se refiere a composiciones que comprenden celulas madre adherentes de medula osea suspendidas en un lfquido farmaceuticamente aceptable para uso en el tratamiento de una lesion degenerativa o traumatica de un tejido nervioso o del cerebro, en donde dichas celulas se pueden obtener mediante: a) cultivo de una muestra biologica que comprende celulas madre de medula osea adulta sobre un sustrato recubierto con poli-L- lisina durante 2 a 72 horas, de manera que una capa de celulas madre de medula osea se adhiere a dicho sustrato sin expandir las celulas en cultivo; b) lavado de las celulas no adherentes de dicho sustrato y recoleccion de las celulas madre adherentes de la medula osea; y c) suspender las celulas madre adherentes de medula osea en un lfquido farmaceuticamente aceptable; y en donde dicho tratamiento comprende: administrar dicha composicion en o cerca del sitio de la lesion en una cantidad eficaz para provocar regeneracion axonal o remielinizacion en el sitio de dicha lesion. Como se proporciona en la presente memoria, la presente invencion se basa en el descubrimiento de que las celulas adherentes de medula osea (ABMC) se diferencian en o inducen la produccion de tipos de celulas progenitoras neurales, celulas formadoras de mielina, astrocitos, oligodendrocitos, neuronas maduras, axones

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mielinizados y similares. Mas especfficamente, se descubrio sorprendentemente que cuando se introducen ABMC aisladas en un mamffero que sufre de una lesion nerviosa, por ejemplo de SCI, el efecto neto es remielinizacion y regeneracion axonal del tejido neural danado en el sitio de la lesion. Esto se observo para conducir adicionalmente a una mejor coordinacion motora y/o una reduccion de la condicion neurodegenerativa objetivo, particularmente cuando se combina con terapia ffsica.

Las poblaciones de celulas de medula osea de la presente invencion se pueden obtener usando cualquier procedimiento conocido en la tecnica. En una realizacion, la poblacion de celulas de medula osea puede ser aspirada mediante la remocion de fluido y celulas de la medula osea a traves de una aguja insertada en el hueso. La aspiracion de medula osea puede realizarse en la cresta ilfaca, pero no se limita a este sitio y puede realizarse en cualquier otro sitio del cuerpo donde se sabe que se puede aspirar o bien obtener celulas de medula osea. En ciertas realizaciones, las celulas de medula osea se obtienen de forma autologa del paciente afectado. Sin embargo, la presente invencion no esta limitada y la poblacion de celulas de medula osea tambien puede obtenerse a partir de cualquier otra fuente conocida en la tecnica, tal como, pero sin limitarse a, un banco de medula osea (o fuentes similares o medula osea derivada de una persona no familiar del paciente), medula osea de un familiar o medula de cualquier otra fuente animal no fetal, sangre de cordon umbilical, tejido adiposo, fluidos biologicos, o cualquier otra fuente conocida en la tecnica, que sea inmunologicamente compatible con el paciente.

Independientemente de su fuente, las celulas de medula osea se afslan del aspirado usando procedimientos estandar conocidos en la tecnica. En una realizacion no limitante, el aspirado de medula osea se diluye con una formulacion reguladora, por ejemplo RPMI-1640, y se centrifuga en presencia de un medio de separacion celular, tal como Ficoll- Plaque PlusMR (Amersham Biosciences). El sobrenadante se elimina y las celulas sedimentadas se resuspenden y se mantienen utilizando medio estandar para el mantenimiento de celulas pluripotentes. En un ejemplo no limitante, dicho medio puede incluir DMEM que contiene cantidades bajas de glucosa y suplementado con FBS, L-glutamina, al menos un antibiotico de amplio espectro y CO2. Pueden utilizarse tambien otros tipos de medio, como se conoce en la tecnica.

A partir de esta poblacion de celulas de medula osea, a continuacion se afsla una subpoblacion de ABMC. Las ABMC se afslan cultivando las celulas sobre un sustrato recubierto con poli-L-lisina sin expandir las celulas en cultivo. Con este fin, las celulas pueden suspenderse en una placa, frasco, bolsa u otro material similar recubierto con poli-L-lisina conocido en la tecnica para cultivar celulas pluripotentes. En una realizacion no limitante, las celulas se suspenden con una densidad de aproximadamente 2,0 x 105 celulas/cm2. El sustrato de recubrimiento puede contener ademas cualquier medio estandar para la supervivencia de las celulas de medula osea que se conozca en la tecnica, por ejemplo a-MEM que contiene L-glutamina, uno o mas antibioticos de amplio espectro y FBS, o similares.

La poblacion de celulas de medula osea se incuba en el sustrato recubierto con poli-L-lisina durante 2 a 72 horas para distinguir las celulas de medula osea adherentes de las celulas de medula osea no adherentes.

Despues de la incubacion, las celulas no adherentes se eliminan lavando el sustrato recubierto usando una o multiples etapas de lavado. Cualquier agente de lavado conocido en la tecnica puede ser utilizado para las etapas de lavado y puede incluir, pero no se limita a, solucion salina, PBS, FBS, dh^O, medio o agentes de lavado similares que son conocidos en la tecnica. En ciertas realizaciones, las celulas se lavan tres veces para retirar las celulas no adherentes.

Despues del lavado, las celulas adherentes se separan del sustrato de poli-L-lisina usando procedimientos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, en una realizacion, se separan las ABMC aisladas del sustrato recubierto de poli-L-lisina incubando el sustrato en presencia de Accutase. En ciertas realizaciones, las celulas se elevan por incubacion con Accutase a 37°C durante 5 min. Sin embargo, la presente invencion no esta limitada de este modo y tambien se contemplan procedimientos similares de elevacion de celulas adherentes o procedimientos conocidos en la tecnica.

Las celulas dentro de la subpoblacion aislada de las ABMC son positivas para uno o mas grupos de marcadores de superficie de celulas de diferenciacion (CD) que son indicativas del potencial de diferenciacion de linajes multiples, en particular la diferenciacion neural. Dichos marcadores pueden constar de, pero no estan limitados a, uno o mas de los siguientes CD44, CD73, CD90, CD105, CD166 y CD271. En ciertas realizaciones, las AMBC de la presente invencion no pueden exhibir expresion de CD14, CD34, CD38 y CD45. La presencia o ausencia de estos marcadores de superficie de celulas CD puede identificarse usando uno o mas procedimientos conocidos en la tecnica. En una realizacion, tal procedimiento incluye citometrfa de flujo despues de la incubacion durante 2 - 72 horas. Tambien se pueden emplear inmunoensayos generales conocidos en la tecnica para la identificacion de marcadores de superficie celular y son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Con este fin, tanto los anticuerpos policlonales como monoclonales pueden usarse en los ensayos. Cuando sea apropiado, pueden usarse otros inmunoensayos, tales como ensayos por inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA) y radioinmunoensayos (RIA), como son conocidos por los expertos en la tecnica. Los inmunoensayos disponibles se divulgan ampliamente en la literatura cientffica y de patentes. Vease, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nos. 3.791.932;

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3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521, asf como Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor, N.Y (1989).

Antes de la administracion, se prefiere que las ABMC se manipulen mfnimamente desde la forma originalmente aislada en que se minimiza o se evita completamente su exposicion a las condiciones ambientales y/o al medio que provocan la diferenciacion.

Las ABMC de la presente invencion se pueden administrar al paciente en o aproximadamente en el sitio de la lesion /dano. El modo de administracion de las celulas puede variar dependiendo de diversos factores incluyendo el tipo de lesion/enfermedad que se esta tratando, la edad del mamffero, si las celulas se diferencian, si las celulas tienen ADN heterologo introducido en el mismo y similares. En la presente memoria se proporciona un ejemplo de administracion de las celulas en el tejido espinal en la seccion de Ejemplos experimentales. En ese ejemplo, las celulas se introducen en el lfquido cefalorraqufdeo del mamffero en forma intratecal cerca del sitio de una lesion de la medula espinal. Con este fin, se pueden introducir las celulas en el sitio deseado mediante inyeccion directa, tal como una inyeccion intratecal, mediante puncion lumbar en el lfquido cefalorraqufdeo del paciente en o cerca del sitio de la lesion.

Sin embargo, la presente invencion no se limita necesariamente a inyeccion intratecal o a una metodologfa de este tipo. En realizaciones alternativas, donde la lesion del nervio es en un nervio periferico, tal como la lesion en el nervio mediano asociado con el sfndrome del tunel carpiano, las celulas pueden ser administradas por sonograffa guiada local aplicada a la rafz del nervio periferico. Las celulas tambien pueden administrarse a un sitio proximo o dentro de la misma region corporal de la lesion y se permite que se infundan en el sitio de la lesion usando uno o mas procedimientos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, con respecto a la administracion a un sitio en el cerebro, las celulas se pueden administrar por via intratecal, o bien usando uno o mas de los procedimientos de la presente invencion, y se les permite infundirse en el tejido danado del cerebro.

Cuando sea necesario, las celulas pueden estar equipadas con uno o mas grupos anexados, por ejemplo peptidos u otros agentes biologicos, facilitando el transporte a traves de la barrera hematoencefalica. De nuevo, los procedimientos anteriores no son limitativos de la invencion y las celulas pueden administrarse en un huesped por cualquier procedimiento siempre y cuando se puedan infundir las celulas de manera segura y ciertamente, tal como, pero sin limitarse a, en forma intravascular, en forma intracerebral, en forma parenteral, en forma intraperitoneal, en forma intravenosa, en forma epidural, intraespinal, en forma intraesternal, intraarticular, intrasinovial, intracerebral, intraarterial, intracardiaca o intramuscular. El trasplante de las celulas de la presente invencion utilizando cualquiera de los modos anteriores, u otros modos similares conocidos en la tecnica, tambien se pueden lograr usando tecnicas proporcionadas en la presente memoria o conocidas en la tecnica.

Las ABMC se usan generalmente para el trasplante como una composicion en forma de suspension en solucion salina fisiologica, agua destilada, fluido espinal o similar. En una realizacion, por ejemplo, la composicion esta formada por las ABMC suspendidas en aproximadamente 150 pl de solucion salina. De nuevo, la presente invencion no esta necesariamente limitada a esta composicion y las ABMC tambien pueden formularse en una composicion adecuada para administracion como una suspension en un regulador apropiado tal como PBS o bien dentro de un lfquido farmaceuticamente aceptable. Las ABMC tambien pueden ser crioconservadas en solucion salina fisiologica, y reconstituidas por suspension en un disolvente anterior antes de su uso. El procedimiento de aislamiento y conservacion de las ABMC y la preparacion de una composicion son conocidos por un experto en la tecnica en relacion con el trasplante de celulas. Tal composicion de las ABMC es util cuando es diffcil obtener las ABMC en forma autologa del paciente.

Como se indica en la presente memoria, se administra una cantidad terapeuticamente eficaz de celulas al paciente para tratar el nervio traumatico o degenerativo o la lesion cerebral. En una realizacion, una cantidad terapeuticamente eficaz se refiere a la cantidad de celulas necesaria para provocar remielinizacion y/o regeneracion axonal del tejido neural danado en un sitio de lesion o bien reparar el nervio danado o el tejido cerebral. Esto, a su vez, puede facilitar una mejor coordinacion motora y/o una reduccion de la afeccion neurodegenerativa objetivo. En una realizacion no limitante, entre aproximadamente 104 a 107 de las AMBC/kg del sujeto se administran al paciente como una cantidad terapeuticamente eficaz. En una realizacion adicional, y como se ejemplifica en los Ejemplos a continuacion, una dosificacion terapeuticamente efectiva puede ser de aproximadamente 2 X 106 ABMC/kg del sujeto.

La composicion que contiene ABMC de la presente invencion se puede administrar a un paciente con una lesion nerviosa o cerebral tan pronto como sea posible despues de la lesion. Sin embargo, tal como se ilustra en los Ejemplos siguientes, un experto en la tecnica comprendera que la temporizacion del tratamiento o similar la determina generalmente un medico y no limita necesariamente a la presente invencion. Con este fin, un paciente puede ser tratado en una etapa posterior dependiendo de sus condiciones y de otros factores.

Se puede proporcionar una dosificacion terapeuticamente eficaz al paciente como administracion unica o multiples

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administraciones. En este ultimo caso, la cantidad terapeuticamente eficaz puede dividirse entre multiples administraciones, tales como entre 2 y 8 administraciones separadas. Dicha administracion puede ocurrir sucesivamente durante un perfodo de varios dfas o como administraciones discretas recibidas diariamente, semanalmente, mensualmente, etc. De nuevo, un experto en la tecnica entendera que el momento del tratamiento y/o el numero de administraciones pueden ser determinados generalmente por un medico y no es necesariamente limitante para la presente invencion.

La composicion de las ABMC tambien puede contener cualquier aditivo farmaceuticamente aceptable siempre y cuando no afecte adversamente la accion o diferenciacion de las ABMC. Por ejemplo, cuando un paciente es tratado con las ABMC recolectadas de una fuente exogena, se pueden administrar preliminarmente uno o mas inmunosupresores conocidos. Los inmunosupresores se pueden seleccionar de los que se usan generalmente en el trasplante de medula o de organos, tales como, pero sin limitarse a, ciclosporina, hidrato de tacrolimus (FK506), ciclofosfamida, azatioprina, mizoribina y metotrexato. La dosis de inmunosupresor puede determinarse apropiadamente considerando los tipos de farmaco, el origen de las ABMC que se van a administrar, la tolerancia del paciente y similares.

La presente invencion es ventajosa por contribuir a la regeneracion axonal y remielinizacion en un sitio de lesion de la medula espinal, o reparacion de otros sitios nerviosos o cerebrales danados (por ejemplo, dano nervioso periferico, dano cerebral, etc.). Con respecto a los pacientes que sufren de una lesion de la medula espinal, es decir, paralisis motora o perdida sensorial, el trasplante de ABMC, particularmente cuando se combina con el entrenamiento funcional por fisioterapia, son promotores eficaces de la regeneracion axonal y remielinizacion e induce reparacion despues de SCI. Como se ejemplifica a continuacion, las ABMC incluyen o dan como resultado la produccion de una o mas celulas formadoras de mielina, celulas precursoras de astrocitos, astrocitos, celulas progenitoras neuronales, celulas precursoras de oligodendrocitos, celulas oligodendrocfticas, axones mielinizados, neuronas maduras y similares. Con este fin, se descubrio que las celulas recien formadas eran positivas para uno o mas marcadores asociados con estos tipos de celulas tales como, pero sin limitarse a, NF70, Nestina, PDGFR, GFAP o TuJ1. Tambien se observo la regeneracion de las fibras del tracto corticoespinal y fue acompanada de una mejorfa funcional.

Sin pretender estar limitado por la teorfa, se supone que la regeneracion axonal probablemente desempena un papel principal, ya sea directamente o a traves del reclutamiento de celulas progenitoras neurales de la cresta neural del cerebro que maduran en celulas de Schwann o celulas madre de tejido de la medula espinal en la region ependimal alrededor del canal central. En las ejemplificaciones a continuacion, esta region fue donde se encontro el mayor numero de celulas derivadas de ABMC, junto con marcadores colocalizados del progenitor residentes en la medula espinal. La ABMC tambien produce factores neurotroficos y mediadores antiinflamatorios que soportan el tejido de la medula espinal huesped creando nuevas vfas neuronales en los tejidos fibrosos de la cicatriz o expandiendo el brote o generando fibras neuronales regeneradas cortas. Ademas, la ABMC puede proporcionar una gufa para la conexion a los extremos distal y proximal del tejido nervioso, y facilitar la regeneracion de las celulas trasplantadas.

La lesion de la medula espinal y de un nervio periferico y la lesion cerebral no se limitan necesariamente a lesiones ffsicas y pueden tambien estar asociadas con un estado de enfermedad. Por consiguiente, tambien se puede contemplar el uso de las ABMC para su uso en el tratamiento de estados patologicos neurodegenerativos. Por ejemplo, entre los recien nacidos y los ninos, las celulas pueden usarse para el tratamiento de una serie de enfermedades geneticas, incluyendo, pero no limitandose a, la enfermedad de Tay-Sachs y la enfermedad relacionada de Sandhoff, el sfndrome de Hurler y la mucopolisacaridosis y la enfermedad de Krabbe. Con respecto a las enfermedades adultas del SNC, las celulas de la presente invencion son utiles para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis lateral amiotrofica, la enfermedad de Huntington, epilepsia y similares. Otras enfermedades neurodegenerativas incluyen, pero no se limitan a, complejo de demencia por SIDA; enfermedades desmielinizantes, tales como esclerosis multiple y mielitis transferasa aguda; trastornos extrapiramidales y cerebelosos, tales como lesiones del sistema corticoespinal; trastornos de los ganglios basales o trastornos cerebelosos; trastornos del movimiento hipercinetico, tales como corea de Huntington y corea senil; trastornos del movimiento hipocinetico; paralisis supranuclear progresiva; lesiones estructurales del cerebelo; degeneraciones espinocerebelares, tales como ataxia espinal, ataxia de Friedreich, degeneraciones corticales cerebelares, degeneraciones de sistemas multiples (Mencel, Dejerine Thomas, Shi- Drager y Machado-Joseph), trastornos sistemicos, tales como la enfermedad de Rufsum, abetalipoprotemia, ataxia, telangiectasia; y trastorno multisistemico mitocondrial; y trastornos de la unidad motora, tales como atrofias musculares neurogenicas; Sfndrome de Down en la edad media; enfermedad difusa por cuerpos de Lewy; demencia senil del tipo de cuerpos de Lewy; sfndrome de Wemicke-Korsakoff; enfermedad de Creutzfeldt-Jakob; panencefalitis esclerosante subaguda; enfermedad de Hallerborden-Spatz; y demencia pugilfstica. Vease, por ejemplo, Berkow y colaboradores, (eds.) (1987), The Merck Manual, (15a edicion), Merck and Co., Rahway, N.J..

Los siguientes ejemplos no limitativos expuestos a continuacion ilustran ciertos aspectos de la invencion.

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Ejemplos

Materiales y Procedimientos: Aislamiento y cultivo de celulas de BM adherentes caninas (cABMC)

Todos los aspectos del cuidado y tratamiento de los animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del NIH y las directrices del comite de cuidado de los animales. Las ABMC se aislaron de los femures de perros adultos. En resumen, se aislaron las celulas mononucleares de baja densidad utilizando Ficoll-Plaque Plus (Amersham Biosciences), y se mantuvieron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), bajo en glucosa suplementado con suero fetal bovino al 10% (FBS), con 2 mg/mL de L -glutamina (Gibco) y penicilina-estreptomicina al 0,3% (Gibco) a 37°C y concentracion de CO2 al 5%. Se sometieron las ABMC a citometrfa de flujo para determinar la pureza como lo describe Pittenger, M.F. Mutlilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells. Science 284, 143-7 (1999). La marcacion con GFP in vitro se realizo mediante la adicion del plasmido pCMV-AcGFP mezclado con Lipofectamina en proporcion de 2:1 para cada placa y se incubo a 37°C durante 6 h antes del trasplante.

Aislamiento y cultivo de ABMC humanas (hABMC)

Se aislaron ABMC humanas usando aspirados de medula osea de la cresta ilfaca de pacientes con SCI. Las muestras se obtuvieron despues de firmar un consentimiento informado. Las celulas se diluyeron 1:1 con RPMI- 1640 y se colocaron en capas sobre 15 mL de Ficoll-Plaque Plus en tubos de 50 mL y se centrifugaron durante 30 min a 800 g a temperatura ambiente. La interfase celular se diluyo hasta aproximadamente 15 mL con medio y se centrifugo durante 10 min a 400 g. Despues de descartar el sobrenadante, el sedimento se resuspendio en 1 mL de medio. Se contaron las celulas nucleadas, se suspendieron a una densidad de 2 x 105 celulas/cm2 sobre placas recubiertas con poli-L lisina en medio estandar que contema a-MEM suplementado con 2 mg/mL de L-glutamina, de antibiotico Antimicotico 1% y FBS al 10% (v/v) precribado seleccionado inactivado sin calor.

Las celulas se incubaron durante 3 dfas, y se retiraron las celulas no adherentes reemplazando el medio con tres etapas de lavado. Se aumentaron las celulas mediante incubacion con Accutase a 37°C durante 5 min. Para la expansion para generar las MSC para comparacion, e induccion neural, se prepararon ABMC como se describio anteriormente. Las celulas expandidas se dejaron crecer durante 12-16 dfas antes de que fueran pasadas y sembradas nuevamente en placa en una proporcion de 1:4. La diferenciacion osteogenica, adipogenica y condrogenica se realizo como se describe en Pittenger, M.F. y colaboradores. Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells. Science 284, 143-7 (1999). Las ABMC fueron analizadas mediante citometrfa de flujo despues de tincion con CD45-PC7, CD44-FITC, CD34-PE, CD73-PE, CD105-PE, CD106-PE, CD166-PE y CD271- PE (todos de BD Biosciences).

Induccion neuronal

La diferenciacion neuronal se realizo como se describe en Arnhold, S. y colaboradores. Human Bone Marrow Sroma Cells Display Certain Neural Characteristic and Integrate in the Subventricular Compartment After Injection into the Liquor System. Eur. J. Cell. Biol. 85, 551-65 (2006), con modificacion. La induccion de neuroesfera se realizo mediante cultivo en DMEM libre de suero suplementado con medio B27 al 2% (v/v) (Invitrogen) y los factores de crecimiento EGF (20 ng/mL, R&D Systems), pFGF (20 ng/mL) y heparina (5 mg/mL). La induccion neural se realizo utilizando celulas individuales preparadas por Accutase y se sembraron en placa con una densidad de 2000 celulas/ cm2 en DMEM/F12 libre de suero, con DMSO al 2% y forskolina 1 mM. Las celulas se mantuvieron bajo estas condiciones durante cuatro dfas y luego se analizaron mediante microscopfa de inmunofluorescencia.

Modelo canino de lesion grave de la medula espinal

Se utilizaron dieciseis perros mestizos adultos sanos que pesaban 3,77 ± 0,59 Kg para el estudio experimental con lesiones de medula espinal. Todos los aspectos del cuidado y tratamiento de los animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del comite de cuidado de animales de la Universidad de El Cairo. Los perros anestesiados (pentobarbital sodico, 40 mg/kg) recibieron una lesion grave de la medula espinal (SCI) a nivel de L4 como se describe en el modelo de gato de Young, W. y colaboradores. Effect of High-dose Corticosteroid Therapy on Blood Flow, Evoked Potentials, and Extracellular Calcium in Experimental Spinal Injury. J. Neurosurg. 57, 667-73 (1982), con modificaciones. Brevemente, despues de la laminectomfa L4, se abrio la duramadre y se corto la medula espinal. Los extremos cortados de la medula se retrajeron tfpicamente aproximadamente 3 mm y se inspeccionaron bajo un microscopio quirurgico para asegurar la transeccion completa. El cuidado postoperatorio incluyo que los perros se mantuvieran calientes, y se les administro evacuacion manual de la vejiga dos veces al dfa y antibioticos profilacticos. Los perros no tuvieron dificultad en la alimentacion.

Los perros fueron asignados, en forma imparcial, a cuatro grupos de acuerdo con el tratamiento despues de la SCI. El trasplante de las ABMC caninas se realizo una semana despues de la SCI. Los perros fueron anestesiados usando los mismos procedimientos descritos anteriormente. El grupo de control no recibio ningun trasplante celular

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despues de la lesion. En los tres grupos que recibieron ABMC no manipuladas o ABMC inducidas para diferenciacion neural durante 24 horas, o durante 72 horas, se inyectaron las celulas suspendidas en 150 pL de solucion salina en el CSF por puncion lumbar. La evaluacion del comportamiento de la recuperacion funcional de la extremidad posterior se realizo mediante grabacion de video. Cada perro fue grabado en video desde los costados y el lomo durante un mfnimo de 10 pasos. Usando un sistema 25 de puntuacion de 15 puntos, se le dio puntaje al modo de andar de cada perro a partir de las cintas de video por parte de investigadores en forma ciega con respecto al tipo de tratamiento, y se registraron las puntuaciones medias al inicio, un dfa despues de la CSI y a las 4, 8, 12 y 16 semanas despues de la SCI.

Inmunotincion

Las celulas se fijaron en paraformaldehido al 4% y se almacenaron en PBS a 4°C hasta que se tineron. Para evaluar los cambios histopatologicos, todos los perros fueron sacrificados a las 16 semanas despues de la terapia celular. Los perros fueron perfundidos con PBS y paraformaldehido al 4%, y las medulas espinales de T10 a L5 se fijaron en formalina neutra tamponada al 10%, sumergidas en una solucion descalcificante. Las secciones se embebieron en parafina y se cortaron secciones axiales de 4 pm de espesor y se tineron con hematoxilina y eosina (H&E), o Luxol fast blue para identificar mielina, o se usaron para analisis de fluorescencia. Las zonas mielinizadas y los volumenes de las cavidades del epicentro de la medula espinal danada se calcularon a partir de imagenes de las secciones transversales utilizando el software de analisis de imagenes AxioVision (Zeiss). La seccion se identifico con la mayor area de cavitacion, y esta area se midio para cada perro, y se expreso como la media ± SEM del control de los perros tratados con la terapia celular. Para la inmunofluorescencia, las secciones se procesaron las secciones sin parafina a traves de la recuperacion del antfgeno durante 2 min, y luego se tineron con anticuerpos especfficos apropiados para la reactividad cruzada canina.

Los anticuerpos primarios fueron anti-GFP monoclonal, Clontech (1:100); anti-GFAP policlonal, Dako (1:500); Tubulina anti-p-III monoclonal, Chemicon (1:200); anti-PDGFRa policlonal, Chemicon (1:80); anti-GAD6 monoclonal, Abcam (1:500); anti-Nestina policlonal, LifeSpan (1:100); anti-acetilcolinesterasa monoclonal AE-1, Millipore (1:50); anti-neurofilamento monoclonal de 70 kDa, Millipore (1:50); anti-A2B5 monoclonal, Millipore (1:100); y anti-GRM1 monoclonal, BD (1:100). Se utilizaron un kit de peroxidasa ABC y diaminobencidina reforzada con CoCl2 (DAB) como cromogeno para tincion de la protefna basica mielina. Para microscopfa fluorescente, se emplearon anticuerpos secundarios marcados con colorantes Alexa Fluor 488, 535 y 610 (Invitrogen). El area objetivo escogida para calcular los valores de GFP, nestina, PDGFR, TuJ1 y NF70 usando 100 cuadrados con un area superficial de 0,01 mm2, cada uno utilizado para el conteo. Los valores se presentan como la media ± SEM. Un patologo que no conocfa el tipo de terapia, realizo todos los examenes histologicos.

Trasplante en humanos

Se evaluaron pacientes elegibles para SCI, y se seleccionaron 159 pacientes para el cribado inicial. Se incluyeron 80 pacientes que cumplieron con los criterios de inclusion (50 SCI toracicas y 30 SCI cervicales) y se asignaron al azar a los dos grupos de control y terapia celular y ambos grupos recibieron terapia ffsica estandar programada en el centro independiente de fuerzas militares para medicina ffsica, rehabilitacion y reumatologfa. Despues de la admision formal al ensayo y de la firma de un consentimiento informado detallado, todos los participates en el grupo de trasplante fueron sometidos a aspiracion de medula osea bajo anestesia local para producir ABMC. Los aspirados se tomaron de la region ilfaca y se colocaron inmediatamente en un recipiente esteril en medio de cultivo frfo y todo el procesamiento subsiguiente se realizo como se describio anteriormente en condiciones clfnicas asepticas completas en el centro de celulas madre del hospital de la Universidad de El Cairo. Los pacientes recibieron una dosis celular acumulativa de 2 x 106 celulas/kg, el numero de celulas ABMC y la viabilidad se evaluaron despues de 72 horas de adherencia, y el procedimiento se repitio mensualmente hasta que se alcanzo esta dosis objetivo (la media fue de 4 inyecciones, el intervalo fue de 1-8 inyecciones).

Datos y analisis estadfstico

Todos los datos se expresaron como la media ± SEM. Los datos continuos se compararon mediante ANOVA de un factor seguido por la diferencia minima significativa protegida de Fisher (PLSD) entre todos los grupos. Para el analisis cuantitativo de las celulas GFP trasplantadas en la medula espinal, se cortaron quince secciones transversales de cada medula espinal de perro con un espesor de 4 pm, separadas por 150 pm. Se contaron todas las celulas en cada seccion con un promedio de 6 pm de diametro. Se examinaron tres secciones de medula espinal por anticuerpo para las celulas doblemente positivas, y se contaron cuatro regiones por seccion. Las areas de cavitacion se compararon entre los grupos de control y de terapia celular usando la prueba t de Student. Para las pruebas funcionales, las diferencias en las puntuaciones locomotoras entre los perros trasplantados y los controles se analizaron en cada punto de tiempo utilizando mediciones repetidas ANOVA. La significancia estadfstica se determino en los niveles de P <0,05.

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Ejemplo 1 - Diferenciacion in vitro de ABMC

Se aislaron seis muestras de BM canina y se cultivaron durante 72 horas sobre poli-L lisina bajo un protocolo aprobado. Se encontro que las ABMC caninas separadas a las 72 horas expresaban CD44, CD73, CD105, CD166, CD271, pero no tenfan expresion o era despreciable para CD34, CD38 y CD45. Las ABMC caninas tenfan una morfologfa oblonga plana (Fig. 5A) con un numero limitado de celulas tipo fibroblastos que predominaron en el cultivo tradicional de MSC expandidas. Las ABMC caninas (Figura 5A) se transfectaron con plasmido que expresa GFP con una eficiencia de cerca del 90% (Figura 5B). Estas celulas conservaban su potencial pluripotencial y podfan ser inmediatamente y potentemente inducidas a adipocitos, osteocitos y condrocitos (Fig. 5E-G). El cultivo de estas celulas en el medio de induccion neuronal, similar a las celulas humanas, dio lugar a la formacion de neuroesferas, y los cambios morfologicos con mayor expresion de Nestina asociada con fenotipos neuronales (Fig. 5C, G-I).

A continuacion se evaluo el potencial de diferenciacion de linajes multiples de ABMC a partir de 10 muestras de BM humanas cultivadas en matraces recubiertos con poli-L lisina durante 72 horas. Los analisis de citometrfa de flujo a las 72 horas revelaron que las ABMC humanas son > 90% positivas para CD90, CD105, CD166, CD271, pero no tenfan expresion de CD34, CD45 y CD14. En comparacion con la induccion tradicional en 2-3 semanas, las ABMC humanas pudieron ser inducidas en forma potente para diferenciacion del triple linaje mesodermico en adipocitos, osteocitos y condrocitos (Fig. 6A-C) en una semana. La induccion neuronal 18 resulto en cambios morfologicos consistentes con la diferenciacion neural (Fig. 6D-F), con morfologfa oligodendroglial tfpica en celulas que elaboran multiples dendritas primarias (Fig. 6F), y con mayor potencia en comparacion con celulas cultivadas expandidas del mismo paciente (Fig. 7I).

Las cantidades de neuroesferas generadas a partir de ABMC (n = 12 realizadas en placas de 6 pozos por triplicado) fueron ligeramente superiores pero no significativamente diferentes de aquellas neuroesferas generadas a partir de las mismas MSC de los pacientes que se expandieron en cultivo durante 6-8 semanas. Sin embargo, en comparacion con MSC expandidas en cultivo, las ABMC pudieron ser inducidas en forma mas potente para los tejidos precursores neurales residentes en la medula espinal como se demostro mediante inmunoreactividad sobrerregulada para la Nestina marcadora precursora de astrocitos (Figura 7C), el marcador precursor de oligodendrocitos, el receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR-a) (Fig. 7G), y el marcador precursor neuronal, epftopo J1 de p-tubulina tipo III (TuJ1) (Figura 7H).

Los analisis cuantitativos de celulas inmunorreactivas del mismo paciente (n = 6 se hizo en placas de 6 pozos por triplicado) que fueron o bien inducidas para diferenciacion neuronal inmediatamente o despues de la expansion del cultivo, no revelaron una diferencia significativa en la expresion de Nestina, mientras que tanto PDGFRa como TuJ1 fueron significativamente mayores en ABMC que en las MSC expandidas en cultivo (Fig. 7I). Por lo tanto, estos estudios in vitro, aunque se realizaron en condiciones que no reflejan el comportamiento in vivo de las celulas trasplantadas, demuestran una ventaja para el uso de ABMC en comparacion con MSC expandidas en cultivo.

Ejemplo 2 - Diferenciacion in vivo de ABMC en modelo canino

Para establecer una estrategia de terapia celular en un modelo preclfnico, se trasplantaron ABMC autologas por via intratecal en un modelo canino de SCI severa. Las contusiones severas en la medula espinal del perro realizadas en 16 perros similares al modelo 24 de SCI severo establecido en gatos, dieron como resultado una perdida sensorial y paralisis del miembro posterior en todos los perros lesionados (n = 16) (Figura 1H). Una semana despues de la lesion, los animales fueron divididos al azar en 4 grupos (n = 4/grupo), con el grupo A sirviendo como controles que no recibieron tratamiento celular. Los perros de los grupos B, C y D tuvieron bM aspirado de la cresta ilfaca y se aislaron las ABMC por adherencia a las placas durante 72 horas. Las celulas se transfectaron con plasmido que expresa GFP preparado como 2 x 106 ABMC/ Kg en 150 pL de solucion salina, y se inyectaron mediante puncion lumbar. Los animales del grupo B recibieron ABMC no manipuladas. Para investigar si la diferenciacion previa in vitro de ABMC para el linaje neural aumento su potencial neural in vivo, los animales de los grupos C y D recibieron ABMC aisladas a las 72 horas de haber sido inducidas para diferenciacion neural ya sea durante las ultimas 24 horas (Grupo C) o para todas las 72 horas (Grupo D).

El rendimiento locomotor y la recuperacion funcional de las extremidades posteriores se evaluaron cada 4 semanas durante 16 semanas despues del trasplante usando un sistema de puntuacion de 15 puntos de video grabacion desarrollado para 25 SCI de canino. La funcion motora de las extremidades posteriores estaba intacta en todos los animales antes de la SCI, y todos tuvieron una puntuacion de 14-15 puntos (Fig. 1H). Despues de la lesion, los perros quedaron paraplejicos sin sensacion de dolor profundo, y los puntajes de las extremidades traseras eran cero. No se midieron diferencias significativas (P = 0,75) entre los tres grupos de perros B, C y D, que recibieron ABMC no manipulada (n = 4) o ABMC inducida para la diferenciacion neuronal ya sea durante 24 horas (n = 4) o 72 horas (n = 4). A diferencia de los 7 perros tratados de control del grupo A, los perros que recibieron trasplante autologo de ABMC (n = 12) alcanzaron casi la recuperacion maxima a las 8 semanas despues del trasplante con recuperacion significativa de su funcion motora a las 16 semanas (Fig. 1H y Tabla 1), y movimientos espontaneos mejorados de las extremidades posteriores (Fig. 1I) detectados en la primera semana, lo que sugiere los primeros

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45

efectos neuroprotectores locales de las ABMC. A las 16 semanas despues del tratamiento, se sacrificaron los perros y se fijaron las medulas espinales, y se analizaron por histologfa e inmunotincion. Las secciones de los perros de control mostraron una formacion severa de vacuolas, en contraste con la cavitacion minima en las secciones tratadas con ABMC (Fig. 1A-C). i La inmunotincion con anticuerpos anti-protema basica mielina (MBP) revelo remielinizacion significativa en perros tratados con ABMC comparado con los controles (Fig. 1D-G). La tincion con MBP en secciones de ABMC alcanzo hasta el 85% de los niveles de MBP en medulas intactas (Fig. 1 D-G), lo que indica remielinizacion sustancial.

Tabla 1. Recuperacion de la actividad locomotora despues de la inyeccion de ABMC posterior a la SCI severa en

perros

Puntaje de campo abierto (media + SEM)

Semana 1 Semana 4 Semana 8 Semana 12 Semana 16

Control (n=4)

1,9 + 0,1 2,2 + 1,2 3,6 + 2,1 3,8 + 0,6 3,5 + 0,8

ABMC (n=4)

1,7 + 0,2 8 + 2,5 11 + 0,9 11 + 1,4 11 + 2,2

ABMC + (24 h) (n=4)

1,8 + 0,3 8,9 + 2,1 10,9 + 0,8 12 + 1,2 11 + 1,9

ABMC + (72 h) (n=4)

1,9 + 0,1 8,7 + 1,8 9,9 + 1,2 12 + 1 12 + 1,8

Para investigar los mecanismos de remielinizacion y si el trasplante de ABMC mejora la regeneracion de axones lesionados, se realizo inmunohistoqmmica multicolor usando GFP como marcador para el ABMC trasplantado en asociacion con los marcadores progenitores neurales residentes en la medula espinal. Se detectaron celulas positivas para GFP dentro de los lfmites de lesion SCI (Figura 2A), pero no en secciones de perros de control (Figura 8A-D). Numerosas celulas positivas para GFP se distribuyeron ampliamente desde el epicentro (figura 2B) y se encontraron en la sustancia gris y blanca de la medula espinal lesionada y se distribuyeron en la zona lfmite de la lesion, alrededor del canal central y en la sustancia gris contralateral (Fig. 2A), indicando que las celulas BM inyectadas por via intratecal migraron rostralmente al sitio de la lesion. Las celulas derivadas de BM positivas para GFP y PDGFR se encontraron alrededor del canal central y asociadas con pequenos vasos dentro de la medula espinal (Fig. 9), que se desarrollaron posiblemente a traves de neovascularizacion. Ademas, al menos el 30% de las celulas positivas para GFP en la materia gris tambien fueron positivas para el neurofilamento de 70 kDa (NF70), un marcador espedfico para las neuronas maduras (Figura 2A).

El fumculo dorsal de la medula espinal consiste en gran parte de axones mielinizados. Se observo tincion intensa de GFP en el fumculo dorsal con varias celulas con grandes lfmites nucleares y citoplasmaticos, indicando mielinizacion periferica. En secciones de animales de control, las micrograffas electronicas demostraron axones desmielinizados, extensa formacion de vacuolas y cicatrizacion glial en un ambiente extracelular libre de astrogliosis (Fig. 10). El analisis cuantitativo de la mielinizacion central versus periferica en micrograffas electronicas de secciones de los perros trasplantados con ABMC demostro que los axones remielinizados son predominantemente de celulas que forman mielina de tipo periferico (Figura 11A-C). En los axones mas pequenos (Fig. 11D-F) se observaron axones mielinizados oligodendrocitos con mielinizacion central y vainas finas de mielina caractensticas en casi un tercio del total de los axones remielinizados.

Se encontro que estos axones remielinizados eran dualmente positivos para GFP y GFAP (Figura 2I), y se asociaron con astrocitos caracterizados por nucleolos multilobulares y grandes procesos intermedios ricos en filamentos que se extendfan hasta multiples axones remielinizados (Fig. 11). Tambien se detectaron astrocitos y celulas formadoras de mielina derivadas de ABMC marcada con GFP en la lesion recuperada de la medula espinal. Ademas, se detectaron significativamente mas axones positivos para GFP que expresan NF70 dentro de las secciones transversales de los tractos corticoespinales ventrales (Fig. 2C-F) en los perros tratados con ABMC, con expresion de GFP marcando claramente axones remielinizados (Fig. 8E-H, e inerte en la Fig. 2F), aunque no se detecto ninguno en los controles (Fig. 8A-D).

La regeneracion de los tractos corticoespinales ventrales y laterales, que controlan los movimientos voluntarios, a partir de ABMC positivas para GFP sugiere una regeneracion axonal mas robusta dentro del sitio de la lesion en los perros trasplantados y revela la potencia de regeneracion neural de ABMC, ya que estos tractos fueron tradicionalmente valorados como aquellos con menor capacidad de regeneracion. Ademas, el predominio de los perfiles doblemente marcados de las celulas positivas para GFP que expresan los marcadores progenitores neurales coinciden con la diferenciacion neural avida en la materia gris y blanca. Las celulas positivas para GFP expresaron marcadores de los tejidos precursores neuronales residentes incluyendo el marcador progenitor neural Nestina en

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50

55

aposiciones sinapticas de alta densidad (Fig. 2G), el marcador precursor de oligodendrocito PDGFR en aposiciones sinapticas de menor densidad (Fig. 2H), y el marcador precursor de astrocitos GFAP en haces nerviosos (Fig. 2I).

La ABMC positiva para GFP contribuyo al destino de la celula neural terminal, como se demostro mediante la deteccion de celulas positivas para GFP que se colocalizaron como se muestra por inmunoreactividad con marcadores neurotransmisores excitadores, inhibidores (GABA) y colinergicos. Las celulas dualmente marcadas con GFP y ya sea el receptor glutamato metabotropico excitador GRM1, la glutamato decarboxilasa inhibidora (GAD) como un marcador para senales GABAergicas y se detectaron las senales de acetilcolinesterasa colinergica (AE-1) (Fig. 2J) en la medula regenerada. Ademas, se observaron celulas positivas para GFP poco frecuentes que se colocalizaron como se muestra por inmunoreactividad con A2B5, un antfgeno gangliosido presente en los precursores gliales comunes O-2A (Figura 2J] que tienen caracterfsticas de celulas madre neurales. Colectivamente, estos datos demuestran la regeneracion neural derivada de ABMC dentro del microambiente de la medula espinal.

Para excluir la posible aparicion de eventos de fusion como un mecanismo para la regeneracion, se analizaron secciones de medulas espinales caninas que fueron sometidas a experimentos de injerto. Las celulas que expresan GFP con coloracion nuclear DAPI se examinaron usando una sonda de hibridacion in situ fluorescente (FISH) del cromosoma 35 canino. Todas las celulas examinadas (n = 500) eran diploides (Fig. 12).

Ejemplo 3 - Diferenciacion in vivo de ABMC en humanos

Los estudios preclfnicos en el modelo canino de SCI severa revelaron que las ABMC autologas trasplantadas en forma intratecal dirigida al sitio de la lesion, y que dio lugar a materia blanca y gris reemplazada, regeneracion neuronal y axonal, neovascularizacion, proliferacion de astrocitos con remielinizacion significativa y mejoramiento funcional en puntajes de locomocion, sin efectos secundarios detectados.

Estos datos nos llevaron a iniciar un ensayo clfnico aleatorio de fase I / II para investigar la seguridad y la eficacia del trasplante intratecal autologo de ABMC en pacientes con SCI de niveles cervical y toracico completos. Los criterios de seleccion (figura 3) incluyeron pacientes que habfan completado al menos 6 meses de fisioterapia despues de una lesion sin recuperacion espontanea. Los pacientes estudiados fueron 9 mujeres y 71 hombres, de 16 a 45 anos de edad. El perfodo transcurrido desde su lesion oscilo entre 12 y 36 meses con ASIA completa, una SCI traumatica, niveles neurologicos entre C3 y T12 sin evidencia de mejorfa neurologica durante al menos 6 meses y ausencia de enfermedades sistemicas concomitantes (Fig. 3). Durante el perfodo de inscripcion, se evaluaron 159 pacientes con SCI cronica completa. Un total de 80 pacientes se inscribieron despues de firmar un consentimiento informado, en virtud de un protocolo aprobado por los comites de revision de ensayos clfnicos de la Universidad de El Cairo y la Universidad Al-Azhar.

Los pacientes fueron asignados al azar a dos grupos equilibrados: 50 pacientes; 40 con SCI toracica y 10 con CSI cervical fueron asignados a trasplante autologo de ABMC en combinacion con fisioterapia estandar, mientras que 30 pacientes correspondientes, 20 con SCI toracica y 10 con SCI cervical fueron asignaron unicamente a fisioterapia estandar, como grupo de control. Los pacientes fueron evaluados antes del tratamiento con terapia celular para establecer las medidas basales. Tanto los pacientes tratados como los pacientes de control paralelo fueron monitoreados, y las mediciones de escala ASIA fueron realizadas por observadores en forma ciega durante el perfodo del ensayo, en el centro independiente de las fuerzas militares para medicina ffsica, rehabilitacion y reumatologfa. Los riesgos asociados con la puncion lumbar y las inyecciones celulares plantearon preocupaciones eticas significativas que limitaron la inclusion de un grupo de control inyectado en forma simulada.

Los pacientes fueron evaluados mediante examenes clfnicos para el desarrollo de dolor neuropatico, quistes, siringomielia o sobrecrecimiento celular. Todos los pacientes trasplantados recibieron luego aspirados de BM, de los cuales se permitio que las celulas BM autologas mfnimamente manipuladas se adhirieran durante 72 horas (ABMC) en condiciones esteriles en la Unidad de Celulas Madre del hospital de la Universidad de El Cairo. Antes del trasplante de ABMC, se verificaron muestras de fenotipo celular, viabilidad y esterilidad. Todos los 50 pacientes tratados con terapia de celulas ABMC autologa por trasplante intratecal mediante puncion lumbar recibieron una dosis acumulativa de celulas objetivo 2x106 celulas/kg, y el procedimiento se repitio mensualmente hasta que se alcanzo esta dosis objetivo (la media fue de 4 inyecciones, el intervalo fue de 1-8 inyecciones). Se examinaron las mediciones de los puntajes ASIA y FIM y SSEP, y se realizo la MRI de la medula espinal en todos los pacientes que consintieron y toleraron la MRI en la lfnea base antes del trasplante y cada seis meses durante 18 meses.

Los datos del ensayo fueron revisados regularmente por el comite de revision del Ministerio de Salud egipcio y por un comite de revision aleman independiente. Los 50 pacientes que recibieron terapia celular experimentaron efectos secundarios leves comunes con las punciones lumbares incluyendo dolor de cabeza (30 pacientes, 60%), dolor lumbar (5 pacientes, 10%), movimientos involuntarios (8 pacientes, 16%) y alteracion de la vision (1 paciente, 2%). Todos los efectos secundarios mencionados fueron temporales y duraron de 12 horas a pocos dfas despues de la puncion lumbar, y se resolvieron completamente mediante tratamiento sintomatico. Durante los 18 meses posteriores al trasplante, no se detectaron efectos secundarios a largo plazo en pacientes tratados con ABMC y ninguno de los pacientes tratados experimento infeccion, perdida de lfquido cefalorraqufdeo, dolor neuropatico

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adicional, deformidad espinal o desarrollo de masas visibles a traves de las imageries de MRI.

Todos los pacientes que recibieron terapia de ABMC autologas ademas de fisioterapia estandar tuvieron una respuesta favorable y una mejora significativa en sus funciones neurologicas en comparacion con los pacientes de control que solamente recibieron fisioterapia (Figura 4). Los pacientes tratados con ABMC autologas tuvieron un aumento significativo en sus puntajes ASIA y FIM y recuperacion de la funcion muscular electrofisiologica a los 6 meses despues del trasplante (Fig. 4A-B).

A los 18 meses despues del trasplante (Tabla 2), 20 pacientes con SCI toracica (50%) mostraron una escala ASIA mejorada del grado A hasta grado C, 15 pacientes (37,5%) mejoraron del grado A hasta grado B, mientras que 5 pacientes (12,5%) permanecieron en el grado A (los criterios detallados de pacientes con SCI toracica se enumeran en la tabla 3). Para los 10 pacientes con SCI cervical tratados con terapia celular ABMC, 2 pacientes (20%) mejoraron de grado A hasta grado C, 3 pacientes mejoraron de grado A hasta grado B y 5 pacientes permanecieron en grado A ((los criterios detallados de pacientes con SCI cervical se enumeran en la tabla 4). Estos cambios se asociaron con la recuperacion de la compresion y edema de la medula espinal (mostrados en la Fig. 4C en las imagenes de MRI de 6 paciente con una SCI cervical C6-C7 un ano despues del trasplante). Ademas, estos cambios se asociaron con actividades cotidianas mejoradas y mejoras significativas en la calidad de vida. Dos pacientes representativos: paciente 1 (con una SCI cervical C6) era tetraplejico, y un paciente (con una SCI toracica T9) era hemiplejico antes de la terapia celular y ambos fueron capaces de caminar y recuperar la movilidad nueve meses a un ano despues de la terapia celular.

Independientemente de las mediciones de escala, todos los pacientes tratados con ABMC autologas, incluyendo aquellos que permanecieron en el grado A de ASIA, notaron funciones neurologicas mejoradas tan pronto como 4-6 semanas despues del trasplante. Los pacientes experimentaron una respuesta mejorada a los estfmulos tactiles y sensoriales primero y despues aumentaron la fuerza muscular que se observo primero en los musculos distales de las extremidades inferiores y luego en los musculos del muslo. Los pacientes con mejorfa de grado ASIA mostraron mejores movimientos de tronco que les permitio sentarse y voltearse en la cama. Ademas, la mejora de la fuerza muscular se asocio un mejor desempeno sexual, y con mayor control intestinal del esffnter de la vejiga que permitio a estos pacientes vivir sin cateter. Estos efectos se reflejaron en la mejora de los niveles neurologicos y la FIM en los pacientes tratados con ABMC comparado con los controles (Fig. 4A y Tablas 3-4). Todos los pacientes mostraron SSEP no cortical antes del tratamiento, mientras que el 65% de los pacientes tratados con ABMC pero ninguno de los pacientes de control mostraron reaparicion del impulso cortical (Fig. 13) a los 6 meses a un ano despues del trasplante. Por lo tanto, la terapia con celulas ABMC autologas mejoro significativamente las funciones motoras y sensoriales en pacientes con SCI cronica completa.

Tabla 2. Respuesta clfnica en todos los pacientes con SCI a los 18 meses posteriores al tratamiento

Respuesta clfnica

Fisioterapia estandar Fisioterapia estandar + ABMC

SCI cervical (n=10) N° de pacientes (%) SCI toracica (n=20) N° de pacientes (%) SCI cervical (n=10) N° de pacientes (%) SCI toracica (n=20) N° de pacientes (%)

COMPLETO

(ASIA escala A a E)

Ninguno en todos los grupos

PARCIAL

(ASIA escala A a D)

Ninguno en todos los grupos

(ASIA escala A a C)

Ninguno Ninguno 2(20) 20(50)

(ASIA escala A a B)

1(10) 3(15) 3(30) 15(37,5)

SIN RESPUESTA

(ASIA escala A permanece A)

9(90) 17(85) 5(50) 5(12,5)

Tabla 3. Demograffa de pacientes con SCI toracica, tratamiento y resultado clfnico 18 meses despues de la terapia. PT, fisioterapia; ITC, terapia celular intratecal con ABMC; Inj., numero de inyecciones de BM; FIM, mediciones de

independencia funcional

Pt. #

Edad/ Sexo Nivel de Inj. de SCI BM Terapia Puntaje Puntaje ASIA FIM Antes/Despues Antes/Despues pt. # Edad/ Sexo Nivel de Inj. de SCI BM Terapia Puntaje Puntaje ASIA FIM Antes/Despues Antes/Despues

1

18.1.1 "4 5 = “+ITC 76 / 171 6 .' 52 51 \7M T6 6 FT+ITC 132 £12 11 1 52

2

ie.*F 3 ”4 ITC 112 7 203 11 f 54 12 26'M T~ 5 PT+ITC 105 7 172 7 s 31

3

36i'M 3 F"4lTC 112 / 216 7 / 53 33 3DjF Tb 3 FT+ITC 112 7 203 7 l 47

i

22*F T12 1 = ~4lTC 1GB ; 206 G / 26 34 45LM 712 2 PT+ITC 1G8 / 206 6 I 27

5

4D.1.1 T1D 3 ■ 4 ITC 14B / 215 16 / 56 35 32'M “10 3 PT+ITC 148 7 192 18 I 45

6

38.1.1 T1D 5 = "4 ITC 144 / 221 5 / 52 36 2 UF T4 5 PT+ITC 144 ) 208 13 ! 52

7

32.11 ~z 5 -“4 ITC 104 j 195 24 i 42 37 35'M T5 5 PT+ITC 104 7 185 24 f 42

8

28 .'F "8 6 = "4lTC 132 i 221 13 7 52 3S 37-M TS 6 PT+ITC 132 J 221 13 7 52

9

32.'M "5 5 = "4lTC 104 i 162 10 / 30 35 41JW T5 b PT+ITC 104 7 182 10 ! 39

10

27.11 “i 4 T“+ ITC 76 t 171 G 52 40 Ift-W T4 4 PT+ITC 76 I 171 6 J 52

11

22.11 "0 5 = '4 ITC 112 i 204 9 54 41 IfiM TS ■ PT 95 J 104 13 7 13

12

27.'F _a 3 = "4lTC 112 i 216 7 1 53 42 M'W T7 ■ PT 112 7 115 15 7 15

13

35;F T12 6 -“4 ITC 1GB i 206 4 ■' 26 43 2B/M T5 - PT 100 7 108 13 7

13

14

25.11 T1D 8 = ”4lTC 14B i 216 16 t 56 44 2frM TB PT 154 f 159 11 7 11

15

35.11 T1D 3 F 74 ITC 144 i 221 5 / 52 45 24.'W "10 PT 164 J 164 13 7 13

16

25.11 -■ 4 = _4 ITC 104 i 195 22 i' 42 46 37.'W Tb ■ PT 145 { 147 11 7 11

17

28.11 _a 6 = "4lTC 132 i 221 11 / 52 47 24.-W "12 . PT 170 I 170 13 7 13

IS

26.1.1 2 F~+ ITC 104 i 162 6 i1 30 48 1&M Tb PT 154 7 182 13 7 20

19

28.11 “7 5 = "4lTC 116 i 210 9 l 52 45 26'W TB - PT 143 7 158 13 7 13

20

30.1.1 ~a 4 "“4 ITC 76 i 171 6 / 52 50 2&'M "10 ■ PT 95 I 95 15 i 15

21

25.11 T11 6 = -4 ITC 139 i 219 5 / 49 51 2BL'M TS - PT 112 f 112 16 / 16

22

2i:f T11 2 = "4lTC 163 i 205 4 / 25 52 27JM TB . PT 146 i 146 12 7 12

23

23.11 77 6 = _4lTC 106 i 172 9 / 32 53 2E.-W TB - PT 147 f 138 15 7 15

24

32.1.1 "5 6 F~+ ITC 76 t 172 6 t 49 54 32‘M TS PT 104 7 95 11 f 11

25

37,'F _a 4 = "4lTC 112 t 206 9 54 55 3D.-M TS - PT 146 7 148 14 7 15

26

33.11 "9 4 - _4 ITC 112 J 216 7 / 50 56 21JM Tb - PT 146 i 148 13 7 13

27

26.11 T12 1 F ~4 ITC 15B t 195 4 / 31 57 2&-M T5 ■ PT 104 7 95 11 ■' 11

28

23.11 “7 3 = "4lTC 150 1 210 17 / 54 58 3UM TB . PT 112 i 114 11 7 20

23

21.11 T1D 5 = "4lTC 126 t 134 22 / 30 59 im "10 - PT 126 7 130 15 7 15

30

19.1.1 4 = "4lTC 104 7 210 22 i 45 60 27.-M Tb PT 112 i 128 13 } 13

5

Tabla 4 Datos demograficos, tratamiento y evolucion clfnica del paciente con SCI cervical 18 meses despues de la _______terapia. PT, fisioterapia, ITC intratecal ABMC terapia celular; FIM medida de independencia funcional._____

Pt. #

Edad / sexo Nivel de SCI Inyecciones de BM Terapia Puntaje ASIA Antes/Despues Puntaje FIM Antes/Despues

1

16/M C8 5 PT+ITC 70/126 1/14

2

26/M C4 3 PT+ITC 59/109 3/14

3

34/M C5 2 PT+ITC 61/144 2/21

4

19/M C4 7 PT+ITC 60/110 4/12

5

29/M C3 1 PT+ITC 67/78 1/5

6

37/M C7 4 PT+ITC 79/171 1/18

7

24/M C6 3 PT+ITC 63/120 4/21

8

18/M C5 6 PT+ITC 50/92 3/20

9

36/M C4 3 PT+ITC 70/118 4/14

Pt. #

Edad / sexo Nivel de SCI Inyecciones de BM Terapia Puntaje ASIA Antes/Despues Puntaje FIM Antes/Despues

10

26/M C7 4 PT+ITC 54/111 2/15

11

18/M C6 - PT 62/68 1/1

12

36/M C4 - PT 59/25 3/3

13

12/M C5 - PT 61/64 2/2

14

28/M C7 - PT 60/27 1/1

15

26/M C3 - PT 67/40 1/1

16

28/M C7 - PT 79/67 2/2

17

30/M C8 - PT 63/67 2/2

18

25/M C8 - PT 95/104 4/4

19

33/M C6 - PT 70/126 3/4

20

23/M C6 - PT 59/109 2/4

Claims (9)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   REIVINDICACIONES

   1. Una composicion que comprende celulas madre adherentes de medula osea suspendidas en un liquido farmaceuticamente aceptable para su uso en el tratamiento de una lesion degenerativa o traumatica en un tejido nervioso o en el cerebro, en la que dichas celulas se pueden obtener mediante:

   (a) cultivar una muestra biologica que comprende celulas madre adultas de medula osea sobre un sustrato recubierto con poli-L-lisina durante 2 a 72 horas, de manera que una capa de celulas madre de medula osea se adhiere a dicho sustrato sin expandir las celulas en cultivo;

   (b) lavar las celulas no adherentes de dicho sustrato y recoger las celulas madre adherentes de la medula osea; y

   (c) suspender las celulas madre adherentes de medula osea en un liquido farmaceuticamente aceptable; y en la que dicho tratamiento comprende:

   administrar dicha composicion en o cerca del sitio de la lesion en una cantidad eficaz para provocar regeneracion axonal o remielinizacion en el sitio de dicha lesion.
2. 2. La composicion para el uso de la reivindicacion 1, en la que dicha lesion traumatica es una lesion de la medula espinal o una lesion de un nervio periferico.
3. 3. La composicion para el uso de la reivindicacion 1, en la que dicha lesion es en el cerebro o medula espinal y dichas celulas de medula osea se administran por inyeccion intratecal mediante puncion lumbar en el liquido cefalorraqufdeo en o cerca de dicho sitio de lesion y/o dicha lesion es de un nervio periferico y dichas celulas de medula osea se administran mediante sonograffa guiada por administracion local a la rafz de dicho nervio periferico.
4. 4. La composicion para el uso de la reivindicacion 1, en la que dicha lesion degenerativa es esclerosis lateral amiotrofica.
5. 5. La composicion para el uso de la reivindicacion 1, en la que dichas celulas de medula osea se derivan de aspirados de sangre del cordon umbilical o de la medula osea.
6. 6. La composicion para el uso de la reivindicacion 1, en la que entre aproximadamente 104 y aproximadamente 107 celulas de medula osea/kg se administran acumulativamente a traves de una o mas inyecciones.
7. 7. La composicion para el uso de la reivindicacion 1, en la que dichas celulas de medula osea comprenden celulas positivas para uno o mas marcadores seleccionados del grupo que consiste en CD44, CD73, CD90, CD105, CD166 y CD271 y/o dichas celulas de medula osea consisten esencialmente en celulas negativas para los marcadores CD34, CD38 y CD45.
8. 8. La composicion para el uso de la reivindicacion 1, en la que dichas celulas de medula osea provocan diferenciacion, posterior a la administracion, de un tipo celular seleccionado del grupo que consiste en una celula formadora de mielina, una celula precursora de astrocitos, un astrocito, una celula progenitora neural, una celula precursora de oligodendrocitos, una celula de oligodendrocito, un axon mielinizado y una neurona madura.
9. 9. La composicion para el uso de la reivindicacion 8, en la que dichas celulas de medula osea provocan diferenciacion, posterior a la administracion, de al menos uno de un tipo celular positivo para NF-70, celulas progenitoras de astrocitos que expresan Nestina, celulas precursoras de oligodendrocitos que expresan PDGFR-a , o un precursor de astrocitos que expresa GFAP.