DE69930150T2

DE69930150T2 - Arginin-reiche anti-vaskuläre endotheliale wachstumsfaktor-peptide,welche wachstum und metastase humaner tumorzellen durch blockierung der angiogenese inhibieren

Info

Publication number: DE69930150T2
Application number: DE69930150T
Authority: DE
Inventors: Chi Bom Chae; Dong Goo Pohang Univ. of Scie.& Tech Pohang Bae; Wan Hee Yoon
Original assignee: Korea Green Cross Corp; Pohang University of Science and Technology Foundation POSTECH
Current assignee: Korea Green Cross Corp; Pohang University of Science and Technology Foundation POSTECH
Priority date: 1999-12-21
Filing date: 1999-12-21
Publication date: 2006-11-30
Anticipated expiration: 2019-12-22
Also published as: DE69930150D1; EP1162991A4; WO2001066127A1; EP1162991A1; EP1162991B1; US7291601B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Peptid, welches eine inhibitorische Aktivität gegenüber dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (nachstehend bezeichnet als "VEGF"), der ein angiogener Faktor ist, zeigt, und die Verwendung hiervon zur Prophylaxe und Behandlung von Krebserkrankungen und mit der Angiogenese in Beziehung stehenden Erkrankungen.
Hintergrund der Erfindung
Per Definition im Hinblick auf die Bildung neuer Blutgefäße in reifen Geweben, aber nicht im Hinblick auf die Vaskulogenese während der Embryogenese oder Entwicklung ist die Angiogenese ein biologischer Prozess, welcher zeitlich und räumlich gesehen eine sehr genaue Synchronisation von angiogenen Faktoren, Substratmolekülen und akzessorischen Zellen erforderlich macht. Die Bildung von Blutgefäßen erfolgt durch komplexe, kollektive, mehrstufige Bioreaktionen, die eine sehr wichtige Rolle bei normalen physiologischen Funktionen wie der Wundheilung, Embryogenese, etc. spielen. Im Körper wird die Angiogenese zu einem erforderlichen Zeitpunkt an einer erforderlichen Stelle während eines erforderlichen Zeitraums durch ein kompliziertes System, welches durch das Gleichgewicht zwischen angiogenen Faktoren und antiangiogenen Faktoren kontrolliert wird, hervorgerufen (Loitta L.A. et al., Cell 64 (1991), 327).
Ein Versagen bei der Kontrolle des komplizierten Mechanismus der Angiogenese hat verschiedene Erkrankungen einschließlich Krebs, diabetische Retinopathie und rheumatoide Arthritis zur Folge (Kohn E.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 1307; Folkman J. et al., Science 235 (1997), 442; Risau W., Nature 386 (1997), 671). Es ist auch gezeigt worden, daß die Angiogenese für das Wachstum und die Metastasierung von Krebszellen unerläßlich ist, da sie die Versorgung der Krebszellen mit Nährstoffen ermöglicht und Durchgänge schafft, über welche Krebszellen zu anderen Stellen transportiert werden (Hanahan D. et al., Cell 86 (1996), 353; Skobe M. et al., Nature Med. 3 (1997), 1222). Im Einzelnen wachsen die Krebszellen bis zu einer Größe von 2 mm oder mehr heran, wobei neue Blutgefäße um den Tumor herum gebildet werden, über welche die Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen erfolgt und die Beseitigung von Abfallprodukten ermöglicht wird (Fidler I.J. et al., Cell 79 (1994), 185). Zusätzlich kann die Metastasierung von Krebszellen durch das ausgedehnte Kapillarnetzwerk, welches durch verschiedene angiogene Faktoren, die durch Krebszellen oder normale Gewebezellen sezerniert werden, neu gebildet wird, beschleunigt werden (Biood C.H. et al., Biochem. Biophys. Acta 1032 (1990), 89).
Herkömmliche Antikrebsmittel und Chemotherapien weisen insofern Begrenzungen auf, als selbst in einem einzelnen Tumor verschiedene Arten von Krebszellen vorhanden sind, die unterschiedliche Mutations- und Wachstumsraten, welche höher sind als die von normalen Zellen, aufweisen und folglich gegen die herkömmlichen Antikrebsmittel resistent werden. Im Gegensatz dazu inhibieren antiangiogene Krebstherapien das Wachstum von normalen Zellen (vaskulären Endothelzellen) des Wirtes, aber nicht von Krebszellen selbst, so daß erwartet wird, daß sie die Probleme herkömmlicher Krebstherapien, welche auf die Vielseitigkeit und Resistenz der Krebszellen zurückzuführen sind, überwinden. Die Vorteile der antiangiogenen Therapien gegenüber gegenwärtigen Krebstherapien werden durch die Ergebnisse verschiedener Tierexperimente, welche durch viele Forscher veröffentlicht wurden, bestätigt (Burrows F.J. et al., Pharmac. Ther. 64 (1994), 155).
Im Körper liegen zugleich angiogene Faktoren als auch antiangiogene Faktoren vor, wobei die Angiogenese durch deren Gleichgewicht genau kontrolliert wird. Bis heute sind Dutzende von krebsrelevanten angiogenen Faktoren bekannt geworden, wobei die meisten hiervon nicht als Wachstumsfaktoren für Endothelzellen wirksam sind (Bussolino F. et al., Trends Biochem. Sci. 22 (1997), 251). Andererseits ist bekannt, daß VEGF als ein endothelialer zellspezifischer Wachstumsfaktor in vitro wirksam ist (Gospodarowics D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 7311), die Gefäßpermeabilität erhöht (Leung D.W. et al., Science 246 (1989), 1306) und die mit dem Krebsprozess in vivo in Beziehung stehende Angiogenese induziert (Plouet J. et al., EMBO J. 8 (1989), 3801).
Es wurde gezeigt, daß VEGF einer der wirksamsten angiogenen Faktoren ist, dessen Expression durch eine Vielzahl von Reizen einschließlich Hypoxie induziert wird und für das Wachstum und die Metastasierung von menschlichen Krebszellen in vivo unerläßlich ist (Connolly D.T. et al., J. Biol. Chem. 264 (1989), 20017; Kim K.J. et al., Nature 362 (1993), 841). VEGF bindet an Heparin und zeigt eine Aminosäuresequenzhomologie zu PLGF (dem plazentalen Wachstumsfaktor) und PDGF (dem von Thrombocyten stammenden Wachstumsfaktor) (Conn G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 2628; Keck P.I. et al., Science 246 (1989), 1309; Maglione D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 9267). Es ist ebenfalls bekannt, daß VEGF durch alternatives Spleißen in vier Isoformen, bestehend aus 121, 165, 189 bzw. 206 Aminosäuren, exprimiert wird (Tischer E. et al., J. Biol. Chem. 266 (1991), 11947), wobei VEGF₁₂₁ nicht mit Heparin assoziiert ist.
Der Signaltransduktionsweg von VEGF, durch den er seine Funktion als ein Wachstumsfaktor ausübt, beginnt mit der Bindung von VEGF an zelluläre Rezeptoren (KDR/Flk-1 und Flt-1), die spezifisch auf vaskulären Endothelzellen exprimiert werden (Millauer B. et al., Cell 72 (1993), 835; De Vries C. et al., Science 255 (1992), 989). Die Wichtigkeit von VEGF bei der Vaskulogenese während der Embryogenese und bei der Angiogenese ist durch Gendeletionsstudien mit VEGF und VEGFR (Fong G.H. et al., Nature 376 (1995), 66; Shalaby F. et al., Nature 376 (1995), 62; Carmeliet P. et al., Nature 380 (1996), 435; Ferrara N. et al., Nature 380 (1996), 439), die maligne Transformation von Krebszellen bei einer Überexpression von VEGF in Krebszellen (Zang H.T. et al., J. Natl. Cancer Inst. 87 (1995), 213) und die Inhibition des Wachstums von Krebszellen durch neutralisierende monoclonale anti-VEGF-Antikörper und durch die Expression eines löslichen Flt-1 und eines dominant-negativen KDR/Flk-1 (Kim K.J. et al., Nature 362 (1993), 841; Goldman C.K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998), 8975) gezeigt worden. Zusätzlich sind andere Forschungsergebnisse vorgestellt worden, welche zeigen, daß VEGF eine Schlüsselrolle bei der Angiogenese spielt.
WO 00 74701 A gemäß Artikel 54 (3) und (4) zusammen mit Artikel 158 (1) EPC, nur relevant für die Beurteilung der Neuheit, betrifft ein Verfahren zur Inhibierung einer traumainduzierten intimalen Hyperplasie in einem Blutgefäß, wobei u.a. ein Arginin-Homopolymer, bestehend aus 6 Aminosäureuntereinheiten, verwendet wird.
DE 197 24 793 A betrifft Peptide mit einer inhibitorischen Wirkung gegenüber VEGF, welche zur Behandlung mehrerer Erkrankungen, z.B. Psoriasis, Kaposi-Sarkom, etc., nützlich sind.
Folglich können Materialien, welche dadurch wirksam sind, daß sie die Assoziation zwischen VEGF und seinen Rezeptoren inhibieren, die durch VEGF gesteuerte Angiogenese sowie das Wachstum und die Metastasierung von Krebszellen, welche VEGF sezernieren, unterdrücken (Martiny-Baron G. et al., Curr. Opin. Biotechnol. 6 (1995), 675).
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein VEGF-antagonistisches Peptid, welches fähig ist, die Angiogenese sowie das Wachstum und die Metastasierung von Krebszellen zu inhibieren, bereitzustellen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1a ist eine Kurve, welche zeigt, daß ein ¹²⁵I-markierter VEGF in einer zeitabhängigen Weise an seine Rezeptoren auf der Oberfläche von HUVECs (menschlichen Endothelzellen der Nabelvene) bindet.
1b ist eine Kurve, welche zeigt, daß ein ¹²⁵I-markierter VEGF in einer dosisabhängigen Weise an seine Rezeptoren auf der Oberfläche von HUVECs bindet.
1c ist ein Scatchard-Diagramm, erhalten aus den Ergebnissen von 1b, welches zeigt, daß zwei Arten von VEGF-Rezeptoren auf der Oberfläche von vaskulären Endothelzellen vorhanden sind.
2 stellt Histogramme bereit, welche die Ergebnisse einer ersten Durchmusterung zeigen, worin die inhibitorische Aktivität von kombinatorischen Peptidbanken gegenüber der Bindung von VEGF an seine Rezeptoren gemäß den Aminosäureresten an jeder Position des Hexapeptids dargestellt ist, wenn die kombinatorischen Peptidbanken in einer Konzentration von 0,33 nM/Peptid verwendet werden.
3a ist ein Histogramm, worin die inhibitorische Aktivität des ersten sekundären Pools von Peptiden, welche basierend auf den Ergebnissen der ersten Durchmusterung synthetisiert wurden, gegenüber der Bindung von VEGF an seine Rezeptoren gemäß den Aminosäureresten dargestellt ist, wenn der Pool in einer Konzentration von 100 nM/Peptid verwendet wird.
3b ist ein Histogramm, worin die inhibitorische Aktivität des zweiten sekundären Pools von Peptiden, welche basierend auf den Ergebnissen von 3a synthetisiert wurden, gegenüber der Bindung von VEGF an seine Rezeptoren gemäß den Aminosäureresten dargestellt ist, wenn der Pool von Peptiden in einer Konzentration von 250 nM/Peptid verwendet wird.
4 zeigt Kurven der inhibitorischen Aktivität von sechs Fraktionen, welche aus einer Mischung der wirksamsten Peptide, ausgewählt aus dem zweiten sekundären Pool, durch eine C18-Umkehrphasensäule entsprechend der Retentionszeit abgetrennt wurden. Die inhibitorische Aktivität jeder Fraktion gegenüber der Bindung von VEGF an seine Rezeptoren ist gegen die Konzentration der Fraktionen aufgetragen.
5 zeigt Kurven, worin die inhibitorische Aktivität von 12 Peptiden gegenüber der Bindung von VEGF an seine Rezeptoren gegen die Peptidkonzentration aufgetragen ist.
6 ist ein Histogramm, welches die quantitativen Ergebnisse für die Bindung eines ¹²⁵I-markierten VEGF und eines ¹²⁵I-markierten bFGF (basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor) an ihre Rezeptoren in Gegenwart von drei ausgewählten Peptiden oder anderen Kontrollpeptiden zeigt.
7 zeigt Kurven, worin die Radioaktivität, welche für einen ¹²⁵I-markierten VEGF in Assoziation mit den fixierten Peptiden (Sequenzen 1, 2 und 3) gemessen wurde, gegen die Molverhältnisse der Kompetitoren (überschüssige freie Peptide) zu ihren Gegenstücken aufgetragen ist.
8 ist ein Histogramm, welches die Strahlungsmengen, gemessen für einen ¹²⁵I-markierten VEGF, welcher mit einer fixierten Sequenz (Sequenz 1) assoziiert ist, in Abwesenheit und in Anwesenheit von Kompetitoren (ein Überschuß an einem unmarkierten VEGF und an freien Sequenzen 1, 2 und 3) zeigt.
9 stellt Histogramme bereit, worin die Radioaktivität, welche für einen ¹²⁵I-markierten VEGF, assoziiert mit der fixierten Sequenz 1 (RRKRRR), gemessen wurde, in Abwesenheit von Kompetitoren und in Anwesenheit von Kompetitoren für verschiedene VEGF-Isoformen aufgetragen ist.
10a stellt Kurven bereit, welche zeigen, daß die Peptide der Sequenzen 1, 2 und 3 das VEGF-induzierte Wachstum von vaskulären Endothelzellen in einem dosisabhängigen Muster inhibieren.
10b ist ein Histogramm, worin die Radioaktivität des in das Genom von HUVECs eingebauten Thymidins in Abwesenheit der Peptide und in Anwesenheit von 100 μM der jeweiligen drei Peptide gemessen wird, welches gezeigt, daß die Inhibition des Zellwachstums nicht auf die Cytotoxizität der Peptide zurückzuführen ist.
11 zeigt Aufnahmen von Kaninchenhornhäuten, welche die deutliche Angiogenese in den mit VEGF allein behandelten Testgruppen (A), die antiangiogene Wirkung in der gleichzeitig mit sowohl Sequenz 1 (RRKRRR) als auch VEGF behandelten Testgruppe (B) und die deutliche Angiogenese in der mit dem Peptid EEFDDA behandelten Testgruppe (C) zeigen.
12 sind Aufnahmen, welche die inhibitorische Wirkung der Sequenzen 1, 2 und 3 auf die durch VEGF, sezerniert durch menschliche Krebszellen, induzierte Angiogenese zeigen.
13 zeigt Kurven, worin die Lebensfähigkeit einer menschlichen Fibrosarkomzelllinie gegen die Konzentrationen der Peptide aufgetragen ist, welche zeigen, daß die erfindungsgemäßen Peptide keinen direkten Einfluß auf die menschlichen Fibrosarkomzellen haben.
14 zeigt Kurven, worin die Veränderungen der Tumorgröße über den Injektionszeitraum protokolliert sind, welche zeigen, daß das Peptid von Sequenz 1 das Wachstum von menschlichen Dickdarmkarzinomzellen in Mäusen wirksam inhibiert.
15a ist ein Histogramm, worin die Anzahl der Metastasenknoten aus der Milz in die Leber nach der Behandlung mit einer Salzlösung und mit verschiedenen Peptiden gemessen wird.
15b ist ein Histogramm, worin das Gewicht der Mäuselebern, in welche die menschlichen Dickdarmkarzinomzellen aus der Milz übertragen werden, nach der Behandlung mit verschiedenen Peptiden bestimmt wird.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Zur Identifizierung der neuen anti-VEGF-Peptide der vorliegenden Erfindung wurde ein kombinatorische Bank von kleinen Peptiden verwendet, welche sich bei der Entwicklung von möglichen Arzneistoffen mit einer kleinen Molekülgröße außerordentlich erfolgreich erwiesen hat (Gho Y.S. et al., Cancer Res. 57 (1997), 3733; Park J.Y. et al., Endocrinology 138 (1997), 617).
Zuerst wird eine kombinatorische Peptidbank konstruiert. Dazu werden Hexapeptide synthetisiert, worin 19 Arten von Aminosäuren an jeder Aminosäureposition festgelegt sind. Wenn ein spezifischer Aminosäurerest an einer bestimmten Position und die anderen Aminosäurereste an den anderen Positionen in den Hexapeptiden durch O bzw. Xs dargestellt werden, können die Peptide als OX₂X₃X₄X₅X₆, X₁OX₃X₄X₅X₆ bis X₁X₂X₃X₄X₅O angegeben werden, wodurch 114 (6 × 19) Kombinationen erhalten werden.
Aus der kombinatorischen Peptidbank werden die Peptidsequenzen ausgewählt, welche die höchste Wirksamkeit bei der Inhibition der Bindung von VEGF an seine Rezeptoren auf vaskulären Endothelzellen zeigen. In der vorliegenden Erfindung wird ein mit Iod radioaktiv markierter VEGF zusammen mit der kombinatorischen Peptidbank zu einer Kultur von vaskulären Endothelzellen zugegeben und miteinander reagieren gelassen. Nach der Entfernung des ungebundenen VEGF wird die Menge des an die Rezeptoren auf der Oberfläche der Endothelzellen gebundenen VEGF durch Messung der Radioaktivität des assoziierten VEGF quantifiziert. Es werden diejenigen Peptidsequenzen ausgewählt, welche bei den niedrigsten Konzentrationen eine inhibitorische Aktivität gegenüber der Bindung von VEGF an seine Rezeptoren zeigen.
Die löslichen Hexapeptidbanken wurden durch das oben beschriebene Durchmusterungsverfahren untersucht (2). Die Aminosäuren an jeder Position der Hexapeptide, welche wesentlich zu der Inhibition beitragen, sind nachstehend in Tabelle 1 aufgeführt.
<Tabelle 1>
Basierend auf den Ergebnissen aus der obigen ersten Durchmusterung, so wie aus der folgenden Tabelle 2 ersichtlich ist, werden Peptidsequenzen in einer solchen Weise synthetisiert, daß die zwei Aminosäuren an den Carboxyenden durch ausgewählte Aminosäuren festgelegt werden, während die anderen Positionen durch die Zufallsmischung aus den Aminosäureresten, welche durch das erste Durchmusterungsverfahren ausgewählt wurden, in gleichen Verhältnissen besetzt werden.
<Tabelle 2>
Diese erste Subbank wird abermals auf die inhibitorische Aktivität gegenüber der Bindung von VEGF an seine Rezeptoren untersucht (vgl. 3a). Anhand dieser quan titativen Daten wurde festgestellt, daß es sich bei den Peptidsequenzen, für welche gezeigt wurde, daß sie die Bindung am wirksamsten inhibieren, um solche handelte, worin Arginin oder Histidin an der sechsten Position und Arginin oder Lysin an der fünften Position vorliegt.
Basierend auf den obigen zwei Durchmusterungsverfahren wird die zweite Subbank in einer solchen Weise konstruiert, daß die erste, die vierte und die sechste Position durch vorher bestimmte Aminosäuren festgelegt ist, während die anderen drei Positionen durch die Aminosäuremischungen, welche durch die obigen zwei Durchmusterungsverfahren bestätigt wurden, wie nachstehend in Tabelle 3 gezeigt, besetzt werden.
<Tabelle 3>
Eine Untersuchung auf die inhibitorische Aktivität gegenüber der Aktivität von VEGF zeigt, daß die Peptide, worin die erste, die vierte und die sechste Position jeweils durch Arginin festgelegt ist, bei der Inhibition der Bindung von VEGF an seine Rezeptoren am wirksamsten sind (vgl. 3b).
Eine weitere Untersuchung der Peptidmischungen, welche nach der Auftrennung durch eine C18-Umkehrphasensäule erhalten wurden, auf eine inhibitorische Aktivität gegenüber der Bindung von VEGF an seine Rezeptoren führte daher zu der Schlußfolgerung, daß die induzierte inhibitorische Aktivität am wirksamsten ist, wenn die erste, die vierte und die sechste Position jeweils durch Arginin, die zweite Position durch Arginin, Lysin oder Histidin und die dritte und die fünfte Position durch Arginin oder Lysin besetzt sind (vgl. 4).
Diese bevorzugten Kombinationen für die Aminosäuresequenz sind nachstehend in Tabelle 4 gezeigt.
<Tabelle 4>
Eine Untersuchung der 12 Peptide auf die inhibitorische Aktivität gegenüber der Bindung von VEGF an seine Rezeptoren bestätigte, daß das Peptid von Sequenz 1 (NH₂-Arg-Arg-Lys-Arg-Arg-Arg-CONH₂), das Peptid von Sequenz 2 (NH₂-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-Arg-CONH₂) und das Peptid von Sequenz 3 (NH₂-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-CONH₂) die wirksamsten Inhibitoren gegenüber der VEGF-Aktivität sind.
Es kann verschiedene Mechanismen geben, durch welche die Peptide die Bindung von VEGF an seine Rezeptoren inhibieren können. Um den genauen Inhibitionsmechanismus aufzuklären, wurde die Möglichkeit untersucht, ob die identifizierten Peptide direkt mit VEGF assoziieren können, um die Bindung von VEGF an seine Rezeptoren auf der Zelloberfläche von vaskulären Endothelzellen zu inhibieren. In diesem Zusammenhang ließ man einen markierten VEGF und einen unmarkierten VEGF um die Assoziation mit den immobilisierten Peptiden konkurrieren. Anhand der Quantifizierung der Radioaktivität der immobilisierten Peptide wurde festgestellt, daß sich das Ausmaß der Assoziation zwischen dem markierten VEGF und den Peptiden verringert, wenn sich die Konzentrationen des unmarkierten VEGF und der zugegebenen freien Peptide erhöhen, was zeigt, daß die identifizierten Peptide der vorliegenden Erfindung direkt mit VEGF eine Assoziation eingehen. Die Feststellung, daß die Assoziation zwischen einem Peptid und einem markierten VEGF durch alle drei Peptide vollständig inhibiert wird, erlaubt die Postulierung, daß die Peptide von Sequenz 1, Sequenz 2 und Sequenz 3 identische oder überlappende Bindungsdomänen auf VEGF besitzen (7 und 8). Eine quantitative Messung der inhibitorischen Aktivität des Peptids von Sequenz 3 gegenüber der Assoziation zwischen 5 Typen von VEGF-Isoformen und ihren Rezeptoren führte zu der Schlußfolgerung, daß sowohl das Amino- als auch das Carboxyende von VEGF₁₂₁ für die Bindungsdomäne wichtig sind (vgl. 9).
Um festzustellen, ob die erfindungsgemäßen Peptide das VEGF-stimulierte Wachstum von vaskulären Endothelzellen inhibieren, wurde die DNA-Menge, welche in den vaskulären Endothelzellen in Gegenwart der durchmusterten Peptide und VEGF synthetisiert wurde, gemessen. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Peptide die durch VEGF induzierte DNA-Synthese in den vaskulären Endothelzellen in einem dosisabhängigen Muster inhibieren. Als Folge davon zeigen die erfindungsgemäßen Peptide eine inhibitorische Aktivität gegenüber dem VEGF-stimulierten Wachstum von vaskulären Endothelzellen (vgl. 10a und 10b).
In einem Experiment wurde die CAM (Chorionallantoismembran) eines Eies mit VEGF in Gegenwart der erfindungsgemäßen Peptide behandelt, wobei Daten erhalten wurden, welche zeigen, daß die VEGF-induzierte Angiogenese durch die Peptide inhibiert wird, wodurch die antiangiogene Aktivität der erfindungsgemäßen Peptide bestätigt wird. Zusätzlich wurde in einem Tiertest auf eine Angiogenese unter Verwendung von Kaninchenhornhäuten die Angiogenese, welche bei der Kontrollgruppe, die nur mit VEGF behandelt wurde, eindeutig beobachtet wurde, in der Gruppe, welche gleichzeitig mit VEGF und den Peptiden behandelt wurde, vollständig inhibiert (vgl. 11). Ferner wurde ein Experiment durchgeführt, um festzustellen, ob die erfindungsgemäßen Peptide in der Lage sind, die durch VEGF, sezerniert durch Krebszellen, induzierte Angiogenese zu inhibieren. Zu diesem Zweck wurden VEGF sezernierende Sarkomzellen zusammen mit den erfindungsgemäßen Peptiden auf die CAM eines Eies appliziert. Es wurde eine inhibitorische Wirkung der erfindungsgemäßen Peptide auf die durch Krebszellen induzierte Angiogenese beobachtet (vgl. 12).
Ein Experiment wurde durchgeführt, um festzustellen, ob die erfindungsgemäßen Peptide, für welche gezeigt wurde, daß sie eine antagonistische Aktivität gegenüber VEGF besitzen, eine direkte inhibitorische Wirkung auf das Wachstum von Krebszellen haben. In dem Experiment wurden menschliche Fibrosarkomzellen gezüchtet und mit den erfindungsgemäßen Peptiden behandelt, wobei anschließend die Zelllebensfähigkeit gemessen wurde. Aus den Messungen wird deutlich, daß die erfindungsgemäßen Peptide keinen direkten Einfluß auf das Wachstum der Fibrosarkomzellen haben, wie in 13 erkennbar ist.
Die erfindungsgemäßen Peptide wurden auch auf die Fähigkeit untersucht, das Wachstum und die Metastasierung von Krebszellen zu inhibieren. Dazu wurden menschliche Dickdarmkrebszellen zusammen mit den erfindungsgemäßen Peptiden durch subkutane Injektion in Mäuse eingebracht. Nach einem bestimmten Zeitraum wurde die Größe der gebildeten Tumoren gemessen. Es wurde beobachtet, daß eine wesentliche Verringerung der Größe des gebildeten Tumors in den Mäusen, welche mit den erfindungsgemäßen Peptiden behandelt wurden, im Vergleich zu der Kontrollgruppe, welche nur mit phosphatgepufferter Salzlösung behandelt wurden, hervorgerufen wurde (vgl. 14). Außerdem wurden bessere Ergebnisse im Hinblick auf die Anzahl der metastasierenden Tumorknoten in der Leber und das Gewicht der Leber erhalten, wenn Krebszellen, implantiert in die Milz von Mäusen, mit den erfindungsgemäßen Peptiden behandelt wurden, als wenn die implantierten Zellen nur mit phosphatgepufferter Salzlösung behandelt wurden (vgl. 15a und 15b). Aus den Ergebnissen der vorstehenden Experimente kann geschlossen werden, daß die inhibitorische Aktivität der erfindungsgemäßen Peptide gegenüber dem Wachstum und der Metastase von malignen Tumoren darauf zurückzuführen ist, daß sie den Signaltransduktionsweg von VEGF blockieren.
Zusammenfassend wurde durch die verschiedenen vorstehenden Experimente gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Peptide das Wachstum von Krebszellen nicht direkt beeinflussen, sondern die durch Krebszellen induzierte Angiogenese als ein Ergebnis der inhibitorischen Aktivität der Peptide gegenüber der Bindung von VEGF, sezerniert durch die Krebszellen, an die Rezeptoren auf der Oberfläche von vaskulären Endothelzellen spezifisch unterdrücken.
Dank der außerordentlichen Fähigkeit, die Bindung von VEGF an seine Rezeptoren zu inhibieren, können die erfindungsgemäßen Peptide als therapeutische Mittel für Angiogenese-bedingte Erkrankungen einschließlich Krebs, diabetische Retinopathie, rheumatoide Arthritis, etc. verwendet werden.
Beispiele
In den folgenden Beispielen werden praktische und gegenwärtig bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung veranschaulicht.
Beispiel 1: Charakterisierung eines ¹²⁵I-markierten VEGF
Da in verschiedenen Experimenten ein ¹²⁵I-markierter VEGF₁₆₅ verwendet wird, wurde untersucht, ob dieses markierte Protein dieselbe Aktivität wie das natürliche VEGF-Protein besitzt.
Dabei wurden zuerst HUVECs (menschliche Endothelzellen der Nabelvene) (Clonetics) auf mit Gelatine beschichtete, 100 mm-Schalen (Falcon), enthaltend ein Kulturmedium für vaskuläre Endothelzellen (Medium 199 + 20% BCS, 5 μg/ml Heparin, 6 μg/ml Nährstoffergänzung für das Wachstum von Endothelzellen und 5 ng/ml basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor), plattiert und in einem CO₂-Inkubator für die Tierzellkultur bei 37°C gezüchtet. Nach einem bestimmten Zeitraum wurden die Zellen mit Trypsin/EDTA behandelt. Nach dem Abzentrifugieren wurden die geernteten Zellen in einem frischen Kulturmedium für vaskuläre Endothelzellen suspendiert und in einer Dichte von 5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung in eine Platte mit 24 Vertiefungen (Costar Co.) aliquotiert. Nach eintägiger Kultivierung wurden die Zellen in ein Bindungsmedium (Medium 199/25 mM HEPES, pH 7,4/0,1 % Rinderserumalbumin), enthaltend 0,2 ng eines ¹²⁵I-markierten VEGF₁₆₅, überführt und damit während 3 Stunden bei 4°C reagieren gelassen. Um den noch im Medium verbliebenen markierten VEGF zu entfernen, wurden die Zellen zweimal mit dem vorstehend verwendeten Medium und einmal mit PBS, enthaltend 0,1 % Albumin, gewaschen. Danach wurden die Zellen mit 0,5 ml einer Lyselösung (20 mM Tris-HCl, pH 7,4/1% Triton X-100) für 20 min behandelt, gefolgt von der Messung der Radioaktivität in dem erhaltenen Lysat mit Hilfe eines Gammazählers, um die Menge des markierten VEGF, welcher an die auf der Oberfläche der vaskuläre Endothelzellen vorhandenen Rezeptoren gebunden wurde, quantitativ zu bestimmen. Die unspezifische Bindung wurde mit Hilfe einer Gruppe von Zellen bestimmt, die in Gegenwart einer Mischung aus dem markierten VEGF und einem unmarkierten VEGF in einem Molverhältnis von 1:100 kultiviert wurden. Diese Gruppe von Zellen wurde als negative Kontrolle kultiviert.
Die Meßergebnisse sind in 1a und 1b gezeigt, worin die Radioaktivität gegen die Zeit bzw. die Konzentration aufgetragen ist. Aus diesen Figuren ist ersichtlich, daß die Bindung des markierten VEGF (1 ng/ml) an die auf der Oberfläche von HUVECs (5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung) vorhandenen VEGF-Rezeptoren in einem zeitabhängigen Muster und in einem VEGF-Dosis-abhängigen Muster erfolgt, was zeigt, daß die Wechselwirkung zwischen VEGF und seinen Rezeptoren spezifisch ist.
Eine Scatchard-Analyse der in 1b erhaltenen Ergebnisse ergab, daß zwei Arten von Rezeptoren auf der Oberfläche von vaskulären Endothelzellen vorliegen, wie in 1c erkennbar ist. Einer dieser zwei Rezeptortypen besitzt eine Dissoziationskonstante (KD) von 3 pM und kommt in einer Dichte von etwa 2000 pro Zelle vor, während der an dere eine Dissoziationskonstante (KD) von 50 pM besitzt und in einer Dichte von etwa 6000 pro Zelle vorhanden ist. Diese Ergebnisse stimmen mit solchen überein, über welche in verschiedenen Studien berichtet wurde (Maciag T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979), 5674; Myoken Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 5819; Gengrinovitch S. et al., J. Biol. Chem. 270 (1996), 15059; Bikfalvi A. et al., J. Cell Physiol. 149 (1991), 50).
Beispiel 2: Durchmusterung einer kombinatorischen Peptidbank auf VEGF-antagonistische Peptidsequenzen
Schritt 1: Konstruktion einer kombinatorischen Peptidbank
Gemäß einer bekannten Methode (Pinilla C. et al., Biotechniques 13 (1992), 901) wurde eine kombinatorische Peptidbank konstruiert.
Bei der Synthese einer aus Hexapeptiden bestehenden Bank wurde ein vorher festgelegter Aminosäurerest einer bestimmten Position der sechs Positionen zugewiesen, während die anderen fünf Positionen durch irgendeine von 19 Aminosäurenarten (ausgenommen Cystein) besetzt wurden. Unter der Annahme, daß ein spezifischer Aminosäurerest an einer bestimmten Position und die anderen Aminosäurereste an den anderen Positionen in den Peptiden aus sechs Aminosäureresten durch O bzw. Xs dargestellt werden können, wurden die Peptide als OX₂X₃X₄X₅X₆, X₁OX₃X₄X₅X₆ bis X₁X₂X₃X₄X₅O angegeben. Das heißt, in Peptiden aus sechs Aminosäureresten sind 19 Arten von Aminosäuren an jeder Aminosäureposition festgelegt, während die nicht festgelegten Positionen durch irgendeine Aminosäure, ausgenommen Cystein, besetzt werden, um Peptidbanken zu konstruieren, wodurch 114 (6 × 19) Kombinationen erhalten werden.
Schritt 2: Erste Durchmusterung auf Peptidsequenzen
Um die Peptide, welche mit VEGF eine Bindung eingehen können, aus den kombinatorischen Peptidbanken auszuwählen, wurde das folgende Experiment durchgeführt.
Auf einer Platte mit 24 Vertiefungen (Costar Co.) wurden HUVECs (menschliche Endothelzellen der Nabelvene) (Clonetics) in einer Dichte von 5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung für einen Tag in einem Medium kultiviert. Anschließend wurden die Zellen in ein Medium (Medium 199/25 mM HEPES, pH 7,4/0,1 % Rinderserumalbumin), enthaltend 0,2 ng eines ¹²⁵I-markierten VEGF und verschiedene Konzentrationen der Peptide oder kombinatorischen Peptidbanken, überführt und damit während 3 Stunden bei 4°C reagieren gelassen. Die Zellen wurden zweimal mit demselben Medium und einmal mit PBS, enthaltend 0,1 % Albumin, gewaschen, um den markierten VEGF, welcher nicht gebunden wurde, zu entfernen. Danach wurden die Zellen mit 0,5 ml einer Lyselösung (20 mM Tris-HCl, pH 7,4/1% Triton X-100) behandelt, gefolgt von der Messung der Radioaktivität des erhaltenen Lysats mit Hilfe eines Gammazählers, um die Menge des markierten VEGF, welcher an die auf der Oberfläche der vaskulären Endothelzellen vorhandenen Rezeptoren gebunden wurde, zu quantifizieren.
In 2. ist die prozentuale Inhibierung der Bindung von VEGF an seine Rezeptoren durch die kombinatorischen Peptidbanken, wenn die kombinatorischen Peptidbanken in einer Konzentration von 0,33 nM/Peptid verwendet werden, in Abhängigkeit von den Aminosäureresten an jeder Position des Hexapeptids angeben. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden 3-5 Aminosäuren für jede Position ausgewählt. Es ist erkennbar, daß die wirksamste antagonistische Aktivität gegenüber VEGF beobachtet wurde, wenn alle Positionen des Peptids durch Lysin oder Arginin besetzt waren.
Schritt 3: Zweite Durchmusterung auf Peptidsequenzen
Basierend auf den Ergebnissen der ersten Durchmusterung, wurden zwei Pools von Peptiden, wie aus Tabelle 2 und 3 ersichtlich ist, synthetisiert. Diese zwei kombinatorischen Peptidbanken wurden erneut auf eine antagonistische Aktivität gegenüber der Bindung von VEGF an seine Rezeptoren untersucht, und die Ergebnisse sind in 3a und 3b angegeben.
Um den ersten sekundären Pool von Peptiden herzustellen, wurden zuerst die zwei Positionen am Carboxyende durch ausgewählte Aminosäuren festgelegt, während die anderen Positionen durch die Aminosäurereste, welche durch die zweite Durchmusterung ausgewählt wurden, in gleichen Verhältnissen besetzt wurden. Dieser erste sekundäre Pool von Peptiden aus insgesamt 375 Sequenzen umfaßte 15 kombinatorische Peptidbanken entsprechend der Kombination der zwei Aminosäuren am Carboxyende.
Dieser erste sekundäre Pool von Peptiden wurde wie bei der ersten Durchmusterung in verschiedenen Konzentrationen (0,01, 0,05, 0,1 und 1 μM/Sequenz) auf eine antagonistische Aktivität gegenüber der Bindung von VEGF untersucht. In 3a ist die prozentuale Inhibierung der Bindung von VEGF an seine Rezeptoren durch die kombinatorischen Peptidbanken, wenn der erste sekundäre Pool von Peptiden in einer Konzentration von 0,1 μM/Peptid verwendet wurde, in Abhängigkeit von den Aminosäureresten an der fünften und der sechsten Position des Hexapeptids angegeben. Aus 3a ist ersichtlich, daß die Peptidsequenzen, welche die höchste Wirksamkeit bezüglich der Inhibierung der Bindung zeigten, diejenigen waren, worin Arginin oder Histidin an der sechsten Position vorhanden war und Arginin oder Lysin an der fünften Position vorhanden war.
Basierend auf den Ergebnissen, welche durch die zwei Durchmusterungsverfahren erhalten wurden, wurde dann der zweite sekundäre Pool von Peptiden konstruiert. Die erste, die vierte und die sechste Position ausgehend vom Aminoende wurde durch vorher bestimmte Aminosäuren festgelegt, während für die anderen drei Positionen die Aminosäurerest-Daten, wie in Tabelle 3 gezeigt, verwendet wurden.
Die Kombination der festgelegten Aminosäurereste ergab 15 kombinatorische Banken, welche jeweils aus 50 Sequenzen bestanden. Die antagonistische Aktivität der Peptide wurde bei verschiedenen Konzentrationen (0,1, 0,25 und 1 μM/Sequenz) unter sucht. In 3b ist die prozentuale Inhibierung der Bindung von VEGF an seine Rezeptoren durch die kombinatorischen Peptidbanken, wenn der zweite sekundäre Pool von Peptiden in einer Konzentration von 0,25 μM/Peptid verwendet wurde, in Abhängigkeit von den Aminosäureresten an der ersten, der vierten und der sechsten Position des Hexapeptids angegeben. Aus 3b ist ersichtlich, daß die wirksamste antagonistische Aktivität gegenüber der Bindung von VEGF an seine Rezeptoren für die Sequenzen beobachtet wurde, worin die erste, die vierte und die sechste Position jeweils durch Arginin besetzt wurde.
Schritt 4: Auftrennung der Peptidsequenzen
Eine Mischung der wirksamsten Peptide, welche aus dem zweiten sekundären Pool ausgewählt wurden, wurde durch eine C 18-Umkehrphasensäule entsprechend der Retentionszeit in der Säule in sechs Fraktionen aufgetrennt. Jede der sechs Fraktionen wurde in verschiedenen Konzentrationen (0,5, 1, 2, 5, 10 und 25 μM/Peptid) erneut auf einen Einfluß auf die Bindung von VEGF an seine Rezeptoren untersucht. Die Ergebnisse sind in 4 angegeben, welche Kurven zeigt, worin die prozentuale Inhibierung gegen die Konzentration der Peptidfraktionen aufgetragen ist.
Aus den Kurven ist ersichtlich, daß die Fraktion 1 die höchste antagonistische Aktivität besitzt. Auch wurde gezeigt, daß die Fraktion 1 kein Tryptophan enthält, da bei UV₂₆₀ keine Extinktion nachgewiesen wurde. Durch eine qualitative Analyse der Aminosäuresequenzen hiervon wurde die Anwesenheit von Arginin, Lysin und Histidin nachgewiesen.
Die bisher erhaltenen Daten zeigen daher, daß die aus sechs Aminosäuren bestehenden Sequenzen, worin die erste, die vierte und die sechste Position jeweils durch Arginin besetzt ist, die größte antagonistische Aktivität gegenüber der Bindung von VEGF an seine Rezeptoren zeigen, während die wirksamsten Kandidaten für die anderen Positionen auf zwei oder drei Aminosäurereste, z.B. Arginin, Lysin und Histidin für die zweite Position, Lysin und Arginin für die dritte Position und Arginin und Lysin für die fünfte Position, eingegrenzt werden können.
Als Ergebnis der Kombination der in Frage kommenden Aminosäurereste wurden 12 Peptide, worin die dritte Position durch Arginin besetzt wurde, synthetisiert, wie in Tabelle 4 gezeigt ist, und anschließend wurde jedes Peptid mit Hilfe einer C18-Umkehrphasensäule isoliert.
Schritt 5: Dritte Durchmusterung auf Peptidsequenzen
Die Sequenz jedes Peptids wurde durch die Analyse der Aminosäurezusammensetzungen indirekt abgeleitet, und die Konzentration davon wurde bestimmt. Anschließend wurden die 12 Peptide in verschiedenen Konzentrationen (1, 4, 10 und 20 μM/Sequenz) auf einen Antagonismus gegen die VEGF-Bindung untersucht. Die Ergebnisse sind in 5 angegeben. Wie aus 5 ersichtlich ist, wurde gezeigt, daß drei Peptide, Sequenzen 1, 2 und 3, die Bindung von VEGF an seine Rezeptoren bei IC₅₀-Werten von 2, 3,4 bzw. 3,8 μM/Sequenz am wirksamsten inhibieren.
In 6 sind die quantitativen Ergebnisse für die Bindung eines ¹²⁵I-markierten VEGF und eines ¹²⁵I-markierten bFGF (basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors) an ihre Rezeptoren in Gegenwart der verschiedenen Peptide dargestellt. Trotz der hohen Konzentration (10 μM) eines Kontrollpeptids, welches ausschließlich aus Lysin bestand, wurde keine Inhibierung zwischen dem markierten VEGF und seinen Rezeptoren beobachtet, was zeigt, daß die inhibitorische Aktivität der drei Peptide, welche vorstehend identifiziert wurden, nicht aus positiv geladenen Aminosäuren resultiert, sondern auf die spezifischen Aminosäuresequenzen zurückzuführen ist. In Anbetracht der Tatsache, daß keines der drei Peptide die Binding von bFGF, einem angiogenen Faktor, welcher mit VEGF vergleichbar ist, an seine Rezeptoren inhibiert, wird bestätigt, daß die Peptide ausschließlich für VEGF spezifisch sind.
Beispiel 3: Charakterisierung der Peptide, welche durch die Durchmusterung der kombinatorischen Peptidbanken erhalten wurden
Es gibt verschiedene mögliche Mechanismen, um die Bindung von VEGF an seine Rezeptoren zu inhibieren. Zum Beispiel kann ein Inhibitor mit entweder VEGF oder einem oder mehreren seiner Rezeptoren eine Bindung eingehen, wodurch die Wechselwirkung zwischen VEGF und dem Rezeptor inhibiert wird.
Zur Bestätigung des postulierten Mechanismus, durch den die durchmusterten Peptide direkt mit VEGF assoziiert sein könnten, um die Bindung von VEGF an seine auf der Oberfläche von vaskulären Endothelzellen vorhandenen Rezeptoren zu inhibieren, wurden die folgenden Experimente durchgeführt. Jedes der Hexapeptide wurde auf einer ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen in einer Konzentration von 100 ng/Vertiefung fixiert, indem eine 20%ige Essigsäurelösung, enthaltend jedes Peptid, darauf luftgetrocknet wurde. Die Platte wurde dreimal, jeweils für 3 min, mit einer phosphatgepufferten Salzlösung, enthaltend 0,1% Albumin, behandelt. Eine Lösung des ¹²⁵I-markierten VEGF in derselben phosphatgepufferten Salzlösung wurde in einer Konzentration von 0,2 ng/Vertiefung zu der Platte zugegeben und für 1 Stunde bei 37°C inkubiert, um eine Assoziation des markierten VEGF mit den Peptiden zu ermöglichen. Um die nicht assoziierten Peptide zu entfernen, wurde die Platte viermal, jeweils für 3 min, mit derselben phosphatgepufferten Salzlösung gewaschen. Anschließend wurde die Radioaktivität mit Hilfe eines Gammazählers gemessen. Die unspezifische Bindung wurde durch eine Inkubation in Gegenwart von entweder einer Mischung aus dem markierten VEGF und einem unmarkierten VEGF oder einer Mischung aus dem fixierten Peptid und dem nicht fixierten Peptid in einem Molverhältnis von 1:100 bestimmt. Dieser Wert wurde als negative Kontrolle genommen.
In 7 ist die Radioaktivität, welche für den ¹²⁵I-markierten VEGF in Assoziation mit den fixierten Peptiden gemessen wurde, gegen die Molverhältnisse eines Kompetitors, wie dem unmarkierten VEGF oder den freien Peptiden, zu seinem Gegenstück aufge tragen. Wie aus den Kurven in 7 ersichtlich ist, steht die Radioaktivität in einem umgekehrten Verhältnis zu dem Molverhältnis, was zeigt, daß die Peptide direkt mit VEGF assoziiert sind. Die Dissoziationskonstante (KD) zwischen VEGF und jedem Peptid wurde unter Verwendung des IC₅₀-Werts gemäß der folgenden Formel bestimmt (De Blasi A. et al., Trends Pharmacol. Sci. 10 (1989), 227).
KD = IC₅₀-[unmarkierter Kompetitor]
Die mittels der Formel bestimmten Dissoziationskonstanten betrugen 5 μM für die Sequenz 1,2 μM für die Sequenz 2 und 22 μM für die Sequenz 3. Aus diesen Ergebnissen wird deutlich, daß alle drei Peptide, welche durch die Durchmusterung der kombinatorischen Peptidbanken erhalten wurden, eine direkte und spezifische Assoziation mit VEGF eingehen.
In 8 sind die Strahlungsmengen angegeben, welche für den ¹²⁵I-markierten VEGF in Assoziation mit einer fixierten Sequenz in Abwesenheit und in Anwesenheit von Kompetitoren gemessen wurden. Wie aus dem Histogramm von 8 ersichtlich ist, wird die Bindung von VEGF an eine Sequenz in Gegenwart einer überschüssigen Menge der drei freien Kompetitoren praktisch vollständig verhindert. Diese Ergebnisse ermöglichen die Postulierung, daß die Sequenzen 1, 2 und 3 identische oder überlappende Bindungsdomänen auf VEGF besitzen.
Um diese Postulierung zu bestätigen, wurde die Sequenz 1 (RRKRRR) auf die gemeinsame Bindungsdomäne auf VEGF untersucht, da sie die höchste Wirksamkeit bezüglich der Inhibierung der Bindung von VEGF an seine Rezeptoren zeigte. Zuerst wurden geeignete Primer synthetisiert und zum Amplifizieren von verschiedenen cDNAs, welche VEGF₁₆₅, VEGF₁₂₁, VEGF_8-121, VEGF₁₀₉, und VEGF_8-109 codieren, verwendet, wobei eine menschliche Leber-cDNA-Bank (Clontech) als Matrize diente. Nach der Insertion in das Plasmid pRSET-A (Invitrogen) wurden die cDNAs sequenziert. Die erhaltenen fünf pRSET-A-Vektoren mit jeweils einer der fünf cDNAs wurden in einen Expressionsstamm (BL21 (DE3)pLyss), enthaltend eine T7-DNA-Polymerase, eingeschleust. Durch das Züchten dieser transformierten Zellen wurden die verschiedenen VEGFs als Einschlußkörper hergestellt, welche dann mittels einer bereits beschriebenen Methode (Siemeister G. et al., Biochem. Biophysics Res. Commun. 222 (1996), 249) in einer Reinheit von 90% oder höher isoliert wurden. Die gereinigten VEGFs wurden unter Verwendung eines Proteintest-Reagens (Bio-Rad) quantifiziert, wobei festgestellt wurde, daß alle an VEGF-Rezeproren binden und eine Aktivität als Wachstumsfaktor auf HUVECs ausüben. Jeder der gereinigten VEGFs wurde mit Hilfe von IODO-Beads (Pierce) mit ¹²⁵I (0,5 mCi/5 μg Protein) markiert. Vor der Verwendung wurde jedes markierte Protein durch einen ELISA (Enzym-gebundenen Immunadsorptionstest) mittels eines monoclonalen Maus-anti-VEGF-Antikörpers (R & D Systems) quantifiziert.
Jedes Peptid wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 auf eine antagonistische Aktivität gegenüber VEGF untersucht. In 9 ist die Radioaktivität, welche für einen ¹²⁵I-markierten VEGF in Assoziation mit der fixierten Sequenz 1 (RRKRRR) gemessen wurde, in Abwesenheit von Kompetitoren und in Anwesenheit von Kompetitoren für verschiedene VEGF-Isomere graphisch dargestellt. In Anbetracht der Tatsache, daß die Sequenz 1 (RRKRRR) nicht nur die Bindung eines markierten VEGF₁₆₅ an seine Rezeptoren, sondern auch die Bindung eines markierten VEGF₁₂₁, dem die Heparin-Bindungsdomäne fehlt, an seine Rezeptoren inhibierte, kann gefolgert werden, daß die Heparin-Bindungsdomäne von VEGF nicht an der Assoziation zwischen den Peptiden und VEGF beteiligt ist. In Anbetracht der Tatsache, daß die anderen VEGF-Isoformen, VEGF_8-121, VEGF₁₀₉ und VEGF_8-109, durch die Sequenz 1 nicht an der Bindung an ihre Rezeptoren gehindert wurden, wird angenommen, daß das Amino- und das Carboxyende von VEGF₁₂₁ eine Schlüsselrolle bei der Bindung des Peptids an VEGF spielt.
Beispiel 4: Test auf eine inhibitorische Aktivität von Peptiden, welche durch die dritte Durchmusterung ausgewählt wurden, gegenüber dem durch VEGF stimulierten Wachstum von vaskulären Endothelzellen
Um zu bestimmen, ob die Peptide, welche aus der Durchmusterung der kombinatorischen Peptidbanken erhalten wurden, und zwar die Sequenz 1, die Sequenz 2 und die Sequenz 3, die VEGF-induzierte DNA-Synthese von HUVECs inhibieren, wurde die folgende Untersuchung durchgeführt.
In einer gelatinebeschichteten Platte mit 48 Vertiefungen (Nunc) wurden HU-VECs in einer Dichte von 10⁴ Zellen/Vertiefung bei 37°C für einen Tag kultiviert. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit serumfreiem Medium 199 gewaschen. Nach der Zugabe von Kulturmedien, welche VEGF (10 ng/ml, R & D Systems) und verschiedene Konzentrationen der durchmusterten Peptide enthalten, wurden die Zellen bei 37°C gezüchtet. Nach einem Züchtungszeitraum von 24 Stunden wurde [Methyl-³H]-Thymidin (0,5 μCi/Vertiefung) zu den Zellen zugegeben, und die Zellen wurden noch einen weiteren Tag kultiviert. Vor der Quantifizierung der Radioaktivität, welche zum Nachweis der DNA-Synthese verwendet wurde, mit Hilfe eines Flüssigszintillationszählers wurden die Zellen mit PBS, enthaltend 0,1 % Albumin, gewaschen, mit 0,4 N NaOH bei Raumtemperatur für 20 min zur Zelllyse behandelt und mit 2 N HCl neutralisiert. Um die Toxizität der Peptide zu bestimmen, wurden die HUVECs wie vorstehend unter Verwendung einer überschüssigen Menge des Peptids (100 μM) in Abwesenheit von VEGF untersucht.
In 10a ist die prozentuale Inhibierung der DNA-Synthese gegen die Peptidkonzentration aufgetragen. Wie aus 10a ersichtlich ist, inhibieren alle durchmusterten Peptide die VEGF-induzierte DNA-Synthese von HUVECs in einem dosisabhängigen Muster bei IC₅₀-Werten im Bereich von 10 bis 20 μM.
In 10b wurde die Radioaktivität des Thymidins, welches in das Genom der HUVECs eingebaut wurde, in Abwesenheit der Peptide und in Anwesenheit von jeweils 100 μM der drei Peptide gemessen. Das Histogramm von 10b zeigt, daß die Peptide keinen direkten Einfluß auf das Wachstum der HUVECs haben, woraus gefolgert werden kann, daß die inhibitorische Aktivität der Peptide nicht direkt gegen die Zellen gerichtet ist.
Basierend auf den Ergebnissen der vorstehenden Experimenten wurde gefolgert, daß die drei Peptide die Bindung von VEGF an seine Rezeptoren blockieren, wodurch das VEGF-induzierte Wachstum von Endothelzellen spezifisch inhibiert wird.
Beispiel 5: Test auf eine inhibitorische Aktivität der ausgewählten Peptide gegenüber einer durch VEGF oder menschliche Krebszellen, welche VEGF sezernieren, induzierten Angiogenese
Um die Peptide auf eine antiangiogene Aktivität zu untersuchen, wurden CAMs (Chorionallantoismembranen) von Eiern darauf untersucht, ob die Peptide die durch VEGF induzierte Angiogenese inhibieren.
Befruchtete Eier (Pulmuwon, Korea) wurden bei 37°C und einer Luftfeuchtigkeit von 90% inkubiert. Nach dem Kultivieren während drei Tagen wurde den Eiern etwa 2 ml Albumin entnommen. Nach vier Tagen wurden die Umhüllung der Eier teilweise entfernt, um ein Fenster mit einer Größe von 2 × 2 cm zu erhalten.
Nach dem Mischen von VEGF (10 ng/Ei) mit verschiedenen Mengen der Peptide oder anderen Proben wurde 3 μl jeder Mischung auf ein Viertelstück eines Thermanox-Deckglases (Nunc) aufgetropft und getrocknet. Die Stücke wurden auf die CAM von 9 Tage alten, befruchteten Eiern aufgebracht.
Zwei Tage später wurden die Proben unabhängig voneinander durch zwei verschiedene Personen unter einem anatomischen Mikroskop untersucht, um festzustellen, ob durch die aufgetropften Proben neue Blutgefäße induziert werden oder nicht. Das Experiment wurde unter Verwendung von 10 oder mehr Eiern pro Probe mindestens dreimal wiederholt, und die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 5 angegeben.
<Tabelle 5>

^a Bestimmt durch Vergleich der Werte zwischen der Wasserprobe und den anderen Proben durch den Student-t-Test; statistisch signifikant, falls p < 0,05 ist.
^b Standardabweichung

Wie aus Tabelle 5 ersichtlich ist, wurde gezeigt, daß VEGF in dem Modelltest eine Angiogenese in einem Ausmaß von 33,6% induziert. Diese angiogene Aktivität wurde wirksam verringert, und zwar auf etwa 15,6%, wenn die Eiproben mit den Peptiden (1 μg/Ei) zusammen mit VEGF behandelt wurden, und auf etwa 18,8% wenn die Eiproben mit Protamin (50 μg/Ei), einem bekannten antiangiogener Faktor, zusammen mit VEGF behandelt wurden. Jedoch zeigte ein Kontrollpeptid (KKKKKK), das trotz seiner Eigenschaften, die mit denen der durchmusterten Peptide vergleichbar waren, nicht ausgewählt wurde, keine antiangiogene Aktivität, da es eine Angiogenese in einem Ausmaß von etwa 32.6% induzierte.
Um die Testergebnisse zu bestätigen, welche durch CAMs von Eiern erhalten wurden, wurde ein Experiment unter Verwendung von Kaninchenhornhäuten für einen in-vivo-Angiogenese-Test durchgeführt. Männliche New Zealand-Kaninchen mit einem Gewicht von 3 kg (SLC, Japan) wurden durch die intramuskuläre Injektion von Ketamin (44 mg/kg) betäubt. Anschließend wurden die Hornhäute unter Verwendung eines Skalpells (Bard-Parker # 11) auf einer Länge von 3 mm freipräpariert. VEGF (10 ng, R & D Systems) wurde allein oder in Kombination mit 1 μg eines Peptids mit der Aminosäuresequenz EEFDDA oder der Sequenz 1 (RRKRRR) auf ein Thermanox-Deckglas (Nunc) aufgetropft und unter keimfreien Bedingungen eingetrocknet. Im Anschluß daran wurden die Deckgläser auf die freipräparierten Bereiche aufgebracht, welche dann auf eine natürliche Heilung überwacht wurden. Pro Testgruppe wurden 6 Kaninchen verwendet, wobei bei allen Tieren ähnliche Ergebnisse beobachtet wurden. 16 Tage nach der Operation war die Angiogenese deutlich zu erkennen, und von den in der Hornhaut neu gebildeten Blutgefäßen wurden Aufnahmen gemacht (Nikon FS-2, Japan). In den Aufnahmen von 11 ist erkennbar, daß das Kontrollpeptid EEFDDA keinen Einfluß auf die VEGF-induzierte Angiogenese in der Kaninchenhornhaut hatte (11c), während die Angiogenese, welche in der Testgruppe, die mit VEGF allein behandelt wurde, eindeutig zu erkennen war ( 11A), in der Testgruppe, die gleichzeitig mit sowohl Sequenz 1 (RRKRRR) als auch VEGF behandelt wurde, vollständig inhibiert wurde (11B).
Die Ergebnisse aus den zwei vorhergehenden Experimenten sowie 10b zeigen zusammengenommen, daß die durchmusterten Peptide keinen direkten Einfluß auf das Wachstum von vaskulären Endothelzellen haben, aber die Bindung von VEGF an seine auf der Oberfläche von vaskulären Endothelzellen vorhandenen Rezeptoren blockieren, wodurch die VEGF-induzierte Angiogenese in vivo inhibiert wird.
Um die inhibitorische Aktivität der durchmusterten Peptide gegenüber der durch Krebszellen, welche VEGF sezernieren, induzierten Angiogenese zu bestätigen, wurde ein Experiment unter Verwendung von CAMs aus Eiern durchgeführt, wobei, wie oben er wähnt, den befruchteten Eiern Albumin entnommen wurde und auf den Eiern Fenster gebildet wurden. 10⁵ HT1080-Zellen (menschliche Fibrosarkomzellen) wurden mit 7,5 μg Kollagen Typ I (Rattenschwanz, Beckton Dickinson, USA) in einem Volumen von 5 μl vermischt und auf Viertelstücke von Thermanox-Deckgläsern aufgetropft, um Kollagenschwämme zu erhalten. Die CAMs von 10 Tage alten, befruchteten Eiern wurden mit den Kollagenschwämmen bedeckt und dann für 3 Tage bei 37°C inkubiert. Es wurden Blutgefäße beobachtet, welche durch die Krebszellen induziert worden waren. Diese Blutgefäße wurden wie vorstehend erwähnt photographiert (vgl. Tabelle 6 und 12).
<Tabelle 6>
VEGF sezernierende, menschliche Fibrosarkomzellen, die in CAMs von Eiern gezüchtet worden waren (10⁵ Zellen/Ei, 76%), zeigten eine typische "Speichenrad"-Struktur, wobei beobachtet wurde, daß CAMs von Eiern, welche gleichzeitig mit den durchmusterten Peptiden (100 ng/Ei, 36–43%) und den Krebszellen behandelt wurden, keine Angiogenese durchmachten. Jedoch zeigte das Kontrollpeptid mit statistischer Signifikanz keine inhibitorische Aktivität gegenüber den Krebszellen (100 ng/Vertiefung, 59%).
Beispiel 6: Test auf einen direkten Einfluß der durchmusterten Peptide auf eine menschliche Fibrosarkomzelllinie
Das folgende Experiment wurde durchgeführt, um festzustellen, ob die Peptide, welche eine antagonistische Aktivität gegenüber VEGF besitzen, einen direkten Einfluß auf das Wachstum von menschlichen Fibrosarkomzellen haben. Nach Züchtung der Krebszellen für einen Tag in einer Platte mit 96 Vertiefungen (Nunc) wurde DMEM, enthaltend verschiedene Konzentrationen der durchmusterten Peptide, zugegeben, und die Zellen wurden inkubiert. Zu den Zellen, die nach einer dreitägigen Inkubation noch am Leben waren, wurden 20 μl eines Tetrazoliumfarbstoffes (Cell Titer 96 Non-Radioactive Proli feration-Testkit, Promega) zugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 37°C für 4 Stunden. Das durch die lebensfähigen Zellen erzeugte Formazan wurde in 0,2 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und durch die Extinktion bei 570 nm quantifiziert. Die auf das Formazan zurückzuführende Extinktion ist proportional zu den lebenden Zellen.
In 13 ist die Zelllebensfähigkeit der menschlichen Fibrosarkomzellen gegen die Konzentrationen der Peptide aufgetragen. Wie aus 13 ersichtlich ist, hatten alle durchmusterten Peptide keinen direkten Einfluß auf das Wachstum der menschlichen Fibrosarkomzellen.
Aus den in diesem Experiment und in Beispiel 5 erhaltenen Ergebnissen wird deutlich, daß die durchmusterten Peptide ohne einen direkten Einfluß auf das Wachstum von menschlichen Fibrosarkomzellen die durch die Krebszellen induzierte Angiogenese inhibieren, indem sie die Bindung von VEGF, welcher durch die Krebszellen sezerniert wird, an seine auf der Oberfläche von vaskulären Endothelzellen vorhandenen Rezeptoren spezifisch blockieren.
Beispiel 7: Test auf eine Wirkung der durchmusterten Peptide auf menschliche Dickdarmkarzinomzellen (HM7)
Es wurde berichtet, daß der Erwerb einer angiogenen Fähigkeit für das Fortschreiten von Krebs entscheidend und für das fortgesetzte Wachstum von Krebsgeweben unerläßlich ist (Hanahan D. et al., Cell 86 (1996), 353; Skobe M. et al., Nature Med. 3 (1997), 1222). Es wurde auch gezeigt, daß die durchmusterten Peptide die Angiogenese in vivo wirksam inhibieren. Anhand dieser Information wurde das folgende Experiment durchgeführt, um festzustellen, ob die durchmusterten Peptide das Wachstum und die Metastasierung von Krebszellen wirksam inhibieren. 5 × 10⁶ HM7-Zellen wurden zusammen mit 0,5 μg/μl der Aminosäuresequenz EEFDDA oder der Sequenz 1 (RRKRRR) zu serumfreiem DMEM zugegeben und dann durch subkutane Injektion in vier Wochen alte, männliche Mäuse (thymusfreie Nacktmäuse, BALB/c/nu/nu, Charles River, Japan) eingebracht. Vom nächsten Tag an wurden den Mäusen eine Lösung jedes Peptids in PBS (0,5 μg/100 μl/Tag) durch subkutane Injektion während 15 Tagen verabreicht. Die Größe der auf diese Weise gebildeten Tumoren wurde regelmäßig gemessen, während das Tumorvolumen gemäß der folgenden Formel berechnet wurde: Tumorgröße = 0,5 × (Durchmesser)2 × Länge
Für ein Experiment in Zusammenhang mit der Metastasierung von Krebszellen in die Leber wurden Krebszellen in die Milz transplantiert. Dazu wurden 4 Wochen alte, männliche Mäuse (thymusfreie Nacktmäuse, BALB/c/nu/nu, Charles River, Japan) nach der Betäubung mit Diethylether einem Flankenschnitt unterzogen. Dann wurden 100 μl einer Mischung, enthaltend 10⁶ HM7-Zellen (eine menschliche Dickdarmkarzinomzelllinie) und 0,5 μg/μl der Aminosäuresequenz EEFDDA, KKKKKK oder der Sequenz 1 (RRKRRR), langsam in die Milz injiziert, gefolgt von der subkutanen Injektion jedes Pep tid, wie vorstehend erwähnt, für drei Wochen. Vier Wochen nach der Injektion wurde jeder Maus die Leber entnommen und bezüglich Gewicht und Größe und der Anzahl der gebildeten Metastasenknoten untersucht. Jede Testgruppe bestand aus 6–7 Mäusen. In einem Student-t-Test wurde ein p-Wert von weniger als 0,05 als statistisch signifikant angesehen. In dem Test unter Verwendung eines Tetrazoliumfarbstoffes (Cell Titer 96 Non-Radioactive Proliferation-Testkit, Promega) wurde für jedes Peptid gezeigt, daß es keinen Einfluß auf das Wachstum der Krebszellen hat (5 × 10³ Zellen/Vertiefung), so daß die Möglichkeit, daß die Toxizität des Peptids selbst das Wachstum und die Metastasierung der Krebszellen inhibieren könnte, ausgeschlossen werden konnte.
In 14 sind die Veränderungen bezüglich der Tumorgröße über den Injektionszeitraum dargestellt. Nach der fünfzehntägigen subkutanen Injektion zeigte die Sequenz EEFDDA keine Wirkungen, während das Peptid RRKRRR von Sequenz 1 die Tumorgröße um etwa 28% im Vergleich zur Kontrolle (PBS) verringerte. In 15 ist die Anzahl der Metastasenknoten und das Lebergewicht nach einer vierzehntägigen Injektion in Abhängigkeit von den injizierten Materialien gezeigt. Es konnte kein Unterschied im Hinblick auf die Metastasierung von Krebszellen zwischen den Gruppen, denen die Tumorzellen allein und zusammen mit der Sequenz EEFDDA injiziert wurden, festgestellt werden. Eine schwache inhibitorische Aktivität wurde in der Gruppe beobachtet, welche eine Injektion mit der Sequenz KKKKKK erhielt (etwa 80% der Kontrollgruppe, welcher nur PBS injiziert wurde). Im Gegensatz dazu wurde für die Testgruppe, welche eine Injektion mit dem Peptid RRKRRR von Sequenz 1 erhielt, eine hohe inhibitorische Wirkung nachgewiesen, da für diese Testgruppe im Hinblick auf die Anzahl der Metastasenknoten und das Lebergewicht nur Werte von 16% bzw. 33% im Vergleich zur Kontrollgruppe erhalten wurden. Daher ist es offensichtlich, daß die durchmusterten Peptide die Signaltransduktion von VEGF blockieren, wodurch das Wachstum und die Metastase von malignen Tumoren inhibiert wird.
Bei der klinischen Anwendung der Peptide mit den Sequenzen 1, 2 und 3 werden parenterale Wege bevorzugt. Die Peptide werden in einer wirksamen Dosis von 0,1 bis 100 μg/kg und vorzugsweise in einer Dosis von 0,5 bis 10 μg/kg einmal pro Tag während 2–3 Wochen injiziert.
Die Peptide mit den Sequenzen 1, 2 und 3 wurden durch das folgende Experiment auf eine akute Toxizität untersucht.
Beispiel 8: Test auf eine akute Toxizität bei Ratten nach einer nicht-oralen Verabreichung
Die Peptide mit den Sequenzen 1, 2 und 3 wurden unter Verwendung von sechs Wochen alten, spezifisch pathogenfreien (SPF) SD-Ratten auf eine akute Toxizität untersucht. An die in zwei Gruppen eingeteilten Ratten wurden Suspensionen der Peptide in 1 ml PBS in einer Dosis von 1 mg/kg durch intramuskuläre Injektion verabreicht. Nach der Verabreichung wurde die Tiere auf Todesfälle, klinische Symptome und Gewichtsver änderungen überwacht sowie serologisch und serobiochemisch untersucht. Die Ratten wurden einer Autopsie mit bloßem Auge unterzogen, um festzustellen, ob die abdominalen und thorakalen Organe geschädigt waren. Bei keinem der Tiere, denen die Peptide von Interesse verabreicht worden waren, wurden ein plötzlicher Tod oder wahrnehmbare klinische Symptome beobachtet. Zusätzlich wurden keine Anzeichen einer Toxizität im Hinblick auf eine Gewichtsveränderung, die serologischen Tests, die serobiochemischen Tests und die Autopsie beobachtet. Weiterhin zeigten Cytotoxizitätstests, daß die Peptide mit den Sequenzen 1, 2 und 3 weder Endothelzellen, menschliche Fibrosarkomzellen noch menschliche Dickdarmkarzinomzellen schädigen. Folglich wurden durch die Peptide mit den Sequenzen 1, 2 und 3 keine toxischen Veränderungen in den Ratten in einer Dosierung von 1 mg/kg hervorgerufen, wodurch gezeigt wurde, daß die Verbindungen sicher sind, wobei die lethale Dosis (LD₅₀) davon bei der Verabreichung über einen nicht-oralen Weg mindestens 1 mg/kg beträgt.
Wie nachstehend beschrieben, sind die erfindungsgemäßen Peptide mit VEGF assoziiert, wodurch sie seine Bindung an Rezeptoren auf der Oberfläche von vaskulären Endothelzellen blockieren und dadurch die hormonale Aktivität von VEGF, welche mit der Angiogenese in Beziehung steht, inhibieren. Da Krebszellen den VEGF sezernieren, um neue Blutgefäße für ihr Wachstum und ihre Metastasierung zu bilden, sind die erfindungsgemäßen Peptide auch nützlich, um das Wachstum und die Metastasierung von Krebszellen zu inhibieren. Daher können die erfindungsgemäßen Peptide dank ihrer außerordentlichen Fähigkeit, die Bindung von VEGF an seine Rezeptoren zu inhibieren, als therapeutische Mittel für Angiogenese-bedingte Erkrankungen einschließlich Krebs, diabetische Retinopathie und rheumatoide Arthritis verwendet werden. Zusätzlich wird durch antiangiogene Krebstherapien unter Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide das Wachstum von normalen Zellen (vaskulären Endothelzellen) des Wirtes, aber nicht das Wachstum der Krebszellen selbst inhibiert, so daß erwartet wird, daß sie die Probleme herkömmlicher Krebstherapien, welche auf die Vielseitigkeit und Resistenz der Krebszellen zurückzuführen sind, überwinden.

Claims

Peptid, bestehend aus sechs Aminosäureresten, welches Arginin an der ersten, der vierten und der sechsten Position vom Aminoende, eines ausgewählt aus Arginin, Lysin und Histidin an der zweiten Position und eines ausgewählt aus Arginin und Lysin an der dritten und der fünften Position umfasst, ausgenommen das Peptid, welches die Aminosäuresequenz ArgArgArgArgArgArg umfasst, als eine pharmazeutische Verbindung.
Peptid gemäß Anspruch 1, welches die Aminosäuresequenz ArgArgLysArgArgArg umfasst.
Peptid gemäß Anspruch 1, welches die Aminosäuresequenz ArgLysLysArgLysArg umfasst.
Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 als eine pharmazeutische Verbindung zur Inhibierung der Aktivität des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors.
Verwendung eines aus sechs Aminosäureresten bestehenden Peptids, welches Arginin an der ersten, der vierten und der sechsten Position vom Aminoende, eines ausgewählt aus Arginin, Lysin, und Histidin an der zweiten Position und eines ausgewählt aus Arginin und Lysin an der dritten und der fünften Position umfasst, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs, diabetischer Retinopathie und rheumatoider Arthritis.
Verwendung gemäß Anspruch 5, worin das Peptid die Aminosäuresequenz ArgArgLysArgArgArg umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 5, worin das Peptid die Aminosäuresequenz ArgLysLysArgLysArg umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 5, worin das Peptid die Aminosäuresequenz ArgArgArgArgArgArg umfasst.