DE60036025T2

DE60036025T2 - Verfahren zur behandlung von hautkrebs mittels zusammensetzungen, die einen endothelinrezeptor-b-hemmer enthalten

Info

Publication number: DE60036025T2
Application number: DE60036025T
Authority: DE
Inventors: Paul H. Altadena PATTERSON; Ronit Le Coutre-Lahav
Original assignee: California Institute of Technology CalTech
Current assignee: California Institute of Technology CalTech
Priority date: 1999-06-29
Filing date: 2000-06-29
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2020-06-30
Also published as: ES2292454T3; AU6065000A; ATE369871T1; CY1108778T1; CA2376912A1; EP1280552A2; WO2001000198A2; DE60036025D1; EP1280552B1; DK1280552T3; US6545048B1; PT1280552E; WO2001000198A3

Description

Alleine ein Drittel aller Individuen in den Vereinigten Staaten entwickelt Krebs. Obgleich die 5-Jahres-Überlebensrate bedeutend um nahezu 50 % gestiegen ist, und zwar als Ergebnis des Fortschritts der frühzeitigen Diagnose und Therapie, so bleibt Krebs dennoch an zweiter Stelle nach Herzerkrankungen die Haupt-Todesursache in den Vereinigten Staaten. 20 % der Amerikaner sterben an Krebs, davon die Hälfte an Lungen-, Brust- und Darmkrebs. Darüber hinaus stellt auch der Hautkrebs eine große Gesundheitsgefährung dar.
Die Entwicklung von effektiven Behandlungen für Krebspatienten stellt eine größere Herausforderung dar. Die gegenwärtigen Behandlungsansätze einer chirurgischen Entfernung, einer externen Strahlentherapie und/oder einer systemischen Chemotherapie waren zwar bei einigen bösartigen Arten von Erkrankungen teilweise erfolgreich, zeigten jedoch bei anderen dieser Erkrankungen keine befriedigende Ergebnisse. Ein Ansatz zur Behandlung von Krebs ist die Induktion der Apoptose (des Zelltodes) bestimmter Tumorzellen; aus diesen Gründen sind die Mechanismen, mit denen die Apoptose induziert wird, von Interesse. Ein solcher Mechanismus wurde beschrieben, bei welchem der Fas-Ligand, (FasL) (auch als CD95L und APO-IL bezeichnet), ein Zelloberflächenmolekül, das zu der Familie der Tumornekrosefaktoren gehört, die Apoptose von Fas-tragenden Tumorzellen induziert. Seino et al., Nature Med., 3(2): 165 (1997).
Bei einem anderen Ansatz sind Krebszelllinien charakterisiert worden. So wurde bspw. berichtet, dass sämtliche humanen Melanomzelllinien, die in einer Reihe von Versuchen untersucht wurde, den Endothelin-B-Rezeptor (ETRB) exprimieren (Yohn et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 201: 449-57 (1994); Kikuchi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 219: 734-9 (1996): Ohtani et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 234: 526-30 (1997); Zhang et al., Brit. J. Cancer, 78: 1141-6 (1988); darüber hinaus steht die Expression mit deren Differenzierungsstatus in Zusammenhang. Eine erhöhte Expression des Endothelin-A-Rezeptors (ETRA) ist mit einer induzierten Differenzierung von A375 Melanomzellen verbunden, wohingegen diese Zellen überwiegend ETRB in ihrem malignem Zustand exprimieren (Ohtani et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 234: 526-30 (1997)). Leider ist die Rolle der Endothelinrezeptoren (ETRB) aus den früheren Versuchen nicht klar. Während ein Bericht darauf hindeutet, dass Endothelin-1 (ET1), über ETRB wirkend, mitogene und chemokinetische Effekte auf Melanomzellen bewirkt (Mohn et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 201: 449-57 (1994)), so legte ein anderer Bericht andere Mechanismen für ET1 nahe (Okazawa et al., J. Biol. Chem., 273: 12584-92 (1998)). Darüber hinaus war zumindest in einer Studie in Sachen Bluthochdruck der Fokus auf ETRB (Hashimoto et al., Biol. Pharm. Bull., 21(8): 800-804 (1998)). Darüber hinaus wurde auch über Endothelin-3 (ET3) berichtet, doch betreffen solche Berichte die Entwicklung nicht-maligner (normaler) Zellen (Lahau et al., PNAS, 93: 3892-7 (1996)).
Hinsichtlich maligner Zellen wurden Untersuchungen über eine ETRA- und ET1-Aktivität vorgelegt, jedoch wurden diese Untersuchungen in vitro durchgeführt. Siehe bspw. Nelson et al., Cancer Res., 56: 663-8 (1996).
Die WO 00/36918 stellt einen Teil des Standes der Technik gemäß Artikel 54(3) und (4) EPC dar, und offenbart die Verwendung von Ro61 zur Induzierung eines apoptotischen Zelltodes von Melanomen. Daher ist in den vorliegenden Ansprüchen die Verwendung von Ro61 ausgenommen.
Daher besteht ein weiteres Bedürfnis, Verbindungen zu identifizieren, die in vivo zur Behandlung von Krankheiten wie Krebs eingesetzt werden können. Insbesondere besteht ein Bedürfnis, in der Lage zu sein, gezielt maligne Zellen zu selektieren und einen Zelltod zu induzieren.
ZUSAMMENFASSENDE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Mit der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Inhibitors des Endothelin-B-Rezeptors für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Hautkrebs bereitgestellt, unter der Voraussetzung, dass der Inhibitor nicht Ro61 ist.
In einer Ausführungsform wird mit der Erfindung die Verwendung von einem Inhibitor einer Endothelin-B-Rezeptor-Aktivität in einer therapeutisch effektiven Menge zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verabreichung an ein Individuum bereitgestellt, das eine Behandlung bezüglich Hautkrebs benötigt. Die Verabreichung kann durch eine Vielzahl von Verfahren durchgeführt werden, die im Stand der Technik bekannt sind, und die eine direkte Verabreichung an die Tumorstelle mit einschließen, oder vorzugsweise eine systemische Verabreichung.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der Krebs metastasierend.
Bei einer Ausführungsform ist der Inhibitor ein Endothelin-B-Rezeptor-Antagonist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Inhibitor BQ788 oder ein Derivat davon. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der Inhibitor ein Antisense-Molekül für eine Endothelin-Rezeptor-Nucleinsäure oder eine Endothelin-Rezeptor-Agonist-Nucleinsäure.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein in vitro-Verfahren zur Induzierung der Differenzierung einer Zelle bereit, welche einen Endothelin-B-Rezeptor enthält, vorausgesetzt, dass der Inhibitor nicht Ro61 ist. Bei einer Ausführungsform umfasst das Verfahren die Verabreichung eines Inhibitors eines Endothelin-B-Rezeptors zu der Zelle, und zwar in einer Menge, mit der die Differenzierung induziert wird. Bei einer noch weiteren Ausführungsform wird ein in vitro-Verfahren zur Induzierung der Apoptose in einer Zelle bereitgestellt. Ein Verfahren umfasst die Verabreichung eines Inhibitors eines Endothelin-B-Rezeptors – außer Ro61 – an diese Zelle, und zwar in einer Menge, mit der Apoptose induziert wird. Die Zelle ist vorzugsweise eine Krebszelle.
In einem anderen Aspekt wird die Verwendung einer Substanz zur Herstellung eines Arzneimittels zur Abgabe an Hautkrebszellen eines Individuums bereitgestellt. Die Verwendung umfasst die Konjugation einer Substanz an BQ788 oder eines Derivats davon zur Bildung eines Konjugats, und die Verabreichung dieses Konjugats an ein Individuum.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die 1A-1F zeigen Bilder, welche zeigen, dass der ETRB-Antagonist BQ788 morphologische Änderungen in den kultivierten Melanomzellen induziert. Die Zellen wurden 4 Tage lang mit 100 μM BQ788 (Figuren A, C und E) oder mit einem Vehikel (Figuren B, D und F) kultiviert. Die Zelllinien waren die Melanomlinien SK-MEL 28 (Figuren A und B), die Melanomlinie SK-MEL 5 (Figuren C und D) und Niere 293 (Figuren E und F). Die Arzneimittel-behandelten Melanomzellen zeigen eine unterschiedliche Form und eine Akkumulierung eines schwarzen Pigments. Die Bilder wurden mit Hellfeld-Optiken bei 40facher Vergrößerung aufgenommen.
2 ist ein Diagramm, das anzeigt, dass BQ788 die Anzahl der lebenden Zellen in kultivierten Melanomzellen, jedoch nicht in Nierenzellen, reduziert. Die Zellen wurden in Gegenwart von BQ788 oder einem Vehikel oder ohne Behandlung 4 Tage lang kultiviert. Drei Wells jeder Kultivierungsbedingung wurden dem MTS-Assay unterzogen. Die Mittelwerte wurden berechnet und als Prozentsatz der Vehikelbehandelten Werte plus S.E.M. berechnet. P-Werte wurden unter Verwendung des Tests für absolute Werte berechnet. Der Versuch wurde dreimal wiederholt, wobei jedes Mal ähnliche Ergebnisse erzielt wurden.
3A und 3B zeigen Bilder von Gelen, die RT-PCR-Ergebnisse zeigen, woraus die Expression von ETRB- und ETRA-mRNA in verschiedenen Zelllinien ersichtlich ist. Die Banden entsprechen den ETRB- (3A) (220 bp) und ETRA- (3B) (352 bp) mRNAs, und wurden unter Verwendung veröffentlichter Primersequenzen und – protokolle erhalten (21).
4 ist ein Diagramm, das anzeigt, dass der selektive ETRA-Antagonist BQ123 die Anzahl der lebenden Zellen in kultivierten Melanomzellen nicht reduziert. Die Bedingungen und die Darstellung sind wie für das in 2 gezeigte BQ788-Experiment beschrieben.
5 ist ein Diagramm, mit welchem gezeigt wird, dass der ETRB-selektive Agonist Sarafotoxin 6c (S6c) die Effekte von BQ788 auf Melanomzellen aufheben kann. S6c wurde in Versuchen, die ähnlich waren zu denjenigen aus 2, hinsichtlich dessen Wirkung auf kultivierte A375-Zellen getestet, entweder alleine oder in Kombination mit BQ788 mit unterschiedlichen Konzentrationen. Der ETRB-Agonist S6c stimuliert das Zellwachstum und kann die inhibitorischen Effekte des ETRB-Antagonisten blockieren.
6 ist ein Diagramm, mit welchem gezeigt wird, dass eine intra-tumorale Injektion von BQ788 das Melanomwachstum in Nacktmäusen inhibieren kann. Nacktmäusen (nu/nu, BALG/c-Hintergrund) wurden Transplantate mit A375-Zellen subkutan in die Flanken implantiert. Sobald die Tumoren einen Durchmesser von ungefähr 4 mm erreicht hatten, wurde täglich BQ788 9 Tage lang injiziert. Lotrechte Tumordurchmesser wurden täglich gemessen, um das Tumorvolumen zu bestimmen. Mit dem gleichen Verabreichungsplan wurden Kontrollen mit einem Vehikel injiziert. Die Daten aus 3 Versuchen, bei welchen 10 BQ788-behandelte Mause und 8 Vehikelbehandelte Mause eingesetzt wurden, wurden gepoolt. P-Werte wurden unter Ver wendung des t-Tests berechnet. Ähnliche Schlussfolgerungen wurden mit der Messung der Tumorgewichte erzielt.
Die 7A und 7B sind Diagramme, in welchen gezeigt wird, dass die systemische Verabreichung von BQ788 das Melanomtumorwachstum in Nacktmäusen inhibiert. Der Versuch war ähnlich zu dem in 6 beschriebenen, mit der Ausnahme, dass das Arzneimittel und das Vehikel täglich intraperitoneal injiziert wurden. In 7A wurden die Daten für die 6 BQ788-behandelten Mäuse gepoolt. In 7B sind für die Daten der 3 Mause, in welchen BQ788 das Tumorwachstum verlangsamte, sowie für die Daten von den 3 Mäusen, in welchen BQ788 eine Tumorregression bewirkte, in getrennten Kurven dargestellt.
8A-8G sind Fotografien, in denen eine TUNEL-Färbung der Tumoren gezeigt ist, welche zeigen, dass BQ788 Apoptose induziert. Die 8A-8D zeigen repräsentative Schnitte aus 4 Tumoren von BQ788-injizierten Mäusen, und die 8E-8G zeigen Tumoren von Vehikel-injizierten Mäusen. TUNEL-positive Zellen sind in den Arzneimittel-behandelten Tieren vergleichsweise größer, was auf eine verstärkte Apoptose hindeutet. Die Vergrößerung ist 20fach.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Vorliegend werden Verwendungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Hautkrebs bereitgestellt. In einigen Fällen kann die Behandlung von Krebs auch die Behandlung von festen Tumoren oder die Behandlung von Metastasen mit einschließen. Metastasen sind eine Krebsform, bei welcher transformierte oder bösartige Zellen ausstreuen und den Krebs von einer Stelle an eine andere ausbreiten. Hautkrebs schließt maligne Melanome mit ein, ferner Basalzellenkarzinome, Plattenepithelkarzinome, Karposi-Sarcome, Leberflecke, dysplastische Muttermale, Lipome, Angiome, Dermatofibrome, Wulstnarben und Psoriasis. Der Krebs ist am bevorzugtesten ein malignes Melanom. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist Krebs ein metastasierendes Melanom. Der Ausdruck "kanzeröse Zelle", wie er hierin ver wendet wird, schließt eine Zelle mit ein, die mit einer der hierin beschriebenen kanzerösen Konditionen behaftet ist.
Das Individuum, oder der Patient, ist im Allgemeinen ein Mensch, obwohl den Fachleuten klar sein wird, dass der Patient genau so gut auch ein Tier sein kann. Daher sind auch andere Tiere, einschließlich Säugetiere, wie bspw. Nagetiere (einschließlich Mäuse, Ratten, Hamster und Meerschweinchen), Katzen, Hunde, Kaninchen, landwirtschaftliche Nutztiere, einschließlich Kühe, Pferde, Ziegen, Schafe, Schweine, etc. sowie Primaten (einschließlich Affen, Schimpansen, Orang-Utans und Gorillas) von der Definition des "Patienten" umfasst.
In einer Ausführungsform inhibiert ein Inhibitor der ETRB-Aktivität, wie hierin definiert, Hautkrebswachstum oder reduziert die Proliferation um zumindest 30 %, bevorzugter um 40 %, noch bevorzugter um 50 %, noch bevorzugter um 70 %, noch bevorzugter um 90 % und am bevorzugtesten um mindestens 95 %. In einer bevorzugten Ausführungsform bewirkt der ETRB-Inhibitor eine Tumorregression um mindestens 30 %, bevorzugter um 40 %, noch bevorzugter um 50 %, noch bevorzugter um 70 %, noch bevorzugter um 90 % und am bevorzugtesten um mindestens 95 %. Die Bestimmung der Inhibierung oder Regression kann durch einen Vergleich der Wirkung der Behandlung wie hierin beschrieben vorgenommen werden, und zwar gegenüber einer Kontrollprobe, bei der die Behandlung mit bspw. einem Inhibitor des Endothelinrezeptors nicht vorgesehen ist. In einigen Fällen kann die Kontrollprobe einen Tumor haben, der auf das zweifache, dreifache oder vierfache des Volumens des Gewebes anwächst, das gemäß den hierin beschriebenen Verfahren behandelt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wachsen behandelte Tumoren mindestens sechsmal langsamer als die Kontrollen.
In einer Ausführungsform besitzt ein ETRB-Aktivitäts-Inhibitor eine ETRB-Inhibitor-Aktivität. Eine ETRB-Inhibitor-Aktivität schließt eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften mit ein: Inhibieren des kanzerösen Wachstums, Regression des Krebswachstums, Induktion von Apoptose in einer kanzerösen Zelle, Induktion der Differenzierung in einer kanzerösen Zelle, Induzierung einer Pigmentierung in einer kanzerösen Zelle, Entgegenwirken gegen ET3, ET2 und/oder ET1, Binden an ETRB, vorzugsweise selektiv, und Entgegenwirken gegen S6c. Vorliegend wird jede Kombination dieser Eigenschaften einschließlich aller oder einer oder mehrerer mit einer oder mehreren Ausnahmen bereitgestellt.
Ein ETRB-Aktivitäts-Inhibitor oder ein ETRB-Inhibitor, wie er hierin beschrieben wird, schließt BQ788 und andere Verbindungen mit ein, die ETRB-Inhibitoren sind, die eine ETRB-Inhibitoraktivität besitzen. BQ788 (N-cis-2,6-Dimethylpiperidin-carbonyl-L-γ-methylleucyl-D-1-methoxycarbonyl-tryptophanyl-D-norleucin) wurde bereits zuvor beschrieben, siehe bspw. Ishikawa et al., PNAS, 91: 4892-4896 (1994). Derivate von BQ788, wie sie hierin verwendet werden, sind funktionell äquivalent mit BQ788, und zwar darin, dass sie eine ETR-, vorzugsweise eine ETRB-, Inhibitoraktivität besitzen. Andere ETRB-Inhibitoren schließen IRL1083, RES7011, RES7013, PD142983 und IRL2500 mit ein, sind jedoch nicht hierauf beschränkt.
In einer anderen Ausführungsform bindet der ETRB-Inhibitor an mehr als einen ETR. Daher kann in einer Ausführungsform der ETRB-Inhibitor aus der Gruppe ausgewählt sein, die aus LU302872, TAK044, PD142893, PD145065, BE18257A/W7338A, Bosentan (RO47-0203), SB217242, RO468443, SB209670, Tnieno[2,3-d]pyrimidin-3-Essigsäuren, RO610612, RO462005, PD156252, A182086, L744453 und L754142 besteht.
In einem anderen Aspekt der Erfindung ist der ETRB-Inhibitor ein Antisense-Molekül der Nucleinsäure, die für einen ETRB oder einen nativen ETRB-Liganden codiert, wie bspw. ET1, ET2 oder ET3. Antisense-Moleküle schließen Oligonucleotide mit ein, die eine einzelsträngige Nucleinsäuresequenz (entweder RNA oder DNA) aufweisen, die dazu in der Lage ist, an Target-Rezeptor- oder Liganden-mRNA- (Sense) oder -DNA-(Antisense)-Sequenzen zu binden. Antisense- oder Sense-Oligonucleotide, weisen gemäß der vorliegenden Erfindung ein Fragment der codierenden Region des Rezeptors oder Liganden auf. Ein solches Fragment umfasst im Allgemeinen mindestens 14 Nucleotide, vorzugsweise von ungefähr 14 bis 30 Nucleotide. Die Möglichkeit, ein Antisense- oder ein Sense-Oligonucleotid abzuleiten, das auf einer cDNA-Sequenz basiert, welche für ein bestimmtes Protein (vorzugsweise für ein im Stand der Technik beschriebenes) codiert, ist bspw. beschrieben in Stein et al., Cancer Res., 48: 2659 (1988) und van der Krol et al., BioTechniques, 6: 958 (1988). Antisense- oder Sense-Oligonucleotide umfassen ferner Oligonucleotide mit einem modifizierten Zucker-Phosphodiester-Grundgerüst (oder anderen Zuckerverbindungen, wie bspw. diejenigen, die in der WO 91/06629 beschrieben sind), und bei welchen solche Zuckerbindungen resistent gegenüber endogenen Nucleasen sind. Solche Oligonucleotide mit resistenten Zuckerbindungen sind in vivo stabil (das heißt, dazu in der Lage, einem enzymatischen Abbau zu widerstehen), behalten jedoch die Sequenzspezifität, um an Target-Nucleotidsequenzen zu binden.
Andere Beispiele für Sense- oder Antisense-Oligonucleotide schließen diejenigen Oligonucleotide mit ein, die kovalent mit organischen Anteilen verbunden sind, wie diejenigen, die in der WO 90/10048 beschrieben sind, und andere Anteile, die die Affinität des Oligonucleotids für eine Target-Nucleinsäuresequenz erhöhen, wie bspw. Poly-(L-Lysin). Auch können interkalierende Substanzen, wie bspw. Ellipticin und alkylierende Agenzien oder Metallkomplexe an Sense- oder Antisense-Oligonucleotide angebracht werden, um die Bindespezifitäten der Antisense- oder Sense-Oligonucleotide für die Target-Nucleotidsequenz zu modifizieren.
In einem anderen Aspekt ist der ETRB-Inhibitor ein Inhibitor des Endothelin-umwandelnden Enzyms (ECE), welches Endothelin-Vorläufer verarbeitet. ECE-Inhibitoren schließen CGS26303 und Phosphoramidon mit ein, sind jedoch nicht hierauf beschränkt. Auch ECE-Antisense-Moleküle können verwendet werden.
In einer Ausführungsform wird der Inhibitor für den Endothelin-B-Rezeptor an eine Zelle oder ein Individuum verabreicht, bevor dieser/dieses Hautkrebs entwickelt. So kann bspw. eine Person, für die das Risiko der Entwicklung von Hautkrebs besteht, mit einer Zusammensetzung behandelt werden, welche einen Inhibitor für den Endothelin-B-Rezeptor aufweist, um die Entwicklung der Krankheit oder des Krank heitszustandes zu verhindern oder zu inhibieren. Es versteht sich, dass die hierin beschriebenen Zusammensetzungen spezifisch für abnormale oder erkrankte Zellen sind, und auf normale, bspw. nicht-maligne Zellen keinen inhibitorischen Effekt haben. Daher können die Zusammensetzungen den Zellen bereits vor dem Krankheitszustand verabreicht werden, wobei sie auch noch aktiv sind, nachdem der Krankheitszustand induziert worden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform jeder der hierin bereitgestellten Verwendungen wird der Inhibitor, wie er hierin beschrieben ist, einer Zelle verabreicht, welche einen Endothelin-B-Rezeptor aufweist. Endothelin-B-Rezeptoren kommen zumindest im Endothel und in den nicht-vaskulären Geweben, bspw. der Leber, Niere und dem Gehirn, vor. Die Rezeptoren kommen auch in bestimmten Gefäßgeweben mit glatter Muskulatur vor. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Endothelin-B-Rezeptor exprimiert, jedoch auf einem vergleichsweise niedrigen Level im Vergleich zu Expressionslevel in anderen malignen Zellen. In einer Ausführungsform wird daher mit einem relativ niedrigen ETRB-mRNA-Level in einer malignen Zelle eine positive Prognose bereitgestellt.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein in vitro-Verfahren zur Induzierung der Differenzierung in einer Melanomzelle bereitgestellt. Die Identifizierung der Differenzierung kann mittels Standardtechniken des Standes der Technik bestimmt werden, einschließlich der Identifizierung morphologischer Änderungen. Die Zelle weist einen Endothelin-B-Rezeptor auf.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein in vitro-Verfahren zur Induktion der Apoptose in einer Melanomzelle bereitgestellt. Das Verfahren zur Induktion der Apoptose umfasst die Verabreichung eines Inhibitors eines Endothelin-B-Rezeptors an die Zelle, und zwar in einer Menge, mit der Apoptose induziert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Inhibitor spezifisch für einen ETRB. Noch bevorzugter ist der Inhibitor BQ788 oder ein BQ788-Derivat. In einer Ausführungsform wirkt der Inhibitor nicht gegen Endothelin-1 (ET-1). Ein charakteristisches Merkmal der Apoptose ist die Aktivierung einer Kaskade cytoplasmatischer Proteasen, das in die Spaltung ausgewählter Target-Proteine resultiert. Die Zelle wird mit Hautkrebs befallen. Standardisierte Kits zur Identifizierung von Zellen, die eine Apoptose durchmachen, wie z.B. das TUNEL-Verfahren, sind im Stand der Technik bekannt. Darüber hinaus kann eine Apoptose durch einen signifikanten Anstieg von hypodiploiden Zellen, einer Chromatin-Kondensation und/oder DNA-Fragmentierung identifiziert werden.
Vorliegend wird ein Verfahren zum Screenen für einen bioaktiven Stoff beschrieben, der die Bindung an einen Endothelinrezeptor, vorzugsweise an einen Endothelin-B-Rezeptor sowie einen Liganden, stören kann. Ein Ligand ist eine Verbindung oder eine Zusammensetzung, die an den Rezeptor bindet. Der Ligand ist vorzugsweise ein Agonist oder ein Antagonist. Noch bevorzugter wird mit dem Verfahren nach einer Wechselwirkung zwischen Agonist und Rezeptor gescreent. Ein Agonist induziert, verstärkt oder hält die ETR-Aktivität aufrecht, wohingegen ein Antagonist die ETR-Aktivität inhibiert.
Die Identifizierung von Auswirkungen eines ETR-Inhibitors auf eine Zelle ermöglicht es, Arzneimittel-Screening-Assays hinsichtlich Verbindungen auszugestalten, welche an ETR binden, oder die Bindung an ETR beeinträchtigen, und hinsichtlich Verbindungen, die die ETR-Aktivität modulieren.
Die Verfahren umfassen die Kombination eines ETR-Liganden, vorzugsweise eines ETR-Inhibitors oder -Agonisten, und eines in Frage kommenden bioaktiven Stoffes, sowie die Bestimmung der Bindung von ETR und ETR-Ligand. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Agonist eingesetzt. Der ETR ist vorzugsweise ein ETRB. Wenn sich die Bindung in Gegenwart des in Frage kommenden bioaktiven Stoffes ändert, so wird der in Frage kommende bioaktive Stoff als ein Stoff identifiziert, der in die Bindung zwischen einem ETR und einem ETR-Liganden eingreift. Der ETRB-Ligand ist vorzugsweise ein Agonist, der ETR3 oder S6c mit einschließt. In anderen Ausführungsformen, die nachstehend diskutiert werden, wird die Bioaktivität bestimmt.
Der Ausdruck "in Frage kommender bioaktiver Stoff" oder "exogene Verbindung", wie sie hierin verwendet werden, beschreibt jedes Molekül, bspw. Protein, kleines organisches Molekül, Kohlenwasserstoffe (einschließlich Polysaccharide), Polynucleotide, Lipide, etc. Im Allgemeinen werden verschiedene Assay-Mischungen parallel gestartet, und zwar mit unterschiedlichen Stoffkonzentrationen, um differenzielle Antworten auf die verschiedenen Konzentrationen zu erhalten. Typischerweise dient eine dieser Konzentrationen als Negativkontrolle, das heißt als Null-Konzentration oder unterhalb des Detektionslevels.
In Frage kommende Stoffe umfassen zahlreiche chemische Klassen, obgleich sie typischerweise organische Moleküle darstellen, vorzugsweise kleine organische Verbindungen mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 und weniger als ungefähr 2.500 Dalton. In Frage kommende Stoffe weisen funktionelle Gruppen auf, die für die strukturelle Wechselwirkung mit Proteinen notwendig sind, insbesondere eine Wasserstoffbrückenbildung, und schließen typischerweise zumindest eine Amin-, Carbonyl-, Hydroxyl- oder Carboxylgruppe mit ein, vorzugsweise mindestens zwei der funktionellen chemischen Gruppen. Die in Frage kommenden Stoffe weisen oftmals cyclische Kohlenstoff- oder heterocyclische Strukturen auf, und/oder aromatische oder polyaromatische Strukturen, die mit einem oder mehreren der oben genannten funktionellen Gruppen substituiert sind. In Frage kommende Stoffe werden auch unter den Biomolekülen gefunden, einschließlich den Peptiden, Sacchariden, Fettsäuren, Steroiden, Purinen, Pyrimidinen, Derivaten, strukturelle Analoga oder Kombinationen davon.
In Frage kommende Stoffe werden aus einer breiten Vielzahl von Herkunftsquellen gewonnen, einschließlich aus Bibliotheken synthetischer oder natürlicher Verbindungen. So sind bspw. zahlreiche Mittel zur zufälligen und gerichteten Synthese einer breiten Vielzahl von organischen Verbindungen und Biomolekülen verfügbar, einschließlich der Expression randomisierter Oligonucleotide. Alternativ sind Bibliotheken natürlicher Verbindungen in Form von bakteriellen, Pilz-, Pflanzen- und Tierextrakten verfügbar, oder einfach herzustellen. Darüber hinaus können natürliche oder synthetisch hergestellte Bibliotheken und Verbindungen durch konventio nelle chemische, physikalische und biochemische Mittel einfach modifiziert werden. Bekannte pharmakologische Stoffe können einer gerichteten oder zufälligen chemischen Modifizierung unterzogen werden, wie bspw. einer Acylierung, Alkylierung, Veresterung, Amidierung, um strukturelle Analoga herzustellen.
Eine Bibliothek unterschiedlicher, in Frage kommender, bioaktiver Stoffe wird eingesetzt. Die Bibliothek sollte vorzugsweise eine hinreichend strukturell unterschiedliche Population randomisierter Stoffe bereitstellen, um einen hinreichend wahrscheinlichen Diversitätsbereich zu bewirken, um die Bindung an ein bestimmtes Ziel zu ermöglichen. Dementsprechend sollte eine Wechselwirkungsbibliothek groß genug sein, so dass zumindest eines ihrer Elemente eine Struktur haben wird, die eine Affinität für das Target aufweist. Obgleich es schwer ist, die notwendige absolute Größe einer Wechselwirkungsbibliothek anzugeben, stellt die Natur einen Hinweis darauf mit der Immunantwort bereit: eine Diversität von 10⁷-10⁸ unterschiedlichen Antikörpern sorgt für zumindest eine Kombination mit hinreichender Affinität, um mit den meisten möglichen Antigenen, denen ein Organismus ausgesetzt ist, in Wechselwirkung zu treten. Veröffentlichte in vitro-Auswahlverfahren haben ferner gezeigt, dass eine Bibliotheksgröße von 10⁷ bis 10⁸ ausreichend ist, Strukturen mit einer Affinität für das Target aufzufinden. Eine Bibliothek aller Kombinationen eines Peptids mit 7 bis 20 Aminosäuren in Länge, wie sie im Allgemeinen hierin vorgeschlagen werden, hat das Potenzial, für 20⁷ (10⁹) bis 20²⁰ zu kodieren. Daher ermöglichen die vorliegenden Verfahren mit Bibliotheken aus 10⁷ bis 10⁸ unterschiedlichen Molekülen ein "Arbeits-"Pool einer theoretisch vollständigen Wechselwirkungsbibliothek für 7 Aminosäuren, und einen Formpool für die 20²⁰-Bibliothek. Daher werden in einer bevorzugten Ausführungsform mindestens 10⁶, vorzugsweise mindestens 10⁷, und noch bevorzugter mindestens 10⁸ und am bevorzugtesten mindestens 10⁹ unterschiedliche Sequenzen mit den erfindungsgemäßen Verfahren simultan analysiert. Bevorzugte Verfahren maximieren die Bibliothekgröße und Diversität.
Die in Frage kommenden, bioaktiven Stoffe können Proteine sein. Mit "Protein" werden vorliegend zumindest zwei kovalent verbundene Aminosäuren bezeichnet, einschließlich Proteine, Polypeptide, Oligopeptide und Peptide. Das Protein kann aus natürlich auftretenden Aminosäuren und Peptidbindungen bestehen, oder synthetischen peptidomimetischen Strukturen. Daher können die Begriffe "Aminosäure" oder "Peptidrest", wie sie hierin verwendet werden, sowohl natürlich vorkommende als auch synthetische Aminosäuren bedeuten. So werden bspw. Homo-Phenylalanin, Citrullin und Norleucin als für die vorliegenden Zwecke der Erfindung geeignete Aminosäuren betrachtet. Der Begriff "Aminosäure" schließt auch Iminosäure-Reste mit ein, wie bspw. Prolin und Hydroxyprolin. Die Seitenketten können entweder in der (R)- oder der (S)-Konfiguration sein. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Aminosäuren in der (S)- oder L-Konfiguration. Wenn nicht natürlich vorkommende Seitenketten eingesetzt werden, können nicht-Aminosäuren-Substituenten eingesetzt werden, bspw. um einen in vivo-Abbau zu verhindern oder zu verzögern. Auch können chemische Blockierungsgruppen oder andere chemische Substituenten hinzugefügt werden.
Die in Frage kommenden, bioaktiven Stoffe können natürlich vorkommende Proteine oder Fragmente natürlich vorkommender Proteine sein. Daher können bspw. zelluläre Extrakte, die Proteine enthalten, oder zufällige oder gerichtete Verdaue von proteinhaltigen Zellextrakten eingesetzt werden. Auf diese Weise können Bibliotheken von prokaryotischen und eukaryotischen Proteinen zum Screenen in den hierin beschriebenen Systemen hergestellt werden. Besonders bevorzugt sind bei dieser Ausführungsform Bibliotheken von bakteriellen, Pilz-, viralen und Säugetier-Proteinen, wobei letztere bevorzugt sind, und wobei menschliche Proteine besonders bevorzugt sind.
Die in Frage kommenden, bioaktiven Stoffe können Peptide von ungefähr 5 bis ungefähr 30 Aminosäuren sein, wobei ungefähr 5 bis ungefähr 20 Aminosäuren bevorzugt sind, und wobei ungefähr 7 bis ungefähr 15 ganz besonders bevorzugt sind. Die Peptide können Verdaue natürlich vorkommender Proteine, wie oben diskutiert, sein, zufällige Peptide oder "vorbestimmte" zufällige Peptide. Mit dem Begriff "zufällige/randomisierte" oder grammatikalischen Äquivalenten davon wird vorliegend beschrieben, dass jede Nucleinsäure und jedes Peptid aus im Wesentlichen zufälligen Nucleotiden und Aminosäuren besteht. Da diese zufälligen Peptide (oder Nucleinsäuren, wie nachstehend diskutiert) gewöhnlich chemisch synthetisiert sind, können sie irgendein Nucleotid oder eine Aminosäure an jeder beliebigen Position besitzen. Das synthetische Verfahren kann dazu ausgebildet sein, zufällige Proteine oder Nucleinsäuren zu generieren, um die Bildung von allen oder der meisten der möglichen Kombinationen über die Länge der Sequenz zu ermöglichen, wodurch die Bildung einer Bibliothek zufälliger/randomisierter, in Frage kommender, bioaktiver, proteinöser Stoffe ermöglicht wird.
Die Bibliothek kann vollständig randomisiert sein, ohne Sequenz-Priorität oder Sequenz-Konstanten an irgendeiner Position. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Bibliothek vorbestimmt. Dies bedeutet, dass einige Positionen innerhalb der Sequenz entweder konstant gehalten werden, oder aus einer begrenzten Anzahl von Möglichkeiten ausgewählt werden. So werden bspw. in einer bevorzugten Ausführungsform die Nucleotide oder Aminosäurereste innerhalb einer definierten Klasse randomisiert, wie bspw. hydrophobe Aminosäuren, hydrophile Reste, sterisch vorbestimmte (entweder kleine oder große) Reste in Richtung der Bildung von Cysteinen, zur Ausbildung einer Vernetzung, Proline für SH-3-Domänen, Serine, Threonine, Tyrosine oder Histidine für Phosphorylierungsstellen, etc., oder Purine etc.
Die in Frage kommenden, bioaktiven Stoffe können Nucleinsäuren sein. Mit "Nucleinsäure" oder "Oligonucleotid" oder grammatikalischen Äquivalenten davon wird hierin gemeint, dass mindestens zwei Nucleotide kovalent miteinander verbunden sind. Eine Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung wird im Allgemeinen Phosphidiesterbindungen enthalten, obgleich in einigen Fällen, wie nachstehend beschrieben, Nucleinsäure-Analoga eingeschlossen sind, die ein sich änderndes Grundgerüst aufweisen, und die bspw. Phosphoramid aufweisen (Beaucage et al., Tetrahedron, 49(10): 1925 (1993) und die hierin zitierten Referenzen; Letsinger, J. Org. Chem., 35: 3800 (1970); Sprinzl, et al., Eur. J. Biochem., 81: 579 (1977); Letsinger et al., Nucl. Acids Res., 14: 3487 (1986); Sawai et al., Chem. Lett., 805 (1984); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc, 110: 4470 (1988); und Pauwels et al., Chemica Scripta, 26: 141 (1986)), Phosphorothioat (Mag et al., Nucleic Acids Res., 19: 1437 (1991); und U.S.-Patent mit der Nummer 5,644,048 ), Phosphorodithioat (Briu et al., J. Am. Chem. Soc, 111:2321 (1989)), O- Methylphosphoroamidit-Bindungen (siehe Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press), und Peptid-Nucleinsäuren-Grundgerüst und – Bindungen (siehe Egholm, J. Am. Chem. Soc, 114: 1895 (1992); Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl., 31: 1008 (1992); Nielsen, Nature, 365: 566 (1993); Carlsson et al., Nature, 380: 207 (1996), die sämtlich durch Bezugnahme hierin mit aufgenommen sind)). Andere analoge Nucleinsäuren schließen solche mit positiv geladenem Grundgerüst mit ein (Denpcy et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA, 92: 6097 (1995)); mit nicht-ionischem Grundgerüst ( U.S.-Patente mit den Nummem 5,386,023 ; 5,637,684 ; 5,602,240 ; 5,216,141 ; und 4,469,863 ; Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English, 30: 423 (1991); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc, 110: 4470 (1988); Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide, 13: 1597 (1994); Kapitel 2 und 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Hrsg. Y. S. Sanghui und P. Dan Cook; Mesmaeker, et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett., 4: 395 (1994); Jeffs, et al., J. Biomolecular NMR, 34: 17 (1994); Tetrahedron Lett., 37: 743 (1996)) und nicht-Ribose-Grundgerüst, einschließlich der in den U.S.-Patenten mit Nummem 5,235,033 und 5,034,506 , und in Kapiteln 6 und 7, ASC-Symposium Reihe 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Hrsg. Y. S. Sanghui und P. Dan Cook beschriebenen. Nucleinsäuren, die einen oder mehrere carbocyclische Zucker enthalten, sind ebenfalls in der Definition der Nucleinsäuren mit eingeschlossen (siehe Jenkins et al., Chem. Soc. Rev., (1995) Seiten 169-176). Mehrere Nucleinsäure-Analoga sind in Ravels, C & E Neves, 2. Juni 1997, Seite 35 beschrieben. Sämtliche der genannten Referenzen sind hiermit ausdrücklich durch Bezugnahme mit aufgenommen. Diese Modifizierungen des Ribose-Phosphat-Grundgerüst können vorgenommen werden, um die Addition zusätzlicher Anteile, wie bspw. Markern, zu erleichtern, oder aber, um die Stabilität und die Halbwertszeit solcher Moleküle in physiologischen Umgebungen zu erhöhen. Darüber hinaus können Mischungen natürlich vorkommender Nucleinsäuren und Analoga vorgenommen werden. Alternativ können Mischungen aus unterschiedlichen Nucleinsäure-Analoga und Mischungen aus natürlich vorkommenden Nucleinsäuren und Analoga vorgenommen werden. Die Nucleinsäuren können einzelsträngig oder Doppelsträngig sein, wie angegeben, oder Abschnitte von sowohl doppelsträngigen als auch einzelsträngigen Sequenzen enthalten. Die Nucleinsäure kann DNA sein, sowohl genomische als auch cDNA, RNA oder ein Hybrid, wobei die Nucleinsäure irgendeine Kombination von Desoxyribo- und Ribonucleotiden enthalten kann, sowie irgendeine Kombination aus Basen, einschließlich Uracil, Adenin, Thymin, Cytosin, Guanin, Inosin, Xanthin, Hypoxanthin, Isocytosin, Isoguanin, etc.
Wie oben im Allgemeinen für Proteine beschrieben, können Nucleinsäuren als in Frage kommende, bioaktive Stoffe natürlich vorkommende Nucleinsäuren sein, zufällige Nucleinsäuren oder "vorbestimmte" zufällige Nucleinsäuren. So können bspw. Verdaue prokaryotischer oder eukaryotischer Genome, wie oben für Proteine beschrieben, eingesetzt werden.
Die in Frage kommenden, bioaktiven Stoffe können organische chemische Anteile sein, von denen eine Vielzahl Verschiedener in der Literatur verfügbar sind. Insbesondere sind kleine Moleküle bevorzugt. Kleine Moleküle ("small molecules") sind gewöhnlicherweise kleiner als ungefähr 800 D, noch bevorzugter kleiner als 500 D, und noch bevorzugter kleiner als 200 D.
Verbindungen oder Zusammensetzungen mit ETR-Aktivität, wie oben beschrieben, werden durch Screenen identifiziert. Die ETRB-Aktivität schließt eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften mit ein: Binden an ETRB, eine vorzugsweise selektive Induzierung der Differenzierung, Induzierung der Pigmentierung, Induzierung der Proliferation und Induzierung der Apoptose. In einer bevorzugten Ausführungsform schließt die ETRB-Aktivität zumindest eines der Folgenden mit ein, Induzierung der Differenzierung, Induzierung der Pigmentierung, Induzierung der Proliferation und Induzierung der Apoptose. Noch bevorzugter wird durch die ETRB-Bindung und zumindest einem der anderen genannten Merkmale ein Stoff identifiziert, der die ETRB-Aktivität moduliert.
Im Allgemeinen wird in einer bevorzugten Ausführungsform des hierin beschriebenen Verfahrens, bspw. für Eindungs-Assays, ein ETR (der Einfachheit halber wird ETRB für die Zwecke der einfacheren Darstellung verwendet) oder der mögliche Stoff nicht-diffus an einen unlöslichen Träger gebunden, der isolierte Probenaufnahmeflä chen besitzt (bspw. eine Mikrotiterplatte, ein Array, etc.). Die unlöslichen Träger können aus irgendeiner Zusammensetzung sein, an welche die Zusammensetzungen binden können, ist ferner einfach vom löslichen Material zu trennen, und ist auch anderweitig mit dem gesamten Screening-Verfahren kompatibel. Die Oberfläche solcher Träger kann fest oder porös sein und irgendeine geeignete Form besitzen. Beispiele solcher geeigneten unlöslichen Träger schließen Mikrotiterplatten, Arrays, Membranen und Beads mit ein. Diese sind typischerweise aus Glas, Kunststoff (bspw. Polystyrol), Polysacchariden, Nylon oder Nitrozellulose, Teflon^TM, etc. Mikrotiterplatten und Arrays sind besonders geeignet, da mit diesen eine große Anzahl von Assays gleichzeitig ausgeführt werden kann, und zwar unter Verwendung kleiner Mengen an Reagenzien und Proben. In einigen Fällen sind magnetische Beads und Ähnliches mit eingeschlossen. Die besondere Art der Brandung der Zusammensetzung ist nicht essentiell, solange sie mit den Reagenzien und dem Gesamtverfahren der Erfindung kompatibel ist, und solange die Aktivität der Zusammensetzung aufrechterhalten wird und sie nicht-diffundierbar ist. Bevorzugte Bindungsverfahren schließen die Verwendung von Antikörpern mit ein (die entweder die Ligandenbindungsstelle oder die Aktivierungssequenz nicht sterisch blockieren, wenn das Protein an den Träger gebunden wird), eine direkte Bindung an "klebrige" oder ionische Träger, eine chemische Vernetzung, die Synthese des Proteins oder des Stoffs auf der Oberfläche, etc. Nach der Bindung des Proteins oder des Stoffes wird überschüssiges ungebundenes Material durch Waschen entfernt. Die Proben-aufnehmenden Flächen können dann anschließend durch Inkubation mit Rinderserumalbumin (BSA), Kasein oder anderen unschädlichen Proteinen oder anderen Anteilen blockiert werden. Mit der vorliegenden Erfindung sind auch Screening-Assays mit eingeschlossen, bei welchen keine festen Träger eingesetzt werden. Solche Beispiele sind nachstehend beschrieben.
ETRB kann an den Träger gebunden werden, und ein in Frage kommender, bioaktiver Stoff wird zu dem Assay hinzugefügt. Alternativ wird der in Frage kommende Stoff an den Träger gebunden und ETRB hinzugefügt. Neue bindende Stoffe schließen spezifische Antikörper, nicht-natürliche bindende Stoffe, die durch Screenen chemischer Bibliotheken identifiziert wurden, Peptidanaloga, etc. mit ein. Von besonderem Interesse sind Screening-Assays für Stoffe, die eine geringe Toxizität gegenüber menschlichen Zellen besitzen. Eine breite Vielzahl von Assays kann zu diesem Zweck eingesetzt werden, einschließlich markierter in vitro-Proteinbindungsassays, elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assays, Immunoassays für die Proteinbindung, funktionelle Assays (Phosphorylierungs-Assays etc.) und Ähnliche.
Die Bestimmung der Bindung des in Frage kommenden, bioaktiven Stoffes an ETRB kann auf viele verschiedene Arten vorgenommen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der mögliche bioaktive Stoff markiert und die Bindung wird direkt bestimmt. Dies kann bspw. durch Anbringen sämtlicher oder eines Teiles der ETRB an einen festen Träger vorgenommen werden, sowie durch Hinzufügen eines markierten möglichen Stoffes (bspw. einem fluoreszierenden Marker), dann durch Abwaschen des überschüssigen Reagens und durch Bestimmung, ob der Marker auf dem festen Träger vorliegt. Verschiedene Blockierungs- und Waschschritte können eingesetzt werden, wie sie im Stand der Technik bekannt sind.
Mit "markiert" wird vorliegend gemeint, dass die Verbindung entweder direkt oder indirekt mit einem Marker markiert ist, der für ein detektierbares Signal sorgt, bspw. ein Radioisotop, ein fluoreszierender Stoff, ein Enzym, Antikörper, Partikel, wie bspw. magnetische Partikel, chemolumineszierende Stoffe oder spezifische Bindungsmoleküle, etc. Spezifische Bindungsmoleküle schließen Paare, bspw. Biotin und Streptavidin, Digoxin und Antidigoxin, etc. mit ein. Für die spezifischen Bindungselemente würden die komplementären Elemente normalerweise mit einem Molekül markiert sein, das für die Detektion sorgt, und zwar gemäß bekannter Verfahren, wie oben diskutiert wurde. Der Marker kann direkt oder indirekt für ein detektierbares Signal sorgen.
In einigen Ausführungsformen ist nur eine der Komponenten markiert. So können bspw. Proteine (oder proteinöse, in Frage kommende Stoffe) an Tyrosin-Positionen mit ¹²⁵I oder mit Fluorophoren markiert sein. Alternativ kann mehr als eine Komponente mit unterschiedlichen Markern markiert sein, ¹²⁵I für die Proteine bspw., und einem Fluorophor für die in Frage kommenden Stoffe.
Die hierin beschriebenen Verfahren schließen die Verwendung kompetitiver Bindungsassays mit ein. Bei dieser Ausführungsform ist der Kompetitor ein Bindungsteil, von dem bekannt ist, dass er an das Target-Molekül (also ETRB) bindet, wie bspw. ein Antikörper, Peptid, Bindungspartner, Ligand, etc. In einer bevorzugten Ausführungsform konkurriert der Kompetitor gegen einen Agonisten, wie bspw. ET3 oder S6c. Am bevorzugtesten werden weitere Assays durchgeführt, um den möglichen Stoff als Antagonisten zu identifizieren. Unter bestimmten Umständen kann eine kompetitive Bindung zwischen dem bioaktiven Stoff und dem bindenden Anteil vorliegen, wobei der bindende Anteil den bioaktiven Stoff verdrängt. Dieses Assay kann eingesetzt werden, um mögliche Stoffe zu bestimmen, die mit der Bindung zwischen ETRBs und Endothelin-3, S6c, BQ-3020 oder BQ-788 in Wechselwirkung treten. Eine "Wechselwirkung der Bindung", wie sie hierin verwendet wird, bedeutet, dass sich die native Bindung der ETRB in Gegenwart des in Frage kommenden Stoffes unterscheidet. Die Bindung kann unterbunden werden oder kann mit einer reduzierten Affinität auftreten. Daher wird in einer Ausführungsform die Wechselwirkung bspw. durch eine Konformationsänderung verursacht, eher als durch eine direkte Kompetition um die native Bindungsstelle. Die beschriebenen Verfahren können auch unter Verwendung von ETRA durchgeführt werden.
In einer Ausführungsform ist der in Frage kommende, bioaktive Stoff markiert. Entweder der mögliche bioaktive Stoff oder der Kompetitor oder beide werden zunächst zu dem Protein, und zwar über einen Zeitraum hinzugefügt, der hinreichend für die Bindung ist, wenn Letztere vorliegt. Die Inkubation kann bei irgendeiner Temperatur durchgeführt werden, welche eine optimale Aktivität ermöglicht, typischerweise zwischen 4 und 40°C. Die Inkubationszeiten werden hinsichtlich einer optimalen Aktivität ausgewählt, können jedoch aber auch optimiert werden, um ein schnelles Hochdurchsatz-Screening zu ermöglichen. Typischerweise wird ein Zeitraum von 0,1 und einer Stunde ausreichend sein. Überschüssige Reagenzien werden im Allgemeinen entfernt oder abgewaschen. Die zweite Komponente wird anschließend hinzugefügt, wonach das Vorliegen oder die Abwesenheit der markierten Komponente folgt, um eine Bindung anzuzeigen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird zunächst der Kompetitor hinzugefügt, gefolgt von dem in Frage kommenden, bioaktiven Stoff. Die Verdrängung des Kompetitors ist ein Anzeichen dafür, dass der in Frage kommende, bioaktive Stoff an ETRB bindet und dass er ETRB binden und möglicherweise die Aktivität von ETRB modulieren kann. Bei dieser Ausführungsform kann irgendeine der Komponenten markiert sein. Daher, wenn bspw. der Kompetitor markiert ist, zeigt das Vorliegen des Markers in der Waschlösung die Verdrängung durch den Stoff an. Alternativ, wenn also der in Frage kommende, bioaktive Stoff markiert ist, zeigt das Vorliegen des Markers auf dem Träger eine Verdrängung an.
In einer alternativen Ausführungsform wird zunächst der in Frage kommende, bioaktive Stoff hinzugefügt, gefolgt von einer Inkubation und einem Waschschritt, worauf die Hinzufügung des Kompetitors folgt. Eine fehlende Bindung durch den Kompetitor kann darauf hindeuten, dass der bioaktive Stoff mit einer höheren Affinität an ETRB gebunden ist. Daher kann, wenn der in Frage kommende, bioaktive Stoff markiert ist, das Vorliegen des Markers auf dem Träger, verbunden mit einer fehlenden Bindung des Kompetitors, darauf hindeuten, dass der in Frage kommende Stoff an ETRB binden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Verfahren ein differenzielles Screening zur Identifizierung bioaktiver Stoffe, die die Aktivität von ETRB modulieren können. Solche Assays können mit ETRB oder Zellen, die ETRB aufweisen, durchgeführt werden. In einer Ausführungsform weisen die Verfahren eine Kombination eines ETRB und eines Kompetitors in der ersten Probe auf. Eine zweite Probe weist einen möglichen bioaktiven Stoff, ein ETRB und einen Kompetitor auf. Die Bindung des Kompetitors wird bei beiden Proben bestimmt, wobei eine Veränderung oder ein Unterschied in der Bindung zwischen den beiden Proben auf das Vorliegen eines Stoffes hindeutet, welcher an ETRB binden und möglicherweise seine Aktivität modulieren kann. Dies bedeutet, dass, wenn die Bindung des Kompetitors in der zweiten Probe im Vergleich zur ersten Probe unterschiedlich ist, der Stoff an ETRB binden kann.
Alternativ wird bei einer bevorzugten Ausführungsform ein differenzielles Screening eingesetzt, um mögliche Arzneimittel zu identifizieren, die an natives ETRB binden, die jedoch nicht an modifizierte ETRs binden können. Die Struktur der ETR kann moduliert werden, und für die Entwicklung von Arzneimitteln eingesetzt werden, um Stoffe zu synthetisieren, die mit dieser Stelle Wechselwirken. In Frage kommende Arzneimittel, die die ETR Bioaktivität beeinflussen, werden ebenfalls durch ein Screenen von Arzneimitteln hinsichtlich der Fähigkeit, die Aktivität des Proteins entweder zu verstärken oder zu reduzieren, selektiert.
In einer hierin beschriebenen Ausführungsform, bei welcher BQ788 hinzugefügt und das Tumorwachstum inhibiert wird, wird die Bindungsstelle, an welche BQ788 bindet, identifiziert und isoliert.
Positivkontrollen und Negativkontrollen können in den Assays verwendet werden. Vorzugsweise werden alle Kontrollen und Testproben zumindest dreifach ausgeführt, um statistisch signifikante Ergebnisse zu erzielen. Eine Inkubation aller Proben ist für einen Zeitraum hinreichend, der ausreicht, um eine Bindung des Stoffes an das Protein zu bewirken. Nach der Inkubation werden alle Proben durch Waschen von ungebundenem nicht-spezifischem Material befreit, und die Menge an gebundenem, im Allgemeinen markiertem Stoff bestimmt. So werden bspw. dann, wenn ein radioaktiv markierter Marker eingesetzt wird, die Proben in einem Szintillationszähler ausgezählt werden, um die Menge der gebundenen Verbindung zu bestimmen.
Eine Vielzahl anderer Reagenzien kann in den Screening-Assays eingesetzt werden. Diese schließen Reagenzien wie Salze, neutrale Proteine, bspw. Albumin, Detergenzien, etc. mit ein, die eingesetzt werden können, um eine optimale Protein-Protein-Bindung zu ermöglichen und/oder unspezifische oder Hintergrundwechselwirkungen zu reduzieren. Auch können Reagenzien, die anderweitig die Effizienz dieses Assays verstärken, wie bspw. Proteaseinhibitoren, Nucleaseinhibitoren, anti-mikrobielle Stoffe, etc., eingesetzt werden. Die Mischung der Komponenten kann in irgendeiner Reihenfolge erfolgen, mit welcher für die notwendige Bindung gesorgt wird.
Auch kann ein Screenen nach Stoffen, die die Aktivität von ETR modulieren, vorgenommen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen Verfahren zum Screenen nach einem bioaktiven Stoff, der die Aktivität von ETR modulieren kann, die Schritte der Hinzufügung eines in Frage kommenden, bioaktiven Stoffes zu einer Probe von einem ETR (oder Zellen, die ein ETR aufweisen) und das Bestimmen einer Änderung in der biologischen Aktivität der ETR. Der ETR ist vorzugsweise ETRB. Bei einem bevorzugten Verfahren wird dies mit Stoffen erzielt, die bereits als an ETR bindend identifiziert wurden; bei dieser Ausführungsform ist die zu bestimmende Bioaktivitäts-Änderung, wenn eine solche vorliegt, ausgewählt aus der Induzierung der Proliferation, der Differenzierung und der Apoptose. "Modulierung der Aktivität eines ETR" schließt einen Anstieg in der Aktivität, ein Absenken der Aktivität oder eine Veränderung in dem Typus oder der Art der vorliegenden Aktivität mit ein. Daher sollte in einer bevorzugten Ausführungsform der in Frage kommende Stoff sowohl an ETR binden (obwohl dies nicht notwendig sein muss) und seine biologische oder biochemische Aktivität, wie hierin definiert, ändern. Die Verfahren schließen sowohl in vitro-Screening-Verfahren, wie sie allgemein oben diskutiert wurden, als auch in vivo-Screening-Verfahren von Zellen hinsichtlich einer Veränderung in der Aktivität von ETR mit ein.
In einer Ausführungsform umfassen die Verfahren das Hinzufügen eines in Frage kommenden, bioaktiven Stoffes, wie oben definiert, zu einer Zelle, welche ETRB enthält. Bevorzugte Zelltypen schließen nahezu jede Zelle mit ein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle kanzerös, oder krebsauslösenden Stoffen ausgesetzt, nachdem der bioaktive Stoff vorliegt. Die Zellen können eine rekombinante Nucleinsäure enthalten, die für ein ETR codiert, oder ein natives ETR. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Bibliothek an möglichen Stoffen auf einer Vielzahl von Zellen getestet.
Messungen können vorgenommen werden, wobei sämtliche Bedingungen für jede der Messungen die Gleichen sind, oder aber unter verschiedenen Bedingungen, mit oder ohne bioaktive Stoffen, oder zu unterschiedlichen Zeitpunkten eines Krankheitszustandes, wie bspw. Krebs. So kann bspw. eine Messung in einer Zelle oder Zellpopulation vorgenommen werden, bei welcher einmal ein in Frage kommender, bioaktiver Stoff vorliegt, und bei welcher der in Frage kommende, bioaktive Stoff das andere Mal fehlt. In einem anderen Beispiel können die Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit oder vorheriger oder nachfolgender Exponierung gegenüber physiologischen Signalen untersucht werden, wie bspw. Hormonen, Antikörpern, Peptiden, Antigenen, Cytokinen, Wachstumsfaktoren, Aktionspotenzialen, pharmakologische "Stoffe", einschließlich Chemotherapeutika, Strahlung, karzinogenen oder anderen Zellen (das heißt, Zell-Zell-Kontakte). In einem weiteren anderen Beispiel können die Messungen der Bioaktivität vorgenommen werden, wobei die Bedingungen die gleichen sind, und die Änderungen zwischen einer Zelle oder Zellpopulation und einer anderen Zelle oder Zellpopulation gemessen werden.
Mit einer "Population an Zellen" oder einer "Bibliothek an Zellen" sind vorliegend zumindest zwei Zellen gemeint, wobei mindestens ungefähr 10³ bevorzugt sind, mindestens ungefähr 10⁶ besonders bevorzugt, und ganz besonders mindestens ungefähr 10⁸ bis 10⁹ bevorzugt sind. Die Population oder die Probe kann eine Mischung an unterschiedlichen Zelltypen von entweder primären oder sekundären Kulturen enthalten, obgleich Proben, die lediglich einen Zelltyp enthalten, bevorzugt sind, wobei bspw. die Probe aus einer Zelllinie, insbesondere einer Tumorzelllinie, stammen kann.
Bevorzugte Zelltypen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen Säugetierzellen mit ein, einschließlich Zellen von Tieren (Nagetieren, einschließlich Mäusen, Ratten, Hamstern und Wüstenrennmäusen), von Primaten und Menschen, insbesondere einschließlich Tumorzellen aller Typen, einschließlich Zellen aus Brustkrebs, Hautkrebs, Lungenkrebs, Gebärmutterhalskrebs, Darmkrebs, Leukämie, Hirntumoren, etc.
Die hierin beschriebenen Zusammensetzungen, einschließlich der ETR-Modulatoren, vorzugsweise Inhibitoren, einschließlich denjenigen, die als solche durch die hierin beschriebenen Assays identifiziert wurden, können in einer Mischung mit einem pharmazeutisch akzeptierbaren Träger kombiniert werden. Therapeutische Formulie rungen werden zu Zwecken der Lagerung dadurch zubereitet, dass der Wirkstoff mit dem erwünschten Reinheitsgrad mit wahlweise physiologisch akzeptierbaren Trägern, Hilfsstoffen oder Stabilisatoren gemischt wird (Remingtons's Pharmaceutical Sciences, 16. Ausgabe, Osol, A. Hrsg. (1980)), und zwar bspw. in Form von lyophilisierten Formulierungen oder wässrigen Lösungen. Akzeptierbare Träger, Hilfsstoffe oder Stabilisatoren sind in den zu verabreichenden Dosierungen und Konzentrationen für die Empfänger nicht toxisch und schließen Puffer mit ein, wie bspw. Phosphat, Citrat, und andere organische Säuren; Antioxidantien, einschließlich Ascorbinsäure; Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als ungefähr 10 Reste); Proteine, wie bspw. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie bspw. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie bspw. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenwasserstoffe, einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; chelatierende Stoffe, wie bspw. EDTA; Zuckeralkohole, wie bspw. Mannitol oder Sorbitol; salzbindende Gegenionen, wie bspw. Natrium; und/oder nicht-ionische oberflächenaktive Stoffe, wie bspw. Tween, Pluronics oder PEG.
Die Dosierungen und die erwünschten Arzneimittelkonzentrationen der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung können in Bezug auf den beabsichtigten bestimmten Einsatz variieren. Die Bestimmung der geeigneten Dosierung oder des Verabreichungsplans liegt im Können eines normalen Arztes. Tierexperimente sorgen für verlässliche Anhaltspunkte für die Bestimmung effektiver Dosen für die menschliche Therapie. Die Skalierung effektiver Dosen zwischen den Spezies kann durchgeführt werden, indem den Prinzipien gefolgt wird, die von Mordenti, J. und Chappell, W. aufgestellt wurden: "The use of interspecies scaling in toxicokinetics", in Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Hrsg., Pergamon Press, New York 1989, Seiten 42-96. Der Ausdruck "therapeutisch effektive" Menge, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Menge, die benötigt wird, um die bestimmte Behandlung als solche durchzuführen, wie bspw. die Behandlung von Krebs. Der Ausdruck "Behandlung" bezieht sich auf sowohl eine therapeutische Behandlung als auch auf prophylaktische oder präventive Maßnahmen, wobei es Aufgabe ist, den bestimmten pathologischen Zustand oder die Krankheit zu verhin dern oder abzubremsen (zu lindern). Diejenigen, die eine solche Behandlung benötigen, schließen diejenigen mit ein, die bereits an der Krankheit leiden, als auch diejenigen, bei denen die Gefahr besteht, dass sie die Krankheit entwickeln, oder bei denjenigen, bei denen die Krankheit verhindert werden soll. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Krankheit bereits präsent. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Leben einer Zelle oder eines Individuums mit den hierin beschriebenen Verfahren verlängert.
Die hierin bereitgestellten Zusammensetzungen können einem Wirt in einem physiologisch akzeptierbaren Träger verabreicht werden, wie zuvor beschrieben. Bevorzugte Verabreichungsverfahren schließen eine systemische oder direkte Verabreichung an eine Tumorstelle mit ein. Bei einem Verfahren werden verzögert freigesetzte Vehikel eingesetzt. Die Zusammensetzungen können in Verbindung mit anderen Zusammensetzungen für die Behandlung verabreicht werden, einschließlich Chemotherapeutika und/oder Strahlung oder mit Regulatoren davon, sind jedoch nicht hierauf beschränkt.
Antisense- oder Sense-Oligonucleotide können mittels Gentransferverfahren in eine Zelle eingeführt werden. Bei einem bevorzugten Verfahren wird ein Antisense- oder Sense-Oligonucleotid in einem geeigneten retroviralen Vektor eingeführt. Eine Zelle, die die Target-Nucleinsäuresequenz enthält, wird mit dem rekombinanten retroviralen Vektor kontaktiert, entweder in vivo oder ex vivo. Geeignete retrovirale Vektoren schließen diejenigen mit ein, die von dem murinen Retrovirus M-MuLV abgeleitet sind, oder von N2 (einem Retrovirus, der von M-MuLV abgeleitet ist), oder von den Vektoren mit doppelter Kopienzahl, die mit DCT5A, DCT5B und DCT5C bezeichnet werden (siehe WO 90/13641 ).
Alternativ kann ein Sense- oder Antisense-Oligonucleotid in eine Zelle eingeführt werden, welche die Ziel-Nucleinsäuresequenz enthält, in der ein Oligonucleotid-Lipid-Komplex gebildet wird, wie in der WO 90/10448 beschrieben ist. Der Sense- oder Antisense-Oligonucleotid-Lipid-Komplex dissoziiert vorzugsweise innerhalb der Zelle durch eine endogene Lipase.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein in vitro-Verfahren zum Beeinflussen von Hautkrebszellen bereitgestellt. In einer Ausführungsform wird eine an eine Zelle abzugebende Verbindung oder Zusammensetzung mit BQ788 oder einem Derivat davon konjugiert, welches spezifisch für ETRB ist. Die Probe der Zellen enthält Hautkrebszellen, die ETRB exprimieren.
Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Art und Weise der Verwendung der weiter oben beschriebenen Erfindung umfassender zu beschreiben, und auch um die bestmöglichen Arten zum Ausführen der verschiedenen Aspekte der Erfindung darzulegen. Es versteht sich, dass diese Beispiele keineswegs den wahren Rahmen der vorliegenden Erfindung begrenzen sollen, sondern dass sie lediglich illustrativen Zwecken dienen.
BEISPIEL 1:
BQ788 INDUZIERT DIFFERENZIERUNG UND APOPTOSE IN KREBSZELLEN UND INHIBIERT KREBS IN VIVO
Methoden
Zellkultur. Menschliche Melanomzelllinien wurden von der American Tissue Culture Collection (ATCC) erhalten und mit Dulbecco's Eagle Medium (ATCC) kultiviert, welches 10 % fötales Kälberserum, Glutamin (Gibco) und Antibiotika (Konzentration; Pen-Strep-Mix, Gibco) enthielt, und zwar in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ bei 37°C. BQ788 und BQ123 (Calbiochem) wurden in 2 % Polyoxyethylen (60) gehärtetem Rizinusöl (HCO60; Nikko Chemicals) aufgelöst. Die Zellen wurden in 96-Well-ELISA-Platten kultiviert. Für das Zell-Lebensfähigkeits-/Zellzahl-Assay wurde am Tag nach der Ausplattierung der Inhibitor oder das Vehikel hinzugefügt und die Kulturen 4 Tage lang inkubiert. Das MTS-Assay wurde eingesetzt, um die Zellen durch die Messung der OD bei 492 μm (Promega) zu messen.
Reverse Transkription-PCR-Analyse. Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung eines RNA-Isolierungs-Kits (Promega) aus jeder Zelllinie isoliert. Die cDNA wurde aus 10 μg Gesamt-RNA unter Verwendung der MMLV-reversen Transkriptase hergestellt. 2 μg der cDNA wurden für jede PCR-Reaktion eingesetzt. Die Primer und Bedingungen waren dabei diejenigen, wie sie schon zuvor beschrieben wurden (Hamroun et al., J. Cardiovasc. Pharmacol., 26(3): S156-8 (1995)).
Immunhistochemie. Die Tumoren wurden auf Trockeneis eingefroren, in einem Kryostaten in 20-μm-Schnitte geschnitten und bei –80°C gelagert. Die Abschnitte wurden in calcium- und magnesiumfreier phosphatgepufferter Saline (PBS) abgewaschen, in 4 % Paraformaldehyd 1 Stunde lang bei Raumtemperatur fixiert, mit 2 % Kaninchenserum blockiert und mit dem Primärantikörper über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach einem Waschschritt in PBS wurden die Abschnitte mit einem biotinylierten sekundären Antikörper inkubiert, und eine Färbung entwickelt, unter Verwendung des Elite-ABC-Kit (Vector Laboratories, Kalifornien). Die in dieser Studie verwendeten primären Antikörper waren monoklonale Ratten-Anti-Maus-CD31-Antikörper (Plättchen-Endothelzellen-Adhäsionsmolekül) und Ratten-Anti-Maus-CD45 (Leukozyten-Antigen, das auf allen Zellen hämatopoetischen Ursprungs gefunden wird, mit Ausnahme von Erythrozyten) (Pharmagen, San Diego, Kalifornien). Für die TUNEL-Färbung (Boehringer Mannheim) wurde ein Zelltod-Kit eingesetzt.
Ergebnisse.
BQ788 induziert Anzeichen der Differenzierung und reduziert die Lebensfähigkeit menschlicher Melanomzellen in vitro
Um die Hypothese zu untersuchen, dass die ETRB-Funktion beim Krebszellwachstum und bei der Differenzierung eine Rolle spielt, wurden 7 menschliche Melanomzellli nien kultiviert, sowie eine menschliche Nierenzelllinie mit dem selektiven ETRB-Antagonisten, nämlich BQ788. Eine Untersuchung der behandelten Kulturen zeigte eine drastische morphologische Änderung in einigen der Melanomlinien. Wie in den 1A und B gezeigt, entwickelte SK-MEL 28 große cytoplasmatische Vakuolen und eine verstärkte Pigmentierung. Ähnliche Veränderungen wurden mit der Antagonisten-Behandlung mit A375 und RPMI 7951-Zellen (nicht gezeigt) beobachtet. Sämtliche Zelllinien zeigten eine erhöhte Oberfläche, und die meisten (mit Ausnahme von SK-MEL 3) zeigten größere Anstiege in der Pigmentierung. Die Behandlung von SK-MEL 5-Zellen führte ebenfalls zu einem dendritischen Phänotyp, ähnlich zu demjenigen, der bei normalen, reifen Melanozyten beobachtet wird (1C, D). Im Gegensatz dazu führte die Behandlung von Nieren-293-Zellen mit BQ788 zu keiner dieser morphologischen Veränderungen (1E, F).
Zusätzlich zur Induzierung morphologischer Veränderungen, die auf eine Differenzierung hindeuten, resultierte die Behandlung der Melanomzellen mit BQ788 schließlich in eine reduzierte Zellzahl und in den Zelltod. Dieser Effekt wurde unter Verwendung des MTS-Assays quantifiziert. Wie in 2 gezeigt, zeigten alle 7 getesteten Melanomlinien ein signifikantes Absinken in der Anzahl der lebensfähigen Zellen nach Behandlung mit 100 μM BQ788, obgleich manche der Linien klar sensitiver sind als andere. Im Gegensatz dazu wurde die Anzahl der Nierenzellen durch hohe Konzentrationen von BQ788 nicht reduziert, was darauf hindeutet, dass dieser Inhibitor im Allgemeinen nicht toxisch ist.
Um zu verifizieren, dass die Zellen ETRB exprimieren, wurden RT-PCR unter Verwendung veröffentlichter Primersequenzen durchgeführt (Hamroun et al., J. Cardiovasc. Pharmacol., 26(3): S. 156-8 (1995)). Sämtliche dieser Zelllinien, einschließlich der Nierenzellen, zeigen eine Bande der Größe, die für echte ETRB-mRNA erwartet wird (3A). Fünf zusätzliche PCR-Zyklen wurden benötigt, um die Bande in RPMI 7951-Zellen zu detektieren. Darüber hinaus exprimierten alle Zelllinien ETRA, und zwar mit unterschiedlichen Leveln (3B). Ähnliche Ergebnisse bezüglich der Rezeptorexpression in einigen dieser Zelllinien wurden bereits zuvor beobachtet (Mohn et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 201: 449-57 (1994); Ohtani et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 234: 526-30 (1997)).
Die Koexpression von ETRA ermöglichte es, den Effekt der Hinzufügung der selektiven ETRA-Antagonisten BQ123 auf diese Zellen zu untersuchen (Itoh et. al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 195: 969-75 (1993)). Wie in 4 gezeigt, reduziert BQ123 die Anzahl der lebensfähigen Zellen in irgendeiner dieser Zelllinien nicht, auch nicht bei hohen Konzentrationen. Tatsächlich erhöhte dieser Antagonist in zwei der Melanomlinien die Zellzahl, nämlich bei A375 und SK-MEL 28. Daher sind die Effekte von BQ788 bei hohen Konzentrationen nicht durch ETRA vermittelt.
Um den Effekt von BQ788 weiter zu untersuchen, wurden der hochsensitive ETRB-Agonist, Sarafotoxin 6c (S6c) (Takasaki et al., Toxicon, 26: 543-8 (1998)) eingesetzt. Wie vorhergesagt, erhöhte S6c bei Konzentrationen von 0,1 bis 1 μM die A375-Zellzahl (5). Was für die vorliegenden Versuche wichtig war, ist, dass S6c die Effekte von BQ788 auf die A375-Zellen vollständig blockieren konnte (5). Daher ist die Fähigkeit von BQ788, die Melanomzellzahl abzusenken, wahrscheinlich durch dessen Wirkung auf ETRB zurückzuführen, und nicht auf eine Nebenwirkung eines anderen Aspekts der Melanomzellphysiologie.
BQ788 inhibiert das Wachstum menschlicher Melanome in Nacktmäusen
Für die in vivo-Experimente wurde die A375-Melanomzelllinie ausgewählt. Obgleich diese Zelllinie nicht diejenige ist, die für eine BQ788-Behandlung in Kultur am empfindlichsten war, so ist doch bekannt, dass diese in Nacktmäusen schnell wachst. Zunächst wurden dissoziierte Zellen als eine Suspension in die Flanken von Nacktmäusen injiziert. Wenn sich Tumore entwickelten, wurden die Mause getötet und der Tumor entfernt und in Stücke mit ungefähr 3 mm Durchmesser geschnitten, sowie unter die Haut einer neuen Reihe von Nacktmäusen implantiert. Wenn der Tumor einen Durchmesser von 4 mm erreicht hatte (was ungefähr 12 Tage dauert, jedoch variieren kann), wurden 25 μl einer Lösung mit 20 μg/ml von BQ788, gelöst in 2 Polyoxyethylen (60) gehärtetem Rizinusöl (HCO60) (Ishikawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 4892-6 (1994) in die Mitte des Tumors injiziert, und zwar täglich über einen Zeitraum von 9 Tagen. Tumoren in den Kontrollmäusen wurden auf die gleiche Art und Weise mit 25 μl 2 % HCO60 behandelt. Nach jeder Injektion wurden die Tumorausmessungen bestimmt. Die Ergebnisse aus drei Experimenten, bei einem Einsatz von insgesamt 10 BQ788-behandelten Mäusen und 8 Vehikel-behandelten Kontrollmäusen, sind in 6 gezeigt. Zu Beginn war das mittlere Tumorvolumen 26 mm³ sowohl in der Kontrolle als auch bei den BQ788-behandelten Mausen. Nach 9 Tagen erreichte das mittlere Tumorvolumen der Kontrollgruppe 376 mm³, wohingegen die behandelte Gruppe ein mittleres Tumorvolumen von 84 mm³ hatte. Die Berechnung der Wachstumsrate (Endgröße minus anfängliche Größe) zeigte, dass die BQ788-behandelten Tumoren sechsmal langsamer wuchsen als die Kontrollen. Ähnliche Schlüsse konnten aus dem Vergleich der Tumorgewichte gezogen werden (mittleres Gewicht von 446 mg gegenüber 93 mg; p < 0,005).
Als Nächstes wurde untersucht, ob die systemische Verabreichung von BQ788 das Tumorwachstum inhibieren kann. Bei diesen Versuchen waren die Tumorinduktion und der Ausgangspunkt der Behandlungen die Gleichen wie für den Intra-Tumor-Ansatz. Zu diesem Punkt wurden den Mäusen intraperitoneal 100 μl BQ788-Lösung injiziert (0,6 mg BQ788 in 30 % Wasser und 70 % Saline, mit einer HCO60-Endkonzentration von 0,6 %), und zwar einmal oder zweimal am Tag über einen Zeitraum von 9 Tagen. Kontrollmäuse erhielten die gleichen Injektionen, jedoch ohne BQ788. In dem ersten Versuch erhielten die Mause einmal am Tag eine Injektion, und bei dem zweiten Versuch erhielten die Mäuse Injektionen morgens und wiederum am frühen Abend. Da die Ergebnisse dieser beiden Versuche sich nicht unterschieden, wurden sie gepoolt und sind in 7A dargestellt. Es zeigte sich, dass auch eine systemische Verabreichung zu einer effektiven Inhibierung des Tumorwachstums führt. Dennoch zeigte sich eine gewisse Heterogenität in der Antwort der Mäuse auf BQ788. In den ersten 6 Tagen unterschieden sich die Tumoren in der BQ788-Gruppe nicht signifikant in ihrer Größe im Vergleich zu Tag 1. Nach 6 Tagen konnten die BQ788-Mäuse in zwei Untergruppen eingeteilt werden, die unterschiedlich auf das Arzneimittel antworteten, wie in 7B gezeigt. Bei einer Gruppe von Mausen verlangsamte die BQ788-Behandlung das Tumorwachstum, wohingegen in der anderen Gruppe von Mäusen die Tumoren schrumpften und einen vollständigen Wachstumsstillstand zeigten.
Mehrere der Tumoren aus den Versuchen mit der intraperitonealen Injektion wurden für eine histologische Untersuchung am Tag 10 herangezogen. Die Schnitte wurden mit einem Anti-CD-31-Antikörper für die Angiogenese gefärbt, sowie mit dem TUNEL-Verfahren für die Apoptose. Allgemein resultierte die BQ788-Behandlung in eine verstärkte TUNEL-Markierung (8), was nahelegt, dass das Arzneimittel die Apoptose erhöht. Die Färbung mit dem Anti-CD-31-Antikörper zur Hervorhebung der Blutgefäße ergab keine Erkenntnisse, dass BQ788 die Angiogenese blockiert (Daten nicht gezeigt).
Die Zelllinie SK-MEL 3 zeigt eine erhöhte Oberfläche (dentritische Morphologie) als Antwort auf BQ788, wohingegen ihre Lebensfähigkeit weniger betroffen ist als diejenige der anderen Linien. Die Lebensfähigkeit von SK-MEL-24- und SK-MEL-31-Zellen ist von BQ788 stärker betroffen, und sie zeigen auch das zusätzliche morphologische Merkmal einer verstärkten Pigmentierung. SK-MEL 5 ist ähnlich zu den letzteren beiden Zelllinien, zeigt jedoch eine erhöhte Dendrizität. A375, SK-MEL 28 und die empfindlichste Zelllinie RPMI 7951 zeigten Vakuolen im Cytoplasma und einen beinahe vollständigen Verlust der Lebensfähigkeit als Antwort auf BQ788. Diese Effekte in Kultur scheinen durch die Wirkung des Arzneimittels auf ETRB selber vermittelt worden zu sein, da BQ788 gegenüber A375-Zellen in Gegenwart des ETRB-Agonisten S6c unwirksam ist. Eine weitere Anzeige der Spezifität der Wirkungsweise von BQ788 ist der sehr unterschiedliche Effekt auf Nieren-293-Zellen. Darüber hinaus inhibierte der ETRA-selektive Blocker BQ123 das Zellwachstum von Melanomen in Kultur nicht, auch nicht bei hohen Konzentrationen.
Die Zelllinie, die den höchsten Grad an Sensitivität gegenüber der Behandlung mit BQ788 zeigte, nämlich RPMI 7951, zeigte auch niedrigere Level an einer ETRB-mRNA-Expression im Vergleich zu den anderen, in dieser Studie verwendeten Zelllinien. Von menschlichen metastasierenden Melanomzellen wurde berichtet, dass sie im Vergleich zu primären Melanomzellen eine erhöhte ETRB-Expression zeigen. Kikuchi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 219: 734-9 (1996). Daher legen die vorliegenden Daten nahe, dass metastasierende Melanomzellen am empfindlichsten gegenüber einer Behandlung mit BQ788 sein könnten.
Die Kulturergebnisse, insbesondere mit den Linien RPMI 7951, SK-MEL 28 und A375, ebenso wie die in vivo-TUNEL-Ergebnisse, deuten darauf hin, dass das Arzneimittel Apoptose induziert. Ferner gibt es Ergebnisse für eine möglich autokrine Rolle, da einige der Zelllinien ET1 mRNA exprimieren (Daten nicht gezeigt). Diese Vorstellung wird weiter durch die Wachstums-Stimulation unterstützt, die bei der Hinzufügung des ETRB-spezifischen Agonisten zu A375-Zellen beobachtet wird (5). Die entgegengesetzten Ergebnisse, die mit dem selektiven ETRA-Antagonisten BQ123 auf A375 und SK-MEL 28 erzielt wurden, zeigen, dass die A- und B-Rezeptoren vollkommen unterschiedliche Wirkungsweisen von ET auf diese Zellen vermitteln. Wenn ETRA blockiert wird, kann die Proliferation verstärkt werden. Nebenbei bemerkt, wird das Haupt-ETRA-Transkript, das von Melanomzelllinien exprimiert wird, gekürzt, und ihm fehlt die hohe Affinitätsbindung an ET. Zhang et al. (Zhang et al., Brit. J. Cancer, 78: 1141-6 (1998)). Im Gegensatz dazu ist in normalen Geweben der Wildtyp-ETRA das vorherrschende Transkript.
Darüber hinaus gibt es Erkenntnisse, dass Arzneimittel, die BQ788 aufweisen, sehr gut verträglich sind. Hashimoto et al., Biol. Pharmaceut. Bull., 21: 800-804 (1998); Haynes et al., Circulation, 93: 1860-70 (1996); Stitch et al., Circulation, 98: 2262-8 (1998).

Claims

Verwendung eines Inhibitors eines Endothelin-B-Rezeptors zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Hautkrebs, unter der Voraussetzung, dass der Inhibitor nicht Ro61 ist.
Verwendung nach Anspruch 1, bei welcher der Krebs ein malignes Melanom, ein Basalzellenkarzinom, ein Plattenepithelkarzinom oder ein Karposi-Sarcom ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, bei welcher das Arzneimittel zur systemischen Verabreichung vorgesehen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei welcher das Arzneimittel zur Verabreichung an einer Tumorstelle vorgesehen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei welcher der Krebs metastasierend ist.
Verwendung nach Anspruch 5, bei welcher der Krebs ein metastasenbildendes Melanom ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei welcher der Inhibitor ein Antisensmolekül für (1) eine Endothelin-Rezeptor-Nucleinsäure oder (2) eine Endothelin-Rezeptor-Agonist-Nucleinsäure ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei welcher der Inhibitor BQ788 ist, oder ein Derivat davon, oder IRL1083, RES7011, RES7013, PD142983 oder IRL2500.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei welcher der Inhibitor BQ788 oder ein Derivat davon ist.
Verwendung nach Anspruch 9, bei welcher BQ788, oder ein Derivat davon, zur Bildung eines Konjugats an eine Substanz konjugiert ist.
In vitro-Verfahren zur Induzierung der Differenzierung in einer Melanomzelle, die einen Endothelin-B-Rezeptor aufweist, wobei das Verfahren das Verabreichen eines Inhibitors eines Endothelin-B-Rezeptors zu der Zelle in vitro umfasst, und zwar in einer Menge, mit der die Differenzierung induziert werden kann, vorausgesetzt, dass der Inhibitor nicht Ro61 ist.
Verfahren nach Anspruch 11, in welchem die Zelle kanzerös ist.
In vitro-Verfahren zur Induzierung der Apoptose in einer Melanomzelle, die einen Endothelin-B-Rezeptor aufweist, wobei das Verfahren die Verabreichung eines Inhibitors eines Endothelin-B-Rezeptors zu der Zelle in vitro umfasst, und zwar in einer Menge, mit der die Apoptose induziert wird, vorausgesetzt, dass der Inhibitor nicht Ro61 ist.
Verfahren nach Anspruch 13, bei welchem die Zelle kanzerös ist.