PT1280552E - ''métodos de tratamento de cancro da pele, utilizando composições compreendendo um inibidor de receptor da endotelina b'' - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "MÉTODOS DE TRATAMENTO DO CANCRO DA PELE, UTILIZANDO COMPOSIÇÕES COMPREENDENDO UM INIBIDOR DO RECEPTOR DA ENDOTELINA B"

Um terço de todos os indivíduos nos Estados Unidos, irá desenvolver cancro. Embora a taxa de sobrevivência a cinco anos tenha aumentado enormemente para quase cinquenta por cento, em consequência do progresso do diagnóstico precoce e da terapia, o cancro permanece, ainda, nos Estados Unidos, como uma causa de morte apenas superada pela doença cardíaca. Vinte por cento dos Americanos morrem de cancro, parte devida aos cancros do pulmão, mama e colo-rectal. Para além disso, o cancro da pele permanece um risco para a saúde. A concepção de tratamentos eficazes para doentes com cancro tem representado um desafio significativo. 0 regime actual de ressecção cirúrgica, terapia por irradiação com radiação externa e/ou quimioterapia sistémica foi, parcialmente, bem sucedido em algumas espécies de malignidades, mas não produziu resultados satisfatórios em outras. Uma abordagem ao tratamento do cancro tem consistido na indução da apoptose (morte celular) de células tumorais visadas; consequentemente, os mecanismos indutores da apoptose têm interesse. Foi descrito um desses mecanismos, em que o ligando Fas, (FasL) (também conhecido como CD95L e APO-IL), uma molécula de superfície celular pertencente à família do factor da necrose tumoral, induz a apoptose de células tumorais contendo Fas. Seino et al., Nature Med., 3(2):165 (1997). 1

Numa outra abordagem, têm sido caracterizadas linhas celulares de cancro. Por exemplo, foi descrito que todas as linhas de melanoma humano testadas em vários estudos, expressam o receptor da endotelina B (ETRB) (Yohn et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 201:449-57 (1994). Kikuchi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 219:734-9 (1996); Ohtani, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 234:526-30 (1997); Zhang et al., Brit. J. Câncer, 78:1141-6 (1988)); para além disso, a expressão está correlacionada com o seu estado de diferenciação. A expressão aumentada do receptor da endotelina A (ETRA) está associada à diferenciação induzida das células de melanoma A375, enquanto que estas expressam, predominantemente, ETRB no seu estado maligno (Ohtani et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 234:526-30 (1997)). Infelizmente, os papéis dos receptores da endotelina (ETR) não resultam evidentes a partir de estudos prévios. Enquanto que um relatório indica que a endotelina-1 (ETl), actuando através do ETRB, medeia os efeitos mitogénicos e quimiocinéticos em células de melanoma (Yohn et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 201:449-57 (1994)), um outro relatório sugere outros mecanismos para a ETl (Okazawa et al., J. Biol. Chem., 273:12584-92 (1998)). Para além disso, pelo menos num estudo, o interesse pelo ETRB estava relacionado com a hipertensão (Hashimoto et al., Biol. Pharm. Buli., 21(8):800-804 (1998)). Adicionalmente, foi descrita a endotelina-3 (ET3), no entanto, muitas dessas descrições referem-se a células não malignas (normais), em desenvolvimento (Lahau et al., PNAS, 93:3892-7 (1996)).

Foi descrita, em estudos, actividade do ETRA e do ETl relacionada com células malignas, no entanto, estes estudos 2 foram realizados in vitro. Ver, por exemplo Nelson et al., Câncer Res., 56:663-8 (1996). 0 documento WO 00/36918 constitui parte do estado da técnica, de acordo com o Artigo 54(3) e (4) da EPC e divulga a utilização de Ro61 na indução de morte celular apoptótica no melanoma. Nas suas reivindicações, é rejeitada a excluída de Ro61.

Consequentemente, verifica-se uma necessidade de identificação dos compostos que possam ser utilizados in vivo, para o tratamento de doenças, tal como o cancro. Em particular, existe uma necessidade da capacidade de visar, selectivamente, células malignas e de indução da morte celular.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Numa forma de realização, a invenção proporciona a utilização de um inibidor de um receptor da endotelina B na produção de um medicamento para o tratamento do cancro da pele, contanto que o inibidor não seja Ro61. A invenção proporciona a utilização de um inibidor de uma actividade do receptor da endotelina B, numa quantidade terapeuticamente eficaz, na preparação de um medicamento a ser administrado a um indivíduo com necessidade de tratamento de cancro da pele. A administração pode ocorrer através de vários métodos conhecidos na técnica, incluindo por administração, directamente no local do tumor ou, de um modo preferido, a administração é sistémica. 3

Numa outra forma de realização preferida, o cancro está num estado metastático. Numa forma de realização, o inibidor é um antagonista do receptor da endotelina B. Numa forma de realização preferida, o inibidor é BQ788 ou um seu derivado. Numa outra forma de realização preferida, o inibidor é uma molécula anti-sentido em relação a um ácido nucleico do receptor da endotelina ou a um ácido nucleico de um agonista do receptor da endotelina.

Num outro aspecto, a invenção proporciona um método in vitro para a indução da diferenciação de uma célula, compreendendo um receptor da endotelina B, contanto que o inibidor não seja Ro61. Numa forma de realização, o método compreende a administração de um inibidor de um receptor da endotelina B à referida célula, numa quantidade indutora da diferenciação. Ainda noutra forma de realização, é proporcionado um método in vitro para a indução da apoptose numa célula. Um método compreende a administração de um inibidor a um receptor da endotelina B, que não Ro61, à referida célula, numa quantidade indutora da apoptose. De um modo preferido, a célula é uma célula de cancro.

Num outro aspecto, é proporcionada a utilização de uma substância para a preparação de um medicamento, para distribuição a uma célula cancerosa da pele, num indivíduo. A utilização compreende a conjugação de uma substância com BQ788 ou com um seu derivado, para formar um conjugado e a administração do referido conjugado ao referido indivíduo. 4

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As Figuras 1A-1F mostram imagens indicando que o antagonista BQ788 do ETRB induz alterações morfológicas em células de melanoma em cultura. As células foram cultivadas durante 4 dias com BQ788 100 μΜ (Figuras A, C, e E) ou com veiculo (Figuras B, D e F) . As linhas celulares foram a linha SK-MEL 28 de melanoma (Figuras A e B), a linha SK-MEL 5 de melanoma (Figuras C e D) e a 293 de rim (Figuras E e F) . As células de melanoma tratadas com fármacos têm uma forma e acumulação de pigmento negro diferentes. As imagens foram obtidas com uma óptica de campo claro, numa ampliação de 40 x. A Figura 2 é um gráfico indicando que BQ788 reduz o número de células viáveis em melanoma em cultura, mas não em células de rim. As células foram cultivadas na presença de BQ788 ou de veiculo ou sem qualquer tratamento, durante 4 dias. Foram submetidos três poços de cada patologia ao ensaio MTS. Foram calculadas as médias e foram representadas graficamente como a percentagem do valor do tratamento com veiculo, + S.E.M. Os valores de P foram calculados utilizando esse teste para valores absolutos. A experiência foi repetida 3 vezes, cada uma originando resultados semelhantes.

As Figuras 3A e 3B mostram imagens de géis mostrando resultados de RT-PCR, revelando a expressão de ARNm do ETRB e do etra em várias linhas celulares. As bandas correspondentes aos ARNm do ETRB (Figura 3A) (220 bp) e do ETRA (Figura 3B) (352 bp) foram obtidas, utilizando sequências iniciadoras e protocolos publicados (21). 5 A Figura 4 é um gráfico indicando que o antagonista BQ123 do ETRA, selectivo, não reduz o número de células viáveis em células de melanoma em cultura. As condições e a apresentação são como descritas para a experiência com BQ788, apresentada na Figura 2. A Figura 5 é um gráfico indicando que o agonista sarafotoxina 6c (S6c) selectivo para ETRB, pode anular os efeitos de BQ788 sobre células de melanoma. Em experiências semelhantes às ilustradas na Figura 2, a S6c foi testada para os seus efeitos sobre células A375 em cultura, isolada ou em combinação com BQ788, a várias concentrações. 0 agonista S6c do ETRB estimula o crescimento celular e pode bloquear os efeitos inibidores do antagonista do etrb. A Figura 6 é um gráfico indicando que a injecção intra-tumoral de BQ788 inibe o crescimento tumoral do melanoma em murganhos nude. Os murganhos nude (nu/nu, de origem BALB/c) foram implantados com enxertos de células A375, subcutaneamente, no flanco. Após os tumores terem atingido, aproximadamente, 4 mm de diâmetro, estes foram injectados, diariamente, com BQ788, durante 9 dias. Os diâmetros perpendiculares dos tumor foram medidos, diariamente, para estimar o volume do tumor. Os controlos foram injectados com veiculo, com o mesmo planeamento. Foram reunidos dados de 3 experiências, utilizando 10 murganhos tratados com BQ788 e 8 murganhos tratados com veiculo. Os valores de P foram calculados, utilizando o teste t. Foram obtidas conclusões semelhantes a partir da medição dos pesos dos tumores. 6

As Figuras 7A e 7B são gráficos indicando que a administração sistémica de BQ788 inibe o crescimento do tumor de melanoma em murganhos nude. A experiência foi semelhante à descrita na Figura 6, excepto por o fármaco e o veiculo terem sido injectados diariamente i. p. Na Figura 7A, foram reunidos os dados de 6 murganhos tratados com BQ788. Na Figura 7B, são traçadas curvas separadas para os dados dos 3 murganhos, nos quais BQ788 reduziu a velocidade do crescimento tumoral e para os dados dos 3 murganhos nos quais BQ788 causou a regressão dos tumores.

As Figuras 8A-8G são fotografias mostrando coloração TÚNEL de tumores, indicando que BQ788 induz a apoptose. As Figuras 8A-8D mostram secções representativas de 4 tumores de murganhos injectados com BQ788 e as Figuras 8E-8G mostram tumores de murganhos injectados com veiculo. As células positivas com TUNEL são, comparativamente, maiores nos animais tratados com fármaco, indicando apoptose intensificada. A ampliação é de 20 x.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO São aqui proporcionadas utilizações para a preparação de um medicamento para o tratamento do cancro da pele. Em alguns casos, o tratamento do cancro pode incluir o tratamento de tumores sólidos ou o tratamento de metástases. A metástase é a forma de cancro em que as células transformadas ou malignas se estão a deslocar e a disseminar o cancro de um local para outro. O cancro da pele inclui melanoma maligno, carcinoma da célula basal, carcinoma das células escamosas, sarcoma de Karposi, verrugas, nevos displásticos, lipoma, angioma, dermatofibroma, 7 quelóides e psoríase. De um modo muito preferido, o cancro é um melanoma maligno. Em ainda outra forma de realização preferida, o cancro é um melanoma metastático. 0 termo "célula cancerosa", como aqui proporcionado, inclui uma célula afectada por qualquer das patologias cancerosas aqui proporcionadas. 0 indivíduo ou doente é, geralmente, um sujeito humano, embora, como será tido em consideração pelos especialistas na técnica, o doente pode ser, também, um animal. Deste modo, outros animais, incluindo mamíferos, tais como roedores (incluindo murganhos, ratos, hamsteres e cobaios), gatos, cães, coelhos, animais de pecuária, incluindo vacas, cavalos, cabras, ovelhas, porcos, etc. e primatas (incluindo macacos, chimpanzés, orangotangos e gorilas) estão incluídos dentro da definição de doente.

Numa forma de realização um inibidor da actividade do ETRB, como aqui definido, inibe o crescimento canceroso da pele ou reduz a proliferação em, pelo menos 30%, de um modo mais preferido 40%, de um modo mais preferido 50%, de um modo mais preferido 70%, de um modo mais preferido 90% e, de um modo muito preferido em, pelo menos 95%. Numa forma de realização preferida, o inibidor do ETRB causa a regressão do tumor em, pelo menos 30%, de um modo mais preferido 44%, de um modo mais preferido 50%, de um modo mais preferido 70%, de um modo mais preferido 90% e, de um modo muito preferido em, pelo menos 95%. A determinação da inibição ou regressão pode ser realizada pela comparação do efeito com o tratamento, como aqui descrito, em comparação com uma amostra de controlo, em que não é proporcionado tratamento, por exemplo, um inibidor do receptor da endotelina. Em alguns casos, a amostra de controlo pode ter um tumor, o qual cresce até duas vezes, três vezes ou quatro 8 vezes o volume do tecido que é tratado de acordo com os métodos, como aqui descrito. Numa forma de realização preferida, os tumores tratados crescem, pelo menos, seis vezes mais lentamente do que os controlos.

Numa forma de realização, um inibidor da actividade de ETRB tem a actividade de inibição do ETRB. A actividade de inibição de ETRB inclui uma ou mais das seguintes caracteristicas: inibe o crescimento canceroso, regride o crescimento do cancro, induz a apoptose numa célula cancerosa, induz a diferenciação numa célula cancerosa, induz a pigmentação numa célula cancerosa, antagoniza ο ET3, ET2 e/ou ET1, de um modo preferido, ligação a um ETRB, selectivamente e antagoniza o S6c. É aqui proporcionada qualquer combinação destas caracteristicas, incluindo a totalidade ou um ou mais, com uma ou mais exclusões.

Um inibidor da actividade do ETRB ou um inibidor do ETRB, como aqui descrito, inclui BQ788 e outros compostos, os quais são inibidores do ETRB, os quais têm bioactividade de inibição do ETRB. 0 BQ788 (N-cis-2, 6-dimetilpiperidinocarbonil-L-Y-metil-leucil-D-l-metoxicarboniltriptofanil-D-norleucina foi anteriormente descrito, e. g., Ishikawa et ai., PNAS, 91:4892-4896 (1994). Os derivados do BQ788, como aqui utilizados, são funcionalmente equivalentes a BQ788, por estes terem actividade inibidora de ETR, de um modo preferido, do ETRB. Outros inibidores do ETRB incluem, mas não estão limitados a IRL 1083, RES7011, RES7013, PD142983 e IRL2500.

Numa outra forma de realização, o inibidor do ETRB liga-se a mais de um ETR. Deste modo, numa forma de realização o inibidor do ETRB é seleccionado do grupo consistindo em LU302872, TAK044, PD142893, PD145065, BE18257A/W7338A, Bosentan 9 (R047-0203), SB217242, R0468443, SB209670, ácidos Tieno [2,3-d]pirimidina-3-acético, RO610612, RO462005, PD156252, A182086, L744453 e L754142.

Num outro aspecto da invenção, o inibidor do ETRB é uma molécula anti-sentido em relação ao ácido nucleico codificando um ETRB ou um ligando nativo do ETRB, tais como, ETl, ET2 ou ET3. As moléculas anti-sentido incluem oligonucleótidos compreendendo uma sequência ácido nucleico em cadeia simples (quer ARN, quer adn) , com capacidade de ligação ao ARNm alvo do receptor ou do ligando (sentido) ou sequências de ADN (anti-sentido) . Os oligonucleótidos anti-sentido ou sentido, de acordo com a presente invenção, compreendem um fragmento da região codificante do receptor ou ligando. Esse fragmento compreende, geralmente, pelo menos, cerca de 14 nucleótidos, de um modo preferido, desde cerca de 14 a 30 nucleótidos. A capacidade de obtenção de um oligonucleótido anti-sentido ou sentido, baseado numa sequência de ADNc codificando uma determinada proteína (anteriormente descrita na técnica) é descrita em, por exemplo, Stein et al., Câncer Res., 48:2659, (1988) e van der Krol et al., BloTechnlques, 6:958 (1988). Os oligonucleótidos anti-sentido ou sentido compreendem, adicionalmente, oligonucleótidos tendo estruturas base açúcar-fosfodiéster modificadas (ou outras ligações açúcar, tais como as descritas no documento WO 91/06629) e em que essas ligações açúcar são resistentes às nucleases endógenas. Esses oligonucleótidos com ligações açúcar resistentes são estáveis in vivo (í. e., com capacidade de resistência à degradação enzimática), mas conservam especificidade de sequência, de forma a terem capacidade de ligação a sequências nucleotídicas alvo. 10

Outros exemplos de oligonucleótidos anti-sentido ou sentido incluem os oligonucleótidos que estão covalentamente ligados a unidades orgânicas, tais como as descritas no documento WO 90/10048 e outras unidades que aumentam a afinidade do oligonucleótido para uma sequência de ácido nucleico alvo, tal como, poli-L-lisina). Ainda para além disso, podem ser ligados agentes intercalantes, tais como a elipticina e agentes alquilantes ou complexos metálicos, a oligonucleótidos sentido ou anti-sentido, para alterar as especificidades de ligação do oligonucleótido anti-sentido ou sentido à sequência nucleotidica alvo.

Num outro aspecto, o inibidor do ETRB é um inibidor da enzima conversora da endotelina (ECE), a qual processa precursores da endotelina. Os inibidores da ECE incluem, mas não estão limitados a, CGS26303 e fosforamido. Podem, também, ser utilizadas moléculas anti-sentido da ECE.

Numa forma de realização, o inibidor do receptor da endotelina B é administrado a uma célula ou a um indivíduo, antes do desenvolvimento do cancro da pele. Por exemplo, uma pessoa em perigo de cancro da pele pode ser tratada com uma composição compreendendo um inibidor do receptor da endotelina B, para prevenir ou inibir o desenvolvimento do distúrbio ou estado de doença. É entendido que as composições aqui descritas são específicas para células anormais ou doentes e não têm um efeito inibidor em células normais, por exemplo, não malignas. Deste modo, as composições podem ser administradas às células antes do estado patológico, mas são eficazes após o estado de doença ser induzido. 11

Numa forma de realização preferida de cada uma das utilizações aqui proporcionadas, o inibidor, como aqui descrito, é administrado a uma célula compreendendo um receptor da endotelina B. Os receptores da endotelina B estão localizados, pelo menos, no endotélio e nos tecidos não-vasculares, tais como o fígado, rim e cérebro. Os receptores estão, também, localizados em determinados tecidos de músculos lisos vasculares. Numa forma de realização preferida, o receptor da endotelina B é expresso, mas a um nível comparativamente baixo, em comparação com níveis de expansão em outras células malignas. Deste modo, numa forma de realização, níveis relativamente baixos de ARNm do ETRB numa célula maligna proporcionam um progóstico positivo.

Num outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método in vitro para a indução da diferenciação numa célula de melanoma. A identificação da diferenciação pode ser determinada através de técnicas padrão na técnica, incluindo por identificação de alterações morfológicas. A célula compreende um receptor da endotelina B.

Numa nova forma de realização, é proporcionado um método in vitro para a indução da apoptose numa célula de melanoma. 0 método de indução da apoptose compreende a administração de um inibidor de um receptor da endotelina B, à referida célula, numa quantidade indutora da apoptose. Numa forma de realização preferida, o inibidor é específico para um ETRB. De um modo mais preferido, o inibidor é BQ788 ou um derivado de BQ788. Numa forma de realização, o inibidor é exclusivo da endotelina-1 (ET—1). Uma característica típica da apoptose é a activação de uma cascata de proteases citoplasmáticas que resulta na quebra de proteínas alvo seleccionadas. A célula sofre de cancro da 12 pele. São conhecidos na técnica kits padrão para a identificação de células que estão a sofrer apoptose, por exemplo, o método TUNEL. Adicionalmente, a apoptose pode ser identificada por um aumento significativo das células hipodiplóides, condensação da cromatina e/ou fragmentação do ADN. É descrito um método de rastreio para um agente bioactivo capaz de interferir na ligação entre um receptor da endotelina, de um modo preferido, entre um receptor da endotelina B e um ligando. Um ligando é qualquer composto ou composição que se liga ao receptor. De um modo preferido, o ligando é um agonista ou um antagonista. De um modo muito preferido, o método rastreia para a interferência entre um agonista e o receptor. Um agonista induz, aumenta ou mantém a actividade do ETR enquanto que um antagonista inibe a actividade de ETR. A identificação dos efeitos de um inibidor do ETR numa célula permite a concepção de ensaios de rastreio de fármacos, para compostos que se ligam ou interferem com a ligação do ETR e para compostos que modulam a actividade do ETR.

Os métodos compreendem a combinação entre um ligando de ETR, de um modo preferido, entre um inibidor ou agonista do ETR e um agente bioactivo candidato e a determinação da ligação entre o ETR e ligando de ETR. Numa forma de realização preferida, é utilizado um agonista. De um modo preferido, o ETR é um ETRB. Quando a ligação é alterada na presença do agente bioactivo candidato, o agente bioactivo candidato é identificado como um agente que interfere com a ligação entre um ETR e um ligando de ETR. De um modo preferido, o ligando de ETRB é um agonista, incluindo ET3 ou S6c. Em outras formas de realização, adicionalmente discutidas abaixo, a bioactividade é determinada. 13 0 termo "agente bioactivo candidato" ou "composto exógeno", como aqui utilizado, descreve qualquer molécula, e. g., proteína, pequena molécula orgânica, hidratos de carbono (incluindo polissacáridos), polinucleótidos, lípidos, etc. Geralmente, são preparadas várias misturas de ensaio em paralelo, com diferentes concentrações do agente, para a obtenção de uma resposta diferencial às várias concentrações. Tipicamente, uma destas concentrações serve como um controlo negativo, i. e., na concentração zero ou abaixo do nível de detecção.

Os agentes candidatos abrangem numerosas classes químicas, embora, tipicamente, estas sejam moléculas orgânicas, de um modo preferido, pequenos compostos orgânicos tendo um peso molecular de mais de 100 e menos de, cerca de 2500 daltons. Os agentes candidatos compreendem grupos funcionais necessários para a interacção estrutural com proteínas, particularmente, ligação de hidrogénio e, tipicamente, incluem, pelo menos, um grupo amina, carbonilo, hidroxilo ou carboxilo, de um modo preferido, pelo menos, dois dos grupos químicos funcionais. Os agentes candidatos compreendem, frequentemente, estruturas de carbono ciclicas ou heterociclicas e/ou estruturas aromáticas ou poliaromáticas substituídas com um ou mais dos grupos funcionais acima. Os agentes candidatos são, também, encontrados entre biomoléculas, incluindo péptidos, sacáridos, ácidos gordos, esteróides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estruturais ou suas combinações.

Os agentes candidatos são obtidos a partir de uma grande variedade de fontes, incluindo bibliotecas de compostos sintéticos ou naturais. Por exemplo, estão disponíveis numerosos 14 meios para a síntese aleatória e dirigida de uma grande variedade de compostos orgânicos e biomoléculas, incluindo a expressão de oligonucleótidos aleatórios. Alternativamente, estão disponíveis ou são facilmente produzidas, bibliotecas de compostos naturais, sob a forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetais e animais. Adicionalmente, as bibliotecas e os compostos naturais ou produzidos sinteticamente são facilmente modificados, através de meios químicos, físicos e bioquímicos convencionais. Os agentes farmacológicos conhecidos podem ser submetidos a modificações químicas dirigidas ou aleatórias, tais como acilação, alquilação, esterificação, amidação, para produzir análogos estruturais. É utilizada uma biblioteca de diferentes agentes bioactivos candidatos. De um modo preferido, a biblioteca deve proporcionar uma população suficientemente estruturalmente diversa de agentes aleatórios, de forma a produzir uma gama de diversidade probabilisticamente suficiente para permitir a ligação a um alvo particular. Consequentemente, uma biblioteca de interacção deve ser suficientemente grande de forma a que, pelo menos, um dos seus membros tenha uma estrutura que lhe forneça afinidade para o alvo. Embora seja difícil a determinação do tamanho absoluto necessário de uma biblioteca de interacção, a natureza fornece uma sugestão com a resposta imunitária: uma diversidade de 107-108 anticorpos diferentes proporciona, pelo menos, uma combinação com afinidade suficiente para interagir com a maioria dos antigénios potenciais contactados por um organismo. As técnicas de selecção in vitro publicada mostraram, também, que um tamanho de biblioteca de 107 a 108 é suficiente para encontrar estruturas com afinidade para o alvo. Uma biblioteca com todas as combinações de um péptido com 7 a 20 aminoácidos de comprimento, tal como, geralmente, proposto aqui, tem o 15 potencial para codificar de 207 (109) a 2020 . Deste modo, com bibliotecas com 107 a 108 moléculas diferentes, os presentes métodos permitem um subconjunto "de trabalho" de uma biblioteca de interacção teoricamente completa para 7 aminoácidos e um subconjunto de formas para a biblioteca com 2020. Deste modo, numa forma de realização preferida, são simultaneamente, analisadas, pelo menos 106, de um modo preferido, pelo menos 107, de um modo mais preferido, pelo menos 108 e, de um modo muito preferido, pelo menos 109 sequências diferentes nos presentes métodos. Os métodos preferidos maximizam o tamanho e a diversidade da biblioteca.

Os agentes bioactivos candidatos podem ser proteínas. Por "proteína" é aqui pretendido significar, pelo menos, dois aminoácidos ligados covalentamente, o que inclui proteínas, polipéptidos, oligopéptidos e péptidos. A proteína pode ser constituída por aminoácidos de ocorrência natural e ligações peptídicas ou estruturas peptidomiméticas sintéticas. Deste modo, "aminoácido" ou "resíduo de péptido", como aqui utilizado, significa aminoácidos, tanto de ocorrência natural, como sintéticos. Por exemplo, homo-fenilalanina, citrulina e noreleucina são considerados aminoácidos para os objectivos da invenção. "Aminoácido" inclui, também, resíduos de iminoácidos tais como prolina e hidroxiprolina. A cadeia lateral pode estar na configuração (R) ou (S) . Na forma de realização preferida, os aminoácidos estão na configuração (S) ou L. Se são utilizadas cadeias laterais de ocorrência não-natural, podem ser utilizados substituintes não-aminoácido, por exemplo, para prevenir ou retardar degradações in vivo. Podem, também, ser adicionados grupos químicos bloqueantes ou outros substituintes químicos. 16

Os agentes bioactivos candidatos podem ser proteínas de ocorrência natural ou fragmentos de proteínas de ocorrência natural. Deste modo, por exemplo, podem ser utilizados extractos celulares contendo proteínas ou digestões aleatórias ou dirigidas de extractos celulares proteicos. Podem ser produzidas, desta forma, bibliotecas de proteínas procariotas e eucariotas, para o rastreio nos sistemas aqui descritos. São, particularmente preferidas, nesta forma de realização, bibliotecas de proteínas bacterianas, fúngicas, virais e de mamífero, sendo as últimas preferidas e sendo as proteínas humanas especialmente preferidas.

Os agentes bioactivos candidatos podem ser péptidos com desde cerca de 5 a cerca de 30 aminoácidos, sendo preferidos com desde cerca de 5 a cerca de 20 aminoácidos e sendo, particularmente preferidos com desde cerca de 7 a, cerca de 15. Os péptidos podem ser digestões de proteínas de ocorrência natural, como é descrito acima, péptidos aleatórios ou péptidos aleatórios "enviezados". Por equivalentes "aleatórios" ou gramaticais, é aqui pretendido significar que cada ácido nucleico e péptido consiste, respectivamente, em nucleótidos e aminoácidos essencialmente aleatórios. Uma vez que, geralmente, estes péptidos aleatórios (ou ácidos nucleicos, discutidos abaixo) são sintetizados quimicamente, estes podem incorporar qualquer nucleótido ou aminoácido em qualquer posição. O processo sintético pode ser concebido para produzir proteínas ou ácidos nucleicos aleatórios, para permitir a formação da totalidade ou da maioria das combinações possíveis ao longo do comprimento da sequência, formando, deste modo, uma biblioteca de agentes proteicos bioactivos candidatos aleatórios. 17 sem A biblioteca pode ser completamente aleatória, preferências ou constantes de sequência em qualquer posição. Numa forma de realização preferida, a biblioteca é enviezada. Ou seja, algumas posições dentro da sequência são mantidas constantes ou seleccionadas a partir de um número limitado de possibilidades. Por exemplo, numa forma de realização preferida, os nucleótidos ou os resíduos de aminoácido são aleatórios dentro de uma classe definida, por exemplo, de aminoácidos hidrofóbicos, resíduos hidrofílicos, resíduos impedidos estericamente (pequenos ou grandes), para a criação de cisteínas, para a reticulação, prolinas para os domínios SH-3, serinas, treoninas, tirosinas ou histidinas para locais de fosforilação, etc. ou para purinas, etc.

Os agentes bioactivos candidatos podem ser ácidos nucleicos. "Ácido nucleico" ou "oligonucleótido" ou equivalentes gramaticais significam aqui, pelo menos, dois nucleótidos ligados covalentamente em conjunto. Um ácido nucleico da presente invenção irá, geralmente, conter ligações fosfodiéster, embora, em alguns casos, como descrito abaixo, estejam incluídos análogos de ácidos nucleicos que podem ter estruturas base alternativas, compreendendo, por exemplo, fosforamida (Beaucage et al., Tetrahedron, 49(10):1925 (1993) e referências contidas; Letsinger, J. Org. Chem., 35:3800 (1970); Sprinzl, et al., Eur. J. Biochem., 81:579 (1977); Letsinger, et al., Nucl. Acids Res., 14:3487 (1986); Sawai, et al., Chem. Lett., 805 (1984),

Letsinger, et al., J. Am. Chem. Soc., 110:4470 (1988); e Pauwels, et al., Chemica Scripta, 26:141 (1986)), fosforotioato (Mag, et al., Nucleic Acids Res., 19:1437 (1991); e Patente U.S. N° 5644048), fosforoditioato (Briu, et al., J. Am. Chem. Soc., 111:2321 (1989)), ligações O-metilfosforamidite (ver Eckstein,

Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford 18

University Press) e estruturas base e ligações peptídicas e de ácidos nucleicos (ver Egholm, J. Am. Chem. Soc., 114:1895 (1992); Meier, et al., Chem. Int . Ed. Engl., 31:1008 (1992);

Nielsen, Nature, 365:566 (1993); Carlsson, et al., Nature, 380:207 (1996), cuja totalidade é incorporada por referência)). Outros análogos de ácidos nucleicos incluem os com estruturas base positivas (Denpcy, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 92:6097 (1995)); estruturas base não-iónicas (Patentes U.S. N° 5386023; 5637684; 5602240; 5216141 e 4469863; Kiedrowshi, et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English, 30:423 (1991);

Letsinger, et al., J. Am. Chem. Soc., 110:4470 (1988);

Letsinger, et al., Nucleoside & Nucleotide, 13:1597 (1994);

Capítulos 2 e 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. v.S. Sanghui e P. Dan Cook; Mesmaeker, et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett., 4:395 (1994); Jeffs, et al., J. Biomolecular NMR, 34:17 (1994); Tetrahedron Lett., 37:743 (1996)) e estruturas base não-ribose, incluindo as descritas nas Patentes U.S. N° 5235033 e 5034506 e nos Capítulos 6 e 7, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. V.S. Sanghui e P. Dan Cook. São, também, incluídos ácidos nucleicos contendo um ou mais açúcares carbocíclicos, dentro da definição de ácidos nucleicos (ver Jenkins et al., Chem. Soc. Rev., (1995) pp 169-176). São descritos vários análogos de ácidos nucleicos em Rawls, C & E News, 2 de Junho de 1997, página 35. Todas estas referências são, deste modo, expressamente incorporadas por referência. Estas alterações da estrutura base de ribose-fosfato podem ser realizadas para facilitar a adição de partes adicionais, tais como marcações ou para aumentar a estabilidade e a meia-vida dessas moléculas em ambientes fisiológicos. Para além disso, podem ser realizadas misturas de ácidos nucleicos de ocorrência natural e de análogos. Alternativamente, podem ser 19 realizadas misturas de diferentes análogos de ácidos nucleicos e misturas de ácidos nucleicos de ocorrência natural e análogos. Os ácidos nucleicos podem ser de cadeia simples ou de cadeia dupla, como especificado ou podem conter porções de sequências, tanto de cadeia simples, como de cadeia dupla. 0 ácido nucleico pode ser ADN, tanto genómico, como ADNc, ARN ou um híbrido, em que o ácido nucleico contém qualquer combinação de desoxiribo e ribonucleótidos e qualquer combinação de bases, incluindo uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xatanina hipoxatanina, isocitosina, isoguanina, etc.

Como descrito acima, geralmente para proteínas, os agentes bioactivos ácidos nucleicos candidatos podem ser ácidos nucleicos de ocorrência natural, ácidos nucleicos aleatórios ou ácidos nucleicos aleatórios "enviezados". Podem ser utilizados, por exemplo, digestões de genomas procariotas ou eucariotas, como é descrito acima para as proteínas.

Os agentes bioactivos candidatos podem ser porções químicas orgânicas, uma grande variedade das quais está disponível na literatura. São, particularmente, preferidas moléculas pequenas. As moléculas pequenas têm, normalmente, menos de, cerca de, 800 D, de um modo mais preferido, menos de 500 D e, de um modo mais preferido, menos de 200 D.

Os compostos ou as composições com actividade do ETR, como descritos acima, são identificados por rastreio. A actividade do ETRB inclui uma ou mais das seguintes características: ligação ao ETRB, de um modo preferido, induzindo a diferenciação, induzindo a pigmentação, reduzindo a proliferação e induzindo a apoptose, selectivamente. Numa forma de realização preferida, a actividade do ETRB inclui, pelo menos, um de, indução da 20 diferenciação, indução da pigmentação, redução da proliferação e indução da apoptose. De um modo mais preferido, a ligação ao ETRB e, pelo menos, uma outra das referidas caracteristicas identificam um agente que modula a actividade do ETRB.

Geralmente, numa forma de realização preferida dos presentes métodos para, por exemplo, ensaios de ligação, um ETR (por conveniência, é utilizado ETRB para ilustração) ou o agente candidato está ligado de um modo não difundivel a um suporte insolúvel, tendo áreas isoladas de recepção de amostra (e. g. uma placa de microtitulação, um “array", etc.). Os suportes insolúveis pode ser feitos por qualquer composição à qual as composições possam ser ligadas, podem ser facilmente separados do material solúvel e são, de qualquer outra forma, compatíveis com o método global de rastreio. A superfície desses suportes pode ser sólida ou porosa e com qualquer forma conveniente. Os exemplos de suportes insolúveis adequados incluem placas de microtitulação, "arrays", membranas e esferas. Estes são, tipicamente, constituídos por vidro, plástico (e. g., poliestireno), polissacáridos, nylon ou nitrocelulose, Teflon™, etc. As placas de microtitulação e os "arrays" são especialmente convenientes, dado que pode ser realizado um grande número de ensaios, simultaneamente, utilizando pequenas quantidades de reagentes e de amostras. Em alguns casos, são incluídas esferas magnéticas e semelhantes. A forma particular de ligação da composição não é crucial, desde que seja compatível com os reagentes e métodos globais da invenção, mantenha a actividade da composição e seja não difundivel. Os métodos preferidos de ligação incluem a utilização de anticorpos (os quais não bloqueiam estericamente o local de ligação do ligando local e a sequência de activação, quando a proteína é ligada ao suporte), a ligação directa a suportes "adesivos" ou iónicos, a 21 reticulação química, a síntese da proteína ou do agente na superfície, etc. Após a ligação da proteína ou do agente, o material não ligado em excesso é removido por lavagem. As áreas de recepção da amostra podem ser, então, bloqueadas por incubação com albumina de soro bovino (BSA), caseína ou com outra proteína inócua ou outra porção. São, também, incluído nesta invenção ensaios de rastreio, em que não são utilizados suportes sólidos; são descritos abaixo exemplos desses. 0 etrb pode ser ligado ao suporte e um agente bioactivo candidato é adicionado ao ensaio. Alternativamente, o agente candidato é ligado ao suporte e o ETRB é adicionado. Os novos agentes ligação incluem anticorpos específicos, agentes de ligação não naturais identificados em rastreios de bibliotecas químicas, análogos de péptido, etc. São de particular interesse ensaios de rastreio de agentes com uma baixa toxicidade para células humanas. Pode ser utilizada uma grande variedade de ensaios com esta finalidade, incluindo ensaios de ligação proteína-proteína in vitro marcados, ensaios de deslocamento da mobilidade electroforética, imunoensaios para a ligação de proteínas, ensaios funcionais (ensaios de fosforilação, etc.) e semelhantes. A determinação da ligação do agente bioactivo candidato ao ETRB pode ser realizada de várias formas. Numa forma de realização preferida, o agente bioactivo candidato é marcado e a ligação é determinada directamente. Por exemplo, isto pode ser realizado pela ligação da totalidade ou de uma parte do ETRB a um suporte sólido, adição de um agente candidato marcado (por exemplo uma marcação fluorescente), lavagem do reagente em excesso e determinação se a marcação está presente no suporte 22 sólido. Podem ser utilizados vários passos de bloqueio e de lavagem, como é conhecido na técnica.

Por "marcado" é aqui pretendido significar que o composto está directamente ou indirectamente marcado com uma marcação, a qual proporciona um sinal detectável, e. g., isótopo radioactivo, agente fluorescente, enzima, anticorpos, partículas, tais como partículas magnéticas, agentes quimioluminescentes ou moléculas de ligação específica, etc. As moléculas de ligação específica incluem pares, tais como biotina e estreptavidina, digoxina e antidigoxina, etc. Para os membros de ligação específica, o membro complementar será, normalmente, marcado com uma molécula que fornece a detecção, de acordo processos conhecidos, como descrito acima. A marcação pode proporcionar, directamente ou indirectamente, um sinal detectável.

Em algumas formas de realização, apenas um dos componentes é marcado. Por exemplo, as proteínas (ou os agentes candidatos proteicos) podem ser marcadas nas posições da tirosina, utilizando 125I ou com fluóforos. Alternativamente, pode ser marcado mais de um componente com diferentes marcações; utilizando, por exemplo, 125I para as proteínas e um fluóforo para os agentes candidatos.

Os métodos aqui descritos incluem a utilização de ensaios de ligação competitiva. Nesta forma de realização, o competidor é uma porção de ligação conhecida por se ligar à molécula alvo (í. e., ETRB), tais como um anticorpo, péptido, parceiro de ligação, ligando, etc. Numa forma de realização preferida, o competidor compete com um agonista, tais como ET3 ou S6c. De um modo muito preferido, são realizados ensaios adicionais para a 23 identificação do agente candidato como um antagonista. Sob determinadas circunstâncias, pode ser verificada ligação competitiva, como entre o agente bioactivo e a porção de ligação, com a porção de ligação a deslocar o agente bioactivo. Este ensaio pode ser utilizado na determinação dos agentes candidatos que interferem com a ligação entre os ETRB e endotelina 3, S6c, BO-3020 ou BQ-788. "Interferência de ligação", como aqui utilizado, significa que a ligação nativa do ETRB difere na presença do agente candidato. A ligação pode ser eliminada ou pode ocorrer com uma afinidade reduzida. Consequentemente, numa forma de realização, a interferência é causada, por exemplo, por uma alteração da conformação, em lugar da competição directa para o local de ligação nativo. Os métodos descritos podem, também, ser realizados utilizando ETRA.

Numa forma de realização, o agente bioactivo candidato está marcado. Quer o agente bioactivo candidato, quer o competidor, quer ambos, são adicionados, inicialmente, à proteína, durante um tempo suficiente para permitir a ligação, se presente. As incubações podem ser realizadas a qualquer temperatura que facilite a actividade óptima, tipicamente, entre 4 e 40 °C. Os períodos de incubação são seleccionados para uma actividade óptima, mas podem ser, também, optimizados para facilitar um rasteio de elevada capacidade de processamento. Tipicamente, será suficiente entre 0,1 e 1 hora. O reagente em excesso é, geralmente, removido ou retirado por lavagem. É, então, adicionado o segundo componente e é seguida a presença ou a ausência do componente marcado, para indicar ligação.

Numa forma de realização preferida, o competidor é adicionado em primeiro lugar, seguido pelo agente bioactivo candidato. O deslocamento do competidor é uma indicação de que o 24 agente bioactivo candidato está ligado ao ETRB e que, deste modo, tem capacidade de ligação a este e, potencialmente, de modulação da actividade do ETRB. Nesta forma de realização, qualquer componente pode ser marcado. Deste modo, por exemplo, se o competidor for marcado, a presença da marcação na solução de lavagem indica o deslocamento pelo agente. Alternativamente, se o agente bioactivo candidato for marcado, a presença da marcação no suporte indica deslocamento.

Numa forma de realização alternativa, o agente bioactivo candidato é adicionado em primeiro lugar, com incubação e lavagem, seguido pelo competidor. A ausência de ligação pelo competidor pode indicar que o agente bioactivo está ligado ao etrb com uma afinidade mais elevada. Deste modo, se o agente bioactivo candidato for marcado, a presença da marcação no suporte, ligada a uma ausência de ligação do competidor, pode indicar que o agente candidato tem capacidade de ligação ao ETRB.

Numa forma de realização preferida, os métodos compreendem o rastreio diferencial para a identificação de agentes bioactivos com capacidade de modulação da actividade do ETRB. Esses ensaios podem ser realizados com o ETRB ou com células compreendendo o referido ETRB. Numa forma de realização, os métodos compreendem a combinação de um ETRB e um competidor, numa primeira amostra. Uma segunda amostra compreende um agente bioactivo candidato, um ETRB e um competidor. A ligação do competidor é determinada para ambas as amostras e uma alteração ou uma diferença na ligação entre as duas amostras indica a presença de um agente com capacidade de ligação ao ETRB e, potencialmente, de modulação da sua actividade. Ou seja, se a ligação do competidor for diferente na segunda amostra em 25 relação à primeira amostra, o agente tem capacidade de ligação ao ETRB.

Alternativamente, uma forma de realização preferida utiliza o rastreio diferencial para a identificação de fármacos candidatos, que se ligam ao etr nativo, mas que não se podem ligar aos ETR modificados. A estrutura do ETR pode ser modelada e utilizada na concepção racional de fármacos, na síntese agentes que interagem com esse local. Os fármacos candidatos que afectam a bioactividade do etr são, também, identificados pelo rastreio de fármacos para a capacidade para, quer intensificar, quer reduzir a actividade da proteína.

Numa presente forma de realização, em que é adicionado BQ788 e o crescimento do tumor é inibido, o local ligação ao qual BQ788 liga é identificado e isolado.

Podem ser utilizados controlos positivos e controlos negativos nos ensaios. De um modo preferido, a totalidade das amostras de controlo e de teste são realizadas em, pelo menos, triplicado, para se obter resultados estatisticamente significativos. A incubação da totalidade das amostras ocorre durante um tempo suficiente para a ligação do agente à proteína. Após incubação, todas as amostras são lavadas, eliminando o material ligado não-especificamente e é determinada a quantidade de agente ligado, geralmente marcado. Por exemplo, quando é utilizada uma marcação radioactiva, as amostras podem ser contadas num contador de cintilação, para a determinação a quantidade do composto ligado.

Podem ser incluídos vários outros reagentes nos ensaios de rastreio. Estes incluem reagentes, tais como sais, proteínas 26 neutras, e. g., albumina, detergentes, etc., os quais podem ser utilizados para facilitar a ligação óptima proteina-proteina e/ou na redução das interacções não-especificas ou de fundo. Podem ser, igualmente, utilizados reagentes que, de alguma forma, melhoram a eficiência do ensaio, tais como inibidores de proteases, inibidores de nucleases, agentes anti-microbianos, etc. A mistura de componentes pode ser adicionada em qualquer ordem que proporcione a ligação necessária.

Pode ser, também, realizado o rastreio de agentes que modulam a actividade do ETR. Numa forma de realização preferida, os métodos de rastreio para um agente bioactivo com capacidade de modulação da actividade de ETR, compreendem os passos de adição de um agente bioactivo candidato a uma amostra de um ETR (ou células compreendendo um ETR) e a determinação de uma alteração na actividade biológica do ETR. De um modo preferido, o ETR é ETRB. Num método preferido, isto é realizado com agentes já identificados como ligando ao ETR; nesta forma de realização, a alteração de bioactividade que é determinada, se for verificada, é seleccionada de redução da proliferação e indução da diferenciação e da apoptose. "Modulação da actividade de um ETR" inclui um aumento da actividade, uma redução da actividade ou uma alteração do tipo ou da espécie de actividade presente. Deste modo, numa forma de realização preferida, o agente candidato deve, tanto ligar-se ao ETR (embora possa não ser necessário), como alterar a sua actividade biológica ou bioquímica, como aqui definido. Os métodos incluem, tanto métodos de rastreio in vitro, como são geralmente descritos acima, como de rastreio in vivo, de células com alterações na actividade de ETR. 27

Numa forma de realização, os métodos compreendem a adição de um agente bioactivo candidato, como definido acima, a uma célula compreendendo ETR. Os tipos de células preferidos incluem, praticamente, qualquer célula. Numa forma de realização preferida, a célula é cancerosa ou está exposta a agentes causadores de cancro, após o agente bioactivo estar presente. As células podem conter um ácido nucleico recombinante que codifica um ETR ou ETR nativo. Numa forma de realização preferida, é testada uma biblioteca de agentes candidatos em várias células.

As medições podem ser determinadas de forma a que a totalidade das condições sejam as mesmas para cada medição ou sob várias condições, com ou sem agentes bioactivos ou em etapas diferentes de um estado de doença, tal como cancro. Por exemplo, uma medição pode ser determinada numa célula ou numa população de células em que um o agente bioactivo candidato está presente e em que o agente bioactivo candidato está ausente. Como outro exemplo, as células podem ser avaliadas na presença ou na ausência ou exposição prévia ou subsequente a sinais fisiológicos, por exemplo hormonas, anticorpos, péptidos, antigénios, citocinas, factores de crescimento, potenciais de acção, agentes farmacológicos incluindo agentes quimioterapêuticos, radiação, carcinogénicos ou outras células (i. e., contactos célula-célula). Em ainda um outro exemplo, as medições da bioactividade são obtidas quando as condições são iguais e as alterações são entre uma célula ou população de células e um outra célula ou população de células.

Por uma "população de células" ou "biblioteca de células" é aqui pretendido significar, pelo menos, duas células, sendo preferidas, pelo menos, cerca de 103, sendo particularmente preferidas, pelo menos, cerca de 106 e sendo especialmente 28 preferidas, pelo menos, cerca de 108 a 109. A população ou a amostra podem conter uma mistura de diferentes tipos celulares, provenientes de, quer culturas primárias, quer secundárias, embora sejam preferidas as amostras contendo apenas um único tipo de células, por exemplo, a amostra pode ser de uma linha celular, particularmente, linhas celulares tumorais.

Os tipos de célula preferidos para utilização na invenção incluem, mas não estão limitados a, células de mamífero, incluindo animais (roedores, incluindo murganhos, ratos, hamsteres e gerbilos), primatas e células humanas, particularmente, incluindo células tumorais de todos os tipos, incluindo mama, pele, pulmão, cérvix, colo-rectal, leucemia, cérebro, etc.

As composições aqui descritas, incluindo moduladores de ETR, de um modo preferido, inibidores, incluindo os identificados como tal pelos ensaios aqui proporcionados, podem ser combinadas em mistura com um veículo transportador farmaceuticamente aceitável. As formulações terapêuticas são preparadas para o armazenamento pela mistura do ingrediente activo, tendo o grau pretendido de pureza, com veículos, excipientes ou estabilizantes opcionais, fisiologicamente aceitáveis (Remington's Pharmaceutícal Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), sob a forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são não-tóxicos para os destinatários, nas dosagens e concentrações utilizadas e incluem tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico; polipéptidos de baixo peso molecular (menos de, cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímero hidrofílicos, tais como, 29 polivinilpirrolidona, aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monosacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; álcoois de açúcares, tais como manitol ou sorbitol; contra-iões formadores de sais, tais como sódio; e/ou tensioactivos não-iónicos tais como Tween, Pluronics ou PEG.

As dosagens e concentrações de fármaco pretendidas das composições farmacêuticas da presente invenção podem variar, dependendo da utilização particular pretendida. A determinação da dosagem apropriada ou via de administração encontram-se bem dentro da especialidade de um médico comum. As experiências com animais proporcionam uma orientação fiável para a determinação das doses eficazes em terapia humana. 0 ajustamento interespécie das doses eficazes pode ser realizado seguindo os princípios estabelecidos por Mordenti, J. e Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" em Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Ed., Pergamon Press, Nova Iorque 1989, pp 42-96. 0 termo quantidade "terapeuticamente eficaz", como aqui utilizado, refere-se à quantidade necessária para a realização do tratamento particular, tal como, por exemplo, cancro. "Tratamento" refere-se, tanto ao tratamento terapêutico, como profilático ou às medidas preventivas, em que o objectivo é impedir ou retardar (diminuir) o estado patológico ou o distúrbio visados. Aqueles que necessitam de tratamento incluem os que já apresentam o distúrbio, assim como aqueles com propensão a terem o distúrbio ou aqueles em que o distúrbio deve ser prevenido. Numa forma de realização preferida, o distúrbio está presente. Numa forma de realização preferida, a vida de uma célula ou de um indivíduo é prolongada devido aos métodos aqui descritos. 30

As composições aqui proporcionadas podem ser administradas a um hospedeiro, num veiculo fisiologicamente aceitável, como anteriormente descrito. Os métodos preferidos para a administração incluem a administração sistémica ou directa a uma cavidade tumoral. Num método, são utilizados veículos de libertação prolongada. As composições podem ser administradas em conjunto com outras composições para o tratamento, incluindo, mas não limitadas a agentes quimioterapêuticos e/ou radiação ou com os seus reguladores.

Podem ser introduzidos oligonucleótidos anti-sentido ou sentido numa célula, por qualquer método de transferência génica. Num processo preferido, é inserido um oligonucleótido anti-sentido ou sentido num vector retroviral adequado. É feita contactar uma célula contendo a sequência de ácido nucleico alvo com o vector retroviral recombinante, in vivo ou ex vivo. Os vectores retrovirais adequados incluem, mas não estão limitados a derivados do retrovírus M-MuL V murino, N2 (um retrovírus derivado do M-MuLVj ou os vectores de cópia dupla designados DCT5A, DCT5B e DCT5C (ver documento WO 90/13641) .

Alternativamente, pode ser introduzido um oligonucleótido sentido ou anti-sentido numa célula contendo a sequência de ácido nucleico alvo, pela formação de um complexo oligonucleótido-lípido, como descrito no documento WO 90/10448. O complexo oligonucleótido-lípido sentido ou anti-sentido é, de um modo preferido, dissociado dentro da célula por uma lipase endógena.

Num aspecto adicional da presente invenção, é proporcionado um método in vitro para visar células cancerosas da pele. Numa 31 forma de realização, um composto ou composição a ser distribuído a uma célula é conjugado com BQ788 ou com um seu derivado, o qual é específico para ETRB. A amostra de células contém células malignas da pele expressando ETRB.

Os exemplos seguintes servem para melhor descrever totalmente a forma de utilização da invenção acima descrita, assim como para estabelecer as melhores formas contempladas para a realização de vários aspectos da invenção. É entendido que estes os exemplos não servem, de modo algum, para limitar o verdadeiro âmbito desta invenção, mas são, antes, apresentados com objectivos ilustrativos. EXEMPLO 1:

BQ788 INDUZ DIFERENCIAÇÃO E APOPTOSE EM CÉLULAS CANCEROSAS E INIBE O CANCRO IN VIVO Métodos.

Cultura celular. As linhas celulares de melanoma humano foram obtidas da American Tissue Culture Collection (ATCC) e foram cultivadas com o meio Eagle de Dulbecco (ATCC), contendo soro fetal de vitelo a 10%, glutamina (Gibco) e antibióticos (concentração; mistura Pen-Strep, Gibco) numa incubadora humidificada, com C02 a 5%, a 37°C. O BQ788 e BQ123 (Calbiochem) foram dissolvidos em polioxietileno a 2% (60) óleo de rícino hidrogenado (HC060; Nikko Chemicals). As células foram cultivadas em placas de ELISA de 96 poços. Para o ensaio de viabilidade celular/número de células, foi adicionado inibidor ou veículo no dia após o plaqueamento e as culturas foram 32 incubadas durante 4 dias. Foi utilizado o ensaio MTS na quantificação das células, pela medição da OD em 492 pm (Promega).

Transcrição reversa - análise por PCR. Foi isolado ARN total a partir de cada linha celular, utilizando um kit de isolamento de ARN (Promega) . 0 ADNc foi preparado a partir de 10 pg de ARN total, utilizando Transcritase Reversa MMLV. Foram utilizados dois pg de ADNc para cada reacção PCR. Os iniciadores e as condições foram utilizados como anteriormente descrito (Hamroun et al., J. Cardiovasc, Pharmacol., 26(3):S156—8 (1995) ) .

Imuno-histoquímica. Os tumores foram congelados em gelo seco, seccionados num criostato em secções com 20 pm e foram armazenados a -80 °C. As secções foram lavadas soro fisiológico tamponado com fosfato, isento de cálcio e magnésio (PBS), fixas em paraformaldeído a 4%, durante 1 hora, à temperatura ambiente, bloqueadas com soro de coelho a 2% e incubadas com o anticorpo primário, durante a noite, a 4 °C. Após lavagem em PBS, as secções foram incubadas com um anticorpo secundário biotinilado e a coloração foi revelada, utilizando o kit Elite ABC (Vector Laboratories, CA). Os anticorpos primários utilizados neste estudo foram o monoclonal de rato anti CD31 de murganho (molécula da adesão celular endotelial das plaquetas) e de rato anti CD45 de murganho (antigénio comum dos leucócitos, encontrado em todas as células de origem hematopoiética, excepto nos eritrócitos) (Pharmagen, San Diego, CA) . Foi utilizado um kit de morte celular na coloração TUNEL (Boehringer Mannheim). 33

Resultados . BQ788 induz sinais da diferenciação e reduz a viabilidade das células do melanoma humano in vitro

Os requerentes cultivaram 7 linhas de células de melanoma humano e uma linha celular de rim humano com o antagonista selectivo do ETRB, BQ788, para testar a hipótese de que a função de ETRB desempenha um papel no crescimento celular e na diferenciação do melanoma. A inspecção das culturas tratadas revela alterações morfológicas drásticas em algumas linhas de melanoma. Como apresentado na Figura IA e B, as células SK-MEL 28 desenvolvem grande vacúolos citoplasmáticos e pigmentação intensificada. São observadas alterações semelhantes com tratamento com antagonista de células A375 e RPMI7951 (não apresentado). Todas as linhas apresentam área superficial aumentada e a maioria destas (excepto SK- MEL 3) apresenta aumentos significativos na pigmentação. O tratamento das células SK-MEL 5 resulta, também, num fenótipo dendritico, semelhante ao observado em melanócitos normais, maduros (Figura 1C. D) . Pelo contrário, o tratamento das células 293 do rim com BQ788 não resulta em qualquer uma destas alterações morfológicas (Figura 1E, F) .

Para além da indução de alterações morfológicas indicadoras de diferenciação, o tratamento das células de melanoma com BQ788 resulta, eventualmente, num número reduzido de células e na morte celular. Este efeito foi quantificado, utilizando o ensaio MTS. Como apresentado na Figura 2, a totalidade das 7 linhas de melanoma testadas apresentou uma perda muito significativa no número de células viáveis, após tratamento com BQ788 100 μΜ, embora algumas linhas sejam claramente mais sensíveis do que 34 outras. Pelo contrário, o número de células de rim não é reduzido por concentrações elevadas de BQ788, demonstrando que este inibidor não é, de um modo geral, tóxico.

Para verificar que as células expressam ETRB, os requerentes realizaram RT-PCR, utilizando sequências iniciadoras publicadas (Hamroun et al. , J. Cardiovasc, Pharmacol., 26(3):S156-8 (1995)). Todas estas linhas celulares, incluindo as células de rim, apresentam uma banda do tamanho esperado para o ARNm de etrb autêntico (Figura 3A). Foram necessários cinco ciclos de PCR adicionais para detectar a banda nas células RPMI 7951. Para além disso, todas as linhas celulares expressam ETRA, em vários niveis (Figura 3B) . Foram, anteriormente, descritas verificações semelhantes, na expressão do receptor em algumas destas linhas (Yohn et al., Biochem. Bíophys. Res. Commun., 201:449-57 (1994); Ohtani et al., Biochem. Bíophys. Res. Commun., 234:526-30 (1997)). A co-expressão de ETRA permitiu que os requerentes examinassem o efeito da adição do antagonista selectivo de ETRA, BQ123 (Itoh et al., Biochem. Bíophys. Res. Commun., 195:969-75 (1993)) a estas células. Como apresentado na Figura 4, BQ123 não reduz o número de células viáveis em qualquer destas linhas celulares, mesmo em concentrações elevadas. De facto, este antagonista aumenta, ligeiramente, o número de células em duas das linhas do melanoma, A375 e SK-MEL 28. Deste modo, os efeitos do BQ788 em concentrações elevadas não são mediados pelo ETRA.

Para examinar, ainda, o efeito de BQ788, os requerentes utilizaram o agonista de ETRB altamente selectivo, sarafotoxina 6c (S6c) (Takasaki et al., Toxicon, 26:543-8 (1998)). Como previsto, em concentrações de 0,1 a 1 μΜ, a S6c aumenta o número 35 de células A375 (Figura 5). Significativamente para as presentes experiências, a S6c pode bloquear, completamente, os efeitos de BQ788 nas células A375 (Figura 5) . Deste modo, a capacidade do BQ788 para baixar o número de células de melanoma é devida, provavelmente, à sua acção sobre o ETRB e não como um efeito secundário sobre outro aspecto da fisiologia da célula do melanoma. Q788 inibe o crescimento do melanoma humano em murganhos nude

Os requerentes seleccionaram a linha de células de melanoma A375 para a experiência in vivo. Embora esta linha não seja a mais sensivel ao tratamento com BQ788 em cultura, esta é conhecida por crescer facilmente em murganhos nude. Inicialmente, as células dissociadas foram injectadas, como uma suspensão, no flanco de murganhos nude. Quando os tumores se desenvolveram, foi sacrificado um murganho, o tumor removido e seccionado em fragmentos com, aproximadamente, 3 mm de diâmetro e implantados sob a pele de uma nova série de murganhos nude. Quando o tumor atinge 4 mm de diâmetro (o que demora, aproximadamente, 12 dias, mas pode variar), foram injectados 25 pL de uma solução contendo 20, pg/pL de BQ788 dissolvido em polioxietileno a 2% (60) óleo de ricino hidrogenado (HC060) (Ishikawa et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91:4892-6 (1994)), no centro do tumor, diariamente, durante 9 dias. Os tumores dos murganhos de controlo foram injectados, da mesma forma, com 25 pL de HC060 a 2%. As dimensões do tumor foram medidas antes de cada injecção. Na Figura 6 são apresentados os resultados de três experiências, utilizando um total de 10 murganhos, tratados com BQ788 e 8 murganhos de controlo, tratados com veiculo. No 36 início, o volume tumoral médio foi de 26 mm3, tanto nos murganhos de controlo, como tratados com BQ788. Após 9 dias, o volume tumoral médio do grupo de controlo atingiu 376 mm3, enquanto que o grupo tratado apresentou um volume tumoral médio de 84 mm3. 0 cálculo da taxa de crescimento (tamanho final subtraído do tamanho inicial) revela que os tumores tratados com BQ788 crescem 6 vezes mais lentamente, em comparação com os controlos. São obtidas conclusões semelhantes a partir da comparação entre os pesos dos tumores (média de 446 mg versus 93 mg; p <0,005).

Os requerentes questionaram, seguidamente, se a administração sistémica de BQ788 inibe o crescimento tumoral. Nestas experiências, a indução do tumor e o ponto de partida dos tratamentos foram tal com na abordagem intra-tumoral. Nesse ponto, os murganhos foram injectados i. p. com 100 pL de solução de BQ788 (0, 6 mg de BQ788 em água a 30% e soro fisiológico a 70%, numa concentração final de HC060 de 0,6%) uma ou duas vezes por dia, durante um período de 9 dias. Os murganhos de controlo receberam as mesmas injecções mas sem BQ788. Na primeira experiência, os murganhos foram injectados uma vez por dia e na segunda experiência os murganhos foram injectados de manhã e, de seguida, novamente no início da tarde. Como os resultados destes duas experiências não diferiram, estes foram reunidos e são apresentados na Figura 7A. É evidente que a administração sistémica resulta, também, na inibição eficaz do crescimento tumoral. No entanto, foi verificada alguma heterogeneidade na resposta dos murganhos a BQ788. Durante os 6 primeiros dias, os tumores no grupo BQ788 não diferiram, significativamente, do seu tamanho no dia 1. Após 6 dias, os murganhos BQ788 puderam ser divididos em dois subgrupos que responderam de um modo diferente ao fármaco, como apresentado na Figura 7B. Num grupo de murganhos, o tratamento com BQ788 reduziu a velocidade de 37 crescimento do tumor, enquanto que no outro grupo de murganhos, os tumores encolheram e apresentaram uma paragem total do crescimento.

Foram recolhidos vários dos tumores da experiência da injecção i. p., no dia 10, para exame histológico. As secções foram coradas com anticorpo anti-CD31, para a angiogénese e com o método TÚNEL, para a apoptose. Em geral, o tratamento com BQ-788 resulta em marcação TUNEL intensificada (Figura 8), sugerindo que o fármaco aumenta a apoptose. A coloração com o anticorpo anti-CD-31, para realçar os vasos sanguíneos não revela qualquer indicio de que BQ788 bloqueie a angiogénese (dados não apresentados). A SK-MEL 3 apresenta uma área superficial aumentada (morfologia dendritica), em resposta a BQ788, enquanto que a sua viabilidade é menos afectada do que a de outras linhas. A viabilidade das células SK-MEL 24 e SK-MEL 31 é mais afectada por BQ788 e estas apresentam, também, a caracteristica morfológica adicional da pigmentação aumentada. A SK-MEL 5 é semelhante às últimas duas linhas, mas apresenta, também, dendricidade aumentada. A375, SK-MEL 28 e a linha celular mais sensível RPMI 7951, apresentam vacúolos no seu citoplasma e uma perda, praticamente, completa da viabilidade, em resposta a BQ788. Estes efeitos em cultura parecem ser mediados pela acção do fármaco sobre o próprio ETRB, uma vez que o BQ788 é ineficaz em células A375, na presença do agonista S6c de ETRB. Uma indicação adicional da especificidade da acção de BQ788 é o seu efeito muito diferente em células 293 de rim. Para além disso, o bloqueador selectivo de ETRA, BQ123, não inibiu o crescimento celular do melanoma em cultura, mesmo em concentrações elevadas. 38 A linha celular que apresenta o grau mais elevado de sensibilidade ao tratamento com BQ788, RPM17951, apresenta, também, níveis mais baixos de expressão de ARNm de ETRB, em comparação com outras linhas celulares utilizadas neste estudo. Foi descrito que as células de melanoma metastático humano apresentam expressão de ETRB reduzida, em comparação com células de melanoma primário. Kikuchi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 219: 734-9 (1996). Consequentemente, os presentes dados sugerem que as células do melanoma metastático possam ser as mais sensíveis ao tratamento com BQ788.

As verificações em cultura, particularmente, com as linhas RPMI 7951, SK-MEL 28 e A375, assim como os resultados de TUNEL, in vivo, indicam que o fármaco induz a apoptose. Os requerentes possuem, igualmente, indícios de uma possível função autócrina, uma vez que algumas linhas expressam ARNm de ETl (dados não apresentados). Esta ideia é suportada, adicionalmente, pelo estímulo do crescimento, observado após adição de agonista específico para ETRB a células A375 (Figura 5) . Os resultados opostos obtidos com o antagonista selectivo para ETRA, BQ123, em A375 e SKMEL 28, indicam que os receptores A e B medeiam acções completamente diferentes da ET, nestas células. Quando ETRA é bloqueada, a proliferação pode ser intensificada. É significativo que os principais transcritos de ETRA expressos por linhas de células de melanoma estejam truncados e não possuam afinidade de ligação elevada a ET. Zhang et al. (Zhang et al., Brit. J. Câncer, 78:1141-6 (1998). Pelo contrário, em tecidos normais, o ETRA do tipo selvagem é o transcrito predominante.

Para além disso, existem indícios de que os fármacos compreendendo BQ788 podem ser bem tolerados. Hashimoto et al., 39

Biol.

Pharamceut.

Buli. 21:800-4 (1998); Haynes et al.,

Circulation,

Circulation, 93:1860-70 (1996); Sutsch et al., 98:2262-8 (1998).

Lisboa, 12 de Novembro de 2007 40

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um inibidor de um receptor da endotelina B, na produção de um medicamento para o tratamento de cancro da pele, contanto que o inibidor não seja Ro61.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o cancro é melanoma maliqno, carcinoma da célula basal, carcinoma de célula escamosa ou sarcoma de Karposi.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que o medicamento é para ser administrado sistemicamente.
4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 1 a reivindicação 3, em que o medicamento é para ser administrado a um local tumoral.
5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 1 a reivindicação 4, em que o referido cancro é metastizante.
6. 6. Utilização de acordo com a reivindicação 5, em que o cancro é melanoma metastático.
7. 7. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, em que o referido inibidor é uma molécula anti-sentido em relação a (1) um ácido nucleico do receptor da endotelina ou (2) um ácido nucleico de um aqonista do receptor da endotelina. 1
8. 8. Utilização de acordo com a qualquer das reivindicações 1 a 6, em que o referido inibidor é BQ788 ou um seu derivado, IRL1083, RES7011, RES7013, PD142983 ou IRL2500.
9. 9. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, em que o referido inibidor é BQ788 ou um seu derivado.
10. 10. Utilização de acordo com a reivindicação 9, em que BQ788 ou um seu derivado são conjuqados com uma substância, para formar um conjuqado.
11. 11. Método in vitro para a indução da diferenciação numa célula de melanoma compreendendo um receptor da endotelina B, compreendendo o referido método a administração de um inibidor de um receptor da endotelina B à referida célula, in vitro, numa quantidade indutora da diferenciação, contanto que o inibidor não seja Ro61.
12. 12. Método da reivindicação 11, em que a referida célula é cancerosa.
13. 13. Método in vitro para a indução da apoptose numa célula de melanoma, compreendendo um receptor da endotelina B, compreendendo o referido método a administração de um inibidor de um receptor da endotelina B à referida célula, in vitro, numa quantidade indutora da apoptose, contanto que o inibidor não seja Ro61.
14. 14. Método da reivindicação 13, em que a referida célula é cancerosa. Lisboa, 12 de Novembro de 2007 2