DE69910756T2 - Multiparameter facs test zum ermitteln von änderungen in den zellularen parametern - Google Patents

Multiparameter facs test zum ermitteln von änderungen in den zellularen parametern Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft neuartige Verfahren zur Detektion von Änderungen von Zell-Parametern und insbesondere zum Screening von Bibliotheken kleiner Moleküle, wie z. B. kombinatorischer chemischer Bibliotheken organischer Moleküle, einschließlich Peptiden und anderen chemischen Bibliotheken, zum Binden von Zielmolekülen unter Verwendung von Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierungs- (FACS-) Geräten.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Das Gebiet der Entdeckung von Medikamenten und des Screenings von Medikamenten-Kandidaten, um Leitverbindungen zu identifizieren, erweitert sich zusehends. Herkömmliche Ansätze, um neue und brauchbare Medikamenten-Kandidaten zu identifizieren und zu charakterisieren, umfassen die Isolierung natürlicher Produkte oder synthetische Herstellung, gefolgt vom Testen gegen bekannte oder unbekannte Ziele. Siehe zum Beispiel WO 94/24314, Gallop et al., J. Med. Chem. 37(9), 1233 (1994); Gallop et al., J. Med. Chem. 37(10), 1385 (1994); Ellman, Acc. Chem. Res. 29, 132 (1996); Gordon et al., E. J. Med. Chem. 30, 388s (1994); Gordon et al., Acc. Chem. Res. 29, 144 (1996); WO 95/12608.
  • Das Screening dieser Bibliotheken wird auf zahlreiche Weisen durchgeführt. Einer der Ansätze umfasst die Anheftung an Perlen und Sichtbarmachung mit Farbstoffen; siehe Neslter et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 6(12), 1327 (1996). In einem weiteren Ansatz sind Perlen und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) angewendet worden; siehe Needles et al., PNAS USA 90, 10700 (1993), und Vetter et al., Bioconjugate Chem. 6, 319 (1995).
  • Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS), auch Durchflusszytometrie genannt, wird verwendet, um einzelne Zellen auf Basis optischer Eigenschaften, einschließlich Fluores zenz, zu sortieren. Sie ist im Allgemeinen schnell und kann das Screening großer Zellpopulationen in einem relativ kurzen Zeitraum ermöglichen.
  • Es gibt eine Reihe von Fällen, in denen schnelle und kostengünstige Screenings, wie z. B. FACS-Screenings, üblicherweise von besonderem Interesse sind. Ein solches Gebiet sind Zellzyklus-Tests. Zellen durchlaufen zyklisch verschiedene Wachstumsstadien, beginnend mit der M-Phase, in der Mitose und zytoplasmatische Teilung (Zytokinese) erfolgt. Der M-Phase folgt die G1-Phase, in der Zellen wieder eine hohe Biosynthese- und Wachstumsrate aufnehmen. Die S-Phase beginnt mit DNA-Synthese und endet, wenn sich der DNA-Gehalt im Zellkern verdoppelt hat. Die Zelle tritt dann in die G2-Phase ein, die endet, wenn die Mitose beginnt, was durch das Auftreten verdichteter Chromosomen signalisiert wird. Terminal differenzierte Zellen werden in der G1-Phase arretiert und teilen sich nicht mehr.
  • Das Kennzeichen einer bösartigen Zelle ist unkontrollierte Vermehrung. Dieser Phänotyp wird über die Ansammlung von Genmutationen erworben, wovon die meisten das Durchlaufen des Zellzyklus fördern. Krebszellen ignorieren Wachstumsregulationssignale und bleiben an die Zellteilung gebunden. Klassische Onkogene, wie z. B. ras, bewirken eine unpassenden Übergang von G1- zu S-Phase im Zellzyklus, wobei extrazelluläre Proliferationssignale nachgeahmt werden. Zellzyklus-Kontrollstellen gewährleisten die getreue Replikation und Segregation des Genoms. Der Verlust der Zellzyklus-Kontrollstelle bewirkt Genom-Instabilität, was die Anhäufung von Mutationen, welche die bösartige Transformation vorantreiben, stark beschleunigt. Daher fungieren Kontrollstellenregulatoren, wie z. B. p53 und ATM (mutiertes Louis-Bar-Syndrom), auch als Tumor-Suppressoren. Folglich könnte das Modulieren von Zellzyklus-Kontrollstellen-Wegen mit therapeutischen Mitteln die Unterschiede zwischen normalen Zellen und Tumorzellen ausnutzen, wodurch die Selektivität von Strahlen- sowie Chemotherapie verbessert wird und neuartige Krebsbehandlungen ermöglicht werden.
  • Demgemäß ist es ein Ziel der Erfindung, Zusammensetzungen und Verfahren bereitzustellen, die für das Screening auf Modulatoren der Zellzyklus-Kontrollstellenregulation zweckdienlich sind.
  • Ein weiteres Gebiet, für das schnelle Screeningverfahren besondere Verwendung finden würden, ist das Gebiet der Exozytose-Tests. Exozytose ist die Fusion von Sekretionsvesikeln mit der Zellplasmamembran und weist zwei Hauptfunktionen auf. Eine ist die Ausschüttung der Vesikelinhalte in den extrazellulären Raum, und die zweite ist die Inkorporation neuer Proteine und Lipide in die Plasmamembran selbst.
  • Exozytose kann in zwei Gruppen unterteilt werden: konstitutiv und reguliert. Alle eukaryotischen Zellen zeigen konstitutive Exozytose, die durch fortlaufende Fusion der Sekretionsvesikel nach der Bildung gekennzeichnet ist. Regulierte Exozytose ist auf bestimmte Zellen, einschließlich exokrine, endokrine und neuronale Zellen, beschränkt. Regulierte Exozytose resultiert in der Anhäufung der Sekretionsvesikel, die nur bei Erhalt eines geeigneten Signals, für gewöhnlich (jedoch nicht immer) ein Anstieg der freien zytosolischen Ca2+-Konzentration, mit der Plasmamembran fusionieren.
  • Die regulierte Exozytose ist für viele spezialisierte Zellen äußerst wichtig, und häufig kann eine bestimmte Zelle mehrere Mediatoren aus denselben exozytischen Granulaten freisetzen, die gemeinschaftlich agieren, um eine koordinierte physiologische Reaktion in den Zielzellen hervorzurufen. Diese regulierten exozytischen Zellen umfassen Neuronen (Neurotransmitterfreisetzung), chromaffine Nebennierenzellen (Adrenalinsekretion), azinöse Pankreaszellen (Verdauungsenyzmsekretion), β-Pankreaszellen (Insulinsekretion), Mastzellen (Histaminsekretion), Brustdrüsenzellen (Milchproteinsekretion), Sperma (Enzymsekretion), Eizellen (Erzeugung der Befruchtungshülle) und Adipozyten (Einbau von Glucose-Transportern in die Plasmamembran). Darüber schlägt die gegenwärtige Theorie vor, dass die grundlegenden Mechanismen von Vesikel-Docking und – Fusion von der Hefe bis zum Säugetierhirn konserviert sind.
  • Darüber hinaus sind Exozytose umfassende Störungen bekannt. Zum Beispiel bewirkt die Entzündungsvermittlerfreisetzung aus Mastzellen eine Reihe von Störungen einschließlich Asthma. Alleine in den Vereinigten Staaten leiden über 50 Millionen Menschen an Asthma, Rhinitis oder irgendeiner anderen Form von Allergie. Die Allergietherapie ist immer noch auf die Blockierung der von Mastzellen freigesetzten Vermittler (Antihistamine), unspezifischer entzündungshemmender Mittel, wie z. B. Steroide, und Mastzellen-Stabilisatoren beschränkt, die für die Drosselung der Allergiesymptomatik nur wenig wirksam sind. In ähnlicher Weise ist das Chediak-Higashi-Syndrom (CHS) eine seltene autosomal-rezessive Krankheit, bei der Neutrophile, Monozyten und Lymphozyten und die meisten Zellen zytoplasmatische Riesengranula enthalten. Ähnliche Störungen sind in Mäusen, Nerzen, Rindern, Katzen und Schwertwalen beschrieben worden, wobei das Maus-Homolog des CHS (beige oder bg genannt) am besten charakterisiert ist. Siehe Perou et al., J. Biol. Chem. 272(47), 29790 (1997) und Barbosa et al., Nature 382, 262 (1996).
  • Darüber hinaus wird weitgehend angenommen, dass ein breites Feld psychiatrischer Störungen das Resultat eines Ungleichgewichts zwischen Neurotransmitter-Exozytose und Vermittler-Wiederaufnahme ist.
  • Es ist eine große Anzahl von Pharmazeutika konstruiert worden, um die exozytischen Vermittler hauptsächlich über die Blockierung ihrer Rezeptoren spezifisch zu stören. Jedoch ist dieser Ansatz durch die Tatsache beschränkt, dass ein einzelner Rezeptor-Blocker die Wirkungen vieler verschiedenartiger Vermittler nicht bewältigen kann.
  • Demgemäß ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Verfahren zum Screenen auf Veränderungen der Exozytose bereitzustellen, insbesondere zum Screenen auf Mittel, die zur Vermittlung einer solchen Exozytose fähig sind. Ebenfalls ein Ziel der Erfindung ist es, solche Screening-Verfahren bereitzustellen, worin der Hintergrund des Tests vermindert und die Spezifität erhöht werden.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Gemäß den oben umrissenen Zielen stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Screenen bioaktiver Mittel auf ihre Fähigkeit bereit, Zellphänotypen zu ändern oder Änderungen von Zellphänotypen zu modulieren. Die Verfahren umfassen im Allgemeinen das Kombinieren von zumindest einem bioaktiven Kandidat-Mittel und einer Zellpopulation, Sortieren der Zellen in einem FACS-Gerät durch Trennen der Zellen auf Basis von zumindest drei, vier oder fünf Zellparametern. Die Kandidat-Mittel können Teil einer molekularen Bibliothek sein, die Fusionsnukleinsäuren enthalten, die für die bioaktiven Kandidat-Mittel kodieren.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Screenen auf Veränderungen der Exozytose einer Zellpopulation oder in Einzelzellen unter verschiedenen Bedingungen oder in Kombination mit verschiedenen bioaktiven Mitteln bereit. Die Verfahren umfassen das Sortieren der Zellen in einem FACS-Gerät durch Testen auf Veränderungen von zumindest drei der aus Lichtstreuung, Fluoreszenzfarbstoff-Aufnahme, Fluoreszenzfarbstoff-Freisetzung, Annexingranulat-Bindung, Oberflächengranulat-Enzymaktivität und der Menge an granulatspezifischen Proteinen bestehenden Gruppe ausgewählten Eigenschaften.
  • Hierin auch bereitgestellt ist ein Verfahren zum Screenen eines bioaktiven Mittels, das in der Lage ist, die Exozytose in einer Zelle zu modulieren. Dieses Verfahren umfasst ein bioaktives Kandidat-Mittel und eine Zellpolulation und das Unterwerfen der Zellen Bedingungen, die üblicherweise Exozytose verursachen. Die Zellen werden in einem FACS-Gerät sortiert durch Testen auf Veränderungen von zumindest drei der aus Lichtstreuung, Fluoreszenzfarbstoff-Aufnahme, Fluoreszenzfarbstoff-Freisetzung, Annexingranulat-Bindung, Oberflächengranulat-Enzymaktivität und der Menge an granulatspezifischen Proteinen bestehenden Gruppe ausgewählten Eigenschaften. Veränderungen von zumindest einer dieser Eigenschaften im Vergleich zu Zellen, die nicht mit dem bioakti ven Kandidat-Mittel exponiert worden sind, zeigen an, dass das besagte Mittel die Exozytose moduliert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zum Screenen auf ein bioaktives Mittel umfassen die ausgewählten Eigenschaften zumindest eine Eigenschaft, die aus der aus Fluoreszenzfarbstoff-Freisetzung, Annexingranulat-Bindung, Oberflächengranulat-Enzymaktivität und der Menge an granulatspezifischen Proteinen bestehenden Gruppe gewählt ist.
  • Wenn die Fluoreszenzfarbstoff-Aufnahme detektiert wird, ist der Farbstoff vorzugsweise ein Styryl-Farbstoff. Im Falle, dass Fluoreszenzfarbstoff-Freisetzung detektiert wird, kann der Farbstoff Niedrig-pH-Anreicherungsfarbstoff oder ein Styryl-Farbstoff sein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Oberflächengranulat-Enzymaktivität durch einen In-situ-Enzymologietest oder durch einen auf Population basierenden Enzymtest detektiert. Das Enzymsubstrat kann jedes detektierbare Substrat sein. Vorzugsweise ist das Enzymsubstrat an ein FRET-Konstrukt gekoppelt. FRET-Konstrukte umfassen zwei fluoreszierende Proteine, die durch eine Proteasestelle abgeteilt sind. In diesem Fall ist die Proteasestelle für eine Granulat-Protease spezifisch.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden granulatspezifische Proteine detektiert. Die granulatspezifischen Proteine können beliebige detektierbare Proteine sein. In einer der Ausführungsformen sind die granulatspezifischen Proteine Fusionsproteine, die ein granulatspezifisches Protein und ein detektierbares Molekül, das ein FRET-Konstrukt sein kann, umfassen.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zum Screenen eines zur Modulation der Exozytose in einer Zelle fähigen bioaktiven Mittels bereitgestellt, worin das besagte Verfahren das Kombinieren zumindest eines bioaktiven Kandidat-Mittels und einer Population von Zellen umfasst, wobei jede eine Fusionsnucleinsäure ent hält, die eine für ein granulatspezifisches Protein und für einen Marken kodierende Nucleinsäure umfasst. Die Zellen werden Bedingungen unterworfen, die normalerweise Exozytose verursachen, und die Änderungen der Marken-Menge werden detektiert. Änderungen der Marken-Menge zeigen an, dass das Mittel die Exozytose moduliert. Vorzugsweise ist der Marken ein Epitop-Marken oder eine fluoreszierendes Molekül. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das fluoreszierende Molekül ein FRET-Konstrukt.
  • In einem zusätzlichen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zum Screening auf Exozytose-Modulatoren bereit, die das Kombinieren von bioaktiven Kandidat-Mitteln, Zellen, die für ein detektierbares granulatspezifisches Protein kodierende Nucleinsäuren enthalten, und eines Mittels zum Detektieren dieses Proteins umfassen. Die Zellen werden Bedingungen unterworfen, die normalerweise Exozytose verursachen, und es wird die An- oder Abwesenheit des Proteins bestimmt.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zum Screenen auf ein zur Modulation der Exozytose in einer Zelle fähiges bioaktives Kandidat-Mittel bereitgestellt, welches das Kombinieren von zumindest einem bioaktiven Kandidat-Mittel und einer Population von Zellen umfasst. Die Zellen werden Bedingungen unterworfen, die normalerweise Exozytose verursachen, und es wird ein fluoreszierendes Annexin zugesetzt. Änderungen der Menge des fluoreszierenden Annexins an der Oberfläche der Zellen werden beurteilt.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zum Screenen auf ein zur Modulation der Exozytose in einer Zelle fähiges bioaktives Kandidat-Mittel bereitgestellt, welches das Bereitstellen einer Population von Zellen umfasst, worin die Zellen einen Niedrig-pH-Anreicherungsfarbstoff aufgenommen haben. Die mit Niedrig-pH-Anreicherungsfarbstoff beladenen Zellen werden mit zumindest einem bioaktiven Kandidat-Mittel kombiniert und Bedingungen unterworfen, die normalerweise Exozytose verursachen. Die Freisetzung des Niedrig-pH-Anreicherungsfarbstoffs wird detektiert.
  • Änderungen der Menge an freigesetztem Farbstoff zeigen an, dass das Mittel die Exozytose moduliert.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zum Screenen auf ein zur Modulation der Exozytose in einer Zelle fähiges bioaktives Kandidat-Mittel bereitgestellt, welches das Kombinieren von zumindest einem bioaktiven Kandidat-Mittel und einer Population von Zellen umfasst. Die Zellen werden Bedingungen unterworfen, die normalerweise Exozytose verursachen, und es wird ein fluoreszierendes Substrat zugesetzt, das für ein Granulat-Enzym spezifisch ist. Das für ein Granulat-Enzym spezifische fluoreszierende Substrat wird detektiert, worin Änderungen der Menge des fluoreszierenden Substrats anzeigen, dass das Mittel die Exozytose moduliert. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Substrat ein FRET-Konstrukt.
  • In einem zusätzlichen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren und Zusammensetzungen zum Screenen auf bioaktive Mittel bereit, die zur Modulation der Zellzyklusregulation in einer Zelle fähig sind. Das Verfahren umfasst das Kombinieren einer Bibliothek von bioaktiven Kandidat-Mitteln und einer Population von Zellen, das Sortieren der Zellen in einem FACS-Gerät durch Trennung der Zellen auf Basis zumindest eines Zelllebensfähigkeitstests, eines Proliferationstests und eines Zellphasentests.
  • In einem weiteren Aspekt umfassen die Verfahren das Exprimieren einer Bibliothek von Fusionsnucleinsäuren in einer Bibliothek von Zellen. Die Fusionsnucleinsäuren umfassen eine Nucleinsäure, die für ein bioaktives Kandidat-Mittel und eine detektierbare Gruppierung kodiert. Die Zellen werden in einem FACS-Gerät durch Trennung der Zellen sortiert; wenn der Zellphänotyp der Zellzyklus ist, werden die Zellen auf Basis zumindest eines Zelllebensfähigkeitstests, eines Expressionstests, eines Proliferationstests und eines Zellphasentests sortiert.
  • Kurzbeschreibung der Abbildungen
  • 1A, 1B und 1C stellen schematisch drei retrovirale Konstruktionen von Beispiel 1 dar. 1A beinhaltet die CRUS-GFP-p21-Konstruktion, umfassend einen CRUS-Promotor, das ψ-retrovirale Verpackungssignal, die kodierende Region für GFP, fusioniert an die kodierende Region von p21, gefolgt von einem LTR. 1B stellt die CRU5-GFP-p21C-Konstruktion dar, die die 24 C-terminalen Aminosäuren von p21 beinhaltet. 1C stellt das CRU5-GFP-pUCmut-Konstrukt dar, das eine mutierte Version von CRUS-p21 mit 3 Alaninsubstitutionen ist.
  • 2A, 2B, 2C und 2D stellen die Ergebnisse des Experiments von Beispiel 1 dar. 2A stellt einen Lebensfähigkeitstest unter Anwendung von Vorwärts- und Seitwärtsstreuung dar. Zellen, die ein charakteristisches Verhältnis zeigen, werden gesammelt. 2B zeigt die Fluoreszenz des GFP der Vektoren. 2C stellt die Verwendung von PKH26, einem Einschlussfarbstoff, in einem Proliferationstest dar; diejenigen Zellen, die p21, ein Protein, das bekanntermaßen Zellen hemmt, enthalten, bleiben hell fluoreszierend, wogegen die Kontrollzellen weiterhin proliferieren, folglich den Farbstoff verdünnen und an Fluoreszenz verlieren. 2D stellt die Verwendung von Hoechst 33342 in einem Zellphasentest dar.
  • 3 stellt die Wirkung von AraC-Behandlung auf Jurkat-Zellen dar, die mit p21, einem Mittel, das die Zellen in der G1-Phase arretiert, infiziert wurden. AraC ist ein Nucleotid-Analogon, das für sich teilende Zellen toxisch ist. Folglich überleben diejenigen Zellen, deren Zellzyklus arretiert ist. Die untere Kurve stellt Jurkat-Zellen ohne dem p21-Insert dar, und die obere Kurve stellt Jurkat-Zellen mit dem p21-Insert dar.
  • 4A und 4B stellen Balkendiagramme dar, welche die Ergebnisse eines auf einer Population basierenden exozytischen Enzymaktivitätstests für Exozytose zeigen. 4A zeigt Glucuronidase- oder Hexosaminidase-Aktivität im Überstand von Zellen, die mit DMSO (–) oder Ionomycin (+) kombiniert wurden. 4B zeigt Hexosaminidase-Aktivi tät im Überstand von Zellen, die mit verschiedenen Mengen IgE-Anti-DNP sensibilisiert und mit ansteigenden Mengen des Antigens BSA-DNP stimuliert wurden.
  • 5A–5F zeigen am Durchflusszytometer beobachtete exozytische Lichtstreuungsänderungen, Seitwärtsstreuung gegen Vorwärtsstreuung, aufgetragen als zweidimensionale Histogramme für RBL-2H3-Zellen (5A und 5D) und MC-9-Zellen (5B, 5C, 5E und 5F). Nach Stimulation mit einem Ionophor wurden die Zellen zu den Zeitpunkten 0 Minuten (5A und 5C), 5 Minuten (5E), 10 Minuten (5D) und 30 Minuten (5B und 5F) beobachtet.
  • 6A–6E zeigen Diagramme der Ergebnisse eines Styrylfarbstofftests, um Exozytose mittels FACS zu detektieren. Zellen wurden mit DMSO (linke Peaks) oder Ionomycin (rechte Peaks) in Gegenwart von entweder FM 4-64 (6A und 6B) oder FM 1-43 ( 6C, 6D und 6E) kombiniert. 6A und 6C zeigen im Fluoreszenzkanal 1 detektierte Zellen. 6B und 6D zeigen im Fluoreszenzkanal 3 detektierte Zellen. 6E zeigt die mittlere Kanalverschiebung, die im Durchflusszytometer im Fluoreszenzkanal 1 detektiert wurde, aufgetragen als Balkendiagramm, worin die Zellen mit variierenden Dosen des PI-3-Kinaseinhibitors Wortmannin vor der Verabreichung eines Ionophors (Balken 1-4) oder DMSO (Balken 5) in Gegenwart von FM 1-43 vorinkubiert wurden.
  • 7A–7D zeigen Diagramme, welche die Ergebnisse eines Annexin-V-Detektionsstests der Exozytose mittels FACS darstellen. Zellen wurden entweder mit DMSO (7A und 7B) oder Ionomycin (7C und 7D) kombiniert und dann mit Propidiumiodid (7A und 7C) sowie Annexin-V-FITC (7B und 7D) gefärbt.
  • 8A–8C zeigen Diagramme, welche die Ergebnisse eines In-situ-Enzymologietests der Exozytose von Exozytose vollführenden Zellen darstellen, die mittels FACS sichtbar gemacht wurden. Die Zellen wurden mit DMSO (8A) oder einem Ionophor (8B und 8C) kombiniert und dann auf In-situ-Glucuronidaseaktivität gefärbt. 8C zeigt das pH-Profil der Zelloberflächen-Enzymaktivität, worin die Balkendiagramme den be obachteten Prozentanteil des Maximalsignals, wie er durch mittlere Kanalverschiebung im Durchflusszytometer gemessen wurde, darstellen.
  • 9 ist ein Histogramm der in Kanal 1 detektierten Fluoreszenzintensität und zeigt mit LYSOTRACKER GREENTM beladene, entweder mit DMSO (links) oder Ionomycin (rechts) kombinierte und im Durchflusszytometer beobachtete Zellen.
  • 10A–10H zeigen die Ergebnisse einer LYSOTRACKER GREENTM, Annexin-V-APC und Vorwärts- und Seitwärtsstreuung umfassenden Mehrfachparameteranalyse. 10A– 10D und 10E–10H zeigen jeweils mit ansteigenden Dosen Ionomycin behandelte und mit vier Parametern gleichzeitig im Durchflusszytometer beobachtete Zellen. Die Zellen wurden mit Niedrig-pH-Anreicherungsfarbstoff beladen, stimuliert und mit Annexin-V-APC gefärbt. 10A–10D zeigen zweidimensionale Histogramme von Seitwärts- gegen Vorwärtsstreuung, und 10E–10H zeigen zweidimensionale Histogramme von Annexin-V-APC- gegen Niedrig-pH-Anreicherungsfarbstoffsignale.
  • 11 zeigt ein Diagramm von in Gegenwart von FM 1-43 stimulierten und Annexin-V-APC-gefärbten Zellen. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach Ionomycin-Stimulation wurden die Zellen mittels Durchflusszytometrie und der Überstand auf Enzymaktivität (Zellüberstand) analysiert. Die Parameter Vorwärtsstreuung, FM-143, Annexin-V-APC und Hexosaminidase sind auf dem Diagramm relativ zur maximalen Reaktion für jeden Parameter aufgetragen. Für Calciumsignalisierung wurde ein gesondertes Röhrchen von Zellen mit Fluo-3 beladen und demselben Verfahren unterzogen.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung zielt auf die Detektion von Änderungen von Zellphänotypen, wie z. B. Zellzyklusregulation, Exozytose, Toxizität kleiner Moleküle, Zelloberflächenrezeptorexpression, Enzymexpression usw. durch Beurteilen oder Testen einer Reihe von Zellparametern, im Allgemeinen über die Verwendung eines fluoreszenzaktivierten Zellsortierungs- (FACS-) Geräts, ab. Es gibt eine Reihe von Parametern, die gemessen werden können, um die Detektion von Änderungen der Zellphänotypen zu ermöglichen, wie unten ausführlicher behandelt wird. Durch Testen einer Vielzahl dieser Parameter, entweder hintereinander oder vorzugsweise gleichzeitig, kann ein schnelles und genaues Screening durchgeführt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die hierin dargelegten Verfahren verwendet, um auf Modulatoren von Zellphänotypen zu screenen. Zellphänotypen, die getestet werden können, umfassen Zellapoptose, einschließlich Zellzyklusregulation, Exozytose, Toxizität gegenüber kleinen Molekülen, die Expression einer beliebigen Anzahl von Gruppierungen, einschließlich Rezeptoren (insbesondere Zelloberflächenrezeptoren), Adhäsionsmolekülen, Zytokinsekretion, Protein-Protein-Wechselwirkungen usw., sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Verfahren verwendet, um die Zellzyklusregulation zu beurteilen. In dieser Ausführungsform sind bevorzugte Zellparameter oder -Tests Zelllebensfähigkeitstests, Tests zur Ermittlung, ob Zellen in einem bestimmten Zellzyklusstadium arretiert sind („ Zellproliferationstests") und Tests zur Ermittlung, in welchem Zellstadium die Zellen arretiert worden sind („Zellphasentests"). Durch Testen oder Messen eines oder mehrerer dieser Parameter ist es möglich, nicht nur Änderungen der Zellzyklusregulation zu detektieren, sondern auch Änderungen oder unterschiedliche Schritte des Zellzyklusregulationswegs. Dies kann durchgeführt werden, um native Zellen zu beurteilen, um zum Beispiel die Aggressivität eines Tumorzelltyps zu quantifizieren oder um die Wirkung von Kandidat-Medikamenten zu beurteilen, die auf ihre Wirkung auf die Zellzyklusregulation getestet werden. Auf diese Weise kann ein schnelles, genaues Screening von Kandidat-Mitteln durchgeführt werden, um Mittel zu identifizieren, welche die Zellzyklusregulation modulieren.
  • Folglich sind die vorliegenden Verfahren zweckdienlich, um bioaktive Mittel zu erklären, die bewirken können, dass eine Population von Zellen sich aus einer Wachstums phase heraus und in eine andere bewegt oder in einer Wachstumsphase arretiert wird. In manchen Ausführungsformen werden die Zellen in einer bestimmten Wachstumsphase arretiert, und es ist wünschenswert, sie entweder aus dieser Phase hinauszubewegen oder sie in eine neue Phase zu bewegen. Alternativ dazu kann es wünschenswert sein, die Zellen dazu zu zwingen, in einer Phase, z. B. G1, zu arretieren, anstatt den Zellzyklus weiterhin zu durchlaufen. Gleichermaßen kann es unter manchen Umständen wünschenswert sein, eine nicht arretierte, jedoch sich langsam bewegende Population von Zellen entweder in die nächste Phase oder gerade noch durch den Zellzyklus zu beschleunigen oder den Beginn der nächsten Phase zu verzögern. Zum Beispiel kann es möglich sein, die Aktivität von bestimmten Enzymen, zum Beispiel Kinasen, Phosphatasen, Proteasen oder Ubiquitinierungsenzymen, die zur Auslösung von Zellphasenänderungen beitragen, zu verändern.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die hierin dargelegten Verfahren an Zellen durchgeführt, die nicht in der G1-Phase arretiert sind; das heißt, dass sie schnell oder unkontrollierbar wachsen und replizieren, wie z. B. Tumorzellen. Auf diese Weise werden Kandidat-Mittel beurteilt, um Mittel zu finden, welche die Zellzyklusregulation verändern können, d. h. die Arretierung der Zellen an Zellzyklus-Kontrollpunkten, wie z. B. in der G1-Phase (obwohl das Arretieren in anderen Phasen, wie z. B. S, G2 oder M ebenfalls wünschenswert ist), bewirken. Alternativ dazu werden Kandidat-Mittel beurteilt, um Mittel zu finden, die eine Proliferation einer Zellpopulation bewirken können, d. h. die es Zellen, die generell in der G1-Phase arretiert sind, ermöglichen, die Proliferation erneut zu beginnen; zum Beispiel Peripherblutzellen, terminal differenzierte Zellen, Stammzellen in Kultur usw.
  • Demgemäß stellt die Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform Verfahren für das Screening auf Änderungen der Zellzyklusregulation einer Zellpopulation bereit. „Änderung" und „Modulation" (hierin wechselseitig verwendet) können, wie hierin verwendet, sowohl Anstiege als auch Verminderungen des gemessenen Parameters oder Phänotyps umfassen. Mit „Änderung" oder „Modulation" ist im Zusammenhang mit der Zell zyklusregulation im Allgemeinen eines von zwei Dingen gemeint. In einer bevorzugten Ausführungsform resultiert die Änderung in einem Wandel im Zellzyklus einer Zelle, d. h. eine proliferierende Zelle wird in irgendeiner der Phasen arretiert oder eine arretierte Zelle bewegt sich aus ihrer Arretierungsphase und beginnt den Zellzyklus im Vergleich zu einer anderen Zelle oder derselben Zelle unter anderen Bedingungen. Alternativ dazu kann das Fortschreiten einer Zelle durch eine beliebige bestimmte Phase geändert werden; das heißt, es kann eine Beschleunigung oder Verzögerung der Zeitdauer auftreten, die die Zellen benötigen, um sich durch eine bestimmte Wachstumsphase zu bewegen. Zum Beispiel kann die Zelle normalerweise eine G1-Phase von mehreren Stunden durchlaufen; die Zugabe eines Mittels kann die G1-Phase verlängern.
  • Die Messwerte können ermittelt werden, wo alle Bedingungen für jede Messung dieselben sind oder unter verschiedenen Bedingungen, mit oder ohne bioaktives Mittel oder in verschiedenen Stadien des Zellzyklusprozesses. Zum Beispiel können Messwerte der Zellzyklusregulation in einer Zellpopulation ermittelt werden, worin das bioaktive Kandidat-Mittel zugegen ist und worin das bioaktive Kandidat-Mittel abwesend ist. In einem weiteren Beispiel werden die Messwerte der Zellzyklusregulation ermittelt, worin die Bedingung oder Umgebung der Zellpopulation sich voneinander unterscheiden. Zum Beispiel können die Zellen in An- oder Abwesenheit von physiologischen Signalen, zum Beispiel Hormonen, Antikörpern, Peptiden, Antigenen, Zytokinen, Wachstumsfaktoren, Aktionspotenzialen, pharmakologischen Mitteln (d. h. Chemotherapeutika usw.), oder anderen Zellen (d. h. Zell-Zell-Kontakte) beurteilt werden. In einem weiteren Beispiel werden die Messwerte der Zellzyklusregulation in verschiedenen Stadien des Zellzyklusvorgangs ermittelt. In noch einem weiteren Beispiel werden Messungen vorgenommen, worin die Bedingungen dieselben sind und die Änderungen zwischen einer Zellen oder Zellpopulation und einer anderen Zelle oder Zellpopulation auftreten.
  • Mit „Zellpopulation" oder „Zellbibliothek" oder „Vielzahl von Zellen" sind hierin zumindest zwei Zellen gemeint, wobei zumindest ungefähr 103 bevorzugt, zumindest ungefähr 106 insbesondere bevorzugt und zumindest ungefähr 108 bis 109 speziell bevor zugt sind. Die Population oder Probe kann ein Gemisch verschiedener Zelltypen entwe der aus primären oder sekundären Kulturen enthalten, obgleich Proben, die nur einen einzigen Zelltyp enthalten, bevorzugt sind; beispielsweise kann die Probe aus einer Zelllinie, insbesondere aus Tumorzelllinien (insbesondere wenn wie unten dargelegt) stammen. Die Zellen können sich, synchron oder auch nicht synchron, in einer beliebigen Zellphase befinden, einschließlich M, G1, S und G2. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Zellen verwendet, die replizieren oder proliferieren; dies kann die Verwendung retroviraler Vektoren zur Einführung von bioaktiven Kandidat-Mitteln ermöglichen. Alternativ dazu können nicht replizierende Zellen verwendet werden, oder es können andere Vektoren (wie z. B. Adenovirus- und Lentivirus-Vektoren) verwendet werden. Des weiteren sind die Zellen mit Farbstoffen und Antikörpern kompatibel, obgleich dies nicht erforderlich ist.
  • Bevorzugte Zelltypen zur Verwendung in der Erfindung variieren üblicherweise mit dem zu modulierenden Zellphänotyp. Geeignete Zellen umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Säugetierzellen, einschließlich Tier- (Nager, einschließlich Mäuse, Ratten, Hamster und Wüstenrennmäuse), Primaten- und Human-Zellen und umfassen insbesondere Tumorzellen jeglicher Art, einschließlich Brust-, Haut-, Lungen-, Cervix-, Enddarm-, Leukämie-, Hirn-Krebszellen usw. Wie unten dargelegt, können weitere Zelltypen zum Screenen auf Exozytose verwendet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Zellzyklusregulationsverfahren das Sortieren der Zellen in einem FACS-Gerät durch Ermitteln mehrerer unterschiedlicher Zellparameter, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Zelllebensfähigkeit, Zellproliferation und Zellphase.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zelllebensfähigkeit getestet, um sicherzustellen, dass ein Fehlen von Zellveränderung auf experimentelle Bedingungen (d. h. auf die Einführung eines bioaktiven Kandidat-Mittels) und nicht auf Zelltod zurückzuführen ist. Es gibt eine Reihe von geeigneten Zelllebensfähigkeitstests, die verwendet wer den können, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Lichtstreuung, Lebensfähigkeitsfarbstoff-Färbung und Ausschlussfarbstoff-Färbung.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Lichtstreuungstest als Lebensfähigkeitstest verwendet, wie auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt ist. Bei Betrachtung im FACS weisen die Zellen bestimmte Charakteristika auf, wie sie durch ihre Vorwärts- und 90-Grad- (Seitwärts-) Lichtstreuungseigenschaften gemessen werden. Diese Streuungseigenschaften stellen die Größe, Form und den Granulatgehalt der Zellen dar. Diese Eigenschaften begründen zwei als Ausgabewert für die Lebensfähigkeit zu messende Parameter. Kurz gesagt verdichtet sich die DNA sterbender oder toter Zellen im Allgemeinen, was die 90°-Lichtstreuung ändert, auf ähnliche Weise kann Blasenbildung der Membran die Vorwärtsstreuung ändern. Änderungen der Intensität der Lichtstreuung oder des Brechungsindex der Zellen zeigen Änderungen der Lebensfähigkeit an.
  • Folglich wird im Allgemeinen für Lichtstreuungstests eine lebende Zellpopulation eines bestimmten Zelltyps beurteilt, um ihre Vorwärts- und Seitwärtsstreuungseigenschaften zu bestimmen. Dies legt einen Standard für die Streuung fest, der anschließend verwendet werden kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform setzt der Lebensfähigkeitstest einen Lebensfähigkeitsfarbstoff ein. Es gibt eine Anzahl bekannter Lebensfähigkeitsfarbstoffe, die tote oder sterbende Zellen färben, nicht jedoch wachsende Zellen färben. Zum Beispiel ist Annexin V ein Mitglied einer Proteinfamilie, die spezifische Bindung an Phospholipid (Phosphatidylserin) in einer von zweiwertigen Ionen abhängigen Weise zeigen. Dieses Protein ist weithin zur Messung von Apoptose (programmierter Zelltod) verwendet worden, da die Zelloberflächenexposition von Phosphatidylserin ein kennzeichnendes frühes Signal dieses Prozesses ist. Geeignete Lebensfähigkeitsfarbstoffe umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Annexin, Ethidium-Homodimer-1, DEAD Red, Propidiumiodid, SYTOX Green usw. und andere, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind; siehe Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Haugland, 6. Aufl., siehe insbesondere Apoptose-Assay auf Seite 285 und Kapitel 16.
  • Protokolle für die Lebensfähigkeitsfarbstoff-Färbung für Zelllebensfähigkeit sind bekannt, siehe Katalog von Molecular Probes, siehe oben. In dieser Ausführungsform wird der Lebensfähigkeitsfarbstoff, wie z. B. Annexin, entweder direkt oder indirekt markiert und mit einer Zellpopulation kombiniert. Annexin ist im Handel erhältlich, d. h. von PharMingen, San Diego, Kalifornien, oder Caltag Laboratories, Millbrae, Kalifornien. Vorzugsweise wird der Lebensfähigkeitsfarbstoff in einer Lösung bereitgestellt, worin der Farbstoff in einer Konzentration von ungefähr 100 ng/ml bis ungefähr 500 ng/ml, bevorzugter ungefähr 500 ng/ml bis ungefähr 1 μg/ml und insbesondere von ungefähr 1 μg/ml bis ungefähr 5 μg/ml vorliegt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Lebensfähigkeitsfarbstoff direkt markiert; beispielsweise kann Annexin mit einem Fluorochrom, wie z. B. Fluoreszeinisothiocyanat (FITC), Alexa-Farbstoffen, TRITC, AMCA, APC, Tri-Color, Cy-5 und anderen fachbekannten und im Handel erhältlichen, markiert werden. In einer alternativ bevorzugten Ausführungsform wird der Lebensfähigkeitsfarbstoff mit einem ersten Marken, wie z. B. einem Hapten, wie z. B. Biotin, markiert, und es wird ein sekundärer fluoreszierender Marken, wie z. B. fluoreszierendes Streptavidin, verwendet. Andere erste und zweite Markierungspaare können verwendet werden, wie Fachleute auf dem Gebiet verstehen werden.
  • Einmal zugesetzt wird der Lebensfähigkeitsfarbstoff mit den Zellen für eine Zeitdauer inkubiert und, wenn nötig, gewaschen. Die Zellen werden dann wie unten besprochen sortiert, um nicht-lebensfähige Zellen zu entfernen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird Ausschlussfarbstoff-Färbung als Lebensfähigkeitstest verwendet. Ausschlussfarbstoffe sind jene, die aus lebenden Zellen ausgeschlossen werden, d. h. sie werden nicht passiv aufgenommen (sie durchdringen nicht die Zellmembran einer lebenden Zelle). Jedoch werden sie wegen der Durchlässigkeit toter oder sterbender Zellen von toten Zellen aufgenommen. Im Allgemeinen, aber nicht immer binden Ausschlussfarbstoffe an DNA, beispielsweise über Interkalation. Vorzugsweise fluoresziert der Ausschlussfarbstoff in Abwesenheit von DNA nicht oder schlecht; dies eliminiert die Notwendigkeit eines Waschschritts. Alternativ dazu können auch Ausschlussfarbstoffe verwendet werden, welche die Verwendung eines sekundären Markers erfordern. Bevorzugte Ausschlussfarbstoffe umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Ethidiumbromid; Ethidium-Homodimer-1; Propidiumiodid; SYTOX Green Nucleinsäurefarbstoff; Calcein AM, BCECF AM; Fluoreszeindiacetat; TOTO® und TO-PROTM (von Molecular Probes; siehe oben, Kapitel 16) und andere fachbekannte Ausschlussfarbstoffe.
  • Protokolle zur Ausschlussfarbstoff-Färbung für die Zelllebensfähigkeit sind bekannt, siehe Katalog von Molecular Proben, siehe oben. Im Allgemeinen wird der Ausschlussfarbstoff den Zellen in einer Konzentration von ungefähr 100 ng/ml bis ungefähr 500 ng/ml, bevorzugter ungefähr 500 ng/ml bis ungefähr 1 μg/ml und insbesondere bevorzugt von ungefähr 0,1 μg/ml bis ungefähr 5 μg/ml zugegeben, wobei 0,5 μg/ml besonders bevorzugt sind. Die Zellen und der Ausschlussfarbstoff werden für eine gewisse Zeitspanne inkubiert und, wenn nötig, gewaschen und die Zellen dann wie unten besprochen sortiert, um nicht-lebensfähige Zellen aus der Population zu entfernen.
  • Darüber hinaus gibt es andere Zelllebensfähigkeitstests, die durchgeführt werden können, einschließlich beispielsweise enzymatische Tests, welche die extrazelluläre Enzymaktivität von entweder lebenden Zellen (d. h. abgesonderte Proteasen usw.) oder toten Zellen (d. h. die Gegenwart intrazellulärer Enzyme im Medium; zum Beispiel intrazelluläre Proteasen, mitochondriale Enzyme usw.) messen können. Siehe Molecular Proben Handbook of Fluorescent Proben and Research Chemicals, Haugland, 6. Aufl., siehe insbesondere Kapitel 16.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird zumindest ein Lebensfähigkeitstest durchgeführt, wobei zumindest zwei unterschiedliche Zelllebensfähigkeitstests bevorzugt sind, wenn die Fluorochrome kompatibel sind. Wenn nur 1 Lebensfähigkeitstest durchgeführt wird, setzt eine bevorzugte Ausführungsform Lichtstreuung in Tests ein (Vorwärts- sowie Seitwärtsstreuung). Wenn zwei Lebensfähigkeitstests durchgeführt werden, setzen bevorzugte Ausführungsformen Lichtstreuung und Farbstoffausschluss ein, wobei Lichtstreuung und Lebensfähigkeits-Färbung ebenfalls möglich sind und in einigen Fällen auch alle drei durchgeführt werden. Lebensfähigkeitstests ermöglichen folglich die Trennung lebensfähiger Zellen von nicht-lebensfähigen oder sterbenden Zellen.
  • Zusätzlich zu einem Lebensfähigkeitstest setzt eine bevorzugte Ausführungsform einen Zellproliferationstest ein. Mit „Zellproliferationstest" wird hierin ein Test verstanden, der die Bestimmung erlaubt, dass eine Zellpopulation entweder sich proliferiert, d. h. repliziert, oder nicht repliziert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Proliferationstest ein Farbstoffeinschlusstest. Ein Farbstoffeinschlusstest beruht auf Verdünnungseffekten, um zwischen Zellphasen zu unterscheiden. Kurz gesagt wird ein Farbstoff (im Allgemeinen ein wie oben besprochener fluoreszierender Farbstoff) in Zellen eingeführt und von den Zellen aufgenommen. Einmal aufgenommen wird der Farbstoff in der Zelle eingeschlossen und diffundiert nicht hinaus. Wie sich die Zellpopulation teilt, wird der Farbstoff proportional dazu verdünnt. Das heißt, dass nach der Einführung des Einschlussfarbstoffs die Zellen für eine gewisse Zeitdauer inkubiert werden; Zellen, die im Zeitablauf Fluoreszenz verlieren, teilen sich, und die Zellen, die fluoreszierend verbleiben, sind in einer Nicht-Wachstumsphase arretiert.
  • Im Allgemeinen kann die Einführung des Einschlussfarbstoffs auf eine von zwei Arten durchgeführt werden. Entweder kann der Farbstoff nicht passiv in die Zellen eindringen (z. B. ist er geladen), und die Zellen müssen behandelt werden, um den Farbstoff aufzunehmen; beispielsweise über die Anwendung eines elektrischen Impulses. Alternativ dazu kann der Farbstoff passiv in die Zellen eindringen, jedoch wird er, wenn einmal aufgenommen, so modifiziert, dass er nicht aus die Zellen hinaus diffundieren kann. Zum Beispiel kann eine enzymatische Modifizierung des Einschlussfarbstoffs bewirken, dass dieser geladen und folglich unfähig wird, aus den Zellen hinaus zu diffundieren. Beispielsweise sind die CellTrackerTM-Farbstoffe von Molecular Probes fluoreszierende Chlormethylderivate, die frei in Zellen diffundieren, und dann produziert eine Glutathion-S-Transferase-vermittelte Reaktion membranundurchlässige Farbstoffe.
  • Geeignete Einschlussfarbstoffe umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die Molecular Probes-Linie von CellTrackerTM-Farbstoffen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, CellTrackerTM Blue, CellTrackerTM Yellow-Green, CellTrackerTM Green, CellTrackerTM Orange, PKH26 (Sigma) und andere, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind; siehe Molecular Probes Handbook, siehe oben; insbesondere Kapitel 15.
  • Im Allgemeinen werden Einschlussfarbstoffe den Zellen in einer Konzentration im Bereich von ungefähr 100 ng/ml bis ungefähr 5 μg/ml zugeführt, wobei ungefähr 500 ng/ml bis ungefähr 1 μg/ml bevorzugt sind. Ein Waschschritt kann eingesetzt werden oder auch nicht. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein bioaktives Kandidat-Mittel mit den Zellen wie hierin beschrieben kombiniert. Die Zellen und der Einschlussfarbstoff werden für eine gewisse Zeitdauer inkubiert, um Zellteilung und folglich Farbstoffverdünnung zu ermöglichen. Die Zeitdauer hängt üblicherweise von der Zellzykluszeit für die jeweiligen Zellen ab; im Allgemeinen sind zumindest ungefähr 2 Zellteilungen bevorzugt, wobei zumindest ungefähr 3 insbesondere bevorzugt und zumindest ungefähr 4 speziell bevorzugt sind. Die Zellen werden dann wie unten dargelegt sortiert, um eine Population von Zellen zu erzeugen, die sich replizieren und solche, die dies nicht tun. Wie Fachleute auf dem Gebiet verstehen werden, werden in manchen Fällen, beispielsweise wenn auf Antiproliferationsmittel gescreent wird, die leuchtenden (d. h. fluoreszierenden) Zellen gesammelt; in anderen Ausführungsformen, beispielsweise für das Screening auf Proliferationsmitteln, werden die wenig fluoreszierenden Zellen gesammelt. Änderungen werden durch Messen der Fluoreszenz entweder zu unterschiedlichen Zeitpunkten oder in unterschiedlichen Zellpopulationen und Vergleichen der Bestimmungen untereinander oder gegen Standards bestimmt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Proliferationstest ein Antimetabolitentest. Im Allgemeinen finden Antimetabolitentests am zweckdienlichsten dann Verwendung, wenn nach Mitteln verlangt wird, die Zellarretierung in der G1- oder G2-Ruhephase verursachen. In einem Antimetaboliten-Proliferationstest bewirkt die Anwendung eines toxischen Antimetaboliten, der sich teilende Zellen abtötet, üblicherweise das Überleben von nur denjenigen Zellen, die sich nicht teilen. Geeignete Antimetaboliten umfassen, sich jedoch nicht beschränkt auf, standardmäßige chemotherapeutische Mittel, wie z. B. Methotrexat, Cisplatin, Taxol, Hydroxyharnstoff, Nucleotidanaloga, wie z. B. AraC usw. Darüber hinaus können Antimetabolitentests die Verwendung von Genen umfassen, die bei Expression Zelltod verursachen.
  • Die Konzentration, in der der Antimetabolit zugesetzt wird, hängt üblicherweise von der Toxizität des jeweiligen Antimetaboliten ab und wird üblicherweise auf fachbekannte Weise bestimmt. Der Antimetabolit wird zugesetzt, und die Zellen werden im Allgemeinen für eine gewisse Zeitdauer inkubiert; wiederum hängt die genaue Zeitdauer üblicherweise von den Eigenschaften und der Identität des Antimetaboliten sowie von der Zellzykluszeit der jeweiligen Zellpopulation ab. Im Allgemeinen eine Zeit, die für das Eintreten von zumindest einer Zellteilung ausreicht.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird zumindest ein Proliferationstest durchgeführt, wobei mehr als einer bevorzugt wird. Folglich resultiert ein Proliferationstest in einer Population proliferierender Zellen und in einer Population arretierter Zellen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird entweder nach oder gleichzeitig mit einem oder mehreren der oben dargelegten Proliferationstests zumindest ein Zellphasentest durchgeführt. Ein „Zellphasen"-Test ermittelt, in welcher Zellphase die Zellen arretiert sind, M, G1, S oder G2.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Zellphasentest ein DNA-Bindungsfarbstoff-Test. Kurz gesagt wird ein DNA-Bindungsfarbstoff in die Zellen eingeführt und passiv aufgenommen. Wenn einmal im Inneren der Zelle, bindet der DNA-Bindungsfarbstoff an DNA, im Allgemeinen durch Interkalation, obgleich in manchen Fällen die Farbstoffe Verbindungen sein können, die entweder an die kleine oder große DNA-Furche binden. Die Farbstoffmenge korreliert daher direkt mit der DNA-Menge in der Zelle, die mit der Zellphase variiert; G2- und M-Phase-Zellen weisen den doppelten DNA-Gehalt von G1-Phase-Zellen auf, und S-Phase-Zellen weisen eine mittlere Menge abhängig davon auf, an welchem Punkt der S-Phase sich die Zellen befinden. Geeignete DNA-Bindungsfarbstoffe sind durchdringend und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Hoechst 33342 und 33258, Acridinorange, 7-AAD, LDS 751, DAPI und SYTO 16, Molecular Probes Handbook, siehe oben; insbesondere Kapitel 8 und 16.
  • Im Allgemeinen werden DNA-Bindungsfarbstoffe in Konzentrationen im Bereich von ungefähr 1 μg/ml bis ungefähr 5 μg/ml zugesetzt. Die Farbstoffe werden den Zellen zugesetzt und für eine gewisse Zeitdauer inkubiert; die Zeitdauer hängt teilweise vom gewählten Farbstoff ab. In einer der Ausführungsformen werden Messungen unmittelbar nach Farbstoffzusatz durchgeführt. Die Zellen werden dann wie unten dargelegt sortiert, um Zellpopulationen zu erzeugen, die verschiedene Farbstoffmengen und folglich verschiedene DNA-Mengen enthalten; auf diese Weise werden Zellen, die sich replizieren, von jenen, die dies nicht tun, getrennt. Wie der Fachkundige anerkennen wird, können in manchen Fällen, beispielsweise wenn auf Antiproliferationsmittel gescreent wird, Zellen mit der geringsten Fluoreszenz (und folglich mit einer Einzelkopie des Genoms) von jenen getrennt werden, die sich replizieren und folglich mehr als ein einzelnes Genom von DNA enthalten. Änderungen können durch Messen der Fluoreszenz entweder zu unterschiedlichen Zeitpunkten oder in unterschiedlichen Zellpopulationen und Vergleichen der Bestimmungen untereinander oder gegen Standards bestimmt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Zellphasentest ein Cyclin-Zerstörungstest. In dieser Ausführungsform wird vor dem Screening (und im Allgemeinen vor der Einführung eines bioaktiven Kandidat-Mittels, wie unten dargelegt) eine Fusionsnucleinsäure in die Zellen eingeführt. Die Fusionsnucleinsäure umfasst Nucleinsäure, die für eine Cy clin-Zerstörungsbox kodiert, und Nucleinsäure, die für ein detektierbares Molekül kodiert. „Cyclin-Zerstörungsboxen" sind fachbekannt und sind Sequenzen, welche die Zerstörung über den Ubiquitinierungsweg von Proteinen, welche die Boxen während bestimmter Zellphasen enthalten, verursachen. Das heißt, dass beispielsweise G1-Cycline während der G1-Phase stabil sein können, jedoch während der S-Phase aufgrund der Anwesenheit einer G1-Cyclin-Zerstörungsbox abgebaut werden. Folglich kann durch Binden einer Cyclin-Zerstörungsbox an ein detektierbares Molekül, zum Beispiel grün fluoreszierendes Protein, die An- oder Abwesenheit des detektierbaren Moleküls dazu dienen, die Zellphase der Zellpopulation zu identifizieren. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Mehrfachboxen verwendet, vorzugsweise jede mit einem anderen Fluorochrom, so dass die Detektion der Zellphase erfolgen kann.
  • Eine Anzahl von Cyclin-Zerstörungsboxen sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, zum Beispiel weist Cyclin A eine Zerstörungsbox auf, welche die Sequenz RTVLGVIGD aufweist; die Zerstörungsbox von Cyclin B1 umfasst die Sequenz RTALGDIGN. Siehe Glotzer et al., Nature 349, 132–138 (1991). Andere Zerstörungsboxen sind ebenfalls bekannt: YMTVSIIDRFMQDSCVPKKMLQLVGVT (Ratten-Cyclin B); KFRLLQETMYMTVSIIDRFMQNSCVPKK (Maus-Cyclin B); RAILIDWLIQVQMKFRLLQETMYMTVS (Maus-Cyclin B1); DRFLQAQLVCRKKLQVVGITALLLASK (Maus-Cyclin B2); und MSVLRGKLQLVGTAAMLL (Maus-Cyclin A2).
  • Die für die Cyclin-Zerstörungsbox kodierende Nucleinsäure ist operativ an für ein detektierbares Molekül kodierende Nucleinsäure gebunden. Die Fusionsproteine werden durch fachbekannte Verfahren konstruiert. Beispielsweise werden die für die Zerstörungsbox kodierenden Nucleinsäuren an eine für ein detektierbares Molekül kodierende Nucleinsäure ligiert. Unter „detektierbares Molekül" wird hierin ein Molekül verstanden, das die Unterscheidung einer das detektierbare Molekül enthaltenden Zelle oder Verbindung von einer erlaubt, die dieses nicht enthält, d. h. einem Epitop, manchmal Antigen-Marken genannt, einem spezifischen Enzym oder einem fluoreszierenden Mole kül. Bevorzugte fluoreszierende Moleküle umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, grünes fluoreszierendes Protein (GFP), blaues fluoreszierendes Protein (BFP), gelbes fluoreszierendes Protein (YFP), rotes fluoreszierendes Protein (RFP) und Enzyme, einschließlich Luciferase und β-Galactosidase. Wenn Antigen-Marken verwendet werden, setzen bevorzugte Ausführungsformen Zelloberflächenantigene ein. Das Epitop ist vorzugsweise ein beliebiges detektierbares Peptid, das sich im Allgemeinen nicht an der Zytoplasmamembran findet, obgleich in machen Fällen, wenn das Epitop eines ist, das sich normalerweise an den Zellen findet, Anstiege detektiert werden können, obgleich dies im Allgemeinen nicht bevorzugt wird. Gleichermaßen können enzymatische detektierbare Moleküle verwendet werden; zum Beispiel ein Enzym, das ein neues chromogenes Produkt erzeugt.
  • Demgemäß resultieren die Ergebnisse der Sortierung nach Zellphasentests im Allgemeinen in zumindest zwei Zellpopulationen, die sich in verschiedenen Zellphasen befinden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Verfahren verwendet, um bioaktive Kandidat-Mittel auf die Fähigkeit hin zu screenen, die Zellzyklusregulation zu modulieren, einschließlich der Aktivierung oder Unterdrückung von Zellzykluskontrollpunktwegen und der Korrektur von Kontrollpunktdefekten. Das bioaktive Kandidat-Mittel kann der Zellpopulation exogen zugegeben werden oder kann wie hierin weitergehend beschrieben in die Zellen eingeführt werden.
  • Der Ausdruck „bioaktives Kandidat-Mittel" oder „exogene Verbindung" beschreibt wie hierin verwendet ein beliebiges Molekül, z. B. Protein, kleines organisches Molekül, Kohlenhydrate (einschließlich Polysaccharide), Polynucleotid, Lipid usw. Im Allgemeinen wird eine Vielzahl von Testgemischen parallel mit verschiedenen Konzentrationen des Mittels verarbeitet, um eine unterschiedliche Reaktion auf die verschiedenen Konzentrationen zu erhalten. Typischerweise dient eine dieser Konzentrationen als negative Kontrolle, d. h. Konzentration Null oder unter der Nachweisgrenze. Zusätzlich können positive Kontrollen verwendet werden. Zum Beispiel können in den Zellzyklustests Mittel, die bekanntermaßen den Zellzyklus ändern, verwendet werden. Zum Beispiel ist p21 ein Molekül, das bekanntermaßen Zellen in der G1-Phase durch Binden von G1-Cyclin-CDK-Komplexen arretiert. Desgleichen können für die Exozytose Verbindungen, die bekanntermaßen Exozytose induzieren, verwendet werden, wie unten ausführlicher behandelt wird.
  • Kandidat-Mittel umfassen zahlreiche chemische Klassen, obgleich sie typischerweise organische Moleküle, vorzugsweise kleine organische Verbindungen mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 und weniger als ungefähr 2.500 Dalton sind. Kandidat-Mittel umfassen funktionelle Gruppen, die für die strukturelle Wechselwirkung mit Proteinen, insbesondere Wasserstoffbrückenbindung, notwendig sind, und umfassen typischerweise zumindest eine Amin-, Carbonyl-, Hydroxy- oder Carboxygruppe, vorzugsweise zumindest zwei der funktionellen chemischen Gruppen. Die Kandidat-Mittel umfassen häufig zyklische Kohlenstoff- oder heterozyklische Strukturen und/oder aromatische oder polyaromatische Strukturen, die mit einer oder mehreren der obigen funktionellen Gruppen substituiert sind. Kandidat-Mittel finden sich auch unter Biomolekülen, einschließlich Peptiden, Sacchariden, Fettsäuren, Steroiden, Purinen, Pyrimidinen, Derivaten, Strukturanaloga oder Kombinationen davon. Insbesondere bevorzugt sind Peptide.
  • Kandidat-Mittel werden aus einer breiten Vielfalt von Quellen erhalten, einschließlich Bibliotheken synthetischer oder natürlicher Verbindungen. Zum Beispiel sind zahlreiche Hilfsmittel für statistische oder gezielte Synthese einer breiten Vielfalt organischer Verbindungen und Biomolekülen verfügbar, einschließlich Expression randomisierter Oligonucleotide. Alternativ dazu sind Bibliotheken natürlicher Verbindungen in Form von Bakterien-, Pilz-, Pflanzen- und Tierextrakten verfügbar oder können leicht hergestellt werden. Zusätzlich können natürliche oder synthetisch produzierte Bibliotheken und Verbindungen leicht über herkömmliche chemische, physikalische und biochemische Weisen leicht modifiziert werden. Bekannte pharmazeutische Mittel können gezielten oder statistischen chemischen Modifikationen, wie z. B. Acetylierung, Alkylierung, Veresterung, Amidierung unterzogen werden, um Strukturanaloga herzustellen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Kandidat-Mittel Proteine. Unter „Protein" werden hierin zumindest zwei kovalent verbundene Aminosäuren verstanden, was Proteine, Polypeptide, Oligopeptide und Peptide umfasst. Das Protein kann aus natürlich auftretenden Aminosäuren und Peptidbindungen oder aus synthetischen peptidnachahmenden Strukturen aufgebaut sein. Folglich werden unter „Aminosäure-" oder „ Peptid-Rest" wie hierin verwendet sowohl natürlich auftretende, als auch synthetische Aminosäuren verstanden. Zum Beispiel werden Homo-Phenylalanin, Citrullin und Norleucin für die Zwecke der Erfindung als Aminosäuren betrachtet. „Aminosäure" umfasst ferner Iminosäurereste, wie z. B. Prolin und Hydroxyprolin. Die Seitenketten können entweder in der (R)- oder (S)-Konfiguration vorliegen. In der bevorzugten Ausführungsform liegen die Aminosäuren in der (S)- oder L-Konfiguration vor. Wenn nicht-natürlich auftretende Seitenketten verwendet werden, können Nicht-Aminosäuresubstituenten verwendet werden, um beispielsweise In-vivo-Abbauvorgänge zu verhindern oder zu verzögern. Chemische Blockierungsgruppen oder andere chemische Substituenten können ebenfalls angeführt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Kandidat-Mittel natürlich auftretende Proteine oder Fragmente natürlich auftretender Proteine. Folglich können beispielsweise Proteine enthaltende Zellextrakte, oder statistische oder gezielte Verdauungsprodukte proteinischer Zellextrakte verwendet werden. Auf diese Weise können Bibliotheken prokaryotischer oder eukaryotischer Proteine für das Screening in den hierin beschriebenen Systemen hergestellt werden. Insbesondere bevorzugt in dieser Ausführungsform sind Bibliotheken von Bakterien-, Virus- und Säugetierproteinen, wobei letztere bevorzugt und Human-Proteine speziell bevorzugt sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Kandidat-Mittel Peptide von ungefähr 5 bis ungefähr 30 Aminosäuren, wobei ungefähr 5 bis ungefähr 20 Aminosäu ren bevorzugt und ungefähr 7 bis ungefähr 15 insbesondere bevorzugt sind. Die Peptide können Verdauungsprodukte natürlich auftretender Proteine sein, wie oben dargelegt ist, Zufallspeptide oder „beeinflusste" Zufallspeptide. Unter „randomisiert" oder den grammatikalischen Entsprechungen wird verstanden, dass jede Nucleinsäure und jedes Peptid aus im Wesentlichen zufälligen Nucleotiden bzw. Aminosäuren besteht. Da diese Zufallspeptide (oder Nucleinsäuren, unten erörtert) im Allgemeinen chemisch synthetisiert werden, können sie beliebige Nucleotide oder Aminosäuren an beliebigen Positionen enthalten. Der Syntheseprozess kann so entworfen sein, dass randomisierte Proteine oder Nucleinsäuren entstehen, um die Bildung aller oder der meisten möglichen Kombinationen über die Länge der Sequenz zu ermöglichen, wodurch folglich eine Bibliothek randomisierter bioaktiver, proteinischer Kandidat-Mittel gebildet wird.
  • In einer Ausführungsform ist die Bibliothek vollständig randomisiert, wobei keine Sequenzpräferenzen oder -Konstanten and irgendwelchen Positionen vorliegen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Bibliothek beeinflusst. Das heißt, dass manche Positionen innerhalb der Sequenz entweder konstant gehalten werden oder aus einer beschränkten Anzahl von Möglichkeiten gewählt sind. Zum Beispiel werden in einer bevorzugten Ausführungsform die Nucleotide oder Aminosäurereste innerhalb einer definierten Klasse, beispielsweise hydrophober Aminosäuren, hydrophiler Reste, sterisch beeinflusster (entweder kleiner oder großer) Reste, in Richtung Erzeugung von Cysteinen zur Vernetzung, Prolinen für SH-3-Domänen, Serinen, Threoninen, Tyrosinen oder Histidinen für Phosphorylierungsstellen usw., oder zu Purinen usw., randomisiert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Kandidat-Mittel Nucleinsäuren. Unter „Nucleinsäure" oder „Oligonucleotid" oder grammatikalischen Entsprechungen werden hierin zumindest zwei kovalent miteinander verbundene Nucleotide verstanden. Eine Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung enthält im Allgemeinen Phosphodiesterbindungen, obgleich in manchen Fällen, wie unten dargelegt, Nucleinsäureanaloga umfasst sind, die alternative Gerüste aufweisen können, die zum Beispiel Phosphoramid (Beaucage et al., Tetrahedron 49(10), 1925 (1993) und Zitate darin; Letsinger, J. Org. Chem. 35, 3800 (1970); Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81, 579 (1977); Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14, 3487 (1986); Sawai et al., Chem. Lett. 805 (1984); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110, 4470 (1988); und Pauwels et al., Chemica Scripta 26, 141 (1986)), Phosphorthioat (Mag et al., Nucleic Acids Res. 19, 1437 (1991); und US-Patent Nr. 5.644.048), Phosphordithioat (Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111, 2321 (1989)), O-Methylphosphoramidit-Bindungen (siehe Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press) und Peptid-Nucleinsäure-Gerüste und Bindungen (siehe Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114, 1895 (1992); Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31, 1008 (1992); Nielsen, Nature 365, 566 (1993); Carlsson et al., Nature 380, 207 (1996)) umfassen. Andere Nucleinsäure-Analoga umfassen jene mit positiven Gerüsten (Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6097 (1995)); nichtionische Gerüste (US-Patente Nr. 5.386.023; 5.637.684; 5.602.240; 5.216.141; und 4.469.863; Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30, 423 (1991); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110, 4470 (1988); Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13, 1597 (1994); Kapitel 2 und 3, ACS Symposium Series 580, „Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Y. S. Sanghui und P. Dan Cook (Hrsg.); Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4, 395 (1994); Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34, 17 (1994); Tetrahedron Lett. 37, 743 (1996)) und Nicht-Ribose-Gerüste, einschließlich jenen, die in US-Patenten Nr. 5.235.033 und 5.034.506 und Kapiteln 6 und 7, ACS Symposium Series 580, „Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Y. S. Sanghui und P. Dan Cook (Hrsg.), beschrieben sind. Nucleinsäuren, die einen oder mehrere carbozyklische Zucker enthalten, sind in der Definition von Nucleinsäuren ebenfalls umfasst (siehe Jenkins et al., Chem. Soc. Rev., S. 169–176 (1995)). Mehrere Nucleinsäureanaloga sind in Rawls, C & E News, S. 35 (2. Juni 1997), beschrieben. Diese Modifikationen des Ribosephosphatgerüsts können durchgeführt werden, um die Addition zusätzlicher Gruppierungen, wie z. B. Markern, zu erleichtern, oder um die Stabilität und Halbwertszeit solcher Moleküle in physiologischer Umgebung zu erhöhen. Darüber hinaus können Gemische natürlich auftretender Nucleinsäuren und Analoga hergestellt werden. Alternativ dazu können Gemische verschiedener Nucleinsäureanaloga und Gemische natürlich auftretender Nucleinsäuren und Analoga hergestellt werden. Die Nu cleinsäuren können nach Spezifikation einzelsträngig oder doppelsträngig sein oder sowohl Abschnitte doppelsträngiger, als auch einzelsträngiger Sequenz enthalten. Die Nucleinsäure kann DNA sein, und zwar sowohl genomische als auch cDNA, RNA oder ein Hybrid, wobei die Nucleinsäure eine beliebige Kombination von Desoxyribo- und Ribonucleotiden und eine beliebige Kombination von Basen, einschließlich Uracil, Adenin, Thymin, Cytosin, Guanin, Inosin, Xanthin, Hypoxanthin, Isocytosin, Isoguanin usw., enthält.
  • Wie oben allgemein für Proteine beschrieben, können bioaktive Kandidat-Nucleinsäuremittel natürlich auftretende Nucleinsäuren, statistische Nucleinsäuren oder „beeinflusste" statistische Nucleinsäuren sein. Beispielsweise können Verdauungsprodukte prokaryotischer oder eukaryotischer Gene wie oben für Proteine dargelegt verwendet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Kandidat-Mittel organische chemische Gruppierungen, wovon eine breite Vielfalt in der Literatur verfügbar ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Bibliothek verschiedener bioaktiver Kandidat-Mittel verwendet. Vorzugsweise sollte die Bibliothek eine strukturell ausreichend verschiedenartige Population randomisierter Mittel bereitstellen, um einen wahrscheinlichkeitstheoretisch ausreichenden Diversitätsbereich zu Stande zu bringen, um die Bindung an ein bestimmtes Ziel zu ermöglichen. Demgemäß sollte eine Wechselwirkungsbibliothek groß genug sein, so dass zumindest eines ihrer Elemente eine Struktur aufweist, die ihm Affinität für das Ziel verleiht. Obgleich es schwierig ist, die erforderliche absolute Größe einer Wechselwirkungsbibliothek abzuschätzen, liefert die Natur mit der Immunantwort einen Hinweis: eine Diversität von 107-108 verschiedenen Antikörpern liefert zumindest eine Kombination mit ausreichender Affinität zur Wechselwirkung mit den meisten potentiellen Antigenen, denen ein Organismus ausgesetzt ist. Publizierte In-vitro-Selektionstechniken haben ebenfalls gezeigt, dass eine Bibliotheksgröße von 107 bis 108 ausreicht, um Strukturen mit Affinität für das Ziel zu finden. Eine Bibliothek mit allen Kombinationen eines Peptids mit einer Länge von 7 bis 20 Aminosäuren, wie sie hierin allgemein vorgeschlagen wird, hat das Potential, für 207 (109) bis 2020 zu kodieren. Folglich ermöglichen die vorliegenden Verfahren mit Bibliotheken von 107 bis 108 verschiedenen Molekülen eine „Arbeits"-Untermenge einer theoretisch vollständigen Wechselwirkungsbibliothek für 7 Aminosäuren und eine Untermenge von Formen für die 2020-Bibliothek. Folglich werden in einer bevorzugten Ausführungsform zumindest 106, vorzugsweise zumindest 107, bevorzugter zumindest 108 und insbesondere bevorzugt zumindest 109 verschiedene Sequenzen in den gegenständlichen Verfahren gleichzeitig analysiert. Bevorzugte Verfahren maximieren die Größe und Diversität der Bibliothek.
  • Die bioaktiven Kandidat-Mittel werden mit einer Zellen oder Zellpopulation kombiniert oder dieser zugegeben. Geeignete Zelltypen für verschiedene Ausführungsformen sind oben dargelegt. Das bioaktiven Kandidat-Mittel und die Zellen werden kombiniert. Wie Fachleute auf dem Gebiet verstehen werden, kann dies auf eine beliebige Anzahl von Wegen erzielt werden, einschließlich Einbringen der Kandidat-Mittel auf die Oberfläche der Zellen, in das die Zellen enthaltende Medium oder auf eine Oberfläche, auf der Zellen wachsen oder mit der die Zellen in Kontakt stehen; Einbringen der Mittel in die Zellen, beispielsweise durch Verwenden von Vektoren, welche die Mittel in die Zellen einführen (d. h. wenn die Mittel Nucleinsäuren oder Proteine sind).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Kandidat-Mittel entweder Nucleinsäuren oder Proteine (Proteine umfassen in diesem Zusammenhang Proteine, Oligopeptide und Peptide), die unter Verwendung von Vektoren, einschließlich viralen Vektoren, in die Wirtszellen eingeführt werden. Die Wahl des Vektors, vorzugsweise eines viralen Vektors, hängt üblicherweise vom Zelltyp ab. Wenn die Zellen replizieren, werden Retrovirus-Vektoren verwendet, wie ausführlicher unten beschrieben wird. Wenn die Zellen nicht replizieren (d. h. dass sie in einer der Wachstumsphasen arretiert sind), können andere virale Vektoren, einschließlich Lentivirus- und Adenovirus-Vektoren, verwendet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform replizieren Zellen oder können so induziert wer den, dass sie replizieren, und es werden Retrovirus-Vektoren verwendet, um bioaktive Kandidat-Mittel in die Zellen einzuführen, wie in PCT US 97/01019 und PCT US 97/01048 allgemein dargelegt ist. Im Allgemeinen wird eine Bibliothek Retrovirus-Vektoren unter Verwendung von Retrovirus-Verpackungs-Zelllinien hergestellt, die Helferdefekt und fähig sind, alle notwendigen Transproteine, einschließlich gag, pol und env, und RNA-Moleküle, die in Cis-Stellung das ψ-Verpackungssignal aufweisen, zu produzieren. Kurz gesagt wird die Bibliothek in einem Retrovirus-DNA-Konstukt-Gerüst erzeugt; standardmäßige Oligonucleotidsynthese wird durchgeführt, um entweder das Kandidat-Mittel oder für ein Protein kodierende Nucleinsäure, z. B. ein statistisches Peptid, unter Anwendung von auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannten Verfahren zu erzeugen. Nach Erzeugung der DNA-Bibliothek wird die Bibliothek in einen ersten Primen kloniert. Der erste Primen dient als „Kassette", die in das Retrovirus-Konstrukt insertiert wird. Der erste Primen enthält im Allgemeinen eine Anzahl von Elementen, die beispielsweise die erforderlichen Regulationssequenzen (z. B. Translationsregulationssequenzen, Transkriptionregulationssequenzen, Promotoren usw.), Fusionspartner, Restriktionsendonuclease- (Klonierungs- und Subklonierungs-) Stellen, Stopcodons (vorzugsweise in allen drei Leserastern), für Zweitstrang-Priming komplementäre Regionen (vorzugsweise am Ende der Stopcodonregion, da geringfügige Deletionen oder Insertionen in der Zufallsregion auftreten können) usw. umfassen.
  • Ein zweiter Primen wird dann angefügt, der im Allgemeinen aus einem Teil oder aus der gesamten komplementären Region besteht, um den ersten Primen und gegebenenfalls erforderliche Sequenzen für eine einzigartige Restriktionsstelle für die Subklonierung zu primen. DNA-Polymerase wird zugesetzt, um doppelsträngige Oligonucleotide herzustellen. Die doppelsträngigen Oligonucleotide werden mit geeigneten Subklonierungsrestriktions-Endonucleasen gespalten und in die unten beschriebenen retroviralen Zielvektoren subkloniert.
  • Es kann eine beliebige Anzahl geeigneter retroviraler Vektoren verwendet werden. Im Allgemeinen können die retroviralen Vektoren Folgendes umfassen: selektierbare Markergene, wie unten ausführlicher beschrieben wird; Promotoren, welche die Expression eines zweiten Gens betreiben, in Sense- oder Antisense-Orientierung relativ zum 5'-LTR platziert; CRU5 (ein synthetisches LTR); Tetracyclin-Regulationselemente in SIN, zellspezifische Promotoren usw.
  • Bevorzugte retrovirale Vektoren umfassen einen Vektor auf Basis des Maus-Stammzellen-Virus (MSCV) (siehe Hawley et al., Gene Therapy 1, 136 (1994)) und eines modifizierten MFG-Virus (Rivere et al., Genetics 92, 6733 (1995)) und pBABE, dargelegt in PCT US 97/01019.
  • Die Retroviren können induzierbare und konstitutive Promotoren zur Expression des Kandidat-Mittels umfassen. Zum Beispiel gibt es Umstände, worin es notwendig ist, die Peptidexpression ausschließlich während bestimmter Phasen des Selektionsprozesses oder ausschließlich in bestimmten Zellphasen zu induzieren (d. h. unter Verwendung phasenspezifischer Promotoren, wie z. B. E2F-reaktiver Promotor, p53-reaktiver Promotor, Cyclin-Promotor usw.). Eine große Anzahl von induzierbaren sowie konstitutiven Promotoren ist bekannt.
  • Darüber hinaus ist es möglich, einen retroviralen Vektor zu konfigurieren, um die induzierbare Expression retroviraler Inserte nach Integration eines einzigen Vektors in Zielzellen zu ermöglichen; wesentlich ist, dass das gesamte System im Inneren eines einzigen Retrovirus enthalten ist. Tet-induzierbare Retroviren sind entworfen worden, welche die Self-Inactivating- (SIN-) Eigenschaft der retroviralen 3'-LTR-Enhancer-Promotor-Deletionsmutante inkorporieren (Hoffman et al., PNAS USA 93, 5185 (1996)). Die Expression dieses Vektors in Zellen ist in Gegenwart von Tetracyclin oder anderen aktiven Analoga praktisch nicht detektierbar. Jedoch erfolgt die Anschaltung der Expression in Abwesenheit von Tet innerhalb von 48 Stunden nach Induktion auf das Maximum mit einheitlich erhöhter Expression der gesamten Zellpopulation, die den induzierbaren Retro virus beherbergen, was darauf hinweist, dass die Expression innerhalb der infizierten Zellpopulation einheitlich reguliert ist. Ein ähnliches, verwandtes System verwendet eine mutierte Tet-DNA-Bindungsdomäne derartig, dass sie DNA in Gegenwart von Tet band und in Abwesenheit von Tet entfernt wurde. Jedes dieser Systeme ist geeignet.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Kandidat-Mittel an einen Fusionspartner gebunden. Unter „ Fusionspartner" oder „funktioneller Gruppe" wird hierin eine Sequenz verstanden, die mit dem bioaktiven Kandidat-Mittel assoziiert ist, die allen Elementen einer Bibliothek in dieser Klasse eine gemeinsame Funktion oder Fähigkeit verleiht. Fusionspartner können heterolog (d. h. nicht nativ für die Wirtszelle) oder synthetisch (nicht nativ für irgendeine Zelle) sein. Geeignete Fusionspartner umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: a) wie unten definierte Präsentationsstrukturen, welche die bioaktiven Kandidat-Mittel in einer konformativ eingeschränkten oder stabilen Form bereitstellen; b) unten definierte, abzielende Sequenzen, welche die Lokalisierung des bioaktiven Kandidat-Mittels in einem subzellulären oder extrazellulären Kompartiment erlauben; c) wie unten definierte Wiedergewinnungssequenzen, welche die Reinigung oder Isolierung entweder der bioaktiven Kandidat-Mittel oder der für sie kodierenden Nucleinsäuren erlauben; d) Stabilitätssequenzen, die dem bioaktiven Kandidat-Mittel oder der dafür kodierenden Nucleinsäure Stabilität oder Schutz vor Abbau, z. B. Resistenz gegen proteolytischen Abbau verleihen; e) Dimerisierungssequenzen, um eine Peptiddimerisierung zu ermöglichen; oder f) jede Kombination von a), b), c), d) und e) sowie Linkersequenzen, wenn benötigt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Fusionspartner eine Präsentationsstruktur. Unter „Präsentationsstruktur" oder grammatikalischen Entsprechungen wird hierin eine Sequenz verstanden, die, wenn an bioaktive Kandidat-Mittel fusioniert, bewirkt, dass die bioaktiven Kandidat-Mittel eine konformativ eingeschränkte Form einnehmen. Proteine wechselwirken miteinander hauptsächlich über konformativ eingeschränkte Domänen. Obgleich kleine Peptide mit frei rotierenden Amino- und Carboxytermini potente Funktionen aufweisen können, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, ist die Um wandlung solcher Peptidstrukturen in pharmakologische Mittel wegen der Unmöglichkeit, Seitenkettenpositionen für peptidmimetische Synthese vorherzusagen, schwierig. Daher wird die Präsentation von Peptiden in konformativ eingeschränkten Strukturen üblicherweise die spätere Erzeugung von Pharmazeutika begünstigen sowie wahrscheinlich auch stärkere Affinitätswechselwirkungen des Peptids mit dem Zielprotein bewirken. Diese Tatsache ist in kombinatorischen Bibliothek-Erzeugungssystemen unter Verwendung biologisch erzeugter kurzer Peptide in bakteriellen Phagensystemen erkannt worden. Eine Reihe von Wissenschaftlern haben kleine Domänenmoleküle konstruiert, in denen randomisierte Peptidstrukturen präsentieren werden könnten.
  • Während die bioaktiven Kandidat-Mittel entweder Nucleinsäuren oder Peptide sein können, werden Präsentationsstrukturen vorzugsweise mit Peptid-Kandidat-Mitteln verwendet. Folglich sind synthetische Präsentationsstrukturen, d. h. künstliche Polypeptide, zur Präsentation eines randomisierten Peptids als konformativ eingeschränkte Domäne fähig. Im Allgemeinen umfassen solche Präsentationsstrukturen einen ersten Abschnitt, der an das N-terminale Ende des randomisierten Peptids gebunden ist, und einen zweiten Abschnitt, der an das C-terminale Ende des Peptids gebunden ist, das heißt, das Peptid wird in die Präsentationsstruktur insertiert, obgleich Variationen angebracht werden können, wie unten dargelegt ist. Um die funktionelle Isolierung des randomisierten Expressionsprodukts zu erhöhen, werden die Präsentationsstrukturen so selektiert oder entworfen, das sie bei Expression in der Zielzelle minimale biologische Aktivität aufweisen.
  • Bevorzugte Präsentationsstrukturen maximieren die Zugänglichkeit zum Peptid durch dessen Präsentation an einer äußeren Schleife. Demgemäß umfassen geeignete Präsentationsstrukturen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Minibody-Strukturen, Schleifen an Beta-Faltblatt-Wendepunkten und superspiralisierte Stammstrukturen, in denen die für die Struktur nicht entscheidende Reste randomisiert werden, Zink-Finger-Domänen, Transglutaminase-gebundene Strukturen, Zinkfingerdomänen, zyklische Peptide, B-Schleifenstrukturen, Helix-Barrel oder -Bündel, Leucin-Zippermotive usw.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Präsentationsstruktur eine superspiralisierte Struktur, was die Präsentation des randomisierten Peptids an einer äußeren Schleife ermöglicht. Siehe beispielsweise Myszka et al., Biochem. 33, 2362–2373 (1994). Unter Verwendung dieses Systems haben Forscher Peptide isoliert, die zu einer hochaffinen Wechselwirkung mit dem geeigneten Ziel fähig sind. Im Allgemeinen erlauben superspiralisierte Strukturen zwischen 6 bis 20 randomisierte Positionen.
  • Eine bevorzugte superspiralisierte Struktur ist die folgende:
    Figure 00350001
  • Die unterstrichenen Regionen stellen eine superspiralisierte Leucin-Zipperregion dar, die früher definiert worden ist (siehe Martin et al., EMBO J. 13(22), 5303–5309 (1994)). Die fett gedruckte GRGDMP-Region stellt die Schleifenstruktur dar, die bei geeignetem Ersatz durch randomisierte Peptide (d. h. bioaktiven Kandidat-Mitteln, hierin allgemein als (X)n dargestellt, worin X ein Aminosäurerest und n eine ganze Zahl von zumindest 5 oder 6 ist) variable Längen aufweisen kann. Der Ersatz der fett gedruckten Region wird durch kodierende Restriktions-Endonucleasestellen in den unterstrichenen Regionen erleichtert, die den direkten Einbau randomisierter Oligonucleotide an diesen Positionen erlauben. Zum Beispiel erzeugt eine bevorzugte Ausführungsform eine Xhol-Stelle an der doppelt unterstrichenen LE-Stelle und eine HindIII-Stelle an der doppelt unterstrichenen KL-Stelle.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Präsentationsstruktur eine Minibody-Struktur. Ein „Minibody" besteht im Wesentlichen aus einem minimalen Antikörper-Komplementärregion. Die Minibody-Präsentationsstruktur stellt im Allgemeinen zwei randomisierte Regionen bereit, die im gefalteten Protein entlang einer einzigen Flanke der Tertiärstruktur präsentiert werden. Siehe beispielsweise Bianchi et al., J. Mol. Biol. 236(2), 649–59 (1994) und darin zitierte Literaturstellen. Forscher haben gezeigt, dass diese Minimaldomäne in Lösung stabil ist und haben Phagenselektionssysteme in kombinatorischen Bibliotheken verwendet, um Minibodies mit Peptidregionen zu selektieren, die hohe Affinität, Kd = 10–7, für das entzündungsfördernde Zytokin IL-6 zeigen.
  • Eine bevorzugte Minibody-Präsentationsstruktur ist die folgende:
  • Figure 00360001
  • Die fett gedruckten, unterstrichenen Regionen sind die Regionen, die randomisiert werden können. Das kursiv gedruckte Phenylalanin muss in der ersten Randomisierungsregion unverändert bleiben. Das gesamte Peptid wird in einer Drei-Oligonucleotid-Variation der Superspiralen-Ausführungsform kloniert, was folglich die gleichzeitige Inkorporation zweier verschiedener Randomisierungsregionen erlaubt. Diese Ausführungsform verwendet nicht-palindrome BstXI-Stellen an den Termini.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Präsentationsstruktur eine Sequenz, die generell zwei Cysteinreste enthält, so dass eine Disulfidbindung gebildet werden kann, was eine konformativ eingeschränkte Sequenz liefert. Diese Ausführungsform wird insbesondere bevorzugt, wenn sekretorische abzielende Sequenzen verwendet werden. Wie der Fachkundige anerkennen wird, kann eine beliebige Anzahl von Zufallssequenzen, mit oder ohne Spacer oder verbindenden Sequenzen, von Cysteinresten flankiert sein. In anderen Ausführungsformen können wirksame Präsentationsstrukturen von den Zufallsregionen selbst erzeugt werden. Zum Beispiel können die Zufallsregionen mit Cysteinresten „dotiert" werden, die unter geeigneten Redoxbedingungen hoch vernetzte, strukturierte Konformationen ähnlich einer Präsentationsstruktur liefern können. Gleichermaßen können Randomisierungsregionen kontrolliert werden, um eine bestimmte Anzahl von Resten zu enthalten, die β-Faltblatt- oder α-Helix-Strukturen verleihen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Fusionspartner eine abzielende Sequenz. Wie der Fachkundige anerkennen wird, ist die Lokalisation von Proteinen innerhalb einer Zelle ein einfaches Verfahren zur Erhöhung der effektiven Konzentration und bestimmenden Funktion. Beispielsweise kann RAF1, wenn es an der Mitochondrienmembran lokalisiert ist, die Anti-Apoptose-Wirkung von BCL-2 hemmen. Gleichermaßen induziert membrangebundenes Sos Ras-vermittelte Signalisierung in T-Lymphozyten. Von diesen Mechanismen wird angenommen, dass sie auf dem Prinzip der Begrenzung des Suchraums für Liganden beruhen, dass nämlich die Lokalisation eines Proteins an der Plasmamembran die Suche für seinen Liganden im Gegensatz zum dreidimensionalen Raum des Zytoplasmas auf jenen begrenzten dreidimensionalen Raum nahe der Membran eingrenzt. Alternativ dazu kann die Konzentration eines Proteins ebenfalls in einfacher Weise durch die Art der Lokalisation erhöht werden. Das Befördern der Proteine in den Kern engt diese auf einen kleineren Raum ein, wodurch die Konzentration erhöht wird. Schließlich kann der Ligand oder das Ziel örtlich einfach auf ein spezielles Kompartiment begrenzt werden, und Hemmstoffe müssen in geeigneter Weise lokalisiert werden.
  • Folglich umfassen geeignete abzielende Sequenzen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Bindungssequenzen, die fähig sind, die Bindung des Expressionsprodukts an ein/eine vorherbestimmtes) Molekül oder Klasse von Molekülen zu bewirken, während die Bioaktivität des Expressionsprodukts erhalten bleibt (beispielsweise durch Verwenden von Enzym-Hemmstoff- oder Substratsequenzen, um auf eine Klasse relevanter Enzyme abzuzielen); Sequenzen, die selektiven Abbau von sich selbst und gleichzeitig gebundenen Proteinen signalisieren; und Signalsequenzen, die zur konstitutiven Lokalisierung der Kandidat-Expressionsprodukte an eine vorherbestimmte Stelle in der Zelle fähig sind, einschließlich an a) subzelluläre Orte, wie z. B. Golgi, endoplasmatisches Retikulum, Kern, Kernkörperchen, Kernmembran, Mitochondrien, Chloroplasten, Sekretionsvesikeln, Lysosomen und Zellmembran; und b) extrazelluläre Orte über ein Sekretionssignal. Insbesondere bevorzugt ist die Lokalisation entweder an subzelluläre Orte oder an die Außenseite der Zelle über Sekretion.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die abzielende Sequenz ein Kernlokalisierungssignal (NLS). NLSs sind im Allgemeinen kurze, positiv geladene (basische) Domänen, die dazu dienen, das gesamte Protein, in dem sie auftreten, in den Zellkern zu leiten. Zahlreiche NLS-Aminosäuresequenzen sind beschrieben worden, einschließlich einzelne monobasische NLSs, wie z. B. jenes des großen T-Antigens (Pro-Lys-Lys-Lys- Arg-Lys-Val) von SV40 (Affenvirus), Kalderon et al., Cell 39, 499–509 (1984); das Human-Retinsäure-Rezeptor-β-Kernlokalisationssignal (ARRRRP); NFκB p50 (EEVQRKRQKL; Gosh et al., Cell 62, 1019 (1990)); NFκB p65 (EEKRKRTYE; Nolan et al., Cell 64, 961 (1991)); und andere (siehe beispielsweise Boulikas, J. Cell Biochem. 55(1), 32–58 (1994)) und dibasische NLSs, wovon jenes des Xenopus- (afrikanischen Krallenfrosch-) Proteins, Nucleoplasmin (Ala Val Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Leu Asp), Dingwall et al., Cell 30, 449–458 (1982) und Dingwall et al., ). Cell Biol. 107, 641–849 (1988), beispielgebend sind. Zahlreiche Lokalisierungsuntersuchungen haben gezeigt, dass NLSs, die in synthetische Peptide eingebaut oder auf Reporterproteine aufgepfropft sind, die normalerweise nicht auf den Zellkern abzielen, bewirken, dass diese Peptide und Reporterproteine im Kern konzentriert werden. Siehe beispielsweise Dingwall und Laskey, Ann. Rev. Cell Biol. 2, 367–390 (1986); Bonnerot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6795–6799 (1987); Galileo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 458–462 (1990).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die abzielende Sequenz eine Membranverankerungssignalsequenz. Dies ist besonders zweckdienlich, da viele Parasiten und Pathogene an die Membran binden, zusätzlich zur Tatsache, dass viele intrazelluläre Ereignisse der Plasmamembran entspringen. Folglich sind membrangebundene Peptidbibliotheken sowohl für die Identifizierung von wichtigen Elementen in diesen Prozessen als auch für die Entdeckung wirksamer Hemmstoffe zweckdienlich. Die Erfindung stellt Verfahren zur Präsentation des randomisierten Expressionsprodukts extrazellulär oder im zytoplasmatischen Raum bereit; siehe 3. Für die extrazelluläre Präsentation wird der Membranverankerungsbereich am Carboxyterminus der Peptidpräsentationsstruktur bereitgestellt. Der randomisierte Expressionsproduktbereich wird auf der Zelloberfläche exprimiert und dem extrazellulären Raum präsentiert, so dass es an andere Oberflächenmoleküle (ihre Funktion beeinflussend) oder an im extrazellulären Medium vorhandene Moleküle binden kann. Die Bindung solcher Moleküle könnte Zellen, die ein das Molekül bindendes Peptid exprimieren, eine Funktion verleihen. Die zytoplasmatische Region könnte neutral sein oder könnte eine Domäne enthalten, die, wenn der extrazellulä re randomisierte Expressionsproduktbereich gebunden ist, den Zellen eine Funktion verleiht (Aktivierung von Kinase, Phosphatase, Binden anderer Zellkomponenten, um eine Funktion zu bewirken). Gleichermaßen könnte die das randomisierte Expressionsprodukt enthaltende Region innerhalb einer zytoplasmatischen Region zurückgehalten werden, und die Transmembranregion und extrazelluläre Region verbleiben konstant oder weisen eine definierte Funktion auf.
  • Membranverankerungssequenzen sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt und basieren auf der genetischen Geometrie von Säugetier-Transmembranmolekülen. Peptide werden auf Basis einer Signalsequenz (hierin als ssTM bezeichnet) in die Membran insertiert und erfordern eine hydrophobe Transmembrandomäne (hierin TM). Die Transmembranproteine werden so in die Membran insertiert, dass die 5' der Transmembrandomäne kodierten Regionen extrazellulär sind und die Sequenzen 3' intrazellulär werden. Natürlich dienen diese Transmembrandomänen, wenn sie 5' der variablen Region platziert werden, ihrer Verankerung als eine intrazelluläre Domäne, die in einigen Ausführungsformen wünschenswert sein kann. ssTMs und TMs sind für eine breite Vielfalt membrangebundener Proteine bekannt, und diese Sequenzen können entsprechend verwendet werden, entweder als Paare aus einem bestimmten Protein oder mit jeder Komponente aus einem anderen Protein, oder es können die Sequenzen alternativ dazu synthetisch sein und völlig von Konsensus- oder künstlichen Bereitstellungsdomänen hergeleitet sein.
  • Wie der Fachkundige anerkennen wird, sind Membranverankerungssequenzen, einschließlich ssTm sowie TM, für eine breite Vielfalt von Proteinen bekannt, und es kann ein beliebiges davon verwendet werden. Insbesondere bevorzugte Membranverankerungssequenzen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, jene, die sich von CD8, ICAM-2, IL-8R, CD4 und LFA-1 herleiten.
  • Zweckdienliche Sequenzen umfassen Sequenzen aus Folgenden: 1) Klasse I Membranproteine, wie z. B. IL-2-Rezeptor-Beta-Kette (Reste 1–26 sind die Signalsequenz, 241–265 sind die Transmembranreste; siehe Hatakeyama et al., Science 244, 551 (1989) und von Heijne et al., Eur. J. Biochem. 174, 671 (1988)) und Insulin-Rezeptor-Beta-Kette (Reste 1–27 sind das Signal, 957–959 sind die Transmembrandomäne und 960–1382 sind die zytoplasmatische Domäne; siehe Hatakeyama, siehe oben, und Ebina et al., Cell 40, 747 (1985)); 2) Klasse II Integralmembranproteine, wie z. B. neutrale Endopeptidase (Reste 29–51 sind die Transmembrandomäne, 2–28 sind die zytoplasmatische Domäne; siehe Malfroy et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 144, 59 (1987)); 3) Typ III Proteine, wie z. B. Human-Cytochrom P450 NF25 (Hatakeyama, siehe oben); und 4) Typ IV Poteine, wie z. B. Human-P-Glykoprotein (Hatakeyama, siehe oben). Insbesondere bevorzugt sind CD8 und ICAM-2. Zum Beispiel liegen die Signalsequenzen aus CD8 und ICAM-2 am äußersten 5'-Ende des Transkripts. Diese bestehen aus Aminosäuren 1–32 im Fall von CD8 (MASPLTRFLSLNLLLLGESILGSGEAKPQAP; Nakauchi et al., PNAS USA 82, 5126 (1985)) und 1–21 in Fall von ICAM-2 (MSSFGYRTLTVALFTLICCPG; Staunton et al., Nature (London) 339, 61 (1989)). Diese Leadersequenzen führen das Konstrukt der Membran zu, während die hydrophoben Transmembrandomänen, 3' der Zufalls-Kandidat-Region platziert, dazu dienen, das Konstrukt in der Membran zu verankern. Diese Transmembrandomänen sind durch Aminosäuren 145–195 aus CD8 (PQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICYHSR; Nakauchi, siehe oben) und 224–256 aus ICAM-2 (MVIIVTVVSVLLSLFVTSVLLCFIFGQHLRQQR; Staunton, siehe oben) umfasst.
  • Alternativ dazu umfassen die Membranverankerungssequenzen den GPI-Anker, der in einer kovalenten Bindung zwischen dem Molekül und der Lipiddoppelschicht über eine Glykosyl-Phosphatidylinositol-Bindung resultiert, beispielsweise in DAF (PNKGSGTTSGTTRLLSGHTCFTLTGLLGTLVTMGLLT, wobei das fett gedruckten Serin die Ankerstelle ist; siehe Homans et al., Nature 333(6170), 269–72 (1988), und Moran et al., J. Biol. Chem. 266, 1250 (1991)). Um dies zu bewerkstelligen, kann die GPI-Sequenz von Thy-1 3' der variablen Region anstelle einer Transmembransequenz als Kassette eingeführt werden.
  • Gleichermaßen können Myristylierungssequenzen als Membranverankerungssequenzen dienen. Es ist bekannt, dass die Myristylierung von c-src dieses in die Plasmamembran einstellt. Dies ist ein einfaches und wirksames Verfahren der Membranlokalisierung, wenn man bedenkt, dass die ersten 14 Aminosäuren des Proteins ausschließlich für diese Funktion verantwortlich sind: MGSSKSKPKDPSQR (siehe Cross et al., Mol. Cell Biol. 4(9), 1834 (1984); Spencer et al., Science 262, 1019–1024 (1993)). Dieses Motiv hat sich bereits bei der Lokalisierung von Reportergenen als wirksam erwiesen und kann verwendet werden, um die Zeta-Kette des TCR zu verankern. Dieses Motiv wird 5' der variablen Region platziert, um das Konstrukt an die Plasmamembran zu lokalisieren. Andere Modifikationen, wie z. B. Palmitoylierung, können verwendet werden, um Konstrukte in der Plasmamembran zu verankern; zum Beispiel Palmitoylierungssequenzen aus der G-Protein-gekoppelten Rezeptorkinase GRK6-Sequenz (LLQRLFSRQDCCGNCSDSEEELPTRL, wobei die fett gedruckten Cysteine palmitoyliert sind; Stoffel et al., J. Biol. Chem. 269, 27791 (1994)); aus Rhodopsin (KQFRNCMLTSLCCGKNPLGD; Barnstable et al., J. Mol. Neurosci. 5(3), 207 (1994)); und dem p21-H-ras-1-Protein (LNPPDESGPGCMSCKCVLS; Capon et al., Nature 302, 33 (1983)).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die abzielende Sequenz eine lysosomale abzielende Sequenz, einschließlich beispielsweise eine lysosomale Abbausequenz aus Lamp-1 (MLIPIAGFFALAGLVLIVLIAYLIGRKRSHAGYQTI, Uthayakumar et al., Cell. Mol. Biol. Res. 41, 405 (1995)) oder Lamp-2 (LVPIAVGAALAGVLILVLLAYFIGLKHHHAGYEQF, Konecki et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 205, 1–5 (1994), wobei beide die Transmembrandomänen kursiv gedruckt und das zytoplasmatische abzielende Signal unterstrichen zeigen).
  • Alternativ dazu kann die abzielende Sequenz eine mitochondriale Lokalisierungssequenz sein, einschließlich mitochondriale Matrixsequenzen (z. B. Hefe-Alkohol-Dehydrogenase III; MLRTSSLFTRRVQPSLFSRNILRLQST; Schatz, Eur. ). Biochem. 165, 1–6 (1987)); mitochondriale Innenmembransequenzen (Hefe-Cytochrom c-Oxidase-Unter einheit IV; MLSLRQSIRFFKPATRTLCSSRYLL; Schatz, siehe oben); mitochondriale Zwischenmembranraumsequenzen (Hefe-Cytochrom c1; MFSMLSKRWAQRTLSKSFYSTATGAASKSGKLTQKLVTAGVAAAGITASTLLYADSLTAEA MTA; Schatz, siehe oben) oder mitochondriale Außenmembransequenzen (Hefe-70-kD-Außenmembranprotein; MKSFITRNKTAILATVAATGTAIGAYYYYNQLQQQQQRGKK; Schatz, siehe oben).
  • Die Zielsequenzen können auch Sequenzen des endoplasmatischen Retikulums sein, einschließlich die Sequenzen aus Calreticulin (KDEL; Pelham, Royal Society London Transactions B, 1–10 (1992)) oder Adenovirus E3/19K-Protein (LYLSRRSFIDEKKMP; Jackson et al., EMBO ). 9, 3153 (1990)).
  • Darüber hinaus umfassen abzielende Sequenzen Peroxisomsequenzen (beispielsweise die Peroxisommatrixsequenz aus Luciferase; SKL; Keller et al., PNAS USA 4, 3264 (1987)); Farnesylierungssequenzen (beispielsweise P21 H-ras 1; LNPPDESGPGCMSCKCVLS, wobei das fett gedruckte Cystein farnesyliert ist; Capon, siehe oben); Geranylgeranylierungssequenzen (beispielsweise Protein rab-5A; LTEPTQPTRNQCCSN, wobei die fett gedruckten Cysteine geranylgeranyliert sind; Farnsworth, PNAS USA 91, 11963 (1994)); oder Zerstörungssequenzen (Cyclin B1; RTALGDIGN; Klotzbucher et al., EMBO ). 1, 3053 (1996)).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die abzielende Sequenz eine Sekretionssignalsequenz, die fähig ist, die Sekretion des Kandidat-Translationsprodukts zu bewirken. Es gibt eine große Anzahl bekannter Sekretionssignalsequenzen, die 5' der variablen Peptidregion platziert sind und die von der Peptidregion abgespalten werden, um die Sekretion in den extrazellulären Raum zu bewirken. Sekretionssignalsequenzen und ihre Übertragbarkeit auf nicht verwandte Proteine sind wohlbekannt, z. B. Silhavy et al., Microbiol. Rev. 49, 398–418 (1985). Dies ist besonders zweckdienlich, um ein Peptid zu erzeugen, das zur Bindung an die Oberfläche einer Zielzelle oder zur Beeinflussung der Physiologie einer Zielzelle fähig ist, die nicht die Wirtszelle ist, z. B. die das Peptid exprimierende Zelle. In einem bevorzugten Ansatz wird ein Fusionsprodukt konfiguriert, um hintereinander Sekretionssignalpeptid-Präsentationsstruktur-randomisierte Expressionsproduktregion-Präsentationsstruktur zu enthalten. Auf diese Weise werden Zielzellen, die in Nachbarschaft von Zellen wachsen, deren Expression der Peptidbibliothek bewirkt wurde, im sekretierten Protein getränkt. Zielzellen, die eine physiologische Änderung als Reaktion auf die Gegenwart eines Peptids zeigen, z. B. indem das Peptid an einen Oberflächenrezeptor bindet oder indem es aufgenommen wird und an intrazelluläre Ziele bindet, und die sekretierenden Zellen werden durch jedes aus einer Vielzahl an Auswahlschemen und Peptiden, die die bestimmte Wirkung verursachen, lokalisiert. Beispielhafte Wirkungen umfassen verschiedenartig jene eines Designer-Cytokins (d. h. ein Stammzellenfaktor, der fähig ist, die Teilung hämatopoetischer Stammzellen zu bewirken und ihre Totipotenz zu bewahren), eines Faktors, der die spontane Apoptose von Krebszellen bewirkt, eines Faktors, der an die Zelloberfläche von Zielzellen bindet und diese spezifisch markiert, usw.
  • Geeignete Sekretionssequenzen sind bekannt, einschließlich Signale an IL-2 (MYRMQLLSCIALSLALVTNS, Villinger et al., J. Immunol. 155, 3946 (1995)), Wachstumshormon (MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFTP; Roskam et al., Nucleic Acids Res. 7, 30 (1979)); Preproinsulin (MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVN; Bell et al., Nature 284, 26 (1980)); und Influenza HA-Protein (MKAKLLVLLYAFVAGDQI; Sekiwawa et al., PNAS 80, 3563)), mit Spaltung an der Verbindungsstelle zwischen nicht unterstrichen und unterstrichen. Eine insbesondere bevorzugte Sekretionssignalsequenz ist die Signalleadersequenz aus dem sekretierten Cytokin IL-4, das die folgenden, ersten 24 Aminosäuren von IL-4 enthält: MGLTSQLLPPLFFLLACAGNFVHG.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Fusionspartner eine Wiedergewinnungssequenz. Eine Wiedergewinnungssequenz ist eine Sequenz, die verwendet werden kann, um entweder das Kandidat-Mittel oder die dafür kodierende Nucleinsäure zu reinigen oder zu isolieren. Folglich umfassen beispielsweise Peptid-Wiedergewinnungssequenzen Reinigungssequenzen, wie zum Beispiel den His6-Marken zur Verwendung mit Ni- Affinitätssäulen und Epitopmarker zur Detektion, Immunpräzipitation oder FACS (fluoreszenzaktivierte Zellsortierung). Geeignete Epitopmarker umfassen myc (zur Verwendung mit dem im Handel erhältlichen 9E10-Antikörper), die BSP-Biotinylierungszielsequenz des bakteriellen Enzyms BirA, Influenza-Marken, IacZ und GST.
  • Alternativ dazu kann die Wiedergewinnungssequenz eine einzigartige Oligonucleotidsequenz sein, die als Sondenzielstelle dient, um die schnelle und einfache Isolierung des retroviralen Konstrukts über PCA, verwandte Techniken oder Hybridisierung zu ermöglichen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Fusionspartner eine Stabilitätssequenz, um dem bioaktiven Kandidat-Mittel oder der dafür kodierenden Nucleinsäure Stabilität zu verleihen. Folglich können beispielsweise Peptide durch den Einbau von Glycinen nach dem Initiationsmethionin (MG oder MGG0), zum Schutz des Peptids gegen Ubiquitinierung gemäß dem Varshavskyschen N-Ende-Gesetz, stabilisiert werden, wodurch folglich eine lange Halbwertszeit im Zytoplasma verliehen wird. Gleichermaßen verleihen zwei Proline am C-Terminus Peptiden eine hohe Resistenz gegen Carboxypeptidase-Wirkung. Die Gegenwart von zwei Glycinen vor den Prolinen verleiht Flexibilität und verhindert, dass sich strukturinitiierende Ereignisse im Di-Prolin in die Kandidat-Peptidstruktur fortpflanzen. Folglich sind bevorzugte Stabilitätssequenzen die folgenden: MG(X)nGGPP, wobei X eine beliebige Aminosäure und n eine ganze Zahl von zumindest vier ist.
  • In einer Ausführungsform ist der Fusionspartner eine Dimerisierungssequenz. Eine Dimerisierungssequenz erlaubt die nicht-kovalente Assoziation von einem statistischen Peptid mit einem anderen statistischen Peptid mit ausreichender Affinität, um unter normalen physiologischen Bedingungen assoziiert zu verbleiben. Dies ermöglicht in wirksamer Weise, dass kleine Bibliotheken von statistischen Peptiden (zum Beispiel 104) zu großen Bibliotheken werden, wenn zwei Peptide pro Zelle erzeugt werden, die dann dimerisieren, um eine tatsächliche Bibliothek von 108 (104 × 104) zu bilden. Es ermöglicht ferner, falls benötigt, die Bildung längerer statistischer Peptide oder strukturell komplexerer statistischer Peptidmoleküle. Die Dimere können Homo- oder Heterodimere sein.
  • Dimerisierungssequenzen können eine einzige Sequenz sein, die mit sich selbst dimerisiert, oder zwei Sequenzen, wobei jede in einem anderen retroviralen Konstrukt erzeugt wird. Das heißt, Nucleinsäuren, die für ein erstes statistisches Peptid mit der Dimerisierungssequenz 1 und für ein zweites statistisches Peptid mit der Dimerisierungssequenz 2 kodieren, so dass bei Einführung und Expression der Nucleinsäure in eine Zelle die Dimerisierungssequenz 1 mit der Dimerisierungssequenz 2 assoziiert, um eine neue statistische Peptidstruktur zu bilden.
  • Geeignete Dimerisierungssequenzen werden üblicherweise eine breite Vielfalt von Sequenzen umfassen. Eine beliebige Anzahl von Protein-Protein-Wechselwirkungsstellen ist bekannt. Darüber hinaus können Dimerisierungssequenzen auch unter Anwendung von Standardverfahren, wie z. B. dem Hefe-Zweihybridsystem, herkömmlichen biochemischen Affinitätsbindungsuntersuchungen oder sogar unter Anwendung der vorliegenden Verfahren erklärt werden.
  • Die Fusionspartner können irgendwo (d. h. N-terminal, C-terminal, intern) in der Struktur platziert werden, wie es die Biologie und Aktivität erlaubt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Fusionspartner eine Linker- oder Bindesequenz, wie sie allgemein in PCT US 97/01019 beschrieben ist, welche es den Kandidat-Mitteln ermöglichen kann, mit potentiellen Zielen ungehindert in Wechselwirkung zu treten. Wenn beispielsweise das bioaktive Kandidat-Mittel ein Peptid ist, umfassen zweckdienliche Linker Glycin-Serin-Polymere (einschließlich beispielsweise (GS)n, (GSGGS)n und (GGGS)n, worin n eine ganze Zahl von zumindest Eins ist), Glycin-Alanin-Polymere, Alanin-Serin-Polymere und andere flexible Linker, wie beispielsweise die Anbindung für den Rüttler-Kaliumkanal, und eine große Anzahl anderer flexibler Linker, wie der Fachkundige anerkennen wird. Glycerin-Serin-Polymere sind bevorzugt, da bei de dieser Aminosäuren relativ unstrukturiert sind und daher in der Lage sein können, als neutrale Bindeglieder zwischen Komponenten zu dienen. Zweitens ist Serin hydrophil und daher in der Lage, das zu solubilisieren; was eine globuläre Glycinkette sein könnte. Drittens haben sich ähnliche Ketten als wirksam zum Verbinden von Untereinheiten rekombinanter Proteine, wie z. B. von Einzelkettenantikörpern, erwiesen.
  • Zusätzlich können die Fusionspartner, einschließlich Präsentationsstrukturen, modifiziert, randomisiert und/oder gereift werden, um die Präsentationsorientierung des randomisierten Expressionsprodukts zu ändern. Zum Beispiel können Determinanten an der Schleifenbasis modifiziert werden, um die Tertiärstruktur des internen Schleifenpeptids leicht zu modifizieren, was die randomisierte Aminosäuresequenz erhält.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden Kombinationen von Fusionspartnern verwendet. Folglich kann eine beliebige Anzahl von Kombinationen von Präsentationsstrukturen, abzielenden Sequenzen, Wiedergewinnungssequenzen und Stabilitätssequenzen mit oder ohne Linkersequenzen verwendet werden.
  • Folglich können Kandidat-Mittel diese Komponenten enthalten und können dann verwendet werden, um eine Bibliothek von Fragmenten zu erzeugen, wobei jedes eine andere statistische Nucleotidsequenz enthält, die für ein anderes Peptid kodieren kann. Die Ligationsprodukte werden dann in Bakterien, wie z. B. E. coli, transformiert, und es wird DNA aus der resultierenden Bibliothek isoliert, wie allgemein in Kitamura, PNAS USA 92, 9146–9150 (1995), hiermit ausdrücklich durch Verweis aufgenommen, dargelegt ist.
  • Die Beförderung der Bibliotheks-DNA in ein retrovirales Verpackungssystem resultiert in einer Umwandlung zum infektiösen Virus. Geeignete Retrovirus-Verpackungszelllinien umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die Bing- und BOSC23-Zellinien, die in WO 94/19478; Soneoka et al., Nucleic Acid Res. 23(4), 628 (1995); Finer et al., Blood 83, 43 (1994) beschrieben sind; unten beschriebene Pheonix-Verpackungslinien, wie z. B. PhiNX-eco und PhiNX-Ampho; 292T + gag-pol und Retrovirushülle; PA317; und in Markowitz et al., Virology 167, 400 (1988), Markowitz et al., ). Virol. 62, 1120 (1988), Li et al., PNAS USA 93, 11658 (1996), Kinsella et al., Human Gene Therapy 7, 1405 (1996) dargelegte Zelllinien. Bevorzugte Systeme umfassen PhiNX-eco und PhiNX-ampho oder ähnliche Zelllinien, die in PCT US97/01019 offenbart sind.
  • Wenn die Zellen sich nicht replizieren, können andere Virusvektoren verwendet werden, einschließlich Adenovirusvektoren, Katzenimmunvirus- (FIV-) Vektoren usw.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform, wenn das Kandidat-Mittel unter Verwendung eines Virusvektors in die Zellen eingeführt wird, ist das Kandidat-Peptidmittel an ein detektierbares Molekül gebunden, und die Verfahren der Erfindung umfassen zumindest einen Expressionstest. Ein Expressionstest ist ein Test, der die Feststellung ermöglicht, ob ein bioaktives Kandidat-Mittel exprimiert worden ist, d. h. ob ein Kandidat-Peptidmittel in einer Zelle vorhanden ist. Folglich kann durch Verbinden der Expression eines Kandidat-Mittels mit der Expression eines detektierbaren Moleküls, wie z. B. eines Markers, die An- oder Abwesenheit des Kandidat-Peptidmittels bestimmt werden. Demgemäß ist in dieser Ausführungsform das Kandidat-Mittel operativ an ein detektierbares Molekül gebunden. Im Allgemeinen wird dies durch Erzeugen einer Fusionsnucleinsäure durchgeführt. Die Fusionsnucleinsäure umfasst eine erste Nucleinsäure, die für das bioaktive Kandidat-Mittel kodiert (welche die oben dargelegten Fusionspartner beinhaltet), und eine zweite Nucleinsäure, die für ein detektierbares Molekül kodiert. Die Ausdrücke „erste" und „zweite" repräsentieren nicht die Orientierung der Sequenz bezüglich der 5'-3'-Orientierung der Fusionsnucleinsäure. Beispielsweise kann unter der Annahme einer 5'-3'-Orientierung der Fusionssequenz die erste Nucleinsäure entweder 5' der zweiten Nucleinsäure oder 3' der zweiten Nucleinsäure lokalisiert sein. Bevorzugte detektierbare Moleküle in dieser Ausführungsform umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, fluoreszierende Proteine, einschließlich GFP, YFP, BFP und RFP, wobei ersteres speziell bevorzugt ist.
  • In Allgemeinen werden die Kandidat-Mittel den Zellen zugegeben (wie oben dargelegt entweder extrazellulär oder intrazellulär), und zwar unter Bedingungen, die Mittel-Ziel-Wechselwirkungen begünstigen. Im Allgemeinen werden dies physiologische Bedingungen sein. Inkubationen können bei jeglicher Temperatur durchgeführt werden, die optimale Aktivität fördert, typischerweise zwischen 4 und 40°C. Inkubationsdauern werden hinsichtlich optimaler Aktivität gewählt, können jedoch auch dahingehend optimiert werden, High-throughput-screening zu erleichtern. Typischerweise sind 0,1 bis 1 Stunde ausreichend. Überschüssiges Mittel wird im Allgemeinen entfernt oder ausgewaschen.
  • Eine Vielfalt anderer Reagenzien kann den Tests beigefügt sein. Diese umfassen Reagenzien wie Salze, neutrale Proteine, z. B. Albumin, Detergenzien usw., die verwendet werden können, um eine optimale Protein-Protein-Bindung zu erleichtern und/oder unspezifische oder Hintergrund-Wechselwirkungen zu vermindern. Es können ferner Reagenzien verwendet werden, die auf eine andere Weise die Effizienz des Tests verbessern, wie z. B. Proteaseinhibitoren, Nucleaseinhibitoren, antimikrobielle Mittel usw. Das Komponentengemisch kann in jeglicher Reihenfolge zugegeben werden, die für eine Detektion sorgt. Waschen oder Spülen der Zellen wird üblicherweise, wie der Fachkundige anerkennen wird, zu verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt und kann die Anwendung von Filtration und Zentrifugation umfassen. Bei Verwendung von zweiten Markierungsgruppierungen (hierin auch als „sekundäre Marken" bezeichnet) werden diese vorzugsweise nach Entfernung überschüssiger, ungebundener Zielmoleküle zugegeben, um unspezifische Bindung zu vermindern; jedoch können unter manchen Umständen alle der Komponenten gleichzeitig zugegeben werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) sortiert. In der vorliegenden Erfindung wird die Zellzyklusregulation durch mehrere Parameter beurteilt, was verminderten Hintergrund und höhere Spezifität zur Folge hat. Im Gegensatz dazu ist FACS in der Vergangenheit verwendet worden, um zwei verschiedene und nicht zusammenhängende Eigenschaften zur selben Zeit zu beurteilen, was Zellen mit diesen beiden Eigenschaften identifiziert, den Hintergrund für die kombinierten Eigenschaften jedoch nicht vermindert.
  • Folglich werden die Zellen in einer FACS auf Basis eines oder mehrerer Tests sortiert oder angereichert, einschließlich eines Zelllebensfähigkeitstests, eines Proliferationstests, eines Zellphasentests und (wenn Kandidat-Mittel mit detektierbaren Gruppierungen exprimiert werden) eines Expressionstests. Die Ergebnisse aus einem oder mehreren dieser Tests werden mit Zellen verglichen, die nicht dem bioaktiven Kandidat-Mittel ausgesetzt worden sind, oder mit denselben Zellen vor der Einführung des Kandidat-Mittels. Veränderungen dieser Ergebnisse können darauf hinweisen, dass das besagte Mittel die Zellzyklusregulation moduliert.
  • Eine Stärke der vorliegende Erfindung ist, dass eine Bibliothek von Kandidat-Mitteln in einer Bibliothek von Zellen getestet werden kann, da die vorliegenden Verfahren Einzelzellsortierung mit extrem hoher Spezifität erlauben, so dass sehr seltene Ereignisse detektiert werden können. Die Verwendung mehrfacher Laserstrahlengänge ermöglicht eine Sortierungsgenauigkeit von 1 in 106 mit einer Genauigkeit von mehr als 70%.
  • Darüber hinaus kann die vorliegende Erfindung zusätzlich zur Identifizierung mehrfacher Zellzyklusregulationseigenschaften mit der Identifizierung anderer Zelleigenschaften kombiniert werden. Zum Beispiel können Parameter des allgemeinen Gesundheitszustands der Zelle ermittelt und auf diese selektiert werden, indem z. B. der eine Calciumreaktion anzeigende Indo-1-Farbstoff verwendet wird. Andere Zellparameter, die vom qualifizierten Fachmann routinemäßig ermittelt werden, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: Zellgröße, Zellform, Redoxzustand, DNA-Gehalt, Nucleinsäuresequenz, Chromatinstruktur, RNA-Gehalt, Gesamtprotein, Antigene, Lipide, Oberflächenproteine, intrazelluläre Rezeptoren, oxidativer Metabolismus, DNA-Synthese und Abbau und intrazellulärer pH.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird jeder der Messwerte simultan an einer einzelnen Zelle ermittelt, während sie die Strahlengänge von mehreren Lasern passiert. Alternativ dazu werden die Messungen hintereinander durchgeführt. Durch Verwenden von mehr als einem Parameter, um die Zellzyklusregulation oder Änderungen der Zellzyklusregulation zu detektieren, wird der Hintergrund vermindert und die Spezifität erhöht. Diejenigen Zellen, welche den Parametern der gewünschten Eigenschaften gerecht werden, können physikalisch von Zellen aussortiert werden, welche den gewünschten Parametern nicht gerecht werden, oder sie können über ihren prozentuellen Anteil in der Zellpopulation bestimmt werden.
  • Im Allgemeinen sind KD ≤ 1 μM bevorzugt, um die Erhaltung der Bindung in Gegenwart der bei der FACS vorhandenen Scherkräfte zu ermöglichen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen bei sehr hohen Geschwindigkeiten sortiert, beispielsweise mehr als ungefähr 5.000 Sortierungsereignisse pro Sekunde, wobei mehr als ungefähr 10.000 Sortierungsereignisse pro Sekunde bevorzugt und mehr als ungefähr 25.000 Sortierungsereignisse pro Sekunde insbesondere bevorzugt sind, wobei Geschwindigkeiten von mehr als ungefähr 50.000 bis 100.000 speziell bevorzugt sind.
  • Für Stimulation und Färbung verarbeitete Zellen werden im Allgemeinen vor der Zytometrie in einem Puffer aufgenommen und filtriert. Die Zellen können mit einem FACSCAN- (Becton Dickinson Inc., Laserlinie 488 nm) oder einem Mo-Flo- (Cytomation Inc., Laserlinien 350 nm Breitband (UV), 488 nm und 647 nm) Zytometer analysiert werden. Zellen werden, wenn erwünscht, unter Verwendung von Mo-Flo sortiert.
  • Wo die Zellen mittels Mikroskopie analysiert werden, werden Zellen nach Stimulierung oder Färbung im Allgemeinen auf Glasobjektträgern montiert und mit Deckgläsern bedeckt; diese werden direkt mittels Hellfeld- oder Fluoreszenzmikroskopie oder umgekehrten Mikroskop (d. h. TE300, Nikon) unter Verwendung von standardmäßigen BFP-, FITC- oder TRITC-Filtersets (beispielsweise) sichtbar gemacht. Bilder können auch mit einem umgekehrten konfokalen Rastermikroskop (Zeiss Inc., Bio-Rad Inc.) unter Verwendung standardmäßiger FITC- und TRITC-Filtersets (beispielsweise) erhalten werden.
  • Die Sortierung liefert eine Zellpopulation mit den gewünschten Eigenschaften. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Parameter so eingestellt, dass zumindest ein bioaktives Kandidat-Mittel identifiziert wird, das die Zellzyklusregulation moduliert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird das bioaktive Mittel charakterisiert. Dies wird wie vom Fachkundigen anerkannt vor sich gehen und umfasst im Allgemeinen eine Analyse der Struktur, Identität, Bindungsaffinität und Funktion des Mittels. Wenn einmal identifiziert, wird das bioaktive Mittel neu synthetisiert und mit der Zielzelle kombiniert, um die Modulation der Zellzyklusregulation unter verschiedenen Bedingungen und in An- oder Abwesenheit verschiedener anderer Mittel zu verifizieren. Das bioaktive Mittel kann in einer therapeutisch wirksamen Dosis hergestellt werden, um die Zellzyklusregulation zu modulieren, und mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger kombiniert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können Zellpopulationen verschiedenen experimentellen Bedingungen mit oder ohne Kandidat-Mitteln unterworfen werden. Änderungen der Bedingungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Änderungen von pH, Temperatur, Puffer- oder Salzkonzentrationen usw. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der pH geändert, im Allgemeinen durch Erhöhen oder Erniedrigen des pH-Werts für gewöhnlich von ungefähr 0,5 bis ungefähr 3 pH-Einheiten. Alternativ dazu wird die Temperatur geändert; wobei Erhöhungen oder Erniedrigungen von ungefähr 5°C bis ungefähr 30°C bevorzugt sind. Gleichermaßen kann die Salzkonzentration modifiziert werden, wobei Erhöhungen oder Erniedrigungen von ungefähr 0,1 M bis ungefähr 2 M bevorzugt sind.
  • Es ist dem Fachkundigen klar, dass die hierin bereitgestellten Schritte in den Tests in ihrer Reihenfolge variieren können. Es versteht sich jedoch auch, dass, obwohl verschie dene Optionen (von Verbindungen, gewählten Eigenschaften oder Reihenfolge von Schritten) hierin bereitgestellt werden, jede der Optionen auch einzeln bereitgestellt wird und jede einzeln von den anderen hierin bereitgestellten Optionen getrennt wer den kann. Darüber hinaus liegen offensichtliche und fachbekannte Schritte, welche die Empfindlichkeit des Tests üblicherweise erhöhen, im Schutzumfang dieser Erfindung. Zum Beispiel können zusätzliche Waschschritte oder Trennungs- und Isolierungsschritte erfolgen. Darüber hinaus versteht sich, dass in manchen Fällen die Detektion in den Zellen erfolgt, jedoch auch in den Medien oder umgekehrt stattfinden kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Zellphänotyp die Exozytose, und die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung richten sich wiederum unter Verwendung eines FACS-Geräts auf die Detektion von Änderungen der Exozytose. Es gibt eine Anzahl von Parametern, die beurteilt oder getestet werden können, um die Detektion von Änderungen von exozytischen Stoffwechselwegen zu ermöglichen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Lichtstreuung, Fluoreszenzfarbstoffaufnahme, Fluoreszenzfarbstofffreisetzung, Granulateinwirkung, Oberflächengranulat-Enzymaktivität und Menge granulatspezifischer Proteine. Durch Testen oder Messen von einem oder mehreren dieser Parameter ist es möglich, nicht nur Änderungen der Exozytose zu detektieren, sondern Änderungen verschiedener Schritte des exozytischen Stoffwechselweges. Zusätzlich vermindert die Multiparameteranalyse auch den Hintergrund oder detektierte „falsch Positive". Auf diese Weise kann eine schnelle, genaue Analyse von Kandidat-Mitteln durchgeführt werden, um Mittel zu identifizieren, welche die Exozytose modulieren.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung Verfahren zum Screenen auf Änderungen der Exozytose einer Zellpopulation bereit. Unter „Änderung" oder „Modulation" wird im Zusammenhang mit Exozytose ein Abfall oder Anstieg des Ausmaßes an Exozytose in einer Zelle im Vergleich zu einer anderen Zelle oder in derselben Zelle unter anderen Bedingungen verstanden. Die Messungen können unter Bedingungen, welche für jede Messung dieselben sind, oder unter verschiedenartigen Bedingungen, mit oder ohne bioaktives Mittel, oder in verschiedenen Stadien des exozytischen Prozesses ermittelt werden. Beispielsweise kann eine Messung der Exozytose in einer Zellpopulation ermittelt werden, in der ein bioaktives Kandidat-Mittel vorhanden oder in der das bioaktive Kandidat-Mittel abwesend ist. In einem weiteren Beispiel werden die Messwerte der Exozytose ermittelt, worin der Zustand oder die Umgebung der Zellpopulation sich voneinander unterscheidet. Zum Beispiel können die Zellen in An- oder Abwesenheit von physiologischen Signalen, wie z. B. exozytischen Induktoren (d. h. Ca++, Ionomycin usw.), Hormonen, Antikörpern, Peptiden, Antigenen, Zytokinen, Wachstumsfaktoren, Aktionspotentialen oder anderen Zellen (d. h. Zell-Zell-Kontakten), beurteilt werden. In einem weiteren Beispiel werden die Messungen der Exozytose in verschiedenen Stadien des exozytischen Prozesses ermittelt. In noch einem weiteren Beispiel werden die Messungen der Exozytose vorgenommen, worin die Bedingungen dieselben sind und die Änderungen zwischen einer Zelle oder Zellpopulation und einer anderen Zelle oder Zellpopulation auftreten.
  • Unter einer „Zellpopulation" wird hierin eine wie oben definierte Probe von Zellen verstanden. In dieser Ausführungsform sind die Zellen vorzugsweise (jedoch nicht notwendigerweise) schnell wachsend, retroviral infizierbar und mit Farbstoffen und Antikörpern kompatibel. Bevorzugte Zelltypen zur Verwendung in dieser Ausführungsform umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Mastzellen, Neuronen, Nebennierenchromaffinzellen, Basophile, Endokrinzellen einschließlich Pankreas-β-Zellen, azinöse Pankreaszellen einschließlich Exokrinzellen, Neutrophile, Monozyten, Lymphozyten, Mammazellen, Sperma, Eizellen und PMN-Leukozyten, Endothelzellen, Adipozyten und Muskelzellen.
  • Die exozytischen Verfahren umfassen das Sortieren der Zellen in einem FACS-Gerät durch Testen auf Änderungen von zumindest drei der Eigenschaften, die aus der aus Lichtstreuung, Fluoreszenzfarbstoffaufnahme, Fluoreszenzfarbstofffreisetzung, Granulatexposition, Oberflächengranulat-Enzymaktivität und Menge an granulatspezifischem Protein bestehenden Gruppe gewählt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform wird jede dieser Messungen gleichzeitig aus einer einzelnen Zelle bestimmt, während sie die Strahlengänge von mehreren Lasern passiert. Alternativ dazu können die Messungen hintereinander durchgeführt werden. Durch Verwenden von mehr als einem Parameter, um Exozytose oder Änderungen der Exozytose zu detektieren, wird der Hintergrund vermindert und die Spezifität erhöht. Diejenigen Zellen, die den Parametern der gewünschten Eigenschaften genügen, können physikalisch von jenen Zellen aussortiert werden, die den gewünschten Parametern nicht entsprechen, oder sie können durch ihren prozentuellen Anteil in der Zellpopulation bestimmt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden Änderungen der Lichtstreuung getestet, um Änderungen der Exozytose in einer Zellpopulation zu ermitteln. Bei Betrachtung in der FACS weisen die Zellen bestimmte Eigenschaften auf, wie sie durch ihre Vorwärts- und 90-Grad- (Seitwärts-) Lichtstreuungseigenschaften gemessen werden. Diese Streuungseigenschaften stellen die Größe, Form und den Granulatgehalt der Zellen dar. Bei Aktivierung der Zellen mit einem pro-exozytischen Stimulus ändern sich die Vorwärtssowie die Seitwärtsstreuungseigenschaften der Zellen beträchtlich. Diese Eigenschaften begründen zwei als Ausgabewert für das exozytische Ereignis zu messende Parameter. Diese Eigenschaften ändern sich proportional zum Ausmaß der Exozytose der Zellen und hängen auch vom Zeitverlauf der exozytischen Ereignisse ab. Änderungen der Intensität der Lichtstreuung oder des Zell-Brechnungsindex zeigen Änderungen der Exozytose entweder in derselben Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten oder im Vergleich zur selben Zelle unter verschiedenen Bedingungen oder mit an- oder abwesenden bioaktiven Kandidat-Mitteln oder im Vergleich zu anderen Zellen oder Zellpopulationen an.
  • In einer hierin bereitgestellten Ausführungsform wird eine Zellpopulation mit einem Mittel kombiniert, das bekanntermaßen die Exozytose stimuliert, und es werden die Lichtstreuungseigenschaften bestimmt. Zellen, die Lichtstreuungseigenschaften aufweisen, welche die gewünschte exozytische Aktivität anzeigen, können identifiziert und/oder sortiert werden. Exozytische Aktivität, wie sie hierin verwendet wird, umfasst das Fehlen von Aktivität. In einer bevorzugten Ausführungsform werden bioaktive Kan didat-Mittel mit der Zellpopulation vor oder mit dem exozytischen Stimulus kombiniert, wie unten ausführlicher dargelegt ist. In dieser Ausführungsform, wo die Lichtstreuungseigenschaften sich zwischen a) einer mit einem bekannten exozytischen Stimulus und einem bioaktiven Kandidat-Mittel kombinierten Zellpopulation und b) einer mit einem bekannten exozytischen Stimulus kombinierten Zellpopulation, worin das bioaktive Kandidat-Mittel abwesend ist, unterscheiden, kann ermittelt werden, dass das bioaktive Kandidat-Mittel die Exozytose moduliert. Es kann ferner in manchen Fällen wünschenswert sein, einen Exozytose-Inhibitor aufzunehmen oder den exozytischen Stimulus auszunehmen, um bioaktive Mittel zu identifizieren, welche die Exozytose induzieren. Vorzugsweise werden Lichtstreuungseigenschaften in Kombination mit zumindest einer und vorzugsweise zwei weiteren Eigenschaften gemessen, die Exozytose-Aktivität anzeigen. Allgemeine Verfahrensweisen für Lichtstreuungsmessungen werden in Perretti et al., J. Pharmacol. Methods 23(3), 187–194 (1990) und Hide et al., J. Cell Biol. 123(3), 585–593 (1993), weitergehend beschrieben. Im Allgemeinen sind Änderungen von zumindest ungefähr 5% bezüglich der Basislinie bevorzugt, wobei zumindest ungefähr 25% bevorzugter, zumindest ungefähr 50% insbesondere bevorzugt und zumindest ungefähr 75 bis 100% speziell bevorzugt sind. Unter Basislinie werden in diesem Fall im Allgemeinen die Lichtstreuungseigenschaften der Zellen vor der exozytischen Stimulation verstanden. In allen hierin bereitgestellten Fällen kann die Basislinie auch fürjeden Kontrollparameter eingestellt werden. Beispielsweise kann die Basislinie auf den Exozytose-Messwert einer bestimmten Zelle, einer ähnlichen Zelle unter anderen Bedingungen oder auf einen bestimmten Zeitpunkt während der Exozytose festgesetzt werden.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Änderungen der Fluoreszenzfarbstoffaufnahme beurteilt. Bevorzugte fluoreszierende Farbstoffe umfassen Styrylfarbstoffe, die Exozytose-Aktivität in Bezug auf Endozytose anzeigen, was manchmal als gekoppelte Endozytose bezeichnet wird. Die Theorie hinter der gekoppelten Endozytose ist, dass Exozytose eingehende Zellen auch Endozytose eingehen müssen, um Zellvolumen und Membranintegrität zu erhalten. Folglich wird bei exozytischen Stimulation auch die Endozytose erhöht, was eine indirekte Messbarkeit der Exozytose durch Quantifizierung des Ausmaßes der Styrylfarbstoffaufnahme bereitstellt.
  • In einer hierin bereitgestellten Ausführungsform werden die Zellen in einer Lösung von Styrylfarbstoff getränkt und mit einem pro-exozytischen Stimulus stimuliert und der Farbstoff quantifiziert. Vorzugsweise werden die Zellen nach exozytischen Stimulation abzentrifugiert, abgesaugt und in frischem Puffer resuspendiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein bioaktives Kandidat-Mittel mit den Zellen wie hierin beschrieben kombiniert. In manchen Fällen kann das bioaktive Kandidat-Mittel mit Zellen mit einem Exozytose-Inhibitor oder ohne den pro-exozytischen Stimulus kombiniert werden. Vorzugsweise wird ein pro-exozytischer Stimulus der Zellpopulation zugesetzt, was in einer drastischen Erhöhung des Fluoreszenzsignals des Farbstoffs resultiert. Das erhöhte zellassozierte Signal beruht auf gekoppelter Endozytose des Styrylfarbstoffs und ist proportional zur exozytischen Reaktion bezüglich der Zeit sowie Intensität. Im Gegensatz dazu erhöht sich das Signal nicht, wenn die Exozytose inhibiert oder nicht induziert ist. Änderungen werden durch Messen der Fluoreszenz entweder zu verschiedenen Zeitpunkten oder in verschiedenen Zellpopulationen und Vergleichen der Bestimmungen miteinander oder mit Standards bestimmt. Im Allgemeinen sind Änderungen von zumindest ungefähr 50% bezüglich der Basislinie bevorzugt, wobei Änderungen von zumindest ungefähr 75%–100% bevorzugter, Änderungen von zumindest ungefähr 250% insbesondere bevorzugt und Änderungen von zumindest ungefähr 1.000–2.000% speziell bevorzugt sind. Unter Basislinie wird in diesem Fall die Styrylfarbstoffaufnahme von Zellen vor exozytischer Stimulation verstanden.
  • Bevorzugte Styrylfarbstoffe umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, FM1-43, FM4-64, FM14-68, FM2-10, FM4-84, FM1-84, FM14-27, FM14-29, FM3-25, FM3-14, FM5-55, RH414, FM6-55, FM10-75, FM1-81, FM9-49, FM4-95, FM4-59, FM9-40 und Kombinationen davon. Bevorzugte Farbstoffe, wie z. B. FM1-43, fluoreszieren nur schwach in Wasser, fluoreszieren jedoch sehr stark, wenn sie mit einer Membran assoziiert sind, so dass die Farbstoffaufnahme leicht erkennbar ist. Geeignete Farbstoffe sind im Handel er hältlich, d. h. von Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, „Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals", 6. Aufl. (1996), besonders Kapitel 17 und insbesondere Abschnitt 2 von Kapitel 17 (einschließlich zitierte verwandte Kapitel). Vorzugsweise werden die Farbstoffe in Lösung bereitgestellt, worin die Farbstoffkonzentration ungefähr 25 bis 1.000–5.000 nM beträgt, wobei ungefähr 50 bis ungefähr 1.000 nM bevorzugt und ungefähr 50 bis 250 insbesondere bevorzugt sind. Die Verwendung von Styrylfarbstoffen wird in Betz et al., Current Opinion in Neurobiology 6, 365–371 (1996), näher beschrieben. Vorzugsweise wird die Fluoreszenzfarbstoffaufnahme in Kombination mit zumindest einem und vorzugsweise zwei anderen Indikatoren der Exozytose-Aktivität gemessen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Änderungen der Fluoreszenzfarbstofffreisetzung beurteilt. Die vorliegende Erfindung richtet sich zum Teil auf die Entdeckung, dass Niedrig-pH-Anreicherungsfarbstoffe, die normalerweise zur Färbung von Lysozymen verwendet werden, auch exozytische Niedrig-pH-Granulate anfärben. Im Allgemeinen können diese Farbstoffe passiv von den Zellen aufgenommen werden und sich in Granulaten anreichern; jedoch können die Zellen zur Aufnahme des Farbstoffs induziert werden, d. h. durch gekoppelte Endozytose. in einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Zellpopulation in einem Niedrig-pH-Anreicherungsfarbstoff getränkt, so dass der Farbstoff von den Zellen aufgenommen wird. Die Zellen werden vorzugsweise gewaschen. Die Zellen können einem pro-exozytischen Stimulus und/oder Inhibitor ausgesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein bioaktives Kandidat-Mittel mit der Zellpopulation und vorzugsweise mit dem pro-exozytischen Stimulus kombiniert. Es wird die Fluoreszenz beurteilt. Änderungen der Fluoreszenzfarbstofffreisetzung zwischen Zellen oder zu verschiedenen Zeitpunkten in derselben Zelle zeigen Änderungen der Exozytose an. Vorzugsweise treten Änderungen zwischen Zellen und insbesondere bevorzugt zwischen Zellen auf, denen unterschiedliche bioaktive Mittel zugesetzt wurden. Änderungen von zumindest ungefähr 5% bezüglich der Basislinie sind bevorzugt, wobei zumindest ungefähr 25% bevorzugter, zumindest ungefähr 50% insbesondere bevorzugt und zumindest ungefähr 100% speziell bevorzugt sind.
  • Unter Basislinie wird in diesem Fall die Menge an Farbstoff in den Zellen vor der Stimulation verstanden.
  • In dieser Ausführungsform sind Niedrig-pH-Anreicherungsfarbstoffe bevorzugt. Solche Niedrig-pH-Anreicherungsfarbstoffe umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Acridinorange, LYSOTRACKERTM-Rot, LYSOTRACKERTM-Grün und LYSOTRACKERTM-Blau. Solche Farbstoffe sind im Handel erhältlich, d. h. von Molecular Probes, siehe oben, insbesondere einschließlich Kapitel 17, Abschnitt 4 von Kapitel 17 und zitierte „verwandte Kapitel", d. h. Kapitel 23. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Farbstoffe in einer Lösung verabreicht, worin der Farbstoff in einer Konzentration von ungefähr 50 nM bis ungefähr 25 μM vorliegt, wobei ungefähr 5 μM bis ungefähr 25 μM bevorzugt und ungefähr 1 bis 5 μM insbesondere bevorzugt sind. Die Verwendung von Niedrig-pH-Anreicherungsfarbstoffen ist allgemein (bezüglich Lysozym-Untersuchungen) in Haller et al., Cell Calcium 19(2), 157–165 (1996), beschrieben.
  • In einer alternativen Ausführungsform, worin Änderungen der Fluoreszenzfarbstofffreisetzung beurteilt werden, wird die in den Überstand freigesetzte Fluoreszenz beurteilt. In dieser Ausführungsform werden entweder Styrylfarbstoffe, die reversibel endozytierte Membranen färben, oder Niedrig-pH-Anreicherungsfarbstoffe verwendet. In dieser Ausführungsform wird eine Zellpopulation im Farbstoff getränkt, so dass der Farbstoff passiv oder durch Induktion in die Zellen aufgenommen wird. Die Zellen werden dann vorzugsweise gewaschen. Die Zellen können einem pro-exozytischen Stimulus und/oder Inhibitor und gegebenenfalls einem bioaktiven Kandidat-Mittel ausgesetzt werden. Die Zellen, die einem pro-exozytischen Stimulus ausgesetzt sind, scheiden üblicherweise Farbstoff in das extrazelluläre Medium aus. Die Fluoreszenz im Medium kann gemessen oder detektiert werden. Dieser Vorgang wird manchmal als Entfärbung der Zellen bezeichnet. Gegebenenfalls kann ein Mittel zur Verbesserung und Erleichterung der Detektian des Farbstoffes im Medium zugesetzt werden. Zum Beispiel erhöhen Mizellenbildende Tenside, wie z. B. 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS) die Fluoreszenz und ermöglichen dadurch die Detektion geringer Mengen exozytischen Aktivität. Veränderungen der Farbstofffreisetzung zeigen üblicherweise Änderungen der Exozytose in denselben Zellen, zwischen Zellen und insbesondere bevorzugt zwischen Zellen an, denen unterschiedliche bioaktive Mittel zugesetzt wurden. Im Allgemeinen sind Änderungen von zumindest ungefähr 5% bezüglich der Basislinie bevorzugt, wobei zumindest ungefähr 25% bevorzugter, zumindest ungefähr 50% insbesondere bevorzugt und zumindest ungefähr 100% speziell bevorzugt sind. Unter Basislinie wird in diesem Fall die Farbstofffreisetzung vor dem exozytischen Stimulus verstanden. Vorzugsweise wird die Farbstofffreisetzung bei Messung im Medium mit der Beurteilung von zumindest einem weiteren Exozytose-Indikator kombiniert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden Änderungen der Granulat-Exposition bestimmt. Die Granulate werden während der Exozytose dem Medium ausgesetzt, d. h. die Granulate fusionieren mit der Zellmembran und exponieren ihren Inhalt bzw. setzen ihn frei. Daher ist Granulat-Exposition indikativ für exozytische Aktivität und ihre Abwesenheit ist dafür indikativ, dass Exozytose nicht induziert worden ist oder inhibiert worden ist. Vorzugsweise wird Granulat-Exposition durch ein detektierbares Mittel detektiert, das spezifisch an Granulate bindet. Ein Beispiel eines hierin verwendeten Mittels ist Annexin V, ein Mitglied einer Proteinfamilie, die spezifische Bindung an Phospholipid (Phosphatidylserin) auf eine von zweiwertigen Ionen abhängige Weise zeigt. Dieses Protein ist weithin verwendet worden zur Messung von Apoptose (programmierter Zelltod), da die Zelloberflächenexposition von Phosphatidylserin ein kennzeichnendes frühes Signal dieses Prozesses ist. Überraschenderweise ist hierin ermittelt worden, dass Annexin V spezifisch an exozytische Granulate bindet, wenn diese während des Sekretionsprozesses an der Zelloberfläche exponiert sind; Granulate im Inneren der Zelle sind unmarkiert. Diese Eigenschaft von Annexin V wird hierin verwendet, um einen Einzel-Exozytose-Test auf Basis seiner Exozytose-abhängigen Bindung zu erstellen. Bei exozytischen Stimulation von Zellen zeigen die Zellen einen Anstieg von Annexin-Bindung und Fluoreszenzsignal proportional zur exozytischen Reaktion hinsichtlich Zeit und Intensität.
  • In dieser Ausführungsform ist das Annexin entweder direkt oder indirekt markiert und mit einer Zellpopulation kombiniert. Annexin ist im Handel erhältlich, d. h. von PharMingen, San Diego, Kalifornien, oder Caltag Laboratories, Millbrae, Kalifornien. Vorzugsweise wird das Annexin in Lösung bereitgestellt, worin das Annexin in einer Konzentration von ungefähr 100 ng/ml bis ungefähr 500 ng/ml, bevorzugter von ungefähr 500 ng/ml bis ungefähr 1 μg/ml und insbesondere bevorzugt von ungefähr 1 μg/ml bis ungefähr 5 μg/ml vorliegt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Annexin direkt markiert; beispielsweise kann Annexin mit einem Fluorochrom, wie z. B. Fluoreszeinisothiocyanat (FITC), Alexa-Farbstoffen, TRITC, AMCA, APC, tri-color, Cy-5 und anderen fachbekannten oder im Handel erhältlichen, markiert sein. In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform ist das Annexin mit einem ersten Marken, wie z. B. einem Hapten, wie z. B. Biotin, markiert, und es wird ein sekundärer fluoreszierender Marken, wie z. B. fluoreszierendes Streptavidin, verwendet. Andere Erst- und Zweitmarkerpaare können verwendet werden, wie der Fachkundige anerkennen wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen Bedingungen unterworfen, die normalerweise Exozytose auslösen. Gegebenenfalls wird den Zellen ein bioaktives Kandidat-Mittel zugesetzt. In manchen Fällen kann es wünschenswert sein, einen Exozytose-Inhibitor aufzunehmen, um zu ermitteln, ob das Kandidat-Mittel die Inhibierung rückgängig machen kann, oder das bioaktives Kandidat-Mittel ohne exozytischen Stimulus zuzusetzen, um zu ermitteln, ob das Mittel Exozytose induziert. Die Zellen werden vorzugsweise gewaschen und die Fluoreszenz im Mikroskop oder am Durchflusszytometer detektiert. Änderungen der Detektion der Annexin-Bindung zeigen Änderungen der Exozytose in derselben Zelle oder unter verschiedenen Zellen mit oder unter denselben Bedingungen und/oder damit kombinierten Mitteln an. Im Allgemeinen sind Änderungen von zumindest ungefähr 25% bezüglich der Basislinie bevorzugt, wobei zumindest ungefähr 50% bevorzugter, zumindest ungefähr 100 insbesondere bevorzugt und zumindest ungefähr 500% speziell bevorzugt sind. Unter Basislinie wird in diesem Fall das Ausmaß der Annexin-Bindung vor der exozytischen Stimulation verstanden.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird Granulat-Exposition mit einem kat ionischen Farbstoff, wie z. B. Berberin oder Rutheniumrot, detektiert. Solche kationischen Farbstoffe färben spezifisch sekretierende Granulate an. Wenn Exozytose auftritt und sekretierende Granulate an der Zelloberfläche exponiert sind, kann folglich ein Anstieg der Fluoreszenz detektiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der kationische Farbstoff mit einer Zellpopulation in An- oder Abwesenheit eines exozytischen Stimulus und/oder Inhibitors und gegebenenfalls in An- oder Abwesenheit eines bioaktiven Kandidat-Mittels kombiniert. In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform wird Berberin mit einer Zelle und einem exozytischen Stimulus und einem bioaktiven Kandidat-Mittel kombiniert, um zu ermitteln, ob das bioaktive Kandidat-Mittel die exozytische Aktivität modulieren kann. Vorzugsweise werden die Zellen gewaschen, und es wird dann die Fluoreszenz bestimmt. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Beurteilung mittels kationischen Farbstoffen mit der Beurteilung von zumindest einem weiteren Indikator der Exozytose kombiniert. Der Farbstoff wird mit den Zellen auf fachbekannte Weise kombiniert. Allgemeine, Berberin beschreibende Verfahrensweisen sind in Berlin und Enerback, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 73(3), 256–262 (1984), beschrieben und hierin durch Verweis aufgenommen. Im Allgemeinen sind Änderungen von zumindest 5% der Basislinie bevorzugt, wobei zumindest ungefähr 25% bevorzugter, zumindest ungefähr 50% insbesondere bevorzugt und zumindest ungefähr 100% speziell bevorzugt sind. Unter Basislinie wird in diesem Fall das Ausmaß der Farbstoffbindung vor der Stimulation verstanden.
  • Gleichermaßen kann Con A-FITC verwendet werden, da es an das Kohlenhydrat an Granulatproteinen in einer Weise bindet, die den hierin dargelegten ähnlich ist.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Änderungen der Oberflächengranulat-Enzymaktivität bestimmt. Sekretionsgranulate enthalten Enzyme, wie z. B. Proteasen und Glykosidasen, die als Teil des Exozytose-Prozesses freigesetzt werden. Häufig sind diese Enzyme innerhalb des Granulats wegen des niedrigen pH-Wertes inaktiv, werden jedoch bei Einwirkung des extrazellulären Mediums bei physiologischem pH aktiviert. Diese Enzymaktivitäten können unter Verwendung von chromogenen oder fluorogenen Substraten als Komponenten des extrazellulären Mediums gemessen werden. Diese ermöglicht die Detektion exozytischen Zellen in verschiedenen Ansätzen.
  • In einer Ausführungsform, die hierin manchmal als auf Population basierter Enzymtest bezeichnet wird, kann die Erzeugung eines Signals über die Spaltung eines chromogenen oder fluorogenen Substrats im Medium quantifiziert werden. Das heißt, dass die Menge von detektierbarem Reaktionsprodukt im Medium mit der Menge an vorhandenem Enzym und folglich mit dem Ausmaß an Exozytose in Zusammenhang steht. In dieser Ausführungsform ist es das Medium, nicht die Zellen, das detektierbar wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden Zellen einem exozytischen Stimulus und gegebenenfalls einem bioaktiven Kandidat-Mittel ausgesetzt. Das chromogene oder fluorogene Substrat wird dem Medium zugesetzt und Änderungen des Signals beurteilt, während die Enzyme die extrazellulären Substrate spalten.
  • In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform, die hierin manchmal „ In-situ-Enzymtest" genannt wird, werden fluorogene Substrate verwendet, die bei Spaltung präzipitieren. Das heißt, dass bei Exozytose eine beträchtliche Menge an Enzymaktivität Zell-/Granulat-assoziiert bleibt und unter Verwendung fluoreszierender Substrate, die am Ort der Aktivität präzipitieren, sichtbar gemacht werden kann. Zum Beispiel präzipitieren Substrate für Glucuronidase, wie z. B. ELF-97-Glucuronid, an exozytierenden Zellen, nicht jedoch an ruhenden Zellen, und folglich können die Zellen erhöhte Fluoreszenz aufweisen. Die Fluoreszenz ist eine direkte Messung der Exozytose und ist pH-abhängig, was die pH-Optima der exozytierten Enzyme widerspiegelt. Dieses Verfahren stellt auch ein Verfahren der Unterscheidung unterschiedlicher Unterarten von Granulaten auf Basis ihres Enzymprofils bereit.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zellpopulation einem exozytischen Stimulus unterworfen und dann mit einem detektierbaren Substrat inkubiert. Ein bioaktives Kandidat-Mittel wird gegebenenfalls zugesetzt. Die Zellen werden gewaschen und dann im Mikroskop oder Durchflusszytometer betrachtet.
  • Bevorzugte Granulatenzyme umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Chymase, Tryptase, Arylsulfatase A, Beta-Hexosaminidase, Beta-Glucuronidase und Beta-D-Galactosidase. Substrate umfassen ELF-97-Glucuronid, N-Acetyl-Beta-D-Glucuronid, an Peptide gekoppeltes ELF-97 usw., wovon viele im Handel erhältlich sind, d. h. von Molecular Probes, siehe oben, speziell Kapitel 10, insbesondere Abschnitt 2 von Kapitel 10 und zitierte „verwandte Kapitel ".
  • Unter einem detektierbaren Substrat wird verstanden, dass das Substrat ein wie hierin weitergehend beschriebenes fluoreszierendes Molekül umfasst oder mit einem für das Substrat oder gespaltene Substrat spezifischen fluoreszierenden Molekül, wie z. B. einem fluoreszierenden Antikörper, detektiert werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Substrat ein detektierbares Molekül, das aus zwei fluoreszierenden Proteinen, d. h. blauem und grünem fluoreszierenden Protein (BFP und GFP) und anderen ähnlichen Molekülen, gebildet wird. Wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, ermöglichen Konstrukte von GFP und BFG, welche diese beiden Proteine unmittelbar benachbart enthalten, Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET). Das heißt, dass das Anregungsspektrum von GFP das Emissionsspektrum von BFP überlagert. Demgemäß resultiert die Anregung von BFP in GFP-Emission. Wenn eine Protease-Spaltstelle zwischen GFP und BFP eingebaut wird, um ein „FRET-Konstrukt" zu bilden, trennen sich die GFP- und BFP-Moleküle bei Einwirkung einer aktiven Protease, die das Konstrukt spaltet, auf das FRET-Konstrukt. Folglich bewirkt die Anregung von GFP BFP-Emission und Verlust der BFP-Emission.
  • Vorzugsweise ist die zwischen den beiden fluoreszierenden Proteinen insertierte, Protease-abhängige Spaltstelle für ein granulatspezifisches Enzym spezifisch. Folglich kann das FRET-Konstrukt zum Detektieren granulatspezifischer Proteasen, die für die Spaltstelle des FRET-Konstrukts spezifisch sind, verwendet werden. In dieser Ausführungsform umfasst das Protease-Substrat, das mit den Zellen oder mit dem Medium kombiniert wird, das FRET-Konstrukt. Das FRET-System ermöglicht die Detektion des detektierbaren Moleküls in seinem gespaltenen und ungespaltenen Zustand und unterscheidet zwischen den beiden. Das System wird in Xu et al., Nucleic Acid Res. 26(8), 2034 (1998); und Miyawaki et al., Nature 388(6645), 882–887 (1997), weitergehend beschrieben.
  • Die den Zellen oder dem Medium zugesetzte Substratmenge hängt üblicherweise zum Teil von der spezifischen Aktivität des Enzyms und dem Substrat selbst ab, beträgt aber im Allgemeinen ungefähr 250 nM bis ungefähr 1 mM, wobei ungefähr 1 μM bis ungefähr 100 μM bevorzugt und ungefähr 1 μM bis ungefähr 10 μM insbesondere bevorzugt sind. Im Allgemeinen sind Änderungen von zumindest 5% bezüglich der Basislinie bevorzugt, wobei zumindest ungefähr 25% bevorzugt, zumindest ungefähr 100% insbesondere bevorzugt und zumindest ungefähr 1.000% speziell bevorzugt sind. Unter Basislinie wird in diesem Fall das Ausmaß an Substratspaltung vor der Exozytose-Induktion verstanden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden Änderungen der Menge an granulatspezifischen Proteinen bestimmt. Sekretionsgranulate enthalten Proteine, die wegen der speziellen Eigenschaften dieser Proteine spezifisch auf das Granulat-Kompartiment abzielen. Bei exozytischer Exposition werden die granulatspezifischen Proteine an der Oberfläche exponiert und detektiert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden detektierbare granulatspezifische Proteine mit einer Zellpopulation kombiniert und Bedingungen unterworfen, die bekanntermaßen Exozytose induzieren. Gegebenenfalls wird ein bioaktiver Kandidat mit der Zellpopulation und detektierbarem granulatspezifischem Protein kombiniert und das granulatspezifische Protein detektiert. Granulatspezifische Proteine umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, VAMP und Synaptotagmin. Ebenso umfasst in der Definition granulatspezifischer Proteine sind die während der Exozytose freigesetzten Vermittler, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Serotonin, Histamin, Heparin, Hormone usw.
  • Die Quantifizierung der Granulatproteine kann auf mehrere Weisen durchgeführt werden. In einer Ausführungsform werden markierte Antikörper (wie z. B. fluoreszierende Antikörper) gegen granulatspezifische Proteine verwendet. In einer weiteren Ausführungsform werden die Zellen gentechnisch manipuliert, um Fusionsproteine zu enthalten, die ein Granulatprotein und ein detektierbares Molekül enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform wird den Zellen ein detektierbares Molekül zur Detektion zugesetzt. Zum Beispiel können entweder direkt oder indirekt markierte Antikörper verwendet werden. Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet einen ersten markierten Antikörper, wobei fluoreszierende Marken bevorzugt sind. Eine weitere Ausführungsform verwendet einen ersten und zweiten Antikörper, beispielsweise einen markierten Sekundärantikörper. Im Allgemeinen kann diese Ausführungsform ein beliebiges Mittel verwenden, das spezifisch an das Granulatprotein oder eine Verbindung bindet, die entweder direkt oder indirekt markiert werden kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Marken gentechnisch in die Zellen eingeführt. Zum Beispiel werden rekombinante Proteine in die Zellpopulation eingeführt, die Fusionsproteine eines granulatspezifischen Proteins und eines detektierbaren Moleküls sind. Dies wird im Allgemeinen durch Transformieren der Zellen mit einer Fusionsnucleinsäure durchgeführt, die für ein Fusionsprotein kodiert, das ein granulatspezifisches Protein und ein detektierbares Molekül kodiert. Dies wird im Allgemeinen auf fachbekannte Weise durchgeführt und hängt üblicherweise vom Zelltyp ab. Im Allgemeinen sind für Säugetierzellen retrovirale Vektoren und Verfahren bevorzugt.
  • Die Fusionsproteine werden mit fachbekannten Verfahren konstruiert. Zum Beispiel werden die für das granulatspezifische Protein kodierenden Nucleinsäuren mit einer Nucleinsäure ligiert, die für ein detektierbares Molekül kodiert. Unter einem detektierbaren Molekül wird hierin ein Molekül verstanden, das die Unterscheidung einer das detektierbare Molekül umfassenden Zelle oder Verbindung von einer ermöglicht, die dieses nicht enthält, d. h. ein Epitop, manchmal Antigen-Marken genannt, oder ein fluores zierendes Molekül. Bevorzugte fluoreszierende Moleküle umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, GFP, BFP, YFP, Enzyme einschließlich Luciferase und β-Galactosidase. Diese Konstrukte können derart hergestellt werden, dass bei Exozytose ein Epitop im Inneren des Granulats an der Zelloberfläche exponiert wird und dann detektiert werden kann. Das Epitop ist vorzugsweise ein beliebiges detektierbares Peptid, dass sich im Allgemeinen nicht an der Zytoplasmamembran findet, obgleich in einigen Fällen, falls das Epitop eines ist, das normalerweise in Zellen auftritt, Erhöhungen detektiert werden können, obgleich dies im Allgemeinen nicht bevorzugt wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die das Fusionsprotein oder das detektierbare granulatspezifische Protein enthaltende Zellpopulation exozytischen Bedingungen ausgesetzt. Gegebenenfalls wird ein bioaktives Kandidat-Mittel und/oder exozytischen Inhibitor aufgenommen. Vorzugsweise werden die Zellen gewaschen. Die Fluoreszenz wird an den Zellen detektiert. Im Allgemeinen sind Änderungen von zumindest ungefähr 5% bezüglich der Basislinie bevorzugt, wobei zumindest ungefähr 25% bevorzugter, zumindest ungefähr 50% insbesondere bevorzugt und zumindest ungefähr 100% speziell bevorzugt sind. Im Allgemeinen versteht man unter Basislinie in diesem Fall das Ausmaß der Fluoreszenz vor dem exozytischen Stimulus.
  • In der Erfindung hierin wird dieselbe Eigenschaft der Exozytose durch mehrere Parameter beurteilt, was in vermindertem Hintergrund und höherer Spezifität resultiert. Im Gegensatz dazu ist FACS in der Vergangenheit verwendet worden, um zwei verschiedene und nicht zusammenhängende Eigenschaften zur selben Zeit zu beurteilen, was Zellen identifiziert, welche diese beiden Eigenschaften aufweisen, jedoch den Hintergrund für die kombinierten Eigenschaften nicht vermindert. Die vorliegende Erfindung kann jedoch zusätzlich zur Identifizierung von mehreren Exozytose-Eigenschaften mit der Identifizierung anderer Zellparameter wie oben dargelegt kombiniert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden Zellen Bedingungen unterworfen, die normalerweise Exozytose hervorrufen. Pro-exozytische Mittel umfassen Ionomycin, Ca++, Ionophore (Ionomycin, AZ3187), Verbindung 48/80, Substanz P, Komplement C3a/C5a, Trypsin, Tryptase, Insulin, Interleukin-3, spezifisches IgE, Allergen, Anti-IgE- oder Anti-IgG-Rezeptor-Antikörper. Diese werden, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, abhängig von der Verbindung in Konzentrationen bereitgestellt, die im Allgemeinen im Bereich von 1 Pikomolar bis 10 μM liegen. In manchen Fällen kann es wünschenswert sein, die Zellen mit Mitteln zu kombinieren, welche die Exozytose inhibieren. Exozytose-Inhibitoren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Wortmannin und Genestein und anderen, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Verfahren verwendet, um bioaktive Kandidat-Mittel auf die Fähigkeit hin zu screenen, die Exozytose zu modulieren. Die bioaktiven Kandidat-Mittel können mit der Zellpopulation vor, während oder nach der Stimulation der Exozytose, vorzugsweise davor, kombiniert werden. In manchen Fällen kann es wünschenswert sein, die Wirkung des bioaktiven Kandidat-Mittels, hierin auch als „Kandidat-Mittel" bezeichnet, auf Zellen zu bestimmen, in denen die Exozytose nicht induziert ist oder in denen die Exozytose inhibiert ist. Das bioaktive Kandidat-Mittel kann der Zellpopulation exogen zugegeben werden oder kann wie hierin weitergehend beschrieben in die Zellen eingeführt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird wie oben für Zellzyklustests eine Bibliothek verschiedener bioaktiver Kandidat-Mittel verwendet.
  • Wie oben werden die bioaktiven Kandidat-Mittel mit einer Zellen oder Zellpopulation kombiniert oder dieser zugesetzt; wiederum wenden bevorzugte Ausführungsformen wie oben dargelegt Kandidat-Nucleinsäure-Mittel und Fusionspartner und vorzugsweise retrovirale Konstrukte an.
  • Worin die Kandidat-Mittel Nucleinsäuren sind, können fachbekannte Verfahren, wie z. B. Calciumphosphat, Elektroporation und Injektion, verwendet werden, um diese in die Zellen einzuführen. Der exozytische Stimulus wird im Allgemeinen mit den Zellen unter physiologischen Bedingungen kombiniert. Inkubationen können bei jeder Temperatur durchgeführt werden, welche optimale Aktivität ermöglicht, typischerweise zwischen 4 und 40°C. Inkubationszeiten werden für optimale Aktivität gewählt, können jedoch auch optimiert werden, um schnelles High-throughput-screening zu ermöglichen.
  • Wie oben können eine Reihe anderer Reagenzien in die Tests aufgenommen und die Zellen wie oben sortiert werden. Das Sortierungsergebnis resultiert in einer Zellpopulation, welche die gewünschten exozytischen Eigenschaften aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Parameter so festgelegt, um zumindest ein bioaktives Kandidat-Mittel zu identifizieren, das die Exozytose moduliert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird das bioaktive Mittel charakterisiert. Dies geht üblicherweise auf vom Fachkundigen anerkannte Weise vonstatten und umfasst im Allgemeinen eine Analyse von Struktur, Identität, Bindungsaffinität und Funktion des Mittels. Im Allgemeinen wird das bioaktive Mittel, wenn es einmal identifiziert ist, neu synthetisiert und mit der Zielzelle kombiniert, um die Exozytose-Modulation unter verschiedenartigen Bedingungen in An- oder Abwesenheit anderer verschiedenartiger Mittel zu verifizieren. Das bioaktive Mittel kann in einer therapeutisch wirksamen Menge zur Modulation der Exozytose produziert und mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger kombiniert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können die Zellpopulationen verschiedenen experimentellen Bedingungen mit oder ohne Kandidat-Mittel und mit und ohne exozytischer Stimulation oder Inhibierung unterworfen werden. Änderungen der Bedingungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Änderungen von pH, Temperatur, Puffer- oder Salzkonzentration usw. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der pH verändert, im Allgemeinen durch Erhöhen und Senken des pH-Werts, für gewöhnlich um ungefähr 0,5 bis ungefähr 3 pH-Einheiten. Alternativ dazu wird die Temperatur verändert, wobei Erhöhungen oder Verminderungen von ungefähr 5°C bis ungefähr 30°C bevorzugt sind.
  • Gleichermaßen kann die Salzkonzentration modifiziert werden, wobei Erhöhungen oder Verminderungen von ungefähr 0,1 M bis ungefähr 2 M bevorzugt sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der zu modulierende Zellphänotyp die Toxizität gegenüber kleinen Molekülen (oder anderen Kandidat-Mitteln). Diese sind im Allgemeinen die oben für Zelllebensfähigkeitstests dargelegten. Dosisreaktionen kleiner Moleküle können auch durch Vergleichen von Zellen mit der höchsten funktionellen Reaktion und anschließendes Rücksteuern verglichen werden, um festzustellen, ob eine höhere oder niedrigere mit diesen Zellen assoziierte Toxizität vorliegt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Zellphänotyp die Expression oder Aktivität von Zelloberflächenrezeptoren; bis zu sechzehn Zelloberflächenmarker können gleichzeitig verfolgt werden, wobei bis zu acht bevorzugt sind. Die An- oder Abwesenheit irgendeines bestimmten Zelloberflächenmarkers kann mit direkt oder indirekt konjugierten Antikörpern gegen irgendein Zelloberflächenprotein, dessen Zelloberflächenexpression einen wichtigen, mit den untersuchten Zellen im Zusammenhang stehenden funktionellen Parameter widerspiegelt, detektiert werden. Die Wirkung von Kandidat-Mitteln, wie z. B. kleinen Molekülen, kann dann gegen einzelne oder mehrere Marken getestet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Zellphänotyp die Expression oder Aktivität von Enzymen, wie z. B. auf Fluoreszenz basierten Reportersystemen, die ein biologisches Ereignis anzeigen, das simultan mit der primären Messung auftritt oder ein Ergebnis der primären Messung ist. Dieses Reportersystem kann ein Ausgabesignal von Stromauf-Signaltransduktionswegen, die im Zytoplasma aktiv sind, oder von Kern-Transkriptions- oder -Translationsereignissen sein sowie Exportereignisse aus dem Kern oder der Zelle sein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Zellphänotyp Protein-Protein-Wechselwirkungen (oder Wechselwirkungen zwischen anderen Bindungsliganden), wie z. B.
  • Dimerisierung, die von einem Kandidat-Mittel entweder gestört oder initiiert werden (können. Diese Ereignisse können durch das Auftreten oder Verschwinden von FRET zwischen zwei markierten Bindungsliganden gemessen werden.
  • Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Art und Weise der Anwendung der oben beschriebenen Erfindung ausführlicher zu beschreiben sowie der Darlegung der am besten geeigneten Art und Weisen, die zur Ausführung verschiedenartiger Aspekte der Erfindung vorgesehen sind. Es versteht sich, dass diese Bespiele in keiner Weise dazu dienen, den wahren Schutzumfang dieser Erfindung einzuschränken, sondern zum Zwecke der Illustration dargelegt werden.
  • Beispiel 1
  • Zellzyklustests unter Verwendung von p21 als positive Kontrolle
  • Materialien und Verfahren
  • Vektorkonstruktion:
  • Die kodierende Region des p21-Gens wurde aus Jurkat-cDNA mittels PCR mit einem Stromauf-Primen kloniert, der das Start-Methionin (5'-GATCGGATCCACC ACCATGGGCTCAGAACCGGCTGTGGATGTC) und den C-Terminus
    Figure 00700001
    umfasst. Das einzelne PCR-Produkt wurde gerichtet in den Retrovirus-Vektor CRU5-GFP (Rigel Inc.) über flankierende BstXI-Stellen innerhalb des Primers kloniert. Das resultierende Konstrukt, CRU5-GFP-p21F (1), kodiert für das an das Human-p21-Protein fusionierte (im Leseraster) GFP mit einer Gly-Insertion an Position 2 und einem FLAG-Epitop am C-Terminus. Die C-terminalen 24 Aminosäuren von p21 wurden in den Retrovi rus-Vektor CRU5-GFP (Riegel Inc.) über flankierende BstXI-Stellen innerhalb des PCRPrimers kloniert:
  • Figure 00710001
  • Des resultierende Konstrukt, CRU5-GFPp21C (1), kodiert für GFP, das im Leseraster mit KRRQTSMTDFYHSRRLIFSKRKP und einem FLAG-Epitop am C-Terminus fusioniert wurde. Die C-terminalen 24 Aminosäuren von p21 mit drei Alanin-Mutationen wurden in den Retrovirus-Vektor CRU5-GFP (Rigel Inc.) über flankierende BstXI-Stellen innerhalb des PCT-Primers kloniert:
  • Figure 00710002
  • Das resultierende Konstrukt, CRU5-GFPp21Cmut (1), kodiert für GFP, das im Leseraster mit KRRQTSATAAYHSRRLIFSKRKP (Mutationen sind unterstrichen) und einem FLAG-Epitop am C-Terminus fusioniert wurde.
  • Retrovirale Transduktion:
  • Phoenix-E-Zellen wurden in 6-Napf-Platten mit 106 Zellen in 1,5 ml Komplett-DMEM (DMEM + 10% FBS + Pen/Strep) ausplattiert und bei 37°C für 16 Stunden inkubiert. CaCl2-Präzipitationstransfektion (2 μl DNA (1μg/μl), 30,5 μl 2 M CaCl2, 217,5 μl H2O, 0,5 ml 2X HBS) wurde mit dem CRU5-IRES-GFP-Vektor oder CRU5-p21F-IRES-GFP-Klon in Gegenwart von 50 μM Chloroquin für 8 Stunden bei 37°C durchgeführt. Das Transfektionsmedium wurde entfernt und durch 2 ml Komplett-DMEM ersetzt und die Zellen für weitere 16 Stunden bei 37°C inkubiert. Das Medium wurde auf 1,5 ml Komplett-RMPI (RMPI + 10% FBS + Pen/Strep) umgestellt und bei 32°C für 48 Stunden inkubiert. Der Virus-Überstand aus transfizierten Platten wurde filtriert (0,45 um) und auf eine 6-Napf-Platte übertragen. Ein 100 μl-Aliquot (5 × 106 Zellen) von Jurkat-T-Zellen, die den ecotrophen Rezeptor (JurkatE) exprimierten, wurde jedem Napf zugegeben. Es wur de Polybrene in eine Endkonzentration von 5 μg/ml zugegeben. Die Platten wurden mit Parafilm versiegelt und bei 32°C für 90 Minuten bei 2.500 U/min zentrifugiert. Der Parafilm wurde entfernt und die Platte über Nacht bei 37°C inkubiert. Das Medium wurde nach 16 Stunden gegen 4 ml Komplett-RMPI ausgetauscht und bei 37°C für 72 Stunden inkubiert.
  • Zellzyklus-FACS-Test:
  • Die mit Retrovirusvektor transduzierten Zellen wurden pelletiert und mit 106 Zellen/ml in Komplett-RMPI resuspendiert. Ein Volumsanteil (1 ml) 4 μM PKH26-Zelltracking-Farbstoff (Sigma) wurde den Zellen zugegeben und bei 25°C für 5 Minuten inkubiert. Die Suspension wurde 5fach verdünnt und die Zellen bei 400 × g für 10 Minuten bei 25°C pelletiert. Die Zellen wurden zweimal mit 6 m) Komplett-RMPI weiter gewaschen und bei 3 × 105 Zellen/ml in einer 6-Napf-Platte für 72 Stunden inkubiert. Die markierten Zellen wurden pelletiert und mit 106 Zellen/ml in 5 μg/ml Hoechst 33342 (Molecular Probes) enthaltendem Komplett-RMPI resuspendiert und bei 37°C für 2 Stunden inkubiert. Die gefärbten Zellen wurden pelletiert und mit > 106 Zellen/ml in FACS-Puffer (PBS/0,5% FCS/5μg/ml Hoechst 33342) resuspendiert. Die Zellen wurden durchflusszytometrischer Analyse an einem mit drei Lasern ausgestatteten MoFlo-Zytometer (Cytomation) analysiert. Vorwärts- und Seitwärtsstreuung wurden mit einem Argonlaser mit 488-nm-Linie ausgelöst und gestreutes Licht mit einem Vorwärtsstreuungsdetektor und 488-nm-Bandpassfilter gesammelt. GFP wurde mit einem Argonlaser mit 488-nm-Linie angeregt und emittiertes Licht durch ein 530-nm-Bandfilter gesammelt. PKH26-Zelltracking-Farbstoff wurde mit einem HeNe-Laser mit 533-nm-Linie angeregt und emittiertes Licht durch ein 570-nm-Bandpassfilter gesammelt. Hoechst-33342-Farbstoff wurde mit einem UV-Laser angeregt und emittiertes Licht durch ein 450-nm-Bandpassfilter gesammelt.
  • Ergebnisse:
  • Jurkat-T-Zellen wurden mit Retrovirusvektoren transduziert, die für Human-p21 (Gp21) oder die PCNA-bindenden C-terminalen 24 Aminosäuren (Gp21C), fusioniert an GFP, kodieren (1). Eine nicht-PCNA-bindende Mutantenversion der C-terminalen 24 Aminosäuren von p21 (Gp21 Cmut, Cayrol et al., Oncogene 16, 311 (1998)) diente als negative Kontrolle. Die Expression des transduzierten p21 konnte vom endogenen Protein durch das FLAG-Epitop mittels Western-Blotting unterschieden werden (nicht gezeigt). Die Expression der Fusionsproteine wurde in der FACS durch GFP-Fluoreszenz angezeigt (2B). Transduzierte Zellen wurden mit einer Trackingverbindung, pkh26, die rot fluoreszierende aliphatische Moleküle in die Zellmembran durch selektive Verteilung einbaut, pulsmarkiert, was eine Korrelation zwischen Zellzyklus und Fluoreszenzintensität erlaubt; arretierte Zellen bleiben hinsichtlich Zelltrackerfarbstoff hell; Zellzyklus durchlaufende Zellen verdünnen das Signal und verdunkeln sich. Wie in 2C gezeigt, zeigten lebende GFP-p21-exprimierende, auf GFP beschränkte Zellen eine höhere Rotfluoreszenz als Vektor-transduzierte Zellen, die identische GFP-Level exprimierten, was auf Zellzyklus-Arretierungen hinweist. Eine ähnliche Wirkung wurde in den Gp21C exprimierenden Zellen beobachtet, jedoch war Gp21-Cmut mit nicht exprimierenden Zellen identisch. Der DNA-Gehalt derselben GFP-beschränkten Zellen ist in 2D gezeigt. Gp21 exprimierende Zellen zeigen G1- und G2-Kontrollpunkt-Akkumulierung im Einklang mit früheren Ergebnissen (Wade Harper et al. (1993); Cayrol et al. (1998)). Die Gp21 Cmut exprimierenden Zellen zeigen eine normale Zellzyklus-Verteilung. Lebensfähige, arretierte exprimierende Zellen (den drei anfänglichen Parametern genügend) wurden auf Basis von DNA-Gehalt in getrennte Kammern sortiert: Linke Ablenkung, G1; rechte Ablenkung, G2.
  • Beispiel 2
  • Auf Population basierende exozytische Enzymaktivitätsmessungen
  • Materialien:
  • Alle Chemikalien wurden von Sigma Chemical Co. erhalten. Farbstoffe und Glucuronid wurden von Molecular Probes Inc. erhalten. Zelllinien MC-9 und RBL-2H3 wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) erhalten. Zellkulturreagenzien wurden von Fisher Scientific und Molekularbiologiereagenzien von Clonetech Inc. erhalten.
  • Zellkultur:
  • MC-9-Zellen wurden aus Suspensionskulturen in Kolben in Medien gehalten, die aus DMEM mit L-Arginin (116 mg/ml), L-Asparagin (36 mg/ml), Natriumpyruvat (1 mM), nicht essentiellen Aminosäuren (0,1 mM), Folsäure (6 mg/ml), 2-Mercaptoethanol (0,05 mM), L-Glutamin (2 mM), hitzeinaktiviertes Fötalkälberserum (10%) und 10% T-stimkonditioniertes Medium (Collaborative Research Inc.) bestanden. Die Zellen wurden bei einer Dichte zwischen 0,25 und 2 × 106/ml gehalten. Experimente wurden ausschließlich an Zellen durchgeführt, die eine durch Trypan-Ausschluss ermittelte Lebensfähigkeit von mehr als 95% aufwiesen. RBL-2H3-Zellen wurden als Adhäsionskulturen an unbeschichteten (Gewebekultur-behandelten) Kolben in Medium bestehend aus Eagles MEM mit 2 mM L-Glutamin und Earl's BSS, 15% hitzeinaktiviertem Fötalrinderserum gehalten. Die Zellen wurden passieren gelassen (0,05% Trypsin), so dass sie für mehr als einen Tag nicht konfluent waren.
  • Exozytose-Stimulationsprotokoll:
  • Experimente wurden in einem modifizierten Tryodes-Puffer (MT) durchgeführt, der aus NaCl (137 mM), KCl (2,7 mM), CaCl2 (1,8 mM), MgCl2 (1 mM), Glucose (5,6 mM), Hepes (20 mM, pH 7,4) und Rinderserumalbumin (0,1%) bestand. MC-9-Zellen wurden bei 400 × g zentrifugiert und das Medium abgesaugt. Die Zellen wurden dann mit MT gewaschen, nochmals zentrifugiert/abgesaugt und in MT in einer Dichte von 5 × 106 Zellen/ml aufgenommen. Die Zellen wurden dann entweder mit DMSO oder Ionophor für 30 Minuten behandelt (oder es wurde die Zeit im Falle eines Zeitverlaufs variiert). Die Zellen wurden dann pelletiert, wobei der Überstand für enzymatische Analyse gesammelt wurde; in manchen Fällen wurden die Zellen dann für die Durchflusszytometrie verarbeitet. Alle Stimulationen wurden bei 37°C durchgeführt. Stimulationen von RBL-2N3-Zellen wurden durch einmaliges Waschen der anhaftenden Zellen in MT und anschließendes Zugeben von den Stimulus enthaltendem, erwärmtem MT (1 ml/106 Zel len) durchgeführt. Die Zellen wurden bei 37°C für 30 Minuten inkubiert und der Überstand für weitere Analyse geerntet. In einigen Beispielen (Beispiele 4–6) wurden die an den Platten gebundenen Zellen auf Annexin gefärbt und dann mittels No-Zyme (Collaborative Research Inc.) für weitere Verarbeitung für die Durchflusszytometrie aus dem Kolben entfernt. Zur Stimulation von RBL-2H3-Zellen mit Antigen-Vernetzung wurden die Zellen über Nacht mit IgE-Anti-DNP (Sigma Chemical Co.) in Komplett-Medium in einer Konzentration von 50 ng/ml inkubiert. Am folgenden Tag wurden sie einmal in MT gewaschen und wie oben beschrieben stimuliert mit der Ausnahme, das an DNP gekoppeltes Rinderserumalbumin als Stimulus mit 100 ng/ml verwendet wurde.
  • Auf Population basierende Enzymtests:
  • Enzymtests wurden an Zellüberständen und Pellets im Anschluss an exozytische Stimulation durchgeführt. Zellüberstände wurden nach der Stimulation geerntet, auf Eis gekühlt und der Überstand nach Zentrifugation bei 5.000 × g für die Enzymaktivitätsanalyse gesammelt. Gleichermaßen wurden Zellpellets in 0,1% Triton X-100 enthaltendem MT gesammelt/lysiert und der Überstand nach Zentrifugation bei 5.000 × g für die Enzymaktivitätsanalyse gesammelt. Für jede Analyse wurden 100 μl Lysat oder Überstand mit 100 μl Reaktionspuffer (40 mM Citrat, pH 4,5), der 2 mM Substrat (4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronid (Glucuronidase-Substrat) oder 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid (Hexosaminidase-Substrat)) enthielt, in einer festen schwarzen 96-Napf-Platte (Costar Inc.) gemischt und bei 37°C für 15 Minuten inkubiert. Die Platte wurde an einem Fluoreszenzplattenlesegerät (Wallac Inc.) unter Verwendung von 380-nm-/440-nm-Anregungs- bzw. -Emissionsfiltern alle 3 Minuten fünf Mal gemessen, um eine Enzymrate zu erhalten; Analysen wurden dreifach durchgeführt.
  • Durchflusszytometrie:
  • Für Stimulation und Färbung verarbeitete Zellen wurden in MT auf Eis aufgenommen und vor der Zytometrie durch ein 100-μm-Filter filtriert. Die Zellen wurden unter Verwendung eines FACSCAN- (Becton Dickinson Inc., Laserlinie 458 nm) oder Mo-Flo- (Cytomation Inc., Laserlinien 350 nm Breitband (UV), 488 nm und 647 nm) Zytometers analysiert. Die Zellen wurden sortiert, falls gewünscht mittels Mo-Flo.
  • Ergebnisse:
  • Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt. Enzymaktivität im Zellüberstand wurde für MC9-(A) und RBL-2H3- (B) Zellen unter verschiedenartigen Bedingungen gemessen. A) MC-9-Zellen wurden in Gegenwart von DMSO (–) oder 2 um Ionomycin (+) für 30 Minuten stimuliert. Der Überstand wurde gesammelt und auf Glucuronidase- oder Hexosaminidase-Aktivität analysiert. Die stimulierte Freisetzung von Granulat-Enzymaktivität ist offensichtlich. B) RBL-2H3-Zellen wurden für 16 Stunden mit variierenden Mengen IgE-Anti-DNP sensibilisiert und durch Einwirkenlassen ansteigender Mengen des Antigens BSA-DNP zur Exozytose stimuliert. Eine Dosisreaktion von Antikörper sowie Antigen ist in der gemessenen Hexosaminidase-Aktivität im Überstand offensichtlich.
  • Beispiel 3: Änderungen der Exozytose-Lichtstreuung von Mastzellen
  • Die Zellen wurden wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt und die Lichtstreuungseigenschaften gemessen.
  • Ergebnisse: Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt. Änderungen der am Durchflusszytometer beobachteten Lichtstreuung (Seitwärtsstreuung gegenüber Vorwärtsstreuung) sind als zweidimensionale Histogramme für RBL-2H3-Zellen (A, D) und MC-9-Zellen (B, C, E, F) aufgetragen. Die Zellen wurden mit dem Ionophor A23187 (0,5 μg/ml) stimuliert und zu verschiedenen Zeitpunkten (0 Minuten (A, C), 5 Minuten (E), 10 Minuten (D) und 30 Minuten (B, F)) beobachtet. Zeitabhängige Änderungen der Streuung waren in beiden Zelllinien offensichtlich, wobei signifikante Änderungen während der ersten 10 Minuten auftreten, die den Haupt-Bolus der Exozytose in diesen Zellen darstellen.
  • Beispiel 4: Styrylfarbstoffe detektieren Mastzellen-Exozytose mittels FACS
  • Styrylfarbstoff-Färbung:
  • Die Zellen wurden wie oben beschrieben hergestellt. Styrylfarbstoffe (FM1-43 oder FM4-64; Molecular Probes Inc.) wurden auf eine Endkonzentration von 250 nM in MT verdünnt und wurden in den Stimulationspuffer aufgenommen (siehe Beispiel 2). Nach dem Stimulationsprotokoll wurden die Zellen zentrifugiert, abgesaugt und in frischem, eiskaltem MT resuspendiert. Die Zellen waren dann für die Analyse im Durchflusszytometer bereit (siehe Beispiel 2).
  • Ergebnisse:
  • Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt. MC-9-Zellen wurden in Gegenwart von FM 4-64 (A, B) oder FM 1-43 (C, D, E) stimuliert (blau = DMSO, rot = 2 μM Ionomycin). A) FM-4-64-markierte Zellen, detektiert im Durchflusszytometer im Fluoreszenzkanal 1. B) FM-4-64-markierte Zellen, detektiert im Durchflusszytometer im Fluoreszenzkanal 3. C) FM-1-43-markierte Zellen, detektiert im Durchflusszytometer im Fluoreszenzkanal 1. D) FM-1-43-markierte Zellen, detektiert im Durchflusszytometer im Fluoreszenzkanal 3. Es besteht eine eindeutige stimulationsabhängige Erhöhung der Fluoreszenzintensität mit beiden Farbstoffen; FM 4-64 ist am stärksten nach Rot verschoben und wird vorwiegend im Kanal 3 detektiert, während FM 1-43 breiter fluoresziert und in beiden Kanälen 1 und 3 detektiert wird. E) MC-9-Zellen wurden mit variierenden Dosen des PI-3-Kinaseinhibitors Wortmannin (1 μM-Balken 1, 100-nM-Balken 2, 10-nM-Balken 3 und 0-nM-Balken 1 und 2) vor der Stimulation mit A23187 (0,5 μg/ml, Balken 1-4) oder DMSO (Balken 5) in Gegenwart von FM 1-43 vorinkubiert. Die im Durchflusszytometer im Fluoreszenzkanal 1 detektierte mittlere Kanalverschiebung ist als Balkengrafik aufgetragen. Wortmannin, ein bekannter Inhibitor der Mastzellen-Exozytose, bewirkt eine dosisabhängige Abnahme des FM-1-43-Signals, was anzeigt, dass das FM-1-43-Signal das Ausmaß der Degranulierung in der MC 9-Mastzelllinie widerspiegelt.
  • Beispiel 5: Annexin-V-Färbung detektiert Mastzellen-Exozytose mittels FACS
  • Materialien:
  • Annexin-V-Biotin, Annexin-V-FITC und Streptavidin APC wurden von Caltag Laboratories erhalten. Andere hierin verwendete Materialien und Verfahren können aus den anderen Beispielen, insbesondere Beispiel 2, übernommen werden.
  • Annexin-V-Färbung:
  • Zellen wurden nach exozytischem Stimulus mit Annexin-PITC in einer Verdünnung von 1/100 in MT für 10 Minuten bei Raumtemperatur gefärbt. Die Zellen wurden dann ein Mal in MT gewaschen, in MT aufgenommen und im Durchflusszytometer oder Mikroskop betrachtet. Für die indirekte Markierung wurde Annexin-Biotin dem MT während der Stimulationsprozedur in einer Verdünnung von 1/200 zugesetzt. Die Zellen wurden dann in eiskaltem MT pelletiert, zentrifugiert, abgesaugt und in eiskaltem MT mit Streptavidin-APC in einer Verdünnung von 1/200 aufgenommen und für 15 Minuten auf Eis gehalten. Nach dem Pelletieren der Zellen und Absaugen des Streptavidin-APC wurden die Zellen in MT resuspendiert und im Durchflusszytometer betrachtet. In einigen Experimenten wurden andere Sekundärmarken, wie z. B. Streptavidin Alexa 488 oder 594 (Molecular Probes Inc.) zur Sichtbarmachung im Mikroskop angewendet.
  • Ergebnisse:
  • Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt. MC-9-Zellen wurden entweder mit DMSO (A und B) oder 2 μM Ionomycin (C und D) stimuliert und dann mit Propidiumiodid [PI] (A und C) und Annexin-V-FITC (B und D) gefärbt. Die Stimulation mit dieser Dosis Ionomycin beeinträchtigt die Plasmamembran nicht, wie aufgrund fehlender signifikanter Erhöhung der PI-Färbung in exozytierenden Zellen nachgewiesen wurde. Degranulierung resultiert in einem signifikanten Anstieg der Annexin-Bindung, wie durch Vergleich der D und B zu erkennen ist.
  • Beispiel 6: Annexin-V-FITC färbt exozytische Granulate in MC-9-Zellen, sichtbar gemacht mittels Konfokalmikroskopie.
  • Mikroskopie:
  • Zellen wurden nach Stimulierung oder Färbung auf Glasobjektträgern montiert und mit Deckgläsern bedeckt; diese wurden direkt mittels Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie an einem umgekehrten Mikroskop (TE300, Nikon) unter Verwendung von BFP-, FITC- oder TRITC-Standardfiltersets sichtbar gemacht. Einige der Bilder wurden unter Verwendung eines umgekehrten konfokalen Rastermikroskops (Zeiss Inc., Bio-Rad Inc.) unter Verwendung von FITC- und TRITC-Standardfiltersets erhalten.
  • Ergebnisse:
  • MC-9-Zellen wurden mit 2 μM Ionomycin oder DMSO stimuliert und mit Annexin-V-FITC gefärbt und für die Konfokalmikroskopie montiert (Daten nicht gezeigt). Alle lebensfähigen, nicht stimulierten Zellen zeigen geringere Annexin-Bindung und keine Zelloberflächengranulatfärbung.
  • Beispiel 7: Annexin-V-FITC färbt exozytische Granulate in mit Antigen-Vernetzung stimulierten RBL-2H3-Zellen
  • Wenn unten nicht anders angegeben, sind die Verfahren für dieses Beispiel in den vorangehenden Beispielen beschrieben.
  • Ergebnisse:
  • RBL-2H3-Zellen wurden mit IgE sensibilisiert und zur Exozytose entweder nur mit MT-Puffer oder mit BSA-DNP-Antigen (100 ng/ml) stimuliert und dann mit Annexin-V-FITC gefärbt. Zahlreiche Zelloberflächengranulate werden in den antigenstimulierten Zellen mit einem ähnlichen Muster gefärbt, wie es in MC-9-Zellen zu sehen ist. Lebensfähige, nicht stimulierte Zellen zeigen vernachlässigbare Annexin-V-Färbung (Daten nicht gezeigt).
  • Beispiel 8: In-situ-Enzymology exozytierender Zellen, sichtbar gemacht im FACS
  • In-situ-Enzymologie:
  • MC-9-Zellen wurden wie oben beschrieben für Exozytose stimuliert und dann in Enzymsubstratpuffer (BSA-freies MT, pH-Bereich 4,3–7,4), der das Substrat ELF-97-Glucuronid (250 μM) enthielt, für 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden ein Mal in MT gewaschen und dann im Mikroskop oder Durchflusszytometer betrachtet. Weitere Verfahrensweisen sind in den vorangehenden Beispielen beschrieben.
  • Ergebnisse:
  • Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt. MC-9-Zellen wurden mit DMSO (A) oder A23187 (0,5 μg/ml – B und C stimuliert und dann auf In-situ-Glucuronidaseaktivität gefärbt. A) Durchflusszytometer-Histogramm der ELF-97-Detektion, welches das enzymatische Zelloberflächenpräzipitat anzeigt. Ein sehr schwaches Signal ist in den DMSO-behandelten Zellen zu sehen. B) Durchflusszytometer-Histogramm der ELF-97-Detektion, welches das enzymatische Zelloberflächenpräzipitat anzeigt. Ein signifikanter Anstieg des Signals ist bei Sekretionsstimulation mit Ionophor zu sehen. C) pH-Profil der Zelloberflächen-Enzymaktivität. MT-Puffer, hergestellt mit verschiedenen pH-Werten, wurde verwendet, um das pH-Profil des im Durchflusszytometer beobachteten Signals zu erstellen. Die Balkengrafiken stellen den prozentuellen Anteil des beobachteten Maximalsignals dar (gemessen durch mittlere Kanalverschiebung im Durchflusszytometer). Die Enzymaktivität ist pH-abhängig mit einem Maximum bei weniger als pH 6; dies steht mit der aus einem sauren Sekretionsgranulat hergeleiteten Enzymaktivität im Einklang.
  • Beispiel 9: Lysotracker-Grün wird aus Mastzellengranulaten bei Exozytose freigesetzt und kann mittels FACS detektiert werden.
  • Lysotracker-Farbstoff-Färbung:
  • Zellen wurden mit Lysotracker-Farbstoffen (blau, grün und rot) beladen, indem sie auf eine Endkonzentration von 1 μM in Komplett-Medium verdünnt und die Zellen für 60 Minuten bei 37°C in ihrer Gegenwart inkubiert wurden. Nach der Beladung wurden die Zellen zwei Mal in MT gewaschen und waren dann für die weitere Analyse oder Stimu lation bereit. Weitere Verfahrensweisen sind in den vorangehenden Beispielen beschrieben.
  • Ergebnisse:
  • Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt. MC-9-Zellen wurden mit Lysotracker-Grün für 1 Stunde beladen und dann entweder mit DMSO oder Ionomycin (2 μM) stimuliert und im Durchflusszytometer betrachtet. Gezeigt ist ein Histogramm der in Kanal 1 detektierten Fluoreszenzintensität; ein signifikanter Signalverlust ist in der Ionophor-stimulierten Probe im Vergleich zur DMSO-Kontrolle zu sehen, was die Freisetzung von Lysotracker-Grün aus den Sekretionsgranulaten widerspiegelt.
  • Beispiel 10: Multiparameteranalyse – Lysotracker-Grün, Annexin-V-APC, Vorwärts- und Seitwärtsstreuung
  • Wenn unten nicht anders angegeben, wurden die in den vorangehenden Beispielen beschriebenen Verfahrensweisen angewendet.
  • Ergebnisse: Die Ergebnisse sind in 10 gezeigt. MC-9-Zellen wurden mit verschiedenen Dosen Ionomycin (0 μM – A, E; 1 μM – B, F; 2 μM – C, G; und 3 μM – D, H) behandelt und im Durchflusszytometer mit vier Parametern gleichzeitig beobachtet. Die Zellen wurden mit Lysotracker-Grün für eine Stunde beladen und dann stimuliert und auf Annexin-VAPC gefärbt. A–D: Zweidimensionale Histogramme von Seitwärts- über Vorwärtsstreuung. Man beachte die dosisabhängigen Änderungen beider Parameter von links nach rechts, während die Vorwärtsstreuung ansteigt und die Seitwärtsstreuung abnimmt. E–H: Zweidimensionale Histogramme von Annexin-V-APC- über Lysotracker-Grün-Signalen. So wie die Exozytose ansteigt (links nach rechts), wird das Annexin-Signal stärker, so wie das Lysotracker-Signal abnimmt. Dies reflektiert die Bindung von Annexin an die Zelloberflächengranulate und den Verlust von Lysotracker aus diesen Granulaten, wenn sie dem extrazellulären Milieu ausgesetzt werden.
  • Beispiel 11: Multiparameteranalyse – FM 1-43, Annexin-V-APC, Vorwärts- und Seitwärtsstreuung
  • Wenn unten nicht anders angegeben, wurden hierin die oben beschriebenen Verfahrensweisen angewendet.
  • Ergebnisse:
  • MC-9-Zellen wurden entweder mit DMSO oder Ionomycin (2 μM) behandelt und im Durchflusszytometer mit vier Parametern gleichzeitig beobachtet. Die Zellen wurden in Gegenwart von FM 1-43 stimuliert und auf Annexin-V-APC gefärbt (Ergebnisse nicht gezeigt). Es wurden stimulationsabhängige Änderungen beider Parameter zum Zeitpunkt 30 Minuten beobachtet. Es wurden stimulationsabhängige Erhöhungen beider Signale beobachtet. Die Änderungen reflektieren die Bindung von Annexin-V an die Zelloberflächengranulate und die gleichzeitig gekoppelte Endozytose des FM 1-43-Farbstoffs in die MC-9-Zellen.
  • Beispiel 12: Gleichzeitige Multiparametermessungen im FACS korrelieren mit den auf Population basierenden Enzym-Ausgabewerten.
  • Calciumsignalisierungstests:
  • MC-9- oder RBL-2H3-Zellen wurden ein Mal in MT gewaschen und mit der Ca++-sensitiven Sonde Fluo-3 (1 μM, Molecular Probes Inc.) in MT bei 37°C für 20 Minuten beladen. Die Zellen wurden ein Mal in warmem MT gewaschen und dann unter Anwendung des oben beschriebenen Protokolls stimuliert. Das Signal aufgrund des Anstiegs der intrazellulären Ca++-Konzentration wurde entweder unter Verwendung des Durchflusszytometers oder mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht oder an einem Fluoreszenzplattenlesegerät (Wallac Inc.) ausgelesen. Die Beladung der Zellen wurde durch Freisetzung des intrazellulären Farbstoffs mit 0,1% Triton X-100 enthaltendem MT bestimmt.
  • Wenn unten nicht anders angegeben, wurden hierin die oben beschriebenen Verfahrensweisen angewendet.
  • Ergebnisse:
  • Die Ergebnisse sind in 11 gezeigt. MC-9-Zellen wurden in Gegenwart von FM 1-43 und Annexin-V-APC wie in den Verfahren oben beschrieben gefärbt. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach Ionomycin-Stimulation wurden die Zellen auf Eis gegeben und entweder mittels Durchflusszytometrie oder auf Enzymaktivität (Zellüberstand) analysiert. Die Parameter Vorwärtsstreuung, FM 1-43, Annexin-V-APC und Hexosaminidase sind auf der Grafik relativ zur Maximalreaktion für jeden Parameter aufgetragen. Für die Calciumsignalisierung wurde ein gesondertes Röhrchen von Zellen mit Fluo-3 beladen und derselben Prozedur unterzogen. Die Zeitverläufe der auf Zytometrie basierenden Parameter zeigen an, dass sie recht gut mit der durch Hexosaminidase-Freisetzung gemessenen Exozytose korrelieren. Die Vorwärtsstreuung zeigt in diesem Beispiel eine Wirkung, die sowohl positiv, als auch negativ mit der Zeit variiert.
  • Beispiel 13: Expression von VAMP-GFP- und VAMP-FRET-Konstrukten
  • cDNA-Konstrukte:
  • VAMP-GFP-Konstrukt:
  • Die Ratten-VAMP-2-cDNA (erhalten von R. Schellet, Stanford University) wurde mittels PCR modifiziert, um folgendes zu enthalten: (1) eine 5'-BstXI-Stelle, die für eine Konsensus-Kozak- und Glycin-Insertion kodiert (a.a.2), um Expression bzw. In-vivo-Stabilität zu ermöglichen; (2) einen Serin-Glycin-Linker mit einer BamHI-Stelle am 3'-Ende. Die GFP-kodierende Sequenz aus CdimGFP (Clontech Inc.) wurde mittels PCR modifiziert, um eine für ein Stopcodon kodierende 3'-BstXI-Stelle einzuführen. Die VAMP-GFP-Fusion wurde durch Ligieren der modifizierten rVAMP- und GFP-PCR-Fragmente über eine gemeinsam BamHI-Stelle im Serin-Glycin-Linker konstruiert, um ein im Leseraster befindliches Fusionsprotein mit der folgenden Sequenz zu erzeugen:
    Figure 00840001
  • Die VAMP-Sequenz ist unterstrichen, der Serin-Glycin-Linker ist kursiv und die GFP-Sequenz in normaler Schrift dargestellt.
  • Die VAMP-GFP-Fusionssequenz wurde in den 96.7-Retrovirusvektor mit gerichteten BstXI-Stellen kloniert, um pVG zu erzeugen. Die Sequenz wurde durch Sequenzieren in beide Richtungen überprüft. Korrekte Expression wurde in transfizierten und infizierten Zellen mittels Western-Analyse und Fluoreszenzmikroskopie verifiziert.
  • Trp-FRET-Konstrukt:
  • Die GFP-kodierende Sequenz aus cGFP (Clontech Inc.) wurde mittels PCR modifiziert, um Folgendes zu erzeugen: (1) eine 5'-BstXI-Stelle, die für eine Konsensus-Kozak- und Glycin-Insertion kodiert (a.a.2), um Expression bzw. In-vivo-Stabilität zu ermöglichen; (2) eine 3'-Ende-SacII-Stelle, die für Ala228 am C-Terminus kodiert. Die BFP-kodierende Sequenz aus cBFP (Clontech Inc.) wurde mittels PCR modifiziert, um Folgendes zu konstruieren: (1) eine für Ser 2 kodierende 5'-BamHI-Stelle; (2) ein für ein Stopcodon kodierendes 3'-Ende-BstXI. Ein SacII-BamHI-Umwandlungslinker, der für Faktor X und Tryptase-Protease-Spaltstellen kodiert, flankiert von GSGS-Spacern (GSGSIEGRLRKQGSCS), wurde verwendet, um GFP und BFP zu fusionieren, um ein im Leseraster befindliches Fusionsprotein mit der folgenden Sequenz zu erzeugen:
  • Figure 00840002
  • Die GFP-Sequenz ist unterstrichen, der Faktor X/Tryptase-Stellen-Linker ist kursiv und die BEP-Sequenz in normaler Schrift dargestellt.
  • Die VAMP-GFP-Fusionssequenz wurde in die BamHI- und BstXI-Stellen des Retrovirusvektors 96.7 kloniert, um pGX/TB zu erzeugen. Die Sequenz wurde durch Sequenzierung in beide Richtungen verifiziert. Korrekte Expression wurde in transfizierten und infizierten Zellen mittels Western-Analyse und Fluoreszenzmikroskopie verifiziert.
  • Die für VAMP-GFP kodierende Sequenz wurde mittels PCR modifiziert, um eine für Ala228 am C-Terminus kodierende 3'-Ende-SacII-Stelle zu erzeugen. Dieses Fragment wurde mit Xhol und SacII gespalten und in die XhoI/SacII-Stellen von pGX/TB kloniert, um pVGX/TB (Trp-FRET) zu erzeugen, das für das rVAMP-2-BFP-Faktor-X/Tryptase-Stellen-GFP-Fusionsprotein mit der folgenden Sequenz kodiert:
  • Figure 00850001
  • Die VAMP-Sequenz ist unterstrichen, der Serin-Glycin-Linker ist kursiv, die FaktorX/Tryptase-Stellen-Linker ist fett und die GFP- und BFP-Sequenzen sind in normaler Schrift dargestellt.
  • Die rVAMP-2-BFP-Faktor-X/Tryptase-Stellen-GFP-Fusionssequenz wurde durch Sequenzierung in beide Richtungen verifiziert. Korrekte Expression wurde in transfizierten und infizierten Zellen mittels Western-Analyse, Fluoreszenzmikroskopie und FACS-Analyse verifiziert.
  • Transfektionen und Infektionen:
  • Um MC-9- und RBL-2H3-Zellen mit rekombinanten, die Vamp-Konstrukte exprimierenden Retroviren zu infizieren, wurde das folgende Verfahren durchgeführt. Phoenix-E- oder -A-Zellen (erhalten von G. Nolan, Stanford Univ.) wurden in 6-Napf-Platten zu 8 × 105 Zellen in 1,5 ml Medium (DMEM, 10% FBS) am Tag Eins ausplattiert. Am Tag Zwei wurden 5 μg DNA mittels CaPO4-Präzipitationsverfahren in Gegenwart von 50 μM Chloroquin in die Zellen transfiziert. Das Präzipitat wurde mit den Zellen für 8 Stunden bei 37°C inkubiert, worauf das Medium entfernt, ein Mal mit frischem Medium gewaschen und das Medium durch frische MC-9- oder RBL-2H3-Medien ersetzt wurde; die Zellen wurden dann bei 32°C für 48–72 Stunden inkubiert. Der Überstand aus den Phoenix-Zellen (Virus-Überstände) wurde bei 1.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert, und es wurde Protaminsulfat auf eine Endkonzentration von 5 μg/ml zugesetzt; dieser Überstand wurde den (frisch trypsinisierten) MC-9- oder RBL-2HS-Zellen in einer 6-Napf-Platte (5 × 105 Zellen pro Napf) zugegeben und das Gemisch bei 1.000 × g für 90 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die Zellen wurden dann bei 32°C für 16 Stunden inkubiert. Der Virus-Übertand wurde entfernt und frisches Medium zugesetzt; Expression des Ziel-Gens wurde 24 Stunden nach der Infektion beobachtet.

Claims (10)

  1. Verfahren zum Screenen auf ein bioaktives Mittel, das fähig ist, einen Zell-Phänotyp zu ändern, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: a) das Kombinieren zumindest eines bioaktiven Kandidaten-Mittels mit einer Zellpopulation; und b) das Sortieren der Zellen in einem FACS-Gerät durch Trennen der Zellen auf Basis von zumindest 5 Zell-Parametern.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin eine Bibliothek von bioaktiven Kandidaten-Mitteln mit der Population kombiniert wird.
  3. Verfahren zum Screenen auf ein bioaktives Mittel, das fähig ist, einen Zell-Phänotyp zu ändern, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: a) das Einführen einer Bibliothek von Nucleinsäuren, die jeweils für ein bioaktives Kandidaten-Mittel kodieren, in eine Population von Zellen; und b) das Sortieren der Zellen in einem FACS-Gerät durch Trennen der Zellen auf Basis von zumindest drei Zell-Parametern.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Bibliothek eine retrovirale Bibliothek ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, worin der Zell-Phänotyp Exocytose ist und die Zell-Parameter aus der aus Lichtstreuung, Fluoreszenzfarbstoff-Aufnahme, Fluoreszenzfarbstoff-Freisetzung, Annexingranulat-Bindung, Oberflächengranulatenzymaktivität und der Menge an granulatspezifischen Proteinen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, der weiters das Einwirkenlassen von Bedingungen, die normalerweise Exocytose verursachen, auf die Zellen umfasst.
  7. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, worin der Zell-Phänotyp Zellzyklusregulierung ist und die Zell-Parameter Zell-Lebensfähigkeit, Vermehrung und Zellphase umfassen.
  8. Verfahren nach Anspruch 3, 4, 5, 6 oder 7, worin die Nucleinsäuren Fusionsnucleinsäuren umfassen, die Folgendes umfassen: a) die Nucleinsäure, die für die bioaktiven Kandidaten-Mittel kodieren; und b) eine detektierbare Gruppierung.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, worin die Zellen Tumorzellen sind.
  10. Verfahren nach Anspruch 8, worin die detektierbare Gruppierung ein fluoreszierendes Protein ist.
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