ES2207203T3

ES2207203T3 - Ensayos con parametros multiples facs para detectar alteraciones en parametros celulares.

Info

Publication number: ES2207203T3
Application number: ES99917563T
Authority: ES
Inventors: Joseph Fisher; James Lorens; Donald Payan; Alexander Rossi
Original assignee: Rigel Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Rigel Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1998-04-17
Filing date: 1999-04-16
Publication date: 2004-05-16
Anticipated expiration: 2019-04-16
Also published as: WO1999054494A2; DK1071809T3; AU3565499A; DE69910756D1; PT1071809E; DE69910756T2; EP1363127A2; CN1304489A; CN100334227C; EP1363127A3; EP1071809B1; CA2325597A1; EP1071809A2; ATE248226T1; JP4511033B2; WO1999054494A3; NZ508120A; JP2002512362A; CA2325597C

Abstract

Procedimiento de rastreo para un agente bioactivo capaz de alterar un fenotipo celular, comprendiendo dicho procedimiento: a) combinar por lo menos un agente bioactivo candidato y una población de células; y b) seleccionar dichas células en un aparato de FACS, mediante la separación de dichas células considerando por lo menos cinco parámetros celulares.

Description

Ensayos con parámetros múltiples FACS para detectar alteraciones en parámetros celulares.

Campo de la invención

La invención hace referencia a nuevos procedimientos de detección de alteraciones en los parámetros celulares y en particular para el rastreo de librerías de moléculas pequeñas, como las librerías de química combinatorial de moléculas orgánicas, incluyendo péptidos y otras librerías químicas, para la unión de moléculas diana, utilizando aparatos de selección de células activadas por fluorescencia (FACS).

Antecedentes de la invención

El campo del descubrimiento de fármacos y el rastreo de fármacos candidatos, para identificar compuestos líderes y caracterizar nuevos fármacos candidatos útiles, incluye el aislamiento de productos naturales o de preparación sintética, seguido de la selección contra dianas conocidas o desconocidas. Ver por ejemplo, la patente internacional WO 94/24314, Gallop y col., J. Med. Chem. 37(9):1233 (1994); Gallop y col., J. Med. Chem. 37(10):1385 (1994); Ellman, Acc. Chem. Res. 29:132 (1996); Gordon y col., Acc. Chem. Res. 29.144 (1996); patente internacional WO95/12608.

El rastreo de estas librerías se realiza de muy diversas maneras. Una aproximación implica la adhesión a perlas y la visualización con colorantes; ver Nestler y col., Bioorg. Med. Chem. Lett. 6(12):1327 (1996). Otra aproximación utilizó perlas y un selector de células activado por fluorescencia (FACS); ver Needless y col., PNAS USA 90:10700 (1993) y Vetter y col., Bioconjugate Chem. 6:316 (1995).

El selector de células activado por fluorescencia (FACS), también denominado citómetro de flujo, se utiliza para separar las células de forma individual según sus propiedades ópticas, incluyendo la fluorescencia. En general, es rápido y puede dar como resultado el rastreo de poblaciones grandes de células en un período relativamente corto de tiempo.

Existe un gran número de ejemplos, en donde sería de interés realizar un rastreo rápido y barato, como el rastreo por FACS. Dentro de dichas áreas se hallarían los ensayos de ciclo celular. Las células se dividen durante las diversas etapas del crecimiento, iniciándose el ciclo celular con la fase M, donde tiene lugar la mitosis y la división citoplasmática (citocinesis). La fase M se continua con la fase G, en donde las células reanudan una tasa elevada de biosíntesis y de crecimiento. La fase S se inicia con la síntesis de DNA y se finaliza cuando se ha doblado el contenido de DNA del núcleo. Entonces, la célula entra en la fase G2, que finaliza cuando se inicia la mitosis, y se visualiza por la apariencia condensada de los cromosomas. Por último, las células diferenciadas están paradas en fase G1 y nunca más llevarán a cabo una división celular.

La marca de una célula maligna es la proliferación descontrolada. Este fenotipo se adquiere gracias a la acumulación de mutaciones génicas, que en su mayoría favorecen el paso a través del ciclo celular. Las células cancerosas ignoran las señales reguladoras de crecimiento y continúan comprometidas con la división celular. Los oncogenes clásicos, como el ras, conducen a una transición inadecuada de la fase G1 a la S del ciclo celular, mimetizando las señales extracelulares de proliferación. Los puntos de control del ciclo celular aseguran la replicación fiel y la segregación de los cromosomas. La pérdida del punto de control del ciclo celular da como resultado una inestabilidad genética, un gran aumento en la acumulación de mutaciones que conducen a la transformación maligna. En consecuencia, los puntos de control reguladores como las proteínas p53 y ATM (ataxia telangiectasia mutada), también funcionan como supresores de tumores. En consecuencia, la modulación de las vías de los puntos de control del ciclo celular con agentes terapéuticos podría explotar las diferencias entre las células normales y tumorales, lo que ayudaría a mejorar la selección de la radio- o quimioterapia y conduciría a nuevos tratamientos contra el cáncer.

De acuerdo con ello, es un objetivo de la presente invención proporcionar composiciones y procedimientos de utilidad en el rastreo de moduladores de la regulación de los puntos de control del ciclo celular.

Otra área en la que los procedimientos de un rastreo rápido hallarían una utilización particular es el área de ensayos de exocitosis. La exocitosis es la fusión de vesículas secretoras con la membrana plasmática celular y tiene dos funciones principales. Una es la descarga de los contenidos de la vesícula en el espacio extracelular y la segunda es la incorporación de proteínas nuevas y de lípidos en la propia membrana plasmática.

La exocitosis se puede dividir en dos clases: constitutiva y regulada. Todas las células eucariotas presentan exocitosis constitutiva, la cual se distingue por la fusión continua de las vesículas secretoras después de su formación. La exocitosis regulada está restringida a ciertas células, incluyendo las células exocrinas, endocrinas y neuronales. La exocitosis regulada da como resultado la acumulación de vesículas secretoras que se fusionan con la membrana plasmática únicamente después de haber recibido una señal adecuada, generalmente (pero no siempre) un incremento en la concentración de Ca^{2+} libre citosólico.

La exocitosis regulada es crucial para muchas células especializadas y a menudo una célula en particular puede liberar múltiples mediadores de los mismos gránulos exocíticos que trabajan en concierto para producir una respuesta fisiológica en las células diana. Las células exocíticas reguladas incluyen las neuronas (liberan neurotransmisores), las células cromafinas adrenales (secreción de adrenalina), las células acinares pancreáticas (secreción de enzimas digestivas), las células \beta pancreáticas (secreción de insulina), mastocitos (secreción de histamina), las células mamarias (secreción de proteínas de la leche), el esperma (secreción de enzimas), las células del huevo (creación de la cubierta de fertilización) y los adipocitos (inserción de transportadores de glucosa en la membrana plasmática). Además, la teoría actual sugiere que los mecanismos básicos de acoplamiento y fusión de vesículas están conservados desde la levadura al cerebro de mamífero.

Además, los trastornos que implican la exocitosis son bien conocidos. Por ejemplo, el mediador inflamatorio liberado por los mastocitos conduce a diversos trastornos, incluyendo el asma. Así, sólo en los Estados Unidos, alrededor de 50 millones de personas sufren de asma, rinitis o de alguna otra forma de alergia. La terapia para la alergia continua limitada al bloqueo de mediadores liberados por los mastocitos (anti-histaminas), agentes anti-inflamatorios inespecíficos como los esteroides y estabilizantes de mastocitos que son sólo efectivos marginalmente en la limitación de la sintomatología de la alergia. De modo similar, el síndrome de Chediak-Higashi (CHS) es una enfermedad autosómica recesiva en la que los neutrófilos, monocitos y linfocitos y la mayoría de células contienen gránulos citoplasmáticos gigantes. Se han descrito trastornos similares en ratones, visones, ganado bovino, gatos y orcas, siendo el homólogo murino de CHS (denominado beige o bg) el mejor caracterizado. Ver Perou y col., J. Biol. Chem. 272(47):29790 (1997) y Barbosa y col., Nature 382:262 (1996).

También, está ampliamente aceptado que una amplia serie de trastornos psiquiátricos son el resultado de un desequilibrio entre la exocitosis neurotransmisora y la reincorporación mediadora.

Un gran número de fármacos han sido diseñados para interferir específicamente con los mediadores exocíticos a través del bloqueo de sus receptores. Sin embargo, esta aproximación está limitada por el hecho de que un único bloqueador de receptor no puede superar los efectos de muy diversos mediadores.

Según ello, es un objetivo de la presente invención proporcionar los procedimientos para el rastreo de alteraciones en la exocitosis, en particular para el rastreo de agentes capaces de mediar la exocitosis. Es también un objetivo de la presente invención el proporcionar dichos procedimientos de rastreo, en donde el ruido de fondo del ensayo se reduce y se incrementa la especificidad.

Resumen de la invención

De acuerdo con los objetivos subrayados anteriormente, la presente invención proporciona procedimientos para el rastreo de agentes bioactivos capaces de alterar o modular las alteraciones de fenotipos celulares. Los procedimientos comprenden, en general, la combinación de por lo menos un agente bioactivo candidato y de una población de células, la selección de células en un dispositivo FACS mediante la separación teniendo en cuenta por lo menos 3, 4, o 5 parámetros celulares. Los agentes candidatos pueden ser parte de una librería molecular que comprenda la fusión de ácidos nucleicos de acuerdo con los agentes bioactivos candidatos.

En otro aspecto, la presente invención proporciona los procedimientos para el rastreo de alteraciones de la exocitosis en una población de células, o en una sola célula en condiciones diferentes, o en combinación con agentes bioactivos diferentes. Los procedimientos comprenden la selección de las células en un aparato de FACS mediante el análisis de por lo menos dos o tres propiedades seleccionadas del grupo consistente en: dispersión de luz, incorporación de colorante fluorescente, liberación de colorante fluorescente, unión de gránulos de anexina, actividad enzimática de gránulos de superficie y cantidad de proteínas específicas de los gránulos.

También se proporciona aquí un procedimiento para el rastreo de un agente bioactivo capaz de modular la exocitosis en una célula. Este procedimiento comprende la combinación de un agente bioactivo candidato y una población de células y el sometimiento de dichas células a condiciones que normalmente causan exocitosis. Las células se seleccionan en un aparato de FACS, analizando las alteraciones en por lo menos tres de las propiedades seleccionadas del grupo consistente en: dispersión de luz, incorporación de colorantes fluorescentes, liberación de colorantes fluorescentes, unión de gránulos de anexina, actividad enzimática de gránulos de superficie y cantidad de proteínas específicas de los gránulos. Las alteraciones en por lo menos una de estas propiedades, en comparación con las células que no se expusieron al agente bioactivo candidato, indican que dicho agente modula la exocitosis.

En una realización preferida del procedimiento para el rastreo de un agente bioactivo, las propiedades seleccionadas incluyen por lo menos una propiedad seleccionada de entre el grupo que consiste en: liberación de colorantes fluorescentes, unión de gránulos de anexina, actividad enzimática de gránulos de superficie y cantidad de proteínas específicas de los gránulos. Las alteraciones en por lo menos una de estas propiedades, en comparación con las células que no se expusieron al agente bioactivo candidato indican que dicho agente modula la exocitosis.

En una realización preferida del procedimiento de rastreo para un agente bioactivo, las propiedades seleccionadas incluyen por lo menos una propiedad seleccionada del grupo consistente en: liberación de colorantes fluorescentes, unión de gránulos de anexina, actividad enzimática de gránulos de superficie y cantidad de proteínas específicas de los gránulos.

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Cuando se pretende la detección de la incorporación de un colorante fluorescente, el colorante es preferentemente un colorante de estiril. En el caso de que se detecte la liberación de colorante fluorescente, el colorante puede ser un colorante de concentración y pH bajos o un colorante de estiril.

En una realización preferida, la actividad enzimática de gránulos de superficie se detecta mediante un ensayo enzimológicos in situ o mediante un ensayo enzimático basado en una población. El sustrato enzimático puede ser cualquier sustrato detectable. Preferentemente, el sustrato enzimático se une a una construcción FRET. Las construcciones FRET incluyen dos proteínas fluorescentes divididas por una diana de corte de proteasas. En dicho caso, la diana de corte de proteasas es específico para una proteasa de gránulos.

En una realización preferida, se detectan las proteínas específicas de gránulos. Las proteínas específicas de gránulos pueden ser cualquiera de las proteínas detectables específicas. En una realización, las proteínas específicas de gránulos son proteínas de fusión que contienen una proteína específica de gránulos y una molécula detectable que puede ser una construcción FRET.

En otra realización preferida, se proporciona un procedimiento para el rastreo de un agente bioactivo capaz de modular la exocitosis en una célula, en donde dicho procedimiento comprende la combinación de por lo menos un agente bioactivo candidato y de una población de células que contienen una fusión de ácido nucleico, que comprende un ácido nucleico codificante para una proteína específica de gránulos y de un marcaje. Las células se someten a condiciones que normalmente causan exocitosis y se detectan las alteraciones en la cantidad de marcaje. Las alteraciones en la cantidad de marcaje indican que el agente modula la exocitosis. Preferentemente, el marcaje es una etiqueta epitópica o una molécula fluorescente. En una realización preferida, la molécula fluorescente es una construcción FRET.

En un aspecto adicional, la invención proporciona los procedimientos de rastreo para los moduladores de exocitosis que comprenden la combinación de agentes bioactivos candidatos, las células que contienen los ácidos nucleicos que codifican para una proteína detectable, específica de gránulos y de un agente para la detección de esta proteína. Las células se someten a condiciones que normalmente causan exocitosis, y se determina la presencia o ausencia de la proteína.

En otra realización preferida, se proporciona un procedimiento para el rastreo de un agente bioactivo capaz de modular la exocitosis en una célula que comprende una combinación de por lo menos un agente bioactivo candidato y de una población de células. Las células se someten a condiciones que normalmente causan exocitosis y se añade una anexina fluorescente. Y a continuación, se evalúan las alteraciones en la cantidad de anexina fluorescente en la superficie de las células.

En otra realización preferida, se proporciona un procedimiento para el rastreo de un agente bioactivo capaz de modular la exocitosis en una célula. Dicho procedimiento comprende una población de células, en donde dichas células se han resuspendido con un colorante a concentración y pH bajos. Las células resuspendidas con un colorante a concentración y pH bajos se combinan con por lo menos un agente bioactivo candidato y se someten a condiciones que normalmente causan exocitosis. Y a continuación, se detecta la liberación del colorante de concentración y pH bajos. Las alteraciones en la cantidad de colorante liberado indican que el agente modula la exocitosis.

En otra realización preferida, se proporciona un procedimiento para el rastreo de un agente bioactivo capaz de modular la exocitosis en una célula que comprende la combinación de por lo menos un agente bioactivo candidato y de una población de células. Las células se someten a condiciones que normalmente causan exocitosis y se añade un sustrato fluorescente específico de una enzima de gránulos. Y a continuación, se detecta al sustrato fluorescente específico de una enzima de gránulos, en donde las alteraciones en la cantidad de sustrato fluorescente son indicativas de que el agente modula la exocitosis. En una realización preferida, el sustrato comprende una construcción FRET.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona los procedimientos y composiciones para el rastreo de agentes bioactivos capaces de modular la regulación del ciclo celular en una célula. El procedimiento comprende la combinación de una librería de agentes bioactivos candidatos y de una población de células, la selección de las células en un aparato de FACS mediante separación de células teniendo en cuenta por lo menos un ensayo de viabilidad celular, un ensayo de proliferación y un ensayo de la fase celular.

En otro aspecto, los procedimientos comprenden la expresión de una librería de fusión de ácidos nucleicos en una librería de células. Los ácidos nucleicos de fusión comprenden un ácido nucleico que codifica para un agente bioactivo candidato y una molécula detectable. Las células se clasifican en un aparato de FACS mediante separación de células; dependiendo de la fase del ciclo celular en que se hallen las células, estas se clasifican teniendo en cuenta por lo menos un ensayo de la viabilidad celular, un ensayo de expresión, un ensayo de proliferación celular y un ensayo de la fase celular.

Descripción resumida de las figuras

Las Figuras 1A, 1B y 1C muestran esquemáticamente tres construcciones retrovirales del Ejemplo 1. La Figura 1A incluye la construcción CRU5-GFP-p21, que comprende un promotor CRU5, la secuencia señal de empaquetamiento retroviral-\Psi, la región codificante para GFP, fusionada con la región codificante de p21, seguida por un LTR. La Figura 1B muestra la construcción CRU5-GFP-p21, que incluye los 24 aminoácidos C-terminales de p21. La Figura 1C muestra la construcción CRU5-GFP-pUCmut, que es una versión mutante de CRU5-p21 con 3 sustituciones de alanina.

Las Figuras 2A, 2B, 2C y 2D muestran los resultados de los experimentos del Ejemplo 1. La Figura 2A muestra un ensayo de viabilidad utilizando una dispersión frontal y lateral. Se recogieron las células que presentaban una proporción característica. La Figura 2B muestra la fluorescencia de GFP de los vectores. La Figura 2C muestra la utilización de PKH26, un colorante de inclusión, en un ensayo de proliferación; las células que contenían la p21, una proteína que se sabe bloquea las células, continúan siendo altamente fluorescentes, mientras las células controles que continúan dividiéndose, diluyen el colorante y pierden fluorescencia. La Figura 2D muestra la utilización del Hoechst 33342 en un ensayo de fase ciclo celular.

La Figura 3 muestra el efecto del tratamiento con AraC sobre las células Jurkat con la p21, un agente que bloquea las células en la fase G1. La Ara C es un análogo de nucleótido que es tóxico para las células en división. De este modo, las células que son bloqueadas en el ciclo celular, sobreviven. La línea inferior muestra las células Jurkat sin el inserto p21 y la línea superior muestra las líneas Jurkat con el inserto p21.

Las Figura 4A y 4B muestran los histogramas de barras con los resultados de una población basada en el ensayo de actividad exocítica para la exocitosis. La Figura 4A muestra la actividad glucuronidasa o hexaminidasa en el sobrenadante de células combinadas con DMSO (-) o ionomicina (+). La Figura 4B muestra la actividad hexominidasa en el sobrenadante de células sensibilizadas con diversas cantidades de IgE anti-DNP y estimuladas con cantidades aumentadas del antígeno BSA-DNP.

Las Figuras 5A-5F muestran los cambios exocíticos en la dispersión de la luz observados con el citómetro de flujo. Dispersión lateral respecto a dispersión frontal, representado como histogramas de datos bivariados para las células RBL-2H3 (Figuras 5A y 5D) y células MC-9 (Figuras 5B, 5C, 5E y 5F). Después de la estimulación con un ionóforo, las células fueron observadas a los 0 minutos (Figuras 5A y 5C), 5 minutos (Figura 5E), 10 minutos (Figura 5D) y 30 minutos (Figuras 5B y 5F).

Las Figuras 6A-6E muestran los gráficos de los resultados de un ensayo con colorante de estiril para detectar la exocitosis mediante FACS. Las células se combinaron con DMSO (picos izquierdos) o ionomicina (picos derechos) en presencia de FM 4-64 (Figuras 6A y 6B) o FM 1-43 (Figuras 6C, 6D y 6E). Las Figuras 6A y 6C muestran células detectadas con el canal 1 de fluorescencia. Las Figuras 6B y 6D muestran las células detectadas con el canal 3 de fluorescencia. La Figura 6E muestra el desplazamiento medio del canal detectado con el citómetro de flujo en el canal 1 de fluorescencia, representado como un histograma de barras, en donde las células se preincubaron con diversas dosis de Wortmanin, inhibidor de quinasa PI-3, antes de la administración de un ionóforo (histogramas 1-4) o DMSO (histograma 5) en presencia de FM 1-43.

Las Figuras 7A-7D muestran los gráficos de los resultados de un ensayo de detección de la exocitosis con anexina-V mediante FACS. Las células se combinaron con DMSO (Figuras 7A y 7B) o con ionomicina (Figuras 7C y 7D) y luego se tiñeron con yoduro de propidio (Figuras 7A y 7c) y anexina-V-FITC (Figuras 7B y 7D).

Las Figuras 8A-8C muestran los gráficos de los resultados de un ensayo enzimológico in situ de exocitosis celular visualizada mediante FACS. Las células se combinaron con DMSO (Figura 8A) o con un ionóforo (Figuras 8B y 8C) y luego se tiñeron para su actividad glucuronidasa. La Figura 8C muestra el perfil de pH de la actividad enzimática de la superficie celular, en donde el histograma representa la señal máxima, tal como se cuantifica por el desplazamiento medio del canal observado con el citómetro de flujo.

La Figura 9 es un histograma de intensidad de fluorescencia detectado en el canal 1 que muestra las células cargadas con LYSOTRACKER GREEN™, combinadas con DMSO (izquierda) o ionomicina (derecha) y analizadas con el citómetro de flujo.

Las Figuras 10A-10H muestran el resultado de un análisis multiparamétrico que incluye la detección de LYSOTRACKER GREEN™, anexina-V-APC y dispersión frontal y lateral. En las Figuras 10A-10D y 10E-10H se muestran las células tratadas con dosis incrementadas de ionomicina y observadas en el citómetro de flujo con cuatro parámetros simultáneamente. Las células se cargaron con colorante de concentración y pH bajos, se estimularon y se colorearon con anexina-V-APC. Las Figuras 10A-10D muestran los histogramas de datos bivariados de la dispersión de luz lateral respecto a frontal y las Figuras 10E-10H muestran los rhistogramas bivariados de las señales de anexina-V-APC respecto a la de colorantes de concentración y pH bajos.

La Figura 11 muestra un gráfico de células estimuladas en presencia de FM-1-43 y teñidas con anexina-V-APC. Después de la estimulación con ionomicina, las células se analizaron a diversos intervalos de tiempo con el citómetro de flujo, y la actividad enzimática se analizó en el sobrenadante celular. Los parámetros de la dispersión frontal, FM-1-43, anexina-V-APC y hexosaminidasa se representaron en el gráfico en relación con la respuesta máxima de cada parámetro. Para la señalización del calcio, se cargó un tubo cargado de células con Fluo-3 y se llevó a cabo el mismo procedimiento.

Descripción detallada de la invención

La presente invención está dirigida a la detección de alteraciones en fenotipos celulares, como la regulación del ciclo celular, la exocitosis, la toxicidad de moléculas pequeñas, la expresión de receptores de superficie celular, la expresión enzimática, etc., mediante la evaluación o el análisis de diversos parámetros, en general a través de la utilización de un aparato separador de células activado por fluorescencia (FACS). Varios son los parámetros que pueden cuantificarse para permitir la detección de las alteraciones en diversos fenotipos celulares, tal como se describirá con mayor detalle más adelante. Analizando diversos de estos parámetros bien secuencial o simultáneamente, se puede realizar un rastro rápido y preciso.

En una realización preferida, los procedimientos subrayados aquí se utilizan para rastrear moduladores de fenotipos celulares. Los fenotipos celulares que se pueden analizar incluyen, pero no se limitan a, la apoptosis celular incluyendo la regulación del ciclo celular, la exocitosis, la toxicidad de pequeñas moléculas, la expresión de cualquier número de porciones incluyendo los receptores (en particular los receptores de superficie celular), las moléculas de adhesión, la secreción de citoquinas, las interacciones proteína-proteína, etc.

En una realización preferida, los procedimientos se utilizan para evaluar la regulación del ciclo celular. En esta realización, los parámetros celulares o los ensayos preferidos son los ensayos de viabilidad celular, los ensayos para determinar si las células se han bloqueado en un estadio determinado del ciclo celular ("ensayos de proliferación celular") y los ensayos para determinar en qué estadio celular se han parado las células ("ensayos de fase del ciclo celular"). Analizando o cuantificando uno o más de estos parámetros, es posible detectar no sólo alteraciones en la regulación del ciclo celular, sino también alteraciones en distintas etapas de la vía de regulación del ciclo celular. Ello puede facilitar, por ejemplo, la evaluación de células nativas, p.ej. para cuantificar la agresividad de un tipo celular de tumor, o para evaluar el efecto de fármacos candidatos que se prueban para conocer su efecto sobre la regulación del ciclo celular. De esta forma, se puede realizar un rastreo rápido y exacto de agentes farmacológicos candidatos con el fin de identificar agentes que modulen la regulación del ciclo celular.

Así, los procedimientos actuales son de utilidad para descubrir agentes bioactivos que puedan provocar que una población de células se mueva de una fase a otra del ciclo celular, o se bloquee en una fase de crecimiento. En algunas realizaciones, las células se bloquean en una fase de crecimiento determinada y se pretende que salgan de dicha fase o entren en una nueva fase. Alternativamente, puede ser deseable forzar el bloqueo de una célula en una fase determinada, por ejemplo G1, en lugar de que continúe el ciclo celular. De forma similar, puede ser deseable, en algunas circunstancias, acelerar una población de células no bloqueadas pero que se desplazan lentamente hacia la fase siguiente o simplemente a través del ciclo celular, o retrasar la aparición de la fase siguiente. Por ejemplo, es posible alterar las actividades de ciertas enzimas, por ejemplo las quinasas, las fosfatasas, las proteasas o enzimas de ubiquitinación, que contribuyen a la iniciación de los cambios de fase del ciclo celular.

En una realización preferida, los procedimientos subrayados aquí se realizan en células que no se han bloqueado en fase G1; es decir, células que se hallan en crecimiento o replicación rápida o incontrolada, como las células tumorales. De esta manera, se evalúan los agentes candidatos para hallar aquellos que alteran la regulación del ciclo celular, es decir, los que causan que las células se bloqueen en los puntos de control del ciclo celular, como por ejemplo G1 (aunque el bloqueo en otras fases como S, G2 o M también es deseable). Alternativamente, se evalúan los agentes candidatos para hallar agentes que provocan la proliferación de una población de células, es decir, que permiten que las células, normalmente paradas en G1, comiencen de nuevo a proliferar; por ejemplo, las células de sangre periférica, diferenciadas en fase terminal, las células madres en cultivo, etc.

Según ello, en una realización preferida, la invención proporciona los procedimientos de rastro de las alteraciones en la regulación del ciclo celular de una población de células. "Alteración" y "modulación" (utilizadas aquí de forma intercambiable), tal como se utilizan aquí incluyen tanto los aumentos como las disminuciones del parámetro o del fenotipo que se cuantifica. El término "alteración" o "modulación" en el contexto de regulación de ciclo celular, significa generalmente uno de las dos cosas. En una realización preferida, la alteración produce un cambio en el ciclo celular de una célula, es decir, una célula proliferante se bloquea en cualquiera de las fases del ciclo celular, o una célula bloqueada pasa del bloqueo de su fase e inicia el ciclo celular, en comparación con otra célula o con el mismo tipo de célula en condiciones distintas. Alternativamente, se puede alterar el progreso de una célula a través de cualquier fase; es decir, puede ser tanto una aceleración o un retraso del periodo de tiempo que necesite la célula para progresar a una fase de crecimiento determinada. Por ejemplo, una célula puede experimentar una fase G1 de varias horas y la adición de un agente podría prolongar dicha fase G1.

Se pueden realizar las cuantificaciones cuando las condiciones son las mismas para cada cuantificación, o en condiciones diversas, con o sin agentes bioactivos, o en estadios distintos del proceso del ciclo celular. Por ejemplo, se puede determinar una cuantificación del ciclo celular en una población celular en donde un agente bioactivo esté presente o ausente. En otro ejemplo, las cuantificaciones de la regulación del ciclo celular se determinan cuando la condición o el entorno de las poblaciones celulares difieren unas de otras. Por ejemplo, las células se pueden evaluar en presencia o ausencia de señales fisiológicas, por ejemplo hormonas, anticuerpos, péptidos, antígenos, citoquinas, factores de crecimiento, potenciales de acción, agentes farmacológicos (por ejemplo, quimioterapéuticos, etc.), u otras células (por ejemplo, contactos célula-célula). En otro ejemplo, las cuantificaciones de la regulación del ciclo celular se determinan en diferentes estadios del proceso del ciclo celular. En otro ejemplo más, las cuantificaciones de la regulación del ciclo celular se realizan cuando las condiciones son las mismas y las alteraciones se hallan entre una célula o población celular y otra célula o población celular.

Los términos "población celular" o "librería de células" o "pluralidad de células" hacen referencia a por lo menos dos células, preferentemente al menos 10^{3} células, más preferentemente al menos 10^{6} células y mejor todavía 10^{8} a 10^{9} células. La población o muestra puede contener una mezcla de distintos tipos celulares procedentes de cultivos primarios o secundarios, aunque son preferibles las muestras que sólo contienen un tipo celular, por ejemplo, la muestra puede ser de una línea celular, y en particular, de líneas celulares tumorales (especialmente tal como se indica más adelante). Las células pueden hallarse en cualquier fase celular, bien sincrónicamente o no, incluyendo la fase M, G1, S y G2. En una realización preferida, se utilizan células que se replican o proliferan; ello puede permitir la utilización de vectores retrovirales para la introducción de agentes bioactivos candidatos. Alternativamente, se pueden utilizar células que no se replican, y otros vectores (como los adenovirus y los lentivirus). Además, aunque no sea necesario, las células han de ser compatibles con colorantes y anticuerpos.

Los tipos celulares preferidos para utilizar en la invención variarán con el fenotipo celular a modular. Las células adecuadas incluyen, pero sin limitarse a, células de mamífero, incluyendo las células de animales roedores (incluyendo ratones, ratas, hámsteres y gérbidos), primates y células humanas, en particular las células tumorales de todo tipo, mama, piel, pulmón, cérvix, recto y colon, leucemia, cerebro, etc. Tal como se indica más adelante, se pueden utilizar tipos celulares adicionales para el rastreo de exocitosis.

En una realización preferida, los procedimientos de regulación del ciclo celular comprende la separación de células en un aparato de FACS mediante el análisis de distintos parámetros celulares, incluyendo, pero sin limitarse a, la viabilidad celular, la proliferación celular y la fase celular.

En una realización preferida, se analiza la viabilidad celular para asegurar que una ausencia de cambio de fase celular es debida a las condiciones experimentales (por ejemplo, la introducción de un agente bioactivo candidato) y no a la muerte celular. Existe una gran diversidad de ensayos adecuados de viabilidad celular que pueden utilizarse, incluyendo, pero sin limitarse a, la dispersión de luz, la tinción con colorantes de viabilidad y la exclusión de la tinción del colorante.

En una realización preferida, se utiliza un ensayo de dispersión de luz como el ensayo de viabilidad, bien conocido en la materia. Cuando se visualizan en el FACS, las células presentan características particulares cuantificadas por las propiedades de dispersión de la luz, luz dispersada hacia delante (frontal) y luz dispersada a 90 grados del eje del haz lumínico (lateral). Estas propiedades de dispersión representan el tamaño, la forma y el contenido de gránulos por célula. Estas propiedades tienen en cuenta dos parámetros a cuantificar como lectura de la viabilidad. En resumen, el DNA de las células muertas o que se están muriendo generalmente se condensa, lo que altera la dispersión de luz 90ºC; de forma similar, la formación de vesículas por la membrana puede alterar la dispersión de luz frontal.

Así, en general, para los ensayos de dispersión de luz, se evalúa una población de células vivas de un determinado tipo celular para determinar sus propiedades de dispersión de luz frontal y lateral. Ello requiere el ajuste de un estándar para que la dispersión pueda ser utilizada.

En una realización preferida, el ensayo de viabilidad utiliza un colorante vital. Existen diversos colorantes vitales conocidos que tiñen las células muertas o que se están muriendo, pero que no tiñen las células en crecimiento. Por ejemplo, la anexina V es un miembro de una familia de proteínas que expresan una unión específica con los fosfolípidos (fosfatidil serina) de forma dependiente de un ión divalente. Esta proteína se ha utilizado ampliamente para cuantificar la apoptosis (muerte celular programada), ya que la presencia de fosfatidil serina en la superficie celular es una señal temprana de este proceso. Colorantes vitales adecuados incluyen, pero sin limitarse a éstos, la anexina, el homodímero-1 de etidio, el DEAD Red, el yoduro de propidio, el SYTOX Green, etc., y otros conocidos en la materia; ver el libro Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Haugland, sexta edición, ver Apoptosis Assay en la página 285 en particular y el capítulo 16.

Los protocolos para la tinción con colorantes vitales para conocer la viabilidad celular son conocidos, ver el catálogo de Molecular Probes, supra. En esta realización, el colorante vital como la anexina se marca, bien directa o indirectamente, y se combina con una población celular. La anexina está disponible comercialmente, por ejemplo, de PharMingen, San Diego, California, o de Caltag Laboratories, Millbrae, California. Preferentemente, el colorante vital se proporciona en una solución en donde el colorante se halla en una concentración de aproximadamente 100 ng/ml a aproximadamente 500 ng/ml, más preferentemente, a aproximadamente 500 mg/ml a 1 \mug/ml y todavía más preferentemente de aproximadamente 1 \mug/ml a 5 \mug/ml. En una realización preferida, el colorante vital se marca directamente; por ejemplo, la anexina puede ser marcada con un fluorocromo como el isotiocianato de fluoresceína (FITC), los colorantes de Alexa, el TRITC, el APC, el tri-color, el Cy-5 y con un primer marcaje, como un hapteno como la biotina y se utiliza un segundo marcaje fluorescente, como una estreptavidina fluorescente. Se pueden utilizar otras parejas de marcaje primario y secundario, tal como se apreciará por los expertos en la materia.

Una vez añadido el colorante vital, se incuba con las células durante un período de tiempo, y si es necesario se lavan las células. A continuación, se separan las células tal como se indica más adelante para eliminar las células no viables.

En una realización preferida, la tinción con colorante de exclusión se utiliza en el ensayo de viabilidad. Los colorantes de exclusión son aquellos que son excluidos por las células vivas, es decir que no se incorporan pasivamente (las membranas celulares de células vivas no son permeables a dichos colorantes). Sin embargo, debido a la permeabilidad de las células muertas o que se están muriendo, sí son incorporados por estas células. En general, pero no siempre, los colorantes de exclusión se unen al DNA, por ejemplo mediante intercalación. Preferentemente, el colorante de exclusión no fluoresce o fluoresce poco en ausencia de DNA; ello elimina la necesidad de una etapa de lavado. Alternativamente, también se pueden utilizar los colorantes de exclusión que no requieran la utilización de un segundo marcaje. Los colorantes de exclusión preferidos incluyen, pero no se limitan a, el bromuro de etidio, el homodímero-1 de etidio, el yoduro de propidio, el colorante de ácido nucleico SYTOX Green; el Calcein AM, el BCEF AM, el diacetato de fluoresceína, el TOTO® y el TO-PRO™ (de Molecular Probes; supra, ver capítulo 16) y otros conocidos en la materia.

Los protocolos para la tinción con colorantes de exclusión para la viabilidad celular son conocidos, ver el catálogo de Molecular Probes, supra. En general, el colorante de exclusión se añade a las células a una concentración de aproximadamente 100 ng/ml a aproximadamente 500 ng/ml, más preferentemente, a aproximadamente 500 ng/ml a 1 \mug/ml, y más preferentemente a aproximadamente 0,1 \mug/ml a aproximadamente 5 \mug/ml y preferentemente con aproximadamente 0,5 \mug/ml. Las células y el colorante de exclusión se incuban durante un período de tiempo, se lavan si es necesario y luego se separan tal como se describe más adelante, para eliminar las células no viables de la población.

Además, existen otros ensayos de viabilidad celular que se pueden realizar, incluyendo por ejemplo los ensayos enzimáticos, que pueden cuantificar la actividad enzimática extracelular de las células vivas (por ejemplo, proteasas secretadas, etc.), o de las células muertas (por ejemplo, la presencia de enzimas intracelulares en el medio; por ejemplo, las proteasas intracelulares, las enzimas mitocondriales, etc.). Ver el libro Molecular Probes Handbook of Fluorescente Probes and Research Chemicals, Haugland, sexta edición, ver el capítulo 16 en particular.

En una realización preferida, se realiza por lo menos un ensayo de viabilidad y preferentemente se realizan dos ensayos de viabilidad, si los fluorocromos son compatibles. Cuando únicamente se realiza un ensayo de viabilidad, una realización preferida utiliza ensayos de dispersión de luz (dispersión frontal y lateral). Cuando se realizan dos ensayos de viabilidad, las realizaciones preferidas utilizan la dispersión de luz y el colorante de exclusión, también utilizan la dispersión de luz y la tinción con colorante vital, utilizándose en algunos casos los tres parámetros. Los ensayos de viabilidad permiten en consecuencia la separación de células viables de las no viables células
muertas.

Además de un ensayo de viabilidad, una realización preferida utiliza un ensayo de proliferación celular. El término "ensayo de proliferación", tal como se utiliza aquí, hace referencia a un ensayo que permita la determinación de que una población celular se está proliferando, es decir replicándose o no.

En una realización preferida, el ensayo de proliferación es un ensayo de inclusión de un colorante. Un ensayo de inclusión de un colorante depende de los efectos de dilución para distinguir entre las fases celulares. En resumen, un colorante (en general, un colorante fluorescente tal como se describe más adelante) se introduce en las células y es incorporado por éstas. Una vez incorporado, el colorante queda atrapado en la célula y no difunde al exterior. Al dividirse la población celular, el colorante se diluye proporcionalmente. En resumen, después de la introducción del colorante de inclusión, se deja incubar las células durante un período de tiempo; las células que pierden fluorescencia con el tiempo, se están dividiendo, y las células que permanecen fluorescentes, están bloqueadas en una fase de no crecimiento.

En general, la introducción del colorante de inclusión puede realizarse de dos maneras. En una, el colorante no puede entrar pasivamente en las células (p.ej., si posee carga) y las células deben tratarse para que puedan incorporar el colorante; por ejemplo, a través de un pulso eléctrico. Alternativamente, el colorante puede entrar pasivamente en las células, pero una vez dentro, es modificado de forma que ya no puede difundir al exterior de las células. Por ejemplo, una modificación enzimática del colorante de inclusión puede proporcionar una carga al colorante y con ello será incapaz de difundir al exterior de las células. Por ejemplo, los colorantes del Molecular Probes CellTracker™ son derivados del clorometil fluorescente que difunden libremente al interior de las células, y luego una reacción mediada por la glutatión S-transferasa los convierte en colorantes incapaces de traspasar la membrana celular.

Los colorantes de inclusión adecuados incluyen, pero no se limitan a los colorantes de Molecular Probes de Cell Tracker™, incluyendo, pero sin limitarse al CellTracker™ Blue, CellTRacker™ Yellow-Green, CellTracker™ Green, CellTRacker™ Orange, PKH26 (Sigmas) y otros conocidos en la materia; ver el libro Molecular Probes Handbook, supra, capítulos 15 en particular.

En general, los colorantes de inclusión se proporcionan a las células a una concentración en el intervalo de aproximadamente 100 ng/ml a aproximadamente 5 \mug/ml y preferentemente desde aproximadamente 500 ng/ml a 1 \mug/ml. Se puede incluir o no una etapa de lavado. En una realización preferida, un agente bioactivo candidato se combina con las células tal como se describe aquí. Las células y el colorante de inclusión se incuban durante un período de tiempo para permitir la división celular y en consecuencia se diluye el colorante. El período de tiempo dependerá de la duración del ciclo celular para cada célula en particular; en general, es preferible durante por lo menos 2 divisiones celulares, preferentemente durante por lo menos 3 y todavía más preferentemente durante por lo menos 4. Las células se separan a continuación, tal como se indica más adelante, para crear poblaciones de células que se están replicando y otras que no. Como podrá apreciarse por los expertos en la materia, en algunos casos, por ejemplo para el de agentes anti-proliferativos, se recogen las células brillantes (p.ej., con fluorescentes); en otra de las realizaciones, por ejemplo para el rastreo de agentes proliferación, se recogen las células poco fluorescentes. Las alteraciones se determinan cuantificando la fluorescencia en diferentes periodos de tiempo o en diferentes poblaciones celulares y comparando las determinaciones de unos con otros o con estándares.

En una realización preferida, el ensayo de proliferación es un ensayo de antimetabolitos. En general, los ensayos de antimetabolitos son principalmente utilizados cuando se desean agentes que causen el bloqueo celular en fase G1 o G2. En un ensayo de proliferación con antimetabolitos, la utilización de un antimetabolito tóxico que elimina las células en división, dará como resultado la supervivencia de únicamente aquellas células que no se dividan. Los antimetabolitos adecuados incluyen, pero no se limitan a, agentes estándares, quimioterapéuticos como el metrotexato, la cisplatina, el taxol, la hidroxiurea, los análogos de nucleótidos como el AraC, etc. Además, los ensayos de antimetabolitos pueden incluir la utilización de genes que causen la muerte celular tras su expresión.

La concentración a la cual se añade el antimetabolito dependerá de la toxicidad del antimetabolito en particular y se determinará tal como se conoce en la materia. Una vez añadido el antimetabolito, las células se incuban generalmente durante un cierto tiempo; de nuevo, el tiempo exacto dependerá de las características y de la identidad del antimetabolito, así como del momento del ciclo celular en que se halle la población celular en particular. En general, un tiempo suficiente para que por lo menos tenga lugar una división celular.

En una realización preferida, se realiza por lo menos un ensayo de proliferación, en donde más de uno son los preferidos. Así, un ensayo de proliferación da como resultado una población de células proliferantes y una población de células bloqueadas.

En una realización preferida, bien después o simultáneamente con uno o más de los ensayos de proliferación citados anteriormente, se realiza por lo menos un ensayo de fase celular. Un "ensayo de fase celular" determina en qué fase celular se han bloqueado las células, si M, G1, S o G2.

En una realización preferida, el ensayo de fase celular en un ensayo con un colorante de unión a DNA. En resumen, un colorante de unión a DNA se introduce en las células y se incorpora de forma pasiva. Una vez dentro de la célula, dicho colorante se une al DNA, generalmente mediante intercalación, aunque en algunos casos, los colorantes pueden ser compuestos de unión en surcos mayores o menores del DNA. La cantidad del colorantes está directamente correlacionada con la cantidad del DNA en la células, que varía con la fase celular; las células en la fase G2 y M tienen el doble de contenido de DNA que las células en fase G1 y las células en fase S tienen una cantidad intermedia, dependiendo en qué punto de la fase S se hallen las células. Los colorantes adecuados de unión a DNA penetran las membranas celulares e incluyen, pero no se limitan a, el Hoechst 33342 y el 333258, el naranja de acridina, el 7-AAD, el LDS 751, el DAPI y el SYTO 16, Molecular Probes Handbook, supra, capítulos 8 y 16 en particular.

En general, los colorantes de unión al DNA se añaden a concentraciones que varían desde aproximadamente 1 \mug/ml a 5 \mug/ml. Los colorantes se añaden a las células y éstas se incuban durante un período de tiempo, dependiendo su duración, en parte, del colorante elegido. En una realización, las cuantificaciones se realizan inmediatamente después de la adición del colorante. Las células se separan a continuación, tal como se describe más adelante, para crear poblaciones de células que contienen cantidades distintas de colorante, y en consecuencia cantidades de DNA distintas; de este modo, las células que se replican se separan de las que no lo hacen. Tal como se apreciará por los expertos en la materia, en algunos casos, por ejemplo cuando se rastrea para agentes anti-proliferación, las células con menor fluorescencia (y en consecuencia con una sola copia del genoma) se pueden separar de las que se están replicando y por lo tanto contienen más de un genoma de DNA. Las alteraciones se determinan cuantificando la fluorescencia en momentos distintos o en poblaciones celulares distintas, comparando a continuación las determinaciones de unos con otros o con los estándares.

En una realización preferida, el ensayo de fase celular es un ensayo de destrucción de ciclinas. En esta realización, antes del rastreo (y en general antes de introducir un agente bioactivo candidato, tal como se describe más adelante), se introduce en las células un ácido nucleico de fusión. El ácido nucleico de fusión comprende el ácido nucleico que codifica para una caja de destrucción de ciclinas y un ácido nucleico que codifica para una molécula detectable. Las "cajas de destrucción de ciclinas" son conocidas en la materia y son secuencias que causan la destrucción por la vía de la ubiquitinación de proteínas que contienen cajas durante fases celulares particulares. Por ejemplo, las ciclinas de G1 pueden estar estables durante G1, pero se degradan durante la fase S debido a la presencia de una caja de destrucción de ciclinas de G1. Así, uniendo una caja de destrucción de ciclinas con una molécula detectable, por ejemplo una proteína fluorescente verde, la presencia o ausencia de la molécula detectable puede servir para identificar la fase celular de la población celular. En una realización preferida, se utilizan múltiples cajas, preferentemente cada una con un fluorocromo distinto, para que pueda ocurrir la detección de la fase celular.

Se conocen en la materia un buen número de cajas de destrucción de ciclinas, por ejemplo, la ciclina A tiene una caja de destrucción que comprende la secuencia RTVLGVIGD; la caja de destrucción de ciclina B1 comprende la secuencia RTALGDIGN; la caja de destrucción de la ciclina B1 comprende la secuencia RTALGDIGN. Ver Glotzer y col., Nature 349:132-138 (1991). Otras cajas de destrucción conocidas son: YMTVSIIDRFMQDSCVPKKMLQLVGVT (ciclina B de rata); KFRLLQETMYMTVSIIDRFMQNSCVPKK (ciclina B de ratón); RAILIDWLIQVQMKFRLLQE
TMYMTVS (ciclina B1 de ratón); DRFLQAQLVCRKKLQVVGITALLLASK (ciclina B2 de ratón); y MSVLRGKLQ
LVGTAAMLL (ciclina A2 de ratón).

El ácido nucleico que codifica para la caja de destrucción de ciclinas está unido operativamente al ácido nucleico que codifica para una molécula detectable. Las proteínas de fusión se construyen mediante procedimientos conocidos en la materia. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican para la caja de destrucción se ligan a un ácido nucleico que codifica para una molécula detectable. El término "molécula detectable" hace referencia a una molécula que permite diferenciar las células que la contienen de las que no contienen dicha molécula detectable, por ejemplo, un epitopo, a veces denominado una antígeno TAG, una enzima específica, o una molécula fluorescente. Las moléculas fluorescentes preferidas incluyen, pero no se limitan a, la proteína fluorescente verde (GFP), la proteína fluorescente amarilla (YFP), la proteína fluorescente roja (RFP) y enzimas como la luciferasa y la \beta-galactosidasa. Cuando se utilizan ETIQUETAS antigénicas, las realizaciones preferidas utilizan antígenos de superficie celular. El epitopo es preferentemente cualquier péptido detectable que no se halle habitualmente en la membrana citoplasmática, aunque en algunos casos, si el epitopo es uno de los que se hallan normalmente en las células, se pueden detectar aumentos, aunque ello no sea generalmente preferible. De modo similar, se pueden también utilizar moléculas enzimáticas detectables, por ejemplo, una enzima que genera un nuevo producto cromogénico.

Según ello, los resultados de la separación de células después de los ensayos de fase celular dan como resultado por lo menos dos poblaciones de células que se hallan en diferentes fases celulares.

En una realización preferida, se utilizan procedimientos para rastrear agentes bioactivos candidatos por su capacidad de modular la regulación del ciclo celular, incluyendo la activación o la supresión de las vías de puntos de control del ciclo celular y la mejora de los defectos introducidos en los puntos de control. El agente bioactivo candidato se puede añadir a la población celular exógenamente o se puede introducir en las células tal como se describe más adelante.

El término "agente bioactivo candidato" o "compuesto exógeno", tal como se utiliza aquí describe cualquier molécula, es decir, proteína, molécula orgánica pequeña, carbohidratos (incluyendo los polisacáridos), los polinucleótidos, los lípidos, etc. En general, se realizan en paralelo diversos ensayos o mezclas de ensayos con concentraciones distintas de los agentes para obtener una respuesta diferencial a las diversas concentraciones. En general, una de estas concentraciones sirve como control negativo, es decir, concentración cero o por debajo del nivel de detección. Además, se pueden utilizar los controles positivos. Por ejemplo, en los ensayos del ciclo celular, se pueden utilizar agentes conocidos por alterar la progresión del ciclo celular. Por ejemplo, la p21 es una molécula conocida por bloquear las células en fase G1 y por unirse a complejos G1 de ciclina-DK. De forma similar, los compuestos que se sabe inducen la exocitosis pueden utilizarse como tales, tal como se describe más adelante.

Los agentes candidatos abarcan numerosas clases químicas, aunque típicamente son moléculas orgánicas, preferentemente son compuestos orgánicos pequeños con un peso molecular de más de 100 y menos de 2.500 daltons. Los agentes candidatos comprenden grupos funcionales necesarios para la interacción de estructuras con las proteínas, en particular con la unión al hidrógeno e incluyen de forma característica por lo menos un grupo amina, un grupo hidroxilo o carboxilo, preferentemente por lo menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos comprenden a menudo estructuras cíclicas o heterocíclicas de carbono y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos anteriores. Los agentes candidatos también se hallan entre las biomoléculas incluyendo péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de lo mismo. En general, los péptidos son preferibles.

Los agentes candidatos se obtienen de una amplia variedad de fuentes incluyendo librerías de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, muchos medios están disponibles para la síntesis aleatoria y directa de una gran variedad de compuestos orgánicos y de biomoléculas, incluyendo la expresión de oligonucleótidos aleatorios. Alternativamente, las librerías de compuestos naturales en la forma de extractos de bacterias, hongos, plantas y animales están disponibles o se producen fácilmente. Además, las librerías producidas de forma natural o sintética y compuestos se modifican fácilmente a través de medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales. Los agentes farmacológicos conocidos pueden someterse a modificaciones químicas dirigidas o aleatorias, como la acilación, alquilación, esterificación y amidificación para producir análogos estructurales.

En una realización preferida, los agentes bioactivos candidatos son proteínas. El término "proteína", tal como se indica aquí, hace referencia a por lo menos dos aminoácidos unidos covalentemente, incluyendo proteínas, polipéptidos, oligopéptidos y péptidos. La proteína puede estar compuesta de aminoácidos de origen natural y de enlaces peptídicos, o de estructuras péptidomiméticas. Así, "aminoácido" o "residuo peptídico", tal como se utiliza aquí, hace referencia tanto a los aminoácidos naturales como a los sintéticos. Por ejemplo, la homo-fenilalanina, la homo-fenilalanina, la citrulina y la norleucina se consideran aminoácidos para el propósito de la invención. El término "aminoácido" también incluye los residuos de aminoácidos como la prolina y la hidroxiprolina. Las cadenas laterales pueden hallarse tanto en la configuración R o en la S. En la realización preferida, los aminoácidos se hallan en la configuración S- o L-. Si se utilizan cadenas laterales de origen no natural, se pueden utilizar sustituyentes no aminoacídicos, por ejemplo, para prevenir o retrasar la degradación in vivo. También se pueden añadir grupos bloqueantes químicos u otros sustituyentes químicos.

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En una realización preferida, los agentes bioactivos candidatos son proteínas o fragmentos de proteínas de origen natural. Así, por ejemplo, se pueden utilizar los extractos celulares que contienen proteínas, o fragmentos de digestión de extractos celulares proteicos. De este modo, se pueden realizar librerías de proteínas procariotas o eucariotas para el rastreo en los sistemas descritos aquí. De particular interés en esta realización son las librerías de proteínas de bacterias, hongos, virus y mamíferos, siendo éstas últimas las preferidas y especialmente las humanas.

En una realización preferida, los agentes bioactivos candidatos son péptidos de aproximadamente 5 a 30 aminoácidos, preferentemente de aproximadamente 5 a 20 aminoácidos y más preferentemente de 7 a 15 aminoácidos. Los péptidos pueden ser fragmentos de digestión de proteínas naturales tal como se indicó anteriormente, péptidos aleatorios o péptidos aleatorios "sesgados". Por "aleatorios" o sus equivalentes gramaticales se indica que cada ácido nucleico y péptido consiste en nucleótidos y aminoácidos aleatorios esenciales, respectivamente. Ya que en general estos péptidos aleatorios (o ácidos nucleicos, tal como se indica más adelante) se sintetizan químicamente, pueden incorporar cualquier nucleótido o aminoácido en cualquier posición. El proceso sintético se puede diseñar para generar proteínas o ácidos nucleicos aleatorios, para permitir la formación de todas o la mayoría de las combinaciones posibles en toda la longitud de la secuencia, formando en consecuencia una librería de agentes proteicos bioactivos candidatos.

En una realización, la librería se realiza de forma totalmente aleatoria, sin ninguna preferencia de secuencias en ninguna posición. En una realización preferida, la librería es sesgada. Es decir, algunas posiciones dentro de la secuencia se mantienen constantes, o se seleccionan a partir de un número limitado de posibilidades. Por ejemplo, en una realización preferida, los nucleótidos o los residuos de aminoácidos son aleatorios dentro de una clase definida, por ejemplo, de aminoácidos hidrofóbicos, residuos hidrofílicos, residuos sesgados estéricamente (bien grandes o pequeños), hacia la creación de cisteínas para la unión por enlace cruzado, prolinas para dominios SH-3, serinas, treoninas, tirosinas o histidinas para los sitios de fosforilación, etc., o para purinas, etc.

En una realización preferida, los agentes bioactivos candidatos son ácidos nucleicos. Los términos "ácido nucleico" u "oligonucleótido" o sus equivalentes gramaticales hacen referencia a por lo menos dos nucleótidos unidos covalentemente. Un ácido nucleico de la presente invención contendrá generalmente enlaces fosfodiéster, aunque en algunos casos, tal como se indica más adelante, se incluyan los análogos de ácidos nucleicos que pueden tener estructuras alternadas, comprendiendo, por ejemplo, fosforamida (Beaucage, y col., Tetrahedron, 49(10):1925 (1993) y las referencias incluidas; Letsinger, J. Org. Chem., 35:3800 (1970); Sprinzl y col., Eur. J. Biochem., 81:579 (1977); Letsinger y col., Nucl. Acids. Res., 14:3487 (1986); Sawai y col., Chem. Lett., 805 (1984), Letsinger, y col., J. Am. Chem. Soc., 110:4470 (1988); y Pauwels, y col., Chemica Scripta, 26:141 (1986)), fosforotioato (Mag y col., Nucleic Acids Res., 19:1437 (1991); y la patente americana U.S. 5.644.048), fosforoditioato (Briu y col., J. Am. Chem. Soc., 111:2321 (1989)), uniones O-metilfosforoamidita (ver Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press) y las estructuras y uniones peptídicas y de ácidos nucleicos (ver Egholm, A. Am. Chem. Soc., 114:1895 (1992); Meier, y col., Chem. Int. Ed. Engl., 31:1008 81992); Nielsen, Nature, 365:566 (1993); Carlsson, y col., Nature, 380:207 (1996). Otros ácidos nucleicos análogos incluyen los que presentan estructuras positivas (Denpcy y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6097 (1995)); las estructuras no-iónicas (patente americana U.S. 5.386.023; 5.637.684; 5.602.240; 5.216.141 y 4.469.863; kiedrowshi y col., Agew. Chem. Intl. Ed. English, 30:423 (1991); Letsonger, y col., J. Am. Chem. Soc., 110:4470 (1988); Letsinger, y col., Nucleoside & Nucleotide, 13:1597 (1994); capítulos 2 y 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui y P. Dan Cook; Mesmaeker, y col., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett., 4:395 (1994); Jeff, y col., J. Biomolecular NMR, 34:17 (1994); Tetrahedron Lett., 37:743 (1996)) y estructuras no compuestas por ribosa, incluyendo las descritos en las patentes americanas U.S. 5.235.033 y 5.034.506 y los capítulos 6 y 7, ASC Symposium Series 580, "Carbhohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui y P. Dan Cook. Los ácidos nucleicos que contienen uno o más azúcares carbocíclicos también se incluyen dentro de la definición de ácidos nucleicos (ver Jenkins y col., Chem. Soc. Rev., (1995) pág. 169-176). Algunos análogos de ácidos nucleicos se describen en Rawls, C&E News, 2 de junio, 1997, pág. 35. Estas modificaciones de la estructura de ribosa-fosfato se pueden realizar para facilitar la adición de porciones adicionales como marcajes, o para incrementar la estabilidad y la vida media de dichas moléculas en entornos fisiológicos. Además, se pueden realizar mezclas de ácidos nucleicos de origen natural. Alternativamente, se pueden realizar mezclas de análogos de ácidos nucleicos y mezclas de ácidos nucleicos de origen natural y de análogos. Los ácidos nucleicos pueden ser de cadena sencilla o de cadena doble, tal como se especifica, o pueden contener porciones de secuencia de cadena doble o sencilla. El ácido nucleico puede ser un DNA, genómico o cDNA, un RNA o un híbrido, en donde el ácido nucleico contiene cualquier combinación de desorribo- y ribonucleótidos y cualquier combinación de bases, incluyendo uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xatanina, hipoxatanina, isocitosina, isoguanina, etc.

Al igual que se describió en general para las proteínas, los agentes bioactivos candidatos de ácido nucleico pueden ser ácidos nucleicos de origen natural, ácidos nucleicos aleatorios, o ácidos nucleicos aleatorios "sesgados". Por ejemplo, se pueden utilizar fragmentos de digestión de genomas de procariotas o eucariotas al igual que se indicó para las proteínas.

En una realización preferida, los agentes bioactivos candidatos son porciones químicas orgánicas, estando la mayoría de ellos disponibles en la bibliografía.

En una realización preferida, se utilizan agentes bioactivos candidatos distintos. Preferentemente, la librería debería proporcionar una población de agentes aleatorios lo suficientemente diversa estructuralmente para producir un intervalo probabilístico de suficiente diversidad con el fin de permitir la unión a una diana determinada. Según ello, una librería de interacción debería ser lo suficientemente grande para que por lo menos uno de sus miembros tuviera una estructura que le proporcione la afinidad por la diana. Aunque, es difícil calibrar el tamaño absoluto requerido, la naturaleza proporciona un buen ejemplo con la respuesta inmune: una diversidad de 10^{7}-10^{8} anticuerpos distintos proporciona por lo menos una combinación con afinidad suficiente para interactuar con la mayoría de antígenos potenciales presentados a un organismo. Las técnicas publicadas de selección in vitro también han demostrado que una librería de un tamaño de 10^{7}-10^{8} es suficiente para hallar estructuras con afinidad por la diana. Una librería con todas las combinaciones de un péptido de 7 a 20 aminoácidos de longitud, como las propuestas en general aquí, tiene el potencial para codificar de 20^{7} (10^{9}) a 20^{20}. Así, con librerías de 10^{7}-10^{8} moléculas distintas, los procedimientos de la presente invención permiten la obtención de un subgrupo "factible" de una librería de interacción completa, teóricamente, para 7 aminoácidos y de un subgrupo de formas para una librería de 20^{20}. Por ello, en una realización preferida, se analizan simultáneamente por lo menos 10^{6}, preferentemente 10^{7}, más preferentemente 10^{8} y todavía más preferentemente 10^{9} secuencias distintas en los procedimientos de la presente invención. Los procedimientos preferidos son los que maximizan el tamaño de la librería y su diversidad.

Los agentes bioactivos candidatos se combinan o añaden a una población de células. Los tipos celulares adecuados para realizaciones distintas son los descritos anteriormente. Se combinan el agente bioactivo candidato y las células. Tal como se apreciará por los expertos en la materia, esto se puede lograr de muchas maneras, incluyendo la adición de agentes candidatos a la superficie de las células, al medio que contiene las células, o a la superficie sobre la que crecen las células o se hallan en contacto; mediante la adición de agentes en las células, por ejemplo utilizando vectores que introducirán los agentes en las células (es decir, cuando los agentes son ácidos nucleicos o proteínas).

En una realización preferida, los agentes bioactivos candidatos son ácidos nucleicos o proteínas (el término proteínas en este contexto incluye proteínas, oligopéptidos y péptidos) que se introducen en las células huésped utilizando vectores, incluyendo los vectores virales. La elección del vector, preferentemente un vector viral, dependerá del tipo celular. Cuando las células se replican, se utilizan los vectores retrovirales, tal como se describe con mayor detalle más adelante. Cuando las células no se replican (es decir, están paradas en una de las fases de crecimiento), se pueden utilizar otros vectores virales, incluyendo vectores lentivirales y adenovirales.

En una realización preferida, las células se replican o pueden ser inducidas a replicarse y los vectores retrovirales se utilizan para introducir agentes bioactivos candidatos en las células, tal como se describen en la PCT US97/01019 y PCT US97/01048. En general, se genera una librería de vectores retrovirales utilizando líneas celulares de empaquetamiento de retrovirus que contienen virus auxiliares defectuosos, capaces de producir todas las proteínas trans, incluyendo gag, pol y env y las moléculas de RNA que tienen la señal de empaquetamiento \Psi en cis. En resumen, la librería se genera en una construcción de DNA; se realiza la síntesis con oligonucleótidos estándar para generar el agente candidato o el ácido nucleico o una proteína, por ejemplo un péptido aleatorio, utilizando técnicas bien conocidas en la materia. Después de la generación de la librería de DNA, la librería se clona en un primer cebador. El primer cebador sirve como "caja", la cual se inserta en la construcción retroviral. El primer cebador contiene generalmente un número de elementos, incluyendo por ejemplo, las secuencias reguladoras necesarias (p.ej., secuencias de traducción, transcripción, promotores, etc.), parejas de fusión, dianas de endonucleasas de restricción (dianas de clonaje y subclonaje), codones de parada (preferentemente en los tres marcos de lectura), regiones de complementariedad para la hibridación de una segunda cadena (preferentemente en el extremo de la región del codón de parada, ya que puede tener lugar deleciones menores o inserciones en la región aleatoria), etc.

A continuación, se añade un segundo cebador, que consiste generalmente de una parte o de toda la región de complementariedad para hibridar con el primer cebador, y opcionalmente secuencias necesarias para una segunda diana de restricción única para el subclonaje. Se añade la DNA polimerasa para generar oligonucleótidos de cadena doble. Los oligonucleótidos de cadena doble se cortan con las endonucleasas de restricción adecuadas para el subclonaje y se subclona el fragmento en los vectores retrovíricos detinados, tal como se describe más adelante.

Se puede utilizar cualquier vector retroviral adecuado. En general, los vectores retrovirales pueden incluir: genes marcadores seleccionables tal como se describe con mayor detalle más adelante; promotores que conducen la expresión de un segundo gen, colocados en dirección 5'-3' (sentido de transcripción) o 3'-5' (antisentido) en relación con el LTR 5'; CRU5 (un LTR sintético), elementos de regulación de tetraciclina de las células SIN, promotores específicos de células, etc.

Los vectores retrovirales preferidos incluyen un vector basado en el virus de células madres murinas (MSCV) (ver Hawly y col., Gene Therapy 1:136 (1994)) y un virus MGF modificado (Revere y col., Genetics 92:6733 (1995)) y un pBABE, descrito en la PCT US97/01019.

Los retrovirus pueden incluir promotores inducibles o constitutivos para la expresión del agente candidato. Por ejemplo, hay situaciones en donde es necesario inducir la expresión de péptidos únicamente durante ciertas fases del proceso de selección, o únicamente en ciertas fases de del ciclo celular (por ejemplo, utilizando promotores específicos de fases, como el promotor sensible de E2F, el promotor sensible de p53, los promotores de ciclinas, etc.). Se conoce un amplio número de promotores inducibles y constitutivos.

Además, es posible configurar un vector retroviral para permitir la expresión inducible de los insertos retrovirales después de la integración de un único vector en las células diana, estando contenido todo el sistema dentro del retrovirus. Los retrovirus Tet-inducibles se han diseñado para incorporar la característica de la propia inactivación (SIN) del mutante de deleción retroviral 3'LTR intensificador/promotor (Hoffman y col., PNAS USA 93.5185 (1996)). La expresión de este vector en las células es virtualmente indetectable en presencia de tetraciclina o de otros análogos activos. Sin embargo, en ausencia de Tet, la expresión alcanza un máximo a las 48 h de la inducción, con una expresión aumentada de forma uniforme en toda la población de células que presentan los retrovirus inducibles, lo que indica que la expresión se regula de forma uniforme dentro de la población de células infectadas. Un sistema relacionado similar utiliza un dominio de unión Tet-DNA mutado, de modo que se une al DNA en presencia de Tet y se desune en su ausencia. Cualquiera de estos sistemas es adecuado.

En una realización preferida, los agentes bioactivos candidatos se unen a una pareja de fusión. Por "pareja de fusión" o "grupo funcional" se indica una secuencia que está asociada con el agente bioactivo candidato, confiriendo a todos los miembros de la librería de esta clases una función común o capacidad. Las parejas de fusión pueden ser heterólogas (es decir no nativas de la célula huésped), o sintéticas (no nativas a ninguna célula). Las parejas de fusión adecuadas incluyen, pero no se limitan a: a) estructuras de presentación, tal como se define más adelante, que proporcionan los agentes bioactivos candidatos en una forma restringida o estable conformacionalmente; b) secuencias de destinación, definidas más adelante, que permiten la localización del agente bioactivo candidato en un compartimento subcelular o extracelular; c) secuencias de rescate, tal como se define más adelante, que permiten la purificación o el aislamiento de los agentes bioactivos candidatos o de los ácidos nucleicos que los codifican; d) secuencias de estabilidad que confieren estabilidad o protección de la degradación del agente bioactivo candidato o del ácido nucleico que lo codifica, por ejemplo la resistencia a la degradación proteolítica; e) secuencias de dimerización, para permitir la dimerización peptídica; o f) cualquier combinación de a), b), c), d) y e), así como las secuencias líder, según sea necesario.

En una realización preferida, la pareja de fusión es una estructura de presentación. Por "estructura de presentación" o sus equivalentes gramaticales se hace referencia aquí a una secuencia que, cuando se fusiona con agentes bioactivos candidatos, causa que estos agentes candidatos asuman una forma restringida conformacionalmente. Las proteínas interactúan unas con otras de forma amplia, a través de dominios restringidos conformacionalmente. Aunque los péptidos pequeños con extremos amino y carboxilo terminales de rotación libre puedan tener funciones potentes tal como se conoce en la materia, la conversión de dichas estructuras peptídicas en agentes farmacológicos es difícil debido a la incapacidad para predecir las posiciones laterales predichas para la síntesis péptidomimética. En consecuencia, la presentación de los péptidos en estructuras restringidas conformacionalmente beneficiará las últimas generaciones de fármacos y probablemente conducirá a interacciones de mayor afinidad del péptido con la proteína diana. Esta característica se ha reconocido en sistemas de generación de librerías combinatoriales utilizando péptidos pequeños generados biológicamente en sistemas de fagos bacterianos. Diversos investigadores han construido moléculas de dominios pequeños, en donde una puede presentar estructuras peptídicas aleatorias.

Aunque los agentes bioactivos candidatos pueden ser ácidos nucleicos o péptidos, las estructuras de presentación se utilizan preferentemente con agentes candidatos peptídicos. Así, las estructuras de presentación sintéticas, es decir polipéptidos artificiales, son capaces de presentar péptidos aleatorios como dominios restringidos conformacionalmente. En general, dichas estructuras de presentación comprenden una primera porción unida al extremo N-terminal del péptido aleatorio y una segunda porción unida al extremo C-terminal del péptido; es decir, el péptido se inserta en la estructura de presentación, aunque pueden realizarse variaciones, tal como se describió anteriormente. Para incrementar el aislamiento funcional del producto de expresión aleatorio, las estructuras de presentación se seleccionan o diseñan para tener una actividad biológica mínima cuando se expresan en una célula diana.

Las estructuras de presentación preferidas maximizan la accesibilidad del péptido al presentarlo en un bucle exterior. Según ello, las estructuras de presentación adecuadas incluyen, pero no se limitan a, estructuras de minicuerpos, bucles en giros de hojas betas y estructuras de tallo-rizo superenrolladas en donde los residuos no críticos para la estructura son aleatorios, dominios de dedos de zinc, estructuras unidas a cisteínas (disulfuros), estructuras unidas a transglutaminasas, péptidos cíclicos, estructuras de bucles B, barriles helicoidales o haces, motivos de cremalleras de leucina, etc.

En una realización preferida, la estructura de presentación es una estructura de rizo superenrollado, los que permite la presentación del péptido en un bucle exterior. Ver, por ejemplo, Myszka y col., Biochem. 33:2362-2373 (1994). Utilizando este sistema los investigadores han aislado péptidos capaces de una alta interacción con la diana adecuada. En general, las estructuras de rizo superenrollado permiten entre unas 6 a 20 posiciones aleatorias.

Una estructura de presentación de rizo superenrollada es la siguiente:

MGCAALESEVSALESEVASLESEVAAL GRDMP LAAVKSKLSAVKSKLASVKSKLAACGPP. Las regiones
subrayadas representan una región cremallera de leucinas de rizo superenrollado definida como antes (ver Martin y col., EMBO J 13822):5303-5309 (1994). Las regiones GRDMP en negrita representan la estructura en bucle y cuando se reemplaza de forma adecuada con péptidos aleatorios (p.ej., agentes bioactivos candidatos, en general se muestran aquí como (X)_{n}, en donde X es un residuo de aminoácido y n es un número entero de por lo menos 5 ó 6) que pueden tener una longitud variable. El reemplazamiento de la región en negrita se facilita por las dianas de endonucleasas de restricción codificadas en las regiones subrayadas, que permiten la incorporación directa de oligonucleótidos en estas posiciones. Por ejemplo, una realización preferida genera una diana XhoI en el sitio LE subrayado en doble y una diana HindIII en el sitio KL subrayado en doble.

En una realización preferida, la estructura de presentación es una estructura de minicuerpo. Un "minicuerpo" está compuesto esencialmente por una región de complementariedad mínima de anticuerpo. La estructura de presentación de minicuerpos proporciona generalmente dos regiones aleatorias, que en la proteína no plegada están presentes en una sola cara de la estructura terciaria. Ver por ejemplo, Bianchi y col., J. Mol. Biol. 236 (2).649-59 (1994), y referencias aquí citadas. Los investigadores han mostrado que este dominio mínimo es estable en solución y han utilizado sistemas de selección de fagos en librerías combinatoriales para seleccionar minicuerpos con regiones peptídicas que exhiben una afinidad elevada, Kd = 10^{-7}, para la citoquina pro-inflamatoria IL-6.

Una estructura de presentación de minicuerpos preferidos es la siguiente:

MGRNSQATS GFT F SHF YMEWVRGGEYIAASR HKNKY TTEYSASVKGRYIVSRDTSQSILYLQKKKG PP. Las regiones subrayadas y en negrita son regiones que pueden ser aleatorias. La fenilalanina en cursiva debe ser invariable en la primera región aleatoria. El péptido entero se clona en una variación de tres oligonucleótidos de la realización de rizo superenrrollado, permitiendo así que dos regiones aleatorias distintas se incorporen simultáneamente. Esta realización utiliza dianas BstXI no palindrómicas en sus extremos.

En una realización preferida, la estructura de presentación es una secuencia que contiene por regla general dos residuos de cisteína, de modo que se puede formar un enlace disulfuro, dando como resultado una secuencia restringida conformacionalmente. Esta realización se prefiere en particular cuando se utilizan secuencias de destinación de proteínas de secreción. Tal como se apreciará por los expertos en la materia, cualquier número de secuencias aleatorias, con o sin secuencias de unión o espaciadoras se pueden flanquear con residuos de cisteína. En otras realizaciones, las estructuras de presentación efectivas se pueden generar por las mismas regiones aleatorias. Por ejemplo, las regiones aleatorias se pueden "adulterar" con residuos de cisteína que, en las condiciones redox adecuadas, pueden dar como resultado conformaciones estructurales fuertemente unidas por enlaces cruzados, similar a una estructura de presentación. De forma similar, las regiones de aleatorización pueden controlarse para contener un cierto número de residuos que confieren estructuras de hoja \beta o hélice-\alpha.

En una realización preferida, la pareja de fusión es una secuencia de destinación de proteínas. Tal como se apreciará por los expertos en la materia, la localización de proteínas dentro de una célula es un procedimiento sencillo para aumentar la concentración efectiva y determinar la función. Por ejemplo, cuando RAF1 se localiza en la membrana de la mitocondria, puede inhibir el efecto anti-apoptótico de BCL2. De forma similar, Sos unido a membrana induce la señalización mediada por Ras en los linfocitos T. Estos mecanismos se cree que se basan en el principio de limitación del espacio de búsqueda para los ligandos, es decir, la localización de una proteína en la membrana plasmática limita la búsqueda de su ligando al espacio dimensional limitado cerca de la membrana, en oposición con el espacio tridimensional del citoplasma. Alternativamente, la concentración de una proteína puede también aumentarse simplemente por la naturaleza de la localización. Transportar las proteínas al núcleo, las confina en un espacio menor por lo que se incrementa su concentración. Por último, el ligando o la diana pueden localizarse simplemente en un compartimento específico, con lo que los inhibidores deben localizarse de forma adecuada.

Así, las secuencias adecuadas de destinación de proteínas incluyen, pero no se limitan a, secuencias de unión capaces de causar la unión del producto de expresión con una molécula predeterminada o clase de moléculas, siempre que retengan la bioactividad del producto de expresión, (por ejemplo utilizando un inhibidor enzimático o secuencias básicas para marcar una diana o clase de enzimas relevantes); secuencias de señalización de degradación selectiva de la misma proteína o de proteínas co-unidas; y secuencias de señalización capaces de localizar constitutivamente los productos de expresión del candidato en una localización celular predeterminada, incluyendo: a) localizaciones subcelulares como el aparato de Golgi, el retículo endoplasmático, el núcleo, el nucleolo, la membrana nuclear, las mitocondrias, los cloroplastos, las vesículas secretoras, los lisosomas y la membrana celular; y b) localizaciones extracelulares mediante una señal secretora. Se prefiere en particular la localización subcelular o externa de la célula mediante secreción.

En una realización preferida, la secuencia de destinación de proteínas es una señal de localización nuclear (NLS). Las NLSs son generalmente cortas, tienen dominios cargados positivamente (básicos) que sirven para dirigir la proteína completa al núcleo de la célula. Se han publicado numerosas secuencias aminoacídicas de NLS, incluyendo las NLSs básicas sencillas del antígeno T grande de SV40 (virus de mono) (Pro Lys, Lys Lys Arg Lys Val), Kalderon (1984), y col., Cell, 39:499-509; la señal de localización nuclear del receptor-\beta del ácido retinoico humano (ARRRRP); NF\kappaB p50 (EEVQRKRQL; Ghoshe y col., Cell 62:1019 (1990); NF\kappaB p65 (EEKRKRTYE; Nolan y col., Cell 64:961 (1991); y otros (ver por ejemplo Boulikas, J. Cell. Biochem. 55(1):32-58 (1994) y NLSs básicos dobles ejemplificados por la proteína de Xenopus (sapo de uñas africano), la nucleoplasmina (Ala Val Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Lys Lys Lys Lys Leu Asp), Dingwall y col., Cell, 30:449-458, 1982 y Dingwall y col., J. Cell Biol., 107:641-849; 1988). Numerosos estudios de localización han demostrado que las NLSs incorporadas en péptidos sintéticos o injertados en proteínas reporteras, no dirigidas normalmente al núcleo de la célula, causan que estos péptidos y proteínas reporteras se concentren en el núcleo. Ver, por ejemplo, Dingwall y Laskey, Ann. Rev. Cell Biol., 2:367-390, 1986; Bonnerot, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:6795-6799, 1987; Galileo, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:458-462, 1990.

En una realización preferida, la secuencia de destinación de proteínas es una secuencia señal de anclaje a membrana. Esto es particularmente útil ya que muchos parásitos y patógenos se unen a la membrana, además del hecho de que muchos sucesos intracelulares se originan en la membrana plasmática. Así, las librerías de péptidos unidos a membrana son útiles tanto para la identificación de elementos importantes en estos procesos, como para el descubrimiento de inhibidores efectivos. La invención proporciona procedimientos para la presentación del producto de expresión aleatorio en el exterior de la célula o en el espacio citoplasmático; ver la Fig. 3. Para la expresión extracelular, se proporciona una región de anclaje a membrana en el extremo carboxi-terminal de la estructura de presentación del péptido. La región del producto aleatorio de expresión se expresa en la superficie celular y se expone al espacio extracelular, para que pueda unirse a otras moléculas de superficie (afectando su función) o a moléculas presentes en el medio extracelular. La unión de dichas moléculas proporcionaría una función a las células que expresen un péptido que se une a la molécula. La región citoplasmática podría ser neutral o podría contener un dominio que, cuando se une la región del producto de expresión aleatoria extracelular, proporciona una función a las células (activación de una quinasa, fosfatasa, unión de otros componentes celulares para efectuar la función). De modo similar, la región que contiene el producto aleatorio de expresión podría estar contenida dentro de una región citoplasmática, y la región transmembrana y la extracelular permanecerían constantes o tendrían una función definida.

Las secuencias de anclaje a membrana son bien conocidas en la materia y se basan en la geometría genética de moléculas transmembrana de mamíferos. Los péptidos se insertan en la membrana dependiendo de una secuencia señal (denominada ssTM) que requiere un dominio transmembrana hidrofóbico (TM). Las proteínas transmembrana se insertan en la membrana de tal modo que las regiones codificadas en 5' del dominio transmembrana son extracelulares y las secuencias 3', intracelulares. Desde luego, si estos dominios transmembrana se colocan en 5' de la región variable, servirán para el anclaje como un dominio intracelular, que puede ser deseable en algunas realizaciones. Las secuencias ssTMs y TMs son conocidas para una amplia variedad de proteínas de unión a membrana y en consecuencia, estas secuencias pueden utilizarse bien como parejas procedentes de una proteína en particular o tomando cada uno de lo componentes de una proteína distinta, o alternativamente, las secuencias pueden ser sintéticas y derivarse en su totalidad de secuencias consenso como dominios de liberación artificial.

Como podrá apreciarse por los expertos en la materia, las secuencias de anclaje a membrana, incluyendo las ssTM y TM son conocidas para una gran variedad de proteínas y cualquiera de ellas puede utilizarse. Las secuencias de anclaje a membrana preferidas en particular incluyen, pero no se limitan a, las derivadas de CD8, ICAM-2, IL-8R, CD4 y LFA-1.

Las secuencias útiles incluyen secuencias de: 1) proteínas de membrana integral de clase I como la cadena beta del receptor Il-2 (los residuos 1-26 son la secuencia señal, 241-265 son los residuos transmembrana; ver Hatakeyama y col., Science 244:551 (1989) y von Heijne y col., Eur. J. Biochem. 174:671 (1988)) y la cadena beta del receptor de la insulina (los residuos 1-27 son la secuencia señal, 957-959 son el dominio transmembrana y 960-1382 son el dominio citoplasmático; ver Hatakeyama, supra, y Ebina y col., Cell 40:747 (1985)); 2) proteínas de la membrana integral de clase II como la endopeptidasa neutra (los residuos 29-51 son el dominio transmembrana, 2-28 son el dominio citoplasmático; ver Malfroy y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 144:59 (1987)); 3) proteínas de tipo III como el citocromo humano P450 NF25 (Hayakeyama, supra); y 4) proteínas de tipo IV como la P-glicoproteína (Hatakeyama, supra). Se prefieren en especial CD8 e ICAM-2. Por ejemplo, las secuencias señal de CD8 e ICAM-2 se hallan en el extremo 5' terminal del transcrito. Estas consisten de los aminoácidos 1-32 en el caso de CD8 (MASPLTRFLSLNLLLLGESILGSGEAKPQAP; Nakauchi y col., PNAS USA 82:5126 (1985) y 1-21 en el caso de ICAM-2 (MSSFGYRTLTVALFTLICCPG; Staunton y col., Nature (London) 339:61 (1989)). Estas secuencias líder liberan la construcción en la membrana mientras que los dominios transmembrana hidrofóbicos situados en 3' de la región candidata aleatoria, sirven de anclaje para la construcción en la membrana. Estos dominios transmembrana están comprendidos por los aminoácidos 145-149 de CD8 (PQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICYHSR; Nakauchies, supra) y 224-256 de ICAM-2 (MVIIVTWSVLLSLFVTSVLLCFIFGQHLRQQR; Staunton, supra).

Alternativamente, las secuencias de anclaje a membrana incluyen el anclaje de GPI, que da como resultado un enlace covalente entre la molécula y la bicapa lipídica mediante un enlace glicosil-fosfatidilinositol por ejemplo en DAF (PNKGSGTTSGTTRLLSGHTCFTLTGLLGTLVYMHLLT, siendo la serina en negrita el aminoácido de anclaje; ver Homans y col., Nature 333 (6170):269-72 (1988) y Moran y col., J. Biol. Chem. 266:1250 (1991)). Con el fin de realizar lo descrito anteriormente, la secuencia GPI de Thy-1 puede introducirse en una caja 3' de la región variable en lugar de una secuencia transmembrana.

De forma similar, las secuencias de miristilación pueden servir como secuencias de anclaje de membrana. Es sabido que la miristilación de c-src lo recluta en la membrana plasmática. Esto es un procedimiento sencillo y efectivo de localización de membrana, ya que los 14 primeros aminoácidos de la proteína son los únicos responsables para esta función: MGSSKSKPKDPSQR (ver Cross y col., Mol. Cell Biol. 4(9):1834 (1984); Spencer y col., Science 262:1019-1024 (1993). Este motivo ha demostrado que es efectivo en la localización de genes reporteros y que puede utilizarse para anclar la cadena zeta del TCR. Este motivo se coloca 5' de la región variable con el fin de localizar la construcción en la membrana plasmática. Otras modificaciones como la palmitoilación pueden utilizarse para anclar las construcciones en la membrana plasmática; por ejemplo, las secuencias de palmitoilación de la secuencia del receptor quinasa acoplado a proteína G (LLQRLFSQDCCGNCSDSEEELPTRL, siendo las cisteínas en negrita palmitoiladas; Stoffel y col., J. Biol. Chem. 269:27791 (1994)); de la rodopsina (KQFRNCMLTSLCCGKNPLGD; Bamstable y col., J. Mol. Neurosci. 5(3):207 81994)); y la proteína p21 H-ras (LNPPDESGPGCMSCKCVLS; Capon y col., Nature 302:33 (1983)).

En una realización preferida, las secuencia de destinación de proteínas es una secuencia de destinación lisosomal, incluyendo, por ejemplo, una secuencia de degradación lisosomal como Lamp-2 (KFERQ; Dice, Ann.N.Y. Acad. Sci. 674:58 (1992); o las secuencias de membranas lisosomales de Lamp-1 (MLIPIAGFFALAGLVLIVLIAYLIYLI GRKR
SHAGYQTI, Uthayakumar y col., Cell Mol. Biol. Res. 41:405 (1995)) o Lamp-2 (LVPIAVGAALAGVLILVLLAYFI GLK
HHHAGYEQF, Konecki y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 205:1-5 (1994), mostrando ambas los dominios transmembrana en cursiva y el citoplasmático subrayado).

Alternativamente, las secuencias de destinación de proteínas puede ser una secuencia de localización mitocondrial, incluyendo secuencias matrices mitocondriales (p.ej., la alcohol deshidrogenasa III de levadura; MLRTSSL
FTRRVQPSLFSRNILRLQST; Schatz, Eur. J. Biochem. 165:1-6 (1987)); las secuencias de membrana interna mitocondriales (subunidad IV de la citocromo c oxidasa de levadura: MLSLRQSIRFFPATRTLCSSRYLL; Schatz, supra); secuencias del espacio intermembranal mitocondrial (citocromo c1 de levadura; MFSMLSKRWAQRTLSKSFYSTA
TGAASKSGKLTQKLVTAGVAAAGITASTLLYADSLTAEMTA; Schatz, supra) o secuencias de membrana externa mitocondrial (proteína de membrana externa de 70 KD de levadura, incluyendo las secuencias de la calreticulina (KDEL; Pelham, Royal Society London Transactions B; 1-10 (1992)) o la proteína del adenovirus E3/19K (LYLSRR
SFIDEKKMP; Jackson y col., EMBO J 9:3153 (1990).

Además, las secuencias de destinación también incluyen las secuencias de peroxisomas (por ejemplo, la secuencia de la matriz peroxisomal de la Luciferasa; SKL; Keller y col., PNAS USA 4:3264 (1987)); las secuencias de farnesilación (por ejemplo, p21 H-ras; LNPPDESGPGCMSCKCVLS, con las cisteína farnesilada en negrita; Capon, supra); las secuencias de geranilgeranilación (por ejemplo, la proteína rab-5A; LTEPTQPTRNQCCSN, con las cisteínas de geranilgeranilación en negrita; Farnsworth, PNAS USA 91:11963 (1994)); o las secuencias de destrucción (ciclina B1; RTALGDIGN; Klotzbucher y col., EMBO J 1:30053 (1996)).

En una realización preferida, la secuencia de destinación es una secuencia señal secretora capaz de realizar la secreción del producto de traducción candidato. Existe un gran número de secuencias señales secretoras que están colocadas en 5' de la región peptídica variable y son cortadas de la región peptídica para realizar la secreción al espacio extracelular. Las secuencias secretoras y su transferabilidad en relación con las proteínas es bien conocida, p.ej., Silhavy y col., (1985) Microbiol. Rev. 49, 398-418. Esto es de particular utilidad para generar un péptido capaz de unirse a la superficie de, o afectar la fisiología de, una célula diana que sea distinta a la célula huésped, p.ej., la célula que expresa el péptido. En una aproximación preferida, un producto de fusión se configura para contener, en serie, el péptido señal de secreción-estructura de presentación-región del producto de expresión aleatorio-estructura de presentación. De esta forma, las células diana crecen en la vecindad de células que expresan la librería de péptidos y se hallan bañadas en el medio donde se secreta el péptido. Las células diana que presentan un cambio fisiológico en la respuesta a la presencia de un péptido, p.ej., por la unión del péptido a un receptor de superficie o por su internalización y unión a dianas intracelulares, y las células secretoras se localizan mediante cualquiera de los diversos esquemas de selección, determinándose el péptido causante del efecto en particular. Ejemplos de efectos incluyen diversas citoquinas diseñadas (p.ej., un factor de célula madre capaz de causar la división de las células madres hematopoyéticas y de mantener su totipotencialidad), un factor causante de que las células cancerosas lleven a cabo la apoptosis espontánea, un factor que se une a la superficie celular de células diana y las marca de forma específica, etc.

Las secuencias secretoras adecuadas son conocidas, incluyendo señales de IL-2 (MYRMQLLSCIALSLALVTNS; Villinger y col., J. Immunol. 155:3946 (1995)), la hormona de crecimiento (MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQE
GSAFPT; Rosakum y col., Nucleic Acids Res 7:30 (1979)); preproinsulina (MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAA
FVN; Bell y col., Nature 284:26 (1980)); y la proteína HA de influencia (MKAKLLVLLYAFVAGDQI; Sekiwawa y col., PNAS 80:3563)), con el corte entre la unión no-subrayada-subrayada. Una secuencia señal secretora preferida es la secuencia señal líder de la citoquina IL-4 secretada, que comprende los primeros 24 aminoácidos de la IL-4 de la manera siguiente: MGLTSQLLPPLFFLLACAGNFVHG.

En una realización preferida, la pareja de fusión es una secuencia de rescate. Una secuencia de rescate es una secuencia que puede solicitarse para purificar o aislar el agente candidato o el ácido nucleico que lo codifica. Así, por ejemplo, las secuencias de rescate peptídicas incluyen las secuencias de purificación, como la etiqueta de His6 para utilizar con las columnas de afinidad de Ni y las etiquetas epitópicas para la detección, la inmunoprecipitación o el FACS (selector de células activadas por fluorescencia). Las etiquetas epitópicas adecuadas incluyen la de myc (para utilizar con el anticuerpo 9E10 disponible comercialmente), la secuencia diana de biotinilación BSP de la enzima bacteriana BirA, etiquetas flu, lacZ y GST.

Alternativamente, la secuencia de rescate puede ser una única secuencia oligonucleotídica que sirva como una sonda diana para permitir el aislamiento rápido y fácil de la construcción retroviral, mediante PCR, técnicas relacionadas, o la hibridación.

En una realización preferida, la pareja de fusión es una secuencia de estabilidad, que confiere estabilidad al agente bioactivo candidato o al ácido nucleico que lo codifica. Así, por ejemplo, los péptidos se pueden estabilizar mediante la incorporación de glicinas después de la metionina de iniciación (MG o MGG0), para la detección del péptido para la ubiquitinación, de acuerdo con la regla del extremo N-terminal de Varshavsky, que confiere una larga vida media citoplasmática.

De forma similar, dos prolinas en el extremo C-terminal transmiten una mayor resistencia a los péptidos frente a la acción de la carboxipeptidasa. La presencia de dos glicinas antes de las prolinas proporciona flexibilidad y evita que los efectos iniciados en las dos prolinas se propaguen por la estructura peptídica del candidato. Así, las secuencias de estabilidad preferidas son las siguientes: MG(X)_{n}GGPP, en donde X es cualquier aminoácido y n es un número entero de por lo menos cuatro.

En una realización, la pareja de fusión es una secuencia de dimerización. Una secuencia de dimerización permite la asociación no covalente de un péptido aleatorio con otro péptido, con la suficiente afinidad para permanecer asociada en condiciones fisiológicas normales. Ello permite efectivamente que librerías pequeñas de péptidos aleatorios (por ejemplo 10^{4}) se conviertan en librerías mayores si se generan dos péptidos por célula que luego dimerizan para formar una librería de 10^{8} (10^{4} x 10^{4}). Ello también permite la formación de péptidos aleatorios mayores, si fuera necesario, o de moléculas de péptidos aleatorios estructuralmente más complejas. Los dímeros pueden ser homo- u heterodímeros.

Las secuencias de dimerización pueden ser una secuencia señal que se agrega con ella misma, o dos secuencias, cada una de las cuales se genera en una construcción retroviral distinta. Es decir, ácidos nucleicos que codifican para un primer péptido aleatorio con una secuencia 1 de dimerización y un segundo péptido aleatorio con una secuencia 2 de dimerización, de modo que tras la introducción en una célula y la expresión del ácido nucleico, la secuencia 1 de dimerización se asocia con las secuencia 2 de dimerización para formar una nueva estructura peptídica.

Las secuencias de dimerización abarcarán una gran variedad de secuencias. Son conocidos todos los sitios de interacción proteína-proteína. Además, las secuencias de dimerización también pueden elucidarse utilizando procedimientos estándares como el sistema del doble híbrido de levadura, los estudios bioquímicos tradicionales de afinidad de unión, o incluso utilizando los actuales procedimientos.

Las parejas de fusión pueden colocarse en cualquier parte de la estructura (es decir, N-terminal, C-terminal e internamente) mientras la biología y la actividad lo permitan.

En una realización, la pareja de fusión incluye una secuencia de unión o de ligamiento, generalmente descrita en la PCT US97/01019, que puede permitir que los agentes candidatos interactúen con dianas potenciales sin estorbos. Por ejemplo, cuando el agente bioactivo candidato es un péptido, los engarces útiles incluyen polímeros de glicina-serina (incluyendo, por ejemplo, (GS)_{n}, (GSGG)_{n} y (GGGS)_{n}, en donde n es un número entero de al menos uno), los polímeros glicina-alanina, polímeros de alanina-serina y otros engarces flexibles como la ligadura para el canal de descarga de potasio y una gran variedad de otros engarces flexibles, tal como se apreciará por los expertos en la materia. Los polímeros glicina-serina son preferibles ya que ambos aminoácidos están relativamente no estructurados y en consecuencia pueden ser capaces de servir como una ligadura neutra entre los componentes. En segundo lugar, la serina es hidrofílica y en consecuencia es capaz de solubilizar lo que podría ser una cadena de glicina globular. En tercer lugar, cadenas similares han demostrado ser efectivas en la unión de subunidades de proteínas recombinantes, como por ejemplo los anticuerpos de cadena sencilla.

Además, las parejas de fusión, incluyendo las estructuras de presentación, pueden modificarse, modificarse aleatoriamente, y/o madurarse para alterar la orientación de presentación del producto aleatorio de expresión. Por ejemplo, puede modificarse los determinantes en la base del bucle para alterar ligeramente la estructura terciaria del bucle interno, mientras se mantiene la secuencia aminoacídica aleatoria.

En una realización preferida, se utilizan las combinaciones de parejas fusionadas. Así, por ejemplo, se puede utilizar cualquier número de combinaciones de estructuras de presentación, secuencias de destinación, secuencias de rescate y secuencias de estabilidad con o sin secuencias engarces.

Así, los agentes candidatos pueden incluir estos componentes y a continuación pueden utilizarse para generar una librería de fragmentos, conteniendo cada uno una secuencia de nucleótidos distintos que pueden codificar un péptido distinto. Los productos de ligamiento se transforman a continuación en la bacteria, como E. coli y el DNA se prepara a partir de la librería resultante, tal como se describió en general por Kitamura, PNAS USA 92:9146-9150 (1995), referencia incorporada aquí.

La liberación de la librería de DNA en un sistema de empaquetamiento retroviral da como resultado la conversión de virus infecciosos. Líneas celulares del sistema de empaquetamiento retroviral adecuadas incluyen, pero no se limitan a, las líneas celulares Bing y BOSC23 las descritas en la patente internacional WO 94/19478; Soneoka y col., Nucleic Acid Res. 23(4):628 (1995); Finer y col., Blood 83:43 (1994); las líneas de empaquetamiento Phoenix como PhiNX-eco y PhiNX-ampho, descritas más adelante; 229T + gag-pol y la cubierta del retrovirus; PA317; y líneas celulares descritas en Markowtiz y col., Virology 167:400 (1988), Markowitz y col., J. Virol. 62:1120 (1988), Li y col., PNAS USA 93:11658 (1996), Kinsella yc ol., Human Gene Therapy 7:1405 (1996). Los sistemas preferidos incluyen las líneas celulares PhiNX-eco y PhiNX-ampho o similares, descritas en PCT US97/0109.

Cuando las células no se están replicando, se pueden utilizar otros vectores virales, incluyendo los vectores adenovirales, los vectores inmunovirales felinos (FIV), etc.

En una realización preferida, cuando el agente candidato se introduce en las células utilizando un vector viral, el agente peptídico candidato se une a una molécula detectable y los procedimientos de la invención incluyen por lo menos un ensayo de expresión. Un ensayo de expresión es un ensayo que permite determinar si un agente bioactivo candidato se ha expresado, es decir, si un agente peptídico candidato está presente en la célula. Así, uniendo la expresión de un agente candidato con la expresión de una molécula detectable como un marcaje, se puede determinar la presencia o ausencia del agente peptídico candidato. Según ello, en esta realización, el agente candidato está unido operativamente a una molécula detectable. En general, esto se realiza creando un ácido nucleico de fusión. El ácido nucleico de fusión comprende un primer ácido nucleico que codifica para el agente bioactivo candidato (que puede incluir parejas de fusión, tal como se indicó anteriormente), y un segundo ácido nucleico que codifica para una molécula detectable. Los términos "primero" y "segundo" no significan que proporcionen una orientación de las secuencias con respecto a la orientación 5'-3' del ácido nucleico de fusión. Por ejemplo, asumiendo una orientación 5'-3' de la secuencia de fusión, el primer ácido nucleico puede estar localizado tanto en 5' o 3' del segundo ácido nucleico. Las moléculas preferidas en esta realización incluyen, pero no se limitan a, proteínas fluorescentes, incluyendo GFP, YFP, BFP y RFP, siendo la primera, la preferida.

En general, los agentes candidatos se añaden a las células (bien extracelular o intracelularmente, tal como se indicó anteriormente) en condiciones de reacción que favorecen las interacciones agente-diana. Habitualmente, éstas serán condiciones fisiológicas. Las incubaciones se pueden realizar a cualquier temperatura que facilite la actividad óptima, típicamente entre 4 y 40ºC. Los períodos de incubación se seleccionan para una actividad óptima, pero también se pueden optimizar para facilitar un rastreo rápido y de alto rendimiento. En general, será suficiente entre 0,1 y 1 hora. Generalmente, el reactivo en exceso se elimina o se extrae mediante lavados.

Se pueden incluir una variedad de otros reactivos en los ensayos. Estos reactivos incluyen sales, proteínas neutras, p.ej., la albúmina, los detergentes, etc., que pueden utilizarse para facilitar la unión óptima proteína-proteína y/o reducir las interacciones inespecíficas o el ruido de fondo. También se pueden utilizar reactivos que mejoren la eficiencia del ensayo, como los inhibidores de proteasas, inhibidores de nucleasas, agentes anti-microbianos, etc. La mezcla de componentes puede añadirse en cualquier orden siempre que se permita la detección. El lavado o aclarado de células se realizará, según se estime por los expertos en la materia, en tiempos diferentes y puede incluir la utilización de filtración y centrifugación. Cuando se utilizan las moléculas de un segundo marcaje (también referidas aquí como "marcajes secundarios"), se añaden preferentemente después de eliminar el exceso de moléculas diana no unidas, con el fin de reducir la unión no específica; sin embargo, en algunas circunstancias, todos los componentes pueden añadirse simultáneamente.

En una realización preferida, las células se seleccionan utilizando un aparato seleccionador de células activado por fluorescencia (FACS). En la presente invención, la regulación del ciclo celular se evalúa mediante múltiples parámetros que dan como resultado un ruido de fondo reducido y mayor especificidad. Ya se había utilizado con anterioridad el FACS para evaluar dos características distintas o no relacionadas al mismo tiempo, que identificaban las células que poseen ambas características, pero al contrario que la presente invención no se redujo el ruido de fondo para las características combinadas.

De este modo, las células se seleccionan o enriquecen en un FACS dependiendo de uno o más ensayos, incluyendo un ensayo de viabilidad celular, un ensayo de proliferación, un ensayo de fase celular y (cuando los agentes candidatos se expresan con moléculas detectables) un ensayo de expresión. Los resultados de uno o más de estos ensayos se comparan con las células que no se expusieron al agente bioactivo candidato, o con las mismas células antes de la introducción del agente candidato. Las alteraciones en estos resultados pueden indicar que dicho agente modula la regulación del ciclo celular.

Un valor positivo de la presente invención es que una librería de agentes candidatos puede analizarse en una librería de células, porque los procedimientos actuales permiten la selección de una sola célula, con una especificidad extremadamente elevada, de modo que incluso se pueden detectar eventos muy raros. La utilización de múltiples haces de láser permite una selección exacta de 1 en 10^{6} con una precisión superior al 70%.

La presente invención puede, además de identificar las muchas propiedades de la regulación del ciclo celular, combinarse con la identificación de otras características celulares. Por ejemplo, se pueden determinar los parámetros de salud celular general y seleccionar para su utilización p.ej., utilizando el colorante Indo-1, indicador de la respuesta del calcio. Otros parámetros celulares que se identifican rutinariamente por el experto en la materia incluyen pero no se limitan a: el tamaño celular, la forma celular, el estadio redox, el contenido de DNA, la secuencia de ácido nucleico, la estructura de la cromatina, el contenido de RNA, la proteína total, los antígenos, los lípidos, las proteínas de superficie, los receptores intracelulares, el metabolismo oxidativo, la síntesis del DNA y la degradación y el pH intracelular.

En una realización preferida, cada una de las cuantificaciones se determina simultáneamente a partir de una célula individual a medida que pasa a través de las trayectorias de los haces de láser. Alternativamente, las cuantificaciones se realizan secuencialmente. Utilizando más de un parámetro para detectar la regulación del ciclo celular o las alteraciones en la regulación del ciclo celular, el ruido de fondo se reduce y se incrementa la especificidad. Las células que cumplen con los parámetros de las propiedades deseadas se pueden separar físicamente de las células que no logran los parámetros deseados, o se pueden identificar por su porcentaje en la población celular.

En general, es preferible una K_{D} de \leq 1 \muM, para permitir la retención de la unión en presencia de fuerzas de corte en la actual selección por FACS. En una realización preferida, las células se clasifican a diferentes velocidades, por ejemplo a 5000 o más eventos de selección por segundo, preferiblemente a más de 10.000 eventos de selección por segundo y todavía más preferentemente a aproximadamente 25.000 eventos de selección por segundo, y en especial se prefieren velocidades superiores a aproximadamente 50.000 a 100.000 eventos por segundo.

Las células procesadas para la estimulación y la tinción se resuspenden en general en tampón y se filtran antes de realizar la citometría. Las células se pueden analizar utilizando un FACSCAN (Becton Dickinson Inc., rayo de láser de 488 nm) o un Mo-Flo Cytometer (Cytomation, Inc., rayos láser de 350 nm de ancha banda (UV), 488 nm y 647 nm). Las células se separan, si se desea, utilizando el Mo-Flo.

Si las células se analizan por microscopía, las células post-estimulación o tinción se montan en general sobre portaobjetos y con cubreobjetos; a continuación se visualizan directamente mediante microscopía de campo claro y fluorescencia en un microscopio invertido (por ejemplo, TE300, Nikon) utilizando grupos de filtros estándares BFP, FITC, o TRITC (por ejemplo). Las imágenes también se pueden obtener utilizando un microscopio de rastreo confocal invertido (Zeiss, Inc''Bio-Rad, Inc.) utilizando grupos de filtros estándares FITC y TRITC, por ejemplo.

La selección da como resultado una población de células con las propiedades deseadas. En una realización preferida, los parámetros se fijan para identificar por lo menos un agente bioactivo candidato que module la regulación del ciclo celular.

En una realización preferida, se caracteriza el agente bioactivo. Esto se realizará tal como se apreciará por los expertos en la materia y en general incluye un análisis de la estructura, la identidad, la afinidad de unión y la función del agente. En general, una vez identificado, el agente bioactivo se resintetiza y combina con la diana celular para verificar la modulación de la regulación del ciclo celular en diversas condiciones y en presencia o ausencia de diversos agentes. El agente bioactivo se puede preparar en una cantidad efectiva terapéuticamente para modular la regulación del ciclo celular y combinar con un vehículo farmacéutico adecuado.

En una realización preferida, las poblaciones celulares pueden someterse a diversas condiciones experimentales, con o sin los agentes candidatos. Los cambios en las condiciones incluyen pero no se limitan a cambios en el pH, la temperatura, el tampón o la concentración de sal, etc. En una realización preferida, el pH se cambia, generalmente por un pH aumentado o disminuido, generalmente desde aproximadamente 0,5 a 3 unidades de pH. Alternativamente, se altera la temperatura, con incrementos o disminuciones de aproximadamente 5ºC a preferentemente 30ºC. De modo similar, la concentración de sal se puede modificar, con incrementos o disminuciones de aproximadamente 0,1 M a preferentemente 2 M.

El experto en la materia entenderá que se puede variar el orden de las etapas de los ensayos que aquí se proporcionan. También se debe entender, sin embargo, que aunque en la presente invención se proporcionan diversas opciones (de compuestos, propiedades seleccionadas u orden de las etapas), también se proporcionan las opciones individualmente y pueden derivarse de forma individual de las otras opciones aquí especificadas. Además, se hallan dentro del ámbito de la invención las etapas que son obvias y conocidas en la materia y que ayudarán a incrementar la sensibilidad del ensayo. Por ejemplo, pueden existir etapas adicionales de lavado, o etapas de separación, o aislamiento. Además, se debe entender que en algunos casos la detección se realiza en las células, pero también puede llevarse a cabo en el medio o vice versa.

En una realización preferida, el fenotipo celular es la exocitosis y los procedimientos y composiciones de la invención se dirigen a la detección de alteraciones en la exocitosis, utilizando de nuevo un aparato de FACS. Existen diversos parámetros que pueden evaluarse o analizarse para permitir la detección o las alteraciones en las vías exocíticas, incluyendo pero sin limitarse a, la dispersión de luz, la incorporación de colorante fluorescente, la liberación de colorante fluorescente, la exposición de gránulos, la actividad enzimática en la superficie de gránulos y la cantidad de proteínas específicas de gránulos. Analizando o cuantificando uno o más de estos parámetros, es posible detectar no sólo alteraciones en la exocitosis, sino alteraciones en diferentes etapas de la vía de exocitosis. Además, el análisis multiparamétrico también reduce el ruido de fondo, o los "falsos positivos", que se detectan. De esta manera, se puede realizar un rastreo rápido y exacto de los agentes candidatos para identificar agentes que modulen la exocitosis.

En una realización preferida, la invención proporciona los procedimientos para el rastreo de alteraciones en la exocitosis de una población de células. Por "alteración" o "modulación" en el contexto de exocitosis se hace referencia a una disminución o a un incremento en la cantidad de exocitosis en una célula, comparada con otra célula o con la misma célula en condiciones distintas. Las cuantificaciones se pueden determinar siendo todas las condiciones las mismas para cada medida, o con condiciones diversas, con o sin agentes bioactivos, o en estadios distintos del proceso de exocitosis. Por ejemplo, una cuantificación de exocitosis se puede determinar en una población celular, en donde un agente bioactivo candidato está presente y en donde el agente bioactivo candidato está ausente. En otro ejemplo, se realizan las cuantificaciones de exocitosis en poblaciones de células, en donde la condición o el entorno de éstas difieren unas de otras. Por ejemplo, las células se pueden evaluar en presencia o ausencia de señales fisiológicas, como los inductores exocíticos (por ejemplo, Ca^{++}, ionomicina, etc.), las hormonas, los anticuerpos, los péptidos, los antígenos, las citoquinas, los factores de crecimiento, los potenciales de acción u otras células (p.ej., contactos célula-célula). En otro ejemplo, las cuantificaciones de exocitosis se determinan en diferentes estadios del proceso de exocitosis. En otro ejemplo más, las cuantificaciones de exocitosis se realizan en condiciones iguales y las alteraciones se hallan entre una célula o una población celular y otra célula o población celular.

El término "población de células" tal como se utiliza aquí hace referencia a una muestra de células. En esta realización, las células son preferentemente (pero no necesariamente) de crecimiento rápido, infectables por retrovirus y compatibles con los colorantes y anticuerpos. Los tipos celulares para utilizar en esta realización, incluyen, pero no se limitan a, mastocitos, neuronas, células cromafinas adrenales, basófilos, las células endocrinas incluyendo las células \beta pancreáticas, las células acinares pancreáticas incluyendo las células exocrinas, los neutrófilos, los monocitos, los linfocitos, las células mamarias, el esperma, los óvulos y los leucocitos PMN, las células endoteliales, los adipocitos y las células musculares.

Los procedimientos exocíticos comprenden la selección de células en un aparato de FACS mediante el análisis de las alteraciones en por lo menos tres de las propiedades seleccionadas del grupo consistente de: dispersión de luz, incorporación de colorante fluorescente, liberación de colorantes fluorescente, exposición de gránulos, actividad enzimática en superficie de gránulos y la cantidad de proteínas específicas de gránulos. En una realización preferida, cada una de las cuantificaciones se determina simultáneamente en una célula individual a medida que pasa a través de las trayectorias de los haces de múltiples lásers. Alternativamente, las cuantificaciones se realizan secuencialmente. Utilizando más de un parámetro para detectar la exocitosis o las alteraciones en la exocitosis, se reduce el ruido de fondo y se incrementa la especificidad. Las células que cumplen con los parámetros de las propiedades deseadas se pueden separar físicamente de las células que no los cumplen, o pueden identificarse por su porcentaje en la población celular.

En una realización preferida, se analizan los cambios en la dispersión de la luz para determinar las alteraciones en la exocitosis en una población de células. Cuando se visualizan en el FACS, las células tienen características particulares tal como se cuantificó mediante sus propiedades de dispersión de luz frontal y a 90ºC (lateral). Estas propiedades de dispersión representan el tamaño, la forma y el contenido de gránulos de las células. Después de la activación con un estímulo pro-exocítico, las propiedades celulares de dispersión de luz frontal y lateral cambian de forma considerable. Estas propiedades tienen en cuenta dos parámetros a cuantificar como una lectura del evento exocítico. Estas propiedades cambian en proporción con la magnitud de la exocitosis de las células y dependen así mismo del tiempo de duración de los eventos exocíticos. Las alteraciones en la intensidad de la dispersión de luz, o del índice de refracción celular indican alteraciones en la exocitosis en la misma célula a tiempos distintos, o comparados con la misma célula en condiciones distintas o con agentes bioactivos candidatos presentes o ausentes, o comparados con células o poblaciones distintas.

En una realización de la presente invención, una población celular se combina con un agente que se sabe estimula la exocitosis y se determinan las propiedades de dispersión de la luz. Las células con propiedades de dispersión de luz, indicativo de una actividad exocítica deseable, se pueden almacenar y/o separar. La actividad exocítica, tal como se utiliza aquí, incluye la falta de actividad. En una realización preferida, los agentes bioactivos candidatos se combinan con la población celular antes de, o con el estímulo exocítico, tal como se detalla de forma más completa más adelante. En esta realización, cuando las propiedades de dispersión de luz difieren entre a) una población combinada con un estímulo exocítico conocido y un agente bioactivo candidato y b) una población celular combinada con un estímulo exocítico conocido, en donde el agente bioactivo candidato está ausente, se puede determinar si el agente bioactivo candidato modula la exocitosis. Puede ser deseable en algunos casos incluir un inhibidor de exocitosis o excluir el estímulo exocítico para identificar qué agentes bioactivos inducen la exocitosis. Preferentemente, se cuantifican las propiedades de dispersión de luz en combinación con por lo menos una y preferentemente otras dos propiedades que indican la actividad exocítica. Las metodologías generales para las cuantificaciones de la dispersión de la luz se describen en Perretti y col., J. Pharmacol. Methods, 23(3):187-194 (1990) y Hide y col., J. Cell Biol., 123(3):585-593 (1993). En general, son preferibles cambios en por lo menos el 5% respecto al nivel basal, preferentemente de por lo menos el 25%, más preferentemente de por lo menos el 50% y todavía más preferentemente del 75% al 100%. El nivel basal en este caso hace referencia en general a las propiedades celulares de dispersión de la luz antes de la estimulación exocítica. En cada caso proporcionado aquí, el nivel basal se puede ajustar para cualquier parámetro control. Por ejemplo, el nivel basal puede ajustarse en las cuantificaciones de la exocitosis de una célula determinada, una célula similar en condiciones distintas, o un momento determinado durante la exocitosis.

En otra realización preferida, se evalúan los cambios en la incorporación de colorante fluorescente. Los colorantes fluorescentes preferidos incluyen los colorantes de estiril, que indican la actividad exocítica en relación con la endocitosis, algunas veces referida como endocitosis acoplada. La teoría de la endocitosis acoplada se basa en que las células que llevan a cabo la exocitosis deben llevar a cabo también la endocitosis con el fin de mantener el volumen celular y la integridad celular. Así, después de la estimulación exocítica, la endocitosis también se incrementa, proporcionando una cuantificación indirecta de la exocitosis mediante cuantificación de la cantidad de colorante de estiril incorporado.

En una realización de la presente invención, las células se bañan en una solución de colorante de estiril y se estimulan con un estímulo proexocítico y se cuantifica el colorante. Preferentemente, después de la estimulación exocítica, se centrifugan las células, se retira el medio por aspiración y se resuspenden en tampón nuevo. En una realización preferida, un agente candidato se combina con las células, tal como se describe aquí. En algunos casos, el agente bioactivo candidato se puede combinar con las células con un inhibidor de exocitosis o sin el estímulo pro-exocítico. Preferentemente, un estímulo pro-exocítico se añade a la población celular, produciendo un incremento dramático de la señal fluorescente del colorante. El aumento de señal asociado con las células es debido a la endocitosis acoplada del colorante estiril y es proporcional a la respuesta exocítica tanto en intensidad como en tiempo. A la inversa, la señal no incrementa cuando la exocitosis se inhibe o no se induce. Las alteraciones se determinan cuantificando la fluorescencia en puntos distintos o en poblaciones celulares distintas y comparando las determinaciones unas con otras o con los estándares. En general, son preferibles cambios de por lo menos el 50% respecto al nivel basal, preferentemente de por lo menos del 75% al 100%, más preferentemente de por lo menos el 250% y todavía más preferentemente del 1000%-2000%. El nivel basal en este caso hace referencia a la incorporación de colorante de estiril por las células antes de la estimulación exocítica.

Los colorantes de estiril preferidos incluyen, pero no se limitan a FM1-43, FM4-64, FM14-68, FM2-10, FM4-84, FM1-84, FM14-27, FM14-29, FM3-25, FM3-14, FM5-55, RH414, FM6-55, FM10-75, FM1-81, FM9-49, FM4-95, FM4-59, FM9-40 y combinaciones de lo mismo. Los colorantes preferidos como el FM1-43 son únicamente fluorescentes débiles en agua, pero muy fluorescentes cuando están asociados con una membrana, de modo que la incorporación de colorante es fácilmente legible. Los colorantes adecuados están disponibles comercialmente, por ejemplo, Molecular Probes, Inc., de Eugene, Oregon, "Handbook of Fluorescence Probes and Research Chemicals", 6ª edición, 1996, en particular el capítulo 17 y más particularmente la Sección 2 del capítulo 17, (incluyendo los capítulos allí referenciados). Preferentemente, los colorantes se proporcionan en una solución, en donde la concentración de colorante es de aproximadamente 25 a 1000-5000 nM, preferentemente de aproximadamente 50 a 1000 nM y más preferentemente de 50 a 250 mM. La utilización de colorantes de estiril se describe con mayor detalle en Betz y col., Current Opinion in Neurobiology, 6:365-371 (1996). Preferentemente, la incorporación de colorante fluorescente se cuantifica en combinación con por lo menos uno y preferentemente otros dos indicadores de actividad exocítica.

En otra realización preferida, se evalúan los cambios en la liberación del colorante fluorescente. La presente invención está dirigida en parte al descubrimiento de que colorantes de concentración y pH bajos, normalmente utilizados para teñir lisosomas, también tiñen los gránulos exocíticos de pH bajo. En general, estos colorantes pueden incorporarse por las células pasivamente y concentrarse en gránulos; sin embargo, las células pueden inducirse a incorporar el colorante; por ejemplo, mediante endocitosis acoplada. En una realización preferida, una población de células se baña en una solución de colorante a concentración y pH bajos con el fin de que las células incorporen el colorante. A continuación, las células se lavan preferentemente y se exponen a un estímulo pro-exocítico y/o inhibidor. En una realización preferida, un agente bioactivo candidato se combina con la población celular y preferentemente, con el estímulo pro-exocítico. Por último, se evalúa la fluorescencia. Los cambios en la liberación de colorante fluorescente entre las células o en tiempos distintos en la misma célula indican alteraciones de la exocitosis. Preferentemente, las alteraciones se realizan entre células y más preferentemente, entre células a las que se ha añadido agentes bioactivos distintos. En general, son preferibles cambios de por lo menos el 5% respecto al nivel basal, preferentemente de por lo menos el 25%, más preferentemente de por lo menos el 50% y todavía más preferentemente del 100%. El nivel basal en este caso hacer referencia a la cantidad de colorante en las células antes de la estimulación.

En esta realización, son preferibles los colorantes de concentración y pH bajos. Dichos colorantes de concentración y pH bajos incluyen, pero no se limitan al naranja de acridina, LYSOTRACKER™ rojo, LYSOTRACKER™ verde y LYSOTRACKER™ azul. Los mencionados colorantes están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Molecular Probes, supra, incluyendo en particular el Capítulo 17, Sección 4 del Capítulo 17 y los "capítulos allí citados", p.ej., el Capítulo 23. En realizaciones preferidas, los colorantes se administran en una solución en donde el colorante está a una concentración de aproximadamente 50 nM a 25 \muM, preferentemente de 5 \muM a 25 \muM y más preferentemente de 1 a 5 \muM. La utilización de colorantes de concentración y pH bajos se describe en general (en relación con los estudios lisosomales) en Haller y col., Cell Calcium, 19(2):157-165 (1996).

En una realización alternativa, en donde se evalúan los cambios en la liberación del colorante fluorescente, se cuantifica la fluorescencia del sobrenadante. En esta realización, se utilizan indistintamente los colorantes de estiril, que marcan de forma reversible las membranas de endocitosis, o los colorantes de concentración y pH bajos. En dicha realización, una población celular se baña en una solución de colorante y el colorante se incorpora en las células de forma pasiva o inducida. Las células, a continuación, se lavan preferentemente y se exponen a un estímulo pro-exocítico que liberará el colorante en el medio extracelular. De este modo se puede cuantificar o detectar la fluorescencia en el medio. Este proceso es referido a veces como un proceso de desteñido de las células. Opcionalmente, se puede añadir un agente para mejorar y facilitar la detección del colorante en el medio. Por ejemplo, los detergentes que forman micelas como el 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio[]-1-propanosulfonato (CHAPS) aumenta la fluorescencia y en consecuencia permite la detección de una actividad exocítica baja. Los cambios en la liberación del colorante indican alteraciones en la exocitosis de la misma célula, entre células y más preferentemente entre células a las que se ha añadido agentes bioactivos distintos. En general, son preferibles cambios de por lo menos el 5% respecto al nivel basal, preferentemente de por lo menos el 25%, más preferentemente de por lo menos el 50% y todavía más preferentemente del 100%. El nivel basal en este caso hace referencia a la liberación de colorante antes del estímulo exocítico. Preferentemente, la liberación de colorante cuando se cuantifica en el medio se combina con la evaluación de por lo menos un indicador de exocitosis.

En una realización preferida, se determinan los cambios en la exposición de gránulos. Los gránulos se exponen al medio durante la exocitosis, es decir, los gránulos se fusionan con la membrana celular y exponen/liberan sus contenidos. En consecuencia, la exposición de gránulos es indicativa de la actividad exocítica, y su ausencia es indicativa de que la exocitosis no se ha inducido, o se ha inhibido. Preferentemente, la exposición de gránulos se detecta mediante un agente detectable que se une específicamente a los gránulos. Un ejemplo de una agente detectable utilizado aquí es la anexina V, un miembro de la familia de proteínas que presenta una unión específica con fosfolípidos (fosfatidilserina) de manera dependiente de iones divalentes. Esta proteína se ha utilizado ampliamente para la cuantificación de la apoptosis (muerte celular programada), ya que la exposición en la superficie de membrana de la fosfatidilserina es una señal temprana de este proceso. Sorprendentemente, se ha determinado aquí que la anexina V se une específicamente a los gránulos exocíticos cuando se exponen en la superficie celular durante el proceso de secreción; estando los gránulos internos de la célula no marcados. Esta propiedad de la anexina V se utiliza en la presente invención para crear un ensayo de exocitosis simple basado en su unión dependiente de exocitosis. Tras la estimulación exocítica de las células, las células muestran un incremento de la unión de la anexina y de la señal fluorescente en proporción con el tiempo y con la intensidad de la respuesta exocítica.

En esta realización, la anexina se marca directa o indirectamente y se combina con una población celular. La anexina está disponible comercialmente, por ejemplo, de PharMingen, San Diego, California, o Caltag Laboratories, Millbrae, California. Preferentemente, la anexina se proporciona en una solución donde la anexina se halla a una concentración de aproximadamente 100 ng/ml a aproximadamente 500 ng/ml, más preferentemente desde aproximadamente 500 ng/ml a 1 \mug/ml y mucho más preferentemente desde aproximadamente 1 \mug/ml a 5 \mug/ml. En una realización preferida, la anexina se marca directamente; por ejemplo, la anexina puede marcarse con un fluorocromo como el isotiocianato de fluoresceína (FITC). Los colorantes Alexa, TRITC, AMCA, APC, tri-colo, Cy-5 y otros conocidos en la materia o disponibles comercialmente. En una realización preferida, la anexina se marca con un marcaje primario, como un hapteno, por ejemplo la biotina, y un marcaje secundario como por ejemplo la estreptavidina fluorescente. Se pueden utilizar también otras parejas de marcaje primario y secundario, según lo considere el experto en la materia.

En la realización preferida, las células se someten a condiciones que normalmente causan exocitosis. Opcionalmente, se añade un agente bioactivo candidato a las células. En algunos casos, puede ser deseable incluir un inhibidor de la exocitosis para determinar si el agente candidato puede invertir la inhibición, o incluir el agente bioactivo candidato sin el estímulo exocítico para determinar si el agente induce la exocitosis. A continuación, las células se lavan preferentemente y se detecta la fluorescencia al microscopio o con el citómetro de flujo. Las alteraciones en la detección de la unión de anexina indican alteraciones en la exocitosis de la misma célula, o entre células distintas, con o sin idénticas condiciones y/o agentes combinados. En general, son preferibles cambios de por lo menos el 25% respecto al nivel basal, preferentemente de por lo menos el 50%, más preferentemente de por lo menos el 100% y todavía más preferentemente del 500%. El nivel basal en este caso hace referencia a la cantidad de anexina unida antes de la estimulación exocítica.

En otra realización, la exposición de gránulos se detecta mediante un colorante catiónico, como por ejemplo el berberino o el rojo de rutenio. Dichos colorantes catiónicos tiñen específicamente los gránulos de secreción. Así, cuando tiene lugar la exocitosis y los gránulos secretores se exponen en la superficie de las células, se puede detectar un incremento de la fluorescencia. En una realización preferida, el colorante catiónico se combina con una población celular en presencia o ausencia de un estímulo exocítico y/o inhibidor, y opcionalmente en presencia o ausencia de un agente bioactivo candidato. En una realización preferida, se combina la berberina con una célula, un estímulo exocítico y un agente bioactivo candidato para determinar si el agente bioactivo candidato puede modular la actividad exocítica. Preferentemente, se lavan las células y a continuación se determina la fluorescencia. En realizaciones preferidas, la evaluación del colorante catiónico se combina con la evaluación de por lo menos otro indicador de exocitosis. El colorante se combina con las células, tal como se conoce en la materia. Las metodología generales que utilizan la berberina se describen en Berlin y Enerback, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 73(3):256-262 (1984), incorporado aquí como referencia. En general, son preferibles cambios de por lo menos el 25% respecto al nivel basal, preferentemente de por lo menos el 50% y todavía más preferentemente del 100%. El nivel basal en este caso hace referencia a la cantidad de colorante unido antes de la estimulación.

De modo similar, se puede utilizar la Con-A-FITC, que se une al carbohidrato en las proteínas de los gránulos, de forma parecida a la indicada anteriormente.

En otra realización preferida, se determinan los cambios en la actividad enzimática de gránulos de superficie. Los gránulos secretores contienen enzimas como las proteasas y las glicosidasas que se liberan como parte del proceso exocítico. Frecuentemente, estas enzimas son inactivas dentro del gránulo, debido al pH bajo, pero después de su exposición en el medio extracelular a pH fisiológico, se activan. Estas actividades enzimáticas se pueden cuantificar utilizando sustratos cromogénicos o fluorogénicos como componentes del medio extracelular. Esto permite la detección de las células exocíticas utilizando diversas aproximaciones.

En una realización, se puede cuantificar la generación de la señal mediante el corte de un sustrato cromogénico o fluorogénico en el medio, dicho ensayo se ha de denominado aquí algunas veces como el ensayo enzimático basado en la población. Es decir, la cantidad de producto de reacción detectable en el medio está relacionada con la cantidad de enzima presente y en consecuencia con la extensión de la exocitosis. En esta realización, es el medio y no las células el que es detectable.

En una realización preferida, las células se someten a un estímulo exocítico y opcionalmente a un agente bioactivo candidato. El sustrato cromogénico o flurorogénico se añade al medio y se evalúan los cambios en la señal, a medida que las enzimas cortan los sustratos extracelulares.

En una realización preferida alternativa, se utiliza un ensayo denominado a veces "ensayo enzimológico in situ", en donde los sustratos cromogénicos o fluorogénicos precipitan después del corte. Es decir, después de la exocitosis, una gran parte de la actividad enzimática permanece asociada a células/gránulos y puede visualizarse utilizando sustratos fluorescentes que precipitan en el lugar de la actividad. Por ejemplo, los sustratos para la glucuronidasa, como el ELF-97 glucurónido, precipita sobre las células exocíticas, pero no en las células bloqueadas y en consecuencia las células pueden mostrar un incremento de fluorescencia. La fluorescencia es una cuantificación directa de la exocitosis y es dependiente del pH, reflejando el pH óptimo de la enzima excretada por exocitosis. Este procedimiento también proporciona un procedimiento para diferenciar los subtipos distintos de gránulos de acuerdo con el perfil
enzimático.

En una realización preferida, la población celular se somete a un estímulo exocítico y luego se incuba con un sustrato detectable. Opcionalmente, se puede añadir un agente bioactivo candidato. Las células se lavan y a continuación se observan al microscopio o con el citómetro de flujo.

Las enzimas de gránulos preferidas incluyen pero no se limitan a la quimasa, la triptasa, la arilsulfatasa A, la beta-hexosaminidasa, la beta-glucuronidasa y la beta-D-galactosidasa. Los sustratos incluyen el ELF-97 glucurónido, el N-acetil-beta-D glucurónido, el ELF-97 conjugado con péptidos, etc., estando muchos de ellos disponibles comercialmente, por ejemplo de Molecular Probes, supra, en particular el Capítulo 10, más preferentemente la Sección 2 del Capítulo 10 y los "capítulos allí citados".

El término sustrato detectable hace referencia a que el sustrato comprende una molécula fluorescente tal como se describe más adelante, o que puede detectarse con una molécula fluorescente específica para el sustrato o el sustrato cortado, por ejemplo, un anticuerpo fluorescente. En una realización preferida, el sustrato comprende una molécula detectable formada de dos proteínas fluorescentes, p.ej., la proteína fluorescentes azul y l verde (BFP y GFP) y otras moléculas similares. Como es conocido en la materia, las construcciones de GFP y BFP que mantienen esas dos proteínas en estrecha proximidad permiten la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET). Es decir, el espectro de excitación de GFP se superpone con el espectro de emisión de BFP. Según ello, la excitación de BFP produce la emisión de GFP. Si un sito de corte de proteasas se diseña entre GFP y BFP para formar una construcción "FRET", después de la exposición de la construcción FRET a una proteasa activa que corte la construcción, se separan las moléculas GFP y BFP. En consecuencia, la excitación de GFP da como resultado la emisión de BFP y la pérdida de emisión de BFP.

Preferentemente, el sitio de corte dependiente de proteasas, que se inserta entre las dos proteínas fluorescentes de la construcción FRET, es específico para una enzima específica de gránulos. Así, la construcción FRET puede utilizarse para detectar las proteasas específicas de gránulos para el sitio de corte de la construcción FRET. En esta realización, el sustrato de proteasas que se combina con las células o el medio incluye la construcción FRET. El sistema FRET permite la detección de la molécula detectable en su estado cortado y no cortado y diferencia entre los dos. El sistema se describe además en Xu y col., Nucleic Acid Res. 26(8):2034 (1998); y Miyawaki y col., Nature 388(6645):882-887 (1997).

La cantidad de sustrato añadido a las células o al medio dependerá en parte de una actividad enzimática específica y del propio sustrato, pero generalmente es de aproximadamente 250 nM a 1 mM, preferentemente desde 1 \muM a 100 \muM y más preferentemente desde aproximadamente 1 \muM a 10 \muM. En general, son preferibles cambios de por lo menos el 5% respecto al nivel basal, preferentemente de por lo menos el 25%, más preferentemente de por lo menos el 100% y todavía más preferentemente de por lo menos el 1000%. El nivel basal en este caso hace referencia a la cantidad de sustrato cortado antes de la inducción de la exocitosis.

En una realización preferida, se determinan los cambios en la cantidad de proteínas específicas de gránulos. Los gránulos secretores contienen proteínas que se dirigen específicamente al compartimento granular debido a las propiedades específicas de estas proteínas. Después de la inducción exocítica, las proteínas específicas de gránulos se exponen en la superficie y se detectan.

En una realización preferida, las proteínas específicas de gránulos y detectables se combinan con una población de células y se someten a condiciones conocidas para inducir la exocitosis. Opcionalmente, un candidato bioactivo se combina con la población celular y se detecta la proteína específica de gránulos detectable. Las proteínas específicas incluyen pero no se limitan a VAMP y sinaptotagmin. También se incluyen dentro de la definición de proteínas específicas de gránulos los mediadores liberados durante la exocitosis, incluyendo, pero sin limitarse a, la serotonina, la histamina, la heparina, las hormonas, etc.

La cuantificación de las proteínas de gránulos puede realizarse de diferentes modos. En una realización, se utilizan anticuerpos marcados (como los anticuerpos fluorescentes) contra proteínas específicas de gránulos. En otra realización, se diseñan células para contener proteínas de fusión que comprenden una proteína de gránulo y una molécula detectable. En una realización preferida, se añade una molécula detectable a las células para su detección. Por ejemplo, se pueden utilizar anticuerpos marcados directa o indirectamente. Una realización preferida utiliza un primer anticuerpo marcado, preferentemente con marcajes fluorescentes. Otra realización utiliza un marcaje primario y un secundario, por ejemplo, un anticuerpo secundario marcado. En general, esta realización puede utilizar cualquier agente que se una específicamente a la proteína de gránulos o compuesto que pueda ser marcado directa o indirectamente.

En una realización preferida, los marcajes se diseñan en las células. Por ejemplo, las proteínas recombinantes que se introducen en la población son proteínas de fusión o proteínas específicas de gránulos junto con una molécula detectable. Ello se realiza generalmente transformando las células con un ácido nucleico de fusión que codifica para una proteína de fusión que comprende una proteína específica de gránulos y una molécula detectable. Ello se realiza tal como se conoce en la materia y depende del tipo celular. En general, para las células de mamífero, son preferibles los vectores y los procedimientos retrovirales.

Las proteínas de fusión se construyen mediante procedimientos conocidos en la materia. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican para la proteína específica de gránulos se unen con un ácido nucleico que codifica para una molécula detectable. El término molécula detectable hace referencia a una molécula que permite que una célula o compuesto que contenga la molécula detectable se diferencie de otra que no la contenga, p.ej., un epitopo, a veces denominado antígeno TAG, o una molécula fluorescente. Las moléculas fluorescentes preferidas incluyen pero no se limitan a GFP, BFP, YFP y enzimas como la luciferasa o la \beta-galactosidasa. Estas construcciones se pueden realizar de modo que tras la exocitosis, se expone un epitopo interno al gránulo en la superficie celular, permitiendo a continuación su detección. El epitopo es preferentemente cualquier péptido detectable que no se halle generalmente en la membrana citoplasmática, aunque en algunas instancias, si el epitopo no se halla normalmente en las células, se pueden detectar incrementos aunque no en general no se prefiera.

En una realización preferida, la población celular que contiene la proteína de fusión o la proteína específica de gránulos se somete a condiciones exocíticas. Opcionalmente, se incluye un agente bioactivo candidato y/o inhibidor exocítico. Preferentemente, se lavan las células y a continuación se detecta la fluorescencia en ellas. En general, son preferibles cambios de por lo menos el 5% respecto al nivel basal, preferentemente de por lo menos el 25%, más preferentemente de por lo menos el 50% y todavía más preferentemente del 100%. El nivel basal en este caso hace referencia a la cantidad de fluorescencia antes del estímulo exocítico.

En la presente invención, se evalúa la misma característica de exocitosis mediante parámetros múltiples que dan como resultado un ruido de fondo reducido y una mayor especificidad. El FACS ya había sido utilizado con anterioridad para evaluar dos características distintas o no relacionadas al mismo tiempo, que identifican las células que tienen esas dos características, pero, a diferencia de la presente invención, no se reduce el ruido de fondo para las características combinadas. Sin embargo, la presente invención, además de identificar propiedades múltiples de exocitosis, puede combinarse con la identificación de otros parámetros celulares, tal como se indicó anteriormente.

En una realización preferida, las células se someten a condiciones que normalmente causan exocitosis. Los agentes pro-exocíticos incluyen la ionomicina, el Ca^{++}, los ionóforos (ionomicina, Az3187), el compuesto 48/80, la sustancia P, el complemento C3a/C5a, la tripsina, la triptasa, la insulina, la interleucina-3, la IgE específica, el alergeno, los anticuerpos de receptores anti-IgE o anti-IgG. Estos se proporcionan a concentraciones dependiendo del compuesto tal como se conoce en la materia, en un intervalo desde 1 picomolar a 10 \muM, en general. En algunos casos, puede ser deseable combinar células con agentes que inhiben la exocitosis. Los inhibidores de exocitosis incluyen pero no se limitan a Wortmannin y Genestein y otros conocidos en la materia.

En una realización preferida, se utilizan procedimientos para rastrear agentes bioactivos candidatos por su capacidad para modular la exocitosis. Los agentes bioactivos candidatos pueden combinarse con la población de células antes, durante o después de estimular la exocitosis, siendo preferible la primera opción. En algunos casos, puede ser deseable determinar el efecto del agente bioactivo candidato, también referido aquí como "agente candidato", en la célula en donde la exocitosis no se induce o está inhibida. El agente bioactivo candidato puede añadirse a la población celular exógenamente o puede introducirse en las células tal como se describe más adelante.

En una realización preferida, al igual que antes para los ensayos de ciclo celular, se utiliza una librería de agentes bioactivos candidatos distintos.

Al igual que antes, los agentes bioactivos candidatos se combinan o añaden a una célula o población de células; de nuevo, tal como se ha descrito anteriormente, las realizaciones preferidas utilizan agentes candidatos de ácido nucleico y parejas de fusión; y preferentemente construcciones retrovirales.

Cuando los agentes candidatos son ácidos nucleicos, se pueden utilizar procedimientos conocidos en la materia como el fosfato cálcico, la electroporación y la inyección para introducir estos ácidos nucleicos en las células. El estímulo exocítico se combina generalmente con las células en condiciones fisiológicas. Las incubaciones se pueden realizar a cualquier temperatura que facilite la actividad óptima, típicamente entre 4 y 40ºC. Los períodos de incubación se seleccionan para una actividad óptima, pero también se optimizan para facilitar un rastreo rápido y de alto rendimiento.

Al igual que antes, se pueden incluir otros diversos reactivos en los ensayos y a continuación separar las células. El procedimiento de separación da como resultado una población de células que presenta las propiedades exocíticas deseadas. En una realización preferida, los parámetros se ajustan a por lo menos un agente bioactivo candidato que modula la exocitosis.

En una realización preferida, se caracteriza el agente bioactivo. Ello se lleva a cabo según se los procedimientos conocidos por los expertos en la materia, y en general incluye un análisis de la estructura, identidad, afinidad de unión y función del agente. Habitualmente, una vez identificado, el agente bioactivo se resintetiza y combina con la célula diana para verificar la modulación de la exocitosis en condiciones diversas y en presencia o ausencia de otros agentes. El agente bioactivo puede prepararse en una cantidad efectiva terapéuticamente para modular la exocitosis y combinar con un vehículo farmacéutico.

En una realización preferida, las poblaciones celulares se pueden someter a diversas condiciones experimentales, con y sin agentes candidatos y con y sin estimulación o inhibición exocítica. Los cambios en las condiciones incluyen pero no se limitan a cambios en el pH, temperatura, tampón o concentración de sal, etc. En una realización preferida, se cambia el pH al incrementarlo o disminuirlo, generalmente desde aproximadamente 0,5 a 3 unidades de pH. Alternativamente, la temperatura se altera, con incrementos o disminuciones desde aproximadamente 5ºC a aproximadamente 30ºC, de preferencia. De forma similar, se puede modificar la concentración de sal, con incrementos o disminuciones desde aproximadamente 0,1 M a 2 M de preferencia.

En una realización preferida, el fenotipo celular a modular es la toxicidad de una molécula pequeña (u otro agente candidato). Dichas moléculas se utilizan para los ensayos de viabilidad celular, tal como se indicó anteriormente. Las respuestas a dosis de moléculas pequeñas también se pueden comparar con las de células con la mayor respuesta funcional, y a continuación ver si existe una mayor o menor toxicidad asociada con dichas células.

En una realización preferida, el fenotipo celular implica la expresión o la actividad de receptores de superficie celular; hasta dieciséis marcadores de superficie celular pueden controlarse simultáneamente, y preferentemente hasta 8. La presencia o ausencia de cualquier marcador de superficie celular en particular puede detectarse mediante anticuerpos conjugados directa e indirectamente contra cualquier proteína de superficie celular, cuya expresión refleje un parámetro funcional importante asociado con las células que se estudian. El efecto de agentes candidatos, como las moléculas pequeñas, se puede probar contra marcadores individuales o múltiples.

En una realización preferida, el fenotipo celular implica la expresión o la actividad de enzimas, como por ejemplo los sistemas de reporteros fluorescentes que pueden detectar un evento biológico que ocurra simultáneamente con la primera cuantificación, o sea un resultado de la primera cuantificación. Este sistema reportero puede ser el resultado de las vías de transducción de señal cadena arriba que están activas en el citoplasma, o de eventos transcripcionales nucleolares o traduccionales, así como también de la exportación de eventos desde el núcleo o la célula.

En una realización preferida, el fenotipo celular implica interacciones proteína-proteína (o interacciones entre otros ligandos de unión), como por ejemplo la dimerización, que puede interrumpirse o fomentarse por un agente candidato. Estos eventos pueden cuantificarse por la aparición o desaparición de FRET entre dos ligandos de unión marcados.

Los ejemplos siguientes sirven para describir con mayor detalle la forma de utilizar la invención anteriormente descrita, así como para ajustar las mejores formas contempladas para llevar a cabo diversos aspectos de la invención. Se entenderá que dichos ejemplos no son de ninguna manera una limitación del ámbito de la invención, sino que se presentan con propósitos ilustrativos.

Ejemplo 1 Ensayos de ciclo celular utilizando la p21 como un control positivo Materiales y métodos

Construcción del vector: la región codificante del gen p21 se clonó a partir del cDNA de Jurkat mediante PCR con un cebador cadena arriba abarcando la metionina de inicio (5'-GATCGGATCCACC ACCATGGGCTCAGAACCGGC
TGGGGATGTC) un cebador C-terminal (5'-GATCCC AATTTAATGGTTTTATTTGTCATCGTCATCCTTGTAGT
CGGGCTTCTTGGAGAAGATCAGCCG GCGTTTG). El producto de PCR aislado se clonó direccionalmente en el vector retroviral CRU5-GFP (Rigel, Inc.) en las dianas BstXI flanqueantes dentro de los cebadores. La construcción resultante, CRU5-GFP-p21F (Figura 1), codifica la GFP fusionada (en el mismo marco de lectura) con la proteína p21 humana con una inserción de Gly en la posición 2 un epitopo-FLAG en el extremo C-terminal. Los 24 aminoácidos del extremo C-terminal de p21 se clonaron en el vector retroviral CRU5-GFP (Rigel, Inc.) en las dianas BstXI flanqueantes dentro de los cebadores de PCR: 5'-GATCCCACCACCATGGGCAAACGGCGGCAGA
CCAGCATGACAGATTTCTACCACTCCAAACGCC GGCTGATCTTCTCCAA; 5'-GATCCCAATTTAAATGGTT
TTATTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCGGGCTTCCTCTTGGAGAAG ATCAGCCGGCGTTTG. La construcción resultante CRU5-GFP p21C (Figura 1), codifica para GFP fusionada en el mismo marco de lectura con KRRQTSMTD
FYHSRRLIFSKRKP y un epitopo FLAG en el extremo C-terminal. Los 24 aminoácidos de p21, junto con tres mutaciones de alanina, se clonaron en el vector retroviral CRU5-GFP (Rigel, Inc.) en las dianas BstXI flanqueantes dentro de los cebadores de PCR:

5'ATCGGATCCACCACCATGGGCAAACGGCGGCAGACCAGCGCCACAGCTGCCTACCACTCC;

5'GATCCCAATTTAATGGTTTTATTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCGGGCTTCCTCTTGGAGAAGA TCA
GCCGGCGTTTG. La construcción resultante, CRU5-GFPp21Cmut (Figura 1), codifica para GFP fusionada en el mismo marco de lectura con KRRQTSATAAYHSRRLIFSKRKP (las mutaciones están subrayadas) y un epitopo FLAG en el extremo C-terminal.

Transducción retroviral: se plaquearon células Phoenix E en placas de 6 pocillos a 10^{6} células en 1,5 ml de medio DMEM completo (DMEM + FBS al 10% + Penicilina/Estreptomicina) y se incubaron a 37ºC durante 16 horas. La transfección se realizó mediante precipitación con CaCl_{2} (2 \mul de DNA (1 \mug/\mul), 30,5 \mul de CaCl_{2} 2 M, 217,5 \mul de H_{2}O, 0,5 ml de 2XHBS) con el vector CRU5-IRES-GFP o con el clon CRU5-p21-IRES-GFP en presencia de cloroquina 50 \muM durante 8 horas a 37ºC. El medio de transfección se extrajo y se reemplazó con 2 ml de medio DMEM completo, incubándose las células durante 16 horas más a 37ºC. El medio se cambió con 1,5 ml de RPMI completo (RPMI + FBS al 10% + Penicilina/estreptomicina) y se incubó a 32ºC durante 48 horas. El sobrenadante de virus de las placas transfectadas se filtró (0,45 \mum) y se transfirió a una placa de 6 pocillos. Se añadió una alícuota de 100 \mul de células T Jurkat (5x10^{6} células) a cada pocillo. Se añadió polibreno a una concentración final de 5 \mug/ml. Las placas se sellaron con parafilm y se centrifugaron a 32ºC durante 90 minutos a 2500 rpm. Se retiró el parafilm y la placa se incubó durante una noche a 37ºC. Se cambió el medio al cabo de 16 horas con 4 ml de RPMI completo y se incubó de nuevo a 37ºC durante 72 horas.

Ensayo FACS del ciclo celular: Las células transducidas con el vector retroviral se sedimentaron por centrifugación y se resuspendieron a 10^{6} células/ml en medio RPMI completo. Se añadió un volumen (1 ml) de colorante trazador de células PKH26 4 \muM (Sigma) a las células y se incubó a 25ºC durante 5 min. La suspensión se diluyó 5 veces y se sedimentaron las células a 400xg durante 10 min a 25ºC. A continuación se lavaron las células dos veces con 6 ml de medio RPMI completo y se incubaron a 3x10^{5} células/ml en una placa de 6 pocillos durante 72 horas. Las células marcadas se sedimentaron y resuspendieron a 10^{6} células/ml en medio RPMI completo con 5 \mug/ml de Hoechst 33342 (Molecular Probes) y se incubaron a 37ºC durante 42 horas. Las células teñidas se sedimentaron y resuspendieron a >10^{6} células/ml en tampón FAGS (PBS/FCS al 0,5%/Hoechst 33342 a 5 \mug/ml). Las células se sometieron al análisis de citometría de flujo en un MoFlo citómetro (Cytomation) equipado con tres lásers. La dispersión de luz frontal y lateral se excitó con un láser de argón de 488 nm y la luz dispersada se recogió con un detector y un filtro de paso de banda de 488 nm. GFP se excitó con un láser de argón a 488 nm y la luz emitida se recogió con un filtro de paso de banda de 530 nm. El colorante trazador de células se excitó con un láser HeNe a 533 nm y la luz emitida se recogió con un filtro de paso de banda de 570 nm. El colorante Hoechst 33342 se excitó con un láser UV y la luz emitida se recogió con un filtro de paso de banda de 450 nm.

Resultados

Las células Jurkat T se transdujeron con vectores retrovirales que codificaban para p21 humana (Gp21), o los 24 aminoácidos C-terminales de unión a PCNA (Gp21) fusionados con GFP (Figura 1). Una versión mutante que no se une a PCNA de los 24 aminoácidos C-terminales de p21 (Gp21Cmut, Cayrol y col., Oncogene 16:311 (1998)) sirvió como control negativo. La expresión de p21 transducida se podía distinguir de la proteína endógena por el epitopo FLAG mediante transferencia de Western (resultados no mostrados). La expresión de las proteínas de fusión se reportó en el FACS mediante GFP fluorescente (Figura 2B). Las células transducidas se marcaron con un pulso de un compuesto trazador de células, pkh26, que incorpora moléculas alifáticas fluorescentes rojas en la membrana celular mediante partición selectiva, permitiendo una correlación entre las células ciclantes y la intensidad de fluorescencia: en las células bloqueadas, el colorante trazador celular continua brillante; las células ciclantes diluyen la señal y la apagan. Tal como se muestra en la Figura 2C, las células vivas que expresan GFP-p21 analizadas para GFP, demostraron una mayor fluorescencia roja que las células transducidas con el vector y que expresaban los mismos niveles de GFP, lo que indicaba un paro del ciclo celular. Un efecto similar se observó en las células que expresaban Gp21, sin embargo, Gp2-Cmut fue idéntico a las células no expresadas. El contenido de DNA de las mismas células analizadas para GFP se muestra en la Figura 2D. Las células que expresan Gp21 se bloquean en fase G1 del ciclo celular, las células que expresan Gp21C muestran una acumulación en el punto de control G1 y G2, consistente con los resultados previos (Wade Harper, y col., 1993; Cayrol y col., 1998). Las células que expresan Gp21-Cmut muestran una distribución normal del ciclo normal. Las células viables, bloqueadas y que expresan (que satisfacen los tres parámetros iniciales) se clasificaron en cámaras separadas de acuerdo con su contenido de DNA: G1, desviación derecha y G2.

Ejemplo 2 Cuantificaciones de la actividad enzimática exocítica de la población

Materiales: Todos los productos químicos se obtuvieron de Sigma Chemical Co. Los colorantes y el glucurónido se obtuvieron de Molecular Probe, Inc. Las líneas celulares MC-9 y RBL-2H3 se obtuvieron del American Type Culture Collection (ATCC). Los reactivos del cultivo celular se obtuvieron de Fisher Scientific y los reactivos de biología molecular de Clontech Inc.

Cultivo celular: las células MC-9 se mantuvieron en cultivos en suspensión en frascos con medio DMEM y L-arginina (116 mg/ml), L-asparraguina (36 mg/ml), piruvato sódico (1 mM), aminoácidos no esenciales (0,1 mM), ácido fólico (6 mg/ml), 2-mercaptoetanol (0,05 mM), L-glutamina (2 mM), suero bovino fetal inactivado por calor (10%) y medio condicionado T-stim al 10% (Collaborative Research, Inc.). Las células se mantuvieron a una densidad de entre 0,25 y 2x10^{6}/ml. Los experimentos se realizaron con células viables en >95% según se determinó mediante tinción de exclusión con trypan blue. Las células RBL-2H3 se mantuvieron como cultivos adherentes en frascos no recubiertos (tratados para cultivo de tejidos) en medio MEM de Eagle con L-glutamina 2 mM y BSS de Earl, suero bovino fetal inactivado por calor al 15%. Se realizaron pasajes de los cultivos (con tripsina al 0,05%) para que los cultivos no alcanzaran una confluencia de más de un día.

Protocolo de estimulación de la exocitosis: los experimentos se llevaron a cabo en tampón Tyrodes modificado, que consistía de NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, CaCl_{2} 1,8 mM, MgCl_{2} 1 mM, glucosa 5,6 mM, Hepes 20 mM, pH 7,4 y albúmina sérica bovina al 0,1%. Las células MC-9 se centrifugaron a 400xg y se aspiró el medio. A continuación se lavaron las células con MT, se recentrifugaron, se aspiró el sobrenadante y se resuspendieron las células en MT a una densidad de 5x10^{6} células/ml, a continuación se trataron las células con DMSO o ionóforo durante 30 min (o se varió el tiempo). Las células se sedimentaron y el sobrenadante se utilizó para análisis enzimáticos; en algunos casos, las células se procesaron mediante citometría de flujo. Todas las estimulaciones se llevaron a cabo a 37ºC. Las estimulaciones de las células RBL-2H3 se llevaron a cabo lavando las células adherentes una vez con TM y luego añadiendo MT atemperado (1 ml/10^{6} células) con el estímulo. Las células se incubaron a 37ºC durante 30 minutos y el sobrenadante se recogió para posteriores análisis. En algunos ejemplos (Ejemplos 4-6), se tiñeron las células unidas a la placa para anexina y a continuación se extrajeron del frasco utilizando No-Zyme (Collaborative Research, Inc.) para un procesamiento posterior mediante citometría de flujo. Para la estimulación de las células RBL-2H3 con el antígeno de unión, las células se incubaron durante toda la noche con IgE anti-DNP (Sigma Chemical Co.) en medio completo a una concentración de 50 ng/ml. Al día siguiente se lavaron una vez en MT y se estimularon tal como se describió anteriormente, excepto que se utilizó albúmina sérica bovina junto con DNP como el estímulo a una concentración de 100 ng/ml.

Ensayos enzimáticos de población: los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo con los sobrenadantes y sedimentos después de la estimulación exocítica. Los sobrenadantes celulares se recogieron después de la estimulación, se enfriaron en hielo, se centrifugaron a 5000xg y se recogió el sobrenadante para el análisis de actividad enzimática. De forma similar, se recogieron los sedimentos celulares, se lisaron con MT y TritonX-100 al 0,1%, se centrifugaron a 5000xg y los sobrenadantes se recogieron para el análisis de la actividad enzimática. Para cada análisis, se mezclaron 100 \mul del lisado o del sobrenadante con 100 \mul de tampón de reacción (citrato 40 mM, pH 4,5) con el sustrato 2 mM (4-metilumbeliferil-\beta-D Glucurónido [sustrato de glucuronidasa] o 4-metilumbeliferlil N-acetil \beta-D-glucosaminido [sustrato de hexosaminidasa]) en una placa de 96 pocillos negra (Costar, Inc.) y se incubaron a 37ºC durante 15 minutos. La placa se leyó con un lector de placas fluorescentes (Wallac, Inc.) utilizando un filtro de excitación de 380 nm y uno de emisión de 440 nm cada 3 minutos, cinco veces para obtener una velocidad enzimática; los análisis se llevaron a cabo por triplicado.

Citometría de flujo: las células se procesaron para su estimulación y la tinción se realizó en MT en hielo, filtrándose con un filtro de 100 \mum antes de pasarlas por el citómetro. Las células se analizaron utilizando un FACSCAN (Becton Dickinson Inc., láser de 458 nm) o un Cytometer Mo-Flo (Cytomation, Inc., láser de banda ancha de 350 nm (UV), 488 nm y 647 nm). Según los requerimientos deseados, se separaron las células.

Resultados: Los resultados se muestran en la Figura 4. La actividad enzimática en el sobrenadante celular se cuantificó para las células MC9 (a) y RBL 2H3 (B) en diversas condiciones. A) Las células MC-9 se estimularon en presencia de DMSO (-) o de ionomicina 2 \mum (+) durante 30 minutos. Los sobrenadantes se recogieron y se analizaron para la actividad glucuronidasa y hexosaminidasa. La liberación estimulada de la actividad enzimática de los gránulos fue evidente. B) Las células RBL-2H3 se sensibilizaron durante 16 horas con diversas cantidades de IgE y DNP y se estimuló su exocitosis mediante exposición a cantidades incrementadas del antígeno BSA-DNP. Se hizo evidente una respuesta dependiente de la dosis tanto para el anticuerpo como para el antígeno en la actividad hexominidasa del sobrenadante.

Ejemplo 3 Cambios exocíticos de la dispersión de luz de mastocitos

Las células se prepararon tal como se describió en el Ejemplo 2 y se determinaron las propiedades de dispersión de luz.

Resultados: Los resultados se muestran en la Figura 4. Los cambios observados en la dispersión de luz con el citómetro de flujo (dispersión lateral versus frontal) se han representado como histogramas bivariados para las células RBL-2H3 (A, D) y las células MC-9 (B, C, E, F). Las células se estimularon con el ionóforo A23187 (0,5 \mug/ml) y se observaron a diversos tiempos [0 minutos (A, C), 5 minutos (E), 10 minutos (D), 30 minutos (B, F)]. Los cambios de dispersión dependientes del tiempo fueron evidentes en ambas líneas celulares, siendo los cambios más significativos los ocurridos durante los primeros 10 minutos, que representan el bolus mayor de exocitosis de estas células.

Ejemplo 4 Colorantes de estiril detectan la exocitosis de mastocitos mediante FACS

Tinción con colorante de estiril: Las células se prepararon tal como se describió anteriormente. Los colorantes de estiril (FM1-43 o FM4-64; Molecular Probes, Inc.) se diluyeron a una concentración final de 250 nM en MT y se incorporaron en el tampón de estimulación (ver Ejemplo 2). Después del protocolo de estimulación, las células se sedimentaron mediante centrifugación, se aspiró el sobrenadante y las células se resuspendieron con MT frío en hielo. De este modo, las células estuvieron preparadas para el análisis con el citómetro de flujo (ver Ejemplo 2).

Resultados: Los resultados se muestran en la Figura 6. Las células MC-9 se estimularon (azul = DMSO, rojo = ionomicina 2\muM) en presencia de FM4-64 (A,B) o M 1-43 (C, D, E). A) Las células marcadas FM4-64 se detectaron en el citómetro de flujo en el canal 1 de fluorescencia. B) Las células marcadas FM4-64 se detectaron en el citómetro de flujo en el canal 3 de fluorescencia. C) Las células marcadas FM1-43 se detectaron en el citómetro de flujo en el canal 1 de fluorescencia. D) Las células marcadas FM1-43 se detectaron en el citómetro de flujo en el canal 3 de fluorescencia. Se observó un claro incremento dependiente de la estimulación de la intensidad de fluorescencia con ambos colorantes; siendo el FM4-64 el más desplazado en el rojo y detectado predominantemente en el canal 3, mientras que el FM1-43 tiene una fluorescencia más amplia, detectándose en ambos canales, 1 y 3. E) Las células MC-9 se preincubaron con diversas dosis de wortmannin, inhibidor de PI-3 quinasa (1 \muM-histograma 1, 100 nM-histograma 2, 10 nM-histograma 3 y 0 nM-histogramas 1 y 2 antes de la estimulación con A23187 (0,5 \mug/ml, histogramas 1-4), o DMSO (histograma 5) en presencia de FM1-43. El desplazamiento medio del canal detectado con el citómetro de flujo en el canal de fluorescencia 1 se representa como un histograma de barras. El wortmannin, conocido inhibidor de la exocitosis de mastocitos, causó una disminución dependiente de la dosis en la señal de FM1-43, lo que indicaba que la señal de FM1-43 reflejaba el grado de desgranulación en la línea de mastocitos MC-9.

Ejemplo 5 La tinción de anexina V detecta la exocitosis de mastocitos mediante FACS

Materiales: La anexina-V biotina, la anexina-V FITC y la estreptavidina APV se obtuvieron de Caltag Laboratories. Otros materiales y procedimientos utilizados aquí se pueden incorporar de otros ejemplos, en particular del ejemplo 2.

Tinción con anexina-V: Se tiñeron las células después del estímulo exocítico con anexina-PITC a una dilución de 1/100 en MT durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron una vez en MT, se resuspendieron con MT y analizaron con el citómetro de flujo o con el microscopio. Para el marcaje indirecto, se añadió anexina-biotina al MT durante el proceso de estimulación a una dilución de 1/200. Las células se sedimentaron con MT frío en hielo, se centrifugaron, se aspiró el sobrenadante y se resuspendieron con MT frío con estreptavidina-APC a una dilución de 1/200 y se mantuvieron en hielo durante 15 minutos. Después de sedimentar las células y aspirar el sobrenadante con estreptavidina-APC en exceso, se resuspendieron las células en MT y se observaron con el citómetro de flujo. En algunos experimentos, se aplicaron moléculas de marcaje secundario distintas, como la estreptavidina alexa 488 ó 594 (Molecular Probes, Inc.) para la visualización en el microscopio.

Resultados: Los resultados se muestran en la Figura 7. Las células MC-9 se estimularon con DMSO (figuras A y B) o con ionomicina 2 \muM (Figuras C y D) y luego se tiñeron con yoduro de propidio (PI) (Figuras A y C) y con anexina V-FITC (Figuras B y D). La estimulación con estas dosis de ionomicina no compromete la membrana plasmática tal como se demostró por un incremento no significativo en la tinción con PI en las células exocíticas. La desgranulación dio como resultado un incremento de la unión de anexina como puede verse comparando las Figuras D y B.

Ejemplo 6 Tinción de los gránulos exocíticos en las células MC-9 por la anexina-V-FITC y visualizado mediante microscopía confocal

Microscopía: Después de la estimulación o la tinción, las células se montaron en portaobjetos con cubreobjetos; se visualizaron directamente con el microscopía de campo claro y con el de fluorescencia en un microscopio invertido (TE300, Nikon) utilizando grupos de filtros BFP, FITC o TRITC. Algunas de las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio de rastreo confocal invertido (Zeiss, Inc. Bio-Rasd, Inc.) utilizando grupos de filtros estándares FITC y TRITC.

Resultados: Las células MC-9 se estimularon con ionomicina 2 \muM o con DMSO y se tiñeron con anexina-V-TITC y se montaron para ser observadas al microscopio confocal (resultados no mostrados). Todas las células no estimuladas viables mostraron una unión pobre con la anexina y ninguna tinción granular de superficie celular.

Ejemplo 7 La anexina-V-FITC tiñe los gránulos exocíticos en las células RBL-2H3 estimuladas con antígeno de unión

Salvo que se indique lo contrario, los procedimientos de este ejemplo se describieron en los ejemplos anteriores.

Resultados: Las células RBL-2H3 se sensibilizaron con IgE y se estimuló su exocitosis con tampón TM solo o con antígeno BSA-DNP (100 ng/ml) y luego se tiñeron con anexina-V-FITC. Se tiñeron numerosos gránulos de superficie celular en las células estimuladas por el antígeno con un patrón similar al observado con las células MC-9. Las células viables no estimuladas presentaron una tinción con anexina-V insignificante (resultados no mostrados).

Ejemplo 8 Enzimología in situ de las células en exocitosis visualizada con el FACS

Enzimología in situ : Las células MC-9 se estimularon para exocitosis tal como se describió anteriormente y luego se incubaron en el tampón del sustrato enzimático (BSA sin MT, pH 4,3-7,4) que contenía el sustrato ELF-97 glucurónido (250 \muM) durante 15 minutos a 37ºC. Las células se lavaron una vez en MT y luego se analizaron con el microscopio o con el citómetro de flujo. Otras metodologías se han descrito en los ejemplos anteriores.

Resultados: Los resultados se muestran en la Figura 8. Las células MC-9 se estimularon con DMSO (Figura A) o con A23187 (0,5 \mug/ml, Figura B y C) y luego se tiñeron para la actividad in situ de glucuronidasa. A) Histograma de citometría de flujo de la detección de ELF-97, indicativo del precipitado enzimático en la superficie celular. Se observó una señal débil en las células tratadas con DMSO. B) Histograma de citometría de flujo de la detección de ELF-97, indicativo del precipitado enzimático en la superficie celular. Se observó un incremento significativo en la señal después de la estimulación secretora con el ionóforo. C) Perfil de pH de la actividad enzimática de superficie celular. Se utilizó tampón MT a distintos pHs, para ver el perfil de pH de la señal observada en el citómetro de flujo. Los histogramas de barras representan el porcentaje de señal máxima (cuantificado por el desplazamiento medio del canal en el citómetro de flujo) observada. La actividad enzimática es pH dependiente con un pico inferior a pH 6; ello es consistente con la actividad enzimática derivada de gránulo secretor acídico.

Ejemplo 9 El lysotracker Green es liberado de los gránulos de mastocitos después de la exocitosis y puede detectarse mediante FACS

Tinción con colorantes Lysotracker: Los colorantes Lysotracker (azul, verde y rojo) se añadieron en las células mediante dilución a una concentración final de 1 \muM en medio completo y se incubaron las células durante 60 minutos a 37ºC en su presencia. Después de su adición, las células se lavaron dos veces con TM, de este modo las células estaban preparadas para el análisis de estimulación. Otras metodologías se han descrito en los anteriores ejemplos.

Resultados: Los resultados se muestran en la Figura 9. Las células MC-9 se tiñeron con el colorante Lysotracker verde durante 1 hora y luego se estimularon con DMSO o con ionomicina (2 \muM) y se visualizaron con el citómetro de flujo. Se muestra un histograma de intensidad de fluorescencia detectado en el canal 1; se observó una pérdida significativa de señal en la muestra estimulada con el ionóforo comparado con el control con DMSO, que es un reflejo de la liberación del colorante lysotracker verde de los gránulos secretores.

Ejemplo 10 Análisis multiparamétrico-Lysotracker verde, Anexina-V-APC, dispersión de luz frontal y lateral

Excepto que se indique lo contrario, se utilizaron las metodologías descritas en los ejemplos anteriores.

Resultados: Los resultados se muestran en la Figura 10. Las células MC-9 se trataron con dosis distintas de ionomicina (0 \muM-A, E; 1 \muM-B, F; 2 \muM-C, G; y 3 \muM-D, H) y se analizaron con el citómetro de flujo utilizando cuatro parámetros a la vez. Las células se tiñeron con lysotracker verde durante 1 h y luego se estimularon y tiñeron con anexina-VAPC. Figuras A-D: histogramas bivariados de la dispersión de luz lateral respecto a la frontal. A remarcar, los cambios dependientes de la dosis en ambos parámetros de izquierda a derecha, donde aumenta la dispersión frontal y disminuye la lateral. Figuras E-H: histogramas bivariados de las señales de anexina-V-APC respecto a las del lysotracker verde. A medida que la exocitosis aumenta (izquierda a derecha), la señal de anexina es mayor y la del lysotracker disminuye. Esto refleja la unión de la anexina-V a los gránulos de superficie celular y la pérdida de lysotracker de estos gránulos a medida que se exponen al medio extracelular.

Ejemplo 11 Análisis multiparamétrico- FM 1-43, Anexina-V-APV, dispersión de luz frontal y lateral

Resultados: Las células MC-9 se trataron con DMSO o ionomicina (2 \muM) y se observaron con el citómetro de flujo con cuatro parámetros simultáneamente. Las células se estimularon en presencia de FM 1-43 y se tiñeron con la anexina-V-APC (resultados no mostrados). Los cambios fueron dependientes de la estimulación en ambos parámetros a los 30 minutos. Se observaron incrementos dependientes de la estimulación en ambas señales. Los cambios reflejan la unión de la anexina-V con los gránulos de superficie celular y al mismo tiempo de la endocitosis acoplada del colorante FM1-43 en las células MC-9.

Ejemplo 12 Cuantificaciones multiparamétricas simultáneas en FACS se correlacionan con las lecturas enzimáticas de población

Ensayos de señalización del calcio: Las células MC-9 o RBL-2H3 se lavaron una vez con MT y se impregnaron con la sonda sensible al Ca^{++}, Fluo-3 (1 \muM, Molecular Probes, Inc.) en MT a 37ºC durante 20 minutos. Las células se lavaron una vez en MT atemperado y luego se estimularon utilizando el protocolo descrito anteriormente. La señal debida al aumento de la concentración de Ca^{++} intracelular se visualizó utilizando el citómetro de flujo (ver más adelante), el microscopio de fluorescencia, o la lectura con un lector de placas fluorescentes (Wallac, Inc.). La impregnación de las células se realizó liberando el colorante intracelular con MT y Triton-X-100 al 0,1%.

Resultados: Los resultados se muestran en la Figura 11. Las células MC-9 se estimularon en presencia de FM 1-43 y se tiñeron con anexina-V-APC tal como se describió anteriormente. En diversos puntos después de la estimulación con ionomicina, las células se colocaron en hielo y se analizaron mediante citometría de flujo o por su actividad enzimática (sobrenadante celular). Los parámetros de dispersión frontal, FM 1-43, anexina-V-APC y la hexominidasa se representaron en la gráfica relativa a la respuesta máxima para cada parámetro. Para la señalización del calcio, se cargó un tubo de células por separado con Fluo-3 y se realizó el mismo proceso. Los tiempos de duración de la citometría según los parámetros utilizados indicaron una buena correlación con la exocitosis, cuantificada por la liberación de hexominidasa. La dispersión frontal, en este ejemplo, muestra un efecto que varia positiva y negativamente con el tiempo.

Ejemplo 12 Expresión de las construcciones VAMP-GFP y VAMP-FRET Construcciones de cDNA

Construcción de VAMP-GFP: El cDNA de VAMP-2 de rata (obtenido de R. Scheller, Stanford University) se modificó mediante PCR para introducirlo en: 81) una diana BstXI en 5' de la secuencia consenso de Kozak y la inserción de glicina (a.a.2) para facilitar la expresión y la estabilidad in vivo, respectivamente; (2) un engarce de serina-glicina con una diana BamHI en el extremo 3'. La secuencia GFP codificante de CdimGFP (Clontech, Inc) se modificó mediante PCR para introducir una diana BstXI 3' que codificaba para un codón de parada. La fusión VAMP-GFP se construyó ligando los fragmentos rVMAP y GFP modificados por PCR en una diana BamHI en el engarce serina-glicina para crear una proteína de fusión en el mismo marco de lectura con la secuencia siguiente:

MGSATAATVPPAAPAGEGGPPAPPPNLTSNRRLQQTQAQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRAD
ALQAGASQFETSAAKLKRKYWWKNLKMMIILIIIIVYFST

GSGSGSGSGSGPVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWP
TLVTTLTHGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDF
KEDGNILGHKLEYNFNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYL
STQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKZ

La secuencia VAMP está subrayada, el engarce serina-glicina están en cursiva y la secuencia GFP en texto normal.

La secuencia de fusión VAMP-GFP se clonó en el vector retroviral 96.7 en las dianas BstXI direccionales para crear pVG. La secuencia se verificó secuenciando en ambas direcciones. La expresión propia se verificó en las células transfectadas y en las infectadas mediante análisis de transferencia de Western y microscopía de fluorescencia.

Construcción Trp-FRET: La secuencia codificante GFP de cGFP (Clontech, Inc) se modificó mediante PCR para crear: respectivamente (2) una diana SacII e'terminal que codificaba para la Ala228 en el extremo C-terminal. La secuencia codificante para BFP de cBFP (Clontech, Inc.) se modificó mediante PCR para crear: (1) una diana BamHI 5' que codificaba para la Ser2; (2) una diana BstXI 3' terminal que codificaba para un codón de parada. Se utilizaron un engarce de conversión SacII-BamHI que codificaba para el Factor X y dianas de corte de proteasas triptasas, flanqueados por espaciadores GSGS (GSGSIEGRLRKQGSCS) para fusionar GFP y el BFP en una proteína de fusión en el mismo marco de lectura con la secuencia siguiente:

MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQ
CFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKL
EYNYNSHNVYMADKQKNGIKVNEKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTOSALSKDPN
EKRDHMVLLEFVTAAGSGSIEGRLRKQGSGSKGEELFTGWPILVELDGDVNFGHKFSVSGEGEGDATYGKL
TLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTHGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVK
FEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQ
NTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKZ

La secuencia GFP está subrayada, el engarce FactorX/diana triptasa en cursiva y la secuencia BEP en texto normal.

La secuencia de fusión VAMP-GFP se clonó en las dianas BamHI y BstXI del vector retroviral 96.7 para crear pGX/TB. La secuencia se verificó secuenciando en ambas direcciones. La expresión correcta se verificó en las células transfectadas y en las infectadas mediante análisis de western y microscopía de fluorescencia.

La secuencia codificante VAMP-GFP se modificó mediante PCR para crear una diana SacII 3' terminal que codificaba para Ala228 en el extremo C-terminal. Este fragmento se cortó con XhoI y SacII y se clonó en las dianas XhoI/SacII de pGX/TB para crear pVGX/TB (Trp-FRET), que codificaba para rVAMP-2-BFP-dianas Factor X/Triptasa-proteína de fusión GFP con la secuencia siguiente:

GSATAATVPPAAPAGEGGPPAPPPNLTSNRRLQQTQAQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADA
LQAGASQFETSAAKLKRKYWWKNLKMMIILGVICAIILIIIIVYFSTGSGSGSGSGSGPV

SKGEELFTGWPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGLÑTÑLFICTTGKLPVPWPTLVTTLTHGVQCFS
RYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEY
NFNSHNVYMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKR
DHMVLLEFVTAAGSGSIEGRRKLQGSGSKGELLFTGWPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKIF
CTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEG
DTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPI
GDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKZ

La secuencia VAMP está subrayada, el engarce de serina-glicina en cursiva, el engarce de dianas Factor X/Triptasa en negrita y las secuencias GFP y BFP se muestran en texto regular.

La secuencia de fusión rVAMP-2-BFP-dianas FactorX/Triptasa-secuencia de fusión GFP se verificó secuenciando por ambas direcciones. La expresión correcta se verificó en las células transfectadas y las infectadas mediante análisis de Western, de microscopía de fluorescencia y análisis de FACS.

Transfecciones e infecciones: Para infectar las células MC-9 y las RBL-2H3 con los retrovirus recombinantes que expresan las construcciones Vamp, se llevaron a cabo los siguientes procedimientos: las células Phoenix E o A (obtenidas de G. Nolan, Stanford Univ.) se plaquearon en placas de 6 pocillos a 8x10^{5} células en 1,5 ml de medio (DMEM, FBS al 10%) el día uno. El día dos, se transfectaron 5 \mug de DNA en las células utilizando el procedimiento de precipitación con CaPO_{4} en presencia de cloroquina 50 \muM. El precipitado se incubó con las células durante 8 horas a 37ºC, después de lo cual, se retiró el medio, se realizó un lavado con medio fresco y se reemplazó con medio fresco para MC-9 o RBL-2H3; las células se incubaron a continuación a 32ºC durante 48-72 horas. El sobrenadante de las células Phoenix (sobrenadantes virales) se centrifugó a 1000 xg durante 10 min y se añadió protamina sulfato a una concentración final de 5 \mug/ml; este sobrenadante se añadió a las células MC-9 o RBL-2H3 recién tripsinizadas) en una placa de 6 pocillos (5x10^{5} células por pocillo) y la mezcla se centrifugó a 1000 xg durante 90 minutos a temperatura ambiente. Las células se incubaron a continuación a 32ºC durante 16 horas. Los sobrenadantes virales se extrajeron y se añadió medio nuevo; la expresión del gen dirigido se observó al cabo de 24 horas post-infección.

Claims

1. Procedimiento de rastreo para un agente bioactivo capaz de alterar un fenotipo celular, comprendiendo dicho procedimiento:

a) combinar por lo menos un agente bioactivo candidato y una población de células; y

b) seleccionar dichas células en un aparato de FACS, mediante la separación de dichas células considerando por lo menos cinco parámetros celulares.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde un librería de agentes bioactivos candidatos se combina con dicha población.

3. Procedimiento de rastreo para un agente bioactivo capaz de alterar un fenotipo celular, comprendiendo dicho procedimiento:

a) introducir una librería de ácidos nucleicos que codifica para un agente bioactivo candidato en una población celular; y

b) seleccionar dichas células en un aparato de FACS, mediante la separación de dichas células considerando por lo menos tres parámetros celulares.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicha librería es una librería retroviral.

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, en donde dicho fenotipo celular es la exocitosis y dichos parámetros celulares se seleccionan del grupo que consiste en: dispersión de luz, incorporación de colorante fluorescente, liberación de colorante fluorescente, unión de gránulos de anexina, actividad enzimática de gránulos de superficie y cantidad de proteínas específicas de gránulos.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, que además comprende someter dichas células a condiciones que normalmente causan exocitosis.

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, en donde dicho fenotipo celular es la regulación del ciclo celular y dichos parámetros celulares comprenden la viabilidad, la proliferación y la fase celular.

8. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 3, 4, 5, 6 ó 7, en donde dichos ácidos nucleicos comprenden:

a): dicho ácido nucleico que codifica para los mencionados agentes bioactivos candidatos; y

b): una molécula detectable.

9. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, en donde dichas células son células tumorales.

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el fragmento detectable es una proteína de fluorescente.