CN1304489A - 检测细胞参数变化和筛选小分子文库所用的多参数facs分析 - Google Patents

检测细胞参数变化和筛选小分子文库所用的多参数facs分析 Download PDF

Info

Publication number
CN1304489A
CN1304489A CN99807090.4A CN99807090A CN1304489A CN 1304489 A CN1304489 A CN 1304489A CN 99807090 A CN99807090 A CN 99807090A CN 1304489 A CN1304489 A CN 1304489A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
exocytosis
sequence
protein
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN99807090.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN100334227C (zh
Inventor
J·费舍尔
J·劳伦斯
D·帕严
A·罗西
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Rigel Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Rigel Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/062,330 external-priority patent/US6897031B1/en
Priority claimed from US09/157,748 external-priority patent/US6461813B2/en
Application filed by Rigel Pharmaceuticals Inc filed Critical Rigel Pharmaceuticals Inc
Publication of CN1304489A publication Critical patent/CN1304489A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100334227C publication Critical patent/CN100334227C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1079—Screening libraries by altering the phenotype or phenotypic trait of the host
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/43504—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from invertebrates
    • G01N2333/43595—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4718—Lipocortins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Measuring Pulse, Heart Rate, Blood Pressure Or Blood Flow (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Cephalosporin Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及通过使用多参数分析和荧光－激活的细胞分选(FACS)仪检测细胞或细胞群体中的细胞周期调节变化和筛选能调制细胞周期调节之药剂的新方法。

Description

检测细胞参数变化和筛选小分子文库 所用的多参数FACS分析
发明领域
本发明涉及使用荧光-激活的细胞分选(FACS)仪检测细胞参数变化，尤其是筛选能结合靶分子的小分子文库，如有机分子的组合化学文库，包括肽和其它化学文库的新方法。
发明背景
发现药物并筛选候选药物以鉴定样板化合物的领域发展很快。鉴定和表征新的和有用的候选药物的传统方法包括分离天然产物或合成制品，然后针对已知或未知的靶进行检测，例见WO94/24314,Gallop等，药物化学杂志，37(9):1233(1994)；Gallop等，药物化学杂志，37(10):1385(1994)；Ellman,Acc.Chem.Res.29:132(1996)；Gordon等，欧洲药物化学杂志，30:388s(1994)；Gordon等，Acc.Chem.Res.29:144(1996)；WO95/12608(皆列入本文作为参考)。
可用多种方法筛选这些文库，其中一个方法包括与玻珠结合并用染料显示；例见Neslter等，生物有机药物化学通讯，6(12):1327(1996)。另一种方法利用了玻珠和荧光激活的细胞分选(FACS)；例见Needles等，PNAS USA 90:10700(1993)和Vetter等，生物缀合物化学，6:319(1995)。
荧光激活的细胞分选(FACS)也称作流式细胞计量术，被用于根据光学特性(例如荧光)来分选各个细胞。该方法一般较为快速，可在相对较短的时间内筛选大的细胞群体。
在很多情况下，快速和经济的筛选(如FACS筛选)特别有意义，其中一个应用领域是细胞周期分析。细胞周期由M期开始，经过多个生长阶段，其间会发生有丝分裂和胞质分裂。M期之后是G1期，其中细胞恢复高速生物合成和生长。S期始于DNA合成，当核的DNA含量加倍时结束。然后细胞进入G2期，当有丝分裂开始时G2期结束，出现凝聚染色体即是G2期结束的信号。终末分化的细胞停滞于G1期，不再进行细胞分裂。
恶性肿瘤细胞的标志是毫无控制的增殖。该表型是通过积累基因突变而获得的，其中的大多数突变促进通过细胞周期进行传代。癌细胞不受生长调节信号的控制，一直进行着细胞分裂。典型的致癌基因，如ras导致细胞周期由G1期不恰当地转变为S期，酷似增殖的细胞外信号。细胞周期的关卡控制确保基因组能正确地复制和分离。细胞周期关卡控制的缺乏导致基因组的不稳定性，大大加快了驱动恶性肿瘤转化之突变的积累。因此，关卡调节剂，如p53和ATM(共济失调-毛细管扩张症突变的)也能用作肿瘤抑制剂。因此，用治疗剂调制细胞周期关卡途径可以利用正常和肿瘤细胞之间的差异，既能改善放射性-和化学疗法的选择性，也能导致产生新的癌症疗法。
因此，本发明的目的是提供可用于筛选细胞周期关卡调节之调制剂的组合物和方法。
特别适于使用快速筛选法的另一个领域是检测胞吐作用的领域。胞吐是分泌小泡与细胞质膜的融合作用，它具有两个主要的功能。一个是将小泡内容物卸至胞外间隙，另一个是使新蛋白质和脂质掺入质膜本身。
胞吐可分为两类：组成型和调节型。所有真核细胞都表现出组成型胞吐，其标志是在形成之后能持续融合分泌小泡。调节型的胞吐仅局限于某些细胞，包括外分泌，内分泌和神经元细胞。调节型胞吐导致与质膜融合的分泌小泡的积累，所述融合只在接收到适当信号后才会发生，所述信号通常为(但不总是)胞质中游离Ca2+浓度的增加。
调节型胞吐对很多特化细胞起着关键性的作用，特定的细胞经常由相同的胞吐颗粒释放出多种介体，这些介体共同作用以在靶细胞中产生相互协作的生理反应。这些调节型胞吐细胞包括神经元(释放神经递质)，肾上腺嗜铬细胞(分泌肾上腺素)，胰腺腺泡细胞(分泌消化酶)，胰腺β-细胞(分泌胰岛素)，肥大细胞(分泌组胺)，乳房细胞(分泌乳蛋白)，精细胞(分泌酶)，卵细胞(产生受精包膜)和脂肪细胞(将葡萄糖转运蛋白插入质膜)。另外，目前的理论表明：从酵母到哺乳动物的脑，小泡停靠和融合的基本机理是保守的。
另外，与胞吐有关的疾病是已知的。例如，由肥大细胞释放的炎症介体可导致多种疾病，包括哮喘。仅在美国，就有超过5000万的人患有哮喘，鼻炎或一些其它形式的变态反应。变态反应的治疗仍局限于阻断由肥大细胞释放的介体(抗-组胺)，而非特异性的抗炎症剂，如类固醇和肥大细胞稳定剂仅在抑制变态反应症状学方面勉强有效。类似地，Chediak-Higashi综合征(CHS)是一种罕见的常染色体隐性疾病，其中嗜中性白细胞，单核细胞和淋巴细胞以及大多数细胞含有大的胞质颗粒。在小鼠，水貂，牛，猫和逆戟鲸中也描述了类似的疾病，其中，描述最详尽的是CHS的鼠同系物(也称为beige或bg)，例见Perou等，生物化学杂志，272(47):29790(1997)和Barbosa等，自然，382:262(1996)(皆列入本文作为参考)。
另外，人们普遍相信神经递质胞吐和介体重新摄取之间的不平衡可引起很多种神经病。
已设计了大量药物，所述药物主要通过阻断胞吐介体的受体来特异性干扰胞吐介体。然而，该方法受以下事实的限制：即单个受体阻断剂不能克服很多种不同介体的影响。
因此，本发明的目的是提供筛选胞吐变化的方法，尤其是筛选能介导这种胞吐的药剂的方法。本发明的另一个目的是提供检测背景降低，特异性增加的上述筛选方法。
发明简述
根据上述目的，本发明提供了筛选生物活性剂的方法，所述生物活性剂能改变或调制细胞表型的变化。所述方法一般包括将至少一种候选生物活性剂与细胞群体混合，通过在至少3个，4个或5个细胞参数的基础上分离细胞以在FACS仪上分选细胞。候选药剂可以是含有编码候选生物活性剂之融合核酸的分子文库的一部分。
另一方面，本发明提供了在不同条件下或与不同生物活性剂联合筛选细胞群体或单个细胞中的胞吐变化的方法。所述方法包括通过检测至少3个特性的变化以在FACS仪上分选细胞，所述特性选自光散射，荧光染料摄取，荧光染料释放，膜联蛋白颗粒结合，表面颗粒酶活性和颗粒特异性蛋白质的量。
本发明还提供了筛选能调制细胞胞吐的生物活性剂的方法。所述方法包括混合候选生物活性剂和细胞群体，使所述细胞处于一般会导致胞吐的条件之下。通过检测至少3个特性的变化以在FACS仪上分选细胞，所述特性选自光散射，荧光染料摄取，荧光染料释放，膜联蛋白颗粒结合，表面颗粒酶活性和颗粒特异性蛋白质的量。与未暴露于候选生物活性剂的细胞相比，至少一个所述特性的变化表明所述生物活性剂能调制胞吐。
在筛选生物活性剂之方法的优选实施方案中，所选择的特性包括选自下列的至少一种特性：荧光染料释放，膜联蛋白颗粒结合，表面颗粒酶活性和颗粒特异性蛋白质的量。
当检测到荧光染料摄取时，优选染料是苯乙烯染料。当检测到荧光染料释放时，染料可以是低pH浓度的染料或苯乙烯染料。
在优选实施方案中，通过原位酶学分析或通过基于群体的酶分析可检测到表面颗粒酶活性。酶底物可以是任何可测的底物，优选酶底物与FRET构建体偶联。FRET构建体包括两个由蛋白酶位点分开的荧光蛋白。此时，蛋白酶位点特异于颗粒蛋白酶。
在优选的实施方案中，检测到颗粒特异性蛋白质。颗粒特异性蛋白质可以是任何可测的蛋白质。在一个实施方案中，颗粒特异性蛋白质是含有颗粒特异性蛋白质和可测分子的融合蛋白，所述可测分子可以是FRET构建体。
在另一个优选的实施方案中，提供了筛选能调制细胞胞吐的生物活性剂的方法，其中所述方法包括：使至少一种候选生物活性剂与各含有融合核酸的细胞群体混合，所述融合核酸含有编码颗粒特异性蛋白质和标记物的核酸。使所述细胞处于一般会导致胞吐的条件之下，并检测标记物量的变化。标记物量的变化表示该生物活性剂能调制胞吐。优选标记物是表位标记或荧光分子。在优选的实施方案中，荧光分子是FRET构建体。
另一方面，本发明提供了筛选胞吐调制剂的方法，所述方法包括使候选生物活性剂，含有编码可测颗粒特异性蛋白质之核酸的细胞和检测该蛋白质的试剂相混合。使所述细胞处于一般会导致胞吐的条件之下，并测定是否存在蛋白质。
在另一个优选的实施方案中，提供了筛选能调制细胞胞吐的生物活性剂的方法，所述方法包括将至少一种候选生物活性剂与细胞群体混合。使所述细胞处于一般会导致胞吐的条件之下，并加入荧光膜联蛋白。评估细胞表面荧光膜联蛋白量的变化。
在另一个优选的实施方案中，提供了筛选能调制细胞胞吐的生物活性剂的方法，所述方法包括提供细胞群体，其中细胞吸收了低pH浓度的染料。将荷载有低pH浓度染料的细胞与至少一种候选生物活性剂混合，并使所述细胞处于一般会导致胞吐的条件之下。检测低pH浓度染料的释放，所释放染料的量的变化表示该生物活性剂能调制胞吐。
在另一个优选的实施方案中，提供了筛选能调制细胞胞吐的生物活性剂的方法，所述方法包括将至少一种候选生物活性剂与细胞群体混合。使所述细胞处于一般会导致胞吐的条件之下，并加入特异于颗粒酶的荧光底物。检测特异于颗粒酶的荧光底物，其中荧光底物量的变化表示该生物活性剂能调制胞吐。在优选的实施方案中，底物包括FRET构建体。
另一方面，本发明提供了筛选能调制细胞中的细胞周期调节的生物活性剂的方法和组合物。所述方法包括混合候选生物活性剂文库和细胞群体，通过至少在细胞生活力试验，增殖试验和细胞期试验的基础上分离细胞以在FACS仪上分选细胞。
另一方面，本发明的方法包括在细胞文库中表达融合核酸文库。融合核酸含有编码候选生物活性剂和可测组成成分的核酸。通过分离细胞以在FACS仪上分选细胞；当细胞表型是细胞周期时，至少在细胞生活力试验，表达试验，增殖试验和细胞期试验的基础上分选细胞。
附图简述
图1A,1B和1C图示了实施例1中的3个逆转录病毒构建体。图1A包括CRU5-GFP-p21构建体，其依次含有CRU5启动子，ψ-逆转录病毒包装信号，与p21编码区融合的GFP编码区，以及LTR。图1B表示CRU5-GFP-p21C构建体，其包括p21C末端的24个氨基酸。图1C表示CRU5-GFP-pUCmut构建体，该构建体是CRU5-p21C经3个丙氨酸取代突变而成的。
图2A,2B,2C和2D显示了实施例1的实验结果。图2A表示利用正面和侧面散射的生活力试验。收集的是表现出特征性比例的细胞。图2B显示了载体的GFP荧光。图2C图示了包含染料PKH26在增殖试验中的用途；含有已知能抑制细胞的蛋白质p21的细胞仍能发出明亮的荧光，而对照细胞继续增殖，从而稀释了染料并失去荧光。图2D表示Hoechst 33342在细胞期试验中的用途。
图3显示了AraC处理对经p21(使细胞停滞在G1期的药剂)感染的Jurkat细胞的影响。AraC是对分裂中的细胞有毒的核苷酸类似物。因此，那些细胞周期停滞的细胞存活下来。下线表示不含p21插入物的Jurkat细胞，上线表示含有p21插入物的Jurkat细胞。
图4A和4B为条形图，图中显示出基于群体的胞吐酶的胞吐活性试验结果。图4A显示出混有DMSO(-)或离子霉素(+)的细胞上清液中的葡糖醛酸酶或氨基己糖苷酶活性。图4B显示出经用不同量的IgE抗-DNP致敏并用增加量的抗原BSA-DNP刺激的细胞的上清液中的氨基己糖苷酶活性。
图5A-5F显示了在流式细胞仪上观察到的RBL-2H3细胞(图5A和5D)和MC-9细胞(图5B,5C,5E和5F)的胞吐光散射变化图，所述图是侧面散射对正面散射的双变量直方图。用离子载体刺激之后，在0分钟(图5A和5C)，5分钟(图5E)，10分钟(图5D)和30分钟(图5B和5F)时观察细胞。
图6A-6E显示了通过FACS检测胞吐的苯乙烯染料试验结果图。在FM4-64(图6A和6B)或FM1-43(图6C,6D和6E)的存在下将细胞与DMSO(左峰)或离子霉素(右峰)混合。图6A和6C显示出荧光信道1中检测的细胞，图6B和6D显示出荧光信道3中检测的细胞。图6E为条形图，图中显示出在流式细胞仪的荧光信道1中检测到的通道转变平均值，其中在施用离子载体(方框1-4)或DMSO(方框5)之前，在FM1-43的存在下将细胞与不同剂量的P1-3激酶抑制剂渥曼青霉素预保温。
图7A-7D显示了通过FACS检测胞吐的膜联蛋白-V检测试验的结果图。将细胞与DMSO(图7A和7B)或离子霉素(图7C和7D)混合，然后用碘化丙锭(图7A和7C)和膜联蛋白-V-FITC(图7B和7D)染色。
图8A-8C显示了经FACS观察到的胞吐细胞原位酶学试验结果图。将细胞与DMSO(图8A)或离子霉素(图8B和8C)混合，然后染色显示原位葡糖醛酸酶活性。图8C显示了细胞表面酶活性的pH分布图，其中条形图表示最大信号的百分比，该百分比是通过流式细胞仪中观察到的通道转变平均值计算出来的。
图9是通道1中检测到的荧光强度的直方图，其中的细胞上荷载有LYSOTRACKER GREENTM，并与DMSO(左)或离子霉素(右)混合，在流式细胞仪中进行观察。
图10A-10H显示了包括检测LYSOTRACKER GREENTM，膜联蛋白-V-APC和正面散射与侧面散射的多参数分析的结果。图10A-10D和10E-10H各自显示了用增加剂量的离子霉素处理并在流式细胞仪中同时用4个参数进行观察的细胞。细胞上荷载有低pH浓度染料，刺激后用膜联蛋白-V-APC染色。图10A-10D显示了侧面光散射对正面光散射的双变量直方图，图10E-10H显示了膜联蛋白-V-APC对低pH浓度染料信号的双变量直方图。
图11显示了在FM1-43的存在下被刺激并经膜联蛋白-V-APC染色的细胞图。在经离子霉素刺激后的不同时间点，通过流式细胞仪分析细胞，并分析上清液(细胞上清液)中的酶活性。将相对于各个参数的最大反应的正面散射，FM-143，膜联蛋白-V-APC和氨基己糖苷酶的参数作于图上。对于钙信号传递而言，使独立管中的细胞荷载有Fluo-3并进行相同的操作。
发明详述
本发明涉及通过使用荧光激活的细胞分选(FACS)仪评价或分析多个细胞参数以检测细胞表型的变化，所述表型如细胞周期调节，胞吐，小分子毒性，细胞表面受体表达，酶表达等。可测定多个参数以检测多个细胞表型的变化，这一点将在下文中更详细地描述。通过依次或优选同时分析多个这些参数，可以进行快速和准确的筛选。
在优选的实施方案中，使用本文所述的方法筛选细胞表型的调制剂。可以测定的细胞表型包括但不限于细胞凋亡，包括细胞周期调节，胞吐，对小分子的毒性，包括受体(尤其是细胞表面受体)，粘附分子的很多组成成分的表达，细胞因子分泌，蛋白质-蛋白质相互作用等。
在优选的实施方案中，使用本文所述的方法评价细胞周期调节。在此实施方案中，优选的细胞参数或试验是细胞生活力试验，测定细胞是否在特定的细胞周期阶段停滞的试验(“细胞增殖试验”)和测定细胞在哪个细胞期停滞的试验(“细胞期试验”)。通过分析或测定上述的一个或多个参数，不仅可以检测细胞周期调节的变化，而且可以检测细胞周期调节途径的不同步骤的变化。通过上述试验可评价天然细胞，例如定量肿瘤细胞类型的攻击力，或者评价所检测的候选药剂对细胞周期调节的影响。通过这种方法可快速而准确地筛选候选药剂，从而鉴定出能调制细胞周期调节的药剂。
因此，本发明的方法可用于鉴定导致细胞群体从一个生长期进入另一个生长期或使细胞停滞于某个生长期的生物活性剂。在一些实施方案中，细胞停滞于特定的生长期，必需使它们脱离该生长期或者进入一个新的生长期。或者，必需使细胞停滞于某个生长期，如G1期，而不是继续完成整个细胞周期。类似地，在某些情况下，需要使未停滞但生长缓慢的细胞群体快一些进入下一细胞期或完成整个细胞周期，或者使下一个生长期延迟开始。例如，可以改变对引发细胞期变化有贡献的某些酶的活性，所述酶如激酶，磷酸酶，蛋白酶或遍在蛋白化酶。
在优选的实施方案中，对那些未停滞于G1期的细胞实施本文所述的方法；即所述细胞快速或不受控制地生长和复制，例如肿瘤细胞。通过此方法评价候选药剂以找到能改变细胞周期调节，即导致细胞停滞于细胞周期关卡，如G1期(但也可以停滞于其它细胞期，如S,G2或M)的药剂。或者，可评价候选药剂以找到能导致细胞群体增殖，即使通常停滞于G1期的细胞重新开始增殖的药剂；所述细胞如外周血细胞，终止分化的细胞，培养中的干细胞等。
因此，在优选的实施方案中，本发明提供了筛选细胞群体之细胞周期调节变化的方法。本文所述的“变化”和“调制”(在本文中可以互换使用)包括所测定参数或表型的增加和降低。对细胞周期调节而言的“变化”或“调制”通常指的是两种情况中的一种，即要么增加，要么降低。在优选的实施方案中，相对于另一个细胞或不同条件下的相同细胞而言，变化导致细胞的细胞周期发生改变，即处于增殖中的细胞停滞于任何一个生长期，或停滞的细胞脱离其停滞的生长期，重新开始细胞周期。或者，细胞渡过任何特定生长期的进程发生变化；即细胞渡过特定生长期的时间变短或变长。例如，细胞渡过G1期的时间通常为几小时；加入药剂可延长G1期。
可进行测定，其中每次测定的所有条件都相同，或在加或不加生物活性剂的不同条件下，或者在细胞周期进程的不同阶段进行测定。例如，可在存在或缺乏候选生物活性剂的情况下测定细胞群体的细胞周期调节。在另一个例子中，可在不同于其它细胞群体的条件或环境下测定某一细胞群体的细胞周期调节。例如，可在存在或缺乏生理信号时评价细胞，所述生理信号如激素，抗体，肽，抗原，细胞因子，生长因子，动作电位，药剂(即化学治疗剂等)，或其它细胞(即细胞-细胞接触)。在另一个例子中，在细胞周期进程的不同阶段测定细胞周期调节。在另一个例子中，在相同条件下测定细胞周期调节，所测定的变化是一个细胞或细胞群体与另一个细胞或细胞群体之间的变化。
本文所述的“细胞群体”或“细胞文库”或“多个细胞”指的是至少两个细胞，优选至少约103个细胞，尤其优选至少约106个细胞，特别优选至少约108至109个细胞。群体或样品可含有得自原代或继代培养物的不同细胞类型的混合物，但优选样品仅含有一种细胞类型，例如，样品可得自细胞系，尤其是肿瘤细胞系(尤其是下文所述的肿瘤细胞系中的一个)。细胞可处于任何细胞期，可以同步也可以不同步，包括M,G1,S和G2期。在优选的实施方案中，使用正在复制或增殖的细胞；这样就可以使用逆转录病毒载体导入候选生物活性剂。或者，也可使用非复制的细胞，此时可使用其它载体(如腺病毒和慢病毒载体)。另外，尽管不是必需的，细胞与染料和抗体相容。
本发明优选使用的细胞类型随欲调制的细胞表型的不同而不同。适当细胞包括但不限于哺乳动物细胞，包括动物(啮齿类动物，包括小鼠，大鼠，仓鼠和沙土鼠)，灵长类动物和人细胞，尤其包括所有类型的肿瘤细胞，包括乳腺癌，皮肤癌，子宫颈癌，结肠癌，白血病，脑瘤等的细胞。如上文所述，也可使用其它细胞类型筛选胞吐。
在优选的实施方案中，细胞周期调节法包括：通过在FACS仪中分析几个不同的细胞参数，包括但不限于细胞生活力，细胞增殖和细胞期来分选细胞。
在优选的实施方案中，分析了细胞生活力以确保细胞变化的缺乏是由实验条件(即导入候选生物活性剂)而不是细胞死亡引起的。可以使用多种适当的细胞生活力试验，包括但不限于光散射，生活力染料染色和排斥染料染色。
在优选的实施方案中，将本领域众所周知的光散射试验用作生活力试验。当在FACS中观察时，通过测定其正面和90°(侧面)光散射特性，细胞显示出特殊的特征。这些散射特性描述了细胞的大小，形状和颗粒含量。这些特性将测定的两个参数计算为生活力的读数。简单地说，正在死亡或已死亡的细胞的DNA通常是凝聚的，这改变了90°散射；类似地，膜上起泡也能改变正面散射。光散射强度或细胞-折射率的变化表示生活力的变化。
因此，一般说来，为了进行光散射分析，可评价特定细胞类型的活的细胞群体以测定其正面和侧面散射特性。籍此建立散射标准待随后使用。
在优选的实施方案中，生活力试验利用了生活力染料。有很多已知的生活力染料可以染色已死亡或正在死亡的细胞，但不会染色正在生长的细胞。例如，膜联蛋白V是显示出以依赖于二价离子的方式特异性结合磷脂(磷脂酰丝氨酸)的蛋白质家族的成员。该蛋白质被广泛用于测定细胞凋亡(编程性细胞死亡)，因为细胞表面露出磷脂酰丝氨酸是细胞凋亡过程的标志性早期信号。适当的生活力染料包括但不限于膜联蛋白，乙锭(ethidium)同型二聚体-1,DEAD Red，碘化丙锭，SYTOXGreen等和本领域已知的其它染料；例见：荧光探针和研究用化合物的分子探针手册，Haugland，第6版，列入本文作为参考；尤其参见第285页的细胞凋亡分析和第16章。
测定细胞生活力的生活力染料染色方法是已知的，例见MolecularProbes目录，文献同上。在此实施方案中，直接或间接标记诸如膜联蛋白的生活力染料，然后与细胞群体混合。膜联蛋白可以商购，即购自PharMingen,San Diego,California，或Caltag Laboratories,Millbrae,California。优选以溶液的形式提供生活力染料，其中染料浓度约为100ng/ml至约500ng/ml，更优选约为500ng/ml至约1μg/ml，最优选约为1μg/ml至约5μg/ml。在优选的实施方案中，直接标记生活力染料，例如用诸如异硫氰酸荧光素(FITC),Alexa染料，TRITC,AMCA,APC，三-色(tri-color)，Cy-5的荧光染料和本领域已知的或可商购的其它荧光染料标记膜联蛋白。在另一个优选的实施方案中，用诸如半抗原(如生物素)的第一个标记物标记生活力染料，另外还使用第二个荧光标记物，如荧光链霉抗生物素蛋白。本领域技术人员应理解，也可使用其它第一和第二标记对。
一旦加入生活力染料，使其与细胞保温一段时间，必要时进行洗涤。然后按下文所述分选细胞以除去未存活的细胞。
在优选的实施方案中，将排斥染料染色用作生活力试验。排斥染料是被活细胞排斥在外的染料，即它们不能被被动吸收(它们不能穿透活细胞的细胞膜)。然而，由于已死亡或正在死亡的细胞的可穿透性，它们能被死亡细胞吸收。排斥染料通常，但不总是经由例如嵌入结合DNA。优选排斥染料在缺乏DNA时不能发荧光或仅能发出很弱的荧光；这样就无需洗涤步骤。或者，也可以使用需要使用第二标记物的排斥染料。优选的排斥染料包括但不限于溴化乙锭；乙锭同型二聚体-1；碘化丙锭，SYTOX绿色核酸染色剂；Calcein AM,BCECF AM；二乙酸荧光素；TOTO和TO-PROTM(得自Molecular Probes；文献同上，见第16章)和本领域已知的其它染料。
测定细胞生活力的排斥染料染色方法是已知的，例见MolecularProbes目录，文献同上。通常，在细胞中加入的排斥染料的浓度约为100ng/ml至约500ng/ml，更优选约为500ng/ml至约1μg/ml，最优选约为0.1μg/ml至约5μg/ml，特别优选约为0.5μg/ml。将细胞与排斥染料保温一段时间，必要时进行洗涤。然后按下文所述分选细胞以从细胞群体中除去未存活的细胞。
另外，也可使用其它细胞生活力试验，包括例如酶试验，该试验可测定活细胞(即分泌的蛋白酶等)或死细胞(即培养基中胞内酶的存在，例如胞内蛋白酶，线粒体酶等)的胞外酶活性。例见：荧光探针和研究用化合物的分子探针手册，Haugland，第6版，列入本文作为参考；尤其参见第16章。
在优选的实施方案中，至少进行一个细胞生活力试验，优选至少进行两个不同的细胞生活力试验，其中荧光剂是相容的。当仅进行一个生活力试验时，优选实施方案利用了光散射试验(正面和侧面散射)。当进行两个生活力试验时，优选实施方案利用了光散射和染料排斥，也可利用光散射和生活力染料染色，在某些情况下也可进行这3个试验。因此，生活力试验可以将活细胞与非存活的或正在死亡的细胞分开。
除了细胞生活力试验外，优选实施方案还利用了细胞增殖试验。本文所述的“增殖试验”指的是可测定细胞群体在增殖，即复制还是不在复制的试验。
在优选的实施方案中，增殖试验是染料包含试验。染料包含试验依赖于区分细胞期的稀释效果。简单地说，将染料(通常为下文所述的荧光染料)导入细胞并被细胞吸收。染料一旦被吸收即陷入细胞，而不会渗出。由于细胞群体的分裂，染料也成比例地稀释。即导入包含染料之后，将细胞保温一段时间，逐渐失去荧光的细胞是正在分裂的细胞，保持荧光的细胞则停滞于非生长期。
一般说来，可以两种方法中的一种导入包含染料。任一种染料都不能被动进入细胞(例如带电的染料)，必须处理细胞以吸收染料；例如通过使用电脉冲。或者，染料可被动进入细胞，但吸收后即被修饰使得其不能渗出细胞。例如，对包含染料进行酶修饰可使其带电，从而不能渗出细胞。例如，Molecular Probes CellTrackerTM染料是可自由渗入细胞的荧光氯甲基衍生物，谷胱甘肽S-转移酶介导的反应产生了不能透过膜的染料。
适当的包含染料包括但不限于可得自Molecular Probes的CellTrackerTM染料系列，包括但不限于CellTrackerTM蓝，CellTrackerTM黄-绿，CellTrackerTM绿，CellTrackerTM橙黄，PKH26(Sigma)和本领域已知的其它染料；参见分子探针手册，文献同上；尤其参见第15章。
通常，给细胞提供的包含染料的浓度约为100ng/ml至约5g/ml，优选约为500ng/ml至约1μg/ml。洗涤步骤可用可不用。在优选的实施方案中，将候选生物活性剂与本文所述的细胞混合。将细胞与包含染料保温一段时间以使细胞分裂，从而使染料被稀释。保温时间的长度取决于特定细胞的细胞周期时间；通常，优选至少进行约2次细胞分裂，特别优选至少进行约3次细胞分裂，尤其优选至少进行约4次细胞分裂。然后按下文所述分选细胞以产生正在复制和不在复制的细胞群体。本领域技术人员应懂得，在某些情况下，例如当筛选抗增殖剂时，需收集发光(即荧光)的细胞；在其它实施方案中，例如筛选增殖剂时，需收集低荧光的细胞。通过测定不同时间点或不同细胞群体中的荧光，并将检测结果与另一个结果或标准结果相比较即可测定变化。
在优选的实施方案中，增殖试验是抗代谢物试验。一般说来，当需要导致细胞停滞于G1或G2静息期的药剂时，抗代谢物试验最为有用。在抗代谢物的增殖试验中，使用能杀死分裂细胞的有毒抗代谢物会导致只有非分裂的细胞才能存活。适当的抗代谢物包括但不限于标准的化学治疗剂，如氨甲蝶呤，顺式铂氨，红豆杉醇，羟基脲，核苷酸类似物，如AraC等。另外，抗代谢物试验可包括使用通过表达导致细胞死亡的基因。
所加入的抗代谢物浓度取决于特定抗代谢物的毒性，本领域技术人员容易确定该浓度。加入抗代谢物，一般将细胞保温一段时间；精确的保温时间取决于抗代谢物的特征和特性以及特定细胞群体的细胞周期时间。通常，保温时间足以发生至少一次细胞分裂。
在优选的实施方案中，至少进行一次增殖试验，优选进行一次以上的增殖试验。因此，增殖试验导致产生增殖细胞群体和停滞细胞群体。
在优选的实施方案中，在上文所述的一次或多次增殖试验之后或同时还进行了至少一次细胞期试验。“细胞期”试验可测定细胞停滞于哪个细胞期，是M,G1,S还是G2期。
在优选的实施方案中，细胞期试验是DNA结合染料试验。简单地说，DNA结合染料被导入细胞和被动吸收。一旦进入细胞，DNA结合染料一般通过嵌入与DNA结合，但在某些情况下，染料可以是主要的或次要的沟结合化合物。因此，染料的量与细胞中的DNA量直接相关，而DNA的量随细胞期的不同而变化；G2和M期细胞的DNA含量两倍于G1期细胞，S期细胞的DNA含量据中，这取决于细胞处于S期的哪个点。适当的DNA结合染料是可穿透的，其包括但不限于Hoechst 33342和33258，丫啶橙，7-AAD,LDS 751,DAPI和SYTO16，分子探针手册，文献同上；尤其参见第8和16章。
通常，所加入的DNA结合染料的浓度约为1μg/ml至约5μg/ml。在细胞中加入染料保温一段时间；保温时间的长度部分取决于所选择的染料。在一个实施方案中，在加入染料之后立即进行测定。然后按下文所述分选细胞以产生含有不同量染料，因此含有不同量DNA的细胞群体；通过这种方法，可将正在复制的细胞与不在复制的细胞分开。本领域技术人员应懂得，在某些情况下，例如当筛选抗增殖剂时，可将具有最少荧光(因此含有单拷贝基因组)的细胞与正在复制因此含有一拷贝以上基因组DNA的细胞分开。通过测定不同时间点或不同细胞群体中的荧光，并将检测结果与另一个结果或标准结果相比较即可测定变化。
在优选的实施方案中，细胞期试验是细胞周期蛋白破坏试验。在此实施方案中，在筛选之前(一般在导入下文所述候选生物活性剂之前)将融合核酸导入细胞。融合核酸含有编码细胞周期蛋白破坏盒的核酸和编码可测分子的核酸。“细胞周期蛋白破坏盒”是本领域已知的，它是在特定的细胞期阶段，经由含有所述破坏盒的蛋白质的遍在蛋白化途径导致破坏的序列。例如，G1细胞周期蛋白在G1期是稳定的，但在S期就会因G1细胞周期蛋白破坏盒的存在而被分解。因此，通过将细胞周期蛋白破坏盒与可测分子(例如绿色荧光蛋白)连接，观察是否存在可测分子即可鉴定细胞群体的细胞期。在优选的实施方案中，使用了多个盒，优选每个盒具有不同的荧光剂以检测细胞期。
本领域已知多个细胞周期蛋白破坏盒，例如，细胞周期蛋白A具有含有序列RTVLGVIGD的破坏盒；细胞周期蛋白B1的破坏盒含有序列RTALGDIGN，例见Glotzer等，自然，349:132-138(1991)。其它破坏盒也是已知的：YMTVSIIDRFMQDSCVPKKMLQLVGVT(大鼠细胞周期蛋白B)；KFRLLQETMYMTVSIIDRFMQNSCVPKK(小鼠细胞周期蛋白B)；RAILIDWLIQVQMKFRLLQETMYMTVS(小鼠细胞周期蛋白B1)；DRFLQAQLVCRKKLQVVGITALLLASK(小鼠细胞周期蛋白B2)；和MSVLRGKLQLVGTAAMLL(小鼠细胞周期蛋白A2)。
编码细胞周期蛋白破坏盒的核酸与编码可测分子的核酸可操作相连。通过本领域已知的方法构建融合蛋白。例如，将编码破坏盒的核酸与编码可测分子的核酸相连接。本文所述的“可测分子”指的是能使含有可测分子的细胞或化合物与不含有可测分子的细胞或化合物区分开的分子，即表位，有时也称为抗原TAG，特异性酶或荧光分子。优选的荧光分子包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)，蓝色荧光蛋白(BFP)，黄色荧光蛋白(YFP)，红色荧光蛋白(RFP)和包括萤光素酶和β-半乳糖苷酶的酶。当使用抗原TAG时，优选实施方案利用了细胞表面抗原。优选表位是任何可测的肽，所述肽不是胞质膜上常见的肽，但在某些情况下，如果表位是细胞上常见的肽，即可检测到增加，但一般不优选这种情况。类似地，也可使用酶可测分子，例如，可使用能产生新的或显色产物的酶。
因此，细胞期试验之后的分选结果一般导致产生至少两个处于不同细胞期的细胞群体。
在优选的实施方案中，使用本发明的方法筛选能调制细胞周期调节的候选生物活性剂，所述方法包括激活或抑制细胞周期关卡途径和改良关卡缺陷。可在细胞群体外部环境中加入候选生物活性剂，或者按下文所述将候选生物活性剂导入细胞中。
本文所用术语“候选生物活性剂”或“外源化合物”描述了任何分子，例如蛋白质，小的有机分子，糖(包括多糖)，多核苷酸，脂质等。通常以不同的生物活性剂浓度平行进行多个试验以得到对不同浓度的差异反应。一般说来，将其中一个浓度用作阴性对照，即0浓度或检测水平以下的浓度。另外，可使用阳性对照。例如，在细胞周期试验中，可使用已知能改变细胞周期的生物活性剂。例如，p21是已知能通过结合G1细胞周期蛋白-CDK复合物而将细胞停滞于G1细胞期的分子。类似地，为了检测胞吐，可使用已知能诱导胞吐的化合物，这一点将在下文中详细描述。
候选药剂包含多个化学类别，但它们一般是有机分子，优选为分子量大于100小于约2500道尔顿的小的有机化合物。候选药剂含有与蛋白质发生结构相互作用(尤其是氢键键合)所必需的功能基团，一般至少包括胺，羰基，羟基或羧基，优选至少包括两个功能性的化学基团。候选药剂经常含有被上述一个或多个功能基团取代的碳环或杂环结构和/或芳香或多芳香结构。候选药剂也可以是生物分子，其包括肽，多糖，脂肪酸，类固醇，嘌呤，嘧啶，以及它们的衍生物，结构类似物或其组合。特别优选的是肽。
候选药剂可得自多个来源，包括合成或天然化合物文库。例如，可使用多种方法随机和定向合成多种有机化合物和生物分子，包括表达随机化的寡核苷酸。或者，也可得到或容易地产生细菌，真菌，植物和动物提取物形式的天然化合物文库。另外，可通过常规的化学，物理和生物化学的方法容易地修饰天然或合成产生的文库和化合物。可对已知药剂进行定向或随机化学修饰，如酰化，烷基化，酯化，酰胺化以产生结构类似物。
在优选的实施方案中，候选生物活性剂是蛋白质。本文所述的“蛋白质”指的是至少两个共价结合的氨基酸，其包括蛋白质，多肽，寡肽和肽。蛋白质可由天然氨基酸和肽键或合成的肽模拟结构构成。因此，本文所述的“氨基酸”或“肽残基”指的是天然和合成的氨基酸。例如，高-苯丙氨酸，瓜氨酸和正亮氨酸也是可用于本发明的氨基酸。“氨基酸”还包括亚氨基酸残基，如脯氨酸和羟脯氨酸。侧链可以是(R)或(S)构型。在优选的实施方案中，氨基酸是(S)或L-构型。如果使用的是非天然侧链，则可使用非氨基酸取代基以防止或延迟体内降解。也可加入化学封闭基团或其它化学取代基。
在优选的实施方案中，候选生物活性剂是天然蛋白质或天然蛋白质的片断。因此，可使用例如含蛋白质的细胞提取物，或含蛋白质之细胞提取物的随机或定向消化物。通过这种方法，可在本文所述的系统中制备原核和真核蛋白质文库以用于筛选。在此实施方案中，特别优选的是细菌，真菌，病毒和哺乳动物的蛋白质文库，优选哺乳动物蛋白质文库，尤其优选人蛋白质文库。
在优选的实施方案中，候选生物活性剂是约5至约30个氨基酸，优选为约5至约20个氨基酸，特别优选为约7至约15个氨基酸的肽。肽可以是上文所述的天然蛋白质的消化物，随机肽或“偏性”随机肽。本文所述的“随机化”或其同义词指的是每个核酸和肽分别由基本上随机的核苷酸和氨基酸组成。由于这些随机肽(或下文将要讨论的核酸)一般是化学合成的，它们可在任何位置处掺入任何核苷酸或氨基酸。可设计合成方法以产生随机化的蛋白质或核酸，从而形成所有或大多数可能的序列长度组合，以形成随机化的候选生物活性蛋白质药剂文库。
在一个实施方案中，文库是完全随机化的，在任何位置处都没有序列优先或保持不变的序列。在优选的实施方案中，文库是有偏好的。即序列的某些位置要么保持不变，要么选自有限数目的可能性。例如，在优选的实施方案中，确定类型的核苷酸或氨基酸残基，例如疏水性氨基酸，亲水性残基，对空间有偏好(或小或大)的残基被随机化，以产生半胱氨酸用于交联，产生脯氨酸用于SH-3结构域，产生丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸或组氨酸用于磷酸化位点等，或者嘌呤被随机化等。
在优选的实施方案中，候选的生物活性剂是核酸。本文所述的“核酸”或“寡核苷酸”或其同义词指的是至少两个共价连接的核苷酸。本发明的核酸一般含有磷酸二酯键，但是，如下文所述，在某些情况下，上述核酸也包括具有另一种骨架的核酸类似物，其含有例如磷酸酰胺(Beaucage等，四面体，49(10):1925(1993)和其中提及的参考文献；Letsinger，有机化学杂志，35:3800(1970)；Sprinzl等，欧洲生物化学杂志，81:579(1977)；Letsinger等，核酸研究，14:3487(1986)；Sawai等，化学通讯，805(1984),Letsinger等，美国化学协会杂志，110:4470(1988)；和Pauwels等，Chemica Scripta,26:141(1986))，硫代磷酸酯(Mag等，核酸研究，19:1437(1991)；和美国专利5,644,048)，二硫代磷酸酯(Briu等，美国化学协会杂志，111:2321(1989)),O-甲基亚磷酰胺连键(见Eckstein，寡核苷酸和类似物：操作方法，牛津大学出版社)，和肽核酸骨架和连键(见Eghoim，美国化学协会杂志，114:1895(1992)；Mejer等，Chem.Int.Ed. Engl,31:1008(1992)；Nielsen，自然，365:566(1993)；Carisson等，自然，380:207(1996)，皆列入本文作为参考)。其它类似物核酸包括具有正骨架(Denpcy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:6097(1995))；非离子型骨架(美国专利5,386,023；5,637,684；5,602,240；5,216,141；和4,469,863；Kiedrowshi等，Angew.Chem.Intl.Ed.English,30:423(1991)；Letsinger等，美国化学协会杂志，110:4470(1988)；Letsinger等，核苷&核苷酸，13:1597(1994)；ASC专题讨论会丛书580“反义修饰糖类的研究”的第2和3章，Y.S.Sanghui和P.Dan Cook编；Mesmaeker等，生物有机化学&药物化学通讯，4:395(1994)；Jeffs等，生物分子NMR杂志，34:17(1994)；四面体通讯，37:743(1996))和非-核糖骨架(包括描述于美国专利5,235,033和5,034,506，以及ASC专题讨论会丛书580“反义修饰糖类的研究”的第6和7章(Y.S.Sanghui和P.Dan Cook编)中的骨架)的核酸。核酸的定义中还包括含有一个或多个碳环糖的核酸(见Jenkins等，化学协会评论(1995)p169-176)。Rawls,C&E News,June 2,1997,p35中描述了几个核酸类似物。上述所有参考文献都列入本文作为参考。可对核糖-磷酸骨架进行这些修饰以便于添加其它组成成分(如标记)，或者增加该分子在生理环境中的稳定性和半寿期。另外，可制备天然核酸和类似物的混合物。或者，可制备不同核酸类似物的混合物，和天然核酸和类似物的混合物。按照说明，核酸可以是单链或双链，或含有部分双链或单链序列。核酸可以是DNA(基因组DNA和cDNA),RNA或杂合体，其中核酸含有任意组合的脱氧核糖-和核糖-核苷酸，和任意组合的碱基，包括尿嘧啶，腺嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶，鸟嘌呤，肌苷，xathanine hypoxathanine，异胞嘧啶(isocytosine)，异鸟嘌呤(isoguanine)等。
如上文对蛋白质所作的一般性描述一样，核酸候选生物活性剂可以是天然核酸，随机核酸，或“偏性”随机核酸。例如，如上文对蛋白质所作的描述一样，可以使用原核或真核基因组的消化物。
在优选的实施方案中，候选生物活性剂是有机化学组成成分，其中的很多成分已在文献中描述过。
在优选的实施方案中，使用了不同候选生物活性剂的文库。优选文库应提供在结构上足够多样化的随机化生物活性剂群体以获得尽可能多的机会来结合特定的靶。因此，相互作用的文库应尽可能大以使其中的至少一个成员具有与靶有亲和力的结构。尽管难以估计相互作用文库所需的绝对大小，但免疫应答给我们提供了一个暗示：107-108个不同抗体的多样性提供了至少一个具有足够的亲和力以与生物体面临的大多数潜在抗原相互作用的组合。已知的体外选择技术显示出大小为107-108的文库足以筛选到与靶具有亲和力的结构。本文一般性建议的长度为7至20个氨基酸的肽的所有组合文库具有编码207(109)至2020的潜力。因此，具备107-108个不同分子的文库，本发明方法允许7个氨基酸在理论上完全的相互作用文库的“工作”子集，和2020文库的外形子集。因此，在优选的实施方案中，使用本发明方法同时分析至少106，优选至少107，更优选至少108和最优选至少109个不同的序列。优选方法使文库大小和多样性最大化。
在细胞或细胞群体中混合或加入候选生物活性剂。不同实施方案的适当细胞类型如上所述。使候选生物活性剂和细胞混合。本领域技术人员应懂得，使用多种方法中的任何一种或多种都可实现此目的，所述方法包括在细胞表面，在含有细胞的培养基中，或在细胞生长或接触的表面加入候选药剂；通过例如使用可将药剂导入细胞中的载体将药剂加入细胞中(即当药剂是核酸或蛋白质时)。
在优选的实施方案中，候选生物活性剂是使用载体(包括病毒载体)导入宿主细胞的核酸或蛋白质(此意义上的蛋白质包括蛋白质，寡肽和肽)。载体，优选为病毒载体的选择取决于细胞类型。当细胞正在复制时，可使用逆转录病毒载体，这一点将在下文详细描述。当细胞不在复制时(即停滞于某个生长期)，可使用其它病毒载体，包括慢病毒和腺病毒载体。
在优选的实施方案中，细胞正在复制或可经诱导而复制，可使用逆转录病毒载体将候选生物活性剂导入细胞，PCT US97/01019和PCTUS97/01048(皆列入本文作为参考)中一般性地描述了上述方法。通常，使用逆转录病毒包装细胞系制备逆转录病毒载体文库，所述细胞系为辅助细胞缺损的细胞系，它能产生所有必需的反式蛋白质，包括gag,pol和env，以及顺式具有ψ包装信号的RNA分子。简单地说，在逆转录病毒构建体骨架中产生文库；使用本领域众所周知的技术进行标准的寡核苷酸合成以产生候选药剂或编码蛋白质(例如随机肽)的核酸。产生DNA文库之后，将文库克隆至第一个引物中。第一个引物可用作“盒”，将该盒插入逆转录病毒构建体中。第一个引物一般含有多个元件，包括例如必需的调节序列(如翻译，转录，启动子等)，融合配对物，限制性内切核酸酶(克隆和亚克隆)位点，终止密码子(优选在所有3个框内)，与第二条引发链互补的区域(优选位于终止密码子区域的末端，因为在随机区域中可能会出现小的缺失或插入)等。
然后加入第二个引物，该引物一般由一些或所有互补区域(用于引发第一个引物)和任选的第二个唯一的限制性位点(用于亚克隆)的必需序列组成。加入DNA聚合酶以制备双链寡核苷酸。按下述用适当的亚克隆限制性内切核酸酶裂解双链寡核苷酸，然后亚克隆至靶逆转录病毒载体。
可使用很多适当逆转录病毒载体。通常，逆转录病毒载体包括：下文将要详细描述的选择标记基因；相对于5’LTR而言被置于有义或反义方向的，用于驱动第二个基因表达的启动子；CRU5(合成的LTR)，SIN中的四环素调节元件，细胞特异性启动子等。
优选的逆转录病毒载体包括基于鼠干细胞病毒(MSCV)(见Hawley等，基因治疗，1:136(1994))和经修饰的MFG病毒(Rivere等，遗传学，92:6733(1995))的载体和pBABE(见PCT US97/01019)。
逆转录病毒可含有表达候选药剂所用的诱导型和组成型启动子。例如，在某些情况下，仅在选定过程的某个时期，或仅在某个细胞期(即使用生长期特异性的启动子，如E2F反应启动子，p53反应启动子，细胞周期蛋白启动子等)必需诱导肽表达。多种诱导型和组成型的启动子是已知的。
另外，可设计逆转录病毒载体以在将单个载体转化至靶细胞之后能诱导表达逆转录病毒插入物；重要的是，整个系统包含在单个逆转录病毒中。经设计，在四环素-诱导型逆转录病毒中掺入了3’LTR增强子/启动子逆转录病毒缺失突变体的自我灭活(SIN)特征(Hoffman等，PNAS USA 93:5185(1996))。在四环素或其它活性类似物的存在下在细胞中表达该载体是肉眼观察不到的。然而，缺乏四环素时，在诱导后48小时之内表达达到最高水平，携有诱导型逆转录病毒的整个细胞群体的表达均一地增加，这表明被感染的细胞群体内的表达受到均一地调节。类似地，相关系统使用了突变的四环素DNA-结合结构域使其在存在四环素时能结合DNA，而在缺乏四环素时可被除去。其中的任一种系统都是合适的。
在优选的实施方案中，候选生物活性剂与融合配对物连接。本文所述的“融合配对物”或“功能性基团”指的是与候选生物活性剂相连的序列，它可赋予该类文库的所有成员以共同的功能或能力。融合配对物可以是异源的(即不是宿主细胞天然具有的)或合成的(不是任何细胞所天然具有的)。适当的融合配对物包括但不限于：a)呈递结构，如下文所述，该结构可提供构象受限制的或稳定形式的候选生物活性剂；b)靶向序列，如下文所述，该序列可使候选生物活性剂定位于亚细胞的或细胞外的区室内；c)获救序列，如下文所述，该序列可以纯化或分离候选生物活性剂或编码它们的核酸；d)稳定性序列，该序列可赋予候选生物活性剂或编码它们的核酸以稳定性或防止它们降解，例如赋予它们对蛋白酶解的抗性；e)二聚体化序列，该序列可以使肽二聚体化；或f)a),b),c),d)和e)的任何组合以及所需的接头序列。
在优选的实施方案中，融合配对物是呈递结构。本文所述的“呈递结构”及其同义词指的是序列，当该序列与候选生物活性剂融合时，会导致候选生物活性剂成为构象受限的形式。蛋白质主要通过构象受限的结构域而相互作用。尽管具有自由旋转的氨基和羧基末端的小肽具有本领域已知的潜在功能，但将该肽结构转变为药剂是困难的，因为无法预测合成模拟肽时的侧链位置。因此，呈递具有构象受限之结构的肽有利于以后产生药物，也可能导致肽与靶蛋白质之间较高亲和力的相互作用。在细菌噬菌体系统中使用生物产生的短肽，在组合文库产生系统中验证了上述事实。很多研究人员已构建了小结构域分子，其中可能提供了随机化的肽结构。
尽管候选生物活性剂可以是核酸或肽，但优选使用含有肽候选药剂的呈递结构。因此，合成的呈递结构，即人工多肽能将随机化的肽呈递为构象受限的结构域。这种呈递结构一般含有与随机化肽的N末端相连的第一部分和与肽的C末端相连的第二部分；即肽被插入呈递结构中，但如下文所述，也可以进行改变。为了增加随机化表达产物的功能性分离，可选择或设计呈递结构以使其在靶细胞中表达时具有最低的生物活性。
优选的呈递结构通过将肽呈递至外部环上而尽可能地靠近肽，因此，适当的呈递结构包括但不限于小体结构，β-折叠转角上的环和卷曲螺旋茎结构上的环(其中对结构不是至关重要的残基被随机化)，锌指结构域，半胱氨酸-连接的(二硫键)结构，转谷氨酰胺酶连接的结构，环肽，β-环结构，螺旋筒或螺旋束，亮氨酸拉链基元等。
在优选的实施方案中，呈递结构是卷曲螺旋结构，该结构可使随机化的肽被呈递至外部环上。例见Myszka等，生物化学，33:2362-2373(1994)(列入本文作为参考)。研究人员使用该系统分离出能与适当靶以高亲和力相互作用的肽。通常，卷曲螺旋结构允许有6至20个随机化位置。
优选的卷曲螺旋呈递结构如下：MGCAALESEVSALESEVASLESEVAALGRGDMPLAAVKSKLSAVKSKLASVKSKLAACGPP。下划线区域表示上文所述的卷曲螺旋亮氨酸拉链区域(见Martin等，EMBO J.13(22):5303-5309(1994)，列入本文作为参考)。黑体的GRGDMP区域表示环结构，当被随机化的肽(即候选生物活性剂，本文中一般以(X)n表示，其中X是氨基酸残基，n是至少为5或6的整数)适当取代时其长度可变。通过在下划线区域编码限制性内切核酸酶位点有利于取代黑体区域，这样就可以在这些位置处直接掺入随机化的寡核苷酸。例如，优选实施方案在双划线的LE位点产生了XhoⅠ位点，在双划线的KL位点产生了HindⅢ位点。
在优选的实施方案中，呈递结构是小体结构。“小体”实质上由小的抗体互补区域组成。小体呈递结构一般提供了两个随机化区域，在折叠的蛋白质中，该小体沿着四级结构的单一表面被呈递。例见Bianchi等，分子生物学杂志，236(2):649-59(1994)和其中提及的参考文献(皆列入本文作为参考)。研究人员已证明这一小结构域在溶液中是稳定的，并在组合文库中使用噬菌体选择系统选择出小体，该小体具有的肽区域对促炎细胞因子IL-6表现出高亲和力，Kd=10-7。
优选的小体呈递结构如下：MGRNSQATSGFTFSHFYMEWVRGGEYIAASRHKHNKYTTEYSASVKGRYIVSRDTSQSILYLQKKKGPP。黑体，下划线的区域是可以随机化的区域。第一个随机化区域中的斜体苯丙氨酸必须是不变的。将整个肽克隆至卷曲螺旋实施方案的3-寡核苷酸变异处，从而使两个不同的随机化的区域能同时掺入。该实施方案利用了末端的非-回文BstⅪ位点。
在优选的实施方案中，呈递结构是一般含有两个半胱氨酸残基的序列，从而形成二硫键，导致构象受限的序列。当使用分泌靶向序列时，特别优选此实施方案。本领域技术人员应懂得，含有或不含有间隔序列或连接序列的很多随机序列的侧翼都可具有半胱氨酸残基。在其它实施方案中，通过随机区域本身可产生有效的呈递结构。例如，可在随机区域中掺入半胱氨酸残基，在适当的氧化还原作用条件下可产生类似于呈递结构的具有高度交联结构的构象。类似地，可控制随机化区域以含有一些残基，所述残基可赋予β-折叠或α-螺旋结构。
在优选的实施方案中，融合配对物是靶向序列。本领域技术人员应懂得，细胞中的蛋白质定位是增加有效浓度和测定功能的简单方法。例如，当RAF1位于线粒体膜时可抑制BCL-2的抗细胞凋亡作用。类似地，与膜结合的Sos可诱导T淋巴细胞中由Ras介导的信号传递。据认为这些机理依赖于限制配体搜寻空间的原理，也就是说，蛋白质在质膜上的定位将对其配体的搜寻局限在膜附近有限维的空间而不是胞质的三维空间。或者，蛋白质的浓度也可简单地通过定位的特征而增加。将蛋白质穿梭至核中可使它们局限于较小的空间从而增加浓度。最终，配体或靶可简单地定位于特定的区室，而抑制剂必须适当地定位。
因此，适当的靶向序列包括但不限于：能导致表达产物与预定分子或分子类结合而同时能保持表达产物的生物活性的结合序列(例如通过使用酶抑制剂或底物序列靶向一类相关酶)；能发出选择性降解其自身或共结合的蛋白质之信号的序列；和能将候选表达产物组成型定位于预定细胞区域的信号序列，所述定位包括a)亚细胞定位，如高尔基体，内质网，核，核仁，核膜，线粒体，叶绿体，分泌小泡，溶酶体和细胞膜；和b)经由分泌信号在细胞外定位。特别优选的是定位于亚细胞位置或经由分泌定位于细胞外部。
在优选的实施方案中，靶向序列是核定位信号(NLS)。NLS一般是短的，带正电(碱性)的区域，它们出现在细胞核中可用于介导整个蛋白质的定位。已报道了多个NLS氨基酸序列，包括单个碱性NLS，如SV40(猴病毒)大T抗原的NLS(Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val),Kalderon(1984)等，细胞，39:499-509；人视黄酸受体β核定位信号(ARRRRP)；NFkB p50(EEVQRKRQKL；Ghosh等，细胞，62:1019(1990))；NFkB p65(EEKRKRTYE；Nolan等，细胞，64:961(1991))；和其它NLS(例见Boulikas，细胞生物化学杂志，55(1):32-58(1994)，列入本文作为参考)和两个碱性NLS，例如非洲爪蟾蛋白质核质蛋白的NLS(Ala Val Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys LysAla Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Leu Asp,Dingwall等，细胞，30:449-458,1982和Dingwall等，细胞生物学杂志，107:641-849；1988)。多项定位研究表明：掺入合成肽或移植到一般不会靶向细胞核的报道蛋白上的NLS会导致这些肽和报道蛋白在核中浓缩。例见Dingwall和Laskey，细胞生物学年评，2:367-390,1986；Bonnerot等，Proc.NatⅠ.Acad.Sci.USA,84:6795-6799,1987；Galileo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:458-462,1990。
在优选的实施方案中，靶向序列是膜锚着信号序列。该序列特别有用，因为除了很多细胞内事件源于质膜的这一事实外，很多寄生虫和病原体也与膜结合。因此，与膜结合的肽文库可用于鉴定这些过程中的重要元件以及用于发现有效的抑制剂。本发明提供了将随机化的表达产物呈递至细胞外或胞质空间的方法；见图3。为了呈递至细胞外，可在肽呈递结构的羧基末端提供膜锚着区域。在细胞表面表达随机化表达产物区域并呈递至细胞外间隙，以使其能结合其它表面分子(以实现其功能)或细胞外基质中存在的分子。这种分子的结合能赋予细胞表达与分子结合之肽的功能。胞质区域可以是中性的，或可含有结构域，当胞外随机化表达产物区域被结合时，该结构域可赋予细胞功能(激活激酶，磷酸酶，结合其它细胞成分以实现功能)。类似地，胞质区域中可含有含-随机化表达产物的区域，跨膜区和胞外区域保持不变或具有确定的功能。
膜锚着序列是本领域众所周知的，它以哺乳动物跨膜分子的遗传几何学为基础。根据信号序列(本文称之为ssTM)将肽插入膜，所述肽需要疏水性跨膜结构域(本文称之为TM)。将跨膜蛋白质插入膜以使编码跨膜结构域5’端的区域位于细胞外，而序列3’端位于细胞内。当然，如果这些跨膜结构域位于可变区的5’端，它们可用于将其锚着为胞内结构域，这在某些实施方案中是必需的。多种膜结合蛋白的ssTM和TM是已知的，因此可将这些序列用作特定蛋白质的配对物，或将这些序列与得自不同蛋白质的各个成分一起使用，或者，序列可以是合成的，并作为人工传递结构域完全得自共有序列。
本领域技术人员应懂得，对多种蛋白质而言，包括ssTM和TM的膜锚着序列是已知的，它们中的任一种都可以使用。特别优选的膜锚着序列包括但不限于得自CD8,ICAM-2,IL-8R,CD4和LFA-1的膜锚着序列。
有用的序列包括得自下列蛋白质的序列：1)Ⅰ类膜内在蛋白，如IL-2受体β-链(残基1-26是信号序列，241-265是跨膜残基；例见Hatakeyama等，科学，244:551(1989)和von Heijne等，欧洲生物化学杂志，174:671(1988))和胰岛素受体β-链(残基1-27是信号序列，957-959是跨膜结构域，960-1382是胞质结构域；例见Hatakeyama等，文献同上和Ebina等，细胞40:747(1985))；2)Ⅱ类膜内在蛋白，如中性内肽酶(残基29-51是跨膜结构域，2-28是胞质结构域；例见Malfroy等，生物化学与生物物理研究通讯，144:59(1987))；3)Ⅲ型蛋白质，如人细胞色素P450 NF25(Hatakeyama，文献同上)；和4)Ⅳ型蛋白质，如人P-糖蛋白(Hatakeyama，文献同上)。特别优选的是CD8和ICAM-2。例如，得自CD8和ICAM-2的信号序列位于转录物5’末端最靠外的位置。对CD8而言，这构成了氨基酸1-32(MASPLTRFLSLNLLLLGESILGSGEAKPQAP；Nakauchi等，PNAS USA 82:5126(1985))，对ICAM-2而言，这构成了氨基酸1-21(MSSFGYRTLTVALFTLI CCPG；Staunton等，自然(伦敦)339:61(1989))。这些前导序列将构建体传递至膜，而位于随机候选区域3’末端的疏水性跨膜结构域可用于将构建体锚着于膜中。这些跨膜结构域由CD8的氨基酸145-195(PQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIYIWAPLAGICVALLLSLIITLICYHSR；Nakauchi，文献同上)和ICAM-2的氨基酸224-256(MVIIVTVVSVLLSLFVTSVLLCFIFGQHLRQQR；Staunton，文献同上)构成。
或者，膜锚着序列包括GPI锚，例如，该锚在DAF中可导致分子和脂质双层之间经由糖基磷脂酰肌醇键的共价键(PNKGSGTTSGTTRLLSGHTCFTLTGLLGTLVTMGLLT，黑体的丝氨酸即为锚着位点；例见Homans等，自然333(6170):269-72(1988)和Moran等，生物化学杂志，266:1250(1991))。为了做到这一点，可将Thy-1的GPI序列插入可变区的3’端以取代跨膜序列。
类似地，十四烷基化的序列可用作膜锚着序列。已知c-src的十四烷基化可使其被吸收到质膜上。假设该蛋白质的前14个氨基酸仅负责此功能：MGSSKSKPKDPSQR(例见Cross等，分子细胞生物学，4(9):1834(1984)；Spencer等，科学262:1019-1024(1993)，皆列入本文作为参考)，这就是一个简单而有效的膜定位方法。已证明该基元能有效定位报道基因，并可用于锚着TCR的θ链。将该基元置于可变区的5’端以使构建体定位于质膜。可使用诸如十六酰化的其它修饰将构建体锚着于质膜；例如，得自与G蛋白-偶联的受体激酶GRK6序列的十六酰化序列(LLQRLFSRQDCCGNCSDSEEELPTRL，黑体的半胱氨酸被十六酰化；Stoffel等，生物化学杂志，269:27791(1994))；得自视紫红质的十六酰化序列(KQFRNCMLTSLCCGKNPLGD；Barnstable等，分子神经科学杂志，5(3):207(1994))；和p21H-ras1蛋白(LNPPDESGPGCMSCKCVLS；Capon等，自然302:33(1983))。
在优选的实施方案中，靶向序列是溶酶体靶向序列，包括例如溶酶体降解序列，如Lamp-2(KFERQ；Dice,Ann.N.Y.Acad.Sci.674:58(1992))或Lamp-1的溶酶体膜序列(MLIPIAGFFALAGLVLIVLIAYLIGRKRSHAGYQTI,Uthayakumar等，细胞分子生物学研究，41:405(1995))或Lamp-2的溶酶体膜序列(LVPIAVGAALAGVLILVLLAYFIGLKHHHAGYEQF,Konecki等，生物化学与生物物理研究通讯，205:1-5(1994)，两个序列中的斜体都表示跨膜结构域，下划线的是胞质靶向信号)。
或者，靶向序列可以是线粒体定位序列，包括线粒体基质序列(如酵母的醇脱氢酶Ⅲ；MLRTSSLFTRRVQPSLFSRNILRL QST；Schatz，欧洲生物化学杂志，165:1-6(1987))；线粒体内膜序列(酵母细胞色素c氧化酶亚单位Ⅳ；MLSLRQSIRFFKP ATRTLCSSRYLL；Schatz，文献同上)；线粒体膜间间隙序列(酵母细胞色素c1；MFSMLSKRWAQRTLSKSFYSTATGAASKSGKLTQKLVTAGVAAAGITASTLLYADSLTAEAMTA；Schatz，文献同上)或线粒体外膜序列(酵母70kD外膜蛋白；MKSFITRNKTAILATVAATGTAIGAYYYYNQLQQQQQRGKK；Schatz，文献同上)。
靶序列也可以是内质网序列，包括得自钙网蛋白的序列(KDEL；Pelham,Royal Society London Transactions B；1-10(1992))或得自腺病毒E3/19K蛋白的序列(LYLSRRSFIDEKKMP；Jackson等，EMBO J,9:3153(1990))。
另外，靶向序列也包括过氧化物酶体序列(例如，萤光素酶的过氧化物酶体基质序列；SKL；Keller等，PNAS USA 4:3264(1987))；法尼基化序列(例如，P21H-ras1；LNPPDESGPGCMS CKCVLS，黑体的半胱氨酸被法尼基化；Capon，文献同上)；香叶基香叶基化序列(例如，蛋白质rab-5A；LTEPTQPTRNQCC SN，黑体的半胱氨酸被香叶基香叶基化；Farnsworth,PNAS USA 91:11963(1994))；或破坏序列(细胞周期蛋白B1；RTALG DIGN；Klotzbucher等，EMBO J,1:3053(1996))。
在优选实施方案中，靶向序列是能影响候选翻译产物分泌的分泌信号序列。有很多已知的分泌信号序列位于肽可变区的5’端，从肽区域上裂解下该序列可使肽分泌至胞外间隙中。分泌信号序列及其转移至不相关的蛋白质的能力是众所周知的，例见Silhavy等(1985)，微生物学评论，49,398-418。这对产生能结合至不是宿主细胞的靶细胞(如表达肽的细胞)表面或影响靶细胞的生理学的肽特别有用。在优选的方法中，成形的融合产物依次含有分泌信号肽-呈递结构-随机化表达产物区域-呈递结构。通过这种方法，在导致表达肽文库的细胞附近生长的靶细胞周围含有分泌的肽。通过多种选择方案中的任一种定位对肽的存在作出反应(例如通过肽与表面受体的结合或通过肽的内部化和与胞内靶的结合)而表现出生理学变化的靶细胞和分泌细胞，并测定导致反应的肽。例举的反应包括设计细胞因子(即能导致造血干细胞分裂并维持其全能性的干细胞因子)，导致癌细胞自发性细胞凋亡的因子，与靶细胞细胞表面结合并特异性标记靶细胞的因子等的不同反应。
适当的分泌序列是已知的，包括得自IL-2的信号(MYRMQLLSCIALSLALVTNS；Villinger等，免疫学杂志，155:3946(1995))，生长激素的信号(MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPT；Roskam等，核酸研究，7:30(1979))；得自前胰岛素原的信号(MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVN；Bell等，自然，284:26(1980))；和流感病毒HA蛋白的信号(MKAKLLVLLYAF VAGDQI；Sekiwawa等，PNAS 80:3563)，在未下划线-下划线的连接处裂解。特别优选的分泌信号序列是分泌型细胞因子IL-4的信号前导序列，其含有IL-4的前24个氨基酸：MGLTSQLLPP LFFLLACAGNFVHG。
在优选的实施方案中，融合配对物是获救序列。获救序列是可用于纯化或分离候选药剂或编码候选药剂的核酸的序列。因此，例如，肽的获救序列包括纯化序列，例如与Ni亲和柱一起使用的His6标记物和用于检测，免疫沉淀或FACS(荧光激活的细胞分选)的表位标记。适当的表位标记包括myc(与商购的9E10抗体一起使用)，细菌酶BirA,flu标记，lacZ和GST的BSP生物素化靶序列。
或者，获救序列可以是独特的寡核苷酸序列，该序列可用作探针的靶位点以快速而容易地经由PCR，相关技术或杂交分离逆转录病毒构建体。
在优选的实施方案中，融合配对物是赋予候选生物活性剂或其编码核酸以稳定性的稳定序列。因此，例如，通过在起始甲硫氨酸之后掺入甘氨酸(MG或MGG0)，保护肽使其不会按照per Varshavsky N-EndRule遍在蛋白化，从而使肽稳定化，在胞质中的半寿期延长。类似地，C末端的两个脯氨酸使肽对羧肽酶作用的抗性大大增强。脯氨酸前面存在两个甘氨酸会增加柔性，并可防止二-脯氨酸中的结构导入事件蔓延至候选肽结构中。因此，优选的稳定序列如下：MG(X)nGGPP，其中X是任何氨基酸，n是至少为4的整数。
在一个实施方案中，融合配对物是二聚体化的序列。二聚体化的序列可以使一个随机肽与另一个随机肽非共价连接，其结合亲和力足以使两个随机肽在正常生理条件下保持连接。如果每个细胞产生两个肽，然后二聚体化以形成108(104×104)有效文库的话，就可以使小的随机肽文库(例如104)有效地变成大的文库。必要时也可形成较长的随机肽，或结构更加复杂的随机肽分子。二聚体可以是同二聚体或异二聚体。
二聚体化的序列可以是自我聚集的单个序列，或者是两个序列，每个序列在不同的逆转录病毒构建体中产生。即核酸编码具有二聚体化序列1的第一个随机肽和具有二聚体化序列2的第二个随机肽，通过将核酸导入细胞并表达核酸，二聚体化序列1与二聚体化序列2连接形成新的随机肽结构。
适当的二聚体化序列包含多个序列。很多的蛋白质-蛋白质相互作用位点都是已知的。另外，使用标准方法，如酵母双杂合系统，传统的生物化学亲和结合研究或甚至使用本发明的方法也可阐明二聚体化序列。
只要生物学和活性允许，可将融合配对物置于结构中的任何位置处(即N末端，C末端，内部)。
在优选的实施方案中，融合配对物包括PCT US97/01019中一般性描述的接头或限制序列，它们可以使候选药剂与潜在的不受妨碍的靶相互作用。例如，当候选生物活性剂是肽时，有用的接头包括甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n,(GSGGS)n和(GGGS)n，其中n是至少为1的整数)，甘氨酸-丙氨酸聚合物，丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域技术人员已知的多种其它柔性接头。优选甘氨酸-丝氨酸聚合物，因为这两种氨基酸相对不成结构，因此能用作组分之间的中性限制序列。第二，丝氨酸是亲水的，因此能溶解球状甘氨酸链。第三，类似的链显示出能有效连接重组蛋白质(如单链抗体)的亚单位。
另外，可以使包括呈递结构的融合配对物被修饰，随机化和/或成熟化以改变随机化表达产物的呈递方向。例如，可以修饰环底部的决定簇以稍微修饰内部环的肽四级结构，而所述结构仍保持随机化的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，使用的是融合配对物组合，因此，例如，可以使用呈递结构，靶向序列，获救序列和稳定序列的多种组合，同时还可以使用或不使用接头序列。
因此，候选药剂可以包括这些组分，然后可用于产生各含有不同随机核苷酸序列的片断文库，所述核苷酸序列编码不同的肽。然后用连接产物转化细菌，例如大肠杆菌，从所得文库中制备DNA，例见Kitamura,PNAS USA 92:9146-9150(1995)(列入本文作为参考)。
将文库DNA传递至逆转录病毒包装系统导致其转变为感染性病毒。适当的逆转录病毒包装系统细胞系包括但不限于WO 94/19478,Soneoka等，核酸研究，23(4):628(1995),Finer等，血液，83:43(1994)中所述的Bing和BOSC23细胞系；Pheonix包装细胞系，如下文所述的PhiNX-eco和PhiNX-ampho；292T+gag-pol和逆转录病毒包膜；PA317；和Markowitz等，病毒学，167:400(1988),Markowitz等，病毒学杂志，62:1120(1988),Li等，PNAS USA 93:11658(1996),Kinsella等，人类基因治疗，7:1405(1996)(皆列入本文作为参考)中所述的细胞系。优选系统包括PhiNX-eco和PhiNX-ampho或PCT US97/01019中描述的类似细胞系。
当细胞不在复制时，可使用其它病毒载体，包括逆转录病毒载体，猪免疫病毒(FIV)载体等。
在优选的实施方案中，当使用病毒载体将候选药剂导入细胞中时，候选肽药剂与可测分子连接，本发明的方法至少包括一个表达试验。表达试验是测定候选生物活性剂是否表达，即细胞中是否存在候选肽药剂的试验。因此，通过将候选药剂的表达与可测分子(如标记物)的表达相连接，即可测定是否存在候选肽药剂。因此，在此实施方案中，候选药剂与可测分子可操作相连。通常，通过产生融合核酸可实现此目的。融合核酸包括编码候选生物活性剂的第一个核酸(它可包括上文所述的融合配对物)，和编码可测分子的第二个核酸。术语“第一个”和“第二个”不是指相对于融合核酸的5’至3’方向的序列方向。例如，假定融合序列为5’至3’方向，第一个核酸可以位于第二个核酸的5’方向，也可以位于第二个核酸的3’方向。此实施方案中的优选的可测分子包括但不限于荧光蛋白，包括GFP,YFP,BFP和RFP，尤其优选前者。
通常，在有利于药剂-靶相互作用的反应条件下将候选药剂加入细胞(如上文所述，加入胞外或胞内)。所述条件一般是生理条件。可在有利于最佳活性的任何温度下进行保温，一般为4至40℃之间。选择保温时间以得到最佳活性，但也可使保温时间最优化以有利于快速的高物料流通量的筛选。一般保温0.1至1小时就足够了。一般应除去或洗去过量试剂。
试验中可包括多种其它试剂，其中包括盐，中性蛋白质(如白蛋白)，去污剂等试剂，使用这些试剂有利于最佳的蛋白质-蛋白质结合和/或降低非特异性的或背景相互作用。也可使用能改善试验效率的试剂，如蛋白酶抑制剂，核酶抑制剂，抗微生物剂等。可以能提供所需结合的任何次序添加组分混合物。本领域技术人员知道应对细胞进行不同次数的洗涤或浸洗，其中还包括使用过滤和离心。当使用第二个标记组成成分(本文也称之为“第二标记物”)时，优选在除去过量的非结合靶分子之后加入该成分以降低非特异性结合；然而，在某些情况下，可同时加入所有成分。
在优选的实施方案中，使用荧光激活的细胞分选(FACS)分选细胞。在本发明中，通过导致背景降低和特异性更强的多个参数评价细胞周期调节。相反，过去人们使用FACS是为了同时评价两个不同的或不相关的特征，这样可以鉴定具有这两个特征的细胞，但不能降低组合特征的背景。
因此，根据一个或多个试验在FACS中分选或富集细胞，所述试验包括细胞生活力试验，增殖试验，细胞期试验和(当候选药剂与可测的组成成分一起表达时)表达试验。将一个或多个上述试验的结果与未暴露于候选生物活性剂的细胞或导入候选药剂之前的相同细胞相比较。这些结果的变化表示所述药剂可调制细胞周期调节。
本发明的优点是可在细胞文库中检测候选药剂文库，因为本发明的方法可以以极高的特异性分选单个细胞，从而检测出很少发生的事件。使用多个激光通道可使106中的分选准确率为1，准确率大于70％。
另外，本发明除了可鉴定多个细胞周期调节特性外，还可以鉴定其它细胞特性。例如，通过使用表示钙反应的染料Indo-1可测定并选择反映细胞健康状况的参数。本领域技术人员可常规鉴定的其它细胞参数包括但不限于：细胞大小，细胞形状，氧化还原作用状态，DNA含量，核酸序列，染色质结构，RNA含量，总蛋白，抗原，脂质，表面蛋白，胞内受体，氧化代谢，DNA合成和降解和胞内pH。
在优选的实施方案中，由单个细胞同时测定各个检测结果，因为该细胞穿过多个激光的光束通道，或者，可依次测定各个检测结果。通过使用一个以上的参数检测细胞周期调节或细胞周期调节中的变化，背景降低而特异性增加。可从不符合所需参数的细胞中物理分选出符合所需特性之参数的细胞，或者可通过该细胞在细胞群体中的百分比来鉴定该细胞。
通常，优选KDs≤1μM以使FACS分选中存在的剪切力可保留结合。在优选的实施方案中，以很高的速度分选细胞，例如以大于约5,000个分选事件/秒的速度，优选以大于约10,000个分选事件/秒的速度，特别优选以大于约25,000个分选事件/秒的速度，尤其优选以大于约50,000至100,000个分选事件/秒的速度分选细胞。
经刺激和染色处理的细胞一般被置于缓冲液中，并在进行细胞计数之前过滤。可使用FACSCAN(Becton Dickinson公司，激光线路488nm)或Mo-Flo(Cytomation公司，激光线路350nM宽带(UV),488nm和647nm)细胞计数器分析细胞。必要时可使用Mo-Flo分选细胞。
当通过显微术分析细胞时，一般将经刺激或染色后的细胞置于玻片上并盖上盖玻片；通过在使用标准的BFP,FITC或TRITC(例如)成套滤光片的倒置显微镜(即TE300,Nikon)中经明视野和荧光显微术可直接观察细胞。利用使用标准的FTTC和TRITC(例如)成套滤光片的倒置共聚焦扫描显微镜(Zeiss公司，Bio-Rad公司)也可得到影像。
分选导致产生具有所需特性的细胞群体。在优选的实施方案中，设置参数以鉴定至少一个可调制细胞周期调节的候选生物活性剂。
在优选的实施方案中，鉴定了生物活性剂。本领域技术人员应知道如何进行鉴定，所述方法一般包括分析生物活性剂的结构，特性，结合亲和力和功能。通常，一旦鉴定出生物活性剂，可重新合成该生物活性剂，并使其与靶细胞混合以在不同条件下和存在或缺乏其它多种药剂时证实细胞周期调节的调制作用。可制备治疗有效量的生物活性剂以调制细胞周期调节并与适当的药物载体混合。
在优选的实施方案中，可使细胞群体经受含和不含候选药剂的多种实验条件。条件的变化包括但不限于pH，温度，缓冲液或盐浓度等的变化。在优选的实施方案中，pH有所变化，一般是增加或降低pH，通常使pH变化约0.5至约3个pH单位。或者可改变温度，优选将温度增加或降低约5℃至约30℃。类似地，也可改变盐浓度，优选将盐浓度增加或降低约0.1M至约2M。
本领域技术人员应理解本文所提供的分析步骤可以一定的次序改变。然而，也应理解尽管本文提供了多个选择(对化合物，选定特性或步骤顺序的选择)，也可单独提供各个选择，并将其中的每一个选择与本文所提供的其它选择分开。另外，本领域显而易见的和已知的能增加分析的敏感性的步骤也包括在本发明的范围之内。例如，还可包括洗涤步骤，或分离步骤。另外，应懂得在某些情况下检测在细胞中进行，但也可在培养基中进行检测，反之亦然。
在优选的实施方案中，细胞表型是胞吐，本发明的方法和组合物涉及使用FACS仪检测胞吐的变化。可评价或分析多个参数以检测胞吐途径的变化，所述参数包括但不限于光散射，荧光染料摄取，荧光染料释放，颗粒暴露，表面颗粒酶活性和颗粒特异性蛋白质的量。通过分析或测定一个或多个这些参数，不仅可以检测胞吐的变化，还可以检测胞吐途径不同步骤的变化。另外，多参数分析还可以降低检测到的背景，或“错误的阳性结果”。通过这种方法，可快速而准确地筛选候选药剂以鉴定出调制胞吐的药剂。
在优选的实施方案中，本发明提供了筛选细胞群体胞吐变化的方法。对胞吐而言的“变化”或“调制”指的是与另一个细胞或不同条件下的相同细胞相比，一个细胞中的胞吐量降低或增加。可进行检测，其中每次检测的所有条件都相同，或在含或不含生物活性剂的不同条件下进行检测，或在胞吐过程的不同阶段进行检测。例如，可在存在或缺乏候选生物活性剂的情况下测定细胞群体的胞吐。在另一个例子中，可在不同于其它细胞群体的条件或环境下测定某一细胞群体的胞吐。例如，可在存在或缺乏生理信号时评价细胞，所述生理信号如胞吐诱导物(即Ca++，离子霉素等)，激素，抗体，肽，抗原，细胞因子，生长因子，动作电位，或其它细胞(即细胞-细胞接触)。在另一个例子中，在胞吐过程的不同阶段测定胞吐。在另一个例子中，在相同条件下测定胞吐，所测定的变化是一个细胞或细胞群体与另一个细胞或细胞群体之间的变化。
本文所述的“细胞群体”指的是上文所述的细胞样品。在此实施方案中，优选细胞(但不是必须)快速生长，可被逆转录病毒感染，并可与染料和抗体相容。用于此实施方案的优选细胞类型包括但不限于肥大细胞，神经元，肾上腺嗜铬细胞，嗜碱性粒细胞，内分泌细胞，包括胰腺β-细胞，胰腺腺泡细胞，包括外泌细胞，嗜中性白细胞，单核细胞，淋巴细胞，乳房细胞，精细胞，卵细胞和PMN白细胞，内皮细胞，脂肪细胞和肌肉细胞。
胞吐方法包括在FACS仪中通过分析至少3个特性的变化来分选细胞，所述特性选自光散射，荧光染料摄取，荧光染料释放，颗粒暴露，表面颗粒酶活性和颗粒特异性蛋白质的量。在优选的实施方案中，由单个细胞同时测定各个检测结果，因为该细胞穿过多个激光的光束通道，或者，可依次测定各个检测结果。通过使用一个以上的参数检测胞吐或胞吐的变化，背景降低而特异性增加。可从不符合所需参数的细胞中物理分选出符合所需特性之参数的细胞，或者可通过该细胞在细胞群体中的百分比来鉴定该细胞。
在优选的实施方案中，分析光散射的变化以测定细胞群体胞吐的变化。当在FACS中观察时，通过测定其正面和90°(侧面)光散射特性，细胞显示出特殊的特征。这些散射特性描述了细胞的大小，形状和颗粒含量。通过用促-胞吐的刺激物激活细胞，细胞的正面和侧面散射特性有相当大的改变。这些特性将测定的两个参数计算为胞吐事件的读数。这些特性的变化与细胞的胞吐程度成比例，也取决于胞吐事件的时程。光散射强度或细胞-折射率的变化表示相同细胞在不同时间的胞吐变化，或者与含或不含候选生物活性剂的不同条件下的相同细胞相比，或与不同细胞或细胞群体细胞相比的胞吐变化。
在本文提供的一个实施方案中，将细胞群体与已知能刺激胞吐的药剂混合并测定光散射特性。鉴定和/或分选具有表示所需胞吐活性之光散射特性的细胞。本文所用胞吐活性包括缺乏活性。在优选的实施方案中，在加入胞吐刺激物之前或加入的同时使候选生物活性剂与细胞群体混合，这一点将在下文中详细描述。在此实施方案中，下列两组物质之间的光散射特性有所不同：a)细胞群体与已知的胞吐刺激物和候选生物活性剂混合，和b)细胞群体与已知的胞吐刺激物混合，其中缺乏候选生物活性剂，可以测定候选生物活性剂能调制胞吐。在某些情况下也需要包括胞吐抑制剂或排除胞吐刺激物以鉴定能诱导胞吐的生物活性剂。优选在测定光散射特性的同时还测定至少一个，优选为两个可表示胞吐活性的其它特性。光散射测定的一般方法学进一步描述于Perretti等，药学方法杂志，23(3):187-194(1990)和Hide等，细胞生物学杂志，123(3):585-593(1993)(皆列入本文作为参考)。通常，优选相对于基线而言变化至少约5％，更优选变化至少约25％，特别优选变化至少约50％，尤其优选变化至少约75至100％。此时的基线一般指的是细胞经胞吐刺激之前的光散射特性。在本文所提供的每种情况下，也可为任何控制参数设置基线。例如，可在测定特定细胞，不同条件下的类似细胞或胞吐过程中的特定时间点的类似细胞的胞吐时设置基线。
在另一个优选的实施方案中，评价了荧光染料摄取的变化。优选的荧光染料包括苯乙烯染料，它表示相对于胞吞的胞吐活性，有时也称作偶联胞吞。有关偶联胞吞的理论是经受胞吐的细胞必须也经受胞吞以维持细胞体积和膜的完整性。因此，通过胞吐刺激，胞吞也有所增加，通过确定所摄取的苯乙烯染料的量即可以间接测定胞吐。
在本文提供的一个实施方案中，将细胞置于苯乙烯染料的溶液中，并用促胞吐的刺激物进行刺激，然后测定染料的量。优选在胞吐刺激之后离心细胞，抽吸并重新悬浮于新鲜的缓冲液中。在优选的实施方案中，按本文所述混合候选生物活性剂和细胞。在某些情况下，在含有胞吐抑制剂或不含促胞吐刺激物时混合候选生物活性剂和细胞。优选在细胞群体中加入促胞吐刺激物，这会显著增加染料的荧光信号。增加的与细胞相关的信号是由苯乙烯染料的偶联胞吞引起的，它在时间和强度上与胞吐反应成比例。相反，当胞吐被抑制或未被诱导时，信号未增加。通过测定不同时间点或不同细胞群体中的荧光，并与其它或标准的测定结果相比较即可测定变化。通常，优选相对于基线而言变化至少约50％，更优选变化至少约75％至100％，特别优选变化至少约250％，尤其优选变化至少约1000-2000％。此时基线指的是细胞在胞吐刺激之前的苯乙烯染料摄取。
优选的苯乙烯染料包括但不限于FM1-43,FM4-64,FM14-68,FM2-10,FM4-84,FM1-84,FM14-27,FM14-29,FM3-25,FM3-14,FM5-55,RH414,FM6-55,FM10-75,FM1-81,FM9-49,FM4-95,FM4-59,FM9-40及其组合。诸如FM1-43的优选染料在水中仅发出微弱的荧光，但当与膜结合时可发出很强的荧光，从而使染料摄取易于分辨。适当的染料可以商购，即Molecular Probes公司，Eugene,Oregon，“荧光探针和研究用化合物手册”，第6版，1996，尤其参见第17章，特别是第17章的第2节(包括参照的相关章节)(列入本文作为参考)。优选在溶液中提供染料，其中染料浓度约为25至1000-5000nM，优选约为50至约1000nM，特别优选约为50至250nM。苯乙烯染料的使用进一步描述于Betz等，神经生物学最新观点，6:365-371(1996)(列入本文作为参考)。优选在测定荧光染料摄取的同时还测定至少一个，优选为两个其它的胞吐活性指示参数。
在另一个优选的实施方案中，评价荧光染料释放的变化。本发明部分涉及发现低pH浓度的染料，该染料一般用于染色溶酶体，在低pH下也可染色胞吐颗粒。通常，这些染料可被细胞被动吸收，并在颗粒中浓缩；然而，细胞经诱导后可通过偶联胞吞吸收染料。在优选的实施方案中，将细胞群体置于低pH浓度的染料中以使染料被细胞吸收。优选洗涤细胞。可将细胞暴露于促-胞吐的刺激物和/或抑制剂中。在优选的实施方案中，将候选生物活性剂与细胞群体混合，优选加入促-胞吐的刺激物。评价荧光。细胞之间或相同细胞在不同时间点的荧光染料释放变化表示胞吐的变化。优选变化发生在细胞之间，最优选发生在加入了不同生物活性剂的细胞之间。优选相对于基线而言变化至少约5％，更优选变化至少约25％，特别优选变化至少约50％，尤其优选变化至少约100％。此时基线指的是刺激前细胞中的染料量。
在此实施方案中，优选低pH浓度染料。这种低pH浓度染料包括但不限于丫啶橙，LYSOTRACKERTM红，LYSOTRACKERTM绿和LYSOTRACKERTM蓝。这种染料可以商购，即得自Molecular Probes，文献同上，尤其包括第17章，第17章第4节，和参照的“相关章节”，即第23章。在优选的实施方案中，使用的是溶液形式的染料，其中染料浓度约为50nM至约25μM，优选染料浓度约为5μM至约25μM，特别优选染料浓度约为1至5μM。低pH浓度染料的使用一般描述于(关于溶酶体的研究)Haller等，细胞钙，19(2):157-165(1996)(列入本文作为参考)。
在评价荧光染料释放之变化的另一个实施方案中，评价的是释放至上清液中的荧光。在此实施方案中，使用能可逆标记胞吞膜的苯乙烯染料或低pH浓度染料。在此实施方案中，将细胞群体置于染料中以使细胞被动吸收染料，或通过诱导来吸收染料。然后优选洗涤细胞。可将细胞暴露于促-胞吐刺激物和/或抑制剂中，任选加入候选生物活性剂。暴露于促-胞吐刺激物中的细胞会将染料释放至胞外介质中。可测量或检测介质中的荧光。该方法有时被称作使细胞脱色。任选加入能改进和便于检测介质中的染料的试剂。例如，可形成微胶粒的去污剂，如3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙铵]-丙磺酸(CHAPS)能增加荧光，从而可检测少量胞吐活性。染料释放的变化表示相同细胞，细胞之间，最优选为加入了不同生物活性剂的细胞之间的胞吐变化。通常，优选相对于基线而言变化至少约5％，更优选变化至少约25％，特别优选变化至少约50％，尤其优选变化至少约100％。此时基线指的是胞吐刺激前染料的释放。当测定介质中的染料释放时，优选同时评价至少一个其它胞吐指示参数。
在优选的实施方案中，测定的是颗粒暴露的变化。在胞吐过程中将颗粒暴露于介质中，即颗粒与细胞膜融合并暴露/释放其内容物。因此，颗粒暴露是胞吐活性的指征，它的缺乏是胞吐尚未被诱导或已被抑制的指征。优选通过特异性结合颗粒的可测试剂检测颗粒暴露。本文所用可测试剂的例子是膜联蛋白V，膜联蛋白V是显示出以依赖于二价离子的方式特异性结合磷脂(磷脂酰丝氨酸)的蛋白质家族的成员。该蛋白质被广泛用于测定细胞凋亡(编程性细胞死亡)，因为细胞表面露出磷脂酰丝氨酸是细胞凋亡过程的标志性早期信号。令人惊奇地是，本文已测定当膜联蛋白V在分泌过程中暴露于细胞表面时可特异性结合胞吐颗粒；而细胞内部的颗粒未被标记。本文使用了膜联蛋白V的这一特性来根据其依赖于胞吐的结合产生单个胞吐分析。通过对细胞进行胞吐刺激，细胞的膜联蛋白结合和荧光信号的增加与时间和胞吐反应的强度成正比。
在此实施方案中，直接或间接标记膜联蛋白，然后与细胞群体混合。膜联蛋白可以商购，即购自PharMingen,San Diego,California，或Caltag Laboratories,Millbrae,California。优选以溶液的形式提供膜联蛋白，其中膜联蛋白的浓度约为100ng/ml至约500ng/ml，更优选约为500ng/ml至约1μg/ml，最优选约为1μg/ml至约5μg/ml。在优选的实施方案中，直接标记膜联蛋白，例如用诸如异硫氰酸荧光素(FITC),Alexa染料，TRITC,AMCA,APC，三-色(tri-color),Cy-5的荧光染料和本领域已知的或可商购的其它荧光染料标记膜联蛋白。在另一个优选的实施方案中，用诸如半抗原(如生物素)的第一个标记物标记膜联蛋白，另外还使用第二个荧光标记物，如荧光链霉抗生物素蛋白。本领域技术人员应理解，也可使用其它第一和第二标记对。
在优选的实施方案中，使细胞经受一般会导致胞吐的条件。任选在细胞中加入候选生物活性剂。在某些情况下，需要包括胞吐抑制剂以测定候选药剂是否能逆转抑制，或者加入不含胞吐刺激物的候选生物活性剂以测定药剂是否能诱导胞吐。优选洗涤细胞，并在显微镜或流式细胞仪中检测荧光。膜联蛋白结合之检测结果的变化表示相同细胞，或不同细胞之间，在相同或不同的条件下和/或在其中加入药剂时胞吐的变化。通常，优选相对于基线而言变化至少约25％，更优选变化至少约50％，特别优选变化至少约100％，尤其优选变化至少约500％。此时的基线一般指的是经胞吐刺激之前的膜联蛋白结合量。
在另一个优选的实施方案中，通过诸如小檗碱或钌红的阳离子染料检测颗粒暴露。所述阳离子染料特异性染色分泌的颗粒。因此，当胞吐发生时，分泌的颗粒暴露在细胞表面，可检测到荧光的增加。在优选的实施方案中，在存在或缺乏胞吐刺激物和/或抑制剂时，和任选在存在或缺乏候选生物活性剂时将阳离子染料与细胞群体混合。在特别优选的实施方案中，将小檗碱与细胞和胞吐刺激物和候选生物活性剂混合以测定候选生物活性剂是否能调制胞吐活性。优选洗涤细胞，然后测定荧光。在优选的实施方案中，在评价阳离子染料的同时还评价至少一个其它的胞吐指示参数。本领域已知如何将染料与细胞混合。描述小檗碱的一般方法学描述于Berlin和Enerback,Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.,73(3):256-262(1984)(列入本文作为参考)。通常，优选相对于基线而言变化至少约5％，更优选变化至少约25％，特别优选变化至少约50％，尤其优选变化至少约100％。此时的基线一般指的是刺激之前的染料量。
类似地，可使用ConA-FITC，因为它以类似于本文所述的方式与颗粒蛋白质上的糖结合。
在另一个优选的实施方案中，测定的是表面颗粒酶活性的变化。分泌的颗粒含有诸如蛋白酶和糖苷酶的酶，这些酶作为胞吐过程的一部分被释放出来。由于pH值低，这些酶在颗粒内通常是无活性的，但通过暴露于生理pH下的胞外介质，这些酶可被激活。将产色或产荧光底物用作胞外介质的组分可测定这些酶的活性。这样就可以用多种方法检测胞吐细胞。
在一个实施方案中，本文有时也称之为基于群体的酶试验，可以定量介质中经由产色或产荧光底物的裂解而产生的信号。即介质中可测反应产物的量与存在的酶量相关，从而与胞吐的量相关。在此实施方案中，可以检测的是介质而不是细胞。
在优选的实施方案中，在细胞中加入胞吐刺激物，任选加入候选生物活性剂。在介质中加入产色或产荧光底物，由于酶裂解了胞外底物，即可评价信号的变化。
在有时也称为“原位酶学试验”的另一个优选实施方案中，使用了通过裂解而沉淀的产荧光底物。即通过胞吐，大量酶活性仍与细胞/颗粒相关，并可使用在活性位点沉淀的荧光底物进行观察。例如，葡糖醛酸酶的底物，如ELF-97葡糖苷酸沉淀于胞吐细胞而不是静息细胞上，因此，细胞显示出增加的荧光。荧光是胞吐的直接测定结果，荧光依赖于pH，反映了胞吐酶的最适pH。该方法也提供了根据其酶分布图区分不同的颗粒亚型的方法。
在优选的实施方案中，在细胞群体中加入胞吐刺激物，然后与可测底物保温。任选加入候选生物活性剂。洗涤细胞，然后在显微镜或流式细胞仪上进行观察。
优选的颗粒酶包括但不限于食糜酶(chymase)，胰蛋白酶，芳基硫酸酯酶A，β-氨基己糖苷酶，β-葡糖醛酸酶和β-D-半乳糖苷酶。底物包括ELF-97葡糖苷酸，N-乙酰基β-D-葡糖苷酸，与肽偶联的ELF-97等，其中的很多是可以商购的，即得自Molecular Probes，文献同上，尤其是第10章，特别是第10章第2节，和参照的“相关章节”。
可测底物指的是底物含有本文详细描述的荧光分子，或者可用特异于底物或裂解底物的荧光分子，即荧光抗体进行检测。在优选的实施方案中，底物含有由两个荧光蛋白，即蓝色和绿色荧光蛋白(BFP和GFP)形成的可测分子和其它类似的分子。本领域已知在很靠近的位置处携有这两个蛋白质的GFP和BFP构建体能进行荧光共振能转移(FRET)，即GFP的激发光谱覆盖了BFP的发射光谱。因此，激发BFP导致GFP发射。如果在GFP和BFP之间插入蛋白酶裂解位点以形成“FRET构建体”，通过将FRET构建体暴露于能裂解构建体的活性蛋白酶，GFP和BFP分子即可分开。因此，激发GFP导致BFP发射和BFP发射的损失。
在FRET构建体的两个荧光蛋白之间插入的依赖于蛋白酶的裂解位点优选特异于颗粒特异性酶。因此，可使用FRET构建体检测特异于FRET构建体之裂解位点的颗粒特异性蛋白酶。在此实施方案中，与细胞或介质混合的蛋白酶底物包括FRET构建体。FRET系统可以检测裂解和非裂解状态的可测分子，并区分这两种分子。该系统进一步描述于Xu等，核酸研究，26(8):2034(1998)；和Miyawaki等，自然388(6645):882-887(1997)(皆列入本文作为参考)。
在细胞或介质中加入的底物的量部分取决于酶的比活性及其底物，当一般约为250nM至约1mM，优选约为1μM至约100μM，特别优选约为1μM至约10μM。通常，优选相对于基线而言变化至少约5％，更优选变化至少约25％，特别优选变化至少约100％，尤其优选变化至少约1000％。此时的基线一般指的是诱导胞吐之前的底物裂解量。
在优选的实施方案中，测定了颗粒特异性蛋白质的量的变化。分泌的颗粒含有蛋白质，这些蛋白质的特性使其能特异性靶向颗粒区室。通过胞吐诱导，颗粒特异性蛋白质暴露于表面，检测该蛋白质。
在优选的实施方案中，将可测的颗粒特异性蛋白质与细胞群体混合，并使其处于已知能诱导胞吐的条件之下。任选将候选生物活性剂与细胞群体和可测的颗粒特异性蛋白质混合，检测颗粒特异性蛋白质。颗粒特异性蛋白质包括但不限于VAMP和突触结合蛋白。颗粒特异性蛋白质的定义中还包括胞吐过程中释放的介体，包括但不限于5-羟色胺，组胺，肝素，激素等。
可用几种方法定量颗粒蛋白质。在一个实施方案中，使用的是针对颗粒特异性蛋白质的经标记的抗体(例如荧光抗体)。在另一个实施方案中，细胞经改造后含有融合蛋白，该融合蛋白含有颗粒蛋白质和可测分子。在优选的实施方案中，在细胞中加入可测分子以进行检测。例如，可使用直接或间接标记的抗体。优选的实施方案使用第一个标记抗体，优选的是荧光标记，另一个实施方案使用第一个和第二个标记物，例如，经标记的第二抗体。通常，此实施方案可使用特异性结合颗粒蛋白质的任何试剂或能直接或间接被标记的化合物。
在优选的实施方案中，将标记物插入细胞。例如，将重组蛋白质导入细胞群体，所述蛋白质是颗粒特异性蛋白质和可测分子的融合蛋白。一般而言，通过用编码融合蛋白的融合核酸转化细胞可以实现此目的，所述融合蛋白含有颗粒特异性蛋白质和可测分子。本领域技术人员知道怎么做，这取决于细胞类型。通常，对哺乳动物细胞而言，优选使用逆转录病毒载体和方法。
通过本领域已知的方法构建融合蛋白。例如，将编码颗粒特异性蛋白质的核酸与编码可测分子的核酸连接。本文所述的可测分子指的是能使含有可测分子的细胞或化合物与不合有可测分子的细胞或化合物区分开的分子，即表位，有时也称为抗原TAG，或荧光分子。优选的荧光分子包括但不限于GFP,BFP,YFP，和包括萤光素酶和β-半乳糖苷酶的酶。可制备这些构建体使得通过胞吐，颗粒内部的表位可暴露于细胞表面，然后检测这些表位。优选表位是任何可测的肽，所述肽不是胞质膜上常见的肽，但在某些情况下，如果表位是细胞上常见的肽，即可检测到增加，但一般不优选这种情况。
在优选的实施方案中，使含有融合蛋白或可测的颗粒特异性蛋白质的细胞群体处于胞吐条件下。任选加入候选生物活性剂和/或胞吐抑制剂。优选洗涤细胞。检测细胞上的荧光。通常，优选相对于基线而言变化至少约5％，更优选变化至少约25％，特别优选变化至少约50％，尤其优选变化至少约100％。此时的基线一般指的是刺激胞吐之前的荧光量。
在本发明中，通过导致背景降低和特异性更强的多个参数评价相同的胞吐特性。相反，过去人们使用FACS是为了同时评价两个不同的或不相关的特征，这样可以鉴定具有这两个特征的细胞，但不能降低组合特征的背景。然而，本发明除了可鉴定多个胞吐特性之外，还可同时鉴定上述其它细胞参数。
在优选的实施方案中，使细胞处于一般可导致胞吐的条件之下。促胞吐试剂包括离子霉素，Ca++，离子载体(离子霉素，AZ3187)，化合物48/80,P物质，补体C3a/C5a，胰蛋白酶，类胰蛋白酶，胰岛素，白细胞介素-3，特异性的IgE，变应原，抗-IgE或抗-IgG受体抗体。本领域技术人员应知道，所提供试剂的浓度取决于化合物，一般为1皮摩尔至10μM。在某些情况下，需要将细胞与胞吐抑制剂混合。胞吐抑制剂包括但不限于Wortmannin和Genestein，以及本领域已知的其它药剂。
在优选的实施方案中，使用本发明的方法筛选能调制胞吐的候选生物活性剂。在刺激胞吐之前，之中或之后，优选在刺激胞吐之前使候选生物活性剂与细胞群体混合。在某些情况下，需要测定候选生物活性剂(本文也称之为“候选药剂”)对细胞的作用，所述细胞中的胞吐未被诱导或其中的胞吐被抑制。在细胞群体的外部环境中加入候选生物活性剂，或按本文所述将其导入细胞。
在优选的实施方案中，与上述细胞周期试验一样，也使用了不同的候选生物活性剂文库。
如上所述，在细胞或细胞群体中混合或加入候选生物活性剂；如上所述，优选的实施方案利用核酸候选药剂和融合配对物；优选使用逆转录病毒构建体。
当候选药剂是核酸时，可使用本领域已知的方法，如磷酸钙，电穿孔和注射法将其导入细胞。一般在生理条件下将胞吐刺激物与细胞混合。保温可在有利于最佳活性的任何温度下进行，一般为4至40℃。选择保温时间以得到最佳活性，但也可最优化保温时间以便于快速进行高物料流通量的筛选。
如上所述，试验中可包括多种其它试剂，按上述分选细胞。分选导致产生具有所需胞吐特性的细胞群体。在优选的实施方案中，设置参数以鉴定至少一种可调制胞吐的候选生物活性剂。
在优选的实施方案中，鉴定了生物活性剂。本领域技术人员应知道如何进行鉴定，所述方法一般包括分析生物活性剂的结构，特性，结合亲和力和功能。通常，一旦鉴定出生物活性剂，可重新合成该生物活性剂，并使其与靶细胞混合以在不同条件下和存在或缺乏其它多种药剂时证实胞吐调制作用。可制备治疗有效量的生物活性剂以调制胞吐并与适当的药物载体混合。
在优选的实施方案中，可使细胞群体经受含和不含候选药剂，用或不用胞吐刺激或抑制的多种实验条件。条件的变化包括但不限于pH，温度，缓冲液或盐浓度等的变化。在优选的实施方案中，pH有所变化，一般是增加或降低pH，通常使pH变化约0.5至约3个pH单位。或者可改变温度，优选将温度增加或降低约5℃至约30℃。类似地，也可改变盐浓度，优选将盐浓度增加或降低约0.1M至约2M。
在优选的实施方案中，被调制的细胞表型是小分子(或其它候选药剂)的毒性。所述毒性在上文所述的细胞生活力试验中有所描述。通过将细胞与最大的功能反应相比较，然后回过头来看是否有更大或更小的毒性与那些细胞相关也可以比较小分子剂量反应。
在优选的实施方案中，细胞表型包括细胞表面受体的表达或活性；可同时跟踪16个，优选为6个细胞表面标记。可通过直接和间接缀合的抗体检测任何特定细胞表面标记的存在或缺乏，所述抗体针对的是任何细胞表面蛋白质，其细胞表面表达反映了与所研究细胞相关的重要功能参数。可针对单个或多个标记检测候选药剂，如小分子的效果。
在优选的实施方案中，细胞表型包括酶的表达或活性，例如基于荧光的报道系统，该报道系统可报道与主要的检测同时发生或身为主要检测之结果的生物事件。该报道系统可以是在胞质中具有活性的上游信号转导途径的读数，或者是核仁转录或翻译事件的读数，以及从核或细胞中输出事件的读数。
在优选的实施方案中，细胞表型包括蛋白质-蛋白质相互作用(或其它结合配体之间的相互作用)，如二聚体化，所述相互作用可被候选药剂破坏。通过两个经标记的结合配体之间FRET的出现或消失可测定这些事件。
下列实施例更完整地描述了使用上述发明的方式，并阐明了实施本发明之不同方面的最佳模式。应理解提供这些实施例只是为了阐明本发明，而不以任何方式限制本发明真正的范围。本文提及的所有参考文献都全文列入本文作为参考。
                      实施例1
        使用p21作为阳性对照的细胞周期分析材料和方法：
载体构建：用覆盖起始甲硫氨酸(5’-GATCGGATCCACCACCATGGGCTC AGAACCGGCTGGGGATGTC)和C-末端(5’-GATCCCAATTTAATGGTTTTATTT GTCATCGTCATCCTTGTAGTCGGGCTTCCTCTTGGAGAAGATCAGCCGGCGTTTG)的上游引物，通过PCR由Jurkat cDNA克隆p21基因的编码区。将单一PCR产物通过引物中的旁侧BstX1位点定向克隆到CRU5-GFP逆转录病毒载体(Rigel公司)中。得到的构建体，CRU5-GFP-p21F(图1)，编码与位置2插入一个Gly，C-末端具有FLAG-表位的人p21蛋白质融合(读框内)的GFP。将p21的C-末端24个氨基酸通过PCR引物中的旁侧BstX1位点克隆到GRU5-GFP逆转录病毒载体(Rigel公司)中，所述PCR引物为：5′GATCCCACCACCATGGGCAAACGGCGGCAGACCAGCATGACAGATTTCTACCACTCCAAACGCCGGCTGATCTTCTCCAA；5′GATCCCAATTTAAATGGTTTTATTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCGGGCTTCCTCTTGGAGAAGATCAGCCGGCGTTTG.得到的构建体，CRU5-GFPp21C(图1)，编码读框内融合KRRQTSMTDFYHSRRLIFSKRKP和C-末端融合FLAG-表位的GFP。将具有三个丙氨酸突变的p21的C-端24个氨基酸通过PCR引物中的旁侧BstX1位点克隆到CRU5-GFP逆转录病毒载体中，所述PCR引物为：5′ATCGGATCCACCACCATGGGCAAACGGCGGCAGACCAGCGCCACAGCTGCCTACCACTCC；5′GATCCCAATTTAATGGTTTTATTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCGGGCTTCCTCTTGGAGAAGATCAGCCGGCGTTTG.得到的构建体，CRU5-GFPp21Cmut(图1)，编码读框内融合KRRQTSATAAYHSRRLIFSKRKP(突变用下划线标出)和C-末端融合FLAG-表位的GFP。
逆转录病毒的转导：将Phoenix E细胞以每1.5ml完全-DMEM(DMEM+10％FBS+Pen/Strep)106个细胞的浓度在6-孔培养板中铺板，在37℃保温16小时。于37℃，在存在50μM氯喹的条件下，用CRU5-IRES-GFP载体或CRU5-p21F-IRES-GFP克隆进行CaCl2-沉淀传染(2μl DNA(1μg/μl),30.5μl 2M CaCl2,217.5μl H2O,0.5 ml 2×HBS)8小时。除去转染培养基，加入2ml完全-DMEM，使细胞于37℃进一步培养16小时。将培养基换成1.5ml完全RPMI(RPMI+10％FBS+Pen/Strep)，于32℃培养48小时。过滤(0.45μm)转染培养板的病毒上清液，转移到6-孔培养板中。将表达亲嗜性受体(JurkatE)的Jurkat T-细胞的100μl等分试样(5×106个细胞)加入各孔。加入终浓度为5μg/ml的Polybrene。用石蜡膜密封培养板，于32℃,2500 RPM下离心90分钟。除去石蜡膜，使培养板在37℃保温过夜。16小时后将培养基换成4ml完全-RPMI，于37℃保温72小时。
细胞周期FACS-分析：沉淀逆转录病毒载体-转导的细胞，以106个细胞/ml在完全-RPMI中重悬浮。将一体积(1ml)4μM PKH26细胞示踪染料(Sigma)加入细胞，在25℃保温5分钟。将悬浮液稀释5倍，在25℃,400×g下沉淀细胞10分钟。用6ml完全RPMI进一步洗涤细胞两次，以3×105个细胞/ml在6-孔培养板中保温72小时。沉淀标记细胞，以106个细胞/ml在含有5μg/ml Hoechst 33342(Molecular Probes)的完全-RPMI中重悬浮，于37℃保温2小时。沉淀被染色的细胞，以＞106个细胞/ml的浓度重悬浮于FACS缓冲液(PBS/0.5％FCS/5μg/ml Hoechst33342)。将细胞在装备有三束激光的MoFlo细胞计数仪(Cytomation)上进行流式细胞计数分析。用488nm-系氩激光激发正面和侧面散射，用正面散射检测仪和488nm带通滤波器收集散射光。用488nm-系氩激光激发GFP，通过530nm-带通滤波器收集发射光。用533nm-系HeNe-激光激发PKH26细胞示踪染料，通过570nm-带通滤波器收集发射光。用UV-光激发Hoechst 33342染料，通过450nm-带通滤波器收集发射光。结果：
用编码与GFP融合的人p21(Gp21)，或与PCNA结合的C-末端的24个氨基酸(Gp21C)(图1)的逆转录病毒载体转导Jurkat T-细胞。将p21C-端24个氨基酸的非-PCNA结合突变型(Gp21Cmut,Cayrol等，癌基因16:311(1998))用作阴性对照。转导的p21的表达可以通过用FLAG-表位进行Western印迹(未显示)与内源性蛋白质区别开来。据报道，在FACS中通过GFP荧光发现融合蛋白的表达(图2B)。
用细胞示踪化合物，pkh26脉冲标记转导细胞，其可通过选择性分配(partioning)将带红色荧光的脂肪性分子掺入细胞膜中，使细胞周期和荧光强度之间存在相关性：停滞细胞保持细胞示踪染料的光亮，处于细胞周期中的细胞稀释了信号变得暗淡。如图2C所示，控制GFP的活GFP-p21-表达细胞，证明比表达显著GFP水平的载体转导细胞(指示细胞周期被抑制)具有较强的红色荧光。在Gp21C表达细胞中看到类似作用，然而，Gp21-Cmut与非表达细胞相同。相同GFP-控制细胞的DNA含量如图2D所示。Gp21表达细胞在细胞周期的G1期被抑制，Gp21C-表达细胞表明G1和G2关卡累积，这与以前的结果一致(WadeHarper，等，1993；Cayrol等，1998)。Gp21Cmut表达细胞表现正常的细胞周期分布。活的、被抑制的表达细胞(满足三个初始参数)按照DNA含量分成独立区段：左偏斜，G1；右偏斜，G2。
                      实施例2
              基于群体的胞吐酶活性检测
材料：所有化学试剂均得自Sigma Chemical公司。染料和葡糖苷酸得自Molecular Probes公司。细胞系MC-9和RBL-2H3得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。细胞培养试剂得自Fisher Scientific，分子生物学试剂得自Clontech公司。
细胞培养：将MC-9细胞在装有加L-精氨酸(116mg/ml)，L-天冬氨酸(36mg/ml)，丙酮酸钠(1mM)，非必需氨基酸(0.1mM)，叶酸(6mg/ml)，2-巯基乙醇(0.05mM)，L-谷氨酰胺(2mM)，热灭活胎牛血清(10％)的DMEM，和10％T-stim条件培养基(Collaborative Research,Inc.)的摇瓶中作为悬浮培养物维持培养。维持细胞密度在0.25和2×106/ml。在通过锥虫蓝排除法确定细胞存活率大于95％的细胞上进行实验。使RBL-2H3细胞在装有加2mM L-谷氨酰胺和Earl＇s BSS,15％热灭活胎牛血清的Eagles MEM培养基的未涂布(被处理的组织培养物)摇瓶中作为粘附培养物维持生长。传代细胞(0.05％胰蛋白酶)，以使它们保持一天以上不凝聚。
胞吐刺激方案：在由NaCl(137mM),KCl(2.7mM),CaCl2(1.8mM),MgCl2(1mM)，葡萄糖(5.6mM),Hepes(20mM,pH7.4)，和牛血清白蛋白(0.1％)组成的改进tyrodes缓冲液(MT)中进行实验。在400×g下离心MC-9cells，对培养基进行抽吸。然后用MT清洗细胞，再离心/抽吸，以5×106个细胞/ml的密度分散于MT中。然后用DMSO或离子载体处理细胞30分钟(或者如果是一个耗时过程则调整时间)。然后使细胞沉淀，收集的上清液用于酶分析；在某些情况下，之后对细胞进行流式细胞计数。所有刺激均在37℃进行。对RBL-2H3细胞的刺激则在MT中洗涤粘附细胞一次，然后加入含有刺激物的保温MT(1ml/106个细胞)中进行。细胞在37℃保温30分钟，收获上清液进行进一步的分析。在某些实施例中(实施例4-6)，染色培养板结合细胞中的膜联蛋白，然后用No-Zyme(Collaborative Research公司)从摇瓶中分离出来，用于进一步的流式细胞计数。为了刺激与抗原交联的RBL-2H3细胞，将细胞与完全培养基中的浓度为50ng/ml的IgE抗-DNP(SigmaChemical公司)一同保温过夜。第二天用MT洗涤一次，如上述进行刺激，除了用100ng/ml偶联于DNP的牛血清白蛋白作为刺激物。
基于群体的酶分析：对细胞上清液和沉淀进行酶分析，然后进行胞吐刺激：刺激后收获细胞上清液，在冰面上冷却，加速5000×g离心，收集上清液进行酶活性分析。同样，收集细胞沉淀，在含0.1％tritonX-100的MT中使细胞溶解，加速5000×g离心，收集上清液进行酶活性分析。对于每次分析，将100μl细胞溶解液或上清液与100μl含2mM底物(4-甲基伞形酮基(methylumbelliferyl)β-D葡糖苷酸[葡糖醛酸酶底物]or 4-甲基伞形酮基N-乙酰β-D氨基葡糖苷[氨基己糖苷酶底物]的反应缓冲液(40mM柠檬酸盐，pH 4.5)在纯黑色96孔培养板(Costar公司)上混合，在37℃保温15分钟。在荧光培养板读数仪(Wallac,Inc.)上用激发380nm/发散440nm滤波器每3分钟记录培养板一次，共记录5次，得到酶解速率；分析重复三次。
流式细胞计数：将经刺激和染色的细胞悬浮于冰面上的MT中，通过100μm滤器过滤，然后进行细胞计数。用FACSCAN(BectonDickinson公司，激光线458nm)或Mo-Flo(Cytomation公司，激光线350nM宽带(UV),488nm，和647nm)细胞计数仪分析细胞。分选细胞，必要时使用Mo-Flo。
结果：结果如图4所示。测定各种条件下MC9(A)和RBL 2H3(B)细胞上清液中的酶活性。A)MC-9细胞在存在DMSO(-)或2μm离子霉素(+)的条件下刺激30分钟。收集上清液，分析葡糖醛酸酶和氨基己糖苷酶活性。经刺激后颗粒释放的酶活性是明显的。B)用不同量的IgE抗-DNP使RBL-2H3细胞致敏16小时，暴露于增加量的抗原BSA-DNP刺激胞吐。在测定的上清液氨基己糖苷酶活性中抗体和抗原的剂量反应是明显的。
            实施例3：肥大细胞胞吐光散射变化
如实施例2的描述制备细胞，测定光散射特性。
结果：结果如图4所示。RBL-2H3细胞(A、D)和MC-9细胞(B、C、E、F)的流式细胞计数观察到的光散射变化(侧面散射对正面散射)被描绘成双变量直方图。用离子载体A23187(0.5μg/ml)刺激细胞，在不同时间点观察[0分钟(A,C)，5分钟(E)，10分钟(D)，和30分钟(B,F)]。时间依赖型散射变化是明显的，这两个细胞系在前10分钟内均发生显著改变，代表这些细胞中的大块胞吐物。
实施例4：在FACS中用苯乙烯染料检测肥大细胞胞吐
苯乙烯染料染色：如上述制备细胞。将苯乙烯染料(FM143 orFM4-64；Molecular Probes公司)在MT中稀释到终浓度为250nM，然后加入刺激缓冲液(参见实施例2)。完成刺激后，使细胞沉淀下来，抽吸并重悬浮于新鲜的冰冷MT中。然后准备对细胞进行流式细胞计数分析(参见实施例2)。
结果：结果如图6所示。在存在FM 4-64(A,B)或FM 1-43(C,D,E)的条件下刺激MC-9细胞(蓝色=DMSO，红色=2μM离子霉素)。A)FM 4-64标记细胞在流式细胞仪的1号荧光信道中检测。B)FM 4-64标记细胞在流式细胞仪的3号信道中检测。C)FM 1-43标记细胞在流式细胞仪的1号信道中检测。D)FM 1-43标记细胞在流式细胞仪的3号信道中检测。用这两种染料进行的刺激依赖性荧光密度增加是明显的：FM 4-64大多数向红移，主要在3号信道中检测，而FM1-43表现更广泛的荧光，在1号和3号中均可检测。E)MC-9细胞与不同剂量的PI-3激酶抑制剂渥曼青霉素(1μM-柱1,100nM-柱2,10nM-柱3，和0nM-柱1和2)预保温，然后在存在FM 1-43的情况下，用A23187(0.5μg/ml，柱1-4)或DMSO(柱5)刺激。在流式细胞仪荧光信道1中检测到的平均信道移动被描绘成直方图。渥曼青霉素，一种已知的肥大细胞胞吐抑制剂，导致FM1-43信号的剂量依赖性降低，说明FM1-43信号反映了MC-9肥大细胞系的脱粒程度。
实施例5：在FACS中通过膜联蛋白-V染色检测肥大细胞胞吐
材料：膜联蛋白-V生物素，膜联蛋白-V FITC和链霉抗生物素蛋白APC从Caltag Laboratories得到。可以应用其它实施例，特别是实施例2的其它材料和方法。
膜联蛋白-V染色：经胞吐刺激后的细胞用MT以1/100稀释的膜联蛋白-PITC在室温下染色10分钟。然后用MT清洗细胞一次，悬浮于MT中，然后在流式细胞仪中或显微镜下观察。对于间接标记，在刺激过程中向MT中加入稀释度为1/200的膜联蛋白-生物素。然后在冰冷的MT中沉淀细胞，离心，抽吸、然后悬浮于含有稀释度为1/200抗生蛋白链菌素-APC的冰冷MT中，在冰面上保持15分钟。沉淀细胞，抽吸链霉抗生物素蛋白-APC之后，将细胞重悬浮于MT，在流式细胞仪中观察。在一些实验中，应用不同的第二步，例如链霉抗生物素蛋白-alexa 488或594(Molecular Probes公司)，用于在显微镜下观察。
结果：结果如图7所示。用DMSO(图A和B)或2μm离子霉素(图C和D)刺激MC-9细胞，然后用碘化丙锭[PI](图A和C)和膜联蛋白-V-FITC(图B和D)染色。正如胞吐细胞中PI染色无显著增强所证实，用该剂量离心霉素刺激不能损害细胞质膜。与图D和B比较可以看出脱粒导致膜联蛋白的结合显著增强。实施例6：经共聚焦显微镜检观察膜联蛋白-V-FITC染色的MC-9细胞的胞吐颗粒显微镜检：将刺激或染色后的细胞置于载玻片上并盖上盖玻片；采用标准的BFP,FITC或TRITC滤光片的倒置显微镜(TE300,Nikon)直接经亮视野和荧光显微镜检观察这些细胞。采用标准FITC和TRITC滤光片的倒置共聚焦扫描显微镜(Zeiss,Inc.,Bio-Rad,Inc.)获得了某些图象。结果：用2μm离子霉素或DMSO刺激MC-9细胞并用膜联蛋白-V-FITC将其染色，制片进行共聚焦显微镜检(未显示数据)。所有活的未激活细胞均显示出低的膜联蛋白结合，没有细胞表面颗粒着色。实施例7：在用抗原交联刺激的RBL-2H3细胞中用膜联蛋白-V-FITC染色胞吐颗粒
除非以下另有说明，用于本实施例的方法同前。
结果：用IgE致敏RBL-2H3细胞，并用MT缓冲液或BSA-DNP抗原(100ng/ml)刺激细胞使其进行胞吐，然后用膜联蛋白V-FITC染色。在用抗原刺激过的细胞中有很多细胞表面颗粒着色，与MC9-细胞中见到的情形类似。活的未激活细胞显示出细微的膜联蛋白V着色(未显示数据)。实施例8：在FACS目测到的胞吐细胞的原位酶学
原位酶学：如上所述刺激MC-9cells进行胞吐，然后于370C在含有底物ELF-97葡糖苷酸(250(M)的酶底物缓冲液(BSA无MT,pH 4.3-7.4)中温育15分钟。将细胞在MT中洗一次，然后在显微镜或流式细胞仪中观察。其他方法在前面的实施例中已有描述。
结果：结果示于图8。用DMSO(图A)或A3187(0.5(g/ml-图B和C)刺激MC-9细胞然后染色检测原位葡萄糖醛酸酶活性。A)ELF-97检测的流式细胞仪直方图指示细胞表面酶的沉淀。在DMSO处理的细胞中信号非常低。B)ELF-97检测的流式细胞仪直方图指示细胞表面酶的沉淀。在用离子载体刺激分泌作用时可见信号显著升高。C)细胞表面酶活的pH曲线。用在不同pH制备的MT缓冲液做流式细胞仪中信号的pH曲线。条形图代表观察到的最大信号(用流式细胞仪中平均信道移位来衡量)的百分比。酶活是pH依赖性的，在pH6以下有一个峰；这与由酸性分泌颗粒得到的酶活一致。实施例9：胞吐时从肥大细胞颗粒中释放Lysotracker Green并可经
                        FACS检测
Lysotracker染料染色：通过将细胞在完全培养基中稀释至终浓度1(M并于370C在有lysotracker染料(蓝、绿和红色)的情况下将细胞保温60分钟以便使染料填充到细胞中。填充后，在MT中将细胞洗两次，以待进一步分析或刺激。其他方法在前面的实施例中已有描述。
结果：结果示于图9。MC-9细胞用Lysotracker green填充1小时，然后用DMSO或离子霉素(2(M)刺激，在流式细胞仪中观察。所示为1道中检测到的荧光强度直方图；与DMSO对照相比，离子载体刺激的样品中信号显著缺损，这反映出从分泌颗粒中释放出了lysotrackergreen染料。实施例10：多参数分析-Lysotracker Green、膜联蛋白-V-APC、正面和
                      侧面散射
除非以下另有描述，使用在前实施例中描述的方法。
结果：结果示于图10。用不同剂量的离子霉素(0(M-A.E；1(M-B、F；2(M-C、G；和3(M-D、H)处理MC-9细胞，在流式细胞仪中同时用四种参数观察。细胞用lysotracker green填充1小时，然后进行刺激并用膜联蛋白-VAPC染色。图A-D：侧面对正面光散射的双变量直方图。注意从左至右随着正面散射的增高和侧面散射降低，两个参数均有剂量依赖性变化。图E-H：膜联蛋白-VAPC对Lysotracker green信号的双变量直方图。随着胞吐增加(从左至右)膜联蛋白信号变大，而lysotracker信号降低。这反映出暴露到胞外环境时，膜联蛋白V结合到细胞表面颗粒上，而lysotracker从这些颗粒上释放。
实施例11：多参数分析-FM 1-43、膜联蛋白-V-APC、正面和
侧面散射
除非以下另有说明，此处使用上面描述的方法。
结果：用DMSO或离子霉素(2(M)处理MC-9 cells，在流式细胞仪中同时用四种参数观察。在有FM 143的情况下刺激细胞，并用膜联蛋白-V-APC染色(数据未显示)。在30分钟的时间点，两个参数中均有刺激依赖性变化。两种信号均有刺激依赖性变化。所述变化反映出膜联蛋白-V结合到细胞表面颗粒上，同时发生的FM143染料胞吞到MC 9细胞中。实施例12：与基于群体的酶读数相关联的FACS的同步多参数测量
钙信号检测：MC-9或RBL-2H3细胞在MT中洗一次，于370C在MT中填充Ca++敏感性探针Fluo-3(1(M,Molecular Probes公司)20分钟。将细胞在温MT中洗一次，然后用上面描述的方案刺激。用流式细胞仪(见下文)、荧光显微镜或者在荧光板阅读器(Wallac,Inc.)上读出来以目测胞内Ca++浓度升高所形成的信号。用含有0.1％tritonⅩ-100的MT释放胞内染料来确定细胞填充情况。
除非以下另有说明，此处采用上面描述的方法。
结果：结果示于图11。在有FM143的情况下如以上方法的描述刺激MC-9细胞，并用膜联蛋白-V-APC染色。离子霉素刺激后，在各时间点将细胞置冰上，经流式细胞仪分析或者测酶活(细胞上清液)。将正面散射、FM143、膜联蛋白-V-APC以及氨基己糖苷酶等参数相对每个参数最大反应来绘制图形。对于钙信号，单独一试管细胞填充Fluo-3，并进行相同的操作。基于细胞仪的参数的时程表明它们与通过氨基己糖苷酶释放测量到的胞吐相关性很好。在本实施例中，正面散射显示出随时间即有正态变化又有负变的效果。
实施例12：VAMP-GFP和VAMP-FRET构建体的表达cDNA构建体：
VAMP-GFP构建体：将大鼠VAMP-2 cDNA(得自R.Scheller,Stanford University)作PCR修饰以便导入：(1)分别编码有助于表达和体内稳定性的共有Kozaka序列和甘氨酸插入(a.a.2)的5’BstⅪ位点；(2)3’末端具有BamHⅠ位点的丝氨酸-甘氨酸接头。对得自CdimGFP(Clontech公司)的GFP编码序列进行PCR修饰以导入编码终止密码子的3’BstⅪ位点。通过丝氨酸-甘氨酸接头中的共有的BamHⅠ位点连接经修饰的rVAMP和GFP PCR片断以产生具有下列序列的框内融合蛋白，从而构建VAMP-GFP融合蛋白：MGSATAATVPPAAPAGEGGPPAPPPNLTSNRRLQQTQAQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADALQAGASQFETSAAKLKRKYWWKNLKMMIILGVICAIILIIIIVYFSTGSGSGSGSGSGPVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTHGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKZ
下划线的是VAMP序列，斜体的是丝氨酸-甘氨酸接头，规范的字母表示GFP序列。
将VAMP-GFP融合序列克隆至具有定向BstⅪ位点的96.7逆转录病毒载体以产生pVG。通过测定两个方向上的序列来验证序列。通过Western分析和荧光显微镜检证实转染和感染细胞中的适当表达。
Trp-FRET构建体：对得自cGFP(Clontech公司)的GFP编码序列进行PCR修饰以产生：(1)分别编码有助于表达和体内稳定性的共有Kozaka序列和甘氨酸插入(a.a.2)的5’BstⅪ位点；(2)编码C末端之Ala228的3’末端SacⅡ位点。对得自cBFP(Clontech公司)的BFP编码序列进行PCR修饰以产生：(1)编码Ser2的5’BamHⅠ位点；(2)编码终止密码子的3’末端BstⅪ。使用编码Ⅹ因子和类胰蛋白酶蛋白酶裂解位点的SacⅡ-BamHⅠ转变接头(其侧翼为GSGS间隔序列(GSGSIEGRLRKQGSCS))融合GFP和BFP以产生具有下列序列的框内融合蛋白：MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGSGSIEGRLRKQGSGSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTHGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKZ
下划线的是GFP序列，斜体的是Ⅹ因子/类胰蛋白酶位点接头，规范的字母是BEP序列。
将VAMP-GFP融合序列克隆至逆转录病毒载体96.7的BamHⅠ和BstⅪ位点以产生pGX/TB。通过测定两个方向上的序列来验证序列。通过Western分析和荧光显微镜检证实转染和感染细胞中的适当表达。
对VAMP-GFP编码序列进行PCR修饰以产生编码C末端之Ala228的3’末端SacⅡ位点。用XhoⅠ和SacⅡ裂解此片断并克隆至pGX/TB的XhoⅠ/SacⅡ位点以产生pVGX/TB(Trp-FRET)，该载体编码具有下列序列的rVAMP-2-BFP-Ⅹ因子/类胰蛋白酶位点-GFP融合蛋白：GSATAATVPPAAPAGEGGPPAPPPNLTSNRRLQQTQAQVDEWDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADALQAGASQFETSAAKLKRKYWWKNLKMMIILGVICAIILIIIIVYFSTGSGSGSGSGSGPVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGFGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTHGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGSGSIEGRRKLQGSGSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKIFCTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDEL
下划线的是VAMP序列，斜体的是丝氨酸-甘氨酸接头，黑体的是Ⅹ因子/类胰蛋白酶位点接头，规范字母表示的是GFP和BFP序列。
通过测定两个方向上的序列来验证rVAMP-2-BFP-Ⅹ因子/类胰蛋白酶位点-GFP融合蛋白的序列。通过Western分析和荧光显微镜检和FACS分析证实转染和感染细胞中的适当表达。
转染和感染：为了用表达Vamp构建体的重组逆转录病毒感染MC-9和RBL-2H3细胞，可实施下列方案，在第1天，将Phoenix E或A细胞(可得自G.Nolan,Stanford大学)以8×10E5细胞/1.5ml培养基(DMEM,10％FBS)的浓度铺于6孔培养板中。第2天，在50(M氯喹存在下使用磷酸钙沉淀法将5微克DNA转染至细胞中。37℃将沉淀物与细胞保温8小时，每次需除去培养基，用新鲜培养基洗涤一次，并更换新鲜的MC-9或RBL-2H3培养基；然后将细胞置于32℃保温48至72小时。以1000×g的转速将Phoenix细胞的上清液(病毒上清液)离心10分钟，加入鱼精蛋白硫酸盐至终浓度为5(g/ml；将该上清液加入6孔培养板中经新鲜胰蛋白酶消化的MC-9或RBL-2HS细胞中(5×10E5细胞/孔)，室温下，以1000×g的转速将混合物离心90分钟。然后将细胞置于32℃保温16小时。除去病毒上清液，加入新鲜培养基；在感染后24小时观察到靶基因的表达。

Claims (10)

1．筛选能改变细胞表型的生物活性剂的方法，所述方法包括：
a)使至少一种候选生物活性剂与细胞群体混合；和
b)在FACS仪中通过在至少5个细胞参数的基础上分离所述细胞以分选所述细胞。
2．根据权利要求1的方法，其中使候选生物活性剂文库与所述细胞群体混合。
3．筛选能改变细胞表型的生物活性剂的方法，所述方法包括：
a)将各编码候选生物活性剂的核酸文库导入细胞群体；和
b)在FACS仪中通过在至少3个细胞参数的基础上分离所述细胞以分选所述细胞。
4．根据权利要求3的方法，其中所述文库是逆转录病毒文库。
5．根据权利要求3或4的方法，其中所述细胞表型是胞吐，所述细胞参数选自光散射，荧光染料摄取，荧光染料释放，膜联蛋白颗粒结合，表面颗粒酶活性和颗粒特异性蛋白质的量。
6．根据权利要求5的方法，其进一步包括使所述细胞处于一般会导致胞吐的条件下。
7．根据权利要求3或4的方法，其中所述细胞表型是细胞周期调节，所述细胞参数包括细胞生活力，增殖和细胞期。
8．根据权利要求3,4,5,6或7的方法，其中所述核酸包括融合核酸，该融合核酸含有：
a)编码所述候选生物活性剂的所述核酸；和
b)可测的组成成分。
9．根据权利要求1,2,3,4,5,6,7或8的方法，其中所述细胞是肿瘤细胞。
10．根据权利要求8的方法，其中所述可测的组成成分是荧光蛋白。
CNB998070904A 1998-04-17 1999-04-16 检测细胞参数变化和筛选小分子文库所用的多参数facs分析 Expired - Lifetime CN100334227C (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/062,330 US6897031B1 (en) 1998-04-17 1998-04-17 Multiparameter FACS assays to detect alterations in exocytosis
US09/062,330 1998-04-17
US09/157,748 US6461813B2 (en) 1998-09-21 1998-09-21 Multiparameter FACS assays to detect alterations in cell cycle regulation
US09/157,748 1998-09-21
PCT/US1999/008345 WO1999054494A2 (en) 1998-04-17 1999-04-16 Multiparameter facs assays to detect alterations in cellular parameters

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1304489A true CN1304489A (zh) 2001-07-18
CN100334227C CN100334227C (zh) 2007-08-29

Family

ID=26742137

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB998070904A Expired - Lifetime CN100334227C (zh) 1998-04-17 1999-04-16 检测细胞参数变化和筛选小分子文库所用的多参数facs分析

Country Status (12)

Country Link
EP (2) EP1071809B1 (zh)
JP (1) JP4511033B2 (zh)
CN (1) CN100334227C (zh)
AT (1) ATE248226T1 (zh)
AU (1) AU3565499A (zh)
CA (1) CA2325597C (zh)
DE (1) DE69910756T2 (zh)
DK (1) DK1071809T3 (zh)
ES (1) ES2207203T3 (zh)
NZ (1) NZ508120A (zh)
PT (1) PT1071809E (zh)
WO (1) WO1999054494A2 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102156131A (zh) * 2010-02-09 2011-08-17 斯蒂芬·立业·陈 显微线阵扫描器在测定活生物体的变化率上的应用
CN1860363B (zh) * 2003-08-28 2011-12-28 赛路拉公司 用于在微流通道网络中使用光学开关将细胞分类的方法和设备
CN110412179A (zh) * 2018-04-26 2019-11-05 缪荣明 一种液相色谱检测颗粒酶a的方法

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030215798A1 (en) 1997-06-16 2003-11-20 Diversa Corporation High throughput fluorescence-based screening for novel enzymes
US7090976B2 (en) 1999-11-10 2006-08-15 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions comprising Renilla GFP
US6651008B1 (en) 1999-05-14 2003-11-18 Cytokinetics, Inc. Database system including computer code for predictive cellular bioinformatics
US6743576B1 (en) 1999-05-14 2004-06-01 Cytokinetics, Inc. Database system for predictive cellular bioinformatics
US7151847B2 (en) 2001-02-20 2006-12-19 Cytokinetics, Inc. Image analysis of the golgi complex
CN100467604C (zh) * 2000-06-01 2009-03-11 巴斯德研究所 嵌合GFP-水母发光蛋白作为单细胞水平的生物发光的Ca2+报道分子
US7218764B2 (en) 2000-12-04 2007-05-15 Cytokinetics, Inc. Ploidy classification method
US6956961B2 (en) 2001-02-20 2005-10-18 Cytokinetics, Inc. Extracting shape information contained in cell images
US7016787B2 (en) 2001-02-20 2006-03-21 Cytokinetics, Inc. Characterizing biological stimuli by response curves
DE60233574D1 (de) 2001-07-10 2009-10-15 Univ R Verfahren und zusammensetzungen zum nachweis des aktivierungszustands multipler proteine in einzelzellen
US7381535B2 (en) 2002-07-10 2008-06-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior Methods and compositions for detecting receptor-ligand interactions in single cells
US7393656B2 (en) 2001-07-10 2008-07-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for risk stratification
GB2423988A (en) 2003-07-18 2006-09-13 Cytokinetics Inc Characterizing biological stimuli by response curves
US7235353B2 (en) 2003-07-18 2007-06-26 Cytokinetics, Inc. Predicting hepatotoxicity using cell based assays
US20050014217A1 (en) 2003-07-18 2005-01-20 Cytokinetics, Inc. Predicting hepatotoxicity using cell based assays
JP4454998B2 (ja) * 2003-09-29 2010-04-21 株式会社ニコン 細胞観察装置および細胞観察方法
US7323318B2 (en) 2004-07-15 2008-01-29 Cytokinetics, Inc. Assay for distinguishing live and dead cells
JP4557685B2 (ja) 2004-11-15 2010-10-06 独立行政法人理化学研究所 蛍光蛋白質
KR20080073293A (ko) 2005-10-14 2008-08-08 메디뮨 엘엘씨 항체 라이브러리의 세포 디스플레이
FR2902440B1 (fr) * 2006-06-19 2008-08-29 Univ Paris Curie Methode de detection et de denombrement des cellules en cytodierese
WO2009025847A2 (en) 2007-08-21 2009-02-26 Nodality, Inc. Methods for diagnosis, prognosis and methods of treatment
US8227202B2 (en) 2008-07-10 2012-07-24 Nodality, Inc. Methods for diagnosis, prognosis and methods of treatment
US8309306B2 (en) 2008-11-12 2012-11-13 Nodality, Inc. Detection composition
US9459246B2 (en) 2009-09-08 2016-10-04 Nodality, Inc. Induced intercellular communication
ES2577607T3 (es) * 2010-07-28 2016-07-15 Canvax Biotech Sl Nuevos sensores ultrasensibles basados en células y usos de los mismos
US9005909B2 (en) 2011-01-06 2015-04-14 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Whole blood assay for measuring AMPK activation
CA2980133A1 (en) 2015-03-25 2016-09-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Single cell analysis using secondary ion mass spectrometry
EP3443123B1 (en) 2016-04-11 2021-08-11 Board of Regents, The University of Texas System Methods and compositions for detecting single t cell receptor affinity and sequence
WO2020102556A1 (en) 2018-11-15 2020-05-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods of prognosis and classification for preeclampsia
JPWO2021079656A1 (zh) * 2019-10-24 2021-04-29
EP4343775A1 (en) 2022-09-22 2024-03-27 SurgeCare A method for determining a medical outcome for an individual, related electronic system and computer program

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4304720A (en) * 1980-04-30 1981-12-08 Merck & Co., Inc. Fluorescein esters and ethers and the preparation thereof
US5266464A (en) * 1988-02-10 1993-11-30 Ict Pharmaceuticals, Inc. Method of screening for protein inhibitors and activators
WO1991002084A1 (en) * 1989-08-09 1991-02-21 Michael Reese Hospital And Medical Center Method for detection and treatment of multiple drug-resistant tumor cells and useful colchicine derivative probes
US5264341A (en) * 1989-08-30 1993-11-23 Eli Lilly And Company Selective cloning for high monoclonal antibody secreting hybridomas
JPH04252128A (ja) * 1990-08-03 1992-09-08 Systemix Inc 免疫化された宿主における変性された異種移植器官系
US5723288A (en) * 1994-05-06 1998-03-03 The University Of North Carolina At Chapel Hill Method of fluorescent detection of nucleic acids and cytoskeleton elements using bis-dicationic aryl furans, and kits useful therefor
GB9506466D0 (en) * 1994-08-26 1995-05-17 Prolifix Ltd Cell cycle regulated repressor and dna element
GB9516138D0 (en) * 1995-08-05 1995-10-04 Medical Res Council Improvements in or relating to methods of screening substances
US20030215798A1 (en) * 1997-06-16 2003-11-20 Diversa Corporation High throughput fluorescence-based screening for novel enzymes
IL129354A0 (en) * 1996-10-18 2000-02-17 Genentech Inc Anti-ErbB2 antibodies

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1860363B (zh) * 2003-08-28 2011-12-28 赛路拉公司 用于在微流通道网络中使用光学开关将细胞分类的方法和设备
CN102156131A (zh) * 2010-02-09 2011-08-17 斯蒂芬·立业·陈 显微线阵扫描器在测定活生物体的变化率上的应用
CN110412179A (zh) * 2018-04-26 2019-11-05 缪荣明 一种液相色谱检测颗粒酶a的方法

Also Published As

Publication number Publication date
DE69910756D1 (de) 2003-10-02
JP4511033B2 (ja) 2010-07-28
CA2325597C (en) 2010-09-21
CN100334227C (zh) 2007-08-29
NZ508120A (en) 2003-10-31
PT1071809E (pt) 2004-01-30
DK1071809T3 (da) 2003-12-01
EP1071809A2 (en) 2001-01-31
WO1999054494A3 (en) 2000-02-10
ATE248226T1 (de) 2003-09-15
AU3565499A (en) 1999-11-08
DE69910756T2 (de) 2004-07-08
EP1363127A2 (en) 2003-11-19
ES2207203T3 (es) 2004-05-16
EP1363127A3 (en) 2004-03-24
EP1071809B1 (en) 2003-08-27
JP2002512362A (ja) 2002-04-23
WO1999054494A2 (en) 1999-10-28
CA2325597A1 (en) 1999-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1304489A (zh) 检测细胞参数变化和筛选小分子文库所用的多参数facs分析
Aoki et al. Single-cell transcriptome analysis reveals disease-defining T-cell subsets in the tumor microenvironment of classic Hodgkin lymphoma
Oszmiana et al. The size of activating and inhibitory killer Ig-like receptor nanoclusters is controlled by the transmembrane sequence and affects signaling
Evans et al. Comparative proteomics of primitive hematopoietic cell populations reveals differences in expression of proteins regulating motility
AU2021203291A1 (en) Modulation of cancer immunity with type 2 innate lymphoid cells, interleukin 33, and/or interferon induced protein 44
JP2003526772A (ja) 細胞ベースのスクリーニング用のシステム
US20070015280A1 (en) Production of cultured human mast cells and basophils for high throughput small molecule drug discovery
JP2003513672A (ja) Ｒｅｎｉｌｌａｇｆｐを含む方法および組成物
US20130310278A1 (en) Multiparameter FACS Assays to Detect Alterations in Cellular Parameters and to Screen Small Molecule Libraries
Berkson et al. Inflammatory cytokines induce sustained CTLA-4 cell surface expression on human MAIT cells
CN107904278B (zh) 检测药物对细胞增殖影响的方法
US6461813B2 (en) Multiparameter FACS assays to detect alterations in cell cycle regulation
Furuya et al. Interleukin‐23 Regulates Inflammatory Osteoclastogenesis via Activation of CLEC5A (+) Osteoclast Precursors
Clausen et al. Guidelines for mouse and human DC functional assays
US20070224660A1 (en) Method for Assessment of Cytotoxic T Lymphocyte Activity
Yi et al. Mesenchymal Stromal Cells Increase the Natural Killer Resistance of Circulating Tumor Cells via Intercellular Signaling of cGAS‐STING‐IFNβ‐HLA
US6897031B1 (en) Multiparameter FACS assays to detect alterations in exocytosis
EP4057005A1 (en) Biomarker for use in cancer therapy
Clausen Guidelines for mouse and human DC functional assays
Maunder Langhans-type multinucleated giant cells in giant cell arteritis
Askar Cytometry by Time-of-Flight (CyTOF) and its Application in Brain Immunology
Jiang Elucidating the Molecular Mechanism of Apoptotic Cell Disassembly in vitro and in vivo
Steichele Apoptosis in hydra and an ancient function of the tumor necrosis factor receptor family
Balog et al. Multi-Dimensional Immuno-Profiling of Drosophila Hemocytes by Single Cell Mass Cytometry
WO1998046640A2 (en) Methods and compositions for inducing immunosuppression

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CX01 Expiry of patent term
CX01 Expiry of patent term

Granted publication date: 20070829