CN110412179A - 一种液相色谱检测颗粒酶a的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种液相色谱检测颗粒酶A的方法，将血清标本先经低温加热低速离心，再沸水加热后高速离心，取上清液，与洗脱液充分混合，得到供试品；取颗粒酶A标准品，用流动相溶解配置成溶液；精密量取对照品溶液及供试品溶液各10~20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算血清中颗粒酶A的含量；其中，色谱条件为：色谱柱以阳离子交换树脂为填充剂；以pH值为2～4的水为流动相；流动相的流速为0.8～1.2ml/min；检测波长为200～220nm；柱温为20～50℃。本发明首次采用液相色谱检测颗粒酶A的浓度，检测灵敏度高，检测时间短，重复性好，方法简便、准确、重复性好、专属性强。

Description

一种液相色谱检测颗粒酶A的方法
技术领域
本发明属于蛋白检测领域，具体涉及一种液相色谱检测颗粒酶A的方法。
背景技术
颗粒酶（granzyme）属于丝氨酸蛋白酶( serine protease) 家族成员, 存在于活化的细胞毒淋巴细胞（CTL） 和自然杀伤细胞NK 细胞胞浆中, 作为细胞毒细胞的活化标志发挥细胞毒的主要效应分子，从而参与免疫反应。相对于矽肺和肺癌，颗粒酶A在肺结核病人血清中浓度有所升高，但幅度不大。颗粒酶A可能通过不同的细胞毒性免疫途径参与到三组疾病中，发挥不同的作用。
目前颗粒酶采用Aelisa测定试剂盒测定，检测试剂盒价格昂贵，急需开发新的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种液相色谱检测颗粒酶A浓度的方法，检测时间短，灵敏度高。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种液相色谱检测颗粒酶A的方法，包括如下步骤：
1）供试品的制备：将血清标本先经低温加热低速离心，再沸水加热后高速离心，取上清液，与洗脱液充分混合，得到供试品；
2）对照品的制备：取颗粒酶A标准品，用流动相溶解配置成溶液；
3）测定：精密量取对照品溶液及供试品溶液各10~20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算血清中颗粒酶A的含量；
其中，色谱条件为：色谱柱以阳离子交换树脂为填充剂；以pH 值为2～4 的水为流动相；流动相的流速为0.8 ～ 1.2ml/min ；检测波长为200 ～ 220nm ；柱温为20～50℃。
步骤1）中所述低温加热温度为40~65℃，加热时间为20~50min。
步骤1）中所述沸水加热时间为10~20min。
步骤1）中所述低速离心转速为4000rpm，所述高速离心转速为8000rpm，离心时间为5~10min。
所述洗脱液由0.05 M硫酸钠、0.01M 磷酸钠、0.1%十二烷基磺酸钠组成，pH在6.5~7.2之间。
所述阳离子交换树脂色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18 液相色谱柱。
所述外标法以峰面积计算公式为供试品标示含量（%）=（供试品溶液峰面积/ 标准品溶液峰面积）×100%。
所述流动相用1mol/L 的硫酸溶液调节pH 值。
本发明利用颗粒酶A与其他蛋白的温度差，通过梯度加热沉淀血样中不同蛋白，然后经过不同离心处理，得到上清液直接进样，对其他蛋白沉淀更加完全，测定精密度更好，同时简化了操作手续，测定时间短、费用低，该法对设备的要求不高，流动相为水，安全环保。
有益效果：
本发明首次采用液相色谱检测颗粒酶A的浓度，通过对血浆样品的简单处理，排除了血浆中其他复杂成分对检测结果的影响，处理后的样品可直接进样检测，检测灵敏度高，检测时间短，重复性好，方法简便、准确、重复性好、专属性强。
具体实施方式
颗粒酶A标准品购自青岛捷世康生物科技有限公司 ；HP 1100 高效液相色谱仪(Hewlett Packard , 德国)；Agilent ZORBAX SB-C18 液相色谱柱购自安捷伦科技(中国)有限公司。
实施例1
一种液相色谱检测颗粒酶A的方法，包括如下步骤：
1）供试品的制备：将血清标本先经在50℃下加热30min，4000rpm低速离心10min，再沸水加热15min后8000rpm高速离心8min，取上清液，与洗脱液充分混合，得到供试品；所述洗脱液由0.05 M硫酸钠、0.01M 磷酸钠、0.1%十二烷基磺酸钠组成，pH为6.8左右；
2）对照品的制备：取颗粒酶A标准品，用流动相溶解配置成溶液；
3）测定：精密量取对照品溶液及供试品溶液各10~20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算血清中颗粒酶A的含量；
其中，色谱条件为：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18 液相色谱柱；以pH 值为3的水为流动相；流动相的流速为0.8 ～ 1.2ml/min ；检测波长为200 ～ 220nm ；柱温为20～50℃。
外标法以峰面积计算公式为供试品标示含量（%）=（供试品溶液峰面积/ 标准品溶液峰面积）×100%。
实施例2 精密度实验
将同一份样品（准确配置的含120µg/mL颗粒酶A的样品）分成6次同样处理和进样，测定其结果，结果见表1，精密度良好。
表1
序号 1 2 3 4 5 6
浓度µg/mL 120.6 119.1 119.4 120.9 120.7 119.2
实施例3回收率实验
制备低中高三种浓度60、120、240µg/mL的加标血浆样，每种浓度6份，按样品前处理与分析方法测定，连续测定3d，计算平均回收率和精密度。结果，高、中、低浓度样品的加标回收率为89.43％～105.17％，批内精密度为3.8％～6.1％，批间精密度为2.8％～5.6％，结果见表2。均符合《生物材料分析方法的研制准则》的要求。
表2 方法的平均回收率与相对标准偏差（n=6），%
加标60 µg/mL 加标120 µg/mL 加标240µg/mL
Recovery 89. 43 98. 29 105.17
RSD（批内） 4.7 3.8 6.1
RSD（批间） 5.6 2.8 4.5

Claims (8)

1.一种液相色谱检测颗粒酶A的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）供试品的制备：将血清标本先经低温加热低速离心，再沸水加热后高速离心，取上清液，与洗脱液充分混合，得到供试品；
2）对照品的制备：取颗粒酶A标准品，用流动相溶解配置成溶液；
3）测定：精密量取对照品溶液及供试品溶液各10~20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算血清中颗粒酶A的含量；
其中，色谱条件为：色谱柱以阳离子交换树脂为填充剂；以pH 值为2～4 的水为流动相；流动相的流速为0.8 ～ 1.2ml/min ；检测波长为200 ～ 220nm ；柱温为20～50℃。
2.根据权利要求1所述一种液相色谱检测颗粒酶A的方法，其特征在于，步骤1）中所述低温加热温度为40~65℃，加热时间为20~50min。
3.根据权利要求1所述一种液相色谱检测颗粒酶A的方法，其特征在于，步骤1）中所述沸水加热时间为10~20min。
4.根据权利要求1所述一种液相色谱检测颗粒酶A的方法，其特征在于，步骤1）中所述低速离心转速为4000rpm，所述高速离心转速为8000rpm，离心时间为5~10min。
5.根据权利要求1所述一种液相色谱检测颗粒酶A的方法，其特征在于，所述洗脱液由0.05 M硫酸钠、0.01M 磷酸钠、0.1%十二烷基磺酸钠组成，pH在6.5~7.2之间。
6.根据权利要求1所述一种液相色谱检测颗粒酶A的方法，其特征在于，所述阳离子交换树脂色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18 液相色谱柱。
7.根据权利要求1所述一种液相色谱检测颗粒酶A的方法，其特征在于，所述外标法以峰面积计算公式为供试品标示含量（%）=（供试品溶液峰面积/ 标准品溶液峰面积）×100%。
8.根据权利要求1所述一种液相色谱检测颗粒酶A的方法，其特征在于，所述流动相用1mol/L 的硫酸溶液调节pH 值。
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