CN107389922A - 一种胶乳增强免疫比浊法定量检测莱克多巴胺的试剂 - Google Patents

一种胶乳增强免疫比浊法定量检测莱克多巴胺的试剂 Download PDF

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Abstract

本发明之目的是提供一种胶乳增强免疫比浊法定量检测莱克多巴胺的试剂，包括试剂R1、试剂R2，试剂R1是由甘氨酸3.75—15.01g、莱克多巴胺—载体抗原复合物0.2—1.1g加蒸馏水定容至1000ml制成，试剂R2是由甘氨酸1.4—7.0g、聚乙二醇6000 10‑30 g、羧基胶乳与抗莱克多巴胺单克隆抗体交联胶乳100‑600mg、牛血清白蛋白（BSA）10‑30 g、Proclin300 1‑5 ml，加蒸馏水定容至1000ml制成，本发明组方科学合理，易生产制备，使用方便、安全、准确，可有效用于快速检测食品中的莱克多巴胺，确保食品安全，经济和社会效益显著。

Description

一种胶乳增强免疫比浊法定量检测莱克多巴胺的试剂
技术领域
本发明涉及一种胶乳增强免疫比浊法定量检测莱克多巴胺的试剂，属于食品安全检测技术领域。
背景技术
莱克多巴胺（ractopamine，RAC）是一种人工合成的β-肾上腺受体激动剂(俗称β-兴奋剂)类化合物，分子量：337.83；是由美国制药公司最先研究出的毒性小、代谢快的克伦特罗替代品，属于第二代瘦肉精。因其具有调节蛋白质合成的作用，国外也称为蛋白质再分配剂(Repartitioner)，在临床上主要用于治疗支气管哮喘、充血性心力衰竭症和肌肉萎缩症等。莱克多巴胺的毒性远低于具有相同功能的其它瘦肉精添加物。常规剂量的瘦肉精类药物可在机体内被代谢并排出体外，不会对机体造成伤害，但过量摄入莱克多巴胺，人体会出现不同程度的中毒反应，其症状与动物中毒症状相似，表现为肌肉震颤、四肢麻痹、心动过速、心律失常、腹痛、肌肉疼痛、恶心眩晕等症状，重者可引发高血压、心脏病甚至死亡。
当莱克多巴胺的使用量为临床使用量的5～10倍时，可以增加胴体蛋白质含量、减少脂肪组织，有效提高瘦肉率和饲料利用率。目前世界各国对莱克多巴胺在养殖业的适用范围的规定不尽相同。国际食品法典委员会(CAC)制定的莱克多巴胺在猪和牛中的最高残留量(MRL)标准均为:肌肉10μg/kg、脂肪10μg/kg、肝40μg/kg、肾90μg/kg，每日允许摄入量(ADI)为0-1μg/kg。世界各国对莱克多巴胺在养殖业适用范围的规定不尽相同。在美国、加拿大、日本、墨西哥、巴西、澳大利亚等24个国家和地区，莱克多巴胺可作为瘦肉精被允许用于畜禽养殖，以提高动物的蛋白质含量和瘦肉率；但在欧盟、中国、俄罗斯等国家，畜牧养殖中该类药物被全面禁止。中国台湾地区不允许使用，但允许进口使用了β-兴奋剂的动物产品。
2002年，农业部、原卫生部、原国家药品监督管理局联合发布《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》(农业部公告第176号)禁止莱克多巴胺在动物养殖中的使用。2011年12月5日，工信部、农业部、商务部、原卫生部、国家工商行政管理总局、国家质量监督检验检疫总局六部委发布联合公告(2011年第41号)，要求即日起在我国境内禁止生产和销售莱克多巴胺。
目前我国检测饲料、猪肌肉及其脏器、猪尿中莱克多巴胺的常规方法是酶联免疫（ELISA）法、高效液相色谱（HPLC）法、气相色谱－质谱（GC-MS）法和胶体金免疫层析（CIA）法。
酶联免疫（ELISA）法定量检测莱克多巴胺其主要工作原理如下：利用免疫学竞争法的原理，固相载体微孔板上包被有莱克多巴胺蛋白偶联物，加入待测莱克多巴胺标准品或样品溶液及特异性的抗莱克多巴胺的抗体，包被在微孔板上的莱克多巴胺蛋白偶联物和标准品或样品中的莱克多胺竞争性地与抗体结合；再加入酶标二抗，形成抗原抗体复合物；洗涤后加入显色剂，结合的酶将无色的显色剂转化为蓝色的产物；加入反应终止液后使颜色由蓝色变为黄色；在450nm波长进行检测，样品中的莱克多巴胺浓度与吸收光强度成反比。该方法操作步骤多，反应时间长，检测费用昂贵，不适于分析大批量的样品。
高效液相色谱（HPLC）法定量检测莱克多巴胺其主要工作原理如下：用2％氨/甲醇溶液提取试样中的莱克多巴胺，经固相萃取柱净化，浓缩后用2％乙酸溶液定容，用高效液相色谱－荧光检测法分离测定。其中需要使用高效液相色谱仪（配荧光检测器）、冷冻离心机、振荡器、 涡旋混合器、分析天平 、旋转蒸发仪、 氮吹仪一系列仪器设备。莱克多巴胺对照溶液和试液分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积进行计算样品含量。该方法操作步骤繁琐，反应时间长，需要大量精密仪器，对试验人员要求高，检测费用昂贵，仅适合实验室定量分析使用，不适于大批量的样品分析和基层实验室使用。
气相色谱－质谱（GC-MS）定量检测莱克多巴胺其主要工作原理如下：试样中莱克多巴胺先用2％氨/甲醇溶液提取，甲醇和正己烷分配脱脂，然后用柱净化，BSTFA（双三甲基硅基三氟乙酰胺）+TMCS（三甲基氯硅烷）衍生，最后用GC－MS法进行定性定量分析。将莱克多巴胺对照溶液和试液分别注入气相色谱－质谱联用仪，记录谱图，按外标法以峰面积进行计算。该方法操作步骤繁琐，反应时间长，需要使用精密仪器，对试验人员要求高，检测费用昂贵，仅适合实验室定量分析使用，不适于大批量的样品分析和基层实验室使用。
胶体金免疫层析方法（CIA）检测莱克多巴胺的主要工作原理：采用胶体金免疫层析技术和竞争抑制原理，将胶体金颗粒与包括抗原、抗体在内的许多蛋白质标记形成免疫金复合物的技术。检测时，样品中的莱克多巴胺在流动过程中与胶体金标记的特异性莱克多巴胺抗体结合，抑制了莱克多巴胺抗体与固相载体膜上的莱克多巴胺-BSA偶联物的结合，如果样品中含有莱克多巴胺时，则检测线T在规定时间内不显颜色，结果为阳性，反之，若检测线T显红色色带，结果为阴性。无论样品中莱克多巴胺浓度高低，C线均显红色色带。该方法操作方便，检测时间短，缺点：该技术只能对样品进行定性检测，不能实现对样品定量检测和动态监测。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的是提供一种胶乳增
强免疫比浊法定量检测莱克多巴胺的试剂，可有效解决快速检测食品中是否含有莱克多巴胺，确保食品安全的问题。
本发明解决的技术方案是，本发明试剂包括试剂R1、试剂R2，试剂R1是由甘氨酸3.75—15.01g、莱克多巴胺—载体抗原复合物0.2—1.1g加蒸馏水定容至1000ml制成，载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA），其中，莱克多巴胺—载体抗原复合物制备方法是：莱克多巴胺150mg，加入4ml含22.8mg戊二酸酐的吡啶溶液中，室温搅拌下反应22h，搅拌速度150rpm/分钟，反应后真空抽干反应物中的吡啶，得沉淀物，沉淀物溶解于8ml由DMF与1,4-二恶烷按1:1配制的溶剂中，加入正三丁胺52.4μl和氯甲酸异丁酯28.8μl，冰浴反应1h，再将该反应液逐滴加入10ml4℃预冷的质量浓度为0.2%的BSA溶液中，4℃反应48小时，反应物在0.01M PH=7.2 PBS中透析48小时，透析时每4小时换水一次，除去未反应的试剂，透析后反应物即为莱克多巴胺—载体抗原复合物；
所述的试剂R2是由甘氨酸3.75—15.01g、聚乙二醇6000 10-30 g、羧基胶乳与抗莱克多巴胺单克隆抗体交联胶乳100-600mg、牛血清白蛋白（BSA）10-30 g、Proclin300 1-5 ml，加蒸馏水定容至1000ml制成，其中，羧基胶乳与抗莱克多巴胺单克隆抗体交联胶乳的制备方法是：(l)活化羧基：称取羧基胶乳颗粒20-200mg，胶乳颗粒大小50-500nm，溶于PH6.5，50mM 10ml MES中，称取交联剂EDC 20mg、S-NHS 20mg依次加入上述胶乳溶液中震荡反应1h活化胶乳颗粒，随后离心，20000rpm，40分钟，离心后去上清，沉淀使用MES PH6.5,50mM10ml复溶，重复离心二次；沉淀溶于10ml 0.01M PH7.2 PBS液中，即为活化胶乳；(2)活化后胶乳每毫升中加入400ug抗莱克多巴胺单克隆抗体，室温搅拌下反应4小时；随后每毫升加入10%BSA溶液500ul，继续室温搅拌反应2小时；离心20000rpm，40分钟，去上清，沉淀使用甘氨酸溶液复溶即制成羧基胶乳与抗莱克多巴胺单克隆抗体交联胶乳。
本发明组方科学合理，易生产制备，使用方便、安全、准确，可有效用于快速检测食品中的莱克多巴胺，确保食品安全，经济和社会效益显著。
具体实施方式
实施例1: 本发明试剂包括试剂R1、试剂R2，试剂R1是由甘氨酸3.75g、莱克多巴胺—载体抗原复合物0.2加蒸馏水定容至1000ml制成，载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA），其中，莱克多巴胺—载体抗原复合物制备方法是：莱克多巴胺150mg，加入4ml含22.8mg戊二酸酐的吡啶溶液中，室温搅拌下反应22h，搅拌速度150rpm/分钟，反应后真空抽干反应物中的吡啶，得沉淀物，沉淀物溶解于8ml由DMF与1,4-二恶烷按1:1配制的溶剂中，加入正三丁胺52.4μl和氯甲酸异丁酯28.8μl，冰浴反应1h，再将该反应液逐滴加入10ml4℃预冷的质量浓度为0.2%的BSA溶液中，4℃反应48小时，反应物在0.01M PH=7.2 PBS中透析48小时，透析时每4小时换水一次，除去未反应的试剂，透析后反应物即为莱克多巴胺—载体抗原复合物；
所述的试剂R2是由甘氨酸3.75g、聚乙二醇6000 10 g、羧基胶乳与抗莱克多巴胺单克隆抗体交联胶乳100mg、牛血清白蛋白（BSA）10g、Proclin300 1 ml，加蒸馏水定容至1000ml制成，其中，羧基胶乳与抗莱克多巴胺单克隆抗体交联胶乳的制备方法是：(l)活化羧基：称取羧基胶乳颗粒20-200mg，胶乳颗粒大小50-500nm，溶于PH6.5，50mM 10ml MES中，称取交联剂EDC 20mg、S-NHS 20mg依次加入上述胶乳溶液中震荡反应1h活化胶乳颗粒，随后离心，20000rpm，40分钟，离心后去上清，沉淀使用MES PH6.5,50mM 10ml复溶，重复离心二次；沉淀溶于10ml 0.01M PH7.2 PBS液中，即为活化胶乳；(2)活化后胶乳每毫升中加入400ug抗莱克多巴胺单克隆抗体，室温搅拌下反应4小时；随后每毫升加入10%BSA溶液500ul，继续室温搅拌反应2小时；离心20000rpm，40分钟，去上清，沉淀使用甘氨酸溶液复溶即制成羧基胶乳与抗莱克多巴胺单克隆抗体交联胶乳；
实施例2：试剂R1：甘氨酸 7.505g、莱克多巴胺-载体蛋白复合物 0.4g、
调PH至7.4蒸馏水定容至1000ml；
试剂R2: 甘氨酸 7.505g、聚乙二醇6000 20g、抗莱克多巴胺单抗交联胶乳 300mg、牛血清白蛋白（BSA）20g、Proclin300 2ml
调PH至7.4蒸馏水定容至1000ml；
制备方法同实施例1。
实施例3：试剂R1：甘氨酸 15.01g、莱克多巴胺-载体蛋白复合物 1.1g
调PH至7.4蒸馏水定容至 1000ml；
试剂R2: 甘氨酸15.01g、聚乙二醇6000 30g、抗莱克多巴胺单抗交联胶乳 600mg、牛血清白蛋白（BSA）30g、Proclin300 5ml
调PH至7.4蒸馏水定容至1000ml；
制备方法同实施例1。
本发明使用情况是：使用半自动生化分析仪或全自动生化分析仪；基本参数如下：反应温度37℃；比色杯光径1.0cm；主波长570nm，副波长800nm；反应时间 8分钟；待测物品和标准品用量10ul；待测物品为饲料、猪肌肉及其脏器、猪尿，标准品为纯度达99.5% 莱克多巴胺纯品。
首先使用梯度稀释的系列标准品做标准曲线，然后取10μL待测物品溶液，加试剂R1 150μL，37℃孵育3-5分钟，加试剂R2 50μl混匀，37℃孵育30秒后读取吸光度值A1，3分钟后读取吸光度值A2，ΔA=A2-A1，以空白管调零读取吸光度。
试验结果的计算： 待测物品ΔA
待测物品RAC浓度(ng/ml )=×校准品浓度 式（1）
标准品ΔA
式中：待测物品Δ A ：以空白管吸光度为对照的待测物品管吸光度
标准品Δ A：以空白管吸光度为对照的标准品管吸光度
所述的标准品溶液的制备方法是：（1）、PH 7.4 0.01M PBS 缓冲液的配制：分别称取磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾 0.24g，氯化钠8 g，氯化钾0.2g，蒸馏水溶解、混匀，定容至1000ml，用盐酸或氢氧化钠调pH值至7.4±0.10，备用；（2）、标准品的配制：精密称取莱克多巴胺（纯度99.5%，购自中国药品生物制品鉴定所对照品）1mg，于10ml容量瓶使用PH7.40.01M PBS 缓冲液完全溶解后定容，浓度为100μg/ml；取10μL 100μg/ml莱克多巴胺标准品于10ml容量瓶使用PH7.4 0.01M PBS 缓冲液定容，浓度为100ng/ml；取3mL 100ng/ml莱克多巴胺溶液于100ml容量瓶使用PH7.4 0.01M PBS 缓冲液定容，浓度为3.0ng/ml标准品溶液；
本发明的测量原理是：纳米胶乳颗粒包被的是莱克多巴胺单克隆抗体,在液相中与一定量的莱克多巴胺-载体蛋白抗原发生抗原抗体反应,形成不溶性的免疫复合物,进一步产生浊度。该浊度在波长570nm可被检测到，在全自动生化分析仪上该浊度变化表现为相应的吸光度变化值。检测饲料、猪肌肉及其脏器、猪尿样品，当被测物中含有莱克多巴胺时,由于竞争原理,所形成的吸光度变化值与无被测物质时相比下降,在竞争法中吸光度的变化值与被测物质莱克多巴胺含量负相关,使用已知浓度的标准品绘制标准曲线,则可根据被测标本的反应吸光度变化由上述给出的式（1）计算出其浓度含量，非常方便快速。
试剂性能稳定可靠，并经试验得到了充分证明，有关试验情况如下：
试验质控品
水平质控品I：靶值：0.75ng/ml ，允许范围：0.675～0.825 ng/ml；
水平质控品II：靶值：2.0ng/ml，允许范围：1.8～2.2ng/ml。
测试仪器：日立7060全自动生化分析仪。
准确度试验
用水平质控品进行测试，重复检测3次，取测试结果均值（M），按下列公式计算相对偏差（B）。
B=×100%
式中：
M—测试结果均值；
T—有证参考物质标志值，或各浓度动物源样品定值。
测定准确度结果如下表：
水平质控品I测定结果：靶值：0.75ng/ml ，允许范围：0.675～0.825 ng/ml
水平质控品II测定结果：靶值：2.0ng/ml，允许范围：1.8～2.2ng/ml
精密度（变异系数CV）试验
取本发明试剂，对配制质控品II: 2.0ng/ml进行10次重复测定，然后计算测定值的均数X、测定值的标准差S与测定值的变异系数CV值，其公式如下：
式中：
—为测定值的平均数；
S—为测定值的标准差；
CV—为测定值的变异系数。
试剂测定结果如下表：
水平质控品II：靶值：2.0ng/ml，允许范围：：1.8～2.2ng/ml
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 X S CV
ng/ml 1.98 1.98 2.01 1.97 2.00 2.02 2.02 2.02 1.99 2.01 2.00 0.019 0.95%
线性试验
取RAC浓度为10ng/ml左右的猪尿标本，用生理盐水作梯度稀释，稀释浓度为3.0、1.5、0.75、0.33、0.16、0.02ng/ml。将系列稀释样品和生理盐水进行测定，每点测定3次，取平均值，对系列7点的实测平均值与相应理论值作回归分析，结果见下表
线性试验结果
线性试验结果
临床对比试验
同时用本发明试剂与现有的德国拜发R-Biopharm公司莱克多巴胺酶联免疫试剂盒检测20份猪尿标本，数据和统计结果如下：
原始试验数据记录表
本发明试剂测定结果与德国拜发R-Biopharm公司莱克多巴胺酶联免疫试剂盒对照结果的相关系数r=0.9983。
试验表明，（1）本发明选择交联莱克多巴胺-惰性蛋白合成人工抗原为反应抗原，该抗原与抗莱克多巴胺单抗有良好的反应性，具有准确性好，特异性高的优点。
（2）本发明选择纳米胶乳颗粒直径在50~500nm作为莱克多巴胺单克隆抗体的包被载体，它能够通过特定的交联技术高效交联莱克多巴胺单克隆抗体，从而完成特异性的抗原抗体反应。
（3）本发明选择甘氨酸缓冲液，使整个配方处于一种极其稳定的状态，提高了试剂的稳定性。
（4）本发明中选取聚乙二醇6000作为促凝剂，也是反应的促凝剂，它提高检测的灵敏度，促进样本中的抗原与结合有莱克多巴胺单克隆抗体的纳米胶乳微粒产生特异性的抗原抗体反应。
（5）本发明中选取稳定性较强，不易分解的Proclin300作为防腐剂，有效的避免了试剂在存储过程中细菌生长的问题，从而保证了试剂的稳定性。
（6）本发明中选取牛血清白蛋白（BSA）作为稳定剂，从而保证羧基胶乳交联莱克多巴胺单克隆抗体的稳定性。
（7）采用本发明的方法定量检测莱克多巴胺，检测时间仅需8分钟。
以上清楚表明，本发明组分科学，易生产制备，成本低，本发明胶乳增强免疫比浊法测定莱克多巴胺试剂与其它检测方法试剂相比，本发明的试剂既保留了现有试剂的优点：试剂可定量、检测时间短、仅需8min，保存期长，可达12月以上，又降低了成本，成本降低50%以上；操作更简便，使用样品量小；且对环境无污染，节能环保，是定量测定莱克多巴胺试剂上的创新，经济和社会效益显著。

Claims (4)

1.一种胶乳增强免疫比浊法定量检测莱克多巴胺的试剂，其特征是：包括试剂R1、试剂R2，试剂R1是由甘氨酸3.75—15.01g、莱克多巴胺—载体抗原复合物0.2—1.1g加蒸馏水定容至1000ml制成，载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA），其中，莱克多巴胺—载体抗原复合物制备方法是：莱克多巴胺150mg，加入4ml含22.8mg戊二酸酐的吡啶溶液中，室温搅拌下反应22h，搅拌速度150rpm/分钟，反应后真空抽干反应物中的吡啶，得沉淀物，沉淀物溶解于8ml由DMF与1,4-二恶烷按1:1配制的溶剂中，加入正三丁胺52.4μl和氯甲酸异丁酯28.8μl，冰浴反应1h，再将该反应液逐滴加入10ml4℃预冷的质量浓度为0.2%的BSA溶液中，4℃反应48小时，反应物在0.01M PH=7.2 PBS中透析48小时，透析时每4小时换水一次，除去未反应的试剂，透析后反应物即为莱克多巴胺—载体抗原复合物；
所述的试剂R2是由甘氨酸3.75—15.01g、聚乙二醇6000 10-30 g、羧基胶乳与抗莱克多巴胺单克隆抗体交联胶乳100-600mg、牛血清白蛋白（BSA）10-30 g、Proclin300 1-5 ml，加蒸馏水定容至1000ml制成，其中，羧基胶乳与抗莱克多巴胺单克隆抗体交联胶乳的制备方法是：(l)活化羧基：称取羧基胶乳颗粒20-200mg，胶乳颗粒大小50-500nm，溶于PH6.5，50mM 10ml MES中，称取交联剂EDC 20mg、S-NHS 20mg依次加入上述胶乳溶液中震荡反应1h活化胶乳颗粒，随后离心，20000rpm，40分钟，离心后去上清，沉淀使用MES PH6.5,50mM10ml复溶，重复离心二次；沉淀溶于10ml 0.01M PH7.2 PBS液中，即为活化胶乳；(2)活化后胶乳每毫升中加入400ug抗莱克多巴胺单克隆抗体，室温搅拌下反应4小时；随后每毫升加入10%BSA溶液500ul，继续室温搅拌反应2小时 ；离心20000rpm，40分钟，去上清，沉淀使用甘氨酸溶液复溶即制成羧基胶乳与抗莱克多巴胺单克隆抗体交联胶乳。
2.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊法定量检测莱克多巴胺的试剂，其特征是：所述试剂R1是由甘氨酸3.75g、莱克多巴胺—载体抗原复合物0.2g加蒸馏水定容至1000ml制成；所述的试剂R2是由甘氨酸3.75g、聚乙二醇6000 10 g、羧基胶乳与抗莱克多巴胺单克隆抗体交联胶乳100mg、牛血清白蛋白（BSA）10g、Proclin300 1 ml，加蒸馏水定容至1000ml制成。
3.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊法定量检测莱克多巴胺的试剂，其特征是：所述试剂R1是由甘氨酸7.505g、莱克多巴胺—载体抗原复合物0.4g加蒸馏水定容至1000ml制成；所述的试剂R2是由甘氨酸7.505g、聚乙二醇6000 20 g、羧基胶乳与抗莱克多巴胺单克隆抗体交联胶乳300mg、牛血清白蛋白（BSA）20g、Proclin300 2 ml，加蒸馏水定容至1000ml制成。
4.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊法定量检测莱克多巴胺的试剂，其特征是：所述试剂R1是由甘氨酸15.01g、莱克多巴胺—载体抗原复合物1.1g加蒸馏水定容至1000ml制成；所述的试剂R2是由甘氨酸15.01g、聚乙二醇6000 30 g、羧基胶乳与抗莱克多巴胺单克隆抗体交联胶乳600mg、牛血清白蛋白（BSA）30g、Proclin300 5 ml，加蒸馏水定容至1000ml制成。
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