CN103193883A

CN103193883A - 一种特异性莱克多巴胺人工抗原的合成方法

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Publication number: CN103193883A
Application number: CN2013101068882A
Authority: CN
Inventors: 胥传来; 刘丽强; 王利兵; 匡华; 徐利广; 马伟; 胡拥明
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2013-03-28
Filing date: 2013-03-28
Publication date: 2013-07-10
Anticipated expiration: 2033-03-28
Also published as: CN103193883B

Abstract

一种特异性莱克多巴胺人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明包括如下步骤：将章鱼胺和乙酰丙酸乙酯混合在甲醇溶液中，在三乙胺催化下，通过氰基硼氢化钠还原，反应得到中间产物，将中间产物在碱性条件下水解，得到含活性羧基的分子，该分子与莱克多巴胺分子的同源性大于70%，可作为莱克多巴胺的半抗原，将半抗原再与载体蛋白进行偶联，得到莱克多巴胺人工抗原。实验结果表明，用本发明的抗原免疫动物产生的抗体特异性高、灵敏度高，得到的抗血清效价可达64000，检测限为0.1ng/mL，半抑制浓度IC₅₀为1ng/mL。本发明的抗原或抗体可用于建立酶联免疫吸附分析方法和胶体金试纸快速检测法，用于快速检测食品中的莱克多巴胺残留，应用前景广阔。

Description

一种特异性莱克多巴胺人工抗原的合成方法

技术领域

一种高特异性莱克多巴胺人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

莱克多巴胺（Ractopamine）是一种人工合成的β肾上腺受体激动剂，可用于治疗充血性心力衰竭症、肌肉萎缩症，增长肌肉，减少脂肪蓄积，并对胎儿和新生儿生长有益。其分子结构式为：

莱克多巴胺可以用于动物营养配剂，已被用来作为动物饲料添加物，用以助长猪、牛、火鸡生出肌肉（俗称瘦肉），减少体脂肪。其肉品残留毒性远低于具有相同功能的其他瘦肉精添加物，目前广泛地用于畜牧业和养殖业。可以同时提高动物的日增重，提高饲料利用率，提高动物的蛋白质含量。

目前全世界允许在牛饲料中添加莱克多巴胺的国家包括美国、加拿大、墨西哥、印度尼西亚等。然而莱克多巴胺在养殖业的适用范围和安全性在其他国家的规定不尽相同。中国自2011年12月5日起禁止生产和销售莱克多巴胺。

目前我国对莱克多巴胺的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、液质联用法（LC/MS）、酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、胶体金试纸条法等。仪器分析方法存在样品须经多步稀释、过滤、提取，制备复杂、繁琐的缺点。尽管仪器分析方法是莱克多巴胺检测的确证方法，但是由于其操作繁琐，以及长时间的样本前处理过程，导致检测成本高，周期长，无法满足大批量样本快速筛查，以及现场快速检测的要求。ELISA和胶体金试纸条法属于免疫分析技术，具有较高的灵敏度和特异性，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。

影响免疫分析方法的关键因素在于特异性的抗原和抗体。传统的莱克多巴胺人工抗原一般通过琥珀酸酐与莱克多巴胺分子上的羟基偶联，衍生出羧基再与蛋白偶联。由于莱克多巴胺上有三个羟基，都能参与反应，因此使用琥珀酸酐法得到的羧基衍生物是一个混合物，最终通过免疫动物得到的抗体是针对这种混合物的，抗体的特异性会受到很大影响。由于莱克多巴胺在动物体内可从不同的酚羟基偶联的糖苷键代谢，形成不同的代谢产物，如莱克多巴胺葡萄糖苷酸A、B和C等3种类型，且莱克多巴胺葡萄糖苷酸A、B型的含量最高。因此，本发明从呈现莱克多巴胺葡萄糖苷酸A、B型的类似结构出发，设计具有单一结构的抗原，使其能产生对莱克多巴胺葡萄糖苷酸A、B型和莱克多巴胺分子具有高特异性的抗体。

发明内容

本发明的目的：针对现有莱克多巴胺抗原合成技术以及相应抗体的不足和缺陷，提供一种新型的莱克多巴胺半抗原及完全抗原合成方法，使得制备高特异性的莱克多巴胺单克隆抗体成为可能。

本发明的技术方案：

本发明提供的可用作莱克多巴胺半抗原的化合物I，具有式I所示分子结构。

（式I）

所提供的莱克多巴胺人工抗原的化合物Ⅱ，其分子结构式如式Ⅱ所示：

式Ⅱ。

一种特异性莱克多巴胺人工抗原的合成方法，以章鱼胺和乙酰丙酸乙酯为原料合成莱克多巴胺半抗原即化合物I，通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDC与N-羟基琥珀酰亚胺NHS活化、或者通过三正丁胺与氯甲酸异丁酯活化，再与载体蛋白上的氨基进行偶联，制得莱克多巴胺人工抗原即化合物Ⅱ，合成路线如下：

（1）莱克多巴胺半抗原的制备：

将章鱼胺和乙酰丙酸乙酯按摩尔比1:1混合，在甲醇溶液中，每1mmol章鱼胺用0.5mL三乙胺催化下，在室温条件下，通过氰基硼氢化钠还原，每1mmol章鱼胺用1.1mmol氰基硼氢化钠还原反应12h得到中间产物。

将中间产物在碱性条件水解，得到含活性羧基的分子，该分子与莱克多巴胺分子的同源性大于70%，可以作为莱克多巴胺半抗原，即化合物I。

莱克多巴胺分子与半抗原结构对比：

（2）莱克多巴胺人工抗原的制备：

（A）将化合物I用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，化合物I与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)的摩尔比为1:1.5:2，在4℃避光搅拌反应1h，再在室温反应12h，得活化的莱克多巴胺半抗原溶液；

取牛血清白蛋白，化合物I与牛血清白蛋白的摩尔比为80:1，将牛血清白蛋白用0.1M pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，其中溶解后的牛血清白蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸盐缓冲液与N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的体积比例为5:1；将活化的莱克多巴胺半抗原溶液慢速滴加到牛血清白蛋白溶液中，室温下反应24h，用PBS缓冲液透析2天，期间更换PBS缓冲液4次，即得到莱克多巴胺人工抗原，即化合物Ⅱ；

或（B）将化合物I用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，化合物I与三正丁胺，氯甲酸异丁酯的摩尔比为1:1.2:1.2,0℃反应1h，得活化的莱克多巴胺半抗原溶液；

取牛血清白蛋白，化合物I与牛血清白蛋白的摩尔比为80:1，将牛血清白蛋白用0.1M pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，0℃预冷30min，其中溶解后的牛血清白蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸盐缓冲液与N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的体积比例为5:1；在0℃条件下，将活化的莱克多巴胺半抗原溶液慢速滴加到牛血清白蛋白溶液中，0℃条件下反应1h，然后室温反应24h，用PBS缓冲液透析2天，期间更换PBS缓冲液4次，即得到莱克多巴胺人工抗原，即化合物Ⅱ。

将半抗原上的羧基与载体蛋白上的氨基进行偶联，得到完全抗原，将完全抗原透析，然后进行紫外鉴定（图1）。

所述的章鱼胺和乙酰丙酸乙酯纯度均大于95%。

所述的载体蛋白为：牛血清白蛋白BSA、匙孔血蓝蛋白KLH、血蓝蛋白LPH、鸡卵清白蛋白OVA、人血清白蛋白HSA之一种。

上述莱克多巴胺半抗原或完全抗原化合物在制备莱克多巴胺抗体中的应用也属于本发明的保护范围。

上述莱克多巴胺半抗原或完全抗原化合物免疫动物得到的抗体也属于本发明的保护范围，所述抗体为多克隆抗体和/或单克隆抗体。

上述莱克多巴胺半抗原或完全抗原化合物或抗体在检测莱克多巴胺中的应用，检测食品中莱克多巴胺残留也属于本发明保护的范围。

本发明的有益效果：本发明是新型的莱克多巴胺人工抗原的合成方法，由于整个反应中只有含羧基的半抗原才可能与蛋白偶联，因此得到的完全抗原具有很好的特异性。即使有部分原料乙酰丙酸乙酯没有反应完全，在最后水解产生了羧基，与蛋白进行偶联，但由于是短链状的乙酰丙酸，具有很低的免疫源性，不会影响特异性的莱克多巴胺抗体的产生，使得筛选出高特异性的莱克多巴胺单克隆抗体成为可能。

实验结果表明，用本发明的抗原免疫动物得到的抗血清效价可达64000，检测限为0.1ng/mL，半抑制浓度IC₅₀为1ng/mL。产生的抗体特异性高、灵敏度高。本发明的抗原或抗体可用于建立酶联免疫吸附分析方法和胶体金试纸快速检测法，从而用于快速检测食品中的莱克多巴胺残留。

附图说明

图1莱克多巴胺人工抗原紫外光谱图。

具体实施方式

下述实例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、莱克多巴胺半抗原的制备

1）章鱼胺306mg(2mmol），加入乙酰丙酸乙酯288.3μL（2mmol），甲醇10mL，三乙胺1mL，氰基硼氢化钠145mg（2.2mmol），室温搅拌反应12h，旋蒸，得到中间产物。

2）将中间产物溶解在15%KOH甲醇溶液（15mL）里，保持80℃回流反应2h，旋蒸干，固体残留溶解在5mL蒸馏水里，用6M HCl调其pH值至2.0，用乙酸乙酯提取三次，收集提取液，旋蒸干，得到半抗原化合物I，产率约30%。

实施例2、莱克多巴胺人工抗原的制备

取25mg（0.1mmol）半抗原，加入2mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，再分别加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺

(EDC)（半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)的摩尔比为1:1.5:2），4℃下，避光混匀，搅拌反应60min，再在室温下反应12h。取85mg（0.00125mmol）牛血清白蛋白（半抗原与牛血清白蛋白的摩尔比为80:1），加入10mL0.1M pH9.6碳酸盐缓冲液。将活化的莱克多巴胺半抗原溶液慢速滴加到牛血清白蛋白溶液中，室温下反应24h。用PBS缓冲液透析2天，期间更换PBS缓冲液4次，即得到莱克多巴胺人工抗原化合物Ⅱ。

实施例3、莱克多巴胺人工抗原的制备

取25mg（0.1mmol）半抗原，加入2mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，0℃预冷30min。0℃条件下，分别加入三正丁胺,氯甲酸异丁酯（半抗原:三正丁胺:氯甲酸异丁酯的摩尔比为1:1.2:1.2）,0℃反应1h。取85mg（0.00125mmol）牛血清白蛋白（半抗原:牛血清白蛋白的摩尔比为80:1），加入10mL0.1M pH9.6碳酸盐缓冲液，0℃预冷30min。在0℃条件下，将活化的半抗原溶液慢速滴加到牛血清白蛋白溶液中，0℃条件下反应1h，然后室温下反应24h。用PBS缓冲液透析2天，期间更换PBS缓冲液4次，即得到莱克多巴胺人工抗原化合物Ⅱ。

实施例4、莱克多巴胺抗血清的制备

以实施例2制得的莱克多巴胺人工抗原为免疫原，选用6-8周龄，雌性BALB/C小鼠为免疫动物，采用弗氏佐剂进行免疫，免疫小鼠5只。弗氏佐剂免疫方法为：首免取适量免疫原与等体积弗氏完全佐剂混合，乳化好后经颈背部皮下多点注射免疫，每间隔3周加强免疫一次。

实施例5、莱克多巴胺抗血清的测定

一、采用间接ELISA方法检测血清效价，具体操作步骤如下：

（1）包被：将实施例3中所得的莱克多巴胺人工抗原用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液从10μg/mL开始倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h。

（2）洗涤：将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液洗涤3次，每次3min。

（3）封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用。

（4）加样：将实施例4所得抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应1h；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应1h。

（5）显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min。

（6）终止和测定：每孔加入100ul终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD₄₅₀值。

（7）结果判读：以OD₄₅₀值大于或等于阴性对照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。

二、最低检测限、半数抑制以及特异性的检测

具体操作步骤如下：

（1）用上述的间接ELISA方阵滴定法确定包被原和抗体的工作浓度，以OD₄₅₀值在1.5左右时所对应的抗原和抗体浓度为最适工作浓度。

（2）包被：将包被原用包被缓冲液稀释至最适工作浓度，100μL/孔，37℃反应2h。

（3）洗涤和封闭：方法操作同上述间接ELISA法。

（4）配制莱克多巴胺标准溶液：将莱克多巴胺标准品用0.01mol/L、pH7.4的PBS溶液配制成1mg/mL的母液，然后，在加样前，再用0.01mol/L、pH7.4的PBS溶液倍比稀释成需要浓度。

（5）加样：每孔加入50μL倍比稀释的莱克多巴胺各浓度标准品，然后再加入50μL/孔最适稀释倍数的抗血清，37℃反应1h。充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应1h。

（6）显色反应：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min。

（7）终止和测定：每孔加入100μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD₄₅₀值。

（8）数据处理：以莱克多巴胺各浓度的对数为横坐标，以莱克多巴胺各浓度对应的OD值为纵坐标，绘制标准曲线，计算半数抑制浓度（IC₅₀，即OD₄₅₀值从零标准溶液对应的A0下降到50%时所对应的标准品浓度），从而判定抗血清对莱克多巴胺是否具有特异性。

（9）将莱克多巴胺的标准品换成沙丁胺醇、齐帕特罗、克仑特罗按上述方法测定IC₅₀值，并计算交叉反应率。

交叉反应率（%）=IC₅₀（莱克多巴胺）/IC₅₀（类似物）

实验设3次重复，结果取平均值。

结果显示，四免后，小鼠抗血清效价可达64000，检测限为0.1ng/mL，半抑制浓度IC₅₀为1ng/mL，各类似物的交叉反应率均小于0.1。

Claims

1.一种特异性莱克多巴胺人工抗原的合成方法，其特征在于以章鱼胺和乙酰丙酸乙酯为原料合成莱克多巴胺半抗原即化合物I，化合物I通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDC与N-羟基琥珀酰亚胺NHS活化、或者通过三正丁胺与氯甲酸异丁酯活化，再与载体蛋白进行偶联制得莱克多巴胺人工抗原即化合物Ⅱ，合成路线如反应式所示：

步骤为：

（1）莱克多巴胺半抗原的制备：

将章鱼胺和乙酰丙酸乙酯按摩尔比1:1混合，在甲醇溶液中，每1mmol章鱼胺用0.5mL三乙胺催化下，室温条件下，通过氰基硼氢化钠还原，每1mmol章鱼胺用1.1mmol氰基硼氢化钠还原反应12h得到中间产物；

将中间产物在碱性条件水解，得到含活性羧基的分子，作为莱克多巴胺半抗原，即化合物I；

（2）莱克多巴胺人工抗原的制备：

（A）将化合物I用N,N-二甲基甲酰胺DMF溶解，化合物I与N-羟基琥珀酰亚胺NHS，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDC的摩尔比为1:1.5:2，在4℃避光搅拌反应1h，再在室温反应12h，得活化的莱克多巴胺半抗原溶液；

取牛血清白蛋白，化合物I与牛血清白蛋白的摩尔比为80:1，将牛血清白蛋白用0.1M pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，其中溶解后的牛血清白蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸盐缓冲液与N,N-二甲基甲酰胺DMF的体积比例为5:1；将活化的莱克多巴胺半抗原溶液慢速滴加到牛血清白蛋白溶液中，室温下反应24h，用PBS缓冲液透析2天，期间更换PBS缓冲液4次，即得到莱克多巴胺人工抗原，即化合物Ⅱ；

或（B）将化合物I用N,N-二甲基甲酰胺DMF溶解，化合物I与三正丁胺，氯甲酸异丁酯的摩尔比为1:1.2:1.2,0℃反应1h，得活化的莱克多巴胺半抗原溶液；

2.根据权利要求1所述莱克多巴胺人工抗原的合成方法，其特征在于：所述的载体蛋白为：牛血清白蛋白BSA，或匙孔血蓝蛋白KLH、血蓝蛋白LPH、鸡卵清白蛋白OVA、人血清白蛋白HSA之一种。

3.根据权利要求1所述莱克多巴胺人工抗原的合成方法，其特征在于：化合物I莱克多巴胺半抗原，其分子结构式如式I所示：

式I。

4.根据权利要求1所述莱克多巴胺人工抗原的合成方法，其特征在于：化合物Ⅱ莱克多巴胺人工抗原，其分子结构式如式Ⅱ所示：

式Ⅱ。

5.用权利要求1所述方法合成的莱克多巴胺人工抗原的应用，其特征在于制备莱克多巴胺抗体，所述抗体为多克隆抗体和/或单克隆抗体。

6.用权利要求1所述方法合成的莱克多巴胺人工抗原的应用，其特征在于检测食品中莱克多巴胺残留。