CN105837683A - 一种氯丙那林人工抗原的合成方法 - Google Patents

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徐丽广
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Abstract

一种氯丙那林人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明以氯丙那林结构类似物为半抗原，用碳二亚胺法将其与载体蛋白BSA偶联，得氯丙那林人工抗原，用凝胶电泳法测定偶联物的偶联比。本发明成功合成了氯丙那林的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了必需的人工抗原。

Description

一种氯丙那林人工抗原的合成方法
技术领域
本发明涉及一种氯丙那林人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。
背景技术
氯丙那林，英文名称：Clorprenaline，分子式为C11H16ClNO，又称氯喘，属于β-受体激动剂，是目前常见的瘦肉精替代品，临床用于治疗支气管炎、喘息性支气管炎等，但是医学实验已经证明其残留对人体健康有严重危害，人长期食用含有β-受体激动剂残留的猪肉有致癌、致畸的可能。目前国内外各种兴奋剂、食品和饲料中添加剂的标准中关于氯丙那林的限量要求并没有体现，在实际检测中已经有氯丙那林检出。
目前，对于猪肉样品中β-激动剂的检查主要是通过固相萃取和酶解的方法提取后进行高效液相色谱-串联质谱、气相色谱法的方法检测，但是这些方法存在操作繁琐，耗时，费用比较贵等缺点，不能实现大量样品的快速检测，因此建立一种快速简便的氯丙那林检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，然而得到高亲和力和高特异性的单克隆抗体是免疫学检测的前提，其中人工抗原的合成是重要的一步。
发明内容
本发明的目的是提供一种氯丙那林人工抗原的合成方法，所制备的产品用于氯丙那林的免疫分析方法研究，为今后人们的研究提供了必需的人工抗原。
本发明的技术方案，一种氯丙那林人工抗原的合成方法，以氯丙那林结构类似物为半抗原，用碳二亚胺法将半抗原与载体蛋白BSA偶联，得到氯丙那林人工抗原；用凝胶电泳法测定偶联物的偶联比：
具体步骤如下：
（1）半抗原4-LR的合成：
半抗原4-LR合成路线为：
称取15g化合物Ⅰ于100mL HCl中50℃反应过夜得化合物Ⅱ；化合物Ⅱ加入到100mL亚硫酰氯中80℃反应过夜得黄色油状液体即化合物Ⅲ；称取6.2g氰化亚铜、23g碘化钾溶于120 mL乙腈中震荡反应10min，将化合物Ⅲ加入到上述反应液中，室温反应过夜，乙腈洗涤吹干获得黑色固体即化合物Ⅳ；取化合物Ⅳ、5.5 g氢氧化铝LAH溶于300 mL四氢呋喃THF中，0℃冰水浴反应30 min，室温搅拌2h冰浴至0℃，反应体系中加入6mL水，6mL 质量浓度15%的氢氧化钠溶液，室温搅拌15min，浓缩得到黄色油状液体即化合物Ⅴ，化合物Ⅴ溶于70mL甲醇中并加入6.5g乙酰丙酸乙酯，50℃反应2h，加入4.2g NaBH3CN冷却至℃，加入丙烯酸乙酯冰浴条件下萃取，洗去有机相，离心，纯化，烘干的终产物即氯丙那林结构类似物Ⅵ，将氯丙那林结构类似物Ⅵ经盐酸酸化即得氯丙那林半抗原4-LR；
（2）人工抗原的合成：将步骤（1）制备所得氯丙那林半抗原4-LR、碳二亚胺EDC、N-羟基琥珀酰亚胺NHS以三者摩尔比依次为1︰3︰3的比例在pH5.6的酸性溶液中反应，室温搅拌反应8h，得到A液；称取BSA 112mg溶于20mL pH7.2的0.01mol/L PBS缓冲液中，得到B液；在室温条件下，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得氯丙那林clo- BSA偶联物混合液；
（3）透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；
（4）透析：将步骤（2）制备所得clo-BSA偶联物混合液移入步骤（3）处理所得透析袋中，用2×2L的0.01M的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液和2×2L的去离子水透析3天后取出即得氯丙那林人工抗原；
（5）氯丙那林人工抗原的鉴定： 氯丙那林人工抗原采用凝胶电泳法鉴定其偶联结果，利用标准蛋白得到标准曲线，计算其偶联比。
偶联比测定：是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。凝胶电泳法是依据合成的人工抗原的分子量比载体蛋白的分子量增加来确定偶联比的。
本发明的有益效果：本发明成功合成了氯丙那林人工抗原，合成步骤简洁，有效，可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了必需的人工抗原。
附图说明
图1是牛血清蛋白BSA及其偶联物的凝胶电泳图；
A：氯丙那林人工抗原，B：牛血清蛋白BSA。
具体实施方式
实施例1
一种氯丙那林人工抗原的合成方法，用碳二亚胺法将半抗原与载体蛋白BSA偶联，用凝胶电泳法测定偶联物的偶联比：
具体步骤如下：
（1）半抗原4-LR的合成：
半抗原4-LR合成路线为：
称取15g化合物Ⅰ于100mL HCl中50℃反应过夜得化合物Ⅱ；化合物Ⅱ加入到100mL亚硫酰氯中80℃反应过夜得黄色油状液体即化合物Ⅲ；称取6.2g氰化亚铜、23g碘化钾溶于120 mL乙腈中震荡反应10min，将化合物Ⅲ加入到上述反应液中，室温反应过夜，乙腈洗涤吹干获得黑色固体即化合物Ⅳ；取化合物Ⅳ、5.5 g氢氧化铝LAH溶于300 mL四氢呋喃THF中，0℃冰水浴反应30 min，室温搅拌2h冰浴至0℃，反应体系中加入6mL水，6mL 质量浓度15%的氢氧化钠溶液，室温搅拌15min，浓缩得到黄色油状液体即化合物Ⅴ，化合物Ⅴ溶于70mL甲醇中并加入6.5g乙酰丙酸乙酯，50℃反应2h，加入4.2g NaBH3CN冷却至℃，加入丙烯酸乙酯冰浴条件下萃取，洗去有机相，离心，纯化，烘干的终产物即氯丙那林结构类似物Ⅵ，将氯丙那林结构类似物Ⅵ经盐酸酸化即得氯丙那林半抗原4-LR；
（2）人工抗原的合成：将步骤（1）制备所得氯丙那林半抗原4-LR、碳二亚胺EDC、N-羟基琥珀酰亚胺NHS以三者摩尔比依次为1︰3︰3的比例在pH5.6的酸性溶液中反应，室温搅拌反应8h，得到A液；称取BSA 112mg溶于20mL pH7.2的0.01mol/L PBS缓冲液中，得到B液；在室温条件下，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得氯丙那林clo- BSA偶联物混合液；
（3）透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；
（4）透析：将步骤（2）制备所得clo-BSA偶联物混合液移入步骤（3）处理所得透析袋中，用每次2L的0.01M的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液透析2次，再用每次2L的去离子水透析2次，共透析3天后取出，即得氯丙那林人工抗原。
（5）氯丙那林人工抗原的鉴定：氯丙那林人工抗原采用凝胶电泳法鉴定其偶联结果，利用标准蛋白得到标准曲线，计算其偶联比。
偶联比测定：是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。凝胶电泳法是依据合成的人工抗原的分子量比载体蛋白的分子量增加来确定偶联比的。SDS-聚丙烯酰胺电泳利用迁移率只与分子量有关，而与所带电荷、分子形状无关，可以利用SDS-聚丙烯酰胺电泳来确定人工抗原的分子量从而确定偶联比。
本实施例采用10%的分离胶，5%的浓缩胶，对牛血清蛋白BSA、氯丙那林人工抗原进行SDS-聚丙烯酰胺电泳，并计算得到人工抗原的分子量从而确定偶联比为21，完全适合免疫要求。

Claims (1)

1.一种氯丙那林人工抗原的合成方法，其特征在于以氯丙那林结构类似物为半抗原，用碳二亚胺法将半抗原与载体蛋白BSA偶联，得到氯丙那林人工抗原；
具体步骤如下：
（1）半抗原4-LR的合成：
半抗原4-LR合成路线为：
称取15g化合物Ⅰ于100mL HCl中50℃反应过夜得化合物Ⅱ；化合物Ⅱ加入到100mL亚硫酰氯中80℃反应过夜得黄色油状液体即化合物Ⅲ；称取6.2g氰化亚铜、23g碘化钾溶于120 mL乙腈中震荡反应10min，将化合物Ⅲ加入到上述反应液中，室温反应过夜，乙腈洗涤吹干获得黑色固体即化合物Ⅳ；取化合物Ⅳ、5.5 g氢氧化铝LAH溶于300 mL四氢呋喃THF中，0℃冰水浴反应30 min，室温搅拌2h冰浴至0℃，反应体系中加入6mL水，6mL 质量浓度15%的氢氧化钠溶液，室温搅拌15min，浓缩得到黄色油状液体即化合物Ⅴ，化合物Ⅴ溶于70mL甲醇中并加入6.5g乙酰丙酸乙酯，50℃反应2h，加入4.2g NaBH3CN冷却至0℃，加入丙烯酸乙酯冰浴条件下萃取，洗去有机相，离心，纯化，烘干的终产物即氯丙那林结构类似物Ⅵ，将氯丙那林结构类似物Ⅵ经盐酸酸化即得氯丙那林半抗原4-LR；
（2）人工抗原的合成：将步骤（1）制备所得氯丙那林半抗原4-LR、碳二亚胺EDC、N-羟基琥珀酰亚胺NHS以三者摩尔比依次为1︰3︰3的比例在pH5.6的酸性溶液中反应，室温搅拌反应8h，得到A液；称取BSA 112mg溶于20mL pH7.2的0.01mol/L PBS缓冲液中，得到B液；在室温条件下，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得氯丙那林clo-BSA偶联物混合液；
（3）透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；
（4）透析：将步骤（2）制备所得clo-BSA偶联物混合液移入步骤（3）处理所得透析袋中，用2×2L的0.01M的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液和2×2L的去离子水透析3天后取出，即得氯丙那林人工抗原。
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