CN110412138A - 一种液相色谱检测血清中组织蛋白酶g的方法 - Google Patents

一种液相色谱检测血清中组织蛋白酶g的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种液相色谱检测组织蛋白酶G浓度的方法，将血样于3000~5000r/min离心10~20min取血清，加入碘乙酰胺与NH4HCO3混和，避光45 min充分混匀，依次用氯化钠溶液、乙腈洗脱，收集洗脱液；取组织蛋白酶G标准品，用流动相溶解配置成溶液；精密量取对照品溶液及供试品溶液各10~20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算血清中组织蛋白酶G的含量。本发明首次采用液相色谱检测组织蛋白酶G的浓度，通过对血浆样品的简单处理，排除了血浆中其他复杂成分对检测结果的影响，处理后的样品可直接进样检测，检测灵敏度高，检测时间短，重复性好，方法简便、准确、重复性好、专属性强。

Description

一种液相色谱检测血清中组织蛋白酶G的方法
技术领域
本发明属于蛋白检测领域，具体涉及一种液相色谱检测血清中组织蛋白酶G的方法。
背景技术
组织蛋白酶(cathepsin)分布广泛，是半胱氨酸蛋白家族的成员之一，与多种严重疾病密切相关，例如恶性肿瘤、关节炎等。组织蛋白酶G在嗜中性多形核白细胞的嗜苯胺蓝颗粒中发现的，编码的蛋白酶与胰凝乳蛋白酶C具有相似的特异性，并可能参与了吞噬后病原菌的消化，和结缔组织炎症部位的重塑。组织蛋白酶G在矽肺病人血清中的浓度相对肺结核和肺癌有所增加，而在肺结核和肺癌血清的趋势基本一致。组织蛋白酶G在矽肺与后两组疾病中的表达变化提示其可能利用不同蛋白降解功能而参与多种生理活动（酶原和激素原）和免疫反应（抗原呈现），在肺部纤维化及肺部肿瘤的发生发展中发挥作用。
目前采用多抗或单抗包被微板来捕捉标本中的组织蛋白酶, 然后再加酶标记的抗组织蛋白酶抗体的双夹心EIJSA来检测血清中的组织蛋白酶的含量，检测试剂盒价格昂贵，急需开发新的组织蛋白酶的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种液相色谱检测组织蛋白酶G浓度的方法，检测时间短，灵敏度高。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种液相色谱检测血清中组织蛋白酶G的方法，包括如下步骤：
1）供试品的制备：将血样于3000~5000r/min离心10 ~20min取血清，加入碘乙酰胺与NH4HCO3混和，避光 45 min充分混匀，依次用氯化钠溶液、乙腈洗脱，收集洗脱液；
2）对照品的制备：取组织蛋白酶G标准品，用流动相溶解配置成溶液；
3）测定：精密量取对照品溶液及供试品溶液各10~20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算血清中组织蛋白酶G的含量；
其中，色谱条件为：色谱柱以阳离子交换树脂为填充剂；以乙腈和缓冲盐溶液的混合溶液为流动相；流动相的流速为0.8 ～ 1.2ml/min ；检测波长为190 ～ 210nm ；柱温为20～ 50℃。
步骤1）中碘乙酰胺与NH4HCO3的质量比为1： 10~20,碘乙酰胺加入量为每1mL血清中加入10~20mg。
步骤1）中所述氯化钠溶液浓度为0.5~1.5mol/L。
步骤2）中所述流动相为乙腈和缓冲盐溶液的混合溶液，所述的乙腈和缓冲盐溶液的体积比例为70:30～85:15。
所述阳离子交换树脂色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18 液相色谱柱。
所述外标法以峰面积计算公式为供试品标示含量（%）=（供试品溶液峰面积/ 标准品溶液峰面积）×100%。
所述缓冲盐溶液由3 .728gKCl和7mlHCl溶解于1000ml水中制得。
有益效果：
本发明首次采用液相色谱检测组织蛋白酶G的浓度，通过对血浆样品的简单处理，排除了血浆中其他复杂成分对检测结果的影响，处理后的样品可直接进样检测，检测灵敏度高，检测时间短，重复性好，方法简便、准确、重复性好、专属性强。
具体实施方式
组织蛋白酶G标准品购自常州贝源鑫生物科技有限公司； HP 1100 高效液相色谱仪(Hewlett Packard , 德国)；Agilent ZORBAX SB-C18 液相色谱柱购自安捷伦科技(中国)有限公司。
实施例1
一种液相色谱检测血清中组织蛋白酶G的方法，包括如下步骤：
1）供试品的制备：将血样于3000~5000r/min离心10 ~20min取血清，在1mL血清中加入15mg碘乙酰胺与150mg NH4HCO3混和，避光 45 min充分混匀，依次用1.0mol/L氯化钠溶液、乙腈洗脱，收集洗脱液；
2）对照品的制备：取组织蛋白酶G标准品1mg，精密称定，置50ml 容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml 置50ml 容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀；
3）测定：精密量取对照品溶液及供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算血清中组织蛋白酶G的含量；
其中，色谱条件为：以乙腈和缓冲盐溶液的混合溶液为流动相, 所述的乙腈和缓冲盐溶液的体积比例为70:30；流动相的流速为0.8 ～ 1.2ml/min ；检测波长为190 ～ 210nm；柱温为35℃，所述缓冲盐溶液由3 .728gKCl和7mlHCl溶解于1000ml水中制得。
供试品标示含量(％ ) ＝ ( 供试品溶液峰面积/ 标准品溶液峰面积)×100％。
实施例2 精密度实验
将同一份样品（准确配置的含80µg/mL组织蛋白酶G的样品）分成6次同样处理和进样，测定其结果，结果见表1，精密度良好。
表1
序号 1 2 3 4 5 6
浓度µg/mL 80.6 79.1 79.4 80.9 79.7 81.2
实施例3回收率实验
制备低中高三种浓度40、100、200µg/mL的加标血浆样，每种浓度6份，按样品前处理与分析方法测定，连续测定3d，计算平均回收率和精密度。结果，高、中、低浓度样品的加标回收率为95.43％～103.66％，批内精密度为2.8％～5.5％，批间精密度为1.8％～4.6％，结果见表2。均符合《生物材料分析方法的研制准则》的要求。
表2　方法的平均回收率与相对标准偏差（n=6），%
加标40 µg/mL 加标100 µg/mL 加标200µg/mL
Recovery 95. 43 98. 29 103.66
RSD（批内） 4.7 2.8 5.5
RSD（批间） 4.6 1.8 4.5

Claims (7)

1.一种液相色谱检测血清中组织蛋白酶G的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）供试品的制备：将血样于3000~5000r/min离心10 ~20min取血清，加入碘乙酰胺与NH4HCO3混和，避光 45 min充分混匀，依次用氯化钠溶液、乙腈洗脱，收集洗脱液；
2）对照品的制备：取组织蛋白酶G标准品，用流动相溶解配置成溶液；
3）测定：精密量取对照品溶液及供试品溶液各10~20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算血清中组织蛋白酶G的含量；
其中，色谱条件为：色谱柱以阳离子交换树脂为填充剂；以乙腈和缓冲盐溶液的混合溶液为流动相；流动相的流速为0.8 ～ 1.2ml/min ；检测波长为190 ～ 210nm ；柱温为20～ 50℃。
2.根据权利要求1所述一种液相色谱检测血清中组织蛋白酶G的方法，其特征在于，步骤1）中碘乙酰胺与NH4HCO3的质量比为1： 10~20。
3.根据权利要求1所述一种液相色谱检测血清中组织蛋白酶G的方法，其特征在于，步骤1）中所述氯化钠溶液浓度为0.5~1.5mol/L。
4.根据权利要求1所述一种液相色谱检测血清中组织蛋白酶G的方法，其特征在于，步骤2）中所述流动相为乙腈和缓冲盐溶液的混合溶液，所述的乙腈和缓冲盐溶液的体积比例为75:25～85:15。
5.根据权利要求1所述一种液相色谱检测血清中组织蛋白酶G的方法，其特征在于，所述阳离子交换树脂色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18 液相色谱柱。
6.根据权利要求1所述一种液相色谱检测血清中组织蛋白酶G的方法，其特征在于，所述外标法以峰面积计算公式为供试品标示含量（%）=（供试品溶液峰面积/ 标准品溶液峰面积）×100%。
7.根据权利要求1所述一种液相色谱检测血清中组织蛋白酶G的方法，其特征在于，所述缓冲盐溶液由3 .728gKCl和7mlHCl溶解于1000ml水中制得。
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