JP2003500649A - 薬剤耐性の新規機構の同定 - Google Patents

薬剤耐性の新規機構の同定

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cell
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シアン・シュ
ドナルド・パヤン
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ライジェル・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、多剤耐性(ＭＤＲ)に関与する細胞タンパク質に結合し調節する候補作用物質を同定する方法を提供する。本明細書中に概述したように、実行可能な二つの基本的なスクリーニングがある：１)多剤耐性表現型を付与する化合物のスクリーニング；および２)多剤耐性表現型を減弱させる化合物のスクリーニングである。ＸＡＰＣ７およびＺｅｔａの同定について本明細書中に概述したように、一旦標的分子が同定され、そして多剤耐性を付与するＲＧＰ８.５ペプチドで阻害されれば、ＸＡＰＣ７およびＺｅｔａ分子を、それらに結合しそれらの活性を調整する候補薬剤のスクリーニングに用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 (技術分野) この発明は一般的に、薬剤耐性、特に化学療法剤に対する腫瘍細胞の耐性に
関与する細胞のタンパク質に結合しおよび／もしくは調節する作用物質のスクリ
ーニング方法に関する。
【０００２】 (背景技術) 病理学的表現型に関与する情報伝達経路の重要な側面を同定するために生化学
的および遺伝学的アプローチが通常用いられる。生化学的アプローチは細胞内タ
ンパク質の特徴づけを行い、一方において遺伝学的アプローチは細胞成分の変異
の特徴づけを行う。薬理学は、興味の対象である成分に結合する候補作用物質を
同定することによって長い間遺伝学的および生化学的アプローチを補完してきた
。候補作用物質はいかなる分子であってもよいが、それらは典型的には有機化合
物である。低分子有機化合物はポリペプチドの構造、安定性、もしくは機能にし
ばしば作用を及ぼす。これに加えて、低分子有機化合物はタンパク質が互いに作
用する様式に影響を与えることができる(Fabbrizio, E., et al., (1999) Oncog
ene, 18: 4357-63)。有機低分子のこのトランスエフェクター機能は情報伝達経
路を研究しもしくは修正することができる精妙な手段を与える。
【０００３】 トランスエフェクターを求めて化合物の分子ライブラリーをスクリーニングす
ることは、情報伝達経路を特徴づけ得るもう一つの手段を提供する。多様な有機
分子のライブラリーを低分子ペプチドの形で細胞に送達することが可能であろう
。ペプチドは既知の標的タンパク質に対するインビトロスクリーニングにおいて
用いられてきた(Wong, D.W. & Robertson, G.H., (1998) Ann. N. Y. Acad. Sci
., 864, 555-557; Bremnes, T., et al., (1998) Immunotechnology, 4, 21-8)
。ファージに発現させたペプチドライブラリーは既知の標的分子に結合する高親
和性アプタマーを単離するために用いられてきている。そのような結合はインビ
トロでタンパク質の機能に影響を与えることが知られている。化学的に合成され
たペプチドのライブラリーも作成され、同様のレベルの効率で種々のインビトロ
アッセイでスクリーニングされている。しかしながら、生細胞中の全経路に対し
てペプチドをスクリーニングすることはこれまで可能ではなかった。
【０００４】 全経路に対するペプチドのスクリーニングに基づくアプローチは、疾病および
表現型成果を活性化する刺激の知識を必要とする。例えば、刺激はサイトカイン
に対する応答のように環境によって決定され、もしくは構成的に変異原性反応の
シグナルを出して腫瘍表現型をもたらす変異タンパク質のように構成的に存在す
ることができる。表現型成果は、表現型の多数の代替指標のいずれかを遺伝的選
択の手段に用いることにより、疾病状態に向かうか、もしくは離れる、運動と考
えることができる。そのような試みに最も近い試みは哺乳動物細胞中において相
補性を求めて行うｃＤＮＡライブラリースクリーニングである。
【０００５】 腫瘍細胞において化学療法薬に対する感受性の消失に導く経路に対するペプチ
ドを求めてスクリーニングを行うことは特に価値があるであろう。化学療法剤に
対する感受性の消失は結果として複数の化学療法剤に対する耐性をもたらす。こ
の耐性は多剤耐性(ＭＤＲ)と呼称され、広範囲の悪性腫瘍において種々の治療剤
で出現する。多剤耐性、ならびにそれによる腫瘍細胞選択、増生および再発が癌
患者の発病および死亡へと導く。
【０００６】 腫瘍細胞がＭＤＲを獲得するために用いる１つのメカニズムはＭＤＲ−１遺伝
子生成物であるＰ−糖タンパク質(Ｐ−ｇｐ)の上方制御である。そのような上方
制御は、広範な種類の固形腫瘍(Kaye, S.B., (1998) Curr. Opin. Oncol., 10 S
uppl 1, S15-19)および特定の白血病およびリンパ腫 (Hart, S.M. et al, (1993
) Leuk. Lymphoma, 11, 239-248; Yamaguchi, M. et al., (1995) Cancer, 76,
2351-2356)を含むヒトの多くの癌のＭＤＲ表現型と関連している。Ｐ−ｇｐは
エネルギー依存性排出ポンプとして機能する膜貫通タンパク質であり、その通常
の機能は代謝物を輸送し、また細胞毒性物質に対する保護を提供することである
(Bello-Reuss, E. & Ernest, S., (1994) Am. J. Physiol., 267, C1351-1358;
Chin, K.V., et al., (1990) Cell Growth Differ., 8, 361-365)。Ｐ−ｇｐの
過剰発現は抗癌薬剤の細胞外への排除、またその結果としてのこれらの化合物に
対する耐性の確立をもたらす。そのような薬剤耐性は、タキソールのような細胞
毒性薬剤(Parekh, H., Wiesen, K. & Simpkins, H. (1997) Biochem. Pharmacol
., 53, 461-470)ならびにその他の多くの化学療法剤(Fardel, O., et al., (199
4) Eur. J. Biochem., 219, 521-528)に対する曝露により腫瘍細胞で実証されて
いる。ＭＤＲと関係があると考えられている他のタンパク質は、アポトシス調節
因子(即ち、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘＬ)およびＬＲＰ(肺抵抗性タンパク質)
である。ＬＲＰタンパク質は卵巣癌、転移性悪性メラノーマ、および急性リンパ
性白血病と関係があると考えられている(Leith, C., (1998) Curr. Opin. Hemat
ol., 5, 287-291)。
【０００７】 したがって、細胞を化学療法剤耐性にすることに関与している細胞成分は最も
興味のあるものであり、ＭＤＲに関与するタンパク質および関連分子を提供する
ことがこの発明の目的である。ＭＤＲに関与する組換え核酸、ならびＭＤＲに関
与するタンパク質をコード化する核酸を含有する発現ベクターおよび宿主細胞を
提供することはこの発明のさらなる目的である。この発明のさらなる目的は、Ｍ
ＤＲに関与しているタンパク質のアンタゴニストおよびアゴニストをスクリーニ
ングする方法を提供することである。
【０００８】 (発明の要約) 上に概述した目的に沿って、本発明はＭＤＲを付与し、もしくは減弱させる作
用物質をスクリーニングするための方法および組成物を提供する。したがって、
この発明は、ＭＤＲ表現型を付与する耐性付与ペプチドおよびＭＤＲ表現型を減
弱させる薬剤候補のようなバイオ活性物生を提供する。
【０００９】 一つの態様では、この発明は細胞に多剤耐性を付与するバイオ活性物生をスク
リーニングする方法を提供する。その方法は、ａ)ランダムな候補ペプチドのレ
トロウイルスによるライブラリーを複数の細胞に導入し、そこにおいては当該ペ
プチドのそれぞれは異なるペプチド配列を含み；ｂ)複数の細胞をスクリーニン
グし、ＭＤＲ表現型を表している細胞であって、ＭＤＲ表現型がバイオ活性物生
の存在に因る細胞を探すステップを含む。この方法はまた、ｃ)ＭＤＲ表現型を
表している細胞を単離し；そして、ｄ)その細胞から耐性付与ペプチドを単離す
るステップを含んでいてもよい。
【００１０】 この発明はさらに、耐性経路のタンパク質を単離する方法を提供する。 さらなる態様では、この発明は多剤耐性経路のタンパク質に結合する能力を有
するバイオ活性物生をスクリーニングする方法を提供する。その方法は、ａ)多
剤耐性経路のタンパク質と候補バイオ活性物生とを結合させ；そしてｂ)候補作
用物質のタンパク質への結合を測定するステップを含む。
【００１１】 この発明はさらに、ａ)多剤耐性経路のタンパク質と耐性付与ペプチドとを接
触させ；そしてｂ)候補薬剤存在下でのペプチドのタンパク質への結合の低下を
検出し、それによって薬剤候補を同定するステップを含む薬剤候補を同定する方
法を提供する。
【００１２】 さらなる態様では、この発明は多剤耐性経路のタンパク質の活性を調整する能
力があるバイオ活性物生を同定する方法を提供する。この方法は、ａ)候補バイ
オ活性物生を、当該細胞のそれぞれが多剤耐性経路のタンパク質を発現している
複数の細胞に添加し；ｂ)当該複数細胞に化学療法剤を添加し；そしてｃ)化学療
法剤への耐性に対する候補バイオ活性物生の効果を測定するステップを含む。
【００１３】 一つの追加的態様では、本発明は多剤耐性経路のタンパク質のモデュレーター
の組成物を投与することを含む多剤耐性に関連する疾患を治療する方法を提供す
る。
【００１４】図面の簡単な説明 図1はＨｅＬａ細胞にタキソール耐性を付与するペプチドのスクリーングを示
す。図１Ａはペプチドライブラリースクリーニングを示す。ダイヤグラムの最上
段に示したベクターは、ペプチドとＧＦＰインディケーター遺伝子を共発現でき
るオペロンをコード化する単一の長末端反復(ＬＴＲ)により駆動されるＲＮＡ転
写物をコード化している。ＧＦＰの翻訳は内部リボゾーム侵入部位(ＩＲＥＳ)か
ら開始される。Ψはウイルスパッケージング配列を表す。スクリーニングを開始
するためには、ベクター内にコード化されているペプチドライブラリー(複雑度
３ｘ１０８)をウイルスパッケージング細胞株Ｐｈｏｅｎｉｘ−ａｍｐｈｏにト
ランスフェクトする。ウイルス粒子を収穫し次いでこれを用いてＨｅＬａ細胞に
形質導入する。感染ＨｅＬａ細胞を致死量のタキソールで処理する。ペプチド配
列をＰＴ−ＰＣＲにより生存クローンから救出し、次いでＴｅｔ調節可能な(Ｔ
ｒａ)レトロウイルスベクターに再クローニングする。Ｔｒａベクターは、テト
ラサイクリン応答性エレメント(ＴＲＥ)，サイトメガロウイルスの最小即時性初
期プロモーター(Ｐｍｉｎ)、ならびにプロモーターおよびエンハンサー機能を取
り除き、転写がＴＥＲ／Ｐｍｉｎで駆動できるようにした３’ＳＩＮ−ＬＴＲを
含む。次いで、タキソール耐性に対するこれらのペプチドの効果を未処理のＨｅ
Ｌａ細胞で再テストする。タキソール耐性表現型を確認した後、これらのペプチ
ドの細胞標的の機能を酵母の二ハイブリッドスクリーニングにより単離する。そ
れから、タキソール耐性におけるこれらの細胞タンパク質の機能をさらに検証す
る。
【００１５】 図１Ｂは、ペプチドＲＧＰ８.５で感染したＨｅＬａ細胞のクローン原性生存
アッセイにおける増強された生存を示す。ＨｅＬａ細胞をＲＧＰ８.５ペプチド
もしくはＧＦＰコントロールを発現するｔｅｔ−調節性レトロウイルスベクター
(Ｔｒａ)で感染させた。感染後、２×１０５個の細胞を６穴プレートの一つのウ
エルに分注し、細胞の半分をＤｏｘとインキュベートした。翌日、細胞を異なる
投与量のタキソールで４８時間処理した。２週間後、生存するコロニーをギムザ
液で染色し、写真撮影した。Ｄｏｘを加えた細胞は実験の間Ｄｏｘ中に維持した
。このアッセイをＲＧＰ８.５ペプチドについて数回繰り返した。同様の結果が
得られた(データは示していない)。
【００１６】 図２は、ＨｅＬａ細胞においてＲＧＰ８.５ペプチドがＭＤＲ１を上方調節す
ることを示している。図２Ａは、ＲＧＰ８.５ペプチドを発現しているタキソー
ル耐性ＨｅＬａ細胞を示す。ＨｅＬａ細胞を異なるレトロウイルスベクターに感
染させ、モノクローナル抗体ＭＤＲ１(ＵＩＣ２)ＰＥ複合体で染色し、蛍光活性
化セルソーター(ＦＡＣＳ)機で解析した。左上のパネルはＧＦＰコントロールベ
クターを発現する細胞を示しており、Ｘ軸にＧＦＰの発現を、Ｙ軸にＭＤＲ発現
を示す。左中央のパネルは８.２ペプチドコントロールであり、ＭＤＲ発現に対
して影響を示していない。左下は８.５のプールであり、それはＧＦＰ発現(ペプ
チドの代替指標)と相関した有意なＭＤＲ発現を示す。右側のパネルは、選択さ
れたクローンＲＧＰ８.５.１が誘導されたベクター発現によってＭＤＲ発現を調
節していることを実証している。右上はＨｅＬａ細胞コントロール；右中央は推
定ペプチド発現の不在下におけるベクター発現；右下はペプチド発現の脱抑制後
であり、ＧＦＰ(ペプチド)発現と相関する誘導されたＭＤＲ発現を示す。
【００１７】 図２Ｂは、ＨｅＬａ細胞中におけるベクター誘導の脱抑制後のタキソール耐性
を示す。ＲＧＰ８.５ペプチドを発現する細胞(選択されたクローン)を２００ｎ
ｇ／ｍｌのＤｏｘの存在下もしくは不在下に２日間インキュベートした。引き次
いて、細胞を１００ｎＭのタキソールで４８時間インキュベートし、次いで視覚
化して細胞の生存を調べた。
【００１８】 図２ＣはＣｓＡによるＭＤＲ−１ポンプ阻害がＲＧＰ８.５ペプチドの活性に
拮抗することを示す。Ｄｏｘを添加した細胞をドキシサイクリンで最初に２日間
インキュベートした後、９６穴プレートに撒いた。その時点以後、細胞は全実験
期間の間Ｄｏｘ中で維持した。５×１０３個ずつの細胞を９６穴プレートのウエ
ルに分注した。翌日、細胞を異なる濃度のタキソールのプラスもしくはマイナス
２μＭのＣｓＡをＤｏｘと組み合わせて処理した。示したデータは、標準的ＸＴ
Ｔアッセイにおいてそれぞれの処理の３回の平均値である。誤差バーはグラフの
データポイントより小さく、それ故に図では見ることができない。実験試料はグ
ラフの挿入説明に示されている。
【００１９】 図２Ｄは、ＲＧＰ８.５ペプチドを発現するＨｅＬａ細胞クローンのローダミ
ン１２３エフラックスアッセイを示す。細胞を２００ｎｇ／ｍｌのＤｏｘの存在
下もしくは不在下に４日間インキュベートした。次いで細胞を１ｎＭのローダミ
ン１２３で染色しＦＡＣＳで解析した。上段のパネルには、ＧＦＰ陽性細胞(縞
模様をつけたピーク、左上)が細胞(縞模様をつけたピーク、右上)からローダミ
ン１２３を排出しているのが見られる。ＧＦＰを活性化しなかった細胞はポンプ
活性を活性化しなかった(黒塗り)。下段の２枚のパネルはｔＴＡプロモーターが
Ｄｏｘの存在下に遮断された細胞を示す。殆どの細胞はＧＦＰ域値未満であり、
ローダミン１２３を強く保持していることを示していた(黒塗りピーク)。
【００２０】 図３は、ＲＧＰ８.５ペプチドを発現しているＨｅＬａ細胞クローンのｍｄｒ
１ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ解析を示す。ＲＧＰ８.５.１から全ＲＮＡを単離
し、等量のＲＮＡを用いて半定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った(２５サイクル)。Ｈｅ
Ｌａ細胞を先ず２００ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンと０、２、４、８、１２時
間(レーン１、２、３、および４)および３日間(レーン５)インキュベートした後
ＲＮＡを収穫して精製した。等量のＲＴ生成物をｍｄｒ１およびβ‐チュブリン
のＰＣＲ増幅に用いた。
【００２１】 図４は、免疫沈降およびウエスタンブロットによるＲＧＰ８.５ペプチドとＸ
ＡＰＣ７およびＺｅｔａタンパク質との会合の解析を示す。図４Ａは、細胞中の
発現されたＲＧＰ８.５とプロテアゾームサブユニットとの会合を示す。プラス
ミドにコード化されたＧＦＰ−ＲＧＰ８.５(レーン１、２および３)ならびにＧ
ＦＰ−ＲＧＰ５６.１融合体(レーン４、５および６)を、ベクターのみ(レーン１
および４)、フラグタグをつけたＺｅｔａ(レーン２および５)ならびにＸＡＰＣ
７(レーン３および６)の発現ベクターとともにＨｅＬａ細胞に共トランスフェク
ションを行った。トランスフェクションの４８時間後、細胞を収穫し、ＴＮＴ緩
衝液中に溶解し、抗フラグ抗体をつけたビーズを用いた免疫沈降に付した。共沈
したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ＧＦＰタンパク質抗体で検出し
た。ＧＦＰ−ペプチド融合体、ＺｅｔａおよびＸＡＰＣ７の発現の検出には、等
量の細胞抽出物をゲルにロードし、タンパク質発現をＧＦＰおよびフラグタグに
対する抗体で明らかにした。
【００２２】 図４Ｂは、ＲＧＰ８.５のアフィニティーカラムを用いたプロテアゾームサブ
ユニットの精製を示す。ＨｅＬａ細胞抽出物をストレプトアビジンカラムで予め
澄明にした。次いで、ビオチニル化ＲＧ８.５ペプチドを細胞溶解物に添加し４
℃で一夜混合した。翌日、ストレプトアビジンアガローズビーズを細胞抽出物と
４℃で３時間インキュベートした。ビーズを溶解緩衝液で５回洗浄した後、会合
したタンパク質を２倍濃度のタンパク質試料緩衝液で溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で分離し、ＺｅｔａおよびＸＡＰＣ７のプロテオゾームサブユニットに対するモ
ノクローナル抗体で検出した。
【００２３】 図５は、プロテアゾームのプロキシ阻害による形質模写ペプチド発現がＭＤＲ
−１発現を誘導することを示す。図５Ａは、ＲＧＰ８.５ペプチドを発現してい
るＨｅＬａクローンのｍｄｒ１ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ解析を示す。ＨｅＬ
ａ細胞の全ＲＮＡ(レーン１)およびＲＧＰ８.５ＨｅＬａ細胞クローン(レーン２
、３および４)を単離し、等量のＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ (２５サイクル)
を行った。ＨｅＬａクローンを２００ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリン(レーン３)
プラス５μＭのＭＧ１３２(レーン４)と２３時間先ずインキュベートした後、Ｒ
ＮＡ調製用に細胞を収穫した。等量のＲＴ生成物をｍｄｒ−１およびβ‐チュブ
リンのＰＣＲ増幅に用いた。
【００２４】 図５Ｂは、ＭＧ１３２によるプロテオゾーム阻害がＭＤＲ−１発現を誘導する
ことを示す。ＲＧＰ８.５ペプチドを発現するクローンを２００ｎｇ／ｍｌのＤ
ｏｘの有りもしくは無しで２日間インキュベートし、引き次いて細胞を５μＭの
ＭＧ１３２の有りもしくは無しで２１時間処理した。細胞をモノクローナル抗体
ＭＤＲ１(ＵＩＣ２)ＰＥ複合物で染色してＦＡＣＳで解析した。
【００２５】 図６は、ＲＧＰ８.５によるプロテアゾーム活性阻害が細胞サイクルの進行を
停止させることを示す。図６Ａは、ＲＧＰ８.５ペプチドを発現するＨｅＬａク
ローン中のＧＦＰ、ｈｓｐ７０およびサイクリンＢタンパク質の内在性レベルの
ウエスタンブロット解析を示す。内在性タンパク質発現に及ぼすＲＧＰ８.５の
作用を調べるために、ＲＧＰ８.５を発現しているＨｅＬａ細胞をドキシサイク
リン(２００ｎｇ／ｍｌ)と４日間インキュベートした後、収穫してウエスタン分
析を行った。等量の細胞溶解物をそれぞれのレーンにロードし、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで分離してＧＦＰ(Kodak)、ｈｓｐ７０およびサイクリンＢ１(Santa Cruz)に
対する抗血清でイムノブロットを行った。
【００２６】 図６Ｂは、ＲＧ８.５ペプチドを発現する細胞の細胞サイクル分析を示す。Ｒ
Ｇ８.５ペプチドを発現する細胞は５０％コンフルエンスまで生育していた。細
胞を収穫しＤＮＡのサイトメトリーのための処理を行った。ＤＮＡ含量プロファ
イルでは、太線はペプチド陰性細胞を表し、灰色の領域を示す曲線はＲＧ８.５
プチド陽性細胞を表す。図６の上段に示すように細胞をＧＦＰ発現に関して分別
した。
【００２７】 図７はＲＧＰ８．５のアミノ酸配列(配列番号１)およびＲＧＰ８.５のヌクレ
オチド配列(配列番号２)を示す。
【００２８】 図８Ａは、プロテアゾームサブユニットＸＡＰＣ７のヌクレオチド配列(配列
番号３、ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＡＦＯ２２８１５)を示す。図８Ｂは、プ
ロテアゾームサブユニットＸＰＡＣ７のアミノ酸配列(配列番号４、ＧｅｎＢａ
ｎｋ受け入れ番号ＡＡＢ８１５１５)を示す。Huang, J., et al., (1996) J. Vi
rol., 70: 5582-5591を参照のこと。図８Ｃは、プロテアゾームサブユニットＺ
ｅｔａのヌクレオチド配列(配列番号５、ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＮＭ＿０
０２７９０)を示す。図８Ｄは、プロテアゾームサブユニットＺｅｔａのアミノ
酸配列(配列番号６、ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＮＭ＿００２７８１。DeMarti
nio, G.N., et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta, 1079: 29038を参照)を示
す。
【００２９】 (発明の詳細な説明) 本発明は、多剤耐性(ＭＤＲ)に関与する細胞タンパク質に結合し調節する候補
作用物質を同定する方法を提供する。上に概述したように、実行可能な二つの基
本的なスクリーニングがある：１)多剤耐性表現型を付与する化合物のスクリー
ニング；および２)多剤耐性表現型を減弱させる化合物のスクリーニングである
。
【００３０】 したがって、好ましい実施態様では、多剤耐性表現型を付与する化合物を候補
作用物質のライブラリーを用いてスクリーニングを行う。化合物の標的分子を同
定し；そしてこれを用いて化合物存在下で標的分子に結合しおよび／もしくはそ
の活性を調整する候補薬剤をスクリーニングする。例えば、ここに概述したよう
に、ＭＤＲ表現型を付与するＲＧＰ８.５ペプチドのような化合物を用いてＭＤ
Ｒ経路内の標的分子を同定する。ＸＡＰＣ７およびＺｅｔａの同定についてここ
に概述したように、一旦標的分子が同定され、そして多剤耐性を付与するＲＧＰ
８.５ペプチドで阻害されれば、ＸＡＰＣ７およびＺｅｔａ分子を、それらに結
合しそれらの活性を調整する候補薬剤のスクリーニングに用いることができる。
【００３１】 したがって、開示された方法は遺伝子的スクリーニングを用いて、タキソール
、エトポシド、シスプラチン、その他のような化学療法剤に対する耐性を細胞に
付与する多剤耐性経路のタンパク質(即ち、以下に規定するＰＲＰタンパク質)を
同定する。またＰＲＰタンパク質の同定および分離の方法、抵抗性の経路を特徴
づける手段、およびＭＤＲを治療するのに使用できる新規薬剤を同定するために
、ＰＲＰタンパク質に結合しその活性を調整する能力のある候補バイオ活性物生
のスクリーニング法も提供される。
【００３２】 本発明は化学療法剤に耐性を付与する候補バイオ活性物生をスクリーニングす
る方法を提供する。これらの「耐性付与」作用物質は、化学療法剤への曝露によ
り細胞死を引き起こすかもしくは少なくともそれに貢献するところの細胞性タン
パク質に結合する能力がある。かくして、耐性付与作用物質は耐性経路のタンパ
ク質(ＰＲＰタンパク質、下記参照)を干渉しもしくは調整し、それによって化学
療法剤に対する耐性を誘導する。ランダムなペプチドもしくはオリゴヌクレオチ
ドを細胞に送達し、これらの細胞を化学療法剤を用いて選択圧の下に置き、そし
て生存している細胞を収穫することによって、細胞生存の役割を担っている作用
物質を同定する。加えて、本発明の方法は、作用物質が結合する細胞性タンパク
質の同定、およびバイオ活性物生、即ち、ＭＤＲ表現型を減弱させるのに使用で
きる増感剤のスクリーニングにおけるその細胞性タンパク質の次の使用を可能に
する。
【００３３】 これらの方法を用いることにより、耐性付与ペプチドＲＧＰ８.５および二つ
のＲＰＰタンパク質ＸＡＰＣ７およびＺｅｔａが同定された。米国出願番号６０
／１３６,０１８、特に出展明示により本明細書の一部とする、もまた参照のこ
と。
【００３４】 ＸＡＰＣ７およびＺｅｔａはα型プロテアゾームサブユニット(Groettrup & S
chmidtke, (1999) Drug discovery Today, 4: 63-71)である。プロテアゾームは
細胞内におけるタンパク質の大量分解のための主要なシステムである。プロテア
ゾームにより調節される重要な生物学的過程は、細胞サイクルの調節、アポトシ
ス、形態発生、分化、代謝調節、および抗原提示を含む(Groettrup & Schmiddtk
e, I; Chen, Z. et al., (1995) Genes Dev., 9, 1586-1597; Tsurumi, C., et
al., (1996) Nippon Rinsho, 54, 861-869)。２０Ｓプロテオゾームは、それぞ
れ７個のサブユニットをもつ４個のリングからなる樽形をしたコアタンパク質分
解複合体である。内側の２個のリングのサブユニットはベータ型をしており、樽
の内腔に向いたタンパク質分解活性センターをもっている；外側の２個のリング
はアルファー型をしており、プロテアゾームの内側の空間へのアクセスおよび調
節複合体との会合を制御している(Groettrup, M. & Schmidtke, G., (1999) Dru
g Research, 4, 63-71; Kania, M.A., et al., (1996) Eur. J. Biochem., 236,
510-516)。
【００３５】 プロテオゾーム活性を阻害する薬剤は細胞サイクルの進行に影響を及ぼすこと
が示されている。ｐ２１およびサイクリンＢのような多くの細胞サイクル調節因
子は極めて不安定であり、細胞サイクルの間プロテアゾーム仲介性のタンパク質
分解によって制御される細胞内濃度が迅速に変化する。２６Ｓプロテアゾームに
よるサイクリンＢの分解は中期から後期への細胞サイクルの移行に必要とされる
(Spataro, V., et al., (1997) J. Biol. Chem., 272: 30470-5)。
【００３６】 耐性付与ペプチドのＲＧＰ８.５はＭＤＲ−１発現を上方調節する；以下の実
施例を参照のこと。理論に縛られることなしに、ＲＧＰ８.５はＸＰＡＣ７に結
合してプロテアゾーム活性を妨害し得る。この理論は、肝炎ＢウイルスのｐＸタ
ンパク質(Ｘ因子)がＭＤＲ１遺伝子を転写促進させるという観察(Doong, S.L. e
t al., (1998) J. Hepatol., 29, 872-878)によって支持される。酵母の二ハイ
ブリッドタンパク質相互作用のスクリーニングにおいてＸＡＰＣ７はＸ因子と会
合し、ＸＡＰＣ７のアンチセンス発現はＸ因子によるトランス活性化の阻害をも
たらす(Huang, J., et al., (1996) J. Virol. 70, 5582-5591; Jorgensen, L.
& Hendil, K.B. (1999) Mol. Biol. Rep. 26, 119-123)。
【００３７】 Ｚｅｔａサブユニットは推定的リボヌクレアーゼであると示唆されており、構
成的に発現されたｍｄｒ−１転写物に結合したタンパク質に作用することにより
ｍＲＮＡ発現を調節するであろう(Fischer, M., Runkel, L. & Schaller, H., (
1995) Virus Genes, 10, 99-102; Petit, F. et al., (1997) Biochem. J., 326
, 93-98)。かくして、ＲＧＰ８.５ペプチドはプロテアゾーム阻害剤として働く
ことによって化学療法剤タキソールに対する耐性を付与するのであろう。
【００３８】 それ故に、理論に縛られることなく、癌細胞における薬剤耐性の一つの形は、
ＸＰＡＣ７もしくはＺｅｔａのプロテオゾームアルファサブユニットの変異もし
くは修飾またはそれらの作用の特異性を通して生じるのであろう。プロテアゾー
ムによる標的分子分解の変化は、直接ＭＤＲ−１タンパク質産生の調節因子に影
響を及ぼし、ＭＤＲ−１および化学療法剤に対する耐性状態の上方調節に導くこ
とになろう。
【００３９】 かくして、ＸＰＡＣ７およびＺｅｔａタンパク質はＭＤＲにおいて役割を有す
るものとして同定されており、そしてＸＰＡＣ７および／もしくはＺｅｔａの活
性の選択的調整のための候補薬剤のスクリーニングを含む種々の方法において用
いることができる。 ＭＤＲにおいて役割を果たすＸＰＡＣ７およびＺｅｔａのようなタンパク質を
ここでは「耐性経路のタンパク質」もしくは「ＰＲＰタンパク質」と規定する。
かくして、ＰＲＰタンパク質は細胞を化学療法剤に対して耐性にすることに関与
する細胞成分である。
【００４０】 したがって、本発明はＸＡＰＣ７およびＺｅｔａのようなＰＲＰタンパク質に
結合し、もしくはそれらの活性を調整することのできる成分を求めて候補バイオ
活性物生をスクリーニングする方法を提供する。
【００４１】 本明細書において「候補バイオ活性物生」または「候補薬物」または「外生化
合物」とは、例えば、タンパク質、小型の有機分子、炭水化物（多糖類を含む）
、ポリヌクレオチド、脂質などのいずれかの分子をいう。一般に、複数のアッセ
イ混合物を種々の薬物濃度を用いてパネルに並行して流し、種々の濃度に対して
の種々の示差応答を得る。典型的には、これらの濃度のうち１つ、すなわち０ま
たは検出レベルに満たない濃度が負の対照として用いられる。さらに、正の対照
も使用できる。例えば、細胞周期アッセイでは、細胞周期を変化させることが知
られている薬剤を使用してもよい。
【００４２】 候補薬物は多くの化学クラスを包含するが、典型的にはそれらは有機分子、好
ましくは分子量が１００ダルトンより大きく約２,５００ダルトン未満の小型の
有機分子である。候補薬物はタンパク質との構造相互作用、特に水素結合に必要
な官能基を含んでなり、典型的には少なくとも１つのアミン、カルボニル、ヒド
ロキシルまたはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つの官能化学基を含む
。該候補薬物は環式炭素または複素環式構造および／または上記の１以上の官能
基で置換された芳香族もしくはポリ芳香族構造を含んでなる。候補薬物はまた、
ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似
体またはそれらの組合せを含む生体分子間に見出せる。特に好ましいのはペプチ
ドである。
【００４３】 候補薬物は合成または天然化合物のライブラリーを含む多様な供給源から得ら
れる。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現をはじめ、多様な有機化合
物および生体分子のランダムな、また所定の合成には多くの手段が利用できる。
あるいは、細菌、真菌、植物および動物の抽出物形態における天然化合物のライ
ブラリーが入手可能であるか、または容易に作製できる。さらに、天然の、また
は合成により作製したライブラリーまたは化合物は従来の化学的、物理的、生化
学的手段により容易に修飾される。公知の薬理活性物質は、アシル化、アルキル
化、エステル化、アミド化などの所定のまたはランダムな化学修飾を受けて構造
類似体を形成し得る。
【００４４】 好ましい態様では、該候補バイオ活性物生はタンパク質である。本明細書にお
いて「タンパク質」とは共有結合した少なくとも２つのアミノ酸を意味し、タン
パク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドが含まれる。該タンパク
質は天然に存在するアミノ酸およびペプチド結合または合成ペプチド模倣構造か
らなってもよい。従って本明細書において「アミノ酸」または「ペプチド残基」
とは、天然に存在するアミノ酸と合成アミノ酸の双方を意味する。例えば、ホモ
フェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシンは、本発明の目的のためのア
ミノ酸と考えられる。また「アミノ酸」には、プロリンおよびヒドロキシプロリ
ンなどのイミノ酸残基が含まれる。その側鎖は（Ｒ）配置または（Ｓ）配置のい
ずれであってもよい。好ましい態様では、該アミノ酸は（Ｓ）またはＬ配置であ
る。天然に存在しない側鎖を用いる場合は、例えばインビボ分解を妨げるまたは
遅延させるために非アミノ酸置換基を用いてもよい。また、化学ブロッキング基
またはその他の化学置換基を付加してもよい。
【００４５】 好ましい態様では、候補バイオ活性物生は天然に存在するタンパク質または天
然に存在するタンパク質の断片である。従って、例えば、タンパク質またはタン
パク質性細胞抽出物のランダムなもしくは所定の消化物を含む細胞抽出物を用い
てもよい。このように、本明細書に記載の系のスクリーンのためには、原核生物
および真核生物のタンパク質ライブラリーを作製すればよい。本態様において特
に好ましいのは、細菌、真菌、ウイルスおよび哺乳類タンパク質のライブラリー
であり、後者が好ましく、ヒトタンパク質が特に好ましい。
【００４６】 好ましい態様では、該候補バイオ活性物生は、約５ないし約３０のアミノ酸か
らなるペプチドであり、約５ないし約２０のアミノ酸からなるものが好ましく、
約７ないし約１５のアミノ酸からなるものが特に好ましい。該ペプチドは上記に
概説したような天然に存在するタンパク質の消化物、ランダムペプチド、または
「偏りのある」ランダムペプチドであってもよい。本明細書において「ランダム
化された」または文法上の同義語は、核酸およびペプチドがそれぞれ実質的にラ
ンダムなヌクレオチドおよびアミノ酸からなることを意味する。一般にこれらの
ランダムペプチド（または以下に論じる核酸）は化学的に合成されるので、いず
れの位置にいずれのヌクレオチドまたはアミノ酸でも組み込める。この合成法は
、ランダム化されたペプチドまたは核酸を作製し、その長さおよび配列において
あり得る組合せのすべてまたは大部分の形成を可能にし、ランダム化されたタン
パク質性生理活性剤候補のライブラリーを形成するよう設計することができる。
【００４７】 １つの態様では、該ライブラリーは十分にランダム化され、いずれの位置でも
優先のまたは一定の配列は存在しない。好ましい態様では、該ライブラリーには
偏りがある。すなわち、配列内のある位置では一定であるか、または限られた数
の可能性から選択される。例えば、好ましい態様では、ヌクレオチドまたはアミ
ノ酸残基は、例えば、疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的に偏りのある（小さ
いまたは大きい）残基、架橋のためのシステイン、ＳＨ−３ドメインのためのプ
ロリン、リン酸化部位のためのセリン、トレオニン、チロシンもしくはヒスチジ
ンの作出などに対して、またはプリンに対してといった所定のクラス内でランダ
ム化される。
【００４８】 好ましい態様では、該候補バイオ活性物生は核酸である。本明細書において「
核酸」もしくは「オリゴヌクレオチド」または文法上の同義語は、共有結合した
少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は一般にホスホジエス
テル結合を含むが、以下に概説されるいくつかの場合では、例えば、ホスホルア
ミド(Beaucage, et al., Tetrahedron, 49(10):1925 (1993)およびその参照文献
; Letsinger, J. Org. Chem., 35:3800 (1970); Sprinzl, et al., Eur. J. Bio
chem., 81:579 (1977); Letsinger, et al., Nucl. Acids Res., 14:3487 (1986
); Sawai, et al., Chem. Lett., 805 (1984); Letsinger , et al., J. Am. Ch
em. Soc., 110:4470 (1988); およびPauwels, et al., Chemica Scripta, 26:14
1 (1986))、ホスホロチオエート(Mag, et al., Nucleic Acids Res., 19:1437 (
1991);および米国特許第 5,644,048号)、ホスホロジチオエート(Briu, et al.,
J. Am. Chem. Soc., 111:2321 (1989))、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合(Ec
kstein , Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford Un
iversity Press参照)、ならびにペプチド核酸主鎖および結合(Egholm, J. Am. C
hem. Sci., 114:1895 (1992); Meier, et al., Chem. Int. Ed. Engl., 31:1008
(1992); Nielsen, Nature, 365:566 (1993); Carisson, et al., Nature, 380:
207 (1996)参照。なお、これらは出典明示により本明細書の一部とする)を含ん
でなる選択的主鎖を有し得る核酸類似体が含まれる。その他の核酸類似体として
は正電荷主鎖(Denpcy, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6097 (1995))
；非イオン性主鎖(米国特許第５,３８６,０２３号、同第５,６３７,６８４号；
同第５,６０２,２４０号；同５,２１６,１４１号；および同第４,４６９,８６３
号; Kiedroeshi, et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English, 30;423 (1991); L
etsinger, et al., J. Am. Chem. Sci., 110:4470 (1988); Letsinger, et al.,
Nucleoside & Nucleotide, 13:1597 (1994); Chapters 2 and 3, ASC Symposiu
m Series 580, "Carbohydrate modifications in Antisense Research", Ed. Y.
S. Sanghui and P. Dan Cook; Mesmaeker, et al., Bioorganic & Medicinal Ch
em. Lett., 4:395 (1994); Jeffs, et al., J. Biomolecular NMR, 34:17 (1994
); Tetrahedron Lett., 37:743 (1996))、ならびに米国特許第５,２３５,０３３
号、同５,０３４,５０６号、およびChapters 6 and 7, ASC Symposium Series 5
80, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui
and P.Dan Cookに記載のものをはじめとする非リボース主鎖を有するものが挙
げられる。１以上の炭素環式糖を含む核酸もまた本核酸定義内に含まれる(Jenki
ns, et al., Chem. Soc. Rev., (1995) pp. 169-176参照)。いくつかの核酸類似
体がRawls, C & E News, June 2, 1997, page 35に記載されている。これらの参
照文献はすべて出典明示して本明細書の一部とする。リボース−リン酸主鎖のこ
れらの修飾を行い、標識などの付加部分の付加を助けたり、あるいは生理学的環
境下でかかる分子の安定性を高め、半減期を延ばしてもよい。さらに、天然に存
在する核酸と類似体の混合物を作製することもできる。あるいは、種々の核酸類
似体の混合物や天然に存在する核酸と類似体の混合物を作製してもよい。該核酸
は明示したように一本鎖であっても二本鎖であってもよく、あるいは二本鎖また
は一本鎖配列の双方の部分を含んでもよい。該核酸は、デオキシリボヌクレオチ
ドとリボヌクレオチドのいずれかの組合せ、およびウラシル、アデニン、チミン
、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン
、イソグアニンなどを含む塩基のいずれかの組合せを含む限り、ＤＮＡ（ゲノム
ＤＮＡおよびｃＤＮＡの双方）、ＲＮＡまたはハイブリッドであってもよい。
【００４９】 一般にタンパク質に関して上記したように、核酸候補バイオ活性物生は天然に
存在する核酸、ランダム核酸、または「偏りのある」ランダム核酸であってよい
。例えば、タンパク質に関して先に概説したように原核生物ゲノムまたは真核生
物ゲノムの消化物を用いてもよい。
【００５０】 好ましい態様では、該候補バイオ活性物生は有機化学部分であり、多様なもの
が文献から得られる。
【００５１】 好ましい態様では、種々の候補バイオ活性物生のライブラリーを用いる。好ま
しくは、該ライブラリーはランダム化された物生の十分構造的に多様な集団を提
供して、特定の標的との結合を可能とするに見込みとして十分な範囲の多様性を
達成する。従って、相互作用ライブラリーは、メンバーの少なくとも１つがそれ
に標的に対する親和性を与える構造を持つよう十分大きくなければならない。相
互作用ライブラリーの必要とされる絶対的なサイズを測るのは難しいが、自然が
免疫応答でヒントを与えてくれる。すなわち、多様な１０7ないし１０8個の異な
る抗体は、生物が直面する大部分のあり得る抗原と相互作用するに十分な親和性
を有する少なくとも１つの組合せを与える。また、公表されているインビトロ選
択技術も、１０7ないし１０8のライブラリーサイズが、標的親和性を有する構造
を見出すに十分であることを示している。本明細書で一般に提案されるものなど
７ないし２０アミノ酸長のペプチドのすべての組合せに関するライブラリー２０ 7 （１０9）ないし２０20をコードする可能性を有する。従って、１０7ないし１
０8の異なる分子のライブラリーを用い、本方法では理論的に完全な相互作用ラ
イブラリーの「実働」サブセットをアミノ酸７個とし、形態サブセットを２０20 とする。このように好ましい態様では、主題の方法において少なくとも１０6、
好ましくは１０7、より好ましくは少なくとも１０8、最も好ましくは少なくとも
１０9個の異なる配列が同時に解析される。好ましい方法はライブラリーのサイ
ズおよび多様性を最大にする。
【００５２】 該候補バイオ活性物生は細胞または細胞集団に結合または付加される。種々の
態様に好適な細胞種は先に概説されている。該候補バイオ活性物生と細胞は結合
させる。当業者には理解されるであろうが、これは候補薬物を細胞表面へ、細胞
を含む培地へ、または細胞が増殖している、もしくは接触している表面へ該候補
薬物を添加する。例えば、薬剤を細胞に導入するベクターを用いることにより該
物生を細胞に付加する（ずなわち、物生が核酸またはタンパク質である場合）こ
とをはじめ、多くの方法のいずれで達成してもよい。
【００５３】 好ましい態様では、該候補バイオ活性物生は、ウイルスベクターをはじめとす
るベクターを用いて宿主細胞へ導入される核酸またはタンパク質（この場合タン
パク質とはタンパク質、オリゴペプチドおよびペプチドを含む）のいずれかであ
る。ベクター、好ましくはウイルスベクターの選択は細胞種による。細胞が複製
する場合、以下にさらに十分記載されるようにレトロウイルスベクターを用いる
。細胞が複製しない場合（すなわちある増殖期で拘束されている場合）には、レ
ンチウイルスおよびアデノウイルスベクターをはじめとするその他のウイルスベ
クターを使用してもよい。
【００５４】 好ましい態様では、細胞は複製するかまたは複製を誘導できるかのいずれかで
あり、ＰＣＴ ＵＳ８７／０１０１９およびＰＣＴ ＵＳ８７／０１０４８に一
般に概説されているように、レトロウイルスベクターを使用して候補バイオ活性
物生を細胞に導入する。なおこの双方は出典明示により本明細書の一部とする。
一般に、レトロウイルスベクターのライブラリーはヘルパーは欠くが、ｇａｇ、
ｐｏｌおよびｅｎｖをはじめとする必要なすべてのトランスタンパク質、ならび
にシスにψパッケージングシグナルを有するＲＮＡ分子を産生できるレトロウイ
ルスパッケージング細胞系統を用いて作製される。便宜には、レトロウイルスＤ
ＮＡ構築主鎖にライブラリーを作製し、当技術分野において十分に公知である技
術を用いて標準的なオリゴヌクレオチド合成を行い、候補薬物またはタンパク質
、例えばランダムペプチドをコードする核酸のいずれかを作製する。ＤＮＡライ
ブラリーを作製した後、該ライブラリーを第１のプライマーにクローン化する。
第１のプライマーはレトロウイルス構築物に挿入される「カセット」として機能
する。第１のプライマーは一般に、例えば、必要とされる調節配列（例えば、翻
訳、転写、プロモーターなど）、融合パートナー、制限エンドヌクレアーゼ（ク
ローニングおよびサブクローニング）部位、拘束コドン（好ましくは３フレーム
すべての）、第２鎖プライミングのための相補性領域（好ましくは停止コドン領
域の末端に小さな欠失または挿入としてランダムな領域に起こり得る）などをは
じめとするいくつかのエレメントを含む。
【００５５】 次いで、第２のプライマーを加えるが、これは一般に相補性領域のいくつかま
たはすべてからなり、第１のプライマーおよびサブクローニングのための第２の
唯一の制限部位に必要な任意の配列をプライミングする。ＤＮＡポリメラーゼを
加えて二本鎖オリゴヌクレオチドを作製する。この二本鎖オリゴヌクレオチドを
適当なサブクローニング制限エンドヌクレアーゼで切断して以下に記載する標的
レトロウイルスベクターにサブクローン化する。
【００５６】 いずれの数の好適なレトロウイルスベクターを使用してもよい。一般に、レト
ロウイルスベクターは、以下でさらに十分に記載される選択マーカー遺伝子、５
'ＬＴＲに対してセンスまたはアンチセンスに置かれた、第２の遺伝子を発現さ
せるプロモーター、ＳＩＮにおけるＣＲＵＳ（合成ＬＴＲ）テトラサイクリン調
節エレメント、細胞特異的プロモーターなどを含み得る。
【００５７】 好ましいレトロウイルスベクターとしては、ネズミ幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ
）（Hawley et al., Gene Therapy 1:136(1994)参照）および改変ＭＦＧウイル
ス（Rivere et al., Genetics 92:8733(1995)）およびＰＣＴ ＵＳ９７／０１
０１９に概説されたｐＢＡＢＥを基にしたベクターが挙げられる。
【００５８】 レトロウイルスは候補薬物の発現のための誘導プロモーターおよび構成プロモ
ーターを含み得る。例えば選択過程のある相の間でのみ、またはある細胞相にお
いてのみペプチド発現を誘導する必要がある場合（すなわち、Ｅ２Ｆ応答プロモ
ーター、ｐ５３応答プロモーター、サイクリンプロモーターなどの相特異的プロ
モーターを用いる場合）がある。誘導プロモーターおよび構成プロモーター双方
の多数のもが知られている。
【００５９】 さらに、標的細胞における単一ベクターの組み込み後にレトロウイルス挿入部
の誘導発現が可能となるようにレトロウイルスベクターを配置することができる
が、完全な系が単一のレトロウイルスに含まれていることが重要である。３’Ｌ
ＴＲエンハンサー／プロモーターレトロウイルス欠失変異体の自己不活化（ＳＩ
Ｎ）特性を組み込んだＴｅｔ誘導性のレトロウイルスが設計されている（Hoffma
n et al., PNAS USA 93:5185(1996)）。細胞におけるこのベクターの発現はテト
ラサイクリンまたは他の有効な類似体の存在下では実質的には検出できない。し
かしながら、Ｔｅｔの不在下では誘導後４８時間以内に発現が最大を示し、誘導
可能なレトロウイルスを含む細胞の全集団の発現が一様に増加するが、このこと
は、感染細胞集団内では発現が一様に調節されるということを示す。同様に、関
連する系は、Ｔｅｔの存在下でＤＮＡに結合するが、Ｔｅｔの不在下では除去さ
れるような変異ＴｅｔＤＮＡ結合ドメインを使用する。これらの系はいずれも好
適である。
【００６０】 好ましい態様では、候補バイオ活性物生は融合パートナーに結合している。本
明細書において「融合パートナー」または「機能的グループ」とは、候補バイオ
活性物生と会合し、そのクラスのライブラリーのすべてのメンバーに共通の機能
または能力を付与する配列を意味する。融合パートナーは異種（すなわち、宿主
にとり天然でない）、または合成のもの（いずれの細胞にとっても天然でない）
であり得る。好適な融合パートナーとしては、限定されるものではないが、ａ）
候補バイオ活性物生を立体配位上制限されまたは安定な形で提供される以下に定
義の提示構造、ｂ）候補バイオ活性物生を細胞下または細胞外区画へ局在化させ
る、以下に定義される標的配列、ｃ）候補バイオ活性物生かまたはそれらをコー
ドする核酸のいずれかの精製または単離を可能にする以下に定義のレスキュー配
列、ｄ）候補バイオ活性物生またはそれをコードする核酸に安定性または分解か
らの保護、例えばタンパク質分解耐性を付与する安定配列、ｅ）ペプチド二量化
を可能にする二量化配列、あるいはｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）およびｅ）なら
びに要すればリンカー配列のいずれかの組合せが挙げられる。
【００６１】 好ましい態様では、融合パートナーは提示構造である。本明細書において「提
示構造」または文法上の同義語は、候補バイオ活性物生と融合した場合に候補薬
物に立体配位的上制限された形をとらせる配列を意味する。タンパク質は立体配
位上拘束されたドメインを介して互いに強く相互作用する。当技術分野で公知の
ように、自由に回転するアミノおよびカルボキシル末端を有する小さなペプチド
は強い機能を有していても、かかるペプチド構造の薬理活性剤への変換は、ペプ
チド模倣合成に関する側鎖の位置を予測できないために困難である。従って、立
体配位上拘束された構造でのペプチドの提示は、その後の医薬の製造にも有益で
あるし、またおそらくペプチドと標的タンパク質とのより高い親和性の相互作用
をもたらす。この事実は、細菌ファージ系において生物学的に作製した短いペプ
チドを用いる組合せライブラリー作製系において認められている。何人かの研究
者が、ランダム化されたペプチド構造を提示する小ドメイン分子を構築している
。
【００６２】 候補バイオ活性物生は核酸またはペプチドのいずれであってもよいが、提示構
造はペプチド候補薬物とともに用いるのが好ましい。従って合成提示構造、すな
わち人工ポリペプチドはランダム化されたペプチドを立体配位上制限されたドメ
インとして提示できる。一般に、かかる提示構造は、ランダム化されたペプチド
のＮ末端に結合した第１の部分と、そのペプチドのＣ末端に結合した第２の部分
とを含んでなり、すなわち該ペプチドは、以下に概説されるように、変異体を作
製できるが提示構造に挿入されている。ランダム化された発現産物の機能的単離
を高めるには、標的細胞において発現された場合に最小の生物学的活性しか持た
ないように提示構造を選択または設計する。
【００６３】 好ましい提示構造は、外側のループにそれを提示することにより、ペプチドへ
の接近性が最大となる。従って、好適な提示構造としては、限定されるものでは
ないが、ミニボディ構造、βシートターン上のループ、構造に重要でない残基が
ランダム化されている超らせん幹構造、ジンクフィンガードメイン、システイン
結合（ジスルフィド）構造、トランスグルタミナーゼ結合構造、環状ペプチド、
Ｂループ構造、らせんバレルまたはらせん束、ロイシンジッパーモチーフなどが
挙げられる。
【００６４】 好ましい態様では、該提示構造は超らせん構造であり、外側のループでランダ
ム化ペプチドの提示を可能にする。例えば、出典明示により本明細書の一部とす
る、Myazka et al., Biochem. 33:2362-2373(1994)参照。この系を用いて、研究
者らは適当な標的と高い親和性の相互作用が可能なペプチドを単離している。一
般に、超らせん構造は６ないし２０個の間のランダムな位置にある。
【００６５】 好ましい超らせん提示構造は以下のとおりである。
【化１】 下線の領域はこれまでに定義された超らせんロイシンジッパー領域を示す（出典
明示により一部とする、Martin et al., ENBO J. 13(22):5303-5309(1994)参照
）。太字のＧＲＧＤＭＰ領域は、ループ構造を示し、ランダム化されたペプチド
（すなわち、本明細書では概して（Ｘ）n（ここで、Ｘはアミノ酸残基であり、
かつ、ｎは少なくとも５または６の整数である）で示される候補バイオ活性物生
）で適当に置換された場合に可変の長さとなり得る。太字領域の置換は下線領域
に制限エンドヌクレアーゼ部位をコードすることによって促進されて、その位置
でのランダム化されたオリゴヌクレオチドの直接組み込みが可能となる。例えば
、好ましい態様は、二重下線のＬＥ部位にＸｈｏＩ部位を、また二重下線のＫＬ
部位にＨｉｎｄIII部位を作り出す。
【００６６】 好ましい態様では、該提示構造はミニボディ構造である。「ミニボディ」は実
質的に最小の抗体相補性領域からなる。該ミニボディ提示構造は一般に折り畳ま
れたタンパク質において三次構造の単一面に沿って提示される２個のランダム化
領域を提供する。例えば、Bianchi et al., J. Mol. Biol. 236(2):648-59(1994
)およびそこで引用されている文献参照、なお、すべて出典明示により本明細書
の一部とする。研究者らはこの最小ドメインが溶液中で安定であることを示し、
組合せライブラリーにおいて相選択系を使用して炎症性サイトカインＩＬ−８に
Ｋｄ＝１０-7といった高い親和性を示すペプチド領域を用いてミニボディを選択
している。
【００６７】 好ましいミニボディ提示構造は以下のとおりである。
【化２】 太字で下線の領域はランダム化され得る領域である。イタリック体のフェニルア
ラニンは第１のランダム化領域において不変でなくてはならない。完全なペプチ
ドが超らせんの態様の３つのオリゴヌクレオチドからなる可変部分にクローン化
され、従って２個の異なるランダム化領域の同時組み込みが可能となる。この態
様は末端の非パリンドロームＢｓｔＸＩ部位を利用する。
【００６８】 好ましい態様では、該提示構造は一般に２個のシステイン残基を含む配列であ
り、その結果ジスルフィド結合が形成され、立体配位上拘束された配列が得られ
る。この態様は分泌標的配列を用いる場合には特に好ましい。当業者には理解さ
れるであろうが、いずれの数のランダム配列でも、スペーサーまたは連結配列を
伴い伴わなくて、システイン残基でフランクされ得る。他の態様では、効果的な
提示構造はランダム領域自体によって作出され得る。例えば、ランダム領域は、
システイン残基で「処理」するが、適当な酸化還元条件下では提示構造に類似し
た高度に架橋した構造の立体配位をもたらし得る。同様に、ランダム化領域は制
御されてβシートまたはαへリックス構造を与える一定数の残基を含み得る。
【００６９】 好ましい態様では、該融合パートナーは標的配列である。当業者には理解され
るであろうが、細胞内でのタンパク質の局在化は有効濃度を高め、かつ機能を決
定するための単純な方法である。例えば、ＲＡＦ１はミトコンドリア膜に局在し
た場合にはＢＣＬ−２の抗アポトーシス作用を阻害し得る。同様に、膜に結合し
たＳｏｓはＴリンパ球においてＲａｓ媒介性のシグナル伝達を誘導する。これら
の機構はリガンドの探索領域を限定する原理によるものと考えられ、すなわち、
タンパク質の原形質膜への局在化はそのリガンドの探索を細胞質の三次元空間に
対して膜付近の二次元空間に限定することとなる。あるいはまた、タンパク質の
濃度も局在化という性質により簡単に高められる。核へタンパク質を往復させる
ことによりそれらをより小さい空間に制限し、それにより濃度が高まる。最後に
、リガンドまたは標的は特定のコンパートメントに簡単に局在化され得るし、阻
害剤も適当に局在化するはずである。
【００７０】 このように好適な標的配列としては、限定されるものではないが、発現産物の
生物活性を維持しつつ発現産物を所定の分子またはクラスの分子と結合させるこ
とができる結合配列（例えば、酵素阻害剤または基質配列を用いてある関連する
酵素クラスを標的化する）；それ自体またはともに結合しているタンパク質の選
択的分解のシグナルを伝達する配列；ならびに、候補発現産物を、ａ）ゴルジ体
、小胞体、核、仁、核膜、ミトコンドリア、葉緑体、分泌小胞、リソソーム、お
よび細胞膜などの細胞下の位置、およびｂ）分泌シグナルを介する細胞外の位置
を含む、細胞の所定の場所へ構成的に局在化させ得るシグナル配列が挙げられる
。細胞下への局在化または分泌を介する細胞外への局在化のいずれかが特に好ま
しい。
【００７１】 好ましい態様では、標的化配列は核局在化シグナル（ＮＬＳ）である。ＮＬＳ
は一般に、ＮＬＳが生じる完全なタンパク質を細胞核へ向かわせるように働く、
正電荷を有する（塩基性）短いドメインである。ＳＶ４０（サルのウイルス）ラ
ージＴ抗原（
【化３】 ）、Kalderon(1984), et al., Cell, 39:499-509;ヒトレチノイン酸受容体−β
核局在化シグナル (
【化４】 )；ＮＦｋＢ ｐ５０（
【化５】 ；Ghosh et al., Cell 62:1019(1990)；ＮＦｋＢｐ６５（
【化６】 ；Nolan et al., Cell 64:961(1991)；およびその他（例えば出典明示により本
明細書の一部とするBoulikas, J. Cell. Biochem. 55(1):32-58(1994)参照）な
どの単一塩基性ＮＬ、ならびにツメガエル（アフリカツメガエル）タンパク質の
ヌクレオプラスミン（
【化７】 ）、Dingwall, et al., Cell, 30:449-458 1982 and Dingwall et al., J. Cell
Biol., 107:841-849;1988）などの二塩基性ＮＬＳをはじめとする多数のＮＬＳ
アミノ酸配列が報告されている。多数の局在化研究では、合成ペプチドに組み込
まれたＮＬＳまたは通常は細胞核に向かわないリレポータータンパク質につぎ足
されたＮＬＳは、これらのペプチドおよびリポータータンパク質を核内に集中さ
せることが証明されている。例えば、Dingwall, and Laskey, Ann. Rev. Cell B
iol., 2:367-390, 1986; Bonnerot, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:
6795-6799, 1987; Galileo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:458-462
, 1990参照。
【００７２】 好ましい態様では、該標的化配列は膜固定シグナル配列である。多くの細胞内
事象が原形質で起こるということの他、多くの寄生虫および病原体が膜に結合す
るので、これは特に有用である。このように、膜結合ペプチドライブラリーは、
これらの過程における重要な要素の同定、ならびに有効な阻害剤の発見の双方に
有用である。本発明は、ランダムな発現産物を細胞外または細胞質空間で提示す
る方法を提供する。細胞外提示に関しては、ペプチド提示構造のカルボキシル末
端に膜固定領域が提供される。ランダムな発現産物領域は細胞表面で発現され、
細胞外空間に提示され、他の表面分子（それらの機能に影響する）または細胞外
媒体中に存在する分子と結合できるようになる。かかる分子の結合により、その
分子と結合するペプチドを発現する細胞に機能を付与できる。細胞質領域は、き
わだった特徴がなくてもよいし、または細胞外のランダムな発現産物領域が結合
する場合、細胞に機能（キナーゼ、ホスファターゼの活性化、機能を遂行するた
めの他の細胞成分との結合）を付与するドメインを包含することもできる。同様
に、ランダムな発現産物を含む領域は、細胞質領域に包含されることが可能で、
かつ、貫通膜領域および細胞外領域は不変のままであるか、または明らかな機能
を有する。
【００７３】 膜固定配列は、当技術分野で十分公知であり、哺乳類の貫通膜分子の遺伝的幾
何学に基づく。ペプチドは、シグナル配列（本明細書ではｓｓＴＭと表す）に基
づいて膜に挿入され、疎水性貫通膜ドメイン（本明細書ではＴＭ）を必要とする
。この貫通膜タンパク質は、貫通膜ドメインの５'側にコードされる領域は細胞
外に、３'部分をコードする領域は細胞内になるように膜に挿入する。もちろん
、これらの貫通膜ドメインが可変領域の５'側に置かれた場合には、それらは細
胞内ドメインとしてそれを固定する働きをするであろうし、これはいくつかの態
様においては望ましいものであり得る。ｓｓＴＭおよびＴＭは、多様な膜結合タ
ンパク質として公知であり、従ってこれらの配列は、特定のタンパク質由来の対
として、または各成分を異なるタンパク質から取って使用してもよく、あるいは
該配列は人工送達ドメインとして合成してもよいし、また全体が共通配列に由来
してもよい。
【００７４】 当業者には理解されるであろうが、ｓｓＴＭおよびＴＭ双方を含む膜固定配列
は多様なタンパク質について公知であり、これらのうちいずれを用いてもよい。
特に好ましい膜固定配列としては、限定されるものではないが、ＣＤ８、ＩＣＡ
Ｍ−２、ＩＬ−８Ｒ、ＣＤ４およびＬＦＡ−１が挙げられる。
【００７５】 有用な配列としては、1）ＩＬ−２受容体β鎖（残基１−２６はシグナル配列
、２４１−２６５は貫通膜残基；Hatakeyama et al., Science 244:551(1989) a
nd von Heijne et al., Eur. J. Biochem. 174:871(1988)参照）およびインスリ
ン受容体β鎖（残基１−２７はシグナル配列、９５７−９５９は貫通膜ドメイン
、および９６０−１３８２は細胞質ドメイン；Hatakeyama, supra, and Ebina e
t al., Cell 40:747(1983)参照）などのクラスＩ内在性膜タンパク質；２）中性
エンドペプチダーゼ（残基２９−５１は貫通膜ドメイン、２−２８は細胞質ドメ
イン；Malfroy et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 144:59(1987)参照）
などのクラスII内在性膜タンパク質；３）ヒトシトクロムＰ４５０ ＮＦ２５（H
atakeyama, supra）などのタイプIIIタンパク質；ならびに４）ヒトＰ−糖タン
パク質（Hatakeyama, supra）などのタイプIVタンパク質由来の配列が挙げられ
る。特に好ましいのはＣＤ８およびＩＣＡＭ−２である。例えば、ＣＤ８および
ＩＣＡＭ−２由来のシグナル配列は、転写物の最も５'末端に位置する。これら
は、ＣＤ−８の場合はアミノ酸１−３２（
【化８】 ；Nakauchi et al., PNAS USA 82:5126(1985)を、ＩＣＡＭ−２の場合にはアミ
ノ酸１−２１（
【化９】 ；Staunton et al., Nature(London) 339:61(1989)）からなる。これらのリーダ
ー配列は、構築体を膜へと送達する一方で、ランダムな候補領域の３'に位置す
る疎水性貫通膜ドメインは構築体を膜に固定させる。これらの貫通膜ドメインは
ＣＤ８由来のアミノ酸１４５−１９５（
【化１０】 ；Nakauchi, supra）およびＩＣＡＭ−２由来のアミノ酸２２４−２５６（
【化１１】 ；Staunton, supra）に包含される。
【００７６】 あるいは、膜固定配列はＧＰＩアンカーを含み、その結果として例えばＤＡＦ
【化１２】 、アンカー部位に太字のセリンを有する、Homans et al., Nature 333(6170):26
9-72(1968),およびMoran et al., J. Biol. Chem. 266:1250(1991)参照）におい
ては、グリコシル−ホスファチジルイノシトール結合を介して該分子と脂質二重
層の間の共有結合を形成する。これを達成するには、Ｔｈｙ−１由来のＧＰＩ配
列を貫通膜配列の代わりに可変領域の３'にカセットとして挿入できる。
【００７７】 同様に、ミリスチル化配列は膜固定配列として働き得る。ｃ−ｓｒｃのミリス
チル化によりそれが原形質膜に補充されることが知られている。該タンパク質の
最初の１４個のアミノ酸：
【化１３】 （Cross et al., Mol.Cell. Biol. 4(9):1834(1984); Spencer et al., Science
262:1019-1024(1993)参照、双方とも出典明示により本明細書の一部とする）が
単にこの機能のみを担うと仮定すると、これは膜局在化の単純かつ有効な方法で
ある。このモチーフはすでにリポーター遺伝子の局在化に有効であることが示さ
れており、ＴＣＲのゼータ鎖を固定するために使用できる。このモチーフは、該
構築体を原形質膜に局在化させるには可変領域の５'側に置かれる。パルミトイ
ル化のような他の修飾を用いて原形質膜に構築体を固定することもができる；例
えば、Ｇタンパク質結合受容体キナーゼＧＰＫ６配列（
【化１４】 ；太字のシステインがパルミトイル化されている；Stoffel et al., J. Biol. C
hem 269:27791(1994)）由来；ロドプシン（
【化１５】 ；Barnstable et al., J. Mol. Neurosci. 5(3):207(1994)）由来；およびｐ２
１ Ｈ−ｒａｓ１タンパク質（
【化１６】 ；Capon et al., Nature 302:33(1983)）のパルミトイル化配列がある。
【００７８】 好ましい態様では、該標的化配列は、例えばＬａｍｐ−２のようなリソソーム
分解配列（ＫＦＥＲＱ；Dice, Ann. N.Y. Acad. Sci. 674:58(1992)；またはＬ
ａｍｐ−１由来のリソソーム膜配列（
【化１７】 ；Uthayakumar et al., Cell. Mol. Biol. Res. 41:405(1995)）、またはＬａ
ｍｐ−２（
【化１８】 、Koneckl et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 205:1-5(1994)、双方ともイ
タリック体は貫通膜ドメイン、下線は細胞質標的シグナルを示す）をはじめとす
るリソソーム標的化配列である。
【００７９】 あるいは、該標的化配列は、ミトコンドリア・マトリックス配列（例えば、酵
母アルコールデヒドロゲナーゼIII；
【化１９】 ；Schalz, Eur. J. Biochem. 165:1-5(1987)）；ミトコンドリア膜内配列（酵母
シトクロムｃオキシダーゼサブユニットIV；
【化２０】 Schalz, supra）；ミトコンドリア膜間空間配列（酵母シトクロムｃ１；
【化２１】 ；Schalz, supra）またはミトコンドリア膜外配列（酵母７０ｋＤ膜外タンパク
質；
【化２２】
【００８０】 該標的配列はまた、カルレチクリン由来配列（ＫＤＥＬ；Pelham, Royal Soci
etyLondon Transactions B; 1-10(1992)）またはアデノウイルスＥ３／１９Ｋタ
ンパク質由来の配列（
【化２３】 ；Jackson et al., EMBO J. 9:3153(1990)をはじめとする小胞体配列であっても
よい。
【００８１】 さらに標的配列はまた、ペルオキシソーム配列（例えば、ルシフェラーゼ由来
のペルオキシソームマトリックス配列；ＳＫＬ；Ketler et al., PNAS USA 4:32
64(1987)）；ファルネシル化配列（例えば、Ｐ２１ Ｈ-ｒａｓ１；
【化２４】 太字のシステインがファルネシル化されている；Capon, supra）；ゲラニルゲラ
ニル化配列（例えば、タンパク質ｒａｂ−５Ａ；
【化２５】 太字のシステインがゲラニルゲラニル化されている；Farnsworth, PNAS USA 91:
11963(1994)）；または分解配列（サイクリンＢ１；
【化２６】 ；Klotzbucher et al., EMBO J. 1:3053(1996)）を含む。
【００８２】 好ましい態様では、該標的化配列は候補翻訳産物の分泌に作用できる分泌シグ
ナル配列である。可変ペプチド領域の５'側に置かれた公知の分泌シグナル配列
は多数あり、ペプチド領域から切断されて細胞外空間への分泌を果たす。分泌シ
グナル配列とそれらの関連のないタンパク質への転移能力は十分公知である。例
えば、Sllhavy, et al., (1985) Microbiol. Rev. 49, 398-418。これは、宿主
細胞以外の、例えば該ペプチドを発現する細胞のような標的細胞の表面に結合で
きる、またはその生理学に作用できるペプチドを作製するのに特に有用である。
好ましい試みにおいて、融合産物は一連の分泌シグナルペプチド−提示構造−ラ
ンダムな発現産物領域−提示構造を含むように配置する。この方法において、ペ
プチドライブラリーを発現した細胞の近傍で増殖した標的細胞は、分泌したペプ
チドに浸される。標的細胞はペプチドの存在に応答して、例えばペプチドが表面
受容体に結合するか、または取り込まれて細胞内の標的に結合することにより生
理学的変化を示し、種々の分泌スキームのいずれかによって分泌細胞が局在化し
、該ペプチドが所定の作用を引き起こす。作用の例としては、デザイナーサイト
カイン（すなわち、造血幹細胞を分裂させ、それらの全能性を維持できる幹細胞
因子）、癌細胞を自発的アポトーシスに導く因子、標的細胞の細胞表面に結合し
てそれらを特異的に標識する因子など様々なものが挙げられる。
【００８３】 ＩＬ−２（
【化２７】 ；Villinger et al., J. Immunol. 155:3948(1995)）、成長ホルモン（
【化２８】 ；Roskam et al., Nucleic Acids Res. 7:30(1979)）；プレプロインスリン（
【化２９】 ；Bell et al., Nature 284:26(1980)）およびインフルエンザＨＡタンパク質（
【化３０】 ；Sekiwawa et al., PNAS 80:3563）)由来のシグナルをはじめとする好適な分泌
配列が知られている。なおここで、非下線部と下線部の接点が切断される。特に
好ましい分泌シグナル配列は、分泌型サイトカインＩＬ−４由来のシグナルリー
ダー配列であり、これは以下に示すＩＬ−４の最初の２４個のアミノ酸を含む：
【化３１】
【００８４】 好ましい態様では、該融合パートナーはレスキュー配列である。レスキュー配
列は、候補薬物またはそれをコードする核酸のいずれかを精製または単離するた
めに使用できる配列である。このようにペプチドレスキュー配列としては、例え
ば、Ｎｉ親和性カラムと併用するＨｉｓ6タグ、および検出、免疫沈降またはＦ
ＡＣＳ（蛍光活性化細胞分別）のためのエピトープ標識などの精製配列が挙げら
れる。好適なエピトープタグとしては、ｍｙｃ（市販の９Ｅ１０抗体と併用）、
細菌酵素ＢｉｒＡのＢＳＰビオチン化標的配列、ｆｌｕタグ、ｌａｃＺおよびＧ
ＳＴが挙げられる。
【００８５】 あるいは、レスキュー配列は、ＰＣＲ、関連技術またはハイブリダイゼーショ
ンによるレトロウイルス構築体の迅速かつ容易な単離を可能にするプローブ標的
部位として働く特異なオリゴヌクレオチド配列であってもよい。
【００８６】 好ましい態様では、該融合するパートナーは、候補バイオ活性物生またはそれ
をコードする核酸に安定性を付与する安定配列である。このように、例えば、Va
rahavskyのＮ−Ｅｎｄ則に従い、ペプチドのユビキチン化を保護するため、開始
メチオニン（ＭＧまたはＭＧＧ０）の後にグリシンを組み込むことによりペプチ
ドは安定化され、このようにして細胞質中での長い半減期が付与され得る。同様
に、Ｃ末端の２個のプロリンは、ペプチドにカルボキシペプチダ−ゼの作用に対
する強い耐性を付与する。プロリンの前に２個のグリシンが存在すると、可変性
が付与されるとともに、２個のプロリンで一連の事象が起こる構造候補ペプチド
構造へ伝わるのを防げる。このような好ましい安定配列を以下に示す：ＭＧ(Ｘ) n ＧＧＰＰ、ここでＸはいずれかのアミノ酸であり、ｎは少なくとも４の整数で
ある。
【００８７】 １つの態様では、該融合パートナーは二量化配列である。二量化配列により、
通常の生理学的条件下で結合を維持するに十分な親和性で、あるランダムなペプ
チドと別のランダムなペプチドとの非共有結合が可能となる。このことにより、
細胞あたり２個のペプチドが生じ、次いで二量化して１０8（１０4×１０4）の
有効なライブラリーが形成されるとすると、ランダムペプチドの小さなライブラ
リー（例えば、１０4）が効果的に大きなライブラリーとなる。それはまた、要
すればより長いランダムペプチドの形成も可能にし、あるいはより構造的に複雑
なランダムペプチド分子の形成も可能にする。この二量体は、ホモ二量体であっ
てもヘテロ二量体であってもよい。
【００８８】 二量化の配列は、自己凝集する単一の配列、または２つの配列であってもよく
、各配列は異なるレトロウイルス構築体内で生成する。すなわち、二量化配列１
を持つ第一のランダムペプチドおよび二量化配列２をもつ第二のランダムペプチ
ド双方をコードする核酸は、細胞への導入と該核酸の発現に基づき、二量化配列
１が二量化配列２と会合して新らしいランダムペプチド構造を形成するようにし
たものである。
【００８９】 適切な二量化配列は広範な配列を包含する。相当数のタンパク質−タンパク質
相互作用部位が知られている。さらに、二量化配列はまた酵母の２ハイブリッド
システム、伝統的な生化学的親和性結合研究法などの標準的方法、あるいは本発
明方法を用いても解明することができる。米国特許第09/285,912を参照。このす
べてを出典明示により本明細書の一部とする。
【００９０】 加えて、該ペプチドは融合タンパク質の一部として作成され得る。PCT US99/2
3715参照。これを出典明示により本明細書の一部とする。
【００９１】 融合パートナーは生物学と活性が許す限り、構造中のいずれの部分（すなわち
、Ｎ−末端、Ｃ−末端、内部）にあってもよい。
【００９２】 好ましい態様において、融合パートナーは、ＰＣＴ ＵＳ９７／０１０１９に
一般的に記載されているように、リンカーまたはつなぎ鎖配列を包含して、妨害
されていない潜在的標的と候補薬物が相互作用するのを可能とする。例えば、候
補バイオ活性物生がペプチドである場合、有用なリンカーはグリシン−セリン・
ポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎおよび（ＧＧＧＳ）ｎを包含
し、ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン−アラニン・ポリマー、アラニ
ン−セリン・ポリマー、およびシェーカー型カリウムチャンネルのつなぎ鎖など
の他の柔軟性リンカー、さらに当業者が認める多様な他の柔軟性リンカーを包含
する。グリシン−セリン・ポリマーは、このアミノ酸の両方が比較的非構造的で
あり、それ故に成分間の中性的つなぎ鎖として働くことができるので、好適であ
る。第二に、セリンは親水性であり、したがって、球状のグリシン鎖であり得る
ものを可溶化することが可能である。第三に、同様の鎖は、例えば、一本鎖抗体
などの組換えタンパク質のサブユニットを連接するのに有効であることが示され
ている。
【００９３】 さらに、提示構造を含む融合パートナーは、修飾、ランダム化、および／また
は成熟化してランダム化発現産物の提示方向を変えることもできる。例えば、ル
ープ塩基の決定因子を修飾し、ランダム化アミノ酸配列を保持した内部ループペ
プチドの三級構造を僅かに修飾することが可能である。
【００９４】 好ましい態様においては、融合パートナーを合わせて用いる。このように、例
えば、提示構造、標的配列、レスキュー配列および安定配列の多様な合わせをリ
ンカー配列の存在下または不存在下に使用することができる。
【００９５】 このように、候補薬物はこれらの成分を含むことが可能であり、したがって、
各断片が異なるペプチドをコードし得る異なるランダムヌクレオチド配列を含む
断片ライブラリーの生成に使用することができる。連結反応産物は次いで大腸菌
などのバクテリアに形質転換し、一般手法として概括されている（Kitamura, PN
AS USA 92: 9146-9150 (1996); 出典明示により本明細書の一部とする）ように
、得られるライブラリーからＤＮＡを調製する。
【００９６】 レトロウイルスパッケージシステムにライブラリーＤＮＡを導入すると、感染
性ウイルスに転換する。適切なレトロウイルスパッケージシステムは、これらに
限定されるものではないが、ビング（Bing）およびＢＯＳＣ２３細胞株（ＷＯ９
４／１９４７８；Soneoka et al., Nucleic Acid Res. 23 (4): 628 (1995); Fi
ner et al., Blood 83: 43 (1994)に記載）、フェオニックス（Pheonix）パッケ
ージ株、例えば、ＰｈｉＮＸ−ｅｃｏおよびＰｈｉＮＸ−ａｍｐｈｏ（下記）、
２９２Ｔ＋ｇａｇ−ｐｏｌおよびレトロウイルスエンベロープ、ＰＡ３１７、お
よび細胞株（Markowitz et al., Virology 167: 400 (1988), Markowitz et al.
, J. Virol. 62: 1120 (1988); Li et al., PNAS USA 93: 11658 (1996); Kinse
lla et al., Human Gene Therapy 7: 1405 (1996)に概説）を包含する（これら
の文献すべてを出典明示により本明細書の一部とする）。好ましいシステムはＰ
ＣＴ／ＵＳ９７／０１０１９に開示されたＰｈｉＮＸ−ｅｃｏおよびＰｈｉＮＸ
−ａｍｐｈｏまたは類似の細胞株である。
【００９７】 細胞が複製しない場合は、他のウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベ
クター、ネコ免疫ウイルス（ＦＩＶ）ベクターなどを使用してもよい。
【００９８】 好ましい態様において、候補薬物をウイルスベクターにより細胞に導入する場
合には、候補ペプチド薬剤を検出可能な分子に連結するが、本発明方法は少なく
とも１つの発現アッセイ法を包含する。発現アッセイ法は、候補バイオ活性物生
が発現されたかどうか、すなわち、候補ペプチド物生が細胞内に存在するかどう
かの決定を可能とするアッセイ法である。このように、標識などの検出可能な分
子の発現に候補薬物の発現を連結することにより、候補ペプチド物生の存在また
は不存在を決定し得る。したがって、この態様において、候補薬物は検出可能な
分子に操作可能に連結される。一般に、これは融合核酸を創製することにより実
施される。融合核酸は候補バイオ活性物生（上に概説したように融合パートナー
を含んでもよい）をコードする第一核酸と検出可能な分子をコードする第二核酸
を含んでなる。「第一」および「第二」という用語は、融合核酸の５’−３’方
向に関して配列の方向を付与することを意味するものではない。例えば、融合配
列の５’−３’方向を仮定すると、第二核酸に対し５’、または第二核酸に対し
３’に位置してもよい。本態様において好ましい検出可能な分子は、これらに限
定されるものではないが、蛍光タンパク質、例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰお
よびＲＦＰなどを包含し、取分け前者が好ましい。
【００９９】 候補核酸を細胞中に導入し、多薬剤耐性を除去する能力のあるバイオ活性物質
についてスクリーニングする。本明細書中の"〜中に導入する"または文法上の均
等語は、続いての核酸の発現に適切な方法で、核酸が細胞中に入ることを意味す
る。この導入方法は、下記のように標的化細胞型に大きく影響される。例示的な
方法に、ＣａＰＯ4沈澱法、リポソーム融合、リポフェクチョン(登録商標)、エ
レクトロポレーション、ウイルス感染などが含まれる。候補核酸を宿主細胞のゲ
ノム中に安定に組み込むことができ(例えば、下記のレトロウイスル導入で)、ま
た候補核酸は細胞質中に一時的にまたは安定して存在し得る(すなわち、在来の
プラスミドの使用、標準的な制御配列の利用、マーカー選択などを介して)。医
薬的に重要なスクリーンの多くはヒトまたはモデル哺乳動物の細胞標的を必要と
するので、このような標的をトランスフェクトすることができるレトロウイルス
ベクターが好ましい。
【０１００】 好ましい実施態様では、候補核酸は細胞に感染するレトロウイルス粒子の１部
である。一般的に、細胞の感染は感染増強試薬ポリブレン(標的細胞に対するウ
イルス性結合を促進するポリカチオンである)の適用に対して直接的である。感
染を、細胞数に対するウイルス粒子の割合を使用して、各細胞が一般的に単一の
構成を発現するように至適化することができる。感染はポアソン分布に従う。
【０１０１】 あるいは、核酸以外またはそれらによってコードされるペプチドの候補物質を
使用する場合、当業者には理解され得るであろうが、任意の方法で候補物質を細
胞に加えることができる。
【０１０２】 この候補物質を細胞に加える。当業者には理解され得るであろうが、本発明で
使用する細胞の型は広範に変えることができる。基本的に、任意の哺乳動物細胞
を使用することができるが、マウス、ラット、霊長類およびヒト細胞が特に好ま
しく、当業者には理解され得るであろうが、シュードタイプ化による系の変更で
全ての真核細胞(好ましくは高等真核生物)を使うことができる。
【０１０３】 従って、適切な細胞型は、限定するものではないが以下を含む：腫瘍細胞の全
ての型(特に黒色腫、髄球性白血病、肺、乳房、卵巣、大腸、腎臓、前立腺、膵
臓および精巣の癌)、心筋細胞、内皮性細胞、上皮細胞、リンパ球(T-細胞および
B細胞)、マスト細胞、好酸球、血管脈管内膜細胞、肝細胞、単核白血球を含む白
血球、血液(haemopoetic)、神経、皮膚、肺、腎臓、肝臓およびミオサイト幹細
胞などの幹細胞(分化および非分化ファクターに対するスクリーニングの使用)、
破骨細胞、軟骨細胞および他の結合組織細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、
肝臓細胞、腎臓細胞、および含脂肪細胞。適切な細胞には、限定するものではな
いが、Jurkat T細胞s、NIH3T3細胞、CHO、Cos、H1299、MDMB435S、A549、HeLa、
など、知られた研究細胞も含まれる。ATCC細胞株カタログ参照、出典明示により
本明細書の一部とする。 ある実施態様では、この細胞を遺伝学的に操作する、つまり外因性核酸を含有
させたり、例えば標的分子を含有させたりすることができる。
【０１０４】 好ましい実施態様では、細胞の集合体(多数の細胞)をスクリーンする。つまり
、候補核酸を導入した細胞を、本明細書中で略記したようにスクリーンする。本
明細書中の"細胞の集合体(plurality of cells)"とは、おおよそ、約103ないし1
08または109の細胞を意味し、106ないし108の細胞が好ましい。この細胞の集合
体は細胞ライブラリーを含み、通常、ライブラリー中の各細胞はレトロウイルス
分子ライブラリーのメンバー、すなわち異なる候補核酸を含有するが、当業者に
は理解され得るであろうように、ライブラリー中のある細胞群はレトロウイルス
を含有しないこともあり、また、ある細胞群は１以上含有するであろう。あるい
は、非レトロウイルス候補物質を使用する場合は、各細胞は同一であり、そして
異なる細胞を異なる候補物質に曝される。レトロウイルス感染以外の方法を使用
して候補核酸を細胞の集合体中に導入する場合、一般にエレクトロポレーション
などの間に細胞に入る核酸の数を制御することが困難であるので、細胞ライブラ
リーの個々の細胞メンバー内の候補核酸の分布を広範に変えてもよい。
【０１０５】 好ましい実施態様では、候補核酸を細胞の集合体に導入し、そして候補バイオ
活性物生の防護効果を、下記のように、未処置のHeLa細胞中で再試験する。
【０１０６】 必要であれば、細胞を、候補核酸の発現に適切な条件で処置し(例えば誘導プ
ロモーターを使用する場合)、翻訳または転写生成物のいずれかの候補発現生成
物を調製する。
【０１０７】 本明細書中で略記したように、使用できる２つの基本型のスクリーンが存在す
る。好ましい実施態様では、候補物質のライブラリーを使用して、多種薬剤表現
型をもたらす化合物に対してスクリーンする；つまり、例えば、MDR表現型を与
えるペプチドを使用して、MDR経路内で標的分子を同定する。本明細書中に略記
したXAPC7およびZetaの同定のように、一旦これらを同定し、そして、RGP8.5ペ
プチドによる阻害(本明細書中でも同定)が多薬剤耐性を与える場合、XAPC7およ
び/またはZeta分子を、それらに結合し活性を調節する候補薬剤についてのスク
リーンに使用することができる。
【０１０８】 一般的に、この候補物質を、薬剤標的相互作用に有利な反応条件で、細胞に(
既に略述したように、細胞外または細胞間に)加える。一般的に、これは生理学
的条件であろう。インキュベーションを、最適の活性を促進する任意の温度、一
般には4から40℃、で行なうことができる。インキュベーションの時間を至適の
活性から選択することができるが、最適化して迅速な高速大量処理スクリーニン
グも促進する。一般には0.1から1時間の間で十分であろう。過剰な試薬は、通常
は取り除くか、または洗い流す。
【０１０９】 他の種々の試薬をアッセイに含めることができる。これらに、最適のタンパク
質-タンパク質結合の促進におよび/または非特異的またはバックグラウンド相互
作用の低減に使用することができる、塩、中性タンパク質(例えばアルブミン、
洗浄剤など)などの試薬を含めることができる。また、別の方法でアッセイの有
効性を改善する試薬(プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、
抗菌性薬剤など)を使用することができる。検出を提供する目的で、成分の混合
物を加えることができる。細胞の洗浄またはすすぎを、異なる時間に、当業者に
理解され得るように行ない、ここで濾過および濃縮の使用を含めることができる
。第２の標識部分(本明細書中で"第２次標識"とも指す)を使用する場合、非特異
的結合を低減するために、過剰の結合していない標的分子を取り除いた後に加え
るのが好ましい；しかしながら、ある事情下では、全ての成分を同時に加えるこ
とができる。
【０１１０】 従って、好ましい実施態様では、本発明は、多薬剤耐性を与えるまたは改良す
ることができる候補物質のスクリーンを提供する。本明細書中の"多薬剤耐性"ま
たは他の文法上の均等語は、複数の化学療法化合物に対する、同時に起こる感受
性の喪失を意味する。MDRを獲得する細胞を表現型の変化で検出することができ
る。適切な表現型の変化は、限定するものではないが以下を含む：細胞形態、細
胞増殖、細胞生存度、基質または他の細胞に対する付着、および細胞密度の変化
などの全体の物理的変化；１またはそれ以上のRNA、タンパク質、脂質、ホルモ
ン、サイトカイン、または他の分子の発現における変化；または１またはそれ以
上のRNA、タンパク質、脂質、ホルモン、サイトカイン、または他の分子の均衡
状態(すなわち半減期)における変化；１またはそれ以上のRNA、タンパク質、脂
質、ホルモン、サイトカイン、または他の分子の局在化における変化；１または
それ以上のRNA、タンパク質、脂質、ホルモン、サイトカイン、レセプター、ま
たは他の分子のバイオ活性または特異的活性における変化；イオン、サイトカイ
ン、ホルモン、成長因子、または他の分子の分泌における変化；細胞の膜電位、
分極、整合性または輸送の変性；ウイルスおよび細菌性病原体の、感染性、感受
性、潜伏性、接着性、および取り込みにおける変化；など。
【０１１１】 本明細書中の"MDR表現型を与えることができる"は、バイオ活性物生が細胞の
感受性を変化させること(細胞が化学療法化合物の処置で残存するなど)を意味す
る。
【０１１２】 以下に詳記する様に、MDR表現型を広範な方法で検出することができる。一般
的に、MDR表現型を、例えば：細胞形態の顕微分析；標準細胞生死判別アッセイ
、特定の細胞または分子の存在またはレベルについての蛍光指示薬アッセイなど
の標準標識化アッセイ(FACSまたは他の染料染色技術を含む)；細胞を殺した後の
標的化合物の発現の生化学検出など、を使用して検出する。
【０１１３】 好ましい実施態様では、ランダム化した核酸を導入して、MDR表現型を細胞中
で検出する。MDR表現型は、細胞を致死量の化学療法化合物で処置し、そして生
存しているクローンを単離して検出される。本明細書中の"致死量"は、99.99%の
細胞を殺傷するのに十分な化学療法化合物の濃度を意味する。
【０１１４】 本明細書中の"処置した"は、細胞を、化学療法化合物と、MDR表現型を検出す
るのに十分な時間インキュベートすることを意味する。化学療法化合物の濃度を
、薬剤の本質に基づいて変えることができるが、1nmから100μMの範囲で変える
ことができる。本発明の方法に有用な化学療法化合物には、タキソール、エトポ
シド、シスプラチン、アドリアマイシン、ミトキサントロン、カンプトセシン、
ビンクリスチンなどが含まれる。Merck Indexの11版に略述されている任意の抗
腫瘍性薬剤(アルキル化薬剤および抗生物質を含む)も参照、参照して本明細書に
導入した。
【０１１５】 好ましい実施態様では、タキソールを使用する。一般的に、タキソールの使用
濃度は1nmから100μMの範囲である。好ましい実施態様では、細胞を100-200nMの
タキソールで48から72時間処置する。特に好ましい実施態様では、細胞を200nM
タキソールで、48時間処置する。 細胞の"MDR表現型"は、バイオ活性物生の存在を示す。
【０１１６】 好ましい実施態様では、一旦、MDR表現型を有する細胞を検出し、その細胞をM
DR表現型を有しない多数から単離する。これは、当業者に知られているように、
任意の方法で行なうことができ、 そしてある場合にはそのアッセイまたはスク
リーンによって決まる。適切な単離技術には、限定するものではないが、FACS、
補体を使用する溶菌の選択、細胞クローニング、蛍光定量によるスキャニング、
"生存"タンパク質の発現、細胞表面タンパク質のまたは蛍光のまたはタグを与え
ることができる他の分子の誘発性発現；非蛍光分子から蛍光分子へ変化する酵素
の発現；成長しないまたはゆっくりした成長のバックグラウンドに対する異常成
長；細胞死およびDNAまたは他の細胞活力指示染料の単離などが含まれる。
【０１１７】 好ましい実施態様では、生存しているクローンを単離し、そして同濃度の化学
療法化合物と再処置して、非遺伝性、確率論的、または一時的抵抗性による増殖
のクローンを除去する。
【０１１８】 好ましい実施態様では、候補核酸および/またはバイオ活性物生を陽性細胞か
ら単離する。これは種々の方法で行なうことができる。好ましい実施態様では、
レトロウイルス構成に、またはレスキュー配列などのライブラリーの特異的成分
に共通するDNA領域に相補的なプライマーを、"レスキュー"、特異なランダム配
列、に使用する。あるいは、バイオ活性物生を、レスキュー配列を使用して単離
する。従って、例えば、エピトープタグまたは精製配列を含むレスキュー配列を
使用し、免疫沈殿法またはアフィニティーカラムを使用してバイオ活性物生を取
り出す。ある場合は、以下に略述するように、バイオ活性物生と標的分子の十分
に強力な結合相互作用があれば、第１次標的分子を取り出すことができる。ある
いは、質量分析を使用してペプチドを検出することができる。
【０１１９】 バイオ活性物生および/またはバイオ活性核酸の配列を、一旦レスキューして
測定する。この情報を種々の方法で使用することができる。
【０１２０】 好ましい実施態様では、バイオ活性物生を再合成し、標的細胞中に再導入し、
効果を検証する。これは、レトロウイルスを使用して、あるいはHIV-1 Tat タン
パク質との融合、ならびに類似および関連タンパク質を使用して行なうことがで
き、標的細胞中に非常に高度にとり込ませることができる。例えば、Fawell et
al., PNAS USA 91:664 (1994)；Frankel et al., Cell 55:1189 (1988)；Savion
et al., J. Biol. Chem. 256:1149 (1981)；Derossi et al., J. Biol. Chem.
269:10444 (1994)；および Baldin et al., EMBO J. 9:1511 (1990)参照、これ
らすべては出典明示により本明細書に組込まれている。
【０１２１】 好ましい実施態様では、未処置のHeLa細胞中のクローン原性生存アッセイを使
用する。多薬剤耐性を与えるバイオ活性物生を再合成および再導入して、初期選
択工程で使用する、高濃度の化学療法化合物で成長できる構成についてスクリー
ニングする。これらの薬剤を、以下に記すさらなる研究で選択することができる
。
【０１２２】 従って、本発明の方法は、MDRを与えるまたは寛解させることができるバイオ
活性物生の同定および単離を含む。MDRを与えることができるバイオ活性物生を
、本明細書中で、上記定義のように、"抵抗性を与える"(RC)薬剤と定義する。MD
Rを寛解させることができるバイオ活性物生を、本明細書中で、下記定義のよう
に、"感作性"薬剤と定義する。
【０１２３】 ある実施態様では、RC薬剤は、PRPタンパク質と相互作用または調節し、化学
療法化合物の存在下でMDR表現型を与えるペプチドである。好ましい実施態様で
は、RCペプチドは、配列番号:１に示すアミノ酸配列を含む。
【０１２４】 他の実施態様では、バイオ活性物生は、配列配列番号:１に示す配列と少なく
とも90%同一であるRCペプチドである。
【０１２５】 幾つかの実施態様では、RCペプチドをコードし、そして好ましくはRC核酸によ
って発現される(例えば図７Ｂ参照)。
【０１２６】 好ましい実施態様では、バイオ活性物生の配列を使用して、さらなる候補バイ
オ活性物生を調製する。例えば、バイオ活性物生の配列は、(バイアス)ランダム
化の第２のラウンドの骨幹であり得、増幅されたまたは変化した活性を有するバ
イオ活性物生に発展させることができる。あるいは、第２のラウンドのランダム
化でバイオ活性物生のアフィニティーを変えることができる。さらに、望ましく
は、同定したバイオ活性物生のランダム領域を他の提示構造中へ入れることがで
き、または提示構造の定常領域の配列を変えて、バイオ活性物生の構造/形態を
変えることができる。望ましくは、ポテンシャル結合部位の周りの"ウオーク"は
、結合ポケットの変異生成と同様の方法で、リガンド領域の一方を定常に保ち、
そしてもう一方をランダム化して、ペプチド周辺の結合を移す。
【０１２７】 好ましい実施態様では、バイオ活性物生またはそれをコードするバイオ活性核
酸のいずれかを使用して、標的分子、すなわちバイオ活性物生と相互作用する分
子を同定する。当業者には理解され得るであろうが、第１次標的分子(バイオ活
性物生が結合するか、または直接的に作用する)があり、そして第２次標的分子(
バイオ活性物生によって影響されるシグナル経路の１部である)がある；これら
は"有効標的"とも指される。
【０１２８】 好ましい実施態様では、バイオ活性物生を使用して、標的分子(本明細書中のX
APC7およびZeta分子など)を取り出す。例えば、本明細書中で略記したように、
標的分子がタンパク質であれば、エピトープタグまたは精製配列を使用し、生化
学方法を介して第１次標的分子を精製することができる(共免疫沈殿法、アフィ
ニティー カラムなど)。あるいは、ペプチドは、細菌中で発現し精製される場合
は、標的細胞型のmRNAから作られた細菌性cDNA発現ライブラリーに対するプロー
ブとして使用することができる。または、酵母または哺乳動物２または３ハイブ
リッドシステムのいずれかで、ペプチドを"餌"として使用することができる。こ
のような相互作用クローニングアプローチは、DNA-結合タンパク質および他の相
互作用タンパク質成分を単離するのに非常に有用である。ペプチド(類)を他の薬
理活性化剤と組合せて、該当するシグナル形質導入経路の上位性関係を研究する
こともできる。標識化したペプチドバイオ活性物生を合成して調製し、そしてこ
れを使用して、バクテリオファージ中で発現するcDNAライブラリーを、ペプチド
と結合するcDNAについてスクリーンすることができる。さらに、これを、レトロ
ウイルスライブラリーを介するcDNAクローニングに使用して、ペプチドによって
誘発される効果を"補足する"こともできる。このようなストラテジーで、ペプチ
ドは、化学量論滴定に、特定のシグナル経路に対する重要なファクターとして必
要とされる。この分子または活性がcDNAの過剰発現によってcDNAライブラリー内
から補充される場合は、標的をクローンすることができる。同様に、任意の上記
の酵母またはバクテリオファージシステムによってクローンされるcDNAを、本方
法で哺乳動物細胞に再導入し、作用してペプチドが作用するシステムで機能を補
足することを確認することができる。
【０１２９】 一旦第１次標的分子を同定すれば、第２次標的分子も、第１次標的を"餌"とし
て使用して、同じ方法で同定することができる。この方法で、シグナル経路を解
明することができる。同様に、第２次標的分子に特異的なバイオ活性物生を検出
し、多くのバイオ活性物生を、例えば組合せ治療として単一の経路上で作用させ
ることができる。
【０１３０】 好ましい実施態様では、第１スクリーンで同定したPRPタンパク質(XPCA7など)
を、第２次スクリーンの候補物質として使用し、PRPタンパク質の活性を調節す
る薬剤化合物を、MDRの処置方法を使用して同定する。本実施態様では、PRP標的
分子を結合およびバイオ活性スクリーンで使用する。本明細書中の"標的分子"は
、細胞に化学療法化合物を与えるPRPタンパク質および核酸を意味する。好まし
い実施態様では、PRPタンパク質は、プロテアソームアルファ型サブユニットXAP
C7およびプロテアソームアルファ型サブユニットZetaである。
【０１３１】 本発明のPRPタンパク質を、幾つかの方法で同定することができる。この意味
で、"タンパク質"は、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを含む。PRP
核酸またはタンパク質を、図８に示す配列に対する、実質的な核酸および/また
はアミノ酸配列相同性で、最初に同定する。このような同一性は全体的な核酸ま
たはアミノ酸配列に基づき得る。
【０１３２】 本明細書中で使用したように、タンパク質配列の図８Ｂおよび８Ｄに示すアミノ
酸配列に対する全体の同一性が、好ましくは約50%を超える、さらに好ましくは
約60%を超える、より好ましくは約75%を超え、最も好ましくは80%を超える場合
は、タンパク質は"PRPタンパク質"である。幾つかの実施態様で、相同性は約90
から95%、または98%までに高い。
【０１３３】 この文脈における相同性は配列の類似性もしくは同一性を意味し、同一性が好
ましい。相同性は、Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12:387-395 (1984)に述
べられたBest Fit配列プログラムを、好ましくはデフォルトの設定を用いて、ま
たはBLASTXプログラム(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410)により
、測定される。このアラインメントには、アラインしようとする配列中にギャッ
プを導入することを含み得る。加えて、図８Ｂおよび８Ｄに示されるタンパク質
よりも多い、または少ないアミノ酸を有する配列については、相同性の割合は、
アミノ酸総数との関係において相同なアミノ酸の数に基づいて測定されることが
理解される。ゆえに、例えば、図８Ｂおよび８Ｄの配列より短い配列の相同性は
、後述するように、短い配列のアミノ酸の数を用いて測定する。
【０１３４】 類似性は技術上周知の標準的技法を用いて測定することができ、それらは、Sm
ith & Waterman, Adv. Appl. Math., 2: 482 (1981)のアルゴリズム、Needleman
& Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443 (1970)のアルゴリズム、Pearson & Lipman
, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: 2444 (1988)の類似性検索法、これらの
アルゴリズムのコンピュータによる実行(Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Genetics Computer Group, 575 Scien
ce Drive, Madison, WI、中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦ
ＡＳＴＡ)、またはDevereux et al., Nucl. Acid Res., 12: 387-395 (1984)に
記載のＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラム、を非限定的に含む。
【０１３５】 好ましい実施態様では、、ＦｓｔＤＢにより以下のパラメータに基づいてパー
セント同一性または類似性を計算する：ミスマッチペナルティー１．０；ギャッ
プペナルティー１．０；ギャップサイズペナルティー０.３３；連結ペナルティ
ー３０．０。(「Current Methods in Comparison and Analysis」 Macromolecul
e Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-14
9 (1988), Alan R. Liss, Inc.)
【０１３６】 有用なアルゴリズムのもう一つの例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、
漸進的対アラインメントを用いて関連配列からのグループから多重配列アライン
メントを創成する。それはまた、アラインメント創成に使用される、クラスタリ
ングの関係を示すツリーを描くことができる。ＰＩＬＥＵＰは、Feng & Doolitt
le, J. Mol. Evol. 35: 351-360 (1987)の漸進的アラインメント法の簡略化した
ものを用いる；この方法はHiggins & Sharp CABIOS 5: 151-153 (1989)記載の方
法と類似している。有用なＰＩＬＥＵＰアラインメントはデフォルトギャップウ
ェイト３.００、デフォルトギャップ長ウェイト０.１０、および重みつきエンド
ギャップを含む。
【０１３７】 有用なアルゴリズムの別の例は、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-
410, (1990); and Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5873-5
787 (1993)に記載のＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプロ
グラムは、Altschul et al., Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996); h
ttp://blast.wustl/edu/blast/ README.html]から得られるＷＵ−ＢＬＡＳＴ−
２である。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２はいくつかの検索パラメータを使用するがその
殆どはデフォルト値に設定されている。調整可能なパラメータは以下の値で設定
する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０.１２５、
ワード域値(Ｔ)＝１１である。ＨＳＰ ＳおよびＨＳＰ Ｓ２パラメータは動的
数値であり、特定の配列の組成および興味の対象である配列を検索する特定のデ
ータベースに依存してプログラム自身により決定されるが、値は感度を上げるよ
うに調整することができる。
【０１３８】 別の実施態様では、アミノ酸配列同一性パーセントが測定される。同一性パー
セントの計算では、相対的な重量は、挿入、欠損、置換などのような様々な配列
変化の顕れに起因するものとされない。同一性のみがプラスのスコアを与えられ
(＋1)、あらゆる形の配列変化に「０」の値が与えられる。これにより配列類似
性計算について上述したような重みをつけた目盛りまたはパラメーターの必要性
がなくなる。それゆえに、同一性パーセントは、非常に厳密な配列比較の方法を
示す。
【０１３９】 配列同一性パーセントは、例えば、適合する同一残基数を、アラインメントを
行った領域中の「より短い」配列の総残基数で割り、１００倍することにより計
算することができる。「より長い」配列はアラインメントを行った領域中に実際
の残基を最も多く有する配列である。
【０１４０】 本発明のＰＲＰタンパク質は図８Ｂおよび８Ｄに示されるアミノ酸配列より短
くても長くてもよい。ゆえに、好ましい実施態様では、図８Ｂおよび８Ｄに示さ
れる配列の一部分もしくは断片はＭＤＲタンパク質の定義に含まれる。例えば、
ＭＤＲの欠損変異体を作成し得る。
【０１４１】 好ましい実施態様では、このＰＲＰタンパク質は、誘導型または変異型のＰＲ
Ｐタンパク質である。つまり、より詳しく後で概説するように、誘導型ＰＲＰペ
プチドは、特に好ましいアミノ酸置換とともに、少なくとも一つのアミノ酸置換
、欠損または挿入を含む。アミノ酸置換、挿入または欠損は、ＰＲＰペプチド中
の任意の残基で起こり得る。
【０１４２】 さらに、より詳しく後で概説するように、例えばエピトープまたは精製用タグ
の付加、他の融合配列などの付加により、図８Ｂおよび８Ｄに示されるものより
も長いＰＲＰタンパク質を作成し得る。
【０１４３】 ＰＲＰタンパク質はまた、ＰＲＰ核酸にコードされているものとしても同定さ
れ得る。ゆえに、本明細書で概説するように、ＰＲＰタンパク質は、図８Ａおよ
び８Ｃに示された配列またはその相補鎖とハイブリダイゼーションする核酸によ
ってコードされる。
【０１４４】 好ましい実施態様では、抗体を作成するためにＰＲＰタンパク質を用いようと
するとき、ＰＲＰタンパク質は、図８Ｂおよび８Ｄに示されたそれぞれの完全長
タンパク質と、少なくとも一つのエピトープまたは決定因子を共有せねばならな
い。本明細書では、「エピトープ」または「決定因子」は、抗体を作成するであ
ろう、および／または、抗体と結合するであろうタンパク質の一部分を意味する
。ゆえに、ほとんどの例で、より小さいＰＲＰタンパク質に対して作られた抗体
は、完全長タンパク質に結合できる。好ましい実施態様では、エピトープは無二
である。つまり、無二のエピトープに対して作成された抗体は、交差反応性をほ
とんど、または全く示さない。
【０１４５】 後述するように、好ましい実施態様では、ＰＲＰタンパク質に対する抗体は、
ＰＲＰタンパク質の生物学的機能を抑える、または除去することができる。例え
ば、抗ＰＲＰ抗体(ポリクローナル抗体、または好ましくはモノクローナル抗体
のどちらでも)をＰＲＰ(またはＰＲＰを含有する細胞)に加えることで、ＰＲＰ
活性を抑えるか、または除去し得る。一般的に、少なくとも活性の２５％の減少
が好ましく、少なくとも約５０％が特に好ましく、約９５−１００％の減少がこ
とさら好ましい。
【０１４６】 本発明の抗体は、ＰＲＰタンパク質に特異的に結合する。本明細書では、「特
異的に結合する」は、少なくとも１０−４−１０−６Ｍ−１の範囲の結合定数で
、好ましくは抗体が１０−７−１０−９Ｍ−１の範囲で、抗体がタンパク質に結
合することを意味する。
【０１４７】 核酸の場合、核酸配列の包括的な相同性はアミノ酸の相同性と同一基準である
が、遺伝暗号の縮重と異なる生物間のコドンの偏りを考慮にいれる。従って、核
酸配列の相同性は、タンパク質配列のそれと比べて低くも高くもあり得る。ゆえ
に、図８Ａまたは図８Ｃのいずれかの核酸配列と比較した核酸配列の相同性は、
好ましくは７５％より大きく、より好ましくは約８０％より大きく、特に約８５
％より大きく、および最も好ましくは９０％より大きい。いくつかの実施態様で
は、相同性は約９３から９５または９８％ほどに高い。
【０１４８】 核酸の相同性は、例えば、BLASTN (Altschul et al. 1990. J. Mol. Biol. 14
7:195-197)を使って測定できる。BLASTNは、マッチを＋５と数え、ミスマッチを
−４と数える単純なスコアシステムを使っている。コンピューター計算上の効率
を上げるために、デフォルトのパラメーターが、直接スコアコードに組み込まれ
ている。
【０１４９】 好ましい実施態様では、ＰＲＰ核酸は、プロテオソームのアルファ型サブユニ
ットのＸＡＰＣ７またはＺｅｔａのようなＰＲＰタンパク質をコードする。当業
者には認識されるであろうように、遺伝暗号の縮重のために、すべて本発明のＰ
ＲＰタンパク質をコードする、極めて多数の核酸を作り得る。ゆえに、特定のア
ミノ酸配列を同定すれば、この分野の技術を持つ者は、コードされるＰＲＰタン
パク質のアミノ酸配列を変えないような方法で単純に一つまたはそれ以上のコド
ンの配列を変更することにより、いかなる数の核酸をも作り得る。
【０１５０】 ある実施態様では、核酸の相同性はハイブリダイゼーション調査により測定さ
れる。ゆえに、例えば、図８Ａおよび／または８Ｃに示された核酸配列またはそ
の相補鎖と、高い厳密さのもとでハイブリダイゼーションする核酸は、ＰＲＰ遺
伝子と考えられる。
【０１５１】 高い緊縮性条件は、当分野で知られている。例えば、Maniatis et al., Mole
cular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition, 1989, and Short Protocol
s in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al.,を参照のこと。両者は出典明示
により本明細書の一部とする。
【０１５２】 高い緊縮性条件は、当業者に知られている。例えば、Maniatis et al., Molec
ular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition, 1989, and Short Protocols
in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al., Hames and Higgins, eds. Nucl
eic Acid Hybridization, A Practical Approach, IL press, Washington, D.C.
, 1985; Berger and Kimmel eds. Methods in Enzymology, Vol. 52, Guide to
Molecular Cloning Techniques, Academic press Inc., New York, N.Y., 1987;
and Bothwell, Yancopoulos and Alt, eds, Methods for Cloning and Analysi
s of Eukaryotic Gene, Jones and Bartlett Publishers, Boston, Mass. 1990,
を参照のこと。以上全部を出典明示により本明細書の一部とする。
【０１５３】 ハイブリダイゼーション条件の選択は当分野の技術を持つ者には明らかであり
、一般的にはハイブリダイゼーションの目的、ハイブリダイゼーションのタイプ
(DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA, オリゴヌクレオチド‐DNA、等)、配列間に求める
関連性のレベルに応じる。ハイブリダイゼーションの方法は文献でよく確立され
ている。例えば、当業者または当分野で通常の技術を持つ者は、ミスマッチの塩
基の数と近接さが増すに従って、核酸二本鎖の安定性は減少する、と認識してい
る。ゆえにハイブリダイゼーションの緊縮性は、そのような二本鎖の安定性を最
大に、または最小にするために用いられ得る。ハイブリダイゼーションの緊縮性
は、例えば、ハイブリダイゼーション溶液の温度の調整、ハイブリダイゼーショ
ン溶液中の、ホルムアミドのようならせんを不安定にする薬剤の割合の調整、洗
浄液の温度と塩濃度の調整により、変わり得る。一般的に、ハイブリダイゼーシ
ョンの緊縮性は、ハイブリダイゼーション後の洗浄中に、塩濃度および／または
温度を変えることによって調整される。ハイブリダイゼーションの緊縮性は、例
えば、i)ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合を増やす、ii)洗
浄液の温度を上げる、またはiii)洗浄液のイオン強度を下げる、ことにより高め
られ得る。高い緊縮性条件は、高温(例えば、Tmを下回る５℃−２５℃)かつ低塩
濃度(例えば、０．１ｘSSC)の洗浄と組み合わされた高温のハイブリダイゼーシ
ョン(例えば、４−６ｘSSCを含む水溶液中で６５℃−６８℃、５０％のホルムア
ミド中で４２℃)を含み得る。低い緊縮性条件は、より高塩濃度(例えば、２−６
ｘSSC)中で中間的な温度(４０℃−６０℃)の洗浄と、より低温のハイブリダイゼ
ーション(２０−５０％のホルムアミド中で３５℃−４２℃)を含み得る。５０℃
−５５℃の間の温度でのハイブリダイゼーションおよび５０℃−５５℃の間で０
．１xSSC、０．１％SDS中での洗浄を含む穏かな条件が用いられ得る(Maniatis a
nd Ausubel, 前出、参照）。好ましい実施態様では、本明細書中の核酸にハイブ
リダイゼーションする核酸は、本明細書に記すように生物学的活性を有する。
【０１５４】 本発明のＰＲＰタンパク質および核酸は好ましくは組換え体である。ここで用
いられる「核酸」はＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれを意味してもよく、もしくは
デオキシおよびリボヌクレオチドの両者を含む分子を意味してもよい。核酸は、
ゲノムのＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含み、センスおよびアン
チセンス核酸を含む。このような核酸はまた、生理的環境におけるそのような分
子の安全性および半減期を増加させるためにリボース‐リン酸バックボーンに修
飾を含んでいてもよい。
【０１５５】 核酸は二本鎖、単鎖であってもよく、または二本鎖もしくは単鎖の配列の両方
の部分を含んでいてもよい。当業者により認識されるであろうように、単鎖(「
ワトソン」)を描けばもう一つの鎖(「クリック」)の配列が規定され、ゆえに図
８Ａおよび８Ｃに示された配列は、それらの配列の相補鎖もまた含む。ここで「
組換え核酸」という用語は、元々一般的に核酸のエンドヌクレアーゼによる操作
によりインビトロで自然界には存在しない形に生成した核酸を意味する。かくし
て、単離されたＰＲＰ核酸は線状のものも、もしくは通常は結合していないＤＮ
Ａ分子を連結することによりインビトロで生成した発現ベクターも、共にこの発
明の目的には組換え体と考える。一旦組換え核酸が作成され宿主細胞もしくは生
物に再導入されれば、それは非組換え的に、即ちインビトロの操作ではなく宿主
のインビボの細胞機構を用いて増幅すると理解される；しかしながら、そのよう
な核酸は一旦組換え的に生産されれば、以後は非組換え的に複製しても本発明の
目的にはなお組換え体と考えられる。
【０１５６】 同様に、「組換えタンパク質」は組換え技術を用いて、即ち上述のように組換
え核酸の発現を通して作成されたタンパク質である。組換えタンパク質は、少な
くとも一つもしくはそれ以上の特性に関して天然に存在するタンパク質から識別
される。例えば、このタンパク質は、野生型宿主中で通常会合しているタンパク
質の一部もしくは全てから単離もしくは精製し得る。例えば、単離されたタンパ
ク質は、自然状態では通常会合している物質の少なくとも一部を伴わないで、所
定の試料中の総タンパク質重量の好ましくは少なくとも約０.５％、より好まし
くは少なくとも５％を構成している。実質的に純粋なタンパク質は、総タンパク
質重量の少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、そして特に好ま
しくは少なくとも約９０％を含む。この定義には、一つの生物由来のＭＤＲタン
パク質を異なる生物もしくは宿主で生産することが含まれる。これに代えて、タ
ンパク質がより増加した濃度レベルで作られるように誘導性プロモーターもしく
は高発現ベクターを使用することにより、タンパク質を通常見られるよりも有意
に高濃度で作ることができる。これに代えて、以下に考察するように、該タンパ
ク質は、エピトープタグの付加またはアミノ酸の置換、挿入および欠失を含むよ
うな、自然界に通常見いだされない形であり得る。
【０１５７】 ＰＲＰタンパク質のアミノ酸配列変異体もまた、本発明のＰＲＰタンパク質の
定義の中に含まれる。これらの変異体は置換、挿入もしくは欠失した変異体の３
つのクラスの一つもしくはそれ以上に相当する。これらの変異体は通常、カセッ
トもしくはＰＣＲ変異誘発もしくは技術上周知の他の技術を用いて、ＰＲＰタン
パク質ＸＡＰＣ７およびＺｅｔａをコード化するＤＮＡ中のヌクレオチドの部位
特異的変異によって変異体をコード化するＤＮＡを生産し、そして次いでＤＮＡ
を上に略述した組換え培養細胞中で発現させることにより調製する。しかしなが
ら、約１００〜１５０残基までを有する変異ＰＲＰタンパク質断片は、確立され
た技術を用いてインビトロ合成により調製することができる。アミノ酸配列変異
体は変化が予め決定されているという特徴を有し、この特徴はこれらの変異体を
ＰＲＰタンパク質のアミノ酸配列に対する天然の対立遺伝子変異体もしくは種間
変異体から区別する。変異体は典型的に、天然アナログと定性的に同じ生物活性
を発揮するが、ただし、以下にさらに十分に略述するように、修飾された特性を
有する変異体を選択することもできる。
【０１５８】 アミノ酸配列変異を導入する部位もしくは領域は予め決定されるが、変異自身
は予め決定しておく必要はない。例えば、所定の部位における変異能を最適化す
るために、標的コドンもしくは領域にランダム変異を起こし、発現したＰＲＰ変
異体をスクリーニングして所望の活性の最適な組み合わせを有するものを探して
もよい。既知の配列を有するＤＮＡ中の予め定められた部位に置換変異を作成す
る技術は周知であり、例えば、Ｍ１３プライマーによる変異誘発およびＰＣＲに
よる変異誘発がある。変異体のスクリーニングはＰＲＰタンパク質の活性の生存
アッセイ、例えば、タキソールへの耐性、を用いて行われる。
【０１５９】 アミノ酸置換は典型的には単一の残基置換である；かなり大きな挿入も耐えら
れるが、挿入は通常、約１〜２０アミノ酸の単位で行われよう。欠失は、より大
きな場合もあるが、約１から約２０残基の範囲である。
【０１６０】 最終誘導体に到達するために、置換、欠失、挿入またはそれらのいずれの組み
合わせを用いてもよい。一般的に、これらの変化は、分子の変化を最小限にする
ために少数のアミノ酸について行われる。しかしながら、より大きな変化も一定
の状況では耐えられる。ＰＲＰタンパク質の特徴について小さな変化が望まれる
場合は、置換は一般的に次のチャートに従ってなされる。
【表１】 チャートＩ
【０１６１】 機能もしくは免疫学的同一性における実質的な変化は、チャートＩに示された
ものよりより保存性の低い置換を選択することによって行われる。例えば、より
大きく影響する置換を行うことができる：それらは、変化する区域のポリペプチ
ドバックボーンの構造、例えばアルファ-ヘリックス構造もしくはベータ‐シー
ト構造；標的部位の分子の電荷もしくは疎水性；または側鎖の大きさである。一
般的にポリペプチドの性質に最も大きな変化を生じると期待される置換は(ａ)親
水性残基、例えばセリルもしくはスレオニルを、疎水性残基、例えばロイシル、
イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、もしくはアラニルに変える(もしく
は、それにより)、(ｂ)システインもしくはプロリンを他のいずれかの残基に変
える(もしくは、それにより)、(ｃ)正電荷を持つ側鎖、例えばリシル、アルギニ
ル、もしくはヒスチジルを負電荷を持つ側鎖、例えばグルタミル、アスパルチル
に変える(もしくは、それにより)、(ｄ)嵩高い側鎖を持つ残基、例えばフェニル
アラニンを側鎖を持たない残基、例えばグリシンに変える(もしくは、それによ
り)置換である。
【０１６２】 別の実施態様では、全体的、非特異的、無作為的な変異導入法により、変異体
のライブラリーを作成する。これらの技術は、当分野で知られており、変えよう
とする特異的部位や領域の選択を要しない。例えば、Stemmer. Nature 370:389-
391 (1994) and Stemmer. PNAS USA 91:10747-10751 (1994)に記されたＤＮＡ
シャッフリングは、クローン化され、発現され、所望の特性を求めてスクリーニ
ングされる変異体を作成するために用いられる。例えば、ＰＲＰタンパク質の細
胞内での活性を、上げ得る、または下げ得る。
【０１６３】 変異体は典型的には天然産生の類似体と定性的に同じ生物活性を発揮し、同じ
免疫応答を誘起するが、ただし、必要に応じてＰＲＰタンパク質の特性を修飾す
るような変異体もまた選択される。これに代えて、変異体をＰＲＰタンパク質の
生物活性が変わるようにデザインすることができる。例えば、グリコシル化部位
を変えたりもしくは除去したりすることができる。
【０１６４】 ＰＲＰタンパク質の共有結合による修飾は、本発明の範囲内に含まれる。共有
結合による修飾の一つのタイプは、ＰＲＰポリペプチドの標的アミノ酸残基を、
ＰＲＰポリペプチドの選択された側鎖またはＮ−もしくはＣ−末端と反応できる
有機誘導体化試薬と反応させることを含む。二官能性試薬による誘導体化は、以
下に詳述するように、例えば、抗ＰＲＰタンパク質抗体の精製法もしくはスクリ
ーニングにおいて使用する水不溶性の支持マトリックスもしくは表面に、ＰＲＰ
タンパク質を架橋するために有用である。一般的に用いられる架橋試薬としては
、例えば、１，１−ビス(ジアゾアセチル)−２−フェニルエタン、グルタルアル
デヒド、例えば４−アジドサリチル酸とのエステルのようなＮ−ヒドロサクシン
イミドエステル類、３，３’−ジチオビス(サクシニミジルプロピオン酸エステ
ル)のようなジサクシニミジルエステルを含むホモ二官能イミドエステル類、ビ
ス‐Ｎ−マレインイミド‐１，８−オクタンのような二官能マレインイミド類お
よびメチル‐３−[(ｐ−アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミデートのような試
薬が挙げられる。
【０１６５】 他の修飾としては、グルタミニルおよびアスパラギニル残基からそれぞれ対応
するグルタミルおよびアスパルチル残基への脱アミド化、プロリンおよびリシン
の水酸化、セリルもしくはスレオニル残基の水酸基のリン酸化、リシン、アルギ
ニン、およびヒスチジン側鎖の "−アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Prote
ins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Franci
sco, pp. 79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、およびＣ末端カルボキシ
ル基のアミド化が挙げられる。
【０１６６】 この発明の範囲内に含まれるＰＲＰポリペプチドのもう一つのタイプの共有結
合的修飾は、ポリペプチドの天然に存在するグリコシル化パターンを変えること
より成る。「天然のグリコシル化パターンを変える」とは、ここでの目的には、
天然に存在するＰＲＰポリペプチドの配列の中に見出される１個もしくはそれ以
上の炭水化物部分を取り除くこと、および／または天然に存在するＰＲＰポリペ
プチドの配列に存在しない１個またはそれ以上のグリコシル化部位を附加するこ
とを意味する。
【０１６７】 ＰＲＰポリペプチドへのグリコシル化部位の附加はその配列のアミノ酸を変化
させることにより達成される。変化は例えば、一個もしくはそれ以上のセリンも
しくはスレオニン残基をＰＲＰポリペプチドの天然配列に添加もしくは置換する
ことによって行うことができる(Ｏ−グリコシル部位)。ＰＲＰアミノ酸配列は、
ＤＮＡレベルでの変化を通して任意に変え得るが、特に、所望のアミノ酸中に翻
訳されるであろうコドンを作成するように予め選択した塩基において、ＰＲＰポ
リペプチドをコード化するＤＮＡを変異させることによって変え得る。
【０１６８】 ＰＲＰタンパク質上の炭水化物部分の数を増加させるもう一つの方法は、ポリ
ペプチドにグリコシドを化学的もしくは酵素的にカップルさせることによる。こ
のような方法は、技術上で、例えば、１９８７年９月１１日に公告されたWO ８
７／０５３３０におよびAplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 25
9-306 (1981)に記述されている。
【０１６９】 ＰＲＰポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的にもしくは酵
素的にまたはグリコシル化の標的となっているアミノ酸残基をコード化するコド
ンの変異による置換により達成される。化学的脱グリコシル化の手法は技術上周
知であり、例えば、Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (
1987)およびEdge et al., Anal. Biochem., 118: 131 (1981)に記述されている
。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura et al., Meth. En
zymol., 138: 350 (1987)に記述されているように種々のエンド−およびエキソ
−グリコシダーゼ類の使用により達成することができる。
【０１７０】 もう一つのタイプのＰＲＰタンパク質の共有結合的修飾は、米国特許第４,６
４０,８３５、４,４９６,６８９、４,３０１,１４４、４,６７０,４１７、４,７
９１,１９２もしくは４,１７９,３３７号に示されている方法で、ＰＲＰポリペ
プチドを種々の非タンパク質ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプ
ロピレングリコール、もしくはポリオキシアルキレン類に結合することである。
【０１７１】 本発明のＰＲＰタンパク質はまた、もう一つの、異種のポリペプチドもしくは
アミノ酸配列に融合したＰＲＰポリペプチドを含むキメラ分子を形成するように
修飾し得る。一つの実施態様においては、そのようなキメラ分子は、ＰＲＰポリ
ペプチドと、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペ
プチドとの融合より成る。エピトープタグは一般的に、ＰＲＰポリペプチドのア
ミノ−もしくはカルボキシ−末端に置かれる。ＰＲＰポリペプチドにそのような
エピトープタグが付いた形のものの存在はタグポリペプチドに対する抗体によっ
て検出することができる。また、エピトープタグをつけることにより、ＰＲＰポ
リペプチドが抗タグ抗体、もしくはエピトープタグに結合するもう一つのタイプ
のアフィニティーマトリックスによる精製を容易ならしめる。別の実施態様では
、キメラ分子は、ＰＲＰポリペプチドと免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの
特定の領域との融合を含むことができる。２価形態のキメラ分子について、この
ような融合はＩｇＧ分子のＦｃ領域に対してなし得る。
【０１７２】 種々のタグポリペプチドおよびその各々の抗体は技術上周知である。例として
は、ポリ−ヒスチジン(poly-his)もしくはポリ−ヒスチジン−グリシン(poly-hi
s-gly)タグ、ｆｌｕ ＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５[Field e
t al., Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165 (1988)]；ｃ−ｍｙｃタグおよびそれに
対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体[Evan et al.
, Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)]；ならびに単純ヘル
ペスウイルスの糖タンパク質Ｄ(ｇＤ)タグおよびその抗体[Paborsky et al., Pr
otein Engineering, 3(6): 547-553 (1990)]が挙げられる。その他のタグポリペ
プチドとしては、Ｆｌａｇ−ペプチド[Hopp et al., BioTechnology 6: 1204-12
10 (1988)]；ＫＴ３エピトープペプチド[Martin et al., Science 255: 192-194
(1992)]；チューブリンエピトープペプチド[Skinner et al., J. Biol. Chem.
266: 15163-15166 (1991)]；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ[Lut
z-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 6393-6397 (1990)]
が挙げられる。
【０１７３】 一旦あるＰＲＰ核酸が同定されると、それをクローン化し、必要ならばその成
分部分をＰＲＰ核酸全長を形成するために再結合させ得る。一旦、その天然の供
給源、例えばプラスミドまたは他のベクターに含まれる、またはそこから直線状
の核酸断片として切り出して、単離すると、組換えＰＲＰ核酸を、他のＰＲＰ核
酸を同定および単離するためのプローブとしてさらに用い得る。それをまた、修
飾された、または変異型のＰＲＰ核酸およびタンパク質を作成するためにも用い
得る。
【０１７４】 ＰＲＰタンパク質をコード化する本発明の核酸を用いて、種々の発現ベクター
が作られる。発現ベクターは、自己複製的な染色体外ベクターでも宿主ゲノムに
組み込まれるベクターでもよい。一般的に、これらの発現ベクターは、ＰＲＰタ
ンパク質をコード化する核酸に機能し得るように結合された転写および翻訳の調
節核酸を含む。「調節配列」という用語は、特定の宿主生物内で機能し得るよう
にに結合されたコーディング配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生
物に適した調節配列は、例えば、プロモーター、任意にオペレーター配列、およ
びリボゾーム結合部位を含む。真核生物はプロトマー、ポリアデニル化シグナル
、およびエンハンサーを使用することが知られている。
【０１７５】 核酸は、それが他の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合に「機能し得
るようにに結合されて」いる。例えば、前配列もしくは分泌リーダー配列に対す
るＤＮＡは、もしそれがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発
現されるならば、ポリペプチドに対するＤＮＡに機能し得るようにに結合されて
いる；プロモーターもしくはエンハンサーは、もしそれが配列の転写に影響を与
えるならば、コーディング配列に機能し得るようにに結合されている；もしくは
、リボゾーム結合部位は、もしそれが翻訳を促進するように位置しているならば
、コーディング配列に機能し得るようにに結合されている。一般的に、「機能し
得るようにに結合された」とは、結合しているＤＮＡは隣接しており、そして、
分泌リーダー配列の場合においては、隣接しかつ読みとり段階にある。しかしな
がら、エンハンサーは隣接している必要はない。結合は都合のよい制限部位にお
ける結合で達成される。もしそのような部位が存在しないならば、合成オリゴヌ
クレオチドアダプターもしくはリンカーを従来の実施法に従って使用する。転写
および翻訳調節核酸は、ＰＲＰタンパク質の発現に使用する宿主にとって一般的
に適当であるであろう；例えば、Bacillus由来の転写および翻訳の調節核酸配列
はBacillusにおいてＰＲＰタンパク質を発現するために好ましく使用される。夥
しい数の適当な発現ベクターおよび適切な調節配列が様々な宿主細胞に関して技
術上公知である。
【０１７６】 一般的に、転写および翻訳の調節核酸はプロモーター配列、リボゾーム結合部
位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、およびエンハンサーも
しくはアクチベーター配列を非限定的に含む。好ましい実施態様では、調節配列
はプロモーターおよび転写の開始および終結配列を含む。
【０１７７】 プロモーター配列は構成的もしくは誘導的プロモーターをコード化する。プロ
モーターは天然に存在するプロモーターでもハイブリッドプロモーターでもよい
。一個より多くのプロモーターの要素を組み合わせたハイブリッドプロモーター
も技術上公知であり、本発明において有用である。
【０１７８】 加えて、発現ベクターは付加的要素を含み得る。例えば、発現ベクターは二つ
の複製システムを有し、これにより二種の生物、例えば発現のために哺乳動物も
しくは昆虫の細胞で、およびクローニングおよび増幅のために前核宿主で維持す
ることができる。さらに、発現ベクターを組み込むために、発現ベクターは宿主
ゲノムと相同な配列を少なくとも一個、また好ましくは発現構築物に隣接する二
個の相同配列を含む。組込まれるベクターは、ベクターに取り入れる適当な相同
配列を選択することにより宿主細胞の特定の座位を目指して組み込ませ得る。組
み込み用ベクターの構築は技術上周知である。
【０１７９】 加えて、好ましい実施態様では、発現ベクターは形質転換した宿主細胞の選択
を可能にする選択マーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は技術上周知であり、用い
る宿主により異なる。
【０１８０】 好ましい発現ベクターは一般的にＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０１９および ＰＣ
Ｔ／ＵＳ９７／０１０４８、両者とも特に出典明示により本明細書の一部とする
、に記述されているレトロウイルスベクター系である。
【０１８１】 本発明のＰＲＰタンパク質は、ＰＲＰタンパク質をコード化する核酸を含む発
現ベクターで形質転換した宿主細胞を、コードされるタンパク質の発現を誘導も
しくは誘起する適当な条件下で培養することによって生産される。ＰＲＰタンパ
ク質の発現に適当な条件は発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって異なるが
、当業者はルーチンの実験により容易に確かめることができる。例えば、発現ベ
クター中に構成的プロモーターを使用している場合には、宿主細胞の生育および
増殖を最適化することが要求されるだろうし、一方、誘導性プロモーターを使用
している場合には、誘導に適した生育条件が要求される。加えて、いくつかの実
施態様では、収穫のタイミングが重要である。例えば、昆虫細胞での発現に用い
られるバキュロウイルスシステムは溶原性ウイルスであるので、収穫時期の選択
は生産物の収量にとって極めて重要である。
【０１８２】 適当な宿主細胞としては、酵母、細菌、古細菌、真菌、および昆虫並びに哺乳
動物細胞を含む動物細胞が含まれる。特に興味の持たれるのはDrosophila melan
ogaster細胞、Saccharomyces cerevisiaeおよび他の酵母、E. coli, Bacillus s
ubtilis、SF9 cells、C129 cells、293 cells、Neurospora、BHK、CHO、COS、He
la細胞、繊維芽細胞、シュワン腫細胞株、不死骨髄およびリンパ細胞株、Jurkat
細胞、マスト細胞並びに他の内分泌および外分泌細胞、並びに神経細胞である。
【０１８３】 好ましい実施態様では、ＰＲＰタンパク質は哺乳動物細胞で発現される。哺乳
動物の発現系はまた技術上公知であり、レトロウイルスシステムが含まれる。哺
乳動物のプロモーターは、哺乳動物のＲＮＡポリメラーゼを結合し、ＰＲＰタン
パク質をコード化する配列を下流(３’側)に転写を開始できる、如何なるＤＮＡ
でもよい。プロモーターは、通常コーディング配列の５’末端に近接して配置さ
れている転写開始領域、および転写開始部位の２５〜３０塩基対上流を用いるＴ
ＡＴＡボックスを有しているであろう。ＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡ合成を正し
い部位から開始するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩを誘導すると考えられている
。哺乳動物のプロモーターはまた、典型的にＴＡＴＡボックスの１００〜２００
塩基対以内の上流に位置している上流のプロモーターエレメント(エンハンサー
エレメント)を含有しているであろう。上流のプロモーターエレメントは転写開
始速度を決定し、そしてどちら向きにも作用する。哺乳動物プロモーターで特に
有用なのは哺乳動物ウイルスの遺伝子由来のプロモーターであるが、これはウイ
ルスの遺伝子はしばしば高度に発現され、また宿主範囲が広いためである。例と
しては、ＳＶ４０の初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスのＬＴＲプロモータ
ー、アデノウイルスの主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスのプロモー
ター、およびＣＭＶのプロモーターが挙げられる。
【０１８４】 典型的には、哺乳動物細胞によって転写終結配列およびポリアデニレーション
配列は転写終結コドンの３’側に位置する調節領域であり、したがって、プロモ
ーターエレメントと共にコーディング配列に隣接している。成熟ｍＲＮＡの３’
末端は、部位特異的な翻訳後切断およびおよびポリアデニル化により形成される
。転写ターミネーターおよびポリアデニレーションシグナルの例としてはＳＶ４
０由来のものが含まれる。
【０１８５】 外来性核酸を哺乳動物宿主およびその他の宿主中に導入する方法は技術上周知
であり、用いる宿主により異なるであろう。この手技としては、デキストラン仲
介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン仲介性トランス
フェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ウイルス感染、
ポリヌクレオチド(類)のリポソームへの封入、およびＤＮＡの核内への直接マイ
クロインジェクションが挙げられる。
【０１８６】 好ましい実施態様では、ＰＲＰタンパク質は細菌のシステムで発現される。細
菌の発現システムは技術上周知である。
【０１８７】 適当な細菌のプロモーターとしては、細菌のＲＮＡポリメラーゼを結合し、Ｐ
ＲＰタンパク質のコーディング配列を下流(３’側)に転写開始できる如何なる核
酸配列でもよい。細菌のプロモーターは転写開始領域を有し、これは通常コーデ
ィング配列の５’末端に隣接している。この転写開始領域は典型的に、ＲＮＡ結
合部位および転写開始部位とを含んでいいる。代謝経路上の酵素群をコード化す
る配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ガラクトース
、乳糖および麦芽糖のような糖を代謝する酵素群由来のプロモーター配列、およ
びトリプトファンのような物質の生合成にかかわる酵素群由来の配列が挙げられ
る。バクテリオファージ由来のプロモーターも使用し得て、技術上公知である。
加えて、合成プロモーターおよびハイブリッドプロモーターも有用である；例え
ば、ｔａｃプロモーターはｔｒｐおよびｌａｃプロモーター配列のハイブリッド
である。さらに、細菌のプロモーターとしては、細菌起源でないが細菌のＲＮＡ
ポリメラーゼを結合し転写を開始する能力のある天然に存在するプロモーターを
含むことができる。
【０１８８】 機能的プロモーター配列に加えて、効率の良いリボゾーム結合部位が望ましい
。E. coliでは、リボゾーム結合部位はシャイン・ダルガルノ(ＳＤ)配列と呼ば
れ、開始コドン、および開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流にある３〜９ヌ
クレオチド長の配列を含む。
【０１８９】 発現ベクターも細菌中のＰＲＰタンパク質の分泌を起こさせるシグナルペプチ
ド配列を含有していてもよい。技術上周知のように、シグナル配列は典型的に、
細胞からのタンパク質の分泌を指令する疎水性アミノ酸よりなるシグナルペプチ
ドをコード化する。タンパク質は、増殖培地中(グラム陽性細菌)、もしくは細胞
の内膜と外膜の間に位置する周辺腔内(グラム陰性細菌)に分泌される。
【０１９０】 細菌の発現ベクターはまた、形質転換した細菌株の選択を可能にするために、
選択マーカー遺伝子を含んでよい。適当な選択遺伝子は、アンピシリン、クロラ
ムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシンおよびテトラ
サイクリンのような薬剤に対して細菌を耐性にする遺伝子を含む。選択マーカー
はまた、ヒスチジン、トリプトファンおよびロイシンの生合成経路上の遺伝子の
ような生合成遺伝子を含む。
【０１９１】 これらの成分は組み立てて発現ベクターに入れる。細菌用の発現ベクターは技
術上周知であり、なかんずくBacillus subtilis、E. coli、Streptococcus crem
oris、およびStreptococcus lividans用のベクターが含まれる。
【０１９２】 細菌の発現ベクターは、塩化カルシウム処理、エレクトロポレーション、その
他のような技術上周知の手技を用いて細菌宿主細胞に形質転換される。
【０１９３】 一つの実施態様では、ＰＲＰタンパク質は昆虫細胞中に生産される。昆虫細胞
の形質転換用発現ベクター、特にバキュロウイルスに基づく発現ベクターは技術
上周知である。
【０１９４】 好ましい実施態様では、ＰＲＰタンパク質は酵母細胞中に生産される。酵母の
発現システムは技術上周知であり、Saccharomyces cerevisiae、Candida albica
nsおよびC. maltosa、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces fragilisおよびK.
lactis、Pichia guillerimondiiおよびP. pastoris、Schizosaccharomyces pom
be、 ならびにYarrowia lipolytica用の発現ベクターを含む。酵母での発現用に
好ましいプロモーター配列としては、誘導性ＧＡＬ１、１０プロモーターおよび
アルコール脱水素酵素、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース‐６リン酸イ
ソメラーゼ、グリセルアルデヒド‐３リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ホス
ホフラクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、
および酸ホスファターゼ遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。酵母の選択マ
ーカーとしては、ツニカマイシン耐性を付与するＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２
、ＴＲＰ１、およびＡＬＧ７、Ｇ４１８に対する耐性を付与するネオマイシンホ
スホトランスフェラーゼ遺伝子、および銅イオン存在下における酵母の生育を可
能にするＣＵＰ１遺伝子が挙げられる。
【０１９５】 ＰＲＰタンパク質は、当分野で周知の技術を用いて、融合タンパク質としても
作成され得る。ゆえに、例えば、モノクローナル抗体作成のために、もし目的の
エピトープが小さければ、そのＰＲＰタンパク質を、キャリアータンパク質と融
合させて免疫原を形成させ得る。あるいは、ＰＲＰタンパク質を、発現の増加、
または他の目的のために、融合タンパク質としても作成され得る。例えば、ＰＲ
Ｐタンパク質がペプチドであるとき、そのペプチドをコードする核酸は、発現の
目的のために、他の核酸と連結され得る。
【０１９６】 一実施態様では、本発明のＰＲＰ核酸、タンパク質および抗体を標識化する。
本明細書中で「標識化する」とは、ある化合物が、、その化合物の検出を可能に
するように付加した少なくとも一成分、同位元素または化合物、を有することを
意味する。一般的に、標識は次の３つの分類に分けられる。a)放射活性を有する
、または重同位元素であり得る、同位元素標識；b)抗体または抗原であり得る、
免疫標識；c)有色または蛍光染料。これらの標識は化合物のどの位置にでも組み
込まれ得る。
【０１９７】 好ましい実施態様では、ＰＲＰタンパク質は発現後精製もしくは単離される。
ＰＲＰタンパク質は、どのような他の成分が試料中に存在するかに依存して、当
業者周知の種々の方法で単離もしくは精製し得る。標準的な精製法としては、電
気泳動的、分子的、免疫学的技法ならびにイオン交換、疎水、アフィニティー、
および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを含むクロマトグラフィー技法、ならび
にクロマトフォーカシングが挙げられる。例えば、ＰＲＰタンパク質は、ＰＲＰ
タンパク質に特異的な抗体を用いた標準的なアフィニティーカラムを用いて精製
することができる。限外ろ過およびダイアろ過技法とタンパク質濃縮との組合わ
せも有用である。適当な精製技法の一般的手引書としては、Scopes, R., Protei
n Purification, Springer-Verlag, NY (1982)を参照のこと。必要な精製の程度
はＰＲＰタンパク質の用途に依存して変わるであろう。場合によっては精製は不
要であろう。
【０１９８】 一旦発現され、必要により精製されると、ＰＲＰタンパク質および核酸は、多
数の応用において有用である。
【０１９９】 好ましい実施態様では、ＰＲＰタンパク質、核酸、修飾タンパク質、および天
然または修飾ＰＲＰタンパク質を含む細胞がスクリーニングアッセイで用いられ
る。重要なＰＲＰタンパク質の同定は、ＰＲＰ活性を調整する化合物の薬剤スク
リーニングアッセイのデザインを可能にする。かくして、この実施態様では、そ
れらの方法はＰＲＰタンパク質試料と候補バイオ活性物生とを結合させ、多剤耐
性に対する影響を評価することを含む。ここで「ＰＲＰ活性」もしくは文法的同
等語はＭＤＲの減少もしくは消失を意味する。好ましい実施態様では、ＰＲＰ活
性はＭＤＲの消失である。
【０２００】 好ましい実施態様では、ＰＲＰタンパク質の活性が増加する。もう一つの好ま
しい実施態様では、ＰＲＰタンパク質の活性が減少する。かくして、アンタゴニ
ストであるバイオ活性物生が或る実施態様では好ましく、そしてアゴニストであ
るバイオ活性物生が他の実施態様では好ましいことがあり得る。
【０２０１】 スクリーニングは、先ずＰＲＰタンパク質に結合できる候補作用物質を見つけ
るようにデザインし、次いでこれらの作用物質を、候補作用物質のＰＲＰ活性調
整能を評価するアッセイに用いてもよい。かくして、当業者により認識されるで
あろうように、実行できる多数の異なるアッセイ、即ち、結合アッセイおよび活
性アッセイ、が存在する。
【０２０２】 かくして、一つの実施態様では、それらの方法は、ＰＲＰタンパク質と候補作
用物質とを結合させ、候補作用物質のＰＲＰタンパク質への結合を測定すること
を含む。好ましい実施態様はヒトＰＲＰタンパク質を利用するが、げっ歯類(マ
ウス、ラット、ハムスター、モルモット、その他)、家畜(ウシ、ヒツジ、ブタ、
ウマ、その他)、霊長類および酵母を含む他の真核動物のタンパク質を用いても
よい。これら後者の実施態様はヒトの疾患の動物モデルの開発においては好まし
いことがあり得る。ここに概述するように、ある実施態様では、上に概述したよ
うに、欠失ＰＲＰタンパク質を含む変異もしくは誘導ＰＲＰタンパク質を用いて
もよい。
【０２０３】 さらに、ＰＲＰタンパク質の部分もＰＲＰタンパク質の定義の中に含まれる；
即ち、フルレングスタンパク質を用いてもよく、もしくはその機能部分を用いて
もよい。加えて、ここに記述したアッセイは、単離ＰＲＰタンパク質を使用して
も、もしくはＰＲＰタンパク質を含む細胞を利用してもよい。
【０２０４】 一般的に、ここにおける方法の好ましい実施態様では、ＰＲＰタンパク質もし
くは候補作用物質は、隔離された試料受容区域(例えば、マイクロタイタープレ
ート、アレイ、その他)を有する不溶性支持体に非拡散的に結合している。不溶
性支持体は、組成物が結合可能で、可溶性物質から容易に分離でき、そしてその
他の点に関してスクリーニング法全体と適合性のある、いかなる組成物でできて
いてもよい。それぞれの支持体の表面は均質もしくは多孔性でもよく、そしてい
かなる便利な形状でもよい。適切な不溶性支持体の例としては、マイクロタイタ
ープレート、アレイ、メンブラン、およびビーズが挙げられる。これらは典型的
にガラス、プラスチック(例えば、ポリスチレン)、多糖類、ナイロンもしくはニ
トロセルローズ、テフロン[登録商標]、その他でできている。マイクロタイター
プレートおよびアレイは、少量の試薬および試料を用いて多数のアッセイが同時
に行えるので、特に便利である。組成物の特定の結合様式は、それが試薬および
この発明の全体的方法と適合性があり、組成物の活性を維持し、非拡散性である
かぎり重要ではない。結合の好ましい方法は、抗体(タンパク質が支持体に結合
するときに、リガンド結合部位もしくは活性化配列を立体的に阻止しない)、「
粘着性」もしくはイオン性支持体への直接結合、化学的架橋、表面でのタンパク
質もしくは作用物質の合成、その他を含む。タンパク質もしくは作用物質の結合
後、過剰の未結合物質を洗浄により除去する。次いで、試料受容区域をウシ血清
アルブミン(ＢＳＡ)、カゼイン、またはその他の無害のタンパク質もしくはその
他の成分とのインキュベーションにより阻止してもよい。
【０２０５】 好ましい態様では、ＰＲＰタンパク質は支持体に結合され、候補バイオ活性物
生がアッセイに加えられる。これに代えて、候補作用物質が支持体に結合され、
ＰＲＰタンパク質が加えられる。新規結合剤は特異的抗体、化学ライブラリーの
スクリーニングで同定された非天然結合剤、ペプチド類似体、その他を含む。特
に興味あるのは、ヒトの細胞に対して低い毒性を有する作用物質のスクリーニン
グアッセイである。この目的のために、標識インビトロタンパク質‐タンパク質
結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、タンパク質結合検出用の免疫ア
ッセイ、機能アッセイ(リン酸化アッセイ、その他)等を含む広範なアッセイを用
い得る。
【０２０６】 ＰＲＰタンパク質への候補バイオ活性物生の結合の測定は多数の様式で行うこ
とができる。好ましい実施態様では、候補バイオ活性物生を標識し、結合を直接
測定する。例えば、これは、ＰＲＰタンパク質の全てもしくは一部を固相支持体
に付着させ、標識された候補作用物質(例えば、蛍光標識)を加え、過剰の試薬を
洗浄して除去し、そして標識が固相支持体上に存在するかどうかを測定すること
により行い得る。技術上既知であるように、種々のブロッキングおよび洗浄ステ
ップを利用してもよい。
【０２０７】 ここで「標識された」とは、化合物が、例えば、ラジオアイソトープ、蛍光体
、酵素、抗体、マグネチック粒子のような粒子、化学発光体、もしくは特異的結
合分子、その他のような検出可能なシグナルを与える標識体で直接的にもしくは
間接的に標識されることを意味する。特異的結合分子は、ビオチンとストレプト
アビジン、ジゴキシンとアンチジゴキシン、その他のような対を含む。特異的結
合メンバーについては、通常、上に概述したように既知の処理に従って、相補的
メンバーを検出をもたらす分子で、標識するであろう。標識は直接的もしくは間
接的に検出可能なシグナルを提供することができる。
【０２０８】 ある態様では、成分の一つだけが標識される。例えば、タンパク質(もしくは
タンパク性候補作用物質)は、１２５Ｉを用いてもしくは蛍光体でチロシン部位
において標識してもよい。これに代えて、１つ以上の組成物は、例えば、タンパ
ク質については１２５Ｉを用いて、候補作用物質については蛍光体を用いて、異
なる標識体で標識してもよい。
【０２０９】 好ましい実施態様では、候補バイオ活性物生の結合は競合的結合アッセイの使
用により測定される。この実施態様では、競合体は、抗体、ペプチド、結合パー
トナー、リガンド、その他のような標的分子(即ち、ＰＲＰタンパク質)に結合す
ることが知られている結合成分である。好ましい態様では、競合体は配列番号１
のペプチドである。特定の状況下では、バイオ活性物生と結合成分との間で競合
的結合があり、結合成分がバイオ活性物生を置換する。
【０２１０】 一つの実施態様では、候補作用物質が標識される。候補バイオ活性物生、もし
くは競合体、または両者を、在るとすれば、結合を起こすに十分な時間で先ずタ
ンパク質に加える。インキュベーションは最適な活性を促進するいずれの温度で
行ってもよく、典型的には４および４０℃の間である。インキュベーション期間
は最適な活性が得られるように選択されるが、迅速なハイスループットスクリー
ニングを促進するように最適化してもよい。典型的には０.１および１時間の間
で十分である。過剰の試薬は一般的に、除去もしくは洗浄して除かれる。次いで
２番目の組成物を加え、結合を示す標識成分の存在もしくは不在を追跡する。
【０２１１】 ＰＲＰタンパク質の活性を調整する作用物質のスクリーニングもまた行い得る
。好ましい実施態様では、ＰＲＰタンパク質の活性を調整する能力のあるバイオ
活性物生をスクリーニングする方法は、上述のように、候補バイオ活性物生をＰ
ＲＰタンパク質の試料に加え、ＰＲＰタンパク質の生物活性の変化を測定するス
テップを含む。「ＰＲＰタンパク質の活性の調整」は活性の上昇、活性の低下、
または存在する活性のタイプもしくは種類の変化を含む。かくして、候補作用物
質はＰＲＰタンパク質に結合し(これは必要ではないこともあり得るが)、そして
ここに規定する生物学的もしくは生化学的活性を変化させるべきである。これら
の方法は、上に一般的に概述したようなインビボスクリーニング法、およびＰＲ
Ｐタンパク質の存在、分布、活性もしくは量の変化を限定されることなしに含む
ＰＲＰタンパク質の表現型の変化を探すための、細胞のインビボスクリーニング
の両者を含む。
【０２１２】 好ましい実施態様では、競合体が最初に加えられ、次いで候補バイオ活性物生
が加えられる。競合体の置換は、候補バイオ活性物生がＰＲＰタンパク質に結合
しつつあること、したがって、それに結合し、潜在的にＰＲＰタンパク質の活性
を調整する能力を有することの指標である。この実施態様では、いずれの成分も
標識することができる。かくして、例えば、もし競合体が標識されていれば、洗
浄溶液中の標識の存在は作用物質による置換を示す。これに代えて、もし候補バ
イオ活性物生が標識されていれば、支持体上の標識の存在が置換を示す。
【０２１３】 好ましい実施態様では、候補バイオ活性物生による調整は競合的アッセイの使
用によって測定される。この実施態様では、候補バイオ活性物生を最初に加え、
インキュベーションおよび洗浄を行い、次いで競合体を加える。競合体によるＰ
ＲＰタンパク質の調整の不在は、バイオ活性物生がＰＲＰタンパク質に高親和性
で結合したことを示し得る。かくして、もし候補バイオ活性物生が標識されてい
るならば、支持体上の標識の存在は競合体結合の欠如と相俟って、候補作用物質
がＰＲＰタンパク質に結合する能力を有していることを示し得る。
【０２１４】 好ましい実施態様では、これらの方法は、ＰＲＰタンパク質の活性を調整する
能力のあるバイオ活性物生を同定するための異なるディファレンシャルスクリー
ニングを含む。この実施態様では、これらの方法はＰＲＰタンパク質と第一の試
料中の競合体との結合を含む。第二の試料はバイオ活性物生、ＰＲＰタンパク質
、および競合体を含む。競合体の結合を両試料について測定すると、二つの試料
間における結合の変化もしくは差は、ＰＲＰタンパク質に結合する能力を有し、
潜在的にその活性を調整する能力を有する作用物質の存在を示す。即ち、もし競
合体の結合が第一の試料に比して第二の試料で異なれば、作用物質はＰＲＰタン
パク質に結合する能力を有する。
【０２１５】 これに代えて、もう一つの実施態様は、天然のＰＲＰタンパク質に結合するが
、修飾されたＰＲＰタンパク質には結合できない薬物候補を同定するためのディ
ファレンシャルスクリーニングを利用する。ＰＲＰタンパク質の構造モデルを作
成し、その部位と相互作用する作用物質を合成するランダムドラッグデザインに
用い得る。ＰＲＰの生物活性に影響を与える薬剤候補はまた、薬物をこのタンパ
ク質の活性を促進もしくは減少させる能力に対するスクリーニングにかけること
によっても同定される。
【０２１６】 ここに記述するように、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロー
ルをこれらのアッセイで用いてもよい。好ましくは、全てのコントロールおよび
試料は統計的に有意な結果を得るために少なくとも３回実施する。全ての試料の
インキュベーションは、作用物質のタンパク質への結合に十分な時間行う。イン
キュベーション後、全ての試料を洗浄して非特異的に結合した物質を除去し、そ
して結合された、一般的には標識された作用物質の量を測定する。例えば、放射
能標識を使用する場合は、試料はシンチレーションカウンター中で計測して結合
した化合物の量を測定し得る。
【０２１７】 他の様々な試薬をスクリーニングアッセイに含み得る。これらは、最適なタン
パク質‐タンパク質結合を促進および／または非特異的もしくはバックグラウン
ド相互作用を低減するために使し得る塩、中性タンパク質、例えばアルブミン、
界面活性剤、その他のような試薬を含む。また、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレア
ーゼ阻害剤、抗微生物剤、その他のような、別にアッセイの効率を増加させる試
薬を用い得る。組成物の混合物は、必要な結合を起こすいずれの順序で加えても
よい。
【０２１８】 好ましい態様では、この発明は、細胞内のＰＲＰタンパク質の表現型を調整す
る能力を有するバイオ活性物生のスクリーニング法を提供する(Mirski, et al.,
(1987) Cancer Res., 47, 2594-2598)。ここでＰＲＰタンパク質の表現型を調
整するとは、例えば、ＰＲＰタンパク質の存在、分布、活性もしくは量の変化を
意味する。好ましい実施態様では、ＰＲＰタンパク質の活性の変化が測定される
。これらの方法は、候補バイオ活性物生を、上で規定したように、ＰＲＰタンパ
ク質を含む細胞に加えることを含む。好ましい細胞の種類は、ここに記述するよ
うに、殆どいかなる細胞を含む。細胞は内在性遺伝子由来もしくは組換え核酸由
来のＰＲＰタンパク質を発現する。好ましい実施態様では、候補作用物質のライ
ブラリーが細胞集合体で試験される。これに代えて、スクリーニングは競合的阻
害剤の存在下もしくは不在下で行い、ＰＲＰの表現型を測定する。
【０２１９】 一旦同定されれば、ＰＲＰタンパク質およびバイオ活性物生は多剤耐性に関連
した疾患の治療に用いられる組成物で治療剤としての用途を見出すことがあり得
る。治療剤としての用途を見出すバイオ活性物生をここで「増感剤」という。「
増感剤」は、細胞に加えたときに化学療法剤に対する抵抗性を阻害するいかなる
分子でもよい。増感剤は個別に、もしくは化学療法剤との組み合わせで加えても
よい。
【０２２０】 多剤耐性におけるＰＲＰタンパク質の役割と関連する本発見は、ＭＤＲを軽減
もしくは消失させる方法を提供する。好ましい実施態様では、ＰＲＰタンパク質
、特にＸＰＡＣ７およびＺｅｔａならびに／もしくはそれらの断片は、ＭＤＲで
仲介される状態の研究もしくは治療、即ち、ＭＤＲ関連疾患を診断、治療、もし
くは予防するために有用である。かくして、「ＭＤＲ」または「ＭＤＲ関連疾患
」もしくは「疾患状態」は、細胞がＭＤＲ−１の上方調節を含む、いかなる数の
機構により仲介されて化学療法剤に対する感受性を消失する状態を含む。
【０２２１】 ここに提供される組成物および方法は特に、皮膚、乳房、脳の固形癌、子宮頚
癌、睾丸癌、その他を含む癌に関連した多剤耐性の治療に有用であると思われる
。より特には、この発明の組成物および方法によって治療し得る癌は、心臓につ いては ：肉腫(血管肉腫、線維肉腫、横紋肉腫、脂肪肉腫)、粘液腫、横紋筋腫、
線維腫、脂肪腫および奇形腫；肺については：気管支原生癌(扁平上皮細胞、未
分化小細胞、未分化大細胞、腺癌)、肺胞腺(細気管支)癌、気管支腺腫、肉腫、
リンパ腫、軟骨腫様過誤腫、中皮腫；消化器については：食道(扁平上皮癌、腺
癌、平滑筋肉腫、リンパ腫)、胃(癌腫、リンパ腫、平滑筋肉腫)、膵臓(腺管癌、
インシュリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、類癌腫、ビポーマ)、小
腸(腺癌、リンパ腫、類癌腫、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線
維腫、線維腫)、大腸(腺癌、腺管腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫)；尿路性
器については：腎臓(腺癌、ウィルムス腫瘍[腎芽細胞腫、リンパ腫、白血病]、
膀胱および尿道(扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌)、前立腺(腺癌、肉腫)、精巣(
精上皮腫、奇形腫、胎性癌、奇形癌、絨毛膜癌、肉腫、間質細胞癌、線維腫、線
維腺腫、類腺腫瘍、脂肪腫)；肝臓については：肝癌(肝細胞癌)、胆管癌、肝芽
細胞腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫；骨については：骨原性肉腫(骨肉腫)、
線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫(細
網肉腫)、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫脊索腫、骨軟骨腫(骨軟骨性外骨症)、良
性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨腫および巨細胞腫；神経系につ いては ：頭蓋骨(骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎)、髄膜(髄膜腫、
髄膜肉腫、神経膠腫症)、脳(星状細胞腫、髄芽細胞腫、神経膠腫、上衣細胞腫、
胚細胞腫[松果体腫]、多形性神経膠芽腫、乏突起神経膠腫、神経鞘腫、網膜芽細
胞腫、先天性腫瘍)、脊髄神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫)；婦人科系につ いては ：子宮(子宮内膜癌)、子宮頚(子宮頚癌、腫瘍前子宮頚部異形成)、卵巣(
卵巣癌)[漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、未分類癌腫]、顆粒膜卵胞膜細胞腫
、セルトリ-ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫)、外陰部(扁平
上皮癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、悪性黒色腫)、膣(明細胞癌、扁平上皮癌、
ブドウ状肉腫[胎児性横紋筋肉腫]、卵管(癌腫)；血液系については：血液(骨髄
性白血病[急性および慢性]、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、
骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群)、ホジキン病、非ホジキン
リンパ腫[悪性リンパ腫]；皮膚については：悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮
癌、カポジ肉腫、異形成母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、蟹足腫、乾癬；お
よび副腎については：神経芽細胞腫を限定されることなしに含む。かくして、こ
こに規定する「癌性細胞」という用語は上に同定された状態のいかなるものに罹
っている細胞をも含む。
【０２２２】 かくして、一つの実施態様では、細胞もしくは生体内でＭＤＲを調整する方法
を提供する。一つの実施態様では、この方法は、対応する内在性ＰＲＰタンパク
質の生物活性を減少させるかもしくは除去するところの抗−ＰＲＰ抗体を細胞に
投与することを含む。これに代えて、この方法は、ＰＲＰタンパク質をコード化
する組換え核酸を細胞もしくは生体に投与することを含む。当業者により認識さ
れるであろうように、これは数多くの様式で達成し得る。好ましい実施態様では
、遺伝子療法技法は、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３８６８、これは全体的な
出典明示により本明細書の一部とする、に記載されているように、増強された相
同的組換え(ＥＨＲ)を用いる外因性遺伝子の取り込みを含む。
【０２２３】 一つの実施態様では、この発明は、個人においてＭＤＲ関連状態を診断する方
法を提供する。これらの方法は、個人もしくは患者からの組織中においてＰＲＰ
タンパク質の活性を測定することを含むが、ＰＲＰタンパク質であるＸＡＰＣ７
およびＺｅｔａの量もしくは特異的活性の測定を含み得る。この活性は、影響を
受けていない第二の個人もしくは第一の個人からの影響を受けていない組織のど
ちらかかのＸＡＰＣ７およびＺｅｔａの活性と比較される。これらの活性が異な
るときには、第一の個人はＭＤＲ媒介障害に対する危険性を持っているであろう
。
【０２２４】 一つの実施態様では、本発明のＰＲＰタンパク質は、ＰＲＰタンパク質に対す
るポリクローナルおよびモノクローナル抗体を生成するために用い得るが、これ
らはここで記載するように有用である。同様に、ＰＲＰタンパク質は、標準的な
技法を用いて、アフィニティークロマトグラフィーカラムに結合させることがで
きる。これらのカラムはそれから、ＰＲＰ抗体を精製するために使用し得る。好
ましい実施態様では、ＰＲＰタンパク質に特異的なエピトープに対して生成する
；即ち、これらの抗体は、他のタンパク質に対して殆んどもしくは何も交差反応
性を示さない。これらの抗体は、数多くの応用に使用を見出す。例えば、ＰＲＰ
抗体は、標準的なアフィニティークロマトグラフィーカラムに結合させて、ＰＲ
Ｐタンパク質を精製するために使用し得る。これらの抗体はまた、上で概述する
ように、ＰＲＰタンパク質に特異的に結合するので、阻止ポリペプチドとしても
使用し得る。
【０２２５】 一つの実施態様では、治療的有効用量の増感剤を患者に投与する。ここでは、
「治療的有効用量」とは、そのために投与する効果を産生する投与量を意味する。
正確な投与量は、治療目的に依存し、公知の技術を用いて当業者により確認し得
るであろう。技術上公知であるように、増感剤の分解、全身性対局所性の送達お
よび新しいプロテアーゼの合成速度、ならびに年齢、体重、一般的健康状態、性
別、規定食、投与時間、薬剤相互作用および症状の重篤度に対する調節が必要で
あるだろうし、そして当業者により日常的な実験で確認し得るであろう。
【０２２６】 本発明の目的のための「患者」には、ヒトおよび他の動物の両者ならびに実験動
物のような生物が含まれる。かくして、これらの方法はヒトの治療および家畜へ
の応用の両者に適用可能である。に好ましい実施態様では、患者はヒトである。
【０２２７】 本発明の組成物の投与は種々の様式でなされ得るが、これらには、経口投与、
皮下投与、静脈投与、鼻腔内投与、経皮投与、腹腔内投与、筋肉内投与、肺内投
与、膣内投与、直腸内投与、もしくは眼内投与が非限定的に含まれる。ある例に
おいては、例えば、傷および炎症の治療においては、組成物を溶液もしくはスプ
レーとして直接に塗布してもよい。導入様式次第で、化合物は種々の様式で製剤
化され得る。この製剤において治療的に活性な化合物の濃度は約０.１％から１
００％で変わり得る。
【０２２８】 本発明の医薬組成物は、患者に投与するために適した形態における化合物を含
む。好ましい実施態様では、この医薬組成物は、医薬的に許容される塩として存
在するような、水溶性の形態にあるが、これは酸および塩基の両者の付加塩を含
むことを意味する。「医薬的に許容される酸の付加塩」とは、遊離塩基の生物学的
有効性を保持し、かつ生物学的にもしくは他の点でも望ましくないことは無い塩
を言い、それらは、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸、ならび
に酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マ
ロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデ
ル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サルチ
ル酸等の有機酸と形成される。「医薬的に許容される塩基の付加塩」は、ナトリウ
ム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛
、銅、マンガン、アルミニウム塩等のような無機塩基から誘導される塩を含む。
特に好ましいのは、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム、および
マグネシウム塩である。医薬的に許容される、無毒な有機塩基から誘導される塩
は、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヂエチルアミン、トリエチルアミ
ン、トリプロピルアミン、およびエタノールアミンのような第一級、第二級、お
よび第三級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、
ならびに塩基性イオン交換樹脂を含む。
【０２２９】 これらの医薬組成物はまた、一つもしくはそれ以上の以下のものを含んでもよ
い：血清アルブミンのような担体タンパク質；緩衝剤；微結晶性セルロース、乳
糖、トウモロコシおよび他のデンプンのような賦形剤；結合剤；甘味剤および他
の嬌味剤；着色剤；ならびにポリエチレングリコール。添加物は技術上周知であ
り、種々の製剤に使用される。
【０２３０】 以下の実施例は、上記の発明を用いる様式をさらに十分に記述するために、な
らびにこの発明の種々の態様を実施するために意図する最良の形態を示すために
供する。これらの実施例はこの発明の真の範囲を限定するために供することは決
してなく、むしろ例示的な目的のために提供されることは言うまでもない。ここ
で引用される全ての特許、特許出願、出版物および参考資料は、特に出典明示に
より本明細書の一部とする
【０２３１】 (実施例) 実施例１：Ｈｅｌａ細胞中でタキソール耐性を付与するペプチドの分離実験のプロトコール： 細胞培養およびベクター構築 Ｐｈｏｅｎｉｘ−ａｍｐｈｏ細胞(組み込みウイ
ルス性パッケージング遺伝子を持つ２９３Ｔ)(Pear, W. S., et al., (1993) Pr
oc. Natl. Acad. Sci. U S A, 90, 8392-8396)およびＨｅｌａ ｔＴＡ細胞(ｔ
ｅｔアクチベーターを発現するＨｅｌａ)(Clontech)をレテロウイルスの形質導
入およびタキソール感受性の実験にそれぞれ使用した。Ｐｈｏｅｎｉｘ−ａｍｐ
ｈｏに関する情報は、<http://www.stanford.edu/group/nolan>で得られる。図
１Ａに示すように、レテロウイルスのベクターをペプチドライブラリーの構築に
用いた。図１Ａに示すように、ＧＥＰ−ペプチド融合体をＴｒａベクター内にク
ローン化して、ＧＦＰを融合タンパク質と置換し第一次発現位置にはペプチドが
無いようにした。
【０２３２】ランダムなペプチドライブラリーの構築 ＭＧＥＦＬＩＶＩＫＳ(Ｘ１８)ＥＦＬ
ＩＶＩＫＳＧＰＰでフランクしたランダムな１８マーを含むペプチドライブラリ
ーを構築した。ＦＬＩＶＩＫＳ配列は、ＳＫＶＩＬＦＥ配列が溶液中で二量体を
形成すると知られた研究(Bodenmuller, H., et al., (1986) EMBO J., 5, 1825-
29)から誘導される。われわれの研究は、ＦＬＩＶＩＫＳ配列は自己的アニール
をしてプロテアーゼ耐性のスカホールド構造を創生する強い能力を示すことを実
証する。二つのオリゴ体、ＲＧ２２１(５‘−ＧＡＴＣＣＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧ
ＧＧＣＧＡＧＴＴＣＴＴＧＡＴＣＧＴＧＡＡＧＴＣＡＧＧ−Ｇ(ＮＮＫ)１８ＧＧ
ＡＧＡＡＴＴＣＣＴＴＡＴＣＧＴＣ)およびＲＧ２０３(ＧＡＴＣＣＣＡＡＴＴＴ
ＡＡＴＧＧＧ−ＡＡＴＣＡＧＧＴＴＴＴＡＡＧＧＡＧＧＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＡ
ＣＧＡＴＡＡＧＧＡＡＴＴＣＴＣＣ−３’)、をアニールして拡張した。二本鎖
生成物を精製しそして引き続き、図１Ａに示すように、ＢｓｔＸＩ−消化のレテ
ロウイルスのベクター内に連結した。
【０２３３】ペプチド合成 完全に自動化したRainin Symphony/MultiplexTmペプチド合成装
置(Tucson, AZ)上でＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｎｏｖａｓｙｎ−ＴＧＴ樹脂を用いる古
典的なＦｍｏｃ化学にしたがって、ＲＧ８.５のペプチド合成を実施した。標準
的なＦｍｏｃ−適合性な側鎖保護基を使用し、ＢＯＰ／ＤＩＰＥＡ仲介カップリ
ング法(Castro, B., et al,, (1975) Tetrahedron Lett., 14, 1219-1222)を採
用して、５倍過剰量のＦｍｏｃ保護アルファアミノ酸でカップリングを二回実施
した。Ｎ−末端に、全てのアミノ酸に続けてスペーサー(Ａｃａｐ、アミノカプ
ロン酸)およびビオチンを取り付けた後で、ペプチドを樹脂から切断し、ＲＰ−
ＨＰＬＣによって精製し、そしてその完全性を、先に記載したように(Gururaja,
T.L., and Levine, M.J., (1996) Peptide Res., 3, 283-289)、電気スプレー
イオン化質量分析(ＥＳＩ−ＭＳ)により確認した。
【０２３４】ペプチドライブラリーのスクリーニング ペプチドライブラリーをリン酸カルシ
ウム沈澱(Ausubel, F.M., et al., (1994). "Transfection of DNA into eukary
otic cells", In Curr. Prot. Mol. Biol. 1, 9.1.1-9.1.3)によりＰｈｏｅｎｉ
ｘ−ａｍｐｈｏ細胞内にトランスフェクションを行った。２４時間後に、ウイル
スの上澄液を用いて４×１０８のＨｅｌａ細胞を４８時間感染させた。それから
、細胞を１５−ｃｍのディシュ(ディシュあたり４×１０6)中で平板培養した。
２４時間後に、細胞を２００ｎＭのタキソールで４８時間処理した。タキソール
処理に続いて、細胞をＰＢＳで一回洗浄し、３日毎に新しい培地を再供給し、そ
れから４０％Ｈｅｌａ増殖培地を含有する調整培地に変更した。２週間後に、個
々の生存クローンを単離しそして同一投与量のタキソールで再処理して、その増
殖が非遺伝的な、確率的な、もしくは過度的な耐性によるクローンを除去した。
【０２３５】ペプチド救出のためのＲＴ−ＰＣＲおよびＭＤＲ１ ｍＲＮＡレベルアッセイ
ペプチド配列をＲＴ−ＰＣＲによりタキソール耐性細胞から救出し、その後にＴ
ｒａベクター(その中では、ペプチド発現はテトラサイクリン制御下にあった)内
にクローン化した。それぞれのペプチドを未処理のＨｅＬａ細胞中でクローン原
性の生存アッセイにより再テストした。ＭＤＲ１ ｍＲＮＡレベルを測定する半
定量的ＰＣＲのために、RiboGreen ＲＮＡ定量キット(Molecular Probes)およ
び０.５ｍｇの全ＲＮＡを逆転写に用いた。ＭＤＲ１ ｍＲＮＡの増殖のための
オリゴヌクレオチドは以前に記載されていた(Chen, G. et al., (1997) J. Bio
l. Chem., 272, 5974-5982)。
【０２３６】クローン原性生存アッセイ 救出したペプチドを保有するウイルスを用いて、上
述のように、ＨｅＬａ細胞を感染した。感染後、培地中にドキシサイクリン(２
００ｎｇ／ｍｌ)を含有する６穴プレートの単一ウエル内に２×１０5の細胞を撒
いた。２４時間後、細胞を４８時間タキソールで処理した。タキソール処理後２
週間してから、タキソール耐性クローンをギムザ液で染色し、写真撮影しそして
数えた。
【０２３７】結果 機能的スクリーニングを、潜在的に発現したペプチドの大きいライブラリーの
創成をもってレトロウイルスの送達構築体中で、開始した。短いペプチド(材料
および方法を参照)をオリゴヌクレオチドにより発現カセット内にコード化した
。３×１０８以上の異なるペプチドからなるペプチドライブラリーを構築した。
図１Ａに発現構成体を示す。逆転写および送達したレトロウイルスの組み込みの
後、レトロウイルスのプロモーターの制御下で、ペプチドインサートを発現する
。内部翻訳開始部位(ＩＲＥＳ)を共発現したＧＦＰマーカーの翻訳に用いるが、
このマーカーは、ペプチド発現レベルおよび感染効率の代替指標として作用する
。目標は、十分に多量の異なるペプチドモチーフ(アプタマー)を細胞内に発現し
、そして、興味の経路に優性効果を持つような珍しいペプチドに向かう細胞のた
めの遺伝子選択基準を設定することである。図１Ａに、この報告で実施する選択
のために遺伝子スクリーニングの概要を概述する。
【０２３８】 組換えウイルスを作るために、ＤＮＡライブラリーをレトロウイルス生成者細
胞株Ｐｈｏｅｎｉｘ−ａｍｐｈｏ内にトランスフェクションを行った。感染性の
ウイルスの上澄液を４８時間後に収穫した。新鮮な上澄液を直ぐに用いて、４×
１０８のＨｅｌａ細胞を感染させた。レトロウイルスの組込みが完了し、ペプチ
ド発現が最高レベルに達する２日間の期間後に、細胞を「タキソール選択圧」に付
した。９９.９９％以上の感染した細胞が、４８時間２００ｎＭのタキソールに
よる処理の後で死滅した。新鮮な培地中で２週間の生育後に、１５０個の生存ク
ローンを拾い上げて同一投与量のタキソールで再処理をして、その元来の増殖が
擬陽性のブレークスルー(即ち、ペプチド発現に無関係な非遺伝的機構によりタ
キソールに耐性である珍しい細胞)によるものであったクローンをテストして除
去した。タキソール耐性のままであるクローンからのペプチド配列をＲＴ−ＰＣ
Ｒにより救出して、図１Ｂに示すように、テトラサイクリンで調節したレトロウ
イルスベクター(Ｔｒａ)内に再クローニングした。それぞれのタキソール耐性ク
ローンは平均して二つの異なるペプチド配列を救出した。このことは、高度に効
率的な感染が起こっていたことおよび完全ライブラリーは感染および選択の間に
恐らく提供されていたことを示唆する。我々は、それぞれの生存体から唯一つの
ペプチドが耐アポトーシス的効果を潜在的に誘発させる能力を実際に持っていた
ことを期待した。
【０２３９】 これらのペプチドの保護効果を未処理のＨｅＬａ細胞中でクローン原性アッセ
イにより再調査をした。ドキシサイクリン(Ｄｏｘ)の不在下におけるペプチド配
列をＧＦＰレポーターの発現により推論した(図１Ａの構築体を参照)。１５０個
のクローンをテストした。幾つかのペプチドは、目標細胞内に再導入したときに
、Ｄｏｘの存在下(ペプチド発現はオフ)におけるよりはＤｏｘの不在下(ペプチ
ド発現はオン)においてタキソールとチャレンジしたとき、著しくより多くの数
の生存体を与えるところの構築体を与える(図１Ｂ)。コントロールとして、ＧＦ
Ｐのみを発現した細胞は、Ｄｏｘの不在下に比較してＤｏｘの存在下においては
より多くの生存クローンを産生しなかった(データは示していない)。この生存は
タキソールの濃度に依存することが示されたが、薬剤の濃度が高いほどより少な
く生存体が成育した。ＲＧＰ８.５と呼ぶ一個のレトロウイルスクローンのイン
サートをその効果の強度による研究をさらにするために選択した。ＲＧＰ８.５
は４０のアミノ酸ペプチド、ＭＧＥＦＬＩＶＫＶＷＧＲＭＶＣＷＶ−ＬＶＶＲＲ
ＦＶＬＶＩＶＬＥＮＳＬＳＳＮＱＧＰＰ、を含むが、これはフレーム外の停止コ
ドンの使用をひき起こすフレームシフトを含む。
【０２４０】 実施例２：ＲＧＰ８.５、ＭＤＲを与えるペプチド、の特徴づけ実験のプロトコール： 免疫染色およびフローサイトメトリー ２.５×１０5のＨｅｌａ細胞をＰＢＳで
一回洗浄し、それから、０.１%ＢＳＡプラス２０ｍｌのモノクローナルＭＤＲ−
１抗体 (ＵＩＣ２)−フィコエリトリン(ＰＥ)複合体(Immunotech)を含有するＰ
ＢＳ緩衝液８０ｍｌと室温で１５分間インキュベートした。引き続いて、細胞を
ＰＢＳ緩衝液２ｍｌで一回洗浄し、ＰＢＳ緩衝液０.５ｍｌ中に再懸濁しＦＡＣ
Ｓで分析した。
【０２４１】ローダミン１２３エフラックスアッセイ ２.５×１０5のＨｅｌａ細胞を１ｍＭ
ローダミン１２３を含有する無色素ＭＥＭ１ｍＬ中で１５分間３７℃でインキュ
ベートした。細胞を遠心分離し、ローダミン１２３の無いＭＥＭ１ｍＬ中に再懸
濁し、さらに１５分間インキュベートした。ローダミン１２３の保持をＦＡＣＳ
で分析した(Lee, J.S. et al., (1994) Mol. Pharmacol., 46, 627-638)。
【０２４２】細胞増殖アッセイ ｔｅｔアクチベーターの制御下でＲＧＰ８.５ペプチドを発
現する細胞を２００ｎｇ／ｍｌのＤｏｘの添加の有りもしくは無しで２日間生育
した。それから、５×１０3の細胞を９６穴プレートの単一ウエル中に撒いた。
翌日、細胞を２ｍＭＣｓＡの存在下もしくは不在下でタキソールで４８時間処理
した。タキソールで処理した細胞の生存度を細胞増殖キットＩＩ(Cell Prolifer
ation Kit II)(XTT, Boehringer Mannheim)により分析した。
【０２４３】細胞内ＤＮＡ含量のフローサイトメトリー分析 ＲＧ８.５発現細胞を対数期に
おいて生育させた。細胞を収穫し、ＰＢＳで一回洗浄し、そして２％パラホルム
アルデヒド中でｐＨ７.４、４℃において３０分間固定した。１％ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓで洗浄後、細胞を、０.１％クエン酸ナトリウムのｐＨ７.４緩衝液中に２５０
ｍｇ／ｍｌＲＮａｓｅ、５０μｇ／ｍｌＰＩ、０.１％トリトンＸ１００を含有
するＰＩ染色緩衝液中に室温で３０分間再懸濁し、ＦＡＣＳで分析した。
【０２４４】酵母の二ハイブリッドスクリーニング 二ハイブリッドスクリーニングに使用し
たエサは、３個グリシンのリンカー／スペーサーを含むＧａｌ４ ＤＮＡ結合領
域に融合したＲＧＰ８.５であった。複数のヒトの組織(脳、リンパ球、胃、膵臓
、肝臓、腸)の組合せから作ったｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングに用い
た。２億個の形質転換体をスクリーニングした。２７個のＨｉｓ+／ＬａｃＺ+コ
ロニーをさらに分析するために取り出した。
【０２４５】トランスフェクション、免疫沈澱およびウェスターンブロット リン酸カルシウ
ムトランスフェクション法を、テスト構築体の２９３Ｔ細胞内へのトランスフェ
クションの全てに使用した。細胞を、１ｍＭ ＤＴＴおよびプロテアーゼカクテ
ル(Boehringer Mannheim)を補充したＴＮＴ緩衝液(２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ７.５、２００ｍＭ ＮａＣｌおよび１％トリトン−Ｘ１００)２００ｍｌ中で
溶解した。細胞抽出物を３０ｍｌの抗フラグ抗体結合ビーズ(Ｂａｂｃｏ)と共に
４℃でインキュベートした。ビーズを遠心分離し、ＴＮＴ緩衝液８００ｍｌで４
回洗浄した。ビオチニル化ＲＧ８.５ペプチドとの免疫沈澱のために、３×１０
６のＨｅｌａ細胞を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４、１５０ｍＭ塩化ナトリ
ウムおよび１％ＮＰ４０を含有する緩衝液中で溶解させ、ストレプトアビジンカ
ラム(Pierce, Rockford, IL)で予め清浄にして非特異的結合を減少させた。ビオ
チニル化ＲＧ８.５ペプチド(１ｍｇ／ｍｌ)のＤＭＳＯ溶液３ｍｌを細胞溶解物
に添加し４℃で一夜混合させた。それから、ストレプトアビジンアガローズビー
ズ３ｍｌを混合液に加え、４℃で３時間混合させた。ビーズを溶解緩衝液で５回
洗浄した。沈澱したタンパク質を、２倍濃度のタンパク質試料緩衝液中で５分間
９５℃で煮沸することによりビーズより取り離し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分
離した。ウェスターンブロットのために、細胞抽出物１５μｌを５倍濃度のタン
パク質試料緩衝液５ｍｌとインキュベートし、煮沸し、ゲル上で分離してタンパ
ク質レベルを検出した。
【０２４６】 それから、このタンパク質をＰＶＤＦ膜へ転移した。５％の無脂肪ミルクを含
有するPBS-Tween(Calbiochem)中でブロットを阻止し、それから、ウサギの抗Ｇ
ＦＰ(Molecular Probe)、モノクローナル抗フラグ抗体(Kodak)もしくはモノクロ
ーナル抗Ｚｅｔａおよびヒト２０Ｓプロテアソームサブユニットの抗ＸＡＰＣ７
(Affiniti, United Kingdom)と４℃で一夜インキュベートした。洗浄後、ブロッ
トを、ウサギ一次抗体に対するタンパク質Ａ結合ＨＲＰ(Bio-Rad)もしくはマウ
ス一次抗体に対するヤギ抗マウス結合ＨＲＰ(Santa Cruz)で１時間室温でインキ
ュベートした。タンパク質を増強した化学発光基質(Pierce)により視覚化した。
【０２４７】結果： ＲＧＰ８.５ペプチドはＨｅＬａ細胞中でｍｄｒ−１遺伝子発現を上方調節する 発現したペプチドはアポプトシスの既知の調節体上への作用を含めた、種々の
様式でＨｅＬａ細胞の生存を促進するかもしれない。それ故に、我々は、ＲＧＰ
８.５ペプチドを発現する細胞中でＤｏｘの存在下もしくは不在下において、内
因性の抗アポプトシスのタンパク質であるＢｃｌ−２およびＢｃｌ−ＸＬのレベ
ルを検討した。Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ＸＬの両者は、どちらの場合でも同一
の発現レベルに留まり(データは示していない)、ＲＧＰ８.５ペプチド仲介タキ
ソール耐性はこのレベルの抗アポプトシスの経路には関与しないこと示唆する。
かくして、このペプチドは、Ｂｃｌ群タンパク質発現レベルでの直接作用による
よりは異なるレベルで作用する。
【０２４８】 細胞がタキソールに耐性になる一つの様式はＰ−糖タンパク質ＭＤＲ−１の上
方制御によることである。それ故に、我々はｍｄｒ−１遺伝子がペプチド発現構
築体の送達後に上方調節されたかどうかを検討した。我々は、ＲＧＰ８.５ペプ
チドのレトロウイルス発現ベクターを未処理のＨｅＬａ細胞集団中に転移した。
タキソール選択後、耐性クローンをプールした。我々はＦＡＣＳによりＭＤＲ−
１の発現をペプチド発現の関数として(ＧＦＰを代替ペプチド発現指標として用
いて)測定した。図２Ａに示すように、ＭＤＲ−１発現は明らかにＲＧＰ８.５ペ
プチドの発現により調節されている。コントロールのペプチドＲＧＰ８.２およ
びＧＦＰはＭＤＲ−１発現に何の効果も持たなかった。ＲＧＰ８.５.１と呼称さ
れる、ＲＧＰ８.５ペプチドを発現するタキソール耐性クローンを、Ｄｏｘの存
在下および不在下において検討して誘導性のシステムの有効性を実証した。見ら
れるように、ＭＤＲ−１タンパク質の発現はペプチド発現構築体の誘導と高度に
関連している。タキソール耐性表現型を付与する幾らかの他のペプチドの検査に
おいて、他のペプチドはどれも細胞表面におけるＭＤＲ−１タンパク質の誘導を
(ポリクローナルもしくはクローナル検査のどちらによっても)与えなかった。か
くして、我々は、観察されたＭＤＲ−１誘導への効果はインサートの発現による
と結論する。
【０２４９】 我々はテストをして、タキソールのチャレンジに対する生存がＤｏｘ誘導を用
いるペプチド発現の誘導に関連したかどうかを決定した。図２Ｂに示すように、
細胞はドキシサイクリンの不在下で(ペプチド発現をオンにする)タキソール処理
に対して強い耐性を示し、クローンは、４８時間１００ｎＭのタキソール処理の
後でも正常な拡散および生育を保持した。非常に対照的に、ペプチド発現をオフ
にしたときには、細胞はアポプトシスの正常な特徴を示して死滅した(図２Ｂ、
左のパネル)。
【０２５０】 ＭＤＲ−１タンパク質が観察した耐性機構に関与したことを示すために、我々
は、ＭＤＲ−１機能の公知な阻害剤、サイクロスポリンＡ(ＣｓＡ)(Volm, M, (1
998) Anticancer Res., 18, 2905-2917)、を用いてＭＤＲ−１ポンプ機能を薬理
学的に遮断した。レトロウイルス的に送達したペプチドを発現する細胞をＤｏｘ
の添加の有りもしくは無しで２日の間生育した後に、９６穴平板に継代培養した
。それから、細胞を高レベルのＣｓＡと組み合せて４８時間の間タキソールで処
理した。細胞生育に対するＸＴＴアッセイにより、ＣｓＡは薬剤耐性表現型を強
度に抑圧し(図２Ｃ)そしてタキソールで処理すると細胞死に至ることができたこ
とを明らかにした(図２Ｂ)。この結果は、薬剤ポンプ活性はこのクローン中に存
在し、観察した耐性効果に対して主要に寄与するものであったことを示した。
【０２５１】 我々は、この効果をローダミン１２３エフラックスアッセイを用いて視覚的に
確認した。ローダミン１２３、蛍光指示色素、は機能的ＭＤＲ−１タンパク質を
発現する細胞から能動的に汲みだされ、それ故に、ＭＤＲ−１仲介の薬剤エフラ
ックス活性(Krishan, A.., et al., (1997) Cytometry, 29, 279-285)を反映す
る。感染しなかったＨｅＬａ細胞は、ローダミン１２３染色保有により測定する
と(データは示していない)、非常に小さいエフラックスポンプ活性を有する。し
かしながら、ＲＧＰ８.５ペプチドを含むクローンはローダミン１２３を明白に
押し出すことができたしかつ、ペプチド発現をＤｏｘの添加によりオフにしたと
きには、この効果は著しく消滅した(図２Ｄ)。Ｒ６Ｇ，ローダミン１２３の類似
体、をエフラックスアッセイを用いて、我々は、ＧＦＰ陽性集団はポンプ陽性ピ
ークと関連することを見出した(データは示していない)。Ｄｏｘ単独では他のタ
キソール耐性クローンのエフラックス活性に影響しなかったが(データは示して
いない)、これは向上した薬剤ポンプ効果はペプチドの発現に単に依存したこと
を示唆する。
【０２５２】 Ｐ−ｇｐ(ＭＤＲ−１)に加えて、多剤耐性関連タンパク質(ＭＲＰ)および肺耐
性−関連タンパク質(ＬＲＰ) のような他のタンパク質はまた、多剤耐性に包含
されている(Leith, C., (1998) Curr. Opin. Hematol., 5, 287-291)。ＭＲＰタ
ンパク質はＨｅＬａのｔＴＡ細胞株中で発現する。しかしながら、Ｐ−ｇｐと対
照的に、ＲＧＰ８.５ペプチドはこれらの細胞中におけるＭＲＰ発現のレベルに
何の効果も持たない(データは示していない)。以前の研究はまた、ＭＲＰの過剰
発現はタキソールに対する耐性を付与しないことを示唆している(Huang, Y., et
al., (1997) Leukemia, 11, 253-257)。このタキソール耐性クローン中でＬＲ
Ｐの発現は検出されなかった(データは示していない)。このデータを一緒にする
と、ペプチド発現は、ＧＦＰにより示すように、ＭＤＲ１発現と相関しているこ
とが示される。これは、ＲＧＰ８.５ペプチドはｍｄｒ−１遺伝子の調節に投与
量効果を有し、タキソール耐性に至ることを示唆する。それ故に、我々はこれが
起こる機構を決定した。
【０２５３】ＲＧＰ８.５ペプチドはＲＮＡレベルでｍｄｒ−１遺伝子発現を調整する ＲＧＰ８.５ペプチドの効果を解析して、Ｐ−ｇｐ発現がＲＮＡもしくはタン
パク質レベルで調節されるかどうかを決定した。定常状態のｍｄｒ−１ｍＲＮＡ
レベルを半定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いる時間経過実験で検討した。タキソール耐
性細胞を異なる時間間隔でドキシサイクリンと共にインキュベートし、それらの
ＲＮＡの等量をＲＴ−ＰＣＲに用いた。ペプチドを発現する細胞中のｍｄｒ−１
ｍＲＮＡを、コントロールＨｅＬａ細胞中の発現レベルと比較して著しくより高
いレベルで検出した。我々は、ドキシサイクリンを含有する培地中で８時間の間
成育しつつある細胞によりペプチド発現を下方調節した時には、ｍｄｒ−１ｍＲ
ＮＡレベルのレベルが減退したこと(図３、レーン３および４)を観察した。細胞
を７日間以上の間Ｄｏｘに曝露したときには、ｍｄｒ−１ｍＲＮＡは完全に検出
不能であった(図３、レーン５)。しかしながら、Ｄｏｘにより影響されないコン
トロールｍＲＮＡ(チューブリン)は全ての場合に一定のレベルに留まった。これ
は、ＲＧＰ８.５がＭＤＲ−１タンパク質の発現をｍＲＮＡレベルにおいて調節
することを示唆する。
【０２５４】ＲＧＰ８.５ペプチドはインビボでプロテアソームサブユニットと関連する ＲＧＰ８.５ペプチドの細胞性標的タンパク質を同定するために、我々は、エ
サとしてＲＧＰ８.５のペプチド配列に融合したＧａｌ４ ＤＮＡ結合領域を用
いて酵母の二ハイブリッドスクリーニングを実施した。スクリーニングした２億
個の形質転換体から、我々は２6個の陽性クローンを単離し、そのうちの２5個は
プロテアソームアルファ型サブユニットのＸＡＰＣ７をコード化し、残りの一つ
はプロテアソームアルファ型サブユニットのＺｅｔａをコード化した。両方のサ
ブユニットは、プロテアソームの内部チャンバーにアクセスする基質およびプロ
テアソームの他の調節複合体との会合を制御するために必要である(Groettrup,
M. & Schmidtke, G., (1999) Drug Research, 4, 63-71; Kania, M.., et al.,
(1996) Eur. J. Biochem., 236, 510-516)。哺乳動物の細胞中でＲＧＰ８.５ペ
プチドとこれらのサブユニットの間の結合を確認するために、ＧＦＰ−ＲＧＰ８
.５融合体を、フラグタグをつけたＸＡＰＣ７もしくはＺｅｔａと共にＨｅＬａ
細胞内にトランスフェクションを行った。もう一つのコントロールペプチド(Ｍ
ＧＥＦＬＩＶＫＳＧＨＳＳＧＩＰＶＧＶＧＷＣＷＮＳＡＧＧＧＥＦＬＩＶＫＳＧ
ＰＰ)に融合したＧＦＰをコントロールとして使用した。ＲＧＰ８.５とこれらの
プロテアソームサブユニットとの間の相互作用を共免疫沈降およびウエスタンブ
ロットにより解析した。ＧＦＰ−ＲＧＰ８.５融合タンパク質をそれぞれのトラ
ンスフェクションにおいて同一レベルで発現させた(図４Ａ)。ＸＡＰＣ７および
Ｚｅｔａタンパク質に対する抗体はＧＦＰ−ＲＧＰ８.５融合体を引き降ろした(
図４Ａ、レーン２および３)。対照的に、コントロールのＧＦＰ−ＲＧＰ５６.１
融合タンパク質はＸＡＰＣ７もしくはＺｅｔａと共沈澱しなかった(図４Ａ、レ
ーン５および６)。ＧＦＰ−ＲＧＰ８.５発現ベクターをＺｅｔａ発現プラスミッ
ドと共トランスフェクションさせたときには、我々はＧＦＰ−ＲＧＰ８.５融合
タンパク質ペプチドへの修飾を観察した。しかしながら、修飾していない形態の
みがＺｅｔａサブユニットと相互作用をした。
【０２５５】 ＲＧＰ８.５ペプチドが内因性のヒトのプロテアソームサブユニットと結合す
ることをさらに証明するために、ＲＧＰ８.５ペプチドをインビトロで合成し、
生化学カラム用のビーズに結合した。それから、ＨｅＬａ細胞抽出物をこれらの
ビーズの端から端まで通過させて、ＲＧＰ８.５ペプチド結合タンパク質を精製
した。ＸＡＰＣ７およびＺｅｔａタンパク質に対する抗体を用いて、ＲＧＰ８.
５ペプチドが内因性プロテアソームおよびこれらのサブユニットをアフィニティ
ー選択をすることができたかどうかを検出した。図４Ｂに示すように、両方のＸ
ＡＰＣ７およびＺｅｔａサブユニットはＲＧＰ８.５ペプチドに等量で結合する
と示された。かくして、酵母中では遺伝子的にそして哺乳動物細胞中では生化学
的に、我々はＲＧＰ８.５ペプチドとこれらのプロテアソームサブユニットとの
会合を観察する。ＲＧＰ８.５ペプチドに対する抗体
【０２５６】プロテアソーム仲介のタンパク質分解はＭＤＲ−１遺伝子発現を調整する 真核生物の細胞においては、ＮＦ−ｋＢ活性化および細胞サイクル進行のよう
な多くの生化学的に重要な経路は、それらが相互作用をする特異的因子の調節を
経て、ならびにユビキノンの作用を通してのプロテアソーム分解により調節され
る(Chen, Z. et al., (1995) Genes Dev., 9, 1586-1597; Tsurumi, C., et al.
,(1996) Nippon Rinsho, 54, 861-869)。ＲＧＰ８.５がＭＤＲ−１発現を調節し
、哺乳動物細胞中でプロテアソームサブユニットに結合すると仮定して、我々は
、このペプチドがＭＤＲ−１発現の調節に必要な特異的因子のプロテアソーム仲
介分解を阻害することにより機能するかもしれない可能性を検討した。
【０２５７】 ＲＧＰ８.５のプロテアソーム阻害剤活性が、増強したＭＤＲ−１発現の原因
であったことを確認するために、我々は、既知のプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３
２(Lee, D.H. & Goldberg, A.L., (1998) Trends Cell. Biol. ,8, 397-403)の
存在下でＲＴ−ＰＣＲによりＭＤＲ−１ｍＲＮＡのレベルを検査した。ＭＤＲ−
１ｍＲＮＡレベルはＤｏｘの添加によりＲＧＰ８.５ペプチドの発現をオフにし
た後で減少した(図５Ａ、レーン３)。しかしながら、ＭＤＲ−１ｍＲＮＡのレベ
ルは、ＭＧ１３２を培地に添加したときには、同一の条件下で著しく増強した(
図５Ａ、レーン４)。チューブリンコントロールに対するｍＲＮＡレベルはＤｏ
ｘもしくはＭＧ１３２によって影響されなかった。同様な結果が、ＭＧ１３２の
存在下で細胞表面上のＰ−ｇｐタンパク質を検出するＭＤＲ−１抗体を用いて得
られた(図５Ｂ)。これらの結果は、ＲＧＰ８.５がプロテアソームに結合し次い
でプロテアソーム仲介のタンパク質分解を阻害することによりＭＤＲ−１発現を
調整するという仮説を支持する。興味深いことに、このペプチドはＭＧ１３２と
比較すると、ＭＤＲ−１発現レベルを特異的に調節する点でさらに効果的である
。これは多分、ＭＧ１３２がプロテアソーム機能の広範囲な阻害剤であり、そし
てこのペプチドは特定の標的タンパク質が分解されることを阻止するのにさらに
特異的であるかもしれないという事実に因るであろう。
【０２５８】ＲＧＰ８.５ペプチドはプロテアソーム阻害剤活性をしめす ＲＧＰ８.５クローンの発育は我々の実験では遅いものであったが、これは、
細胞の生理機能上でペプチドのより広範な影響があることを示唆する。我々はこ
れらの実験の間に、組み入れたウイルスの発現を失ったＧＦＰ陰性集団はＧＦＰ
陽性集団よりも速い生育速度を持っていたことを観察した。これは、ペプチドが
細胞の生育に陰性の影響を持ったこと(データは示していない)を示唆する。この
効果は、ＩＲＥＳ下にＧＦＰをまた発現する他のクローンはこの表現型を示さな
かったので、ＧＦＰの発現に因るものではない。我々は、ライブラリーからの他
の殆んどのペプチドの細胞への送達は、それ自体は、観察可能な細胞の生理機能
に陰性的に影響しないことを観察しているけれども、プロテアソーム機能に作用
するペプチドは細胞の生育に悪影響を及ぼすかもしれないことが考えられた。
【０２５９】 プロテアソーム活性を阻害する薬剤は細胞サイクル進行に影響すると示されて
いる(Machiels, B.M. et al., (1997) Cytometry, 28, 243-252; Wojcik, C., e
t al., (1996) Eur. J. Cell Biol., 70, 172-178)。ｐ２１およびサイクリンＢ
のような多くの細胞サイクル調節因子は極度に不安定であり、細胞サイクルの間
にプロテアソーム仲介のタンパク質加水分解により制御されるところの細胞内レ
ベルを迅速に変化させる(Blagosklonny, M.V.,et al., (1996) Biochem. Biophy
s. Re.s. Commun., 227, 564-569; Shirane, M. et al., (1999) J. Biol. Che
m., 274, 3886-3893)。２６ＳプロテアソームによるサイクリンＢの分解は、細
胞サイクルが中期から後期へトランジションするために必要である(Parekh, H.,
et al., (1997) Biochem. Pharmacol., 53, 461-470)。プロテアソーム仲介の
タンパク質分解の阻害へのＲＧＰ８.５ペプチドの効果をさらに実証するために
、我々は、ＲＧＰ８.５を発現するおよび発現しない細胞中において内因性サイ
クリンＢタンパク質のレベルを比較した。サイクリンＢはＧ２／Ｍでピークに達
すると知られている。図６Ａに見られるように、ＲＧＰ８.５ペプチドを発現す
る細胞は、ＲＧＰ８.５ペプチドを欠いたＧＦＰ陰性細胞と比較するとサイクリ
ンＢタンパク質のレベルを僅かに上昇させていた。コントロールとして、我々は
、内因性ｈｓｐ７０タンパク質はＲＧＰ８.５ペプチドの発現に無関係に同一レ
ベルで発現することを見ている。
【０２６０】 ペプチド効果のさらに感受性のアッセイは、それ故に、細胞サイクルの分析で
あり得たが、そこでは調節タンパク質のレベルにおける僅かな変動がさらに劇的
な遠位細胞の表現型に至るかも知れない。細胞サイクル分析により、ＲＧＰ８.
５ペプチドを持つ細胞はＧ２／Ｍで蓄積することを確認した(図６Ｂ)。これは、
ＲＧＰ８.５がプロテアソームの活性を減衰させて、サイクリンＢタンパク質の
幾らかの蓄積をもたらし、それ故に、細胞サイクルの進行を穏やかに阻止するこ
とを強く示唆する。ペプチドが我々のスクリーニングで選択されているためには
、細胞サイクルへのこの効果は適度でなければならない。このペプチドは、それ
故に、後の実験で探求され得るところのプロテアソーム特異性を持つ興味あるク
ラスの阻害剤を潜在的に規定する。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 ペプチドライブラリースクリーニングを示す。
【図１Ｂ】 ペプチドＲＧＰ８.５で感染したＨｅＬａ細胞のクローン原性
生存アッセイにおける増強された生存を示す。
【図２Ａ】 ＲＧＰ８.５ペプチドを発現しているタキソール耐性ＨｅＬａ
細胞を示す。
【図２Ｂ】 ＨｅＬａ細胞中におけるベクター誘導の脱抑制後のタキソール
耐性を示す。
【図２Ｃ】 ＣｓＡによるＭＤＲ−１ポンプ阻害がＲＧＰ８.５ペプチドの
活性に拮抗することを示す。
【図２Ｄ】 ＲＧＰ８.５ペプチドを発現するＨｅＬａ細胞クローンのロー
ダミン１２３エフラックスアッセイを示す。
【図３】 ＲＧＰ８.５ペプチドを発現しているＨｅＬａ細胞クローンのｍ
ｄｒ１ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ解析を示す。
【図４Ａ】 細胞中の発現されたＲＧＰ８.５とプロテアゾームサブユニッ
トとの会合を示す。
【図４Ｂ】 ＲＧＰ８.５のアフィニティーカラムを用いたプロテアゾーム
サブユニットの精製を示す。
【図５Ａ】 ＲＧＰ８.５ペプチドを発現しているＨｅＬａクローンのｍｄ
ｒ１ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ解析を示す。
【図５Ｂ】 ＭＧ１３２によるプロテオゾーム阻害がＭＤＲ−１発現を誘導
することを示す。
【図６Ａ】 ＲＧＰ８.５ペプチドを発現するＨｅＬａクローン中のＧＦＰ
、ｈｓｐ７０およびサイクリンＢタンパク質の内在性レベルのウエスタンブロッ
ト解析を示す。
【図６Ｂ】 ＲＧ８.５ペプチドを発現する細胞の細胞サイクル分析を示す
。
【図７】 ＲＧＰ８．５のアミノ酸配列(配列番号１)およびＲＧＰ８.５の
ヌクレオチド配列(配列番号２)を示す。
【図８Ａ】 プロテアゾームサブユニットＸＡＰＣ７のヌクレオチド配列(
配列番号３、ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＡＦＯ２２８１５)を示す。
【図８Ｂ】 プロテアゾームサブユニットＸＰＡＣ７のアミノ酸配列(配列
番号４、ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＡＡＢ８１５１５)を示す。
【図８Ｃ】 プロテアゾームサブユニットＺｅｔａのヌクレオチド配列(配
列番号５、ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＮＭ＿００２７９０)を示す。
【図８Ｄ】 プロテアゾームサブユニットＺｅｔａのアミノ酸配列(配列番
号６、ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＮＭ＿００２７８１)を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/00 Ｃ０７Ｋ 14/00 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ， ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB02 DA12 DA13 DA36 DA78 FB02 4B024 AA11 BA80 CA05 DA02 EA02 GA11 HA12 4B063 QA01 QA18 QQ08 QQ20 QR41 QR77 QR80 QS24 QS28 QS36 4C084 AA16 DC32 DC50 4C086 BA02 4H045 BA10 BA19 EA51 FA34 FA58 FA74 【要約の続き】

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 細胞に多薬剤耐性を与えるＲＣペプチドのスクリーニング方
    法であって、以下の各段階：a)無作為化した候補ペプチド群をコードするレトロ
    ウイルスベクター群の分子ライブラリーを細胞集合体中で発現させる段階、但し
    、該ペプチド群は、異なるペプチド配列群を有する；b)該細胞集合体から、多薬
    剤耐性形質を示す細胞をスクリーニングする段階、但し、該多薬剤耐性は、該ペ
    プチドにより与えられるものである、を含む方法。
  2. 【請求項２】 さらに、c)該多薬剤耐性形質を示す細胞を単離する段階を含
    む、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 さらに、d)該細胞からＲＣペプチドを単離する段階を含む、
    請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 さらに、e)ＲＣペプチドをコードする核酸を該細胞から単離
    する段階を含む、請求項２に記載の方法。
  5. 【請求項５】 さらにf)該ＲＣペプチドを用いて標的分子を同定する段階を
    含む、請求項２または請求項３に記載の方法。
  6. 【請求項６】 該ライブラリーを該細胞中で発現させるためにレトロウイル
    スベクターを用いる、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 該細胞が哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 該哺乳動物細胞が癌細胞である、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 該癌細胞がＨｅＬａ細胞である、請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 該スクリーニングが、化学療法化合物で細胞を処置するこ
    とを含む、請求項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 該化学療法化合物がタキソールである、請求項１０に記載
    の方法。
  12. 【請求項１２】 配列番号１に示す配列と少なくとも９０％の配列同一性を
    有するＲｃペプチド。
  13. 【請求項１３】 配列番号１に示すアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載
    のＲｃペプチド。
  14. 【請求項１４】 ＰＲＰタンパク質との結合能があるバイオ活性物生のスク
    リーニング方法であって、該ＰＲＰタンパク質を候補のバイオ活性物生と結合さ
    せ、そして該候補物生と該ＰＲＰタンパク質との結合を測定することを含む方法
    。
  15. 【請求項１５】 該方法がさらに：c)該物生の存在下および非存在下で、該
    ＰＲＰタンパク質と配列番号１のペプチドとを接触させること、および、d)該物
    生の存在下に該ペプチドと該ＰＲＰタンパク質の結合の減少を検出し、それによ
    り医薬品の候補を同定すること、を含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 ＰＲＰタンパク質活性の調節能があるバイオ活性物生のス
    クリーニング方法であって、以下の各段階：a)候補のバイオ活性物生を細胞集合
    体に加えること、但し、該各細胞はＰＲＰタンパク質を発現するものである；b)
    化学療法化合物を該集合体に加えること；および、c)候補のバイオ活性物生の該
    化学療法化合物に対する耐性への効果を測定すること、を含む方法。
  17. 【請求項１７】 該ＰＲＰタンパク質がＸＡＰＣ７である、請求項１４、請
    求項１５、または請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 該ＰＲＰタンパク質がＺｅｔａである、請求項１４、請求
    項１５、または請求項１６に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 ＰＲＰタンパク質をコードする組換え核酸を含む細胞の集
    合体に、候補のバイオ活性物生群のライブラリーを加える、請求項１６に記載の
    方法。
  20. 【請求項２０】 ＰＲＰタンパク質のモジュレーターを患者に投与すること
    を含む、多薬剤耐性関連疾患の処置法。
  21. 【請求項２１】 該ＰＲＰタンパク質がＸＡＰＣ７である、請求項２０に記
    載の方法。
  22. 【請求項２２】 該ＰＲＰタンパク質がＺｅｔａである、請求項２０に記載
    の方法。
  23. 【請求項２３】 該疾患が癌である、請求項２０に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 該方法がさらに化学療法薬を共に投与することを含む、請
    求項２０に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 該薬がタキソールである、請求項２４に記載の方法。
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