DE19805229A1 - Verfahren zur Messung der Apoptose - Google Patents
Verfahren zur Messung der ApoptoseInfo
- Publication number
- DE19805229A1 DE19805229A1 DE19805229A DE19805229A DE19805229A1 DE 19805229 A1 DE19805229 A1 DE 19805229A1 DE 19805229 A DE19805229 A DE 19805229A DE 19805229 A DE19805229 A DE 19805229A DE 19805229 A1 DE19805229 A1 DE 19805229A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- cells
- apoptosis
- dna
- apoptotic
- plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2510/00—Detection of programmed cell death, i.e. apoptosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet biologischer
Testmethoden.
Die Apoptose oder der programmierte Zelltod
("programmed cell death", PCD) ist ein genetisch
gesteuerter zellulärer Selbstmordmechanismus zur
selektiven Aussonderung unerwünschter Zellen (1-4).
PCD ist in einer Vielzahl biologischer Prozesse,
einschließlich der Embryonal- und der Neural-
Entwicklung, der Regulierung des Immunsystems, der
Organogenese, der Gewebshomöostase und der Verhinderung
von Erkrankungen wie Tumorwachstum und Virusinfektion,
ein unbedingt erforderlicher Prozeß. Apoptose ist
gekennzeichnet durch Blasenbildung der Plasmamembran,
Schrumpfen der Zellen, Kondensation des Kerns,
endonukleolytische Spaltung von genomischer DNA in
Fragmente internukleosomaler Länge sowie Ausbildung
apoptotischer Körper.
Die zur Zeit verfügbaren Methoden zur Untersuchung der
Apoptose beruhen auf der Beurteilung morphologischer
Veränderungen auf zellulärer Ebene mittels Licht-,
Elektronen- oder Zeitraffer-Mikroskopie in Verbindung
mit Fluoreszenz-Vitalfarbstoffen, der Verwendung von
Annexin V, mittels dem der Verlust der
Membranphospholipid-Assymetrie während der Apoptose
verfolgt werden kann (7), oder bestehen in Assays zum
Nachweis der DNA-Fragmentierung mittels
Gelelektrophorese (8) oder mittels in situ Markierung
von DNA-Strangbrüchen ("nick-end-Markierung") (TUNEL)
(9).
Um die Wirkung von Genen, die eine Rolle bei der
Apoptose spielen, mittels transienter Transfektions-
Analysen zu untersuchen, sind jedoch die meisten dieser
Methoden entweder ungeeignet oder, im Fall der
TUNEL-Methode, zu teuer und zu aufwendig.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde,
ein neues Verfahren zur Messung der Apoptose
bereit zustellen, das die Nachteile der bekannten
Methoden beseitigt.
Diese Aufgabe wurde durch ein Verfahren für die Messung
der Apoptose gelöst, welches dadurch gekennzeichnet
ist,
- A) daß man eine Population von Säugetierzellen
transient transfiziert
- ai) mit einem Plasmid, enthaltend eine interessierende DNA-Sequenz, von der bestimmt werden soll, ob sie bzw. das davon exprimierte Polypeptid eine pro- oder anti-apoptotische Wirkung hat,
- aii) oder mit einem Plasmid, enthaltend eine interessierende DNA-Sequenz, von der bestimmt werden soll, ob bzw. durch welche Substanzen ihre pro- oder anti-apoptotische Wirkung bzw. die Wirkung des davon exprimierten Polypeptids modulierbar ist,
- b) und mit einem Plasmid, enthaltend eine für ein fluoreszierendes Markerprotein kodierende DNA,
- B) daß man die Zellen in einem geeigneten Nährmedium, gegebenenfalls in Gegenwart einer Testsubstanz, solange inkubiert, bis die interessierende DNA-Sequenz bzw. das exprimierte Polypeptid seine potentielle Wirkung auf die Apoptose ausgeübt hat,
- C) daß man die Zellen erntet und fixiert, so daß das fluoreszierende Protein in den Zellen verbleibt, während die bei der Apoptose entstehenden DNA-Fragmente aus den Zellen diffundieren können,
- D) daß man mittels Messung des DNA-Gehalts den Anteil der apoptotischen Zellen bestimmt,
- E) daß man mittels Messung der Zellen mit fluoreszierendem Markerprotein den Anteil der transfizierten Zellen bestimmt,
- F) und daß man durch Vergleich der in Schritt D und E erhaltenen Werte den Anteil der apoptischen Zellen in der transfizierten Subpopulation der Zellen bestimmt.
Unter die Bezeichnung "interessierende DNA-Sequenz" (im
folgenden auch als "Apoptose-Testgen" bezeichnet)
fallen sämtliche DNA-Sequenzen, die als solche oder
deren translatierte Produkte direkt oder indirekt
Apoptose beeinflussen. Beispiele für Apoptose
stimulierende Gene sind p53, bax, E1A, Beispiele für
Apoptose hemmende Gene sind bcl-2, bcl-x, E1B 19K, zur
letzteren Gruppe zählen auch die sog.
Überlebensfaktoren wie Insulin-ähnliche
Wachstumsfaktoren (IGFs). Derartige Apoptosegene und
ihre Wirkung wurden in Übersichtsartikeln beschrieben
(z. B. 4, 23, 24).
Bei dem Apoptose-Testgen kann es sich um bekannte oder
unbekannte Gene oder Fragmente davon handeln. Unter
Beeinflussung der Apoptose werden sowohl Induktion und
Verstärkung als auch Blockierung und Abschwächung der
Apoptose verstanden.
Die erfindungsgemäße Methode erlaubt eine große
Variabilität, z. B. hinsichtlich der für die Bestimmung
der transfizierten Zellen bzw. für die Apoptose
verwendeten Marker, hinsichtlich der Plasmide und der
für die Transfektion der Zellen eingesetzten
Transfektions-Methode.
Die erfindungsgemäße Methode weist als eines ihrer
wesentlichen Elemente ein fluoreszierendes
Markerprotein auf, das als Nachweis für die transiente
Transfektion der Zellen dient.
Bevorzugt ist als Markerprotein das Green Fluorescent
Protein (GFP). GFP-Mutanten, die im Hinblick auf die
FACS-Analyse optimiert und für die Anwendung im Rahmen
der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind
literaturbekannt. Ein Beispiel für eine geeignete
GFP-Mutante wurde in (10) beschrieben ("enhanced Green
Fluorescent Protein", eGFP); es können jedoch im Rahmen
der vorliegenden Erfindung auch andere Mutanten
verwendet werden, die die Bedingung erfüllen, daß sie
den Zellmetabolismus nicht beeinflussen, daß sie
intrazellulär lokalisiert bleiben und daß sie ein
meßbares Fluoreszenzsignal liefern, insbesondere daß
sie mittels derzeit gängiger fluoreszenzaktivierter
Durchflußzytometrie-Methoden (Fluorescent Activated Cell
Sorting (FACS)) meßbar sind.
Außer dem Green Fluorescent Protein (GFP) können auch
andere fluoreszierende Markerproteine verwendet werden.
Beispiele dafür sind Blue Fluorescent Protein (BFP)
(26) und Yellow Fluorescent Protein (YFP) (25).
Wesentlich für die Eignung eines Markerproteins für die
Verwendung in der erfindungsgemäßen Methode sind die
oben für GFP-Mutanten angeführten Eigenschaften.
Potentielle Markerproteine sowie Art und Menge der im
Assay einzusetzenden dafür kodierenden Plasmide sowie
die am besten geeignete Transfektionsmethode können
z. B. wie folgt getestet werden: die für die
Markerproteine kodierenden Plasmide werden transient in
Säugerzellen transfiziert, zweckmäßig in dieselben
Zellen und unter denselben Bedingungen, mit denen die
erfindungsgemäße Methode durchgeführt werden soll. Die
Eignung der tranfizierten Markerproteine wird durch
Meßreihen ermittelt, in denen Transfektionseffizienz
und die Effizienz der reproduzierbaren Meßbarkeit durch
FACS-Analyse bestimmt werden.
Als Marker für die Apoptose dient ein DNA-bindender
Farbstoff, z. B. Propidiumjodid (PI), der in der
apoptotischen Subpopulation eine Verringerung der
Fluoreszenz herbeiführt (14-17). Diese
Nachweisweismethode beruht auf dem Prinzip, daß die
genomische DNA in Zellen während der Apoptose
endonukleolytisch abgebaut wird. Die kleinen
DNA-Fragmente diffundieren aus der Zelle; die Verringerung
des DNA-Gehalts auf weniger als den doppelten
Chromosomensatz ("sub-2N") ist ein Kennzeichen
apoptotischer Zellen.
Die verringerte Fluoreszenz von PI in Zellen, die
Apoptose durchmachen, resultiert im Erscheinen eines
charakteristischen Fluoreszenzpeaks ("sub-2N-Peak") im
Bereich der G0/G1-Region des Zellzyklus.
Statt Propidium-Jodid können auch andere DNA-bindende
Farbstoffe verwendet werden. Vertreter geeigneter
Farbstoffe dieses Typs sind kommerziell erhältlich,
z. B. DAPI (4',6'-Diamidino-2-phenylindol),
Acridinorange, Ethidiumbromid. Der am besten geeignete
Farbstoff kann ermittelt werden, indem Zellen zur
Apoptose angeregt werden und anschließend mittels FACS-
oder mikroskopischer Analyse ermittelt wird, ob
Apoptose mit dem Farbstoff-Kandidaten reproduzierbar
gemessen werden kann.
Einer der Vorteile der erfindungsgemäßen Methode
besteht darin, daß die Messung der Fluoreszenz des
Markerproteins und des DNA-Gehalts gleichzeitig
erfolgen kann, vorzugsweise mittels FACS-Analyse.
Geeignete Geräte sind im Handel erhältlich.
Die Erfindung ist auf sämtliche Säugerzellen anwendbar,
die kultivierbar sind. Für den Fachmann ist es Routine,
die handelsüblichen FACS-Geräte auf unterschiedliche
Zelltypen einzustellen.
Für die Transfektion der Zellen mit Markergen
einerseits und interessierendem Gen andererseits sind
sämtliche Vektoren geeignet, die in Säugerzellen
effizient und reproduzierbar Expression herbeiführen.
Beispiele für die zahlreich zur Verfügung stehenden,
auch kommerziell erhältlichen Vektoren, enthalten
regulatorische Sequenzen mit der Fähigkeit, in einer
Vielzahl von Säugerzellen hohe Expressionsraten zu
erzielen. Beispiele sind Vektoren, die den
CMV-(Cytomegalievirus), den SV40-(Simianvirus),
MSV (Moloney Sarcoma Virus)-Promotor oder andere
starke, zelltypunspezifische Promotoren enthalten.
Als Träger für Markergen und interessierendes Gen
können identische oder verschiedene Vektoren verwendet
werden; es kann in Abhängigkeit vom Zelltyp vorteilhaft
sein, Vektoren mit unterschiedlichen Promotoren zu
verwenden, um eine Konkurrenz der Promotoren bei der
Transkription zu vermeiden.
Bezüglich der Transfektions-Methoden ist die Erfindung
keinen Beschränkungen unterworfen; es können
prinzipiell sämtliche für die transiente Transfektion
von Säugetierzellen bekannten Methoden verwendet
werden, z. B. Calciumphosphat, kommerziell erhältliche
kationische Lipide wie Lipofectamin oder Transfectam,
Methoden auf der Grundlage der rezeptorvermittelten,
Adenovirus-unterstützten Endozytose, wie z. B. in der
WO 93/0783 beschrieben, z. B. mittels Polyethylenimin
und Psoralen/UV inaktiviertem Adenovirus, wie auch
in (21) beschrieben. Die Transfektionsmethode kann
mittels Reihenversuchen, in denen hinsichtlich
Transfektionsbedingungen, Zelltyp, Nährmedium etc.
variiert wird, optimiert werden, indem mit einem
fluoreszierenden Markerprotein transfiziert und die
Expression des Proteins mittels FACS-Analyse bestimmt
wird. Die für das Markerprotein optimierten Bedingungen
werden für die Co-Transfektion mit dem interessierenden
Gen verwendet.
Im Anschluß an die Transfektion werden die Zellen in
einem geeigneten Nährmedium, das an den jeweiligen
Zelltyp angepaßt wird, inkubiert. Gegebenenfalls werden
die Zellen zur Apoptose stimuliert, insbesondere wenn
das Apoptose-Testgen auf eine Hemmung der Apoptose
untersucht werden soll. Geeignete Apoptose Stimuli sind
literaturbekannt und im Handel erhältlich, Beispiele
dafür sind Staurosporin, Daunomycin, Etoposid. Die
Inkubationsbedingungen sowie die Zweckmäßigkeit eines
Apoptose-Stimulans werden in Vorversuchen ermittelt.
Wesentlich für die Inkubation, insbesondere für deren
Dauer ist, daß Apoptose in einem Ausmaß stattgefunden
hat, welches ermöglicht, daß eine Änderung
meßtechnisch, z. B. mittels FACS-Analyse, erfaßt werden
kann.
Wesentlich für die Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens ist der anschließend an die Inkubation
vorgenommene Fixierungsschritt.
Wesentliche Anforderung an die Fixierung ist, daß die
Bedingungen so gewählt werden, daß die bei der Apoptose
entstehenden, kleinen subgenomischen
DNA-Fragmente (internukleosomale Fragmente, d. h. solche mit
einer Größe von ca. 200 bp und einem Vielfachen davon)
aus den apoptotischen Zellen diffundieren können,
gleichzeitig aber das fluoreszierende Markerprotein in
der Zelle verbleibt. Bei den bisher verfügbaren
Methoden war die Kombination dieser Messungen nicht
möglich, weil die Anforderungen an die Fixierung im
Hinblick auf Messung des fluoreszierenden
Markerproteins einerseits und Messung des DNA-Inhalts
der Zellen andererseits diametral entgegengesetzt waren
und daher unvereinbar schienen. Die vorliegende
Erfindung ermöglicht es erstmals, mit Hilfe eines
geeigneten Fixierungsschritts beide Messungen in
derselben Zellpopulation durchzuführen.
Um die geeigneten Fixierbedingungen zu ermitteln, wird
zweckmäßig wie folgt vorgegangen: Zunächst werden die
einerseits für die Messung der Fluoreszenz des
Markerproteins (starke Fixierung) und andererseits die
für die Messung des DNA-Gehaltes der Zellen (möglichst
schwache Fixierung) optimalen Fixierbedingungen
unabhängig voneinander ermittelt. Ausgehend von den
Bedingungen, mit denen die maximalen Meßwerte erhalten
werden, werden die Fixierungsbedingungen hinsichtlich
der Reagentien (Fixierungsreagens, Salze, Puffer),
deren Konzentration sowie der Fixierungszeit so
verändert, daß bei gleichzeitiger Vornahme beider
Meßvorgänge die Effizienz möglichst wenig
beeinträchtigt wird.
Bevorzugt wird die Primärfixierung mit Paraformaldehyd
und die anschließende Behandlung
(Sekundärfixierung/Permeabilisierung) mit Ethanol
durchgeführt; diese Behandlung hat sich im Rahmen der
durchgeführten Versuche als am besten geeignet
erwiesen. Die Vorfixierung mittels 1 bis 4% (w/v),
insbesondere 2% Paraformaldehyd findet in einer
isotonischen, gepufferten Salzlösung statt. Geeignet
sind z. B. Standardlösungen wie 100 mM NaCl, 3 mM MgCl2,
300 mM Saccharose sowie handelsübliche physiologisch
verträgliche Puffer.
Statt Paraformaldehyd können auch andere Reagenzien,
wie sie üblicherweise, z. B. in der Immunhistochemie,
eingesetzt werden verwendet werden. Beispiele für
gängige Fixiermittel, die einschlägigen Handbüchern
(27) entnommen werden können, sind Formaldehyd oder
Chloroform/Aceton.
Statt Ethanol, das sich unter den in den durchgeführten
Versuchen gewählten Bedingungen für die
Sekundärfixierung im Anschluß an die Primärfixierung
mit Paraformaldehyd als besonders geeignet erwiesen
hat, können grundsätzlich andere Reagentien, die eine
schwache Permeabilisierung der Zellmembran ermöglichen,
verwendet werden, wie z. B. Detergentien.
Die transiente Expression von Genen, die Apoptose
modulieren, zum Beispiel Bcl-Familienmitglieder oder
Komponenten der Überlebensfaktor-Signaltransduktion,
und die anschließende quantitative Analyse der Apoptose
mittels der erfindungsgemäßen Methode erlauben es,
chemische Verbindungen darauf zu testen, ob sie in der
Lage sind, spezifisch die Funktion der Apoptose-
modulierenden Gene zu beeinflussen.
Die erfindungsgemäße Methode kann durch entsprechende
apparative Anpassungen, z. B. der Probenpräparation und
der FACS-Analyse, automatisiert werden, was sie für
Messungen im großen Maßstab, z. B. in High Throughput
Screening-Methoden, geeignet macht.
Die Methode in dieser Form findet Anwendung bei der
Identifizierung pharmazeutisch wirksamer Substanzen,
die Apoptose in Abhängigkeit der Expression bestimmter
Gene (Apoptose-Testgene) modulieren können. Dabei wird
das Gen, dessen Wirkung auf Apoptose durch die
Testsubstanz moduliert werden soll, transient in
Testzellen transfiziert und die Testzellen mit einer
Testsubstanz aus einem Vorrat von Substanzen inkubiert.
Die modulierende Wirkung einer Testsubstanz auf die
Aktivität des Testgens wird direkt meßtechnisch erfaßt.
Derartige Methoden können für folgende Screening-
Anwendungen eingesetzt werden:
- a) Suche nach Inhibitoren von Überlebensfaktoren und ihrer Signaltransduktion, sowie Inhibitoren von anti apoptotischen Genprodukten in Tumorzellen; b) Suche nach Chemikalien, die in Tumorzellen synergistisch mit Chemotherapie bestimmte Überlebensfaktoren und ihre Signaltransduktion inhibieren; c) Suche nach Chemotherapeutika, die mit der Inhibierung von Überlebensfaktoren synergistisch wirken.
In einer Ausführungsform wird die erfindungsgemäße
Methode in einem Screeningverfahren verwendet, um die
Wirkung von tumorzelleigenen Überlebensfaktoren
(Rezeptorliganden wie IGF-I, IGF-II, FGFs (Fibroblast
Growth Factors), PDGFs (Platelet Derived Growth
Factors) auf die Apoptose zu untersuchen, wie sie durch
die Aktivierung der entsprechenden Rezeptoren durch
diese Faktoren und die darauffolgende Signalkaskade
vermittelt wird. Das Assayverfahren kann in einem
Screening eingesetzt werden, um die Wirkung
natürlicher, bekannter oder gegebenenfalls noch zu
identifizierender Überlebensfaktoren im Hinblick auf
eine Tumortherapie, im Zuge derer die Apoptose von
Tumorzellen verstärkt werden soll, zu modulieren. Ziel
eines solchen Verfahrens ist es vor allem, Substanzen
zu identifizieren, die bezüglich der Apoptose
synergistisch mit der Inhibierung von tumorspezifischen
Überlebensfaktoren wirken.
Um derartige Wirksynergismen zu ermitteln, kann wie
folgt vorgegangen werden:
Es werden, ausgehend von Tumorzellen, Testzellen hergestellt, in denen die Überlebensfaktorfunktion inhibiert wird, indem in die Zellen DNAs, kodierend für dominant-negative Versionen von Rezeptoren der Überlebensfaktoren oder für dominant-negative Signalübertragungsmoleküle solcher Rezeptoren eingeführt und exprimiert werden. Beispiele für Rezeptoren sind der IGF-1-Rezeptor (29), FGF-Rezeptoren (30), PDGF-Rezeptoren (31), Rezeptoren der EGF-Wachstumsfaktoren (32; EGF-Rezeptor, Her-2/neu/ErbB-2, ErbB-3, ErbB-4). Beispiele für Signalübertragungsmoleküle sind Ras, Raf, Phosphoinositol(3)Kinase (=PI(3)-Kinase), MAP-Kinasen, Proteinkinase TypB und TypC, Phospholipase C, ferner Adaptormoleküle wie Shc, Grb-2 (33; 34; 35; 36; 37).
Es werden, ausgehend von Tumorzellen, Testzellen hergestellt, in denen die Überlebensfaktorfunktion inhibiert wird, indem in die Zellen DNAs, kodierend für dominant-negative Versionen von Rezeptoren der Überlebensfaktoren oder für dominant-negative Signalübertragungsmoleküle solcher Rezeptoren eingeführt und exprimiert werden. Beispiele für Rezeptoren sind der IGF-1-Rezeptor (29), FGF-Rezeptoren (30), PDGF-Rezeptoren (31), Rezeptoren der EGF-Wachstumsfaktoren (32; EGF-Rezeptor, Her-2/neu/ErbB-2, ErbB-3, ErbB-4). Beispiele für Signalübertragungsmoleküle sind Ras, Raf, Phosphoinositol(3)Kinase (=PI(3)-Kinase), MAP-Kinasen, Proteinkinase TypB und TypC, Phospholipase C, ferner Adaptormoleküle wie Shc, Grb-2 (33; 34; 35; 36; 37).
Geeignete Rezeptormutanten sind dadurch
charakterisiert, daß die funktionellen Domänen des
Rezeptors derart modifiziert sind, daß der Rezeptor
zwar den Liganden bindet, aber diese Bindung nicht mehr
in der Aktivierung der Signalkaskade resultiert. Im
Fall des IGF-1R handelt es sich bei der Modifikation um
das vollständige Fehlen der Rezeptorkinasedomäne oder
um eine Mutation der ATP-Bindungsstelle (28).
Signalübertragungsmoleküle können verändert werden,
indem die für die Übermittlung des Signals notwendige
Domäne, z. B. die katalytische Domäne eines Enzyms oder
die Proteinbindungstelle eines Adaptormoleküls, durch
Mutation inaktiviert wird.
Die für den Einsatz in einem Screen vorgesehenen
Mutanten werden in Vorversuchen auf ihre
apoptoseinduzierende bzw. -verstärkende Wirkung in
Testzellen (z. B. Fibroblastenzellinien, die durch
Transfektion mit dem jeweiligen Wildtyp-Rezeptor
faktorabhängig gemacht wurden) nach gängigen Methoden
in Serienversuchen optimiert, indem die Mutanten in die
Testzellen transfiziert werden und das Ausmaß der
Apoptose der Testzellen mittels der erfindungsgemäßen
Methode gemessen wird. Die jeweiligen funktionellen
Domänen der Mutanten werden erforderlichenfalls mittels
gängigen molekularbiologischen Methoden weiter
verändert, bis eine optimale Inhibierung des
Wildtyprezeptors und seiner darauffolgenden
Signalübertragung und damit ein maximales Ausmaß an
Apoptpose der Testzellen erreicht wird.
Im Screen werden die Testzellen mit bekannten
Chemotherapeutika oder mit Substanzen aus einem Pool,
die hinsichtlich ihrer potentiellen
chemotherapeutischen Wirkung untersucht werden sollen,
inkubiert und die Wirkung auf Apoptose mit der
erfindungsgemäßen Methode untersucht. Insbesondere ist
es Ziel eines solchen Screens, eine synergistische
Wirkung zwischen der Inhibierung bzw. dem Fehlen der
Überlebensfaktorfunktion in Tumorzellen und bekannten
Chemotherapeutika oder potentiell chemotherapeutisch
wirksamen Substanzen zu ermitteln.
Um mit dem Screeningverfahren Substanzen zu finden, die
den Synergismus mit der Inhibierung der
Überlebensfaktorfunktion spezifisch für bestimmte
Tumorarten aufweisen, können in einem parallelen
Screening Testzellen, die von unterschiedlichen
Tumorarten abgeleitet sind, unter ansonsten identischen
experimentellen Bedingungen eingesetzt werden.
Als Kontrollzellen für die Spezifität der
synergistischen Wirkung zwischen dem Fehlen der
Überlebensfaktorfunktion und der Chemotherapie werden
Zellen verwendet, denen natürlicherweise diejenige
Überlebensfaktorfunktion fehlt, deren Inhibierung im
Assay ermittelt werden soll.
Es ist jedoch grundsätzlich auch möglich, nach
Substanzen zu suchen, die die Wirkung von
apoptoseinduzierenden oder -verstärkenden Molekülen
erhöhen. Beispiele dafür sind Mitglieder der
TNF-Rezeptorfamilie (TNF-Rezeptoren, Fas) und Moleküle
ihrer Signalübertragungswege (Caspasen). Das
Testprinzip ist identisch wie für die apoptosehemmenden
Überlebensfaktoren, mit dem Unterschied, daß Wildtyp-
oder konstitutiv aktive Versionen dieser
Apoptosemoleküle in den Tumorzellen exprimiert werden.
Schwerpunkt der Anwendung in Screeningverfahren ist
somit die Suche nach Synergismen, die zu einer
Verstärkung der Tumorzellapoptose führen. Damit wird
die Voraussetzung für Therapieansätze geschaffen, in
denen bei gleichzeitiger Inhibierung der
Tumorzellüberlebensfunktion die Dosis von
Chemotherapeutika signifikant reduziert werden kann,
ohne den Therapieerfolg zu beeinträchtigen. Die
Herabsetzung der chemotherapeutischen Dosis bringt für
den Patienten entscheidende Vorteile, weil dadurch die
toxischen Begleiterscheinungen der Chemotherapie stark
vermindert werden können.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde mit Hilfe
der erfindungsgemäßen Methode untersucht, ob das durch
den Überlebensfaktor IGF-II vermittelte Signal, welches
das Überleben von β-Tumorzellen bewirkt, durch den
IGF-Rezeptor übermittelt wird. Zu diesem Zweck wurde
eine dominant-negative Version des humanen IGF-1
Rezeptors (dnIGF-1R), die eine Aminosäuresubstitution
in der ATP-Bindungsstelle (28) aufweist, transient in
Wildtyp-β-Tumorzellen mit einem das Green Fluorescence
Protein tragenden Plasmid (eGFP) co-transfiziert. Die
Zellen wurden daraufhin mit apoptotischen Stimuli
und/oder Wachstumsfaktoren inkubiert, geerntet, fixiert
und mit Propidiumjodid gefärbt, um den DNA-Gehalt zu
bestimmen. Mittels Facs Analyse wurden transfizierte,
eGFP exprimierende einzelne Zellen nachgewiesen und in
dieser Population die apoptotischen Zellen durch ihren
DNA-Gehalt von weniger als 2 N identifiziert. Es zeigte
sich, daß die Transfektion mit Plasmiden, die für den
dnIGF-1R kodieren, einen dramatischen Anstieg der
Apoptose sowohl in unbehandelten als auch in mit
Daunomycin oder Etoposid behandelten Wildtyp
β-Tumorzellen zur Folge hat. Es wurde festgestellt, daß
dnIGF-1R die Apoptose in β-Tumorzellen beinahe mit
derselben Effizienz verstärkt wie das Adenovirus-E1A-
Protein, eines der potentesten apoptoseinduzierenden
Genprodukte überhaupt. Somit konnte mit Hilfe der
erfindungsgemäßen Assaymethode gezeigt werden, daß
Tumorzellen auf apoptotische Stimuli empfindlicher
reagieren, wenn die IGF-1R-Signalübertragung
unterbrochen ist und daß sie, ähnlich wie
IGF-II-defiziente Tumorzellen, eine erhöhte Empfindlichkeit
gegenüber Chemotherapeutika aufweisen.
Ferner können mit der erfindungsgemäßen Methode
bekannte Gene daraufhin untersucht werden, ob und in
welchem Ausmaß sie Apoptose in unterschiedlichen
Zelltypen modulieren.
Eine weitere Anwendung der erfindungsgemäßen Methode
ist die Expressionsklonierung von Genen, die Apoptose
modulieren. Dafür wird eine komplette
cDNA-Expressionsbibliothek transient in Zellen transfiziert.
Die erfindungsgemäße Methode ist in der Lage, den
Einfluß von Genexpression innerhalb 24 bis 48 Stunden
zu messen. Es ist daher möglich, Zellen zu analysieren
und noch lebend zu isolieren. Für diese Anwendung wird
eine Modifikation der Methode vorgenommen, indem
Einzelzellen, die von einem zu bestimmenden
Apoptosehintergrund abweichen, durch FACS-Sortierung
isoliert werden. Die in diese Zellen transfizierten
Plasmide werden isoliert, amplifiziert und in weiteren
Transfektionsrunden selektioniert. Plasmide, die ein
Apoptose-modulierendes Gen enthalten, werden auf diese
Weise isoliert. Die entsprechenden Gene werden dann
durch Sequenzierung und weitere Expressions- und
Funktionsstudien charakterisiert.
Um die erfindungsgemäße Methode zu validieren, wurden
im Beispiel 1 zunächst etablierte Tumorzellinen
verwendet, die einerseits mit einem GFP-Plasmid, und
andererseits mit einem Plasmid, enthaltend eine
pro-apoptotische oder eine anti-apoptotische
Gensequenz, oder einem Kontroll-Plasmid transfiziert
wurden. Anschließend an die Transfektion wurden die
Zellen nach einer Ruhepause mit einem apoptotischen
Stimulus behandelt (Kontrollzellen blieben
unbehandelt). Anschließend wurden die abgelösten Zellen
gesammelt und mit den trypsinierten adherenten Zellen
vereinigt, gewaschen und fixiert. Nach dem
anschließenden Waschen wurden die Zellen geteilt, um
einen Vergleich der erfindungsgemäßen Methode mit der
herkömmlichen TUNEL-Methode, die fluroeszierendes
Cy5-dCTP (5-Amino-propargyl-2'-Deoxycytidin 5'-
Triphosphat gekoppelt an Cy5 Fluoreszenzfarbstoff)
verwendet, zu ermöglichen.
Es zeigte sich, daß die erfindungsgemäße Methode
verläßlich den erwarteten pro- oder anti-apoptotischen
Effekt der Genprodukte nachweist und daß der Zusatz des
apoptotischen Stimulus den beobachteten Effekt
verstärkt. Wenngleich die Empfindlichkeit der
erfindungsgemäßen Methode unter den gewählten
Bedingungen etwas geringer war als die der TUNEL-
Methode, war der normalisierte Apoptose-Wert,
ausgedrückt als das Verhältnis der mit dem
pro-apoptotischen Gen erzielten maximalen Apotosewerte
des jeweiligen Assays, nahezu identisch. Gegenüber der
TUNEL-Methode weist die erfindungsgemäße Methode den
Vorteil der Schnelligkeit, Einfachheit und Billigkeit
auf.
Die breite Anwendbarkeit sowie Verläßlichkeit der
erfindungsgemäßen Methode wurde durch Verwendung einer
nicht-transformierten Ratten-Fibroblasten-Zellinie, die
weniger auf apoptotische Stimuli reagiert als die
etablierten Tumorzellinien, bestätigt.
Die erfindungsgemäße Methode ermöglicht es, rasch,
wirkungsvoll und reproduzierbar die potentielle Rolle
eines Genprodukts in der Apoptose festzustellen.
Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt einen
Kit zur einfachen und routinemäßigen Durchführung des
Verfahrens.
Ein solcher Kit enthält zweckmäßig in mehreren
getrennten Behältern folgende Komponenten:
- a) eine oder mehrere für die Transfektion erforderliche Komponenten;
- b) ein Plasmid, enthaltend die für das fluoreszierende Markerprotein kodierende Sequenz;
- c) einen Leervektor für die Inserierung der interessierenden DNA-Sequenz sowie für Kontrollmessungen;
- d) die Primärfixierlösung, z. B. Paraformaldehyd- Lösung;
- e) die Nachfixier/Permeabilisierungslösung, z. B. 70% Ethanol;
- f) Waschlösung(en);
- g) einen DNA-bindenden Farbstoff.
Vorzugsweise enthält der Kit als
Transfektionskomponenten Polyethylenimin und
Psoralen/UV-inaktiviertes Adenovirus.
Für dieses Beispiel wurden etablierte Tumorzellinien
(βTC und βHC) verwendet, die von β-Zell-Tumoren (15)
transgener Mäuse stammen, in denen die regulatorische
Region des Insulin-Gens (Rip) die Expression des großen
T-Antigens von Simianvirus 40 (Tag) in den β-Zellen
pankreatischer Inseln spezifisch induziert (16).
Ca. 80 000 Zellen wurden in eine Vertiefung von 6 cm
einer Kulturschale mit 6 Vertiefungen gesät und in
DMEM, ergänzt mit 10% FCS (v/v), 2 mM Glutamin,
100 internationalen Einheiten Penicillin und 100 µg/ml
Streptomycin, bis zu einer Konfluenz von 70%
gezüchtet. Die Zellen wurden mit 1 µg eines Plasmids,
kodierend für eGFP ("enhanced GFP"; pEGFP-C1; Clontech)
zusammen mit 1 µg eines Kontrollplasmids (pMEX; (22)),
eines pCMV-Plasmids, enthaltend das pro-apoptotische
Adenovirus-Gen E1A oder eines pCMV-Plasmids, enthaltend
das anti-apoptotische Adenovirus-Gen E1B-19K (17, 18)
unter Verwendung von 10 µl LipofectAMINE (GIBCO-BRL)
nach Empfehlung des Herstellers transfiziert. Nach der
Transfektion wurden die Zellen 16 h in komplettem
Medium ruhen gelassen, anschließend wurden die Zellen
entweder unbehandelt gelassen oder mit einem
apoptotischen Stimulus (800 ng/ml Staurosporin; Sigma)
(19, 20) während weiterer 16 h behandelt. 32 h nach der
Transfektion wurden die abgelösten Zellen mit
trypsinierten, adherenten Zellen vereinigt, zweimal mit
4 ml PBS gewaschen und bei Raumtemperatur während
30 min fixiert (2% Paraformaldehyd, 100 mM NaCl,
300 mM Saccharose, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA
(Ethylenglykol-bis-(2-aminoethyl)-tetraessigsäure),
10 mM PIPES (piperazine-N1N1-bis[z-ethane sulfonic
acid]) pH 6.8). Dann wurde zweimal mit 4 ml PBS
gewaschen und 14 h lang in eiskaltem 70% EtOH
nachfixiert.
Nach der Fixierung wurden die Zellen zweimal mit 4 ml
PBS gewaschen und geteilt. Eine Hälfte der Probe wurde
mit RNase A (Sigma, St. Louis, USA) (50 µg/ml) in PBS
während 30 min behandelt, zweimal mit 4 ml PBS
gewaschen und 30 min vor der FACS-Analyse mit
Propidiumjodid in PBS (PI; 50 µg/ml; Sigma, St. Louis,
USA) gefärbt. Die andere Hälfte der Probe wurde mit
50 µl TdT-Reaktionsmischung (terminale
Desoxynukleotidyltransferase; Boehringer Mannheim;
200 mM Kaliumkakodylat, 25 mM Tris-HCl pH 6.6,
0.25 mg/ml Rinderserumalbumin, 1 mM CoCl2; 0.25 nmol
FluoroLink Cy5AP3-dCTP [Amersham], 12.5 Einheiten TdT)
1 h lang bei 37°C inkubiert, zweimal mit 4 ml PBS
gewaschen, mit RNase in PBS (50 µg/ml) während 30 min
behandelt, zweimal mit 4 ml HBS gewaschen (ab diesem
Schritt wurde statt PBS HBS verwendet, weil DAPI in PBS
dazu neigt, Mikropräzipitate zu verursachen), mit DAPI
in HBS (10 µg/ml; Sigma) während 20 min gefärbt und auf
einem Becton Dickinson FACS Vantage Gerät analysiert.
Die FACS Analyse der PI-gefärbten Zellen wurde mit
einem Becton Dickinson FACScan Gerät durchgeführt, das
mit einem sog. "doublet discrimination module"
ausgestattet ist, mit dem Zellaggregate mittels
Berechnung der Pulsweite und Pulsweite diskriminiert
werden. Das Ergebnis der Versuche ist in Fig. 1
dargestellt. Fig. 1A zeigt die Anzahl der apoptotischen
βHC 13T Tumorzellen (% Apoptose) in der gesamten
eGFP-positiven Zellpopulation. Die schwarzen Balken
zeigen die Bestimmung des sub-2N DNA Gehalts (GFP/PI);
die weißen Balken den Einbau von fluoreszentem
Cy5AP3-dCTP während der TdT-Reaktion (GFP/TUNEL). Die
Zugabe von Staurosporin ist angegeben. Es wurde eine
Anregungswellenlänge von 488 nm für eGFP und PI, eine
Anregungswellenlänge von 647 nm für Cy5 und UV eines
Wellenlängenbereichs von 51-364 nm für DAPI
verwendet. Die Emissionsfluoreszenz wurde unter
Verwendung eines 530/20 nm Schmalbandfilters für eGFP,
eines 610 nm Sperrfilters für PI, eines 675/20 nm
Schmalbandfilters für Cy5 und eines
424/44 Schmalbandfilters für DAPI gesammelt. Dupletten
wurden mittels gepulster Prozessierung ausgeschlossen.
eGFP-exprimierende Zellen wurden ausgewählt und auf
Cy5- oder PI-Fluoreszenz analysiert. Die Daten wurden
unter Verwendung der CELLQuest-Software (Becton
Dickinson) analysiert. Jeder Balken stellt den
Durchschnitt von 3 Transfektionen dar,
Standardabweichungen sind durch Fehlerbalken angezeigt.
Jede Messung umfaßte 40 000 Gesamtereignisse,
ausgewählt nach Größe und Einzelzellen. Die
Transfektionseffizienz betrug 20-30%.
Fig. 1B zeigt den normalisierten Prozentsatz der
Apoptose für die verschiedenen Konstrukte.
Apoptoseindex wurde unter Verwendung folgender Funktion
normalisiert: (% Apoptose in X/% Apoptose in
eGFP-C1/E1A) × 100. Der apoptotische Index wurde für
jede der verwendeten Nachweismethoden und für jede
Nach-Transfektionsbehandlung (± Staurosporin)
normalisiert.
In diesem Beispiel wurde einer nicht-transformierte
Ratten-Fibroblasten-Zellinie der Bezeichnung Rat1A
verwendet. Die Zellen wurden transient transfiziert,
wobei entweder, wie in Beispiel 1 beschrieben,
LipofectAMINE oder Polyethylenimin(PEI 2000)-DNA-
Adenovirus-Komplexe (WO 93/0783) verwendet wurden. Im
übrigen wurde hinsichtlich Behandlung der Zellen und
Bestimmung der Apoptose mittels erfindungsgemäßem
Verfahren einerseits und TUNEL-Methode andererseits
genauso vorgegangen, wie in Beispiel 1 beschrieben. Der
Vergleich der verschiedenen Transfektionsmethoden und
Apoptose-Meßmethoden ist in der Tabelle dargestellt.
Jeder Wert stellt den Durchschnitt von 3 Transfektionen
dar; die Standardabweichung ist angegeben (s.d.).
Die Effizienz bei der Transfektionsmethoden betrug
25-30%.
In diesem Beispiel wurden Wildtyp-β-Tumorzellen (15)
verwendet. Das verwendete dominant-negative IGF-1
Rezeptorkonstrukt, das unter der Kontrolle des
CMV-Promotors steht und in dem das Codon 1003 in der
ATP-Bindungsstelle von Lysin zu Alanin mutiert ist,
wurde von (28) beschrieben. Wie in den vorigen
Beispielen beschrieben, wurden Wildtyp-β-Tumorzellen
bei einer Dichte von 80 000 Zellen in Triplikaten in
Kulturplatten mit 6 Vertiefungen ausgesät. 24 h später
wurden die Zellen co-transfiziert mit pEGFP-C1 und
einem Kontrollplasmid (Fig. 2: pMEX/ctr) oder mit
pEGFP-C1 und einem Expressionsplasmid, kodierend
entweder für Adenovirus-E1A (Fig. 2: E1A), Adenovirus-
E1B-19K (Fig. 2: E1B-19K) oder den dominant-negativen
IGF-1R. 36 h nach der Transfektion wurde Daunomycin
(Fig. 2: schraffierte Balken) oder Etoposid (Fig. 2:
weiße Balken) zum Kulturmedium in einer Konzentration
von 1 µM bzw. 10 µM gegeben. Transfizierte, aber
unbehandelte Zellen werden in Fig. 2 durch schwarze
Balken dargestellt. 12 h nach Daunomycin- bzw.
Etoposid-Behandlung wurden die Zellen geerntet, fixiert
und mit Propidiumjodid behandelt, wie in den vorigen
Beispielen beschrieben. Die Bestimmung der
apoptotischen Zellen wurde ebenfalls nach den oben
beschriebenen Methoden durchgeführt. Für jede Messung
wurden 40 000 Ereignisse gesammelt; die
Transfektionseffizienz betrug 25-30%. Die
Standardabweichung ist durch Fehlerbalken angezeigt.
1 Korsmeyer, S. J. (1995) Trends Genet, 11 (3),
101-105.
2 Chinnaiyan, A. M. and Dixit, V. M. (1996) Current Biology, 6(5), 555-562.
3 Vaux, D. L. and Strasser, A. (1996) Proc Natl Acad Sci USA, 93 (6), 2239-2244.
4 White, E. (1996) Genes Dev, 10 (1), 1-15.
5 Kerr, J. F. R., Gobé, G. C., Winterford, C. M. and Harmon, B. V. (1995) In Schwartz, L. M., and Osborne, B. A. (eds.), Cell Death. Academic Press, Inc., San Diego, Vol. 46, pp. 1-27.
6 McGahon, A. J., Martin, S. J., Bissonnette, R. P., Mahboubi, A., Shi, Y., Mogil, R. J., Nishioka, W. K. and Green, D. R. (1995) In Schwartz, L. M., and Osborne, B. A. (eds.), Cell Death. Academic Press, Inc., San Diego, Vol. 46, pp. 153-185.
7 Koopman, G., Reutelingsperger, C. P., Kuijten, G. A., Keehnen, R. M., Pals, S. T. and van Oers, M. J. (1994) Blood, 84 (5), 1415-1420.
8 Wyllie, A. H. (1980) Nature, 284, 555-556.
9 Gavrieli, Y., Sherman, Y. and Ben-Sasson, S. A. (1992) J Cell Biol, 119, 493-501. 10 Cormack, B. P., Valdivia, R. H. and Falkow, S. (1996) Gene, 173, 33-38.
11 Nicoletti, I., Migliorati, G., Pagliacci, M. C., Grignani, F. and Riccardi, C. (1991) J Immunol Meth, 139, 271-279.
12 Telford, W. G., King, L. E. and Fraker, P. J. (1991) Cell Prolif, 24, 447-459.
13 Telford, W. G., King, L. E. and Fraker, P. J. (1992) Cytometry, 13 (2), 137-143.
14 Darzynkiewicz, Z., Bruno, S., Del Bino, G., Gorczyca, W., Hotz, M. A., Lassota, P. and Traganos, F. (1992) Cytoinetry, 13 (8), 795-808.
15 Radvanyi, F., Christgau, S., Baekkeskov, S., Jolicoeur, C. and Hanahan, D. (1993) Mol Cell Biol, 13, 4223-4232.
16 Hanahan, D. (1985) Nature, 315, 115-121.
17 White, E., Cipriani, R., Sabbatini, P. and Denton, A. (1991) J Virol, 65, 2968-2978.
18 White, E. and Cipriani, R. (1990) Mol Cell Biol, 10, 120-130.
19 Jacobsen, M. D., Weil, M. and Raff, M. C. (1996) J Cell Biol, 133, 1041-1051.
20 Raff, M. C., Barres, B. A., Burne, J. F., Coles, H. S., Ishizaki, Y. and Jacobson, M. D. (1993) Science, 262, 695-700.
21 Baker, A., et al., (1997) Gene Therapy, 4, 773-782.
22 Martin-Zanca, D., et al., (1989) Mol. Cell. Biol. 9, 24-33.
23 Reed. J.C. (1997) Nature, 387, 773-776.
24 Villa, P., Kaufmann, S.H. und Earnshaw, W.C., (1997) Trends Biochem. Sci., 22, 388-393.
25 Ormo, M., et al., (1996) Science, 273, 1392-1395.
26 Living Colors pEBFP Vector (1997) CLONTECHniques, XII, 16-17.
27 Light microscopy biology a practical approach. Alan J. Lacey (Hrsg.), IRL Press 1989, Kap. 4, 103-136.
28 Kato, H., et al., 1993, J. Biol. Chem. 268, 2655-2661.
29 Baserga, R., et al., 1997, Biochem. Biophys. Acta, 1332, F105-F126.
30 Partanen, J., et al., 1992, Progr. Growth Factor Res. 4, 69-83.
31 Heldin, C.-H., 1995, Cell 80, 213-223.
32 Peles, E. und Yarden, Y., 1993, Bioessays 15, 815-824.
33 Pawson, T., 1995, Nature 373, 573-580.
34 Downward, J., 1994, Nature 371, 379.
35 Divechia, N. und Irvine, R.F., 1995, Cell 80, 269-278.
36 Franke, T.F., et al., 1997, Cell 88, 435-437.
37 Pritchard, C. und McMahon, M., 1997, Nature Genetics 16, 214-215.
2 Chinnaiyan, A. M. and Dixit, V. M. (1996) Current Biology, 6(5), 555-562.
3 Vaux, D. L. and Strasser, A. (1996) Proc Natl Acad Sci USA, 93 (6), 2239-2244.
4 White, E. (1996) Genes Dev, 10 (1), 1-15.
5 Kerr, J. F. R., Gobé, G. C., Winterford, C. M. and Harmon, B. V. (1995) In Schwartz, L. M., and Osborne, B. A. (eds.), Cell Death. Academic Press, Inc., San Diego, Vol. 46, pp. 1-27.
6 McGahon, A. J., Martin, S. J., Bissonnette, R. P., Mahboubi, A., Shi, Y., Mogil, R. J., Nishioka, W. K. and Green, D. R. (1995) In Schwartz, L. M., and Osborne, B. A. (eds.), Cell Death. Academic Press, Inc., San Diego, Vol. 46, pp. 153-185.
7 Koopman, G., Reutelingsperger, C. P., Kuijten, G. A., Keehnen, R. M., Pals, S. T. and van Oers, M. J. (1994) Blood, 84 (5), 1415-1420.
8 Wyllie, A. H. (1980) Nature, 284, 555-556.
9 Gavrieli, Y., Sherman, Y. and Ben-Sasson, S. A. (1992) J Cell Biol, 119, 493-501. 10 Cormack, B. P., Valdivia, R. H. and Falkow, S. (1996) Gene, 173, 33-38.
11 Nicoletti, I., Migliorati, G., Pagliacci, M. C., Grignani, F. and Riccardi, C. (1991) J Immunol Meth, 139, 271-279.
12 Telford, W. G., King, L. E. and Fraker, P. J. (1991) Cell Prolif, 24, 447-459.
13 Telford, W. G., King, L. E. and Fraker, P. J. (1992) Cytometry, 13 (2), 137-143.
14 Darzynkiewicz, Z., Bruno, S., Del Bino, G., Gorczyca, W., Hotz, M. A., Lassota, P. and Traganos, F. (1992) Cytoinetry, 13 (8), 795-808.
15 Radvanyi, F., Christgau, S., Baekkeskov, S., Jolicoeur, C. and Hanahan, D. (1993) Mol Cell Biol, 13, 4223-4232.
16 Hanahan, D. (1985) Nature, 315, 115-121.
17 White, E., Cipriani, R., Sabbatini, P. and Denton, A. (1991) J Virol, 65, 2968-2978.
18 White, E. and Cipriani, R. (1990) Mol Cell Biol, 10, 120-130.
19 Jacobsen, M. D., Weil, M. and Raff, M. C. (1996) J Cell Biol, 133, 1041-1051.
20 Raff, M. C., Barres, B. A., Burne, J. F., Coles, H. S., Ishizaki, Y. and Jacobson, M. D. (1993) Science, 262, 695-700.
21 Baker, A., et al., (1997) Gene Therapy, 4, 773-782.
22 Martin-Zanca, D., et al., (1989) Mol. Cell. Biol. 9, 24-33.
23 Reed. J.C. (1997) Nature, 387, 773-776.
24 Villa, P., Kaufmann, S.H. und Earnshaw, W.C., (1997) Trends Biochem. Sci., 22, 388-393.
25 Ormo, M., et al., (1996) Science, 273, 1392-1395.
26 Living Colors pEBFP Vector (1997) CLONTECHniques, XII, 16-17.
27 Light microscopy biology a practical approach. Alan J. Lacey (Hrsg.), IRL Press 1989, Kap. 4, 103-136.
28 Kato, H., et al., 1993, J. Biol. Chem. 268, 2655-2661.
29 Baserga, R., et al., 1997, Biochem. Biophys. Acta, 1332, F105-F126.
30 Partanen, J., et al., 1992, Progr. Growth Factor Res. 4, 69-83.
31 Heldin, C.-H., 1995, Cell 80, 213-223.
32 Peles, E. und Yarden, Y., 1993, Bioessays 15, 815-824.
33 Pawson, T., 1995, Nature 373, 573-580.
34 Downward, J., 1994, Nature 371, 379.
35 Divechia, N. und Irvine, R.F., 1995, Cell 80, 269-278.
36 Franke, T.F., et al., 1997, Cell 88, 435-437.
37 Pritchard, C. und McMahon, M., 1997, Nature Genetics 16, 214-215.
Claims (18)
1. Verfahren zur Messung von Apoptose, dadurch
gekennzeichnet, daß man
- A) eine Population von Säugetierzellen transient
transfiziert
- ai) mit einem Plasmid, enthaltend eine interessierende DNA-Sequenz, von der bestimmt werden soll, ob sie bzw. das davon exprimierte Polypeptid eine pro- oder anti-apoptotische Wirkung hat,
- aii) oder mit einem Plasmid, enthaltend eine interessierende DNA-Sequenz, von der bestimmt werden soll, ob bzw. durch welche Substanzen ihre pro- oder anti-apoptotische Wirkung bzw. die Wirkung des davon exprimierten Polypeptids modulierbar ist,
- b) und mit einem Plasmid, enthaltend eine für ein fluoreszierendes Markerprotein kodierende DNA,
- B) die Zellen in einem geeigneten Nährmedium solange inkubiert, bis die interessierende DNA-Sequenz bzw. das exprimierte Polypeptid seine potentielle Wirkung auf die Apoptose ausgeübt hat,
- C) die Zellen erntet und fixiert, so daß das fluoreszierende Protein in den Zellen verbleibt, während die bei der Apoptose entstehenden DNA-Fragmente aus den Zellen diffundieren können,
- D) mittels Messung des DNA-Gehalts den Anteil der apoptotischen Zellen bestimmt,
- E) mittels Messung der Zellen mit fluoreszierenden Markerprotein den Anteil der transfizierten Zellen bestimmt,
- F) und durch Vergleich der in Schritt D und E erhaltenen Werte den Anteil der apoptischen Zellen in der transfizierten Subpopulation der Zellen bestimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Transfektion der Zellen mit
Polyethylenimin und inaktiviertem Adenovirus
durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß das in A b) definierte fluoreszierende
Polypeptid das Green Fluorescent Protein ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man den DNA-Gehalt mit einem DNA-bindenden
Farbstoff mißt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß der Farbstoff Propidiumjodid ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet, daß man die Inkubation
gemäß Schritt B) in Gegenwart einer Testsubstanz
vornimmt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet, daß man die Inkubation
gemäß Schritt B) in Gegenwart einer Substanz
vornimmt, die Apoptose stimuliert.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7,
dadurch gekennzeichnet, daß die Primärfixierung in
Schritt C mit Paraformaldehyd und die
Sekundärfixierung/Permeabilisierung der Zellen mit
Ethanol vorgenommen wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet, daß die in Schritt D und E
definierten Messungen in einem Schritt mittels
fluoreszenzaktivierter Durchflußzytometrie-Analyse
durchgeführt werden.
10. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach
Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er in
mehreren getrennten Behältern folgende Komponenten
enthält:
- a) eine oder mehrere für die Transfektion erforderliche Komponenten;
- b) ein Plasmid, enthaltend die für das fluoreszierende Markerprotein kodierende Sequenz;
- c) einen Leervektor für die Inserierung der interessierenden DNA-Sequenz sowie für Kontrollmessungen;
- d) die Primärfixierlösung;
- e) die Sekundärfixier/Permeabilisierungslösung;
- f) Waschlösung(en);
- g) einen DNA-bindenden Farbstoff.
11. Kit nach Anspruch 10, enthaltend als Komponente a)
Polyethylenimin und Psoralen/UV-inaktiviertes
Adenovirus.
12. Kit nach Anspruch 10, enthaltend als Komponente b)
ein für Green Fluorescent Protein kodierendes
Plasmid.
13. Kit nach Anspruch 10, enthaltend als
Komponenten d) eine ca. 2%ige
Paraformaldehydlösung und als Komponente e) ca.
70% Ethanol.
14. Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 zum
Identifizieren von Substanzen, welche die pro-
oder anti-apoptotische Wirkung von Genen oder
Genprodukten modulieren.
15. Verwendung nach Anspruch 14 zum Identifizieren von
therapeutisch wirksamen Substanzen, die eine
synergistische Wirkung mit der Inhibierung bzw.
dem Fehlen der Überlebensfaktorfunktion von
Tumorzellen aufweisen, dadurch gekennzeichnet, daß
die Zellen Tumorzellen sind, daß die DNA-Sequenz
gemäß aii) eine dominant-negative Version eines
Rezeptors für einen tumorzelleigenen
Überlebensfaktor oder eines
Signalübertragungsmoleküls eines solchen Rezeptors
ist und daß die Zellen in Gegenwart der
Testsubstanz inkubiert werden.
16. Verwendung nach Anspruch 15, dadurch
gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz gemäß aii)
eine dominant-negative Version des IGF-1-Rezeptors
ist.
17. Verwendung nach Anspruch 15, dadurch
gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz gemäß aii)
eine dominant-negative Version eines FGF-Rezeptors
ist.
18. Verwendung nach Anspruch 15, dadurch
gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz gemäß aii)
eine dominant-negative Version eines
PDGF-Rezeptors ist.
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19805229A DE19805229A1 (de) | 1998-02-10 | 1998-02-10 | Verfahren zur Messung der Apoptose |
JP2000523374A JP2001525182A (ja) | 1997-11-28 | 1998-11-27 | アポトーシス測定法 |
EP98959893A EP1034304A1 (de) | 1997-11-28 | 1998-11-27 | Verfahren zur messung der apoptose |
PCT/EP1998/007682 WO1999028499A1 (de) | 1997-11-28 | 1998-11-27 | Verfahren zur messung der apoptose |
CA002311954A CA2311954A1 (en) | 1997-11-28 | 1998-11-27 | Process for measuring apoptosis |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19805229A DE19805229A1 (de) | 1998-02-10 | 1998-02-10 | Verfahren zur Messung der Apoptose |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE19805229A1 true DE19805229A1 (de) | 1999-08-12 |
Family
ID=7857172
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19805229A Withdrawn DE19805229A1 (de) | 1997-11-28 | 1998-02-10 | Verfahren zur Messung der Apoptose |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE19805229A1 (de) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003067255A1 (en) * | 2002-02-04 | 2003-08-14 | Hemolytics Ag | High throughput screening method for compounds with non-, pro-, or anti-apoptotic or proliferative or necrotic activity |
-
1998
- 1998-02-10 DE DE19805229A patent/DE19805229A1/de not_active Withdrawn
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003067255A1 (en) * | 2002-02-04 | 2003-08-14 | Hemolytics Ag | High throughput screening method for compounds with non-, pro-, or anti-apoptotic or proliferative or necrotic activity |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Poenie et al. | Calcium rises abruptly and briefly throughout the cell at the onset of anaphase | |
DE60121346T2 (de) | Suppressor-Gen | |
DE69907156T2 (de) | Krebsbehandlung | |
DE69722176T2 (de) | Verfahren zur suche nach transdominanten effektorpeptiden und rna-molekülen | |
DE60036025T2 (de) | Verfahren zur behandlung von hautkrebs mittels zusammensetzungen, die einen endothelinrezeptor-b-hemmer enthalten | |
DE69835590T2 (de) | Die interaktion von beta-catenin, tcf-4 und apc führt zur verhütung von krebs | |
JP2002512362A (ja) | 細胞パラメーターにおける変化を検出し、小分子ライブラリィをスクリーンするための複数パラメーターfacs | |
DE69633272T2 (de) | Methoden zur Krebsbehandlung und -kontrolle | |
DE69616829T2 (de) | Screeningsverfahrens zum nachweiss induzierfaktors und inhibitionfaktors von "programmed cell death" (apoptosis). | |
DE60037813T2 (de) | Identifikation von stoffen, die transkriptionelle antworten auf hypoxia modifizieren | |
Delanoue et al. | The Drosophila wing differentiation factor Vestigial–Scalloped is required for cell proliferation and cell survival at the dorso-ventral boundary of the wing imaginal disc | |
DE69903559T2 (de) | Verwendung von neuen zelltod inducierenden mitteln im synergismus mit interferon | |
EP1034304A1 (de) | Verfahren zur messung der apoptose | |
DE19805229A1 (de) | Verfahren zur Messung der Apoptose | |
EP1588172A2 (de) | Verfahren zur identifizierung bhs-spezifischer proteine und fragmente davon | |
DE19752922A1 (de) | Verfahren zur Messung der Apoptose | |
DE602004013320T2 (de) | Verfahren zur demonstration eines molekularen ereignisses in einer zelle mittels fluoreszenzmarkerproteinen | |
Triana-Baltzer et al. | Multiple cell adhesion molecules shaping a complex nicotinic synapse on neurons | |
DE60113660T2 (de) | G-protein gekoppelter rezeptor | |
DE10351627B4 (de) | Modulation der Angiogenese durch Bartonella henselae | |
DE69830169T2 (de) | Nachweis und behandlung von krebs | |
DE19737562A1 (de) | Verfahren zur Identifizierung von Wechselwirkungen zwischen Proteinen bzw. Peptiden | |
DE60118783T2 (de) | Auf tsap6-bindungspartnern beruhendes screeningverfahren | |
US20080233645A1 (en) | Methods and Compositions of Ig20 and Denn-Sv Splice Variants | |
MXPA00005165A (en) | Method for measuring the apoptosis |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |