DE60118783T2

DE60118783T2 - Auf tsap6-bindungspartnern beruhendes screeningverfahren

Info

Publication number: DE60118783T2
Application number: DE60118783T
Authority: DE
Inventors: Robert Amson; Adam Telerman; Brent Passer
Original assignee: Cerenis SA
Current assignee: Abionyx Pharma SA
Priority date: 2000-12-26
Filing date: 2001-12-24
Publication date: 2007-03-15
Anticipated expiration: 2021-12-25
Also published as: EP1346230A2; EP1346230B1; CA2432327A1; WO2002052274A2; DE60118783D1; WO2002052274A3

Description

Die Erfindung hat Verfahren zur Detektion, zur Identifizierung und/oder zum Screenen von Verbindungen, die insbesondere für die Behandlung von Krebserkrankungen oder von bestimmten neurodegenerativen Erkrankungen, die mit Unregelmäßigkeiten bei der Regulation der Tumorreversion/-suppression und/oder der Apoptose, in der biologischen p53-Kaskade verbunden sind, eingesetzt werden können, zum Gegenstand.
Die Apoptose oder der Zelltod ist ein komplexes Phänomen, welches durch zahlreiche Proteine reguliert wird, darunter das Protein p53. Dieses Protein zeigt Wechselwirkungen mit zahlreichen anderen Proteinen und seine Expression, die die Phänomene des Zelltods und der Tumorreversion induziert, kann mit der Induktion oder der Repression der Expression von anderen zellulären Genen korreliert werden.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben so Gene, die während der Kaskade, die zur Tumorreversion und/oder Apoptose führt, induziert und aktiviert werden (TSAP für „Tumor Suppressor Activated Pathway"), oder Gene, die reprimiert werden (TSIP für „Tumor Suppressor Inhibited Pathway"), nachgewiesen. Diese Gene bildeten insbesondere den Gegenstand der Patentanmeldungen WO 97/22695 oder WO 00/08147.
Es ist wichtig, die Mechanismen der p53-Kaskade genau verstehen zu können, um neue Verbindungen, die eine Antitumor-Aktivität aufweisen (welche insbesondere die Apoptose oder die Tumorsuppression induzieren können) oder für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen eingesetzt werden können, erzeugen zu können. Tatsächlich haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung gezeigt, dass Presenilin 1 (PS1), für welches eine Rolle bei der Alzheimer'-Krankheit vermutet worden war, identisch war mit dem Protein TSIP2, welches in der Anmeldung WO 97/22695 beschrieben worden ist. So ist es legitim, nach Arzneimitteln zu forschen, welche im Rahmen der Apoptose interferieren können, um dieses Phänomen zu verringern, und die bei den neurodegenerativen Erkrankungen eingesetzt werden könnten.
Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Screening und zur Identifizierung von Produkten, die im Rahmen der p53-Kaskade interferieren und so die Tumorreversion und/oder die Apoptose induzieren oder umgekehrt die Apoptose-Phänomene verringern können.
Anson, R.B., et al. vermuten für TSAP6 einen Einfluss auf die apoptotische Wirkung von p53, ohne zu präzisieren, welchen.
Die Erfindung beruht auf den Wechselwirkungen des Proteins TSAP6 mit anderen Proteinen, wie sie durch die Erfinder der vorliegenden Anmeldung nachgewiesen wurden. Das Protein TSAP6, welches in der Patentanmeldung WO 97/22695 und in GenBank unter der Nummer U50961 beschrieben wird, ist ein Protein, welches sechs Transmembrandomänen aufweist, was eine Lokalisation in einer zellulären Membran nahe legt. So ist es vernünftig, anzunehmen, dass das Protein TSAP6 als ein Rezeptor im Rahmen des Metabolismus der Regulation der mit p53 verbundenen Apoptose wirken kann und dass die Bestimmung von dessen Bindungspartnern sich als wichtig dafür, was das Gesamtverständnis der Regulation der Apoptose/Tumorreversion in den Zellen ist, erweisen kann.
Die Nukleotidsequenz von TSAP6 aus der Maus wird durch SEQ ID Nr. 49 dargestellt und das offene Leseraster des Proteins entspricht SEQ ID Nr. 50.
Die Nukleotidsequenz von humanem TSAP6 wird durch SEQ ID Nr. 51 dargestellt und das offene Leseraster des Proteins entspricht SEQ ID Nr. 52.
So bezieht sich bei einer ersten Ausführungsweise die Erfindung auf Verfahren zum Screenen und/oder zur Selektion oder zur Identifizierung einer Verbindung, welche mit der Bindung von TSAP6 an eines der Proteine, welches aus SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, interferiert, diese verringert oder inhibiert, welche die Schritte aufweisen:

a) die Verbindung mit einem System in Kontakt zu bringen, welches die in vitro-Bestimmung der Bindung zwischen TSAP6 und einem der Proteine, welches aus SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, erlaubt;
b) die Verringerung und/oder die Inhibition der Bindung zwischen TSAP6 und dem Protein, welches aus SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, zu identifizieren.

Um Verbindungen zu bestimmen, die die Erhöhung der Tumorreversion und/oder des Zelltods (Apoptose) erlauben, ist es gleichfalls möglich, ein erfindungsgemäßes Verfahren, insbesondere ein Verfahren zum Screenen, zur Selektion oder zur Identifizierung von Verbindungen, wel che eine Erhöhung der Tumorreversion und/oder des Zelltods (Apoptose) zur Funktion haben, zu definieren, welches die Schritte aufweist:

a) die Verbindung mit einem System in Kontakt zu bringen, welches die in vitro-Bestimmung der Bindung zwischen TSAP6 und einem der Proteine, welches aus SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, erlaubt;
b) Verbindungen zu identifizieren, welche die Verringerung und/oder die Inhibition der Bindung zwischen TSAP6 und dem unter a) definierten Protein induzieren;
c) die in Schritt b) selektionierten Verbindungen in einem in vitro-System in Kontakt zu bringen, welches erlaubt, die Phänomene von Apoptose und/oder von Tumorreversion zu messen;
d) die Erhöhung der Tumorreversion und/oder des Zelltods (Apoptose) in dem Modell durch Vergleich mit einem Vergleichsmodell, mit welchem die Verbindung nicht in Kontakt gebracht worden ist, zu identifizieren.

Ein solches Verfahren ist folglich gleichfalls ein Gegenstand der Erfindung.
Die Erfindung hat gleichfalls ein Verfahren zum Screenen, zur Selektion oder zur Identifizierung von Verbindungen, welche eine Verringerung und/oder die Inhibition der Tumorreversion und/oder des Zelltods (Apoptose) zur Funktion haben, zum Gegenstand, welches die Schritte aufweist:

a) die Verbindung mit einem System in Kontakt zu bringen, welches die in vitro-Bestimmung der Bindung zwischen TSAP6 und einem der Proteine, welches aus SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, erlaubt;
b) Verbindungen zu identifizieren, welche die Verringerung und/oder die Inhibition der Bindung zwischen TSAP6 und dem unter a) definierten Protein induzieren;
c) die in Schritt b) selektionierten Verbindungen in einem in vitro-System in Kontakt zu bringen, welches erlaubt, die Phänomene von Apoptose und/oder von Tumorreversion zu messen;
d) die Verringerung und/oder die Inhibition der Tumorreversion und/oder des Zelltods (Apoptose) in dem Modell durch Vergleich mit einem Vergleichsmodell, mit welchem die Verbindung nicht in Kontakt gebracht worden ist, zu identifizieren.

Die Erfindung nutzt folglich die Tatsache aus, dass die TSAP6-Proteine und die Proteine, die aus SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44 oder 46 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 45 oder 47, kodiert werden, aneinander binden können. Es ist folglich interessant, die Domänen von jedem Protein zu identifizieren, die effektiv in Kontakt mit dem anderen Protein stehen. Tatsächlich müsste dies erlauben, die so identifizierten Peptide als funktionalen Ersatz oder Agonisten der vollständigen Proteine einsetzen zu können. Dies kann so erlauben, Verbindungen zu definieren, die bei der Bindung zwischen TSAP6 und einem der Proteine, welches unter SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt unter SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, interferieren und die entweder die Tumorsuppression und/oder die Apoptose induzieren oder im Gegenteil diese Phänomene verringern könnten.
Die Erfindung hat folglich insbesondere ein Verfahren zur Identifizierung einer Region von TSAP6, welche an eines der Proteine, welches aus SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, bindet, zum Gegenstand, welches die Schritte umfasst:

a) Peptide, welche von dem Protein TSAP6 stammen, in einem System in Kontakt zu bringen, welches die in vitro-Bestimmung der Bindung des Proteins TSAP6 an das Protein, welches aus SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, erlaubt;
b) die Peptide zu identifizieren, welche die Verringerung der Bindung zwischen dem Protein TSAP6 und dem unter a) definierten Protein induzieren durch Vergleich mit der Bindung, die zwischen TSAP6 und dem unter a) definierten Protein beobachtet wird, wenn die Peptide in dem System nicht vorhanden sind.

Unter „Region von TSAP6" versteht man insbesondere Peptide mit einer Primärsequenz, welche aus der Primärsequenz des TSAP6-Proteins stammt.
Die Erfindung hat selbstverständlich gleichfalls die Verfahren zur Identifizierung der Regionen der Proteine, welche aus SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44 oder 46 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 45 oder 47, kodiert werden, die an TSAP6 binden, zum Gegenstand.
Das ins Auge gefasste System kann in vitro ausgeführt werden.
So erlaubt die Erfindung die Identifizierung von Regionen von TSAP6, welche an der Bindung an eines der Proteine, welche aus SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert werden, beteiligt sind, durch ein Verfahren, welches die Schritte umfasst:

a) Peptide, welche von dem Protein TSAP6 stammen, in einem System in Kontakt zu bringen, welches die in vitro-Bestimmung der Bindung zwischen TSAP6 und dem einen der Proteine, welches aus SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, erlaubt;
b) die Peptide zu identifizieren, welche die Verringerung der Bindung zwischen TSAP6 und dem Protein, welches aus SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, in dem System zur Folge haben.

Es ist offensichtlich, dass die Erfindung gleichfalls die Bestimmung der Regionen von dem einen der Proteine, welches aus SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, welche an der Bindung an TSAP6 beteiligt sind, erlaubt gemäß Verfahren, die ähnlich zu den zuvor beschriebenen Verfahren sind, dass diese Regionen insbesondere als funktionaler Ersatz eingesetzt werden können, wenn man wünscht, die Tumorreversion und/oder die Apoptose zu verringern.
Die Erfindung erlaubt folglich, Produkte zu identifizieren, welche erlauben, mit der Bindung zwischen TSAP6 und einem der Proteine, welches aus SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, zu interagieren und welche folglich einen Nutzen bei der Regulation der Apoptose und/oder der Tumorreversion haben können. Gleichwohl ist es möglich, dass diese Produkte, um für eine therapeutische Behandlung, insbesondere Krebs oder die neurodegenerativen Erkrankungen, eingesetzt werden zu können, optimiert werden müssen, um eine höhere Aktivität und/oder eine geringere Toxizität aufzuweisen.
Tatsächlich erfolgt die Entwicklung eines Arzneimittels häufig gemäß dem folgenden Prinzip:

– Screening von Verbindungen, die eine gewünschte Aktivität aufweisen, durch ein geeignetes Verfahren;
– Auswahl von Verbindungen, die den „Rahmenbedingungen" entsprechen,
– Bestimmung der Struktur (insbesondere der Sequenz (gegebenenfalls Tertiärstruktur), wenn es sich um Peptide handelt, der Formel und des Grundgerüsts, wenn es sich um chemische Verbindungen handelt) der ausgewählten Verbindungen,
– Optimierung der ausgewählten Verbindungen durch Modifizierung der Struktur (beispielsweise durch das Verändern der stereochemischen Konformation (beispielsweise Übergehen der Aminosäuren in einem Peptid von L zu D), Hinzufügen von Substituenten an die Peptidgrundgerüste oder chemischen Grundgerüste, insbesondere durch Aufpfropfen von Resten auf das Grundgerüst, Modifizierung der Peptide (siehe insbesondere Gante „Peptidomimetics", in Angewandte Chemie-International Edition Engl. 1994, 33, 1699–1720),
– Durchschleusen und Screening der so erhaltenen Verbindungen durch bzw. mittels geeigneter) Modelle, die oftmals Modelle sind, die der untersuchten Pathologie näher kommen. In diesem Stadium setzt man insbesondere häufig nicht-humane Tiermodelle, im Allgemeinen bei Nagetieren (Mäuse, Ratten...) oder bei Hunden, ja sogar Primaten ein.

Die nicht-humanen Tiermodelle, die eingesetzt werden können, sind beispielsweise für Krebs Modelle, die auf immundeprimierten Mäusen (beispielsweise scid/scid basieren, welchen man (insbesondere subkutan) Tumorzellen injiziert, die zu der Entwicklung von Tumoren führen werden. Man untersucht die Wirksamkeit der potentiellen Antitumor-Verbindungen beispielsweise durch das Messen der Größe der gebildeten Tumore.
Man kann für die Untersuchung der neurodegenerativen Erkrankungen das von Amson et al. (2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 5346-50) beschriebene Modell, welches aus p53-defizienten Mäusen besteht, oder das in Chen et al., Janus et al. und Morgan et al. (2000, Nature 408, S. 975–985) beschriebene Modell einsetzen.
So hat die Erfindung insbesondere zum Gegenstand, die Identifizierung von Verbindungen, die für die Behandlung von Krebs eingesetzt werden könnten, indem sie eine Aktivität einer Erhöhung der Tumorreversion und/oder der Apoptose aufweisen, zu ermöglichen. Einer der Gegenstände der Erfindung ist folglich ein Verfahren, welches die Schritte umfasst:

a) ein Verfahren gemäß der Erfindung auszuführen, welches erlaubt, Verbindungen zu identifizieren, welche eine bestimmte Aktivität der Erhöhung der Tumorreversion und/oder der Apoptose aufweisen und/oder die Bindung zwischen TSAP6 und einem Protein, welches unter SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, inhibieren,
b) das in Schritt a) selektierte Produkt zu modifizieren,
c) das in Schritt b) modifizierte Produkt in in vitro-Verfahren an geeigneten Modellen von Tumorreversion und/oder Apoptose zu testen,
d) das Produkt zu identifizieren, welches erlaubt, eine Tumorreversions- und/oder Apoptoseaktivität, welche höher ist als die Aktivität, die für das in Schritt a) selektierte Produkt erhalten wird, zu erhalten.

Der Fachmann auf diesem Gebiet wird die Bedingungen und die Schwellenwerte definieren, welche für die Identifizierung eines Produkts, welches als Arzneimittel eingesetzt werden kann, erforderlich sind, gemäß den vorschriftsmäßigen Anforderungen (insbesondere der Toxikologie) bezogen auf den Nutzen, welchen das so identifizierte Produkt bringt.
Ebenso betrifft die Erfindung gleichfalls die Verfahren zur Optimierung der Produkte, die die Tumorreversion und/oder die Apoptose reprimieren, welche durch die weiter oben beschriebenen Verfahren identifiziert worden sind, und welche die Identifizierung von Produkten, die als Arzneimittel einsetzbar sind, erlauben.
So betrifft die Erfindung gleichfalls ein Verfahren zur Identifizierung eines Produkts, welches eine Aktivität einer Verringerung und/oder einer Inhibition der Tumorreversion und/oder der Apoptose aufweist, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es die Schritte umfasst:

a) ein Verfahren gemäß der Erfindung auszuführen, welches erlaubt, Verbindungen zu identifizieren, welche eine bestimmte Aktivität der Verringerung der Tumorreversion und/oder der Apoptose aufweisen und/oder die Bindung zwischen TSAP6 und einem Protein, welches unter SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, inhibieren,
b) das in Schritt a) selektierte Produkt insbesondere durch Aufpfropfen von Resten auf das chemische Grundgerüst zu modifizieren,
c) das in Schritt b) modifizierte Produkt in in vitro-Verfahren an geeigneten Modellen von Tumorreversion und/oder Apoptose zu testen,
d) das Produkt zu identifizieren, welches erlaubt, eine Tumorreversions- und/oder Apoptoseaktivität, welche bezogen auf die Aktivität, die für das in Schritt a) selektierte Produkt erhalten wird, verringert ist, zu erhalten.

Es handelt sich tatsächlich des Weiteren darum, das Produkt erhalten zu können, welches das beste Verhältnis (biologische Aktivität und klinische Wirkung)/(potentielle Verwendungsrisiken) aufweist.
Die Parameter, die eingesetzt werden müssen, um diese Ergebnisse zu erhalten, sind allesamt bekannt und liegen innerhalb des Vermögens des Fachmanns auf diesem Gebiet, welcher anstrebt, neue Arzneimittel zu entwickeln, und können beispielsweise in den Direktiven der Organisationen, wie der Agence du Medicament, der Europäischen Kommission oder der Federal Drug Agency, gefunden werden.
Die Ausführung der erfindungsgemäßen Verfahren erfordert Modelle, welche erlauben, die Bindung zwischen TSAP6 und dem einen der Proteine, welches unter SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, zu bestimmen.
Wenn man die erfindungsgemäßen Verfahren an in vitro-Modellen ausführt, um die Bindung zwischen einem der Proteine, welches unter SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, und TSAP6 zu untersuchen, gibt es mehrere Weisen, vorzugehen.
Ein einsetzbares Protokoll kann das folgende sein:

– Expression und Reinigung der TSAP6-Proteine und des einen der Proteine, welches unter SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, beispielsweise in prokaryotischen Zellen (E. coli, B. subtilis...) oder eukaryotischen Zellen (Hefen, wie Saccharomyces, Kluyveromyces..., Säugetierzellen (HeLa, Cos, Hep-2...) oder Insektenzellen (unter Verwendung eines Baculovirus-Systems). Es kann vorteilhaft sein, dass die Proteine eine Markierung (Tag) an deren N- oder C-terminalem Ende tragen, um die Reinigung zu vereinfachen. Man wählt insbesondere einen Histidin-Tag oder GST. Diese Verfahren sind dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt, der die geeigneten Plasmide in den Katalogen von Firmen, wie Stratagene, findet.
– Bindung der Proteine an geeignete Kügelchen. Wenn man eine GST-Markierung einsetzt, bindet man die exprimierten Proteine an Sepharose-Kügelchen, die Glutathion enthalten.
– Herstellung von Proteinen durch in vitro-Translation. Dies kann leicht ausgeführt werden, indem kommerzielle Vektoren (die beispielsweise bei Promega erhältlich sind) eingesetzt werden, die erlauben, die cDNAs unter der Kontrolle von wohlbekannten Promotoren (T7 oder T3) zu klonieren und die geeigneten RNA-Polymerasen einzusetzen, um die RNAs zu produzieren, dann die Expression der Proteine in vitro unter Verwendung der verfügbaren Kits, und indem den Anweisungen des Herstellers gefolgt wird, auszuführen.
– Copräzipitation der Proteine, indem die durch in vitro-Translation erhaltenen Proteine zu den Sepharose-Glutathion-Kügelchen, auf welchen die Fusionsproteine mit GST gebunden sind, hinzugegeben werden. Nach einer ausreichenden Kontaktzeit wäscht man die Kügelchen und man führt eine Analyse durch SDS-PAGE-Gelelektrophorese und Autoradiographie aus. Das Auftreten der den beiden Proteinen entsprechenden Banden zeigt deutlich die Bindung zwischen jenen.

Die Verwendung von geeigneten Kontrollen erlaubt so, die Verringerung und/oder die Inhibition der Bindung zwischen TSAP6 und dem einen der Proteine, welches unter SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, durch Vergleich der Mengen von Proteinen, welche nach Zugabe der getesteten Verbindung während des Copräzipitationsschritts freigesetzt werden, mit den Mengen von Proteinen, die in den Kontrollen freigesetzt werden, zu definieren.
Man kann auch die Bindung der Proteine untersuchen, indem das FRET-System (Fluorescence Resonance Energy Transfer) eingesetzt wird, welches darin besteht, jedes der Proteine mit einem geeigneten Rest zu markieren, wobei die Bindung der beiden Proteine eine Reaktion zwischen jedem der beiden Reste und die Emission einer leicht detektierbaren Fluoreszenz induziert.
Die Erfindung hat gleichfalls die Verbindungen zum Gegenstand, welche durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhalten werden können, insbesondere die Verbindungen, welche eine Aktivität einer Erhöhung der Tumorreversion und/oder der Apoptose aufweisen, jene, die eine Aktivität einer Inhibition der Bindung zwischen TSAP6 und einem der Proteine, welches unter SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, aufweisen, wie auch jene, die eine Aktivität einer Verringerung und/oder einer Inhibition der Tumorreversion und/oder der Apoptose aufweisen.
Die Erfindung betrifft gleichfalls die Peptidsequenzen, welche einer Region von TSAP6, welche mit dem einen Protein der Proteine, welches unter SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, wechselwirkt, entsprechen, die insbesondere durch ein erfindungsgemäßes Verfahren identifiziert werden können.
Die Erfindung betrifft auch die Peptidsequenzen, die einer Region des einen der Proteine, welches unter SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, welche mit dem Protein TSAP6 wechselwirkt, entsprechen, die insbesondere durch ein erfindungsgemäßes Verfahren identifiziert werden können, das Verfahren, welches erlaubt, die Peptidsequenzen von TSAP6 zu identifizieren, welche mit dem einen der Proteine, welches unter SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, wechselwirken, welches angepasst werden kann, um die Peptidsequenzen des einen der Proteine, welches unter SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, zu bestimmen, welche mit TSAP6 wechselwirken, insbesondere indem das oben erläuterte in vitro-Protokoll angepasst wird.
Die Erfindung betrifft auch die Nukleotidsequenzen, welche die so identifizierten Peptidsequenzen kodieren.
Es ist klar, dass der Begriff Peptidsequenz oder Nukleinsäuresequenz oder Nukleotidsequenz (wobei diese beiden letzteren Begriffe unterschiedslos verwendet werden) isolierte Sequenzen repräsentiert, d.h. außerhalb ihres natürlichen Zustands, und dass diese insbesondere durch das Ersetzen von deren Grundeinheiten durch nicht-natürliche Einheiten oder durch die Modifizierung der Bindungen zwischen den Grundeinheiten (beispielsweise die Phosphorothioate (Nukleinsäure) oder die Peptid Nucleic Acids) modifiziert sein können.
Die Erfindung hat folglich insbesondere zum Gegenstand, die Identifizierung von Verbindungen zu erlauben, welche mit der Bindung zwischen TSAP6 und dem einen der Proteine, welches unter SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, interferieren, wobei bestimmte von diesen Verbindungen insbesondere Wirkungen auf die p53-Kaskade induzieren können. So sind die erfindungsgemäßen Verbindungen, die erfindungsgemäßen Peptidsequenzen oder die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen als Arzneimittel gleichfalls Gegenstände der Erfindung.
Eine durch ein erfindungsgemäßes Verfahren identifizierte Verbindung kann eine Verbindung mit einer chemischen Struktur, ein Lipid, ein Zucker, ein Protein, ein Peptid, eine hybride Prote in-Lipid-, Protein-Zucker-, Peptid-Lipid- oder Peptid-Zucker-Verbindung, ein Protein oder ein Peptid, zu welchem man chemische Verzweigungen hinzugefügt hat, sein.
Bezüglich der ins Auge gefassten chemischen Verbindungen können diese einen oder mehrere (insbesondere 2 oder 3) aromatische(n) oder nicht-aromatische(n) Zyklus oder Zyklen, welche 3 bis 8 Kohlenstoffatome aufweisen, wie auch mehrere Reste jeglicher Art (insbesondere Niederalkyl, d.h. welche zwischen 1 und 6 Kohlenstoffatome aufweisen) enthalten.
Diese Verbindungen, Nukleinsäuresequenzen, Peptidsequenzen können so gemäß der Erfindung eingesetzt werden für die Herstellung eines Arzneimittels, welches je nach der pro- oder anti-Apoptose/Tumorreversions-Wirkung insbesondere für die Behandlung von Krebs oder einer neurodegenerativen Erkrankung bestimmt ist.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben erstmals die Tatsache nachgewiesen, dass das Protein TSAP6 an das Protein, das eine der Proteine, welches unter SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, bindet. So betrifft die Erfindung gleichfalls einen Komplex, welcher gebildet wird aus einem TSAP6-Protein und einem der Proteine, welches aus SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird.
Die Erfindung betrifft gleichfalls ein Verfahren zur in vitro-Inhibition der Bindung zwischen TSAP6 und dem einen der Proteine, welches aus SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, in einer Zelle, welches den Schritt umfasst:

a) Inkontaktbringen der Zelle in vitro mit einer Verbindung, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren identifiziert worden ist, welche die Bindung zwischen TSAP6 und einem der Proteine, welches aus SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, inhibiert.

Die so ins Auge gefasste Verbindung kann gleichfalls ein „Köder"- oder als funktionaler Ersatz einsetzbares Peptid, welches aus dem TSAP6-Protein oder dem einen der Proteine, welches aus SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, stammt, sein. Das Verfahren kann in vitro ausgeführt werden.
LEGENDE DER FIGUREN
1: TSAP6 ist gleichzeitig im endoplasmatischen Retikulum und im Golgi lokalisiert
Mit GFP-TSAP6 transfizierte Hela-Zellen wurden hinsichtlich ihrer subzellulären Lokalisation analysiert. Die GFP-TSAP6 überexprimierenden Hela-Zellen wurden mit für das endoplasmatische Retikulum (ER), den Golgi, die Mitochondrien (mito) und den Kern (Nuclei) spezifischen Markern comarkiert. Diese Art von Markierung hat enthüllt, dass die subzelluläre Lokalisation von TSAP6 im Inneren des endoplasmatischen Retikulums und des Golgis liegt. Es empfiehlt sich gleichfalls, anzumerken, dass es sich erweist, dass TSAP6 gleichfalls auf den Plasmamembranen und nukleären Membranen exprimiert wird.
2: Die Antisinn-Sequenz von TSAP6 verhindert den durch p53 induzierten Zelltod bei TS LTR6-Zellen

A. Die Analyse durch Western-Blot zeigt, dass die endogenen Proteinniveaus von TSAP6 24 h nach der Induktion durch p53 in den LTR6-Zellen, welche anti-TSAP6 überexprimieren, verringert sind.
B. Die Überexpression der Antisinn-Sequenz von TSAP6 (as2) verzögert die durch die Aktivierung durch p53 induzierte Apoptose. Die Analyse der zeitlichen Entwicklung von LTR6 und LTR6-as2 gemäß der Temperatur verändert sich bei 32°C.
C. Durchflusszytometrische Zweifarben-Analyse der LTR6- und LTR6-as2-Zellen. Zellen wurden mit Annexin-V und Propidiumiodid (IP) markiert. Die LTR6-as2-Zellen exprimieren verglichen mit den LTR6-Zellen weniger Annexin-V und AnnexinV/IP, was anzeigt, dass die TSAP6-Antisinn-Sequenz die durch p53 induzierte Apoptose verhindert.
D. LTR6-as2 und -as4 verhindert die durch p53 induzierte PARP-Spaltung. Gesamtlysate ausgehend von den obigen Experimenten wurden hinsichtlich der PARP-Spaltung, eines Apoptose-Markers, mit einem anti-PARP-Antikörper analysiert. Wie verglichen mit den LTR6-Zellen, zeigen LTR6-as2 und -as4 eine ausgeprägte Verringerung von PARP 8 h nach der Aktivierung durch p53.

3: TSAP6 bindet in vitro und in vivo an Nix und Myt1

A. Die Analysen eines Hefe-Rasens haben enthüllt, dass TSAP6 mit Nix und Myt1 wechselwirkt.
B. Wechselwirkung von entweder GST-Nix oder GST-Myt1-150 in vitro mit radioaktiv markiertem TSAP6 während der in vitro-Translation (IVT für in vitro-Translation). Man lässt GST-Nix oder GST-Myt1-150 mit in vitro transkribiertem/translatiertem und radioaktiv markiertem TSAP6 inkubieren. Durch IVT markiertes GST-NKTR und AIP1 werden gleichfalls als Negativkontrollen mit aufgenommen. Diese Analysen haben enthüllt, dass GST-Nix und GST-Myt1-150 spezifisch an TSAP6 binden. Außerdem haben Kartierungsexperimente enthüllt, dass Nix und Myt1 mit einem Fragment von TSAP6, welches aus den Aminosäuren 1 bis 316 besteht, wechselwirken.
C. Wechselwirkung von Ha-TSAP6 mit Flag-Nix (linkes Feld) und Flag-Myt1-150 (rechtes Feld) in 293T-Zellen in vivo. 293T-Zellen wurden mit der angegebenen Kombination von Plasmiden transfiziert und TSAP6 wurde mit einem anti-HA-Antikörper immunpräzipitiert. Mit einem anti-Flag-Antikörper wurde eine Wechselwirkung von Nix und Myt1-150 nachgewiesen.
D. Colokalisierung von GFP-TSAP6 und Flag-Myt1. Hela-Zellen, welche GFP-TSAP6 (linkes Feld) und Flag-Myt1 (mittiges Feld) überexprimieren, wurden mit einem konfokalen Mikroskop hinsichtlich einer Colokalisierung (rechtes Feld) analysiert. Diese Analyse zeigt an, dass TSAP6 und Myt1 colokalisiert sind.

4: TSAP6 kooperiert mit Nix bei der Förderung des Zelltods

A. Hela 39- und 51-Zellen, welche HA-TSAP6 überexprimieren. Analyse durch Western-Blot unter Verwendung eines anti-HA an Hela-Zellen, um TSAP6 zu detektieren.
B. Die Überexpression von TSAP6 begünstigt die Verzögerung der Zellvermehrung und die Apoptose. Analyse der Zellvermehrung (linkes Feld). Die Hela-Zellen oder die Hela-Zellen, die entweder einen Kontrollvektor oder TSAP6 (39 und 51) exprimieren, wurden mit Trypanblau markiert und die zelluläre Lebensfähigkeit wurde zu den angegebenen Zeitpunkten bestimmt. Analyse des Zelltods (rechtes Feld): der Zelltod wurde bestimmt durch Zählung von Zellen, die das Trypanblau inkorporiert hatten.
C. Verschlimmung der Apoptose bei den Hela-51-Zellen, die Nix überexprimieren. Ein Hela-Vektor oder Hela-51-Zellen wurden mit Flag-Konstrukten, welche die Negativkontrolle AIP1, Nix oder das proapoptotische Molekül Bid-t, welches als Positivkontrolle verwendet wurde, enthielten, transfiziert. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen mit einem anti-flag-Antikörper, um die überexprimierten Proteine zu detektieren, und mit DAPI, einem Farbstoff für den Zellkern, markiert und dann wurden die Zellen gezählt. Diese Analyse hat gezeigt, dass, während AIP1 eine minimale Wirkung auf die Apoptose in irgendeiner beliebigen Zelllinie hatte, die Überexpression von Nix den Zelltod bei den TSAP6 überexprimierenden Zellen stark stimulierte. Bid-t begünstigte andererseits ähnliche Apoptose-Niveaus unabhängig von der Zelllinie.
D. Die Überexpression von Nix bei Hela-51 begünstigt stark die Spaltung von PARP. Gesamtlysate ausgehend von den vorangegangenen Experimenten wurden durch Western-Blot unter Verwendung eines anti-PARP-Antikörpers analysiert. Diese Analyse zeigt, dass Nix und TSAP6 miteinander kooperieren, um Spaltungsniveaus von PARP zu begünstigen (siehe unten). Die TSAP6-Antisinn-Sequenz verhindert die durch Nix induzierte Spaltung von PARP bei den 293T-Zellen. 293T-Zellen wurden mit den angegebenen Plasmiden transfiziert und 24 h später wur den Zelllysate hergestellt und die Spaltung von PARP wurde durch Immunmarkierung mit einem anti-PARP-Antikörper analysiert. Diese Daten zeigen, dass, während Nix allein die partielle Spaltung von PARP begünstigt, das Hinzufügen einer TSAP6-Antisinnsequenz diese Wirkung vollständig blockiert.
E. Colokalisierung von GFP-TSAP6 und Nix nach Behandlung mit Staurosporin. Hela-Zellen, die mit TSAP6 (linkes Feld) und Nix (mittleres Feld) transfiziert worden sind, wurden durch ein konfokales Mikroskop 24 h später analysiert. Während eine Colokalisierung von TSAP6 und Nix (rechtes Feld) schwierig nachweisbar war (-stauro), begünstigte die Induktion der Apoptose durch Staurosporin eine Coaleszenz von TSAP6 und Nix.

5: Die Überexpression von TSAP6 begünstigt die Verzögerung des Zellzyklus in G2, indem es die Dephosphorylierung von cdc2 verhindert.

A. Die „Double thymidine block"-Analyse enthüllt, dass die Hela-51-Zellen eine zusätzliche G2/M-Population enthalten. Eine DTB-Prozedur wurde ausgeführt und ein Hela-Vektor und Hela-51-Zellen wurden zu den angegebenen Zeitpunkten bezüglich deren Fortschreiten im Zellzyklus analysiert. Eine durchflusszytometrische Analyse wurde an mit Propidiumiodid markierten Zellen ausgeführt mit dem Ziel, die unterschiedlichen Stadien des Zellzyklus sichtbar zu machen. Bei t = 0 zeigten die Hela-51-Zellen eine zusätzliche Population von G2/M entsprechenden Zellen. Bei t = 12 h enthielten die Hela-51-Zellen eine bemerkenswerte Anhäufung dieser G2/M-Zellen zu einem Zeitpunkt, wo die Hauptmenge der Hela-Vektor-Zellen in das G1-Stadium zurückkehren.
B. Markierung der Histone H3 zu den Zeitpunkten t = 0 und t = 12 h nach der DTB-Synchronisierung („relarguage"). Die durchflusszytometrische Analyse wurde an Zellen ausgeführt, die mit einem anti-H3-Phosphohiston-Antikörper, welcher Zellen in Mitose markiert, und mit Propidiumiodid markiert worden waren. Diese Analyse hat enthüllt, dass, während die Hauptmenge der Hela-51-Zellen nach 12 h einen G2/M-Phänotyp aufwies (ungefähr 60%), nur ungefähr 15% der G2/M-Zellen einen H3⁺-Phänotyp aufwiesen. Dies steht im Gegensatz zu den G2/M enthaltenden Hela-Vektor-Zellen, von denen sich in demselben Moment 20% in der Mitose befinden.
C. Analyse des Mitose-Index der Hela-Vektor- und Hela-51-Zellen. Diese Ergebnisse haben enthüllt, dass die Hela-51-Zellen verglichen mit den Hela-Vektor-Zellen einen verzögerten Eintritt in die Mitose zeigen. Außerdem bestätigen diese Daten die obigen Ergebnisse, gemäß welchen die Überexpression von TSAP6 das Fortschreiten des Zellzyklus verzögert, vielmehr als dass diese dieses begünstigt. Die Hela-Zellen wurden mit DTB synchronisiert und zu den angegebenen Zeitpunkten wurden die Zellen fixiert und mit dem Giemsa-Wright-Färbemittel markiert mit dem Ziel, die Chromosomenkontraktionen zu detektieren. Für jeden Zeitpunkt wurden wenigstens 600 Kerne gezählt.
D. Brdu-Markierung der Hela-Vektor-Zellen und der Hela-51-Zellen. Die Hela-Zellen wurden mit Brdu, welches die Zellen, die die Zellen in S-Phase enthalten, detektiert, und mit Propidiumiodid markiert. Es wurde eine durchflusszytometrische Analyse an den Brdu-Markierungen durchgeführt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die späten S-Phase-Zellen einen geringen Prozentsatz von Zellen in G2/M-Phase für die beiden Zelltypen, die Hela-Vektor- oder Hela-51-Zellen sind, repräsentieren.
E. Cdc2 ist in den Zellen, welche TSAP6 überexprimieren, hyperphosphoryliert. Zu den angegebenen Zeitpunkten nach der DTB-Synchronisierung („relarguage") wurden Zelllysate erzeugt und die Analyse durch Immunmarkierung erfolgte unter Verwendung eines anti-cdc2-Antikörpers derart, dass die unterschiedlichen phosphorylierten Formen von cdc2 detektiert wurden. Diese Analyse hat gezeigt, dass 12 h nach der DTB-Synchronisierung („relarguage") die Hauptmenge des cdc2 in den Hela-Vektor-Zellen dephosphoryliert ist, was eine aktive Form anzeigt. Überraschenderweise erwies sich in den Hela-51-Zellen cdc2 in dem gleichen Moment als hyperphosphoryliert.

6: GST-TCTP wechselwirkt mit TSAP6 in vitro.
Wechselwirkung von GST-TCTP und von radioaktiv markiertem TSAP6. TSAP6 und die Negativkontrolle AIP1 wurden durch in vitro-Translation (IVT) in einem Kaninchenretikulozytenlysat in Gegenwart von mit ³⁵S markiertem Methionin und Cystein erzeugt. Gleiche Mengen von radioaktiv markierten Produkten wurden entweder mit GST-TCTP oder den GST-NKTR-Fusionsproteinen, die auf Glutathion-Kügelchen eingefangen waren, als Negativkontrolle inkubiert. Die radioaktiv markierten Proteine wurden in einen Proteinprobenpuffer eluiert, unter Reduktionsbedingungen (0,7 mM 2-β-Mercaptoethanol) durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) (10%) aufgetrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
BEISPIELE
Beispiel 1: Bindung zwischen TSAP6 und den Proteinen, welche unter SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44 oder 46 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 45 oder 47. kodiert werden.
Die zwischen TSAP6 und jedem Protein, welches unter SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, existierende Bindung wurde in einem Doppel-Hybrid-System, welches von dem von Finley und Brent (Interaction trap cloning with yeast, 169–203, in DNA Cloning, Expression Systems: a practical Approach, 1995, Oxford Universal Press, Oxford) entwickelten System abgeleitet worden ist, unter Verwendung von TSAP6 als Köder („bait") und einer cDNA-Bank als Beute („prey") beobachtet.
Das TSAP6-Protein wurde in das Plasmid pEG202, welches dem Fachmann auf diesem Gebiet für eine solche Anwendung bekannt ist (Promotor 67-1511, lexA 1538–2227, ADH Ter 2209–2522, pBR remnants 2540–2889, 2μ ori 2890–4785, YSCNFLP 4923–5729, HIS3 7190–5699, TYIB 7243–7707, RAF_part 7635–7976, pBR-Skelett 7995–10166, bla 8131–8988), kloniert.
Die cDNAs der Bank werden in das Plasmid pJG4-5, welches gleichfalls dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt ist (Promotor GAL 1-528, Fusionskassette 528–849, ADH Ter 867–1315, 2μ ori 1371–3365, TRP1 3365–4250, pUC-Skelett 4264–6422, Ap 4412–5274), kloniert.
Man setzt gleichfalls das Reporterplasmid pSH18-34, welches dem Fachmann auf diesem Gebiet gleichfalls bekannt ist, ein. Dieses Plasmid ist insbesondere bei Invitrogen unter der Referenznummer V611-20 erhältlich und mit diesem wurde gleichfalls der Stamm EGY48 (auch bezeichnet als RFY 231), bei dem gleichen Lieferanten (Referenz Stamm allein: C835-00, transformiert durch pSH18-34: C836-00), transformiert.
Die Bindung wurde in dem Hefestamm RFY 231 (beschrieben in Finley Jr., et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 14266-71) gezeigt. Dieser Hefestamm weist den Genotyp (MATα trp 1Δ::hisG his3 ura3-1 leu2::3Lexop-LEU2) auf und ist von EGY48 (Guris et al., 1993, Cell, 75, 791–803) abgeleitet.
Das Reportergen war das LacZ-Gen.
Man führt die Untersuchung auf einem Galactose enthaltenden Medium, welches kein Leucin enthält, aus und man untersucht das Vorhandensein von gefärbten Kolonien auf diesen Schalen.
Man kann so die Bindung in diesem System zwischen TSAP6 und den Proteinen, welche unter SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44 oder 46 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 45 oder 47, kodiert werden, zeigen.
Beispiel 2: Protokoll für die Expression der GST-Fusionsproteine
Um GST-Fusionsproteine zu erhalten, kann man dem folgenden Protokoll folgen: Herstellung einer Vorkultur ausgehend von einer isolierten Kolonie von BL21 (DE3), welche mit dem Plasmid pGEX-6P-1 oder pGEX-P-1 transformiert ist, in einem SB-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin bei 37°C.
Die Plasmide sind bei Amersham Pharmacia Biotech AB erhältlich.
Die Proteine sind die humanen Proteine, die durch die komplementären cDNAs (SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 7) kodiert werden.
Am folgenden Tag 250 ml SB + Amp mit 5 ml der Vorkultur inokulieren.
Vermehrung bei 28°C oder 37°C je nach der Toxizität der Proteine für die Wirtsbakterien bis zu einer optischen Dichte zwischen 0,5 und 0,7.
Zugabe von 0,1 mM IPTG, um die Synthese der Proteine zu induzieren.
Vermehrung bei 28°C oder 37°C während 1 h oder 1 h 30.
Zentrifugation bei 3000 Upm während 10 min (1800 g, 4°C).
Resuspendierung des Präzipitats in 10 ml Puffer A NP40 (NP40 1%; Tris, pH 7,4, 10 mM; NaCl 150 mM; EDTA 1 mM; Glycerol 10%; DTT 1 mM; Aprotinin 2 μg/ml; Leupeptin 2 μg/ml; Pepstatin 2 μg/ml; AEBSF 1 mM).
Dreimalige Beschallung während 15 s bei Leistung 50 auf Eis.
Zentrifugation bei 12000 Upm während 10 min (18000 g, 4°C).
Den Überstand bei –80°C aufbewahren.
Beispiel 3: Für die Bindung der Fusionsproteine an die Sepharose-Glutathion-Kügelchen zu befolgendes Protokoll
Zugeben von 2 ml Überstand zu 200 μl Kügelchen (hergestellt nach 3 Spülungen in PBS, 1 Spülung in Puffer A NP40, Resuspendierung zu 50% (Gewicht/Volumen) in Puffer A NP40, jedes Mal Zentrifugation bei 3000 Upm).
Die Glutathion-Sepharose 4B-Kügelchen sind bei Amersham Pharmacia Biotech AB unter der Nr. 17.0756.01 erhältlich.
Wenigstens 1 h sanft bei 4°C bewegen.
Die Kügelchen dreimal in Puffer A NP40 ohne Proteaseinhibitor spülen.
Die Kügelchen in 1 ml Puffer A NP40 mit Proteaseinhibitor resuspendieren.
Für die Analyse durch SDS-PAGE-Elektrophorese 20 bis 40 μl der resuspendierten Kügelchen nehmen, 5 min zentrifugieren, den Überstand verwerfen, die Kügelchen in 10 μl Auftragspuffer X resuspendieren, bei 97°C 7 min erwärmen. Auf ein Gel aufladen und nach Sichtbarmachung durch Coomassie-Blau analysieren, um die zu verwendende Menge der Fusionsproteine zu normalisieren.
Beispiel 4: Protokoll für die in vitro-Translation von Proteinen
Es wird der Kit TNT Coupled Reticulocyte Lysate System von Promega mit der T7- oder T3-RNA-Polymerase abhängig von dem Vektor, welcher eingesetzt wird, um die Proteine zu translatieren und zu exprimieren (beispielsweise T7 für TSAP6, T3 für das Protein, welches unter SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird), eingesetzt. Der Kit wird gemäß den Anweisungen des Herstellers (Referenz L4610) eingesetzt.
Die Proteine enthalten ³⁵S-Methionin (Amersham Pharmacia).
Die in vitro erhaltenen Proteine werden durch SDS-PAGE-Elektrophorese analysiert.
Nach der Elektrophorese wird das Gel ½ h in Fixierungspuffer (5% Methanol, 15% Essigsäure, 80% Wasser) gelegt und das Signal wird durch Eintauchen des Gels in das Produkt Amplify von Amersham Pharmacia (Ref.: NAMP100) amplifiziert.
Dann wird ein Kodak Biomax MR-Film auf dem getrockneten Gel während einer Dauer, die von einer Stunde bis zu einer Woche variiert, exponiert, dann entwickelt.
Beispiel 5: Protokoll für die Copräzipitation der Proteine
30 μl Sepharose-Glutathion-Kügelchen, gekoppelt mit den GST-Fusionsproteinen, werden nach Normalisierung der Mengen in Puffer B (NP40 1%, TrisHCl 50 mM, NaCl 150 mM, Leupeptin 2 μl/ml, Aprotinin 1%, ABESF 1 mM) gespült. Man setzt dann 5 bis 10 μl des in vitro-Translationsprodukts, wie es in Beispiel 3 erhalten worden ist, abhängig von der durch Autoradiographie beobachteten Menge des Produkts zu.
Nach einer Nacht Kontakt werden die Kügelchen zehnmal mit Puffer A NP40 ohne Antiproteasen gespült.
Man analysiert durch SDS-PAGE und Autoradiographie.
Man kann so die Bindung zwischen den TSAP6-Proteinen und dem Protein, welches unter SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, zeigen.
Beispiel 6: Protokoll für das Screening von Verbindungen, welche mit der Bindung zwischen TSAP6 und dem einen der Proteine unter SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 oder welches durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, interferieren
Man führt die in den Beispielen 2 bis 5 beschriebenen Versuche aus, indem man die Verbindungen, die man zu untersuchen wünscht, in dem Schritt des Beispiels 5 zusetzt, und man vergleicht mit den Ergebnissen, die erhalten werden, wenn die Verbindungen nicht zugesetzt werden.
MATERIALIEN UND METHODEN
Expression und Reinigung der GST-Fusionsproteine
Es wurde über Nacht bei 37°C eine Vorkultur von TCTP pGEX-6P-1 oder von NKTR in SB + Ampicillin 100 μg/ml ausgehend von einer einzelnen Kolonie hergestellt.
Am Morgen wurden 250 ml LB + Amp mit 5 ml dieser Vorkultur inokuliert.
Vermehrung bei 37°C, bis die OD 0,5 bis 1 erreicht (ungefähr 3 h).
Zugabe von 0,1 mM IPTG.
Vermehrung während weiterer 1 h 30.
Zentrifugation bei 3000 Upm während 10 min.
Resuspendierung des Bodensatzes in 10 eines Lysepuffers A NP40 derart, dass Blasen vermieden werden:
N P40 1%*
Tris pH 7,4, 10 mM*
NaCl 150 mM*
EDTA 1 mM^*
Glycerol 10%*
DTT 1 mM
Aprotinin 2 μg/ml
Leupeptin 2 μg/ml
Pepstatin 2 μg/ml
AEBSF 1 mM.
Dreimalige Beschallung für 15 s in Eis alle 15 s bei einer Leistung von 40.
Zentrifugation bei 12000 Upm = 18000 g (Zentrifuge 1510R) bei 4°C während 30 min.
Aufbewahrung des Überstands vorsichtshalber bei –80°C, sofern erforderlich.
Bindung an die Agarose-Glutathion-Kügelchen
Zugabe von 2 ml Überstand zu 200 μl Kügelchen (sie müssen mit 3 Spülungen mittels PBS, 1 Spülung mittels des NP40-Puffers und mit Proteaseinhibitoren, resuspendiert zu 50%-iger Konzentration in diesem NP40-Puffer, jedes Mal Zentrifugation bei 1500 Upm = 900 g (Zentrifuge 1510R) bei 4°C, hergestellt werden).
Wenigstens 1 h bei 4°C sanft bewegen.
Dreimaliges Spülen der Kügelchen in Puffer A NP40 ohne Proteaseinhibitor in jedes Mal 10 ml NP40-Puffer (50 Volumen).
Resuspendierung von 200 μl Kügelchen in 200 μl NP40-Puffer mit Proteaseinhibitoren, um eine 50%-ige Lösung zu erhalten.
Analyse des Gels:
Zentrifugation von 20 μl während 5 min, Entfernung des Überstands, Resuspendierung der Kügelchen in 10 μl zweimal in einem Probenpuffer, Erwärmen während 7 min bei 97°C. Beladung des Gels zur Normalisierung einer Menge von GST-Fusionsproteinen. Es wurden 10%-ige Novex NuPAGE-Gele mit MES-Puffer eingesetzt, um eine gute Auftrennung zu erhalten.
In vitro-Translation
Es wurde der Kit „TNT Coupled Reticulocyte Lysate System" von PROMEGA mit der T7-Polymerase eingesetzt. Es wurde dem regulären Protokoll gefolgt.
Die Proteine wurden mit ³⁵S-Methionin oder ³⁵S-Methionin und -Cystein von Amersham Pharmacia radioaktiv markiert.
Die Mischung wurde in Eis hergestellt. Die Radioaktivität wurde am Ende zugesetzt.
Die Reaktion erfolgt bei 30°C während 1 h 30.
Während der in vitro-Translation wurden die Kügelchen hergestellt: Berechnung der Menge von jedem Fusionsprotein, welches an Agarose-Glutathion-Kügelchen gebunden ist. In jedem Falle Zugabe von reichlich Kügelchen, um ein Gesamtvolumen von 30 μl Kügelchen pro Wechselwirkung zu haben, mit dem Ziel, in der Lage zu sein, diese auf dem Boden des Röhrchens zu sehen. Die Kügelchen wurden dreimal in 1 ml Puffer B: NP40 1%, TrisHCl 50 mM, NaCl 150 mM, Leupeptin 2 μg/ml, Aprotinin 1%, AEBSF 1 mM, gespült.
Ein Aliquot von 30 μl Kügelchen (60 μl einer 50%-igen Lösung) wurde in Eppendorf-Röhrchen gegeben. Zugabe von 50 μl Puffer B NP40 + Inhibitoren in jedes Röhrchen, um während der Wechselwirkung ein entsprechendes Volumen zu haben. Die Positiv- und Negativkontrollen wurden nicht vergessen. Es empfiehlt sich, GST allein als Negativkontrolle zu vermeiden, denn dieses ist zu viskos.
Nachdem die in vitro-Translation stattgefunden hat, Zugabe von 3 bis 30 μl IVT (je nach der angestrebten Normalisierung) zu jeden 30 μl Kügelchen).
Zugabe von SB 2X, enthaltend 0,7 mM β-Mercaptoethanol, zu dem Rest der IVT, um das Gel zu analysieren. Erwärmen der Proben vor dem Auftrag 5 min bei 80°C.
Nach einer Nacht Kontakt bei 4°C oder 1 h bei Umgebungstemperatur werden die Kügelchen zehnmal in Puffer A oder B (wenn eine bedeutende Stringenz akzeptabel ist) (10 × 1,5 ml) bei 4°C gespült. Nach dem Spülen werden die Kügelchen mit 10 ml Puffer bedeckt, zu welchem man 30 μl 2 × SB, enthaltend 0,7 mM β-Mercaptoethanol, hinzufügt, vor der Analyse durch SDS-PAGE 5 min bei 80°C erwärmt. Es können 12 bis 20 μl der Proben in jede Vertiefung eingefüllt werden. Nach der Elektrophorese wird das Gel in einen Fixierungspuffer (5% Methanol, 15% Essigsäure, 80% Wasser) 30 min eingetaucht und das Signal wird durch Eintauchen des Gels in das Produkt Amplify von Amersham Pharmacia amplifiziert.
Dann wird ein Kodak Biomax MR-Film auf dem trockenen Gel 1 h bis 1 Woche exponiert und entwickelt. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche die Bindung von TSAP6 an eines der Proteine, welches aus SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, inhibiert, welches die Schritte aufweist: a) die Verbindung mit einem System in Kontakt zu bringen, welches die in vitro-Bestimmung der Bindung zwischen TSAP6 und einem der Proteine, welches aus SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, erlaubt; b) die Verringerung und/oder die Inhibition der Bindung zwischen TSAP6 und dem unter a) definierten Protein zu identifizieren.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche die Erhöhung der Tumorreversion und/oder des Zelltods (Apoptose) erlaubt, dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte aufweist: a) Verbindungen mit einem System in Kontakt zu bringen, welches die in vitro-Bestimmung der Bindung zwischen TSAP6 und einem der Proteine, welches aus SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, erlaubt; b) die Verbindungen zu identifizieren, welche die Verringerung und/oder die Inhibition der Bindung zwischen TSAP6 und dem unter a) definierten Protein induzieren; c) die in Schritt b) identifizierten Verbindungen in einem in vitro-System in Kontakt zu bringen, welches erlaubt, die Phänomene von Apoptose und/oder von Tumorreversion zu messen; d) die Erhöhung der Tumorreversion und/oder des Zelltods (Apoptose) in dem Modell bezogen auf ein Vergleichsmodell, mit welchem die Verbindung nicht in Kontakt gebracht worden ist, zu identifizieren.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung für die Verringerung und/oder die Inhibition der Tumorreversion und/oder des Zelltods (Apoptose), welches die Schritte aufweist: a) Verbindungen mit einem System in Kontakt zu bringen, welches die in vitro-Bestimmung der Bindung zwischen TSAP6 und einem der Proteine, welches aus SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, erlaubt; b) die Verbindungen zu identifizieren, welche die Verringerung und/oder die Inhibition der Bindung zwischen TSAP6 und dem unter a) definierten Protein induzieren; c) die in Schritt b) identifizierten Verbindungen in einem in vitro-System in Kontakt zu bringen, welches erlaubt, die Phänomene von Apoptose und/oder von Tumorreversion zu messen; d) die Verringerung und/oder die Inhibition der Tumorreversion und/oder des Zelltods (Apoptose) in dem Modell bezogen auf ein Vergleichsmodell, mit welchem die Verbindung nicht in Kontakt gebracht worden ist, zu identifizieren.
Verfahren zur Identifizierung der Regionen von TSAP6, welche beteiligt sind an der Bindung an eines der Proteine, welches aus SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, welches die Schritte umfasst: a) Peptide, welche von dem Protein TSAP6 stammen, in einem System in Kontakt zu bringen, welches die in vitro-Bestimmung der Bindung zwischen TSAP6 und dem Protein, welches aus SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, erlaubt; b) die Peptide zu identifizieren, welche die Verringerung der Bindung zwischen TSAP6 und dem Protein, welches aus SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird, in dem System zur Folge haben.
Verfahren zur Identifizierung eines Produkts, welches eine Aktivität einer Erhöhung der Tumorreversion und/oder der Apoptose aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte umfasst: a) ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2 auszuführen, b) das in Schritt a) selektierte Produkt insbesondere durch Aufpfropfen von Resten auf das chemische Grundgerüst zu modifizieren, c) das in Schritt b) modifizierte Produkt in in vitro-Verfahren an geeigneten Modellen von Tumorreversion und/oder Apoptose zu testen, d) das Produkt zu identifizieren, welches erlaubt, eine Tumorreversions- und/oder Apoptoseaktivität, welche höher ist als die Aktivität, die für das in Schritt a) selektierte Produkt erhalten wird, zu erhalten.
Verfahren zur Identifizierung eines Produkts, welches eine Aktivität einer Verringerung und/oder einer Inhibition der Tumorreversion und/oder der Apoptose aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte umfasst: a) ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 3 auszuführen, b) das in Schritt a) selektierte Produkt insbesondere durch Aufpfropfen von Resten auf das chemische Grundgerüst zu modifizieren, c) das in Schritt b) modifizierte Produkt in in vitro-Verfahren an geeigneten Modellen von Tumorreversion und/oder Apoptose zu testen, d) das Produkt zu identifizieren, welches erlaubt, eine Tumorreversions- und/oder Apoptoseaktivität, welche bezogen auf die Aktivität, die für das in Schritt a) selektierte Produkt erhalten wird, verringert ist, zu erhalten.
Komplex, welcher gebildet wird aus einem TSAP6-Protein und einem der Proteine, welches aus SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 35 oder SEQ ID Nr. 44, 45 oder 47 ausgewählt oder durch eine Nukleinsäure, ausgewählt aus SEQ ID Nr. 36 bis SEQ ID Nr. 43 oder SEQ ID Nr. 46 oder 48, kodiert wird.