DE60029812T2

DE60029812T2 - Diagnose von Zellenproliferation sowie Screening-Verfahren für deren Modulatoren

Info

Publication number: DE60029812T2
Application number: DE60029812T
Authority: DE
Inventors: W. Kenneth Foster City WOOD; T. Jeffrey Foster City FINER; Christophe San Francisco BERAUD; John San Bruno MAK; Roman Foster City SAKOWICZ
Original assignee: Cytokinetics Inc
Current assignee: Cytokinetics Inc
Priority date: 1999-10-27
Filing date: 2000-10-26
Publication date: 2007-03-29
Anticipated expiration: 2020-10-27
Also published as: AU1236101A; US20040214249A1; CA2387804A1; WO2001031335A3; ES2269196T3; EP1224460A2; US6617115B1; US20100261160A1; WO2001031335A2; EP1726954A2; EP1224460B1; DE60029812D1; ATE335200T1; US6414121B1; US6437115B1; EP1726954A3; WO2001031335A9

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Nukleinsäuren, die für das Kinesin-Protein KSP kodieren, und ihre Gen-Produkte, um Modulatoren für die Zellproliferation zu identifizieren, und ihre Verwendung in der Diagnose, der Prognose und der Behandlung von Zellproliferationszuständen und -störungen, zum Beispiel Krebs.
Hintergrund der Erfindung
In den industrialisierten Staaten ist Krebs die zweithäufigste Todesursache. Effektive Therapien beinhalten Taxane und Vinca Alkaloide, Substanzen, die auf die Mikrotubuli einwirken. Mikrotubuli sind die primären Struktureinheiten des mitotischen Spindelapparates (Kernteilungsspindel). Der mitotische Kernspindelapparat ist für die Verteilung der replizierten Kopien der Genome auf jede der beiden Tochterzellen, die aus der Zellteilung resultieren, verantwortlich. Es wird angenommen, dass es die Zerstörung des Kernspindelapparates durch diese Arzneimittel ist, die zur Inhibierung der Teilung der Krebszelle und damit auch zur Einleitung des Todes der Krebszelle führt. Jedoch formen Mikrotubuli auch andere Arten von zellulären Strukturen, einschließlich Bahnen für den intrazellulären Transport in Nervenzellen. Daher haben die Taxane Nebenwirkungen, die ihre Verwendbarkeit einschränken. Ferner zielen Taxane und Vinca Alyloide speziell auf die Dynamik der Polymerisation der Mikrotubuli. Es gibt weitere Vorgänge des Kernspindelapparates, die von diesen Verbindungen nicht beeinflusst werden.
Daher ist es wünschenswert, Substanzen und Zusammensetzungen zu identifizieren, die spezifisch und therapeutisch gegen Krebs wirken. Es ist ferner wünschenswert, Substanzen und Zusammensetzungen aufzuzeigen, die einen neuen Wirkmechanismus haben. Weiterhin ist es wünschenswert, Verfahren zur Diagnose von Hyper- oder Hypostörungen der Zellproliferation zur Verfügung zu stellen. Zusätzlich ist es wünschenswert, Substanzen und Zusammensetzungen zu identifizieren, die die Zellproliferation modulieren. Die Modulation der Zellproliferation ist in einer Reihe von Fällen wünschenswert, die nachfolgend diskutiert werden, zum Beispiel bei jeglichen Hyper- oder Hypostörungen der Zellproliferation, bei der Wundheilung, bei Transplantationen und für die Verwendung in landwirtschaftlichen Bereichen. Daher ist es wünschenswert, solche Behandlungsverfahren zur Verfügung zu stellen. Darüber hinaus ist es wünschenswert, Assays zur Verfügung zu stellen, die schnell solche Substanzen und Zusammensetzungen identifizieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Vorliegend werden Assays für das Screening von bioaktiven Substanzen, die die Zellproliferation beeinflussen, bereit gestellt. Ferner werden hier Verfahren, um Proliferations-Stadien in einer Zelle zu diagnostizieren, bereit gestellt, die auch zur Erkennung von Störungen der Zellproliferation, solchen wie Krebs, geeignet sind. Des Weiteren werden Verfahren zur Prognose und Verfahren zur Behandlung, einschließlich der Behandlung von Krebs, bereit gestellt. Wie weiter unten beschrieben wird eine Reihe von Zusammensetzungen und Verfahren bereit gestellt.
In einem Aspekt wird ein Verfahren zum Screening von Arzneimittelkadidaten bereit gestellt. In einer Ausführungsform umfasst dieses Verfahren die Bereitstellung einer Zelle, die rekombinantes KSP oder ein Fragment davon exprimiert, und das Hinzufügen eines einen Kandidaten darstellenden Arzneimittels zu dieser Zelle unter Bedingungen, bei denen das einen Kandidaten darstellende Arzneimittel von der Zelle aufgenommen wird. Das Verfahren beinhaltet ferner die Bestimmung der Wirkung von diesem einen Kandidaten darstellenden Arzneimittel auf die Bioaktivität von diesem rekombinanten humanen KSP. Die Bioaktivität von rekombinanten humanen KSP oder insbesondere die Wechsel in der Anwesenheit eines einen Kandidaten darstellenden Arzneimittels können durch Assays bestimmt werden, solche wie diejenigen zur zellulären Proliferation, zellulären Entwicklungsfähigkeit und zellulären Morphologie. In einem weiteren Aspekt der Erfindung kann jeder Wechsel in der Bioaktivität von rekombinantem humanem KSP durch Assays zur Bestimmung von Wechseln im mitotischen Kernspindelapparat, insbesondere in der Hemmung der Mitose, und in der ATP Hydrolyse bestimmt werden. Die Verfahren können hierbei auch die Bioaktivität von rekombinantem humanem KSP in der Gegenwart und der Abwesenheit von einen Kandidaten darstellenden Substanzen durch das Ausführen von Assays bestimmen, die die Wirkung auf die Apoptose und die Necrose bestimmen.
Die hier zur Verfügung gestellten Verfahren können auf einzelne individuelle Zellen oder eine Population von Zellen angewendet werden. Die Zelle kann eine beliebige Art von Zelle sein, einschließlich aber nicht beschränkt auf eine lymphozyte Krebszelle oder eine Endothel-Zelle. In einem Aspekt, wenn Krebszellen verwendet werden, kann das Krebswachstum oder die Krebshemmung bestimmt werden, und, wenn Endothel-Zellen verwendet werden, kann die Angiogenese oder deren Hemmung bestimmt werden.
In einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Screeningverfahren für eine bioaktive Substanz, die an ein zelluläres Proliferationsprotein binden kann, bereit gestellt. Vorzugsweise ist das zelluläre Proliferationsprotein humanes KSP oder ein Fragment davon. In einer Ausführungsform umfasst dieses Verfahren die Kombination von diesem zellulären Proliferationsprotein und einer einen Kandidaten darstellenden bioaktiven Substanz, wobei diese einen Kandidaten darstellende bioaktive Substanz eine exogene Substanz ist, und die Bestimmung der Bindung von dieser einen Kandidaten darstellenden Substanz an dieses zelluläre Proliferationsprotein.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Screeningverfahren für ein einen Kandidaten darstellendes Protein, das an ein zelluläres Proliferationsprotein binden kann, wobei dieses zelluläre Proliferationsprotein KSP oder ein Fragment davon ist, bereit gestellt. In einem bevorzugten Verfahren umfasst dieses Verfahren die Kombination einer Nukleinsäure, die für dieses zelluläre Proliferationsprotein kodiert, und einer Nukleinsäure, die für ein einen Kandidaten darstellendes Protein kodiert, bei dem ein identifizierbarer Marker exprimiert wird, durch den dieses einen Kandidaten darstellenden Protein an dieses zelluläre Proliferationsprotein bindet.
Ferner wird hier ein Screeningverfahren für eine bioaktive Substanz bereit gestellt, die die Bindung von einem zellulären Proliferationsprotein und einem Antikörper stören kann, wobei dieses zelluläre Proliferationsprotein KSP oder ein Fragment davon ist, und wobei der Antikörper an dieses zelluläre Proliferationsprotein bindet. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren die Kombination von einem zellulären Proliferationsprotein, wobei dieses zelluläre Proliferationsprotein KSP oder ein Fragment davon ist, einer einen Kandidaten darstellenden bioaktiven Substanz und einem Antikörper, der an dieses zelluläre Proliferationsprotein bindet, und die Bestimmung der Bindung von diesem zellulären Proliferationsprotein und diesem Antikörper.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird hier ein Screeningverfahren für eine bioaktive Substanz, die die Aktivität von einem zellulären Proliferationsprotein modulieren kann, wobei dieses zelluläre Proliferationsprotein humanes KSP oder ein Fragment davon ist, bereit gestellt. In einem Aspekt umfasst dieses Verfahren die Kombination von diesem zellulären Proliferationsprotein und einer einen Kandidaten darstellenden bioaktiven Substanz, wobei diese einen Kandidaten darstellende bioaktive Substanz eine exogene Substanz ist, und die Bestimmung der Wirkung von dieser einen Kandidaten darstellenden Substanz auf die Aktivität von diesem zellulären Proliferationsprotein.
Ferner wird hier ein Screeningverfahren für einen Kandidaten darstellende Arzneimittel bereit gestellt, das die Bereitstellung einer Zelle, die KSP exprimiert, die Zugabe des einen Kandidaten darstellenden Arzneimittels zu dieser Zelle, und die Bestimmung der Wirkung von diesem einen Kandidaten darstellenden Arzneimittel auf die Expression von KSP umfasst. In einem weiteren Aspekt beinhaltet das Verfahren den Vergleich des Expressionslevels bei Abwesenheit von diesem einen Kandidaten darstellenden Arzneimittel zu dem Expressionslevel bei Anwesenheit von diesem einen Kandidaten darstellenden Arznei mittel, wobei die Konzentration von diesem einen Kandidaten darstellenden Arzneimittel bei Anwesenheit variieren kann, und wobei dieser Vergleich nach der Zugabe oder der Entfernung des einen Kandidaten darstellenden Arzneimittels erfolgen kann. In einer bevorzugten Ausführungsform geht die Expression von diesem KSP aufgrund der Einführung des einen Kandidaten darstellenden Arzneimittels zurück. Insbesondere ist diese Zelle eine Tumorzelle.
In einem weiteren Aspekt wird ein Evaluierungsverfahren für die Wirkung von einem einen Kandidaten darstellenden Arzneimittel für die zelluläre Proliferation (einem einen Kandidaten darstellenden Zellproliferations-Arzneimittel) bereit gestellt, das die Darreichung dieses Arzneimittels an einen Patienten, das Entfernen einer Zellprobe von diesem Patienten und die Bestimmung des Expressions-Profils einschließlich eines KSP-Gens, umfasst. In einem anderen Aspekt beinhaltet das Verfahren den Vergleich dieses Expressionsprofils mit einem Expressionsprofil von einem gesunden Individuum.
In einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Diagnoseverfahren für eine hyper-vermehrende Störung in einem Individuum bereit gestellt, das die Bestimmung des Expressionslevels eines KSP-Gens in einem Individuum und den Vergleich dieses Levels mit einem Standard- oder Kontroll-Expressionslevel umfasst, wobei eine Erhöhung darauf hindeutet, dass das Individuum eine hyper-vermehrende Störung hat, beispielsweise, aber nicht beschränkt auf Krebs.
Hier wird auch ein Evaluierungsverfahren für die Wirkung von einem einen Kandidaten darstellenden Arzneimittel für die zelluläre Proliferation bereit gestellt, das die Verabreichung dieses Arzneimittels an einen Patienten, wobei dieser Patient Krebs hat und als einer identifiziert wurde, der KSP auf einem höheren Level exprimiert als Individuen, die kein Krebs haben, die Entfernung einer Zellprobe von diesem Patienten und die Bestimmung der Wirkung auf die KSP-Aktivität, wobei diese KSP-Aktivität die Mitose ist, umfasst.
In den Verfahren, die hier bereit gestellt werden, können die Zellen von einer Vielzahl von Quellen stammen. Zum Beispiel können Proben ohne Beschränkung der Allgemeinheit stammen von einer Blut-Probe, einer Urin-Probe, einer bukkalen Probe, einem PAP-Abstrich, Hirnrückenmarksflüssigkeit und jedem Gewebe, einschließlich Brustgewebe, Lungengewebe und Darmgewebe. In einer Ausführungsform hat der Patient Krebs.
Weiterhin wird hier ein Verfahren zur Inhibierung der zellulären Proliferation bereit gestellt, wobei dieses Verfahren die Verabreichung einer einen Antikörper für KSP umfassenden Zusammensetzung in eine Zelle umfasst, wobei dieser Antikörper zu einem Liganden konjugiert ist. In einem Aspekt ist der Ligand des Antikörpers spezifisch für Tumorzellen. In einem anderen Aspekt ermöglicht der Ligand diesem Antikörper den Zugang zu dieser Zelle. Zudem kann der Antikörper ein humaner Antikörper sein. Das Verfahren zu Inhibierung kann in vitro auf Zellen oder in vivo bei einem Individuum angewendet werden. In einer Ausführungsform sind die Zellen krebsartig. In einer weiteren Ausführungsform hat das Individuum Krebs. Ein anderes Verfahren zur Inhibierung der zellulären Proliferation in einer Zelle oder einem Individuum, welches die Verabreichung einer ein Antisense-Molekül für KSP enthaltenden Zusammensetzung in eine Zelle oder an ein Individuum umfasst, wird hier bereit gestellt.
In noch einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung wird ein Verfahren zur Inhibierung der zellulären Proliferation bereit gestellt, welches die Verabreichung einer einen Inhibitor für KSP enthaltenden Zusammensetzung in eine Zelle umfasst. In einer Ausführungsform ist der Inhibitor von humanem KSP oder einem Fragment davon. In einer Ausführungsform ist der Inhibitor spezifisch für humanes KSP. In einer Ausführungsform können KSP-Inhibitoren jede Substanz sein, die KSP-Aktivität, wie im weiteren beschreiben, unterbricht oder inhibiert. In einem Aspekt der Erfindung ist der Inhibitor von KSP ein kleines Molekül, wie es hier im weiterem definiert ist. Im allgemeinen haben kleine Moleküle ein Molekulargewicht zwischen 50 kD und 2000 kD und in einigen Fällen weniger als 1500 kD oder weniger als 1000 kD oder weniger als 500 kD. Beispiele für KSP-Inhibitoren beinhalten ohne Beschränkung der Allgemeinheit kleine Moleküle, Ribozyme, Antisense-Moleküle und Antikörper. KSP-Inhibitoren sind hier im weiteren beschrieben und in der Anmeldung, die am 27. Oktober 1999 angemeldet wurde mit dem Titel „Methods and Compositions Utilizing Quinazolines" (serial number: noch nicht zugestellt, benannter Erfinder: Jeffrey T. Finer), die durch Referenz in ihrer Gesamtheit hier eingefügt wird. In einer Ausführungsform enthält die Zusammensetzung, die in einer Zelle verabreicht wird, ferner einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Die Zusammensetzung kann eine Vielzahl von Formulierungen haben, einschließlich aber nicht beschränkt auf die parentale, orale oder topische Verabreichung.
Die Verfahren zur Inhibierung der zellulären Proliferation können in vitro oder in vivo durchgeführt werden. Vorzugsweise können die Zusammensetzungen einer Zelle in vitro oder einem Individuum verabreicht werden. Das Individuum kann eine Krank heit haben oder ein Risiko für eine Krankheit aufweisen. Krankheitsbilder, die mit den hier beschriebenen Verfahren behandelt werden können, sind weiter unten beschrieben. In einem Fall hat das Individuum Krebs oder es besteht ein Risiko zur Restenose. Die Zelle kann jede Zelle sein, bevorzugt eine Krebszelle. Andere bevorzugte Zelltypen beinhalten ohne Beschränkung der Allgemeinheit Endothel-Zellen und Metastasen bildende Krebszellen. In einer Ausführungsform wird das Verfahren zur Inhibierung durch den KSP-Inhibitor durch Störung der Mitose oder durch Einleitung der Apoptose realisiert.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Biochip, der ein Nukleinsäure-Segment von KSP enthält, bereit gestellt, wobei dieser Biochip weniger als 1000 Nukleinsäure-Einheiten umfasst. Auch werden hier Screeningverfahren und Diagnosebedingungen für diesen Biochip bereit gestellt.
Andere Aspekte der Erfindung werden durch die folgende Beschreibung der Erfindung für den Fachmann ersichtlich werden.
Ausführliche Beschreibung der Abbildungen
1 zeigt eine cDNA Sequenz von humanem KSP, GenBank Zugangsnummer X85137, bei der das Anfangs- und das Endkodon unterstrichen in Fettdruck gezeigt werden, beginnend bei der Position 11 beziehungsweise bei 3182.
2 zeigt eine Aminosäure-Sequenz, die für humanes KSP codiert.
3 zeigt eine Nukleinsäure-Sequenz, die für ein Fragment von KSP codiert, hier mit KSPL360 bezeichnet. Teilbereiche, die sich von den Sequenzen der 1 und 2 unterscheiden, sind in fetter Schriftart gekennzeichnet und unter strichen. Reste am C-Terminus beinhalten ein myc Epitop und ein 6-Histidin Tag.
4 zeigt eine Aminosäure-Sequenz, die für KSPL360 codiert.
5 zeigt eine Nukleinsäure-Sequenz, die für ein Fragment von KSP codiert, hier mit KSP-K491 bezeichnet. Teilbereiche, die sich von den Sequenzen der 1 und 2 unterscheiden, sind in fetter Schriftart gekennzeichnet und unterstrichen. Reste am C-Terminus beinhalten ein myc Epitop und ein 6-Histidin Tag.
6 zeigt eine Aminosäure-Sequenz, die für KSP-K491 codiert.
7 zeigt eine Nukleinsäure-Sequenz, die für ein Fragment von KSP codiert, hier mit KSP-S553 bezeichnet. Teilbereiche, die sich von den Sequenzen der 1 und 2 unterscheiden, sind in fetter Schriftart gekennzeichnet und unterstrichen. Reste am C-Terminus beinhalten ein myc Epitop und ein 6-Histidin Tag.
8 zeigt eine Aminosäure-Sequenz, die für KSP-S553 codiert.
9 zeigt eine Nukleinsäure-Sequenz, die für ein Fragment von KSP codiert, hier mit KSP-K368 bezeichnet. Teilbereiche, die sich von den Sequenzen der 1 und 2 unterscheiden, sind in fetter Schriftart gekennzeichnet und unterstrichen.
10 zeigt eine Aminosäure-Sequenz, die für KSP-K368 codiert.
11 ist ein Diagramm, das mRNA-Levels von KSP in passendem normalem und Tumorgewebe von Brust, Lunge und Darm zeigt. MRNA-Levels wurden durch quantitative PCR bezogen auf einen Standard gemessen. Die relativen Größen der Überexpression in jeder Tumorprobe verglichen mit dem passenden normalen Gewebe werden über jedem Paar angezeigt. Alle Werte sind auf das Level von mRNA Expression von KSP, wie sie in kultivierten HeLa Zellen beobachtet wird, normalisiert.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Hier werden Assays für das Screening von bioaktiven Substanzen, die die Zellproliferation beeinflussen, bereit gestellt. Auch werden hier Diagnoseverfahren für Proliferationsstadien in einer Zelle bereit gestellt, die für die Identifizierung von Störungen der Zellproliferation, solchen wie Krebs, geeignet sind. Auch werden hier Verfahren zur Prognose und Verfahren zur Behandlung einschließlich der Behandlung von Krebs bereit gestellt. Wie weiter unten beschreiben wird eine Reihe von Zusammensetzungen und Verfahren bereit gestellt.
In einem Aspekt beinhalten die Assays oder Diagnoseverfahren, die hier bereit gestellt werden, die Verwendung eines zellulären Proliferationsproteins oder einer Nukleinsäure. Die Begriffe „Zellproliferation" und „zelluläre Proliferation" werden hier synonym benutzt. Ferner kann das zelluläre Proliferationsprotein und die Nukleinsäure hier als „zelluläre Proliferationssequenz" bezeichnet werden, wobei der Kontext verdeutlichen wird, ob es sich um eine Aminosäure-Sequenz oder eine Nukleinsäure-Sequenz handelt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die zelluläre Proliferationssequenz KSP. KSP gehört zu einer evolutionsmäßig unveränderten Unterfamilie von Kinesinen von zum positiven Ende gerichteten Mikrotubuli-Motoren, die sich aus bipolaren Homoterameren bestehend aus antiparallelen Homodimeren aufbauen. Während der Mitose bindet KSP an die Mikrotubuli des mitotischen Kernspindelapparates. Mikroinjektion von gegen KSP gerichteten Antikörpern in Zellen verhindert die Spindel-Pol-Trennung während der Prometaphase, wodurch es zur Entstehung von einpoligen Spindeln kommt und die Hemmung der Mitose verursacht wird. KSP und verwandte Kinesine bündeln antiparallele Mikrotubuli und verschieben sie relativ zueinander, wodurch das Erscheinen der zwei Spindelpole erzwungen wird. KSP kann auch in der Anaphase B eine Verlängerung der Spindeln und die Fokussierung der Mikrotubuli an den Spindelpolen vermitteln.
Von humanem KSP (auch als HsEg5 bezeichnet) wurde berichtet. Galgio et al., J. Cell. Bio., 135(2): 399–414 (1996); Kaiser et al., JBC, 274(27): 18925–31 (1999): Blangy et al., Cell, 83: 1159–69 (1995); Blangy et al., J Biol. Chem., 272: 19418–24 (1997); Blangy, et al., Cell Motil Cytoskeleton, 40: 174.82 (1998); Whitehead et al., Arthritis Rheum., 39: 1635–42 (1996); GenBank Zugangsnummern: X85137, NM 004523 und U37426. Darüber hinaus wurde von einem Fragment des KSP-Gens (TRIP5) berichtet. Lee et al., Mol Endocrinol., 9: 243–54 (1995); GenBank Zugangsnummer L40372. Siehe daneben: Whitehead und Rattner, J. Cell Sci., 111: 2551–61 (1998).
Über Xenopus KSP Homologe (Eg5) wurde auch berichtet. Walczak et al., Curr Biol., 8(16): 903–13 (1998); Le Guellec et al., Mol. Cell Biol., 11(6): 3395–8 (1991); Sawin et al., Nature, 359: 540–3 (1992); Sawin und Mitchison, Mol. Biol. Cell, 5: 217–26 (1994); Sawin und Mitchison, PNAS, 92: 4269–93 (1995); Kapoor und Mitchison, PNAS, 96: 9106–11 (1999); Lockhart und Cross, Biochemistry, 35(7): 2365–73 (1996); Crevel et al., J. Mol. Biol., 273: 160–170 (1997). Zusätzlich wurde über Dro sophila KLP61F/KRP130 berichtet. Heck et al., J. Cell. Biol., 123: 655–79 (1993); Cole et al., J. Biol. Chem., 269(37): 22913–6 (1994); Barton et al., Mol. Biol. Cell, 6: 1563–74 (1995).
In einer hier bevorzugten Ausführungsform wird eine Sequenz wie sie in den Abbildungen zu sehen ist, verwendet. Wie hier gezeigt ist, wird in einigen Ausführungsformen ein Fragment von KSP verwendet. Bevorzugte Proteinfragmente sind in den 2, 4, 6 und 8 zu sehen. In einer Ausführungsform ist das zelluläre Proliferationsfragment, das in 4 zu sehen ist, bevorzugt. Bevorzugte Fragmente von KSP haben wie weiter unten beschrieben Kinesin-Aktivität. Darüber hinaus haben in einer Ausführungsform KSP-Peptide oder -Fragmente mindest ein und vorzugsweise mindestens zwei Epitop Tags. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein KSP Fragment ein myc Epitop und ein Histidin Tag.
In einer anderen hier bevorzugten Ausführungsform ist das zelluläre Proliferationsprotein nicht glykosyliert. Zum Beispiel ist in einer Ausführungsform das Protein beispielsweise humanoid exprimiert in Bakterien, beispielsweise E. Coli. Darüber hinaus kann Phosphorylierung und/oder Methylierung von KSP, wie es hier verwendet wird, sich von KSP unterscheiden, wie es in seiner natürlichen Form in der Zelle gefunden wird.
Während ist bevorzugt ist, dass die zellulären Proliferationssequenzen von Menschen kommen, können Sequenzen von anderen Organismen daher bei Tiermodellen von Krankheiten und bei der Evaluierung von Arzneimitteln sinnvoll sein; in alternativen Ausführungsformen werden daher andere Sequenzen bereit gestellt, solche von Wirbeltieren, einschließlich Säugetieren, einschließlich Nagetiere (Raten, Mäuse, Hamster, Meerschwein chen, etc.), Primaten, Bauernhoftiere (einschließlich Schafe, Ziegen, Schweine, Kühe, Pferde etc.), Krallenfrosch (Xenopus) und Drosophila.
In einer anderen Ausführungsform sind die Sequenzen natürlich erscheinende allele Varianten der Sequenzen, die in den Abbildungen dargelegt sind. In einer anderen Ausführungsform sind die Sequenzen Sequenzvarianten wie hier im weiteren beschrieben.
In einer Ausführungsform kann eine zelluläre Proliferationssequenz anfangs durch substanzielle Nukleinsäure- und/oder Aminosäure-Sequenzhomologie zu den hier vorgestellten zellulären Proliferationssequenzen identifiziert werden. Solch eine Homologie kann auf der ganzen Nukleinsäure- oder Aminosäure-Sequenz basieren und ist im allgemeinen bestimmt wie unten angegeben, wobei entweder Homologie-Programme oder Hybridisierungsbedingungen benutzt werden.
In einer Ausführungsform ist eine Nukleinsäure daher eine „zelluläre Proliferationsnukleinsäure", wenn die Übereinstimmung der Nukleinsäurensequenz mit den Nukleinsäuresequenzen der 1, 3, 5, 7 oder 9 (die Nukleinsäureabbildungen) bevorzugt größer als etwa 75% ist, besonders bevorzugt größer als etwa 80%, noch mehr bevorzugt größer als etwa 85% und ganz besonders bevorzugt größer als 90%. In einigen Ausführungsformen wird die Homologie so groß wie etwa 93 bis 95 oder 98% sein. Homologie wie hier benutzt ist bezogen auf Sequenzähnlichkeit oder -gleichheit, wobei Identität bevorzugt ist. Diese Homologie wird durch Standardtechniken bestimmt, die im Stand der Technik verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf den lokalen Homologiealgorithmus von Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), durch den Homologie zuordnungs-Algorithmus von Needleman & Wunsch, J. Mol. Biool. 48: 443 (1970), durch die Suche nach Ähnlichkeiten-Methode von Pearson & Lipman, PNAS USA 85: 2444 (1988), durch computerunterstützte Implementierungen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetics Software-Packet, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI), das Best Fit Sequenzprogramm beschrieben von Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12: 387–395 (1984), bevorzugt unter Benutzung der Standardeinstellungen, oder durch Inspektion.
Ein Beispiel für einen nutzbaren Algorithmus ist PILEUP. PILEUP erzeugt eine multiple Sequenzzuordnung aus einer Gruppe verwandter Sequenzen durch progressive paarweise Zuordnung. Das Programm kann auch einen Abstammungsbaum erzeugen, der die Cluster-Beziehungen anzeigt, mit denen die Zuordnungen erzeugt werden. PILEUP nutzt eine Vereinfachung der progressiven Zuordnungsmethode von Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35: 351–360 (1987); die Methode ist ähnlich zu der beschrieben von Higgins & Sharp CABIOS 5: 151–153 (1989). Nützliche PILEUP-Parameter schließen eine Standard-Lückengewichtung (gap weight) von 3.00, eine Standard-Lückenlängengewichtung (gap length weight) von 0.10 und gewichtete Endlücken (end gaps) mit ein.
Ein weiteres Beispiel für einen nützlichen Algorithmus ist der BLAST-Algorithmus, beschrieben in Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403–410 (1990) und Karlin et al., PNAS USA 90: 5873–5787 (1993). Ein besonders nützliches BLAST-Programm ist das WU-BLAST-2-Programm, welches von Altschul et al. erhalten wurde [Methods in Enzymology, 266: 460–480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/REACRCE.html]. WU-BLAST-2 verwendet einige Suchparameter, von denen die meisten als Standardwerte gesetzt sind. Die justierbaren Parameter sind auf die folgenden Werte gesetzt: overlap span = 1, overlap fraction = 0.125, word threshold(T) = 11. Die Parameter HSP S und HSP S2 sind dynamische Werte und werden vom Programm selbst in Abhängigkeit von der Zusammensetzung der betroffenen Sequenz und der Zusammensetzung der betroffenen Datenbank, in der die betroffene Sequenz gesucht wird, eingestellt; die Werte können auch so eingestellt werden, daß die Empfindlichkeit erhöht wird. Ein prozentualer Aminosäurensequenz-Identitätswert wird durch die Anzahl von übereinstimmenden identischen Reste, dividiert durch die Absolutzahl der Reste der „längeren" Sequenz im zugeordneten Abschnitt bestimmt. Die „längere" Sequenz ist diejenige, die die meisten übereinstimmenden Reste im zugeordneten Abschnitt aufweist (Lücken, die von WU-BLAST-2 für die Maximierung des Zuordnungsergebnisses eingeführt wurden, werden ignoriert).
Ebenso ist die „prozentuale Nukleinsäurensequenz-Identität" als der Prozentsatz der Nukleotidreste in einer betroffenen Sequenz definiert, die identisch mit den Nukleotidresten der Sequenz ist, die in den Nukleinsäureabbildungen gezeigt ist. Ein bevorzugtes Verfahren verwendet den BLASTN Modul von WU-BLAST-2 mit Parametern in den Standardwerten, wobei die Parameter overlap span und overlap fraction auf 1 und 0.125 gesetzt werden.
Die Zuordnung kann die Einführung von Lücken in den zuzuordnenden Sequenzen mit einschließen. Zusätzlich wird für Sequenzen, die mehr oder weniger Nukleoside als die der Nukleinsäureabbildungen enthalten, hierunter verstanden, dass der Prozentsatz der Homologie auf der Relation der Anzahl homologer Nukleoside zu der Gesamtzahl der Nukleoside basierend bestimmt wird. Daher wird die Homologie beispielsweise von Sequenzen, die kürzer als die der hier identifizierten und unten disku tierten Sequenzen sind, durch die Anzahl der Nukleoside in der kürzeren Sequenz bestimmt.
In einer Ausführungsform wird die zelluläre Proliferationsnukleinsäure durch Hybridisierungsstudien bestimmt. Daher werden beispielsweise Nukleinsäuren, die unter hoher Stringenz zu den in den Abbildungen identifizierten Nukleinsäuresequenzen hybridisieren, oder das Gegenstück hiervon, in einer hier beschriebenen Ausführungsform als eine zelluläre Proliferationssequenz verstanden. Hohe Stringenz-Bedingungen sind im Stand der Technik bekannt; siehe zum Beispiel Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition, 1989, and Short Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al., die hiermit beide durch Bezugnahme eingefügt werden. Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und werden unter verschiedenen Umständen unterschiedlich sein. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Eine ausführliche Anleitung für die Hybridisierung von Nukleinsäuren kann bei Tijssen, Techniques in Biochemistry an Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, „Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993) gefunden werden. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen 5–10°C unterhalb des thermischen Schmelzpunktes (Tm) für die spezifische Sequenz bei definierten Ionenstärken und pH gewählt. Der Tm ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke, pH und Nukleinsäurekonzentration), bei welcher 50% der Komplementärstränge im Gleichgewicht mit der zu untersuchenden Sequenz hybridisieren (da die zu untersuchende Sequenz im Überschuß vorhanden ist sind bei Tm 50% der Komplementärstränge im Gleichgewicht besetzt). Stringente Bedingungen werden solche sein, in denen die Salzkonzentration geringer ist als etwa 1.0 M Natrumionen, typischerweise etwa 0.01 bis 1.0 M Natriumionenkonzentration (oder andere Salze) bei pH 7.0 bis 8.3 und mit einer Temperatur von mindestens etwa 30°C für kurze Sonden und mindestens etwa 60°C für lange Sonden (zum Beispiel größer als 50 Nukleotide). Stringente Bedingungen können auch durch die Zugabe von destabilisierenden Reagentien wie Formamid erreicht werden.
In einer anderen Ausführungsform werden schwächer stringente Hybridisierungsbedingungen benutzt; beispielsweise können moderat stringente oder niedrig-stringente Bedingungen benutzt werden, wie sie im Stand der Technik bekannt sind; siehe Maniatis und Ausubel, siehe oben, und Tijssen, siehe oben.
Zusätzlich sind die zellulären Proliferationsnukleinsäure-Sequenzen dieser Erfindung in einer Ausführungsform Fragmente von größeren Genen, d.h. es sind Nukleinsäure-Segmente. „Gene" schließt in diesem Kontext kodierende Abschnitte, nichtkodierende Abschnitte und Mischungen aus kodierenden Abschnitten und nichtkodierenden Abschnitten mit ein. Demgemäß können, wie es in der Technik anerkannt ist, zusätzliche Sequenzen der zellulären Proliferationsgene unter Benutzung der hier bereitgestellten Sequenzen mit im Stand der Technik wohlbekannten Techniken für die Klonierung entweder längerer Sequenzen oder der vollständigen Sequenzen erhalten werden; siehe Maniatis et al., und Ausubel, et al., siehe oben, die hiermit ausdrücklich durch Bezugnahme eingefügt werden.
Sobald die zelluläre Proliferationsnukleinsäure identifiziert ist kann sie kloniert und, falls notwendig, können ihre konstituierenden Bestandteile rekombiniert werden, um die vollständige zelluläre Proliferationsnukleinsäure zu bilden. Sobald die zelluläre Proliferationsnukleinsäure aus ihrer natürlichen Quelle isoliert ist, zum Beispiel enthalten in einem Plasmid oder anderem Vektor, oder hieraus ausgeschnitten als ein lineares Nukleinsäuresegment, kann die rekombinante zelluläre Proliferationsnukleinsäure weiter benutzt werden als Sonde für die Identifizierung und Isolierung anderer zellulärer Proliferationsnukleinsäuren, beispielweise zusätzliche kodierende Regionen. Sie kann auch als „Vorstufen"-Nukleinsäure zur Herstellung modifizierter oder variierter zellulärer Proliferationsnukleinsäuren und Proteine benutzt werden. „Rekombinant" so wie hier verwendet bezieht sich auf eine Nukleinsäure oder ein Protein, die/das nicht im nativen Zustand ist. Beispielsweise kann die Nukleinsäure genetisch hergestellt, isoliert, in einen nicht-natürlichen Vektor insertiert oder in einer Zelle sein, in der sie nicht natürlich exprimiert wird, um als rekombinant angesehen zu werden.
In einem weiteren Aspekt werden die zelluläre Proliferationsnukleinsäure und Proteinsequenzen werden in Zellen mit unterschiedlichen Proliferationsstadien differenziert exprimiert, eingeschlossen Krebszellen, die im Vergleich mit Nicht-Krebszellen zur verstärkten Proliferation neigen. Wie im Folgenden gezeigt wird beeinhalten die zellulären Proliferationssequenzen solche, die bei der Zellteilung hochreguliert sind (d.h. vermehrt exprimiert werden), wie auch solche, die bei der Zellteilung herunterreguliert sind (d.h. in geringerem Umfang exprimiert werden). In einer bevorzugten Ausführungsform liegen die zellulären Proliferationssequenzen im natürlichen Zustand, d.h. ohne Einsatz von Modulatoren oder Therapeutika, während der Zellproliferation hochreguliert vor.
Der Begriff „Nukleinsäure" bezieht sich auf Deoxyribonukleotide oder Ribonukleotide und Polymere davon in entweder einzel- oder doppelsträngiger Form. Sofern nicht spezifisch eingeschränkt schließt der Begriff Nukleinsäuren mit ein, die be kannte Analoge von natürlichen Nukleotiden mit ähnlichen Bindungseigenschaften enthalten, und die in ähnlicher Weise wie natürlich vorkommende Nukleotide metabolisiert werden. Sofern nicht anderweitig angegeben beinhaltet eine spezifische Nukleinsäuresequenz implizit auch konservativ modifizierte Varianten hiervon (z.B. degenerierter Kodonaustausch) und komplementäre Sequenzen von diesen sowie von der spezifisch angegebenen Sequenz. Im Besonderen können degenerierte Kodon-Substitutionen dadurch erhalten werden, dass Sequenzen generiert werden, in denen die dritte Position von einem oder mehreren ausgewählten (oder allen) Kodons durch gemischte Basen und/oder Deoxyinosin-Reste substituiert ist (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605–2608 (1985); Cassol et al., 1992; Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91–98 (1994)). Der Begriff Nukleinsäure wird austauschbar mit Gen, cDNA und Gen-kodierte mRNA benutzt.
Die zellulären Proliferationsnukleinsäuren der vorliegenden Erfindung werden auf mehreren Wegen genutzt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden zelluläre Proliferationsnukleinsäuren, die zelluläre Proliferationsproteine kodieren, benutzt, um eine Vielzahl an Expressionsvektoren für die Expression zellulärer Proliferationsproteine zu erzeugen, die dann in Screening-Assays eingesetzt werden können wie unten beschrieben. Die Expressionsvektoren können entweder selbstreplizierende extrachromosomale Vektoren sein, oder Vektoren, die sich in ein Wirtsgenom integrieren. Im Allgemeinen beinhalten diese Expressionsvektoren transkriptionale und translationale regulatorische Nukleinsäuren, die operativ an die Nukleinsäure gekoppelt sind, die das zelluläre Proliferationsprotein kodiert. Der Begriff „Kontrollsequenz" bezieht sich auf DNA- Sequenzen, die in einem bestimmten Wirtsorganismus für die Expression einer operativ gekoppelten Kodierungssequenz notwendig sind. Die Kontrollsequenzen, die beispielsweise für Prokaryoten passend sind, beinhalten einen Promoter, optional eine Operator-Sequenz, und eine Ribosombindungsstelle. Eukaryotische Zellen sind dafür bekannt, Promoter, Polyadenylierungssignale und Verstärker zu benutzen.
Nukleinsäure ist „operativ gekoppelt", wenn sie in eine funktionale Beziehung zu einer anderen Nukleinsäure gesetzt wurde. Zum Beispiel ist die DNA für eine Vorsequenz oder einen sekretorischen Anfang operativ zu der DNA für ein Polypeptide gekoppelt, wenn dieses als ein Präprotein exprimiert wird, dass an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt; ein Promoter oder Verstärker ist operativ gekoppelt an eine kodierende Sequenz, sofern dieser die Transkription dieser Sequenz beeinflußt; oder eine Ribosombindungsstelle ist operativ gekoppelt an eine kodierende Sequenz, wenn sie so positioniert ist, dass die Translation vereinfacht wird. Im allgemeinen meint „operativ gekoppelt", dass die gekoppelten DNA-Sequenzen aufeinander folgend, und im Falle des sekretorischen Anfangs aufeinander folgend und in der Ablesereihenfolge sind. Nur Verstärker müssen nicht in direkter Nachbarschaft sein. Die Kopplung wird durch Ligation an geeigneten Restriktions-Stellen bewerkstelligt. Falls solche Stellen nicht existieren werden der konventionellen Praxis entsprechend synthetische Oligonukleotid-Adaptoren oder Koppler herangezogen. Die transkriptorisch und translatorisch regulative Nukleinsäure wird im Allgemeinen passend zu der Wirtszelle sein, die für die Expression des zellulären Proliferationsproteins genutzt wird; beispielsweise werden transkriptorisch und translatorisch regulative Nukleinsäuresequenzen aus Bacillus bevorzugt zur Expression des zel lulären Proliferationsproteins aus Bacillus benutzt. Zahlreiche Typen passender Expressionsvektoren und passende regulative Sequenzen sind im Stand der Technik für eine Vielzahl von Wirtszellen bekannt.
Allgemein können transkriptorisch und translatorisch regulative Sequenzen Promotersequenzen, ribosomale Bindungsstellen, transkriptorische Start- und Stoppsequenzen, translatorische Start- und Stoppsequenzen und Verstärker oder Aktivatorsequenzen beinhalten, sind jedoch nicht hierauf limitiert. In einer bevorzugten Ausführungsform beinhalten die regulatorischen Sequenzen einen Promoter und transkriptorische Start- und Stoppsequenzen.
Promotersequenzen kodieren entweder konstitutive oder induzierbare Promoter. Die Promoter können entweder natürlich vorkommende oder Hybridpromoter sein. Hybridpromotoren, die Elemente von mehr als einem Promoter kombinieren, sind auch im Stand der Technik bekannt und in der vorliegenden Erfindung brauchbar.
Zusätzlich kann der Expressionsvektor zusätzliche Elemente einschließen. Zum Beispiel kann der Expressionsvektor zwei Replikationssysteme haben, was die Erhaltung in zwei Organismen erlaubt, zum Beispiel in Säugetier- oder Insektenzellen für die Expression und in einem prokaryotischen Wirt für die Klonierung und Amplifikation. Zudem enthalten Expressionsvektoren für die Integration zumindest eine Sequenz, die homolog zum Wirtszellengenom ist, und bevorzugt zwei homologe Sequenzen, die die Expressionskonstruktion flankieren. Der integrierende Vektor kann durch die Auswahl der passenden homologen Sequenz für den Einbau in den Vektor an eine spezifische Stel le in der Wirtszelle gelenkt werden. Konstruktionen für integrierende Vektoren sind im Stand der Technik wohlbekannt.
Zusätzlich enthält der Expressionsvektor in einer bevorzugten Ausführungsform ein wählbares Marker-Gen, dass die Auswahl transformierter Wirtszellen erlaubt. Selektionsgene sind wohlbekannt im Stand der Technik und werden mit dem Wirtszellentyp variieren.
Die zellulären Proliferationsproteine der vorliegenden Erfindung können durch Kulturierung einer mit einem Expressionsvektor transformierten Wirtszelle produziert werden, wobei der Expressionsvektor eine ein zelluläres Proliferationsprotein kodierende Nukleinsäure enthält und unter passenden Bedingungen eingesetzt wird, um die Expression des zellulären Proliferationsprotein zu induzieren oder zu bewirken. Die für die Expression des zellulären Proliferationsproteins passenden Bedingungen werden mit der Wahl des Expressionsvektors und der Wirtszelle wechseln und werden leicht durch Routine-Experimente von einem Fachmann ermittelt werden können. Zum Beispiel wird die Benutzung konstitutiver Promoter im Expressionsvektor die Optimierung von Wachstum und Wirtszellproliferation erfordern, während die Benutzung eines induzierbaren Promoters die passenden Wachstumsbedingungen für die Induktion erfordert. Zusätzlich ist in einigen Ausführungsformen die Erntezeit wichtig. Zum Beispiel sind die Baculoviralsysteme, die in Insektenzellexpressionen genutzt werden, lytische Viren, weshalb die Wahl der Erntezeit entscheidend sein kann für die Produktausbeute.
Passende Wirtszellen beinhalten Hefe, Bakterien, Archaebakterien, Pilze sowie Insekten- und Säugetierzellen. Von besonderem Interesse sind Drosophila melangaster-Zellen, Saccharomy ces cerevisiae und andere Hefen, E. coli, Bacillus subtilis, Sf9-Zellen, C129-Zellen, 293-Zellen, Neurospora, BHK, CHO, COS, HeLa-Zellen, THP1-Zelllinie (eine Makrophagen-Zelllinie) und humane Zellen und Zelllinien.
In einer Ausführungsform werden die zellulären Proliferationsproteine in Säugetierzellen exprimiert. Säugetier-basierte Expressionssysteme sind auch bekannt im Stand der Technik und beinhalten retrovirale Systeme. Ein bevorzugtes Expressionsvektorsystem ist ein retrovirales Vektorsystem, wie es generell beschrieben ist in PCT/US97/01019 und PCT/US97/01048, die hiermit beide ausdrücklich durch Bezugnahme eingefügt werden. Von besonderem Nutzen als Säugetier-Promotoren sind die Promoter von säugetierischen Viralgenen, weil die Viralgene häufig hochexprimiert sind und einen breiten Wirtsbereich aufweisen. Beispiele beinhalten den SV40 Frühpromoter, den Maus-Brusttumor-Virus LTR-Promoter, den Adenovirus Haupt-Spät-Promoter, den Herpes simplex-Virus-Promoter und den CMV-Promoter. Typischerweise sind die Transkriptionstermination und die Polyadenylierungssequenzen, die von Säugetierzellen erkannt werden, regulatorische Regionen, die 3' vom Translations-Stopp-Codon lokalisiert sind und somit gemeinsam mit den Promoter-Elementen die kodierende Sequenz flankieren. Beispiele für Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungs-Signalen beinhalten diejenigen, die von SV40 erhalten wurden.
Die Methoden zur Einführung exogener Nukleinsäure in Säugetierwirte wie auch in andere Wirte sind wohlbekannt im Stand der Technik und werden mit der benutzten Wirtszelle variieren. Diese Techniken beinhalten die Dextran-vermittelte Transfektion, die Calciumphosphat-Fällung, die Polybrene-vermittelte Transfektion, die Protoplasten-Fusion, die Elektroporation, die virale Infektion, die Einkapselung der Polynukleotide in Liposomen und die direkte Mikroinjektion von DNA in Zellkerne.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden zelluläre Proliferationsproteine in bakteriellen Systemen exprimiert. Bakterielle Expressionssysteme sind wohlbekannt im Stand der Technik. Promotoren von Bakteriophagen können auch benutzt werden und sind im Stand der Technik bekannt. Zudem sind synthetische Promotoren und Hybrid-Promoter auch brauchbar; beispielsweise ist der tac-Promoter ein Hybrid aus den trp- und lac-Promotersequenzen. Zudem kann ein bakterieller Promoter natürlich vorkommende Promoter nicht-bakteriellen Ursprungs beinhalten, die die Fähigkeit zur Bindung bakterieller RNA-Polymerase aufweisen und damit die Transkription inhibieren. Zusätzlich zu einer funktionalen Promotersequenz ist eine effiziente Ribosomen-Bindungsstelle wünschenswert. Der Expressionsvektor kann auch eine Signalpeptid-Sequenz enthalten, die für die Sekretion des zellulären Proliferationsproteins in Bakterien Sorge trägt. Solch ein Protein wird entweder in das Wachstumsmedium abgegeben (gram-positive Bakterien) oder in den periplasmatischen Raum, der sich zwischen der inneren und äußeren Membran der Zellen befindet (gram-negative Bakterien). Der Exprssionsvektor kann auch einen Epitop tag enthalten, der die Affinitätsreinigung des zellulären Proliferationsproteins ermöglicht. Der bakerielle Expressionsvektor kann auch ein selektierbares Markergen enthalten, um die Selektion der Bakterienstämme, die transformiert wurden, zu ermöglichen. Geeignete Gene umfassen Gene, die die Bakterien resistent gegen Arzneimittel machen, solche wie Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Kanamycin, Neomycin und Tetracycline. Selektierbare Marker enthalten auch biosynthetische Gene, solche wie diejeingen in den Histidin-, Trypophan- und Leucin biosynthetischen Bahnen. Diese Komponenten werden gebildet von Expressionsvektoren. Expressionsvektoren für Bakterien sind im Stand der Technik sehr gut bekannt und umfassen neben anderen Vektoren für Bacillus subtilis, E. coli, Streptococcus cremoris und Streptococcus lividans. Die bakteriellen Expressionsvektoren werden mit im Stand der Technik gut bekannten Techniken in Wirtszellen transformiert, solchen wie eine Calciumchlorid-Behandlung, eine Elektroporation und andere.
In einer Ausführungsform wird das zelluläre Proliferationsprotein in Insektenzellen produziert. Expressionsvektoren für die Transformation der Insektenzellen, und insbesondere baculovirus-basierte Expressionsvektoren, sind im Stand der Technik gut bekannt.
In einer anderen Ausführungsform wird das zelluläre Proliferationsprotein in Hefezellen produziert. Hefe-Expressionssysteme sind im Stand der Technik sehr gut bekannt und umfassen Expressionsvektoren für Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans und C. maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis und K. lactis, Pichia guillerimondii und P. pastoris, Schizosaccharomyces pombe und Yarrowia lipolytica.
Das zelluläre Proliferationsprotein kann auch aus einem Fusionsprotein unter Verwendung von aus dem Stand der Technik gut bekannten Techniken hergestellt sein. Daher kann, zum Beispiel für die Herstellung von momoklonalen Antikörpern, wenn das gewünschte Epitop klein ist, das zelluläre Proliferationsprotein unter Bildung eines Immunogens an ein Carrierprotein angekoppelt sein. Alternativ kann das zelluläre Proliferationsprotein aus einem Fusionsprotein hergestellt sein, um die Expression zu steigern oder aus anderen Gründen. Zum Beispiel kann, wenn das zelluläre Proliferationsprotein ein zelluläre Proliferationspeptid ist, die Nukleinsäure, die das Peptid kodiert, mit anderen Nukleinsäuren für Expressionszwecke in Verbindung stehen.
In einer Ausführungsform sind die zellulären Proliferations-Nukleinsäuren, -proteine und -antikörper der Erfindung gekennzeichnet. Mit „gekennzeichnet" ist hier gemeint, dass eine Verbindung mindestens ein Element, ein Isotop oder eine chemische Verbindung hat, um die Erkennung der Verbindung zu ermöglichen. Ganz allgemein können Kennzeichen in drei Klassen eingeteilt werden: a) isotopische Kennzeichen, die radiaoaktive oder schwere Isotope sein können; b) immune Kennzeichen, die Antikörper oder Antigene sein können und c) farbige oder flureszierende Farbstoffe. Die Kennzeichen können in jede Position der zellulären Proliferations-Nukleinsäuren, -proteine und -antikörper eingebaut werden. Zum Beispiel sollte das Kennzeichen in der Lege sein, entweder ein direktes oder ein indirektes detektierbares Signal zu produzieren. Der detektierbare Teil kann ein Radioisotop, solches wie ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S oder ¹²⁵I, eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Verbindung, solch eine wie ein fluoreszierendes Isothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin, oder ein Enzym, solches wie alkalische Phosphatase, beta-Galactosidase oder Meerrettich-Peroxidase, sein. Jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren, um Antikörper mit dem Kennzeichen zu verbinden, kann angewendet werden, einschließlich derjenigen Verfahren, die beschrieben sind bei Hunter et al., Nature, 144: 945 (1962); David et al., Biochemistry, 13: 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40: 219 (1981); und Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407 (1982).
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung auch Proteinsequenzen zur zellulären Proliferation zur Verfügung. Ein zelluläres Proliferationsprotein der vorliegenden Erfindung kann auf verschiedene Weisen identifiziert werden. „Protein" umfasst in dieser Bedeutung Proteine, Polypeptide und Peptide. Wie das vom zuständigen Fachmann verstanden wird, kann die Nukleinsäuresequenz der Erfindung für die Herstellung von Proteinsequenzen verwendet werden.
Innerhalb einer Ausführungsform der zellulären Proliferationsproteine sind auch Aminosäure-Varianten der natürlich auftretenden Varianten umfasst, wie dies hier bestimmt wird. Insbesondere sind die Varianten bevorzugt, die mehr als etwa 75% homolog zu den Wildtyp-Sequenzen sind, besonders bevorzugt mehr als etwa 80%, noch mehr bevorzugt mehr als etwa 85% und ganz besonders bevorzugt mehr als 90%. In einigen Ausführungsformen wird die Homologie so groß wie etwa 93 bis 95 oder 98% sein. Für die Nukleinsäuren meint Homologie in diesem Zusammenhang Sequenzähnlichkeit oder -gleichheit, wobei Identität bevorzugt ist. Diese Homologie wird durch Standardtechniken bestimmt, die im Stand der Technik bekannt sind und wie sie oben für Nukleinsäuren Homologe umrissen sind. Die Proteine der vorliegenden Erfindung können kürzer oder länger sein als die Aminosäure-Sequenzen von Wildtyp. Daher sind in einer bevorzugten Ausführungsform von der Definition des zellulären Proliferationsproteins auch Teile oder Fragmente der Wildtyp-Sequenzen umfasst. Bevorzugte Fragmente haben einen bindenden Bereich für eine modulierende Substanz oder einen Antikörper wie unten diskutiert. Zusätzlich können die zellulären Proliferations-Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um weitere kodierende Bereiche und damit weitere Proteinsequenzen zu erhalten, wobei Verfahren aus dem Stand der Technik verwendet werden.
In einer Ausführungsform sind die zellulären Proliferationsproteine abgeleitete oder variierende zellulären Proliferationsproteine verglichen mit den Sequenzen des Wildtyps. Wie unten ausführlicher umrissen, heißt das, dass das abgeleitete Proliferationsprotein mindestens eine Aminosäure enthält, die substituiert, entfernt oder eingefügt ist, wobei Substitution von Aminosäuren besonders bevorzugt ist. Die Substitution, Einfügung oder Entfernung von Aminosäuren oder deren Kombination kann bei jeden Rest innerhalb des zellulären Proliferationsproteins auftreten. Diese Varianten werden gewöhnlich durch seitenspezifische Mutagenese oder Nukleotide in der DNA, die für das zelluläre Proliferationsprotein kodieren, hergestellt, wobei Cassette oder PCR Mutagenese oder andere in Stand der Technik gut bekannte Verfahren verwendet werden, um die DNA herzustellen, die für die Varianten kodiert, und danach die DNA in rekombinanten Zellkulturen wie oben umrissen exprimiert. Wie auch immer, die variierenden Fragmente der zellulären Proliferationsproteine mit bis etwa 100–150 Reste können durch in vitro Synthese unter Verwendung etablierter Techniken hergestellt werden. Sequenzvarianten der Aminosäuren werden durch die vorbestimmte Natur der Variation charakterisiert, ein Merkmal, das sie von natürlich erscheinenden allelischen Variationen oder Variation zwischen den Arten der zellulären Aminosäuresequenzen des Proliferationsproteins unterscheidet. Die Varianten zeigen typischerweise die gleiche qualitative biologische Aktivität wie die natürlich auftretenden Analoge, obwohl auch Varianten ausgewählt werden können, die in charakteristischen Merkmalen modifiziert wurden, wie es unten ausführlicher umschrieben ist.
Während die Stelle oder der Bereich für die Einführung einer Variation der Aminosäuresequenz vorbestimmt ist, muss die Mutation per se nicht vorbestimmt sein. Um zum Beispiel die Ausführung einer Mutation an einer vorbestimmten Stelle zu optimieren, kann zufällige Mutagenese in einem Ziel-Kodon oder -Bereich durchgeführt werden und die exprimierte zelluläre Proliferationsvarianten werden hinsichtlich der optimalen Kombination nach der gewünschten Aktivität überprüft. Verfahren, um Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in der DNA mit bekannter Sequenz durchzuführen, sind gut bekannt, zum Beispiel M13 Pier Mutagenese und PCR Mutagenese. Screening der Mutanten wird unter Verwendung von Assays der Aktivitäten der zellulären Proliferationsproteine durchgeführt.
Suabstitutionen von Aminosäure sind typisch für einzelne Reste; Einfügung wird bei etwa 1 bis 20 Aminosäuren der Normalfall sein, obwohl erheblich größere Einfügungen toleriert werden können. Entfernungen reichen von etwa 1 bis etwa 20 Resten, obwohl in einigen Fällen Entfernungen viel größer sein können.

Substitutionen, Entfernungen, Einfügungen und jede Kombination hiervon kann verwendet werden, um ein Zielderivat zu erhalten. Im allgemeinen werden diese Wechsel an einigen Aminosäuren durchgeführt, um die Änderung des Moleküls zu minimieren. Wie auch immer, größere Veränderungen können unter bestimmten Umständen toleriert werden. Wenn kleinere Veränderungen in den Merkmalen des zellulären Proliferationsproteins beabsichtigt sind, werden Substitutionen in allgemeinen in Übereinstimmung mit der folgenden Tabelle gemacht: Tabelle I

originaler Rest	beispielhafte Substitution
Ala	Ser

Arg	Lys
Asn	Gln, His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gln	Asn
Glu	Asp
Gly	Pro
His	Asn, Gln
Ile	Leu, Val
Leu	Ile, Val
Lys	Arg, Gin, Glu
Met	Leu, Ile
Phe	Met, Leu, Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp, Phe
Val	Ile, Leu

Bedeutende Wechsel in funktioneller oder immunologischer Identität werden durch die Auswahl von Substitutionen, die weniger zurückhaltend als die in Tabelle I gezeigten sind, gemacht. Zum Beispiel können Substitutionen mit signifikanterer Wirkung gemacht werden: die Struktur des Rückrates des Polypeptids im Bereich der Änderung, zum Beispiel der alpha-helikalan oder der beta-Faltblattstruktur; der Ladung oder der Hydrophobie des Moleküls an der Zielseite; oder des Großteiles der Seitenkette. Die Substitutionen, von denen im allgemeinen erwartet wird, dass sie die größten Wechsel in den Eigenschaften der Polypeptide erzeugen, sind diejenigen, in denen (a) ein hydrophiler Rest, z.B. Seryl oder Threonyl mit (oder durch) einen hydrophoben Rest substituiert ist, z.B. Leucyl, Isoleu cyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl; (b) ein Cystein oder Prolin mit (oder durch) irgendeinen anderen Rest substituiert ist; (c) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z.B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl, mit (oder durch) einen elektronegativen Rest, z.B. Glutamyl oder Aspartyl, substituiert ist oder (d) ein Rest mit einer großen Seitenkette, z.B. Phenylalanin, mit (oder durch) einen ohne Seitenkette, z.B. Glycin, substituiert ist.
Die Varianten zeigen typischerweise die gleiche qualitative biologische Aktivität und werden die gleiche Immunantwort wie die natürlich erscheinenden Analoge hervorrufen, obwohl die Varianten auch ausgewählt sind, um die charakteristischen Merkmale der zellulären Proliferationsproteine wie benötigt zu verändern. Alternativ kann die Variante so gestaltet werden, dass die biologische Aktivität des zellulären Proliferationsproteins verändert ist.
Kovalente Modifikationen der zellulären Proliferations-Polypeptide werden von Umfang dieser Erfindung mit umfasst. Eine Art der kovalenten Modifikation umfasst die Reaktion gezielter Aminosäurereste des zellulären Proliferationspolypeptids mit einer organischen derivatisierten Substanz, die erhältlich ist durch Reaktion mit ausgewählten Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten eines zellulären Proliferationspeptides. Derivatisierung mit bifunktionellen Substanzen ist zum Beispiel brauchbar für eine Vernetzung zellulärer Proliferationsproteine zu einer wasser-unlöslichen Trägermatrix oder Oberfläche für eine Verwendung in dem Verfahren zur Reinigung von anti-KSP Antikörpern oder in dem Verfahren zum Screening von Assays, wie dies ausführlich unten beschrieben wird. Gewöhnlich verwendete Substanzen zur Vernetzung umfassen z.B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N- Hydroxysuccinimid-Ester, zum Beispiel Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionale Imidoester, einschließlich Disuccinimidyl-Ester, solche wie 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat), bifunktionale Maleimide, solche wie Bis-N-Maleimido-1,8-octan, und Substanzen, solche wie Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat.
Andere Modifikationen umfassen die Deamidierung von Glutaminyl- und Asparaginyl-Resten zu den korrespondierenden Glutamyl- beziehungsweise Aspartyl-Resten, Hydroxilierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung der Hydroxyl-Gruppen von Seryl, Threonyl oder Tyrosyl-Resten, Methylierung der α-Amino-Gruppen von Lysin, Arginin und Histidin Seitenketten [T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, S. 79–86 (1983)], Acetylierung der N-terminalen Amine und Amidierung von jeder C-terminalen Carboxyl-Gruppe.
Eine andere Art von kovalenter Modifikation der zellulären Proliferationspeptide, die vom Umfang dieser Erfindung mit umfasst wird, besteht aus der Änderung des natürlichen Glykosylierungsmusters der Polypeptide. Es ist hier beabsichtigt, dass „eine Änderung des natürlichen Glykosylierungsmusters" für Zwecke zu verwenden, die die Entfernung von einer oder mehreren Carbohydrat Einheiten, die in der natürlichen Sequenz der zellulären Proliferationspeptide gefunden werden, und/oder das Zufügen von einer oder mehreren Glykosylierungsstellen, die nicht in der natürlichen Sequenz der zellulären Proliferationspeptide vorhanden sind, bedeuten.
Das Zufügen von Glykosylierungsstellen zu zellulären Proliferationspeptiden kann durch eine Änderung der Aminosäure Sequenz der Peptide erreicht werden. Die Änderung kann zum Bei spiel durch Addition oder Substitution von einem oder mehren Serin- oder Threonin-Resten zu der natürlichen Sequenz des zellulären Proliferationspeptides (für O-verknüpfte Glykosylierungsstellen) gemacht werden. Die Sequenz der zellulären Proliferationsaminosäuren kann optional durch Wechsel auf dem DNA-Niveau geändert werden, insbesondere durch Mutation der DNA, die für das zelluläre Proliferationspolypeptid an vorausgewählten Basen in der Art codiert, dass Kodone erzeugt werden, die in die gewünschten Aminosäuren übersetzt werden.
Eine andere Möglichkeit für die Zunahme der Anzahl der Kohlenhydrat-Einheiten des zellulären Proliferationspeptids besteht in der chemischen oder enzymatischen Kupplung von Glykosiden an die Polypeptide. Solche Verfahren sind im Stand der Technik beschrieben, z.B. in der WO 87/05330, die am 11. September 1987 veröffentlicht wurde, und in Aplin und Wriston, cellular proliferation Crit. Rev. Biochem., S. 259–306 (1981).
Entfernung von Kohlenhydrat-Einheiten, die in dem zellulären Proliferationsprotein vorhanden sind, kann erreicht werden durch chemische oder enzymatische oder mutierende Substitution derjenigen Kodone, die für Aminosäure-Reste kodieren, die als Ziele für die Glykosylierung dienen. Techniken für chemische Deglykosylierung sind im Stand der Technik bekannt und zum Beispiel beschrieben bei Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (1987) und bei Edge et al., Anal. Biochem., 118: 131 (1981). Emzymatische Abspaltung von Kohlenhydrat-Einheiten der Polypeptide kann durch die Verwendung einer Vielzahl von endo- und exo-Glykosidasen wie sie bei Thotakura et al. Meth. Enzymol. 138: 350 (1987) beschrieben sind, erreicht werden.
Eine andere Art von kovalenter Modifikation der zellulären Proliferation enthält die Verknüpfung des zellulären Proliferations-Polypeptids mit einem aus einer Vielzahl von nicht-proteinösen Polymeren, z.B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylen, wie sie in den folgenden U.S. Patenten dargelegt sind 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 oder 4,179,337.
Die zellulären Proliferations-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können in einer Ausführungsform auch derart modifiziert werden, dass sie chimäre Moleküle bilden, die ein zelluläres Proliferations-Polypeptid enthalten, das mit einem anderen heterologen Polypeptid oder einer Aminsosäuresequenz fusioniert ist. In einer Asuführungsform enthält solch ein chimäres Molekül eine Verbindung von einem zellulären Proliferations-Polypeptid mit einem Tag-Polypeptid, das einen Epitop zur Verfügung stellt, an den ein anti-tag Antikörper selektiv binden kann. Bevorzugte Tags umfassen das Myc Epitop und 6-Histidin. Das Epitop Tag befindet sich im allgemeinen an dem Amino- oder Carboxyl-Terminus des zellulären Proliferations-Polypeptids. Die Anwesenheit von solchen Epitop Tag Formen eines zellulären Proliferations-Polypeptids kann bestimmt werden durch die Verwendung eines Antikörpers gegen das Tag Polypeptid, wie dies weiter unten besprochen wird. Die Bereitstellung des Epitop Tags ermöglicht es dem zellulären Proliferations-Polypeptid auch, einfach durch eine Affinitäts-Reinigung gereinigt zu werden unter Verwendung eines anti-tag Antikörpers oder einer anderen Art einer Affinitätsmatrix, die an den Epitop Tag bindet. In einer alternativen Ausführungsform kann das chimäre Molekül eine Verbindung von einem zellulären Proliferations-Polypeptid mit einem Immunglobulin oder einem speziellen Bereich eines Immuglobulins enthalten. Für eine bivalente Form des chimären Moleküls, könnte solch eine Verbindung mit dem Fc Bereicht eines IgG Moleküls bestehen.
Verschiedene Tag Polypeptide und ihre entsprechenden Antikörper sind sehr gut im Stand der Technik bekannt. Bespiele umfassen Poly-histidin (poly-his) oder Poly-histidin-glycerin (poly-his-gly) Tags; das flu HA tag Polypeptid und sein Antikörper 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8: 2159–2165 (1988)]; das c-myc tag und die 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 und 9E10 Antikörper hiergegen [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5: 3610–3616 (1985)]; und das Herpes Simplex Virus Glykoprotein D (gD) tag und sein Antikörper (Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6): 547–553 (1990)]. Andere tag Polypeptide umfassen das Flag-Peptide [Hopp et al., Bio Technology, 6: 1204–1210 (1988)]; das KT3 Epitop Peptid [Martin et al., Science, 255: 192–194 (1992)]; Tubulin Epitop Peptid [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266: 15163–15166 (1991)]; und das T7 Gen 10 Protein Peptid Tag (Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6393–6397 (1990)].
Ebenfalls von der Definition des zellulären Proliferations-Proteins umfasst sind in einer Ausführungsform andere zelluläre Proliferations-Proteine der zellulären Proliferations-Familie und zelluläre Proliferations-Protein von anderen Organismen, die, wie unten umrissen, geklont und exprimiert sind. Daher können eine Sonde oder eine degenerierte Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) Primer-Sequenzen verwendet werden, um andere verwandte zelluläre Proliferations-Proteine von menschlichen oder anderen Organismen zu finden. Wie der Fachmann verstehen wird, umfassen brauchbare Tester und PCR Primer-Sequenzen insbesondere die eindeutigen Bereiche der zellulären Sequenzen der Proliferations-Nukleinsäuren. Wie es im allgemeinen im Stand der Technik bekannt ist, haben bevorzugte PCR Primer eine Länge von etwa 15 bis etwa 35 Nukleotiden, wobei eine Länge von etwa 20 bis etwa 30 bevorzugt ist, und können Inosin enthalten, wenn es benötigt wird. Die Bedingungen für die PCR Reaktion sind im Stand der Technik gut bekannt.
Zusätzlich können, wie es hier umrissen ist, zelluläre Proliferationsproteine gemacht werden, die länger als diejenigen sind, die in den Abbildungen dargestellt sind, zum Beispiel durch die Aufklärung von zusätzlichen Sequenzen, die Zufügung von Epitop- oder Reinigungs-Tags, die Zufügung von anderen Fusionssequenzen, etc.
Zelluläre Proliferations-Proteine können auch identifiziert werden, wenn sie durch zelluläre Proliferations-Nukleinsäuren kodiert sind. Daher sind in einer Ausführungsform die zellulären Proliferations-Proteine durch Nukleinsäuren kodiert, die zu den Sequenzen der Nukleinsäure-Abbildungen oder ihren Komplementären hybridisieren werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das zelluläre Proliferations-Protein nach der Expression gereinigt oder isoliert. Zelluläre Proliferations-Proteine können auf einer dem Fachmann bekannten Vielzahl von Arten isoliert oder gereinigt werden in Abhängigkeit davon, welche anderen Komponenten in der Probe anwesend sind. Standard-Reinigungsverfahren umfassen elektrophoretische, molekulare, immunologische und chromatographische Techniken einschließlich Ionenaustausch, hydrophobe, Affinitäts- und Umkehrphasen- HPLC-Chromatographie und Chromatofokussierung. Zum Beispiel kann das zelluläre Proliferationsprotein unter Verwendung einer anti-KSP Antikörper Standardsäule gereinigt werden. Ultrafiltrations- und Diafiltrationsverfahren zusammen mit Protein-Konzentration sind auch geeignet. Für allgemeine Anleitung in brauchbare Reinigungs verfahren siehe Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, NY (1982). Der Grad der notwendigen Reinheit wird in Abhängigkeit von der Verwendung des zellulären Proliferations-Proteins variieren. In einigen Fällen wird keine Reinigung notwendig sein.
Die Begriffe „isoliert", „gereinigt" oder „biologisch rein" beziehen sich auf Material, das im wesentlichen oder tatsächlich frei von Verbindungen ist, die es normalerweise begleiten, wenn es sich in seinem natürlichen Zustand befindet. Reinheit und Homogenität werden typischerweise bestimmt durch Verfahren der analytischen Chemie, solche wie Polyacrylamid-Gel-Eletrophorese oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. Ein Protein, das in einem Präparat die vorherrschend anwesende Art ist, wird substantiell gereinigt. Der Begriff „gereinigt" bedeutet, dass eine Nukleinsäure oder ein Protein hautsächlich ein Band in einem elektrophoretischen Gel zur Folge hat. Insbesondere ist gemeint, dass die Nukleinsäure oder das Protein mindestens 85% rein, besonders bevorzugt mindestens 95% rein und ganz besonders bevorzugt mindestens 99% rein ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Protein ans rein betrachtet, wenn festgestellt wurde, dass es keine kontaminierende Aktivität aufweist.
Einmal exprimiert und wenn notwendig gereinigt sind die zellulären Proliferations-Proteine und Nukleinsäuren für eine Anzahl von Anwendungen geeignet. In einer Anzahl von hier bereit gestellten Verfahren, bei denen entweder die Nukleinsäure oder ein Protein verwendet wird, wird eine einen Kandidaten darstellende bioaktive Substanz verwendet, um, wie weiter unten beschrieben, die Wirkung auf die zelluläre Proliferations-Sequenz, die zelluläre Proliferation, Krebs, etc. zu bestimmen.
In bevorzugten Ausführungsformen modulieren die bioaktiven Substanzen die hier bereit gestellten zellulären Proliferations-Sequenzen oder die Expressionsprofile. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform unterdrückt die einen Kandidaten darstellende Substanz einen Phänotyp der zellulären Proliferation, zum Beispiel um die Proliferation zu verhindern, das Tumorwachstum zu verhindern oder um den Fingerprint des normalen Gewebes zu unterdrücken, wie weiter unten beschrieben ist. In gleicher Weise unterdrückt die einen Kandidaten darstellende Substanz bevorzugt einen schwerwiegenden Phänotypen der zellulären Proliferation. Unterdrückung kann die Form der Beendigung des Zell- oder Tumorwachstums mit fortgesetzter Entwicklungsfähigkeit annehmen. Alternativ kann die Unterdrückung die Form der Veranlassung zum Zelltod von Zellen annehmen, wodurch die Proliferation eliminiert wird. Wie weiter unten beschreiben werden bevorzugte bioaktive Substanzen identifiziert, die selektiv den Zelltod von Tumorzellen oder sich vermehrenden Zellen verursachen. Im allgemeinen läuft eine Vielzahl von Assay-Mischungen mit verschiedenen Substanzkonzentrationen parallel, um eine unterschiedliche Antwort für die verschiedenen Konzentrationen zu erhalten. Typischerweise dient eine von diesen Konzentrationen als eine negative Kontrolle, z.B. bei der Konzentration null oder unter dem Nachweislevel.
Der Begriff „einen Kandidaten darstellende bioaktive Substanz" oder „einen Kandidaten darstellendes Arzneimittel" oder grammatikalische Äquivalente, wie sie hier verwendet werden, beschreibt jedes Molekül, z.B. Protein, Oligopeptid, kleines organisches Molekül, Polysaccharid, Polynukleotid, Purin Analogon, etc., das sich nach seiner Überprüfung als bioaktive Substanz herausstellte, die fähig zur direkten oder indirekten Änderung ist entweder des zellulären Proliferations-Phänotyps oder der Expression von einer zellulären Proliferations-Sequenz, einschließlich sowohl der Nukleinsäure-Sequenzen wie auch der Protein-Sequenzen. In anderen Fällen wird die Änderung der Bindung und/oder der Aktivität des zellulären Proliferations-Proteins überprüft. In dem Fall, in dem die Proteinbindung oder -aktivität überprüft wird, umfassen die bevorzugten Ausführungsformen keine Moleküle, von denen bekannt ist, dass sie an dieses spezielle Protein binden, zum Beispiel polymere Strukturen, solche wie Mikrotubuli, und Energiequellen, solche wie ATP. Bevorzugte hier beschriebene Ausführungsformen von Assays umfassen einen Kandidaten darstellende Substanzen, die nicht das zelluläre Proliferations-Protein in seinem endogene natürlichen Zustand binden, und werden hier als „exogene" Substanzen bezeichnet. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform schließen exogene Substanzen ferner Antikörper gegen KSP aus.
Einen Kandidaten darstellende Substanzen können mehrere chemische Klassen umfassen, obwohl sie typischerweise organische Moleküle, bevorzugt kleine organische Verbindungen mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 und weniger als etwa 2500 Dalton sind. Kleine Moleküle sind ferner hier definiert als solche, die ein Molekulargewicht zwischen 50 kD und 2000 kD haben. In einer anderen Ausführungsform haben kleine Moleküle ein Molekulargewicht von weniger als 1500, oder weniger als 1200, oder weniger als 1000, oder weniger als 750, oder weniger als 500 kD. In einer Ausführungsform hat ein hier verwendetes kleines Molekül ein Molekulargewicht von etwa 100 bis 200 kD. Einen Kandidaten darstellende Substanzen enthalten funktionelle Gruppen, die für die strukturelle Wechselwirkung mit Proteinen wichtig sind, insbesondere Wasserstoffbrücken bindungen, und typischerweise enthalten sie mindestens eine Amin-, Carbonyl-, Hydroxyl- oder Carboxylgruppe, bevorzugt mindestens zwei von den funktionellen chemischen Gruppen. Die einen Kandidaten darstellende Substanzen enthalten oft zyklische Kohlenstoff- oder heterozyklische Strukturen und/oder aromatische oder polyaromatische Strukturen, die mit einer oder mehreren der obigen funktionellen Gruppen substituiert sind. einen Kandidaten darstellenden Substanzen werden auch unter den Biomolekülen, einschließlich Peptiden, Sacchariden, Fettsäuren, Steroiden, Purinen, Pyrimidinen, Derivaten, strukturellen Analoga oder Kombinationen davon gefunden.
Einen Kandidaten darstellende Substanzen werden von einer großen Vielzahl von Quellen erhalten, einschließlich Bibliotheken von synthetischen oder natürlichen Verbindungen Zum Beispiel sind mehrere Mittel erhältlich für eine zufällige oder gezielte Synthese von einer großen Vielzahl von organischen Verbindungen und Biomolekülen, einschließlich einer Expression von zufällig ausgewählten Oligonukleotiden. Alternativ sind Bibliotheken von natürlichen Verbindungen in der Form von bakteriellen, Pilz-, Pflanz- und Tierextrakten erhältlich oder können ohne weiteres hergestellt werden. Zusätzlich können natürlich oder synthetisch hergestellte Bibliotheken und Verbindungen ohne weiteres durch konventionelle chemische, physikalische und biochemische Mittel modifiziert werden. Bekannte pharmakologische Substanzen können für direkte oder zufällige chemische Modifikationen, solche wie Acylierung, Alkylierung, Veresterung, Amidierung, ausgewählt werden, um struktruelle Analoga herzustellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die einen Kandidaten darstellenden bioaktiven Substanzen Proteine. Mit „Protein" sind hier mindestens zwei kovalent gebundene Aminosäuren ge meint, was Proteine, Polypeptide, Oligopeptide und Peptide einschließt. Das Protein kann aus natürlich auftretenden Aminosäuren und Peptidbindungen gemacht werden oder aus synthetischen peptid-mimetischen Strukturen. Daher meinen „Aminosäuren" oder „Peptidreste", wie sie hier verwendet werden, beides, natürliches auftreten und synthetische Aminosäuren. Zum Beispiel werden Homo-phenylalanin, Citrullin und Norleucin als Aminsosäuren für den Zweck der vorliegenden Erfindung in Erwägung gezogen. „Aminosäure" umfasst auch Iminosäure-Reste, solche wie Prolin und Hydroxyprolin. Die Seitenketten können entweder in der (R) oder der (S) Konfiguration sein. In der bevorzugten Ausführungsform sind die Aminosäuren in der (S) oder L-Konfiguration. Wenn nicht natürlich auftretende Seitenketten verwendet werden, können nicht-Aminosäure-Substituenten verwendet werden, zum Beispiel um in vivo Abbau zu verhindern oder zu verzögern.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die einen Kandidaten darstellenden bioaktiven Substanzen natürlich auftretende Proteine oder Fragmente von natürlich auftretenden Proteinen. Daher können zum Beispiel zelluläre Extrakte, die Proteine oder zufällige oder gezielte Abbauprodukte von proteinartigen zellulären Extrakten enthalten, verwendet werden. Auf diese Art können Bibliotheken von prokaryotischen und eukaryotischen Proteinen für die Überprüfung von den Verfahren dieser Erfindung gemacht werden. Insbesondere bevorzugt in dieser Ausführungsform sind Bibliotheken von bakteriellen, fungizidalen, viralen und Säugetier-Proteinen, wobei die letzteren bevorzugt sind und menschliche Proteine ganz besonders bevorzugt sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die einen Kandidaten darstellenden bioaktiven Substanzen Peptide von etwa 5 bis etwa 30 Aminosäuren, bevorzugt von etwa 5 bis etwa 20 Amino säuren und besonders bevorzugt von etwa 7 bis etwa 15 Aminosäuren. Die Peptide können, wie oben umrissen, Abbauprodukte von natürlich auftretenden Proteinen, zufällige Peptide oder „verzerrt" zufällige Peptide sein. „Zufällig auswählen" oder grammatikalische Äquivalente meint hier, dass jede Nukleinsäure und jedes Peptid aus zufälligen Nukleotiden beziehungsweise Aminosäuren besteht. Wenn im allgemeinen diese zufälligen Peptide (oder Nukleinsäuren; unten beschrieben) chemisch synthetisiert werden, können sie jedes Nukleotid oder jede Aminosäure an jeder Position einbauen. Das synthetische Verfahren kann entworfen werden, um zufällig ausgewählte Proteine oder Nukleinsäuren zu erzeugen, um so die Bildung von allen oder von den meisten der möglichen Kombinationen über die Länge der Sequenz zu ermöglichen, wodurch eine Bibliothek von zufällig ausgewählten einen Kandidaten darstellenden bioaktiven proteinartigen Substanzen entsteht.
In einer Ausführungsform ist die Bibliothek völlig zufällig ausgewählt, ohne Sequenz-Präferenzen oder -konstanten in keiner Position. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Bibliothek verzerrt. Das bedeutet, das einige Positionen innerhalb der Sequenz entweder konstant oder aus einer begrenzten Anzahl von Möglichkeiten ausgewählt sind. Zum Beispiel sind in einer bevorzugten Ausführungsform die Nukleotide oder die Aminosäure-Reste zufällig innerhalb einer definierten Klasse ausgewählt, zum Beispiel der Klasse der hydrophoben Aminosäuren, der Klasse der hydrophilen Reste, der Klasse der sterisch verzerrten (entweder kleinen oder großen) Reste, für die Erzeugung von Nukleinsäurebindungs-Domänen, die Erzeugung von Cysteinen für das Cross-Linking, die Erzeugung von Prolinen für SH-3 Domänen, die Erzeugung von Serinen, Threoninen, Tyrosinen oder Histidinen als Phosphorylierungsstellen, etc. oder zu Purinen etc.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die einen Kandidaten darstellenden bioaktiven Substanzen Nukleinsäuren. „Nukleinsäure" oder „Oligonukleotid" oder grammatikalische Äquivalente meinen hier mindestens zwei Nukleotide, die kovalent miteinander verbunden sind. Eine Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung wird im allgemeinen Phosphodiester Bindungen enthalten, obwohl in einigen Fällen, wie unten umrissen, Nukleinsäure-Analoga umfasst werden, die alternative Rückgrate haben, umfassend zum Beispiel Phosphoramid (Beaucage et al., Tetrahedron 49(10): 1925 (1993) und Referenzen hierin; Letsinger, J. Org. Chem., 35: 3800 (1970); Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81: 579 (1977); Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14: 3487 (1986); Sawai et al., Chem. Lett. 805 (1994); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc., 110: 4470 (1988); und Pauweis et al., Chimica Scripta, 26: 141 (1986)), Phosphorothioat (Mag et al., Nukleic Acids Res., 19: 1437 (1991) und U.S. Patent Nr. 5,644,048), Phosphorodithioat (Briu et al., J. Am Chem. Soc., 111: 2321 (1989)), O-Methylphosphoroamidit Verknüpfungen (siehe Eckstein, Oligonukleotides an Analogues, A Practical Approach, Oxford University Press) und Peptid-Nukleinsäure Rückgrate und Verknüpfungen (siehe Egholm, J. Am. Chem. Soc., 114: 1895 (1992); Meier et al. Chem. Int. Ed. Engl., 31: 1008 (1992); Nielsen, Nature, 365: 566 (1993); Carlsson et al., Nature, 380: 207 (1996), wobei alle Dokumente durch deren Referenz hiermit eingefügt werden). Andere analoge Nukleinsäuren umfassen diejenigen mit positiven Rückgraten (Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 6097 (1995)), nicht-ionischen Rückgraten (U.S. Patent Nr. 5,386,023, 5,637,684, 5,602,240, Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Int. Ed. English, 30: 423 (1991); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc., 110: 4470 (1988); Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide, 13: 1597 (1994); Kapitel 2 und 3, ASC Symposium Series 580, „Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui und P. Dan Cook; Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett., 4: 395 (1994); Jeffs et al., J. Biomolecular NMR, 34: 17 (1994); Tetrahedron Lett., 37: 743 (1996)) und nicht-ribose Rückgrate, einschließlich derjenigen, die beschrieben sind in den U.S. Patenten Nr. 5,235,033 und 5,034,506, und Kapitel 6 und 7, ASC Symposium Series 580, „Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui und P. Dan Cook. Nukleinsäuren, die ein oder mehrere carbocyclische Zucker enthalten, werden auch von der Definition der Nukleinsäuren mitumfasst (siehe Jenkins et al., Chem. Soc. Rev. (1995) S. 169–176). Einige Nukleinsäure Analoga sind bei Rawls, C & E News June 2, 1997, Seite 35 beschrieben. Alle diese Referenzen werden hiermit explizit durch Referenz eingefügt. Diese Modifikationen des Ribose-Phosphat Rückgrates können durchgeführt werden, um die Addition von weiteren Einheiten, solchen wie Markierungen, zu ermöglichen oder um die Stabilität und die Halbwertszeit von solchen Molekülen in physiologischen Umgebungen zu steigern. Zusätzlich können Mischungen von natürlich auftretenden Nukleinsäuren und Analoga gemacht werden. Alternativ können Mischungen von verschiedenen Nukleinsäure-Analoga und Mischungen von natürlich auftretenden Nukleinsäuren und Analoga gemacht werden. Die Nukleinsäure können einzel- oder doppelsträngig sein, wie spezifiziert, oder können Teile von beidem, doppelstränge und einzelsträngige Sequenzen, enthalten. Die Nukleinsäure kann DNA sein, sowohl genomische wie auch cDNA, RNA oder ein Hybrid, bei dem die Nukleinsäure jede Kombination von Deoxyribo- und Ribonukleotiden und jede Kombination von Basen, einschließlich Uracil, Adenin, Thymin, Cyto sin, Guanin, Inosin, Xathanin, Hypoxathanin, Isocytosin, Isoguanin, etc., enthält.
Wie oben im allgemeinen für Proteine beschrieben können einen Kandidaten darstellende bioaktive Substanzen für Nukleinsäuren natürlich auftretende Nukleinsäuren, zufällige Nukleinsäuren oder „verzerrt" zufällige Nukleinsäuren sein. Zum Beispiel können Stellen von prokaryotischen oder eukaryotischen Genomen, wie oben für Proteine umrissen, verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die einen Kandidaten darstellenden bioaktiven Substanzen organische chemische Einheiten, eine große Vielfalt von ihnen sind in der Literatur erhältlich.
In einer bevorzugten Ausführungsform können, wie oben umrissen, Screens von individuellen Genen und Genprodukten (Proteinen) gemacht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden das Gen oder das Protein wie unten beschrieben als ein differentiell exprimiertes Gen, das in einem besonderen Zustand wichtig ist, identifiziert. Daher werden in einer Ausführungsform Screens entworfen, um als erstes einen Kandidaten darstellende Substanzen, die differentiell exprimierte Proteine binden können, zu finden und dann können diese Substanzen in Assay verwendet werden, die die Möglichkeit der einen Kandidaten darstellenden Substanz evaluieren, differentiell exprimierte Aktivität zu modulieren. Daher gibt es, wie es dem Fachmann bekannt ist, eine Zahl von verschiedenen Assays, die durchgeführt werden können; Bindungsassays und Aktivitätsassays.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Bindungsassay zur Verfügung gestellt. In einer Ausführungsform enthalten die Verfahren die Kombination eines zellulären Proliferationspro teins und einer einen Kandidaten darstellenden bioaktiven Substanz bei Anwesenheit oder Abwesenheit von Mikrotubuli und die Bestimmung der Bindung der einen Kandidaten darstellenden Substanz an das zelluläre Proliferationsprotein. Bevorzugte Ausführungsformen verwenden die menschlichen zellulären Proliferationsproteine, obwohl Proteine von anderen Säugetieren, wie oben beschrieben, auch verwendet werden können, zum Beispiel für die Entwicklung von Tiermodellen für menschliche Krankheiten. In einigen Ausführungsformen können, wie hier umrissen, Varianten oder Derivate der zellulären Proliferationsproteine verwendet werden.
Im allgemeinen ist in einer bevorzugten Ausführungsform der hier beschriebenen Verfahren das zelluläre Proliferationsprotein oder die einen Kandidaten darstellende Substanz nicht-diffundierbar an einen unlöslicher Träger mit isolierten Bereichen für die Probenaufnahme (z.B. eine Mikrotiter Platte, ein Array, etc.) gebunden. Die unlöslichen Träger können aus jeder Zusammensetzung gemacht werden, an welche die Zusammensetzungen gebunden werden können, sind einfach von dem löslichen Material zu trennen und sind andererseits kompatibel mit dem gesamten Screeningverfahren. Die Oberfläche von solchen Trägern kann fest oder porös sein und jede geeignete Form aufweisen. Beispiele von geeigneten unlöslichen Trägern umfassen Mikrotiter Platten, Arrays, Membranen und Kugeln. Diese werden typischerweise aus Glass, Kunststoff (z.B. Polystyyrol), Polysacchariden, Nylon oder Nitrocellulose, Teflon^TM, etc. gemacht. Mikrotiter Platten und Arrays sind besonders geeignet, weil sie eine große Anzahl von Assays unter Verwendung von kleinen Mengen an Reagentien und Proben gleichzeitig ausgeführt werden kann. Die besondere Art der Bindung der Zusammensetzung ist solange nicht entscheidend, wie sie mit den Reagentien und den gesamten Methoden der Erfindung kompatibel ist, die Aktivität der Zusammensetzung erhält und nicht diffundierbar ist. Bevorzugte Verfahren der Bindung umfassen die Verwendung von Antikörpern (die sterisch weder die Bindungsstelle des Liganden noch die Aktivierungssequenz blockieren, wenn das Protein an den Träger gebunden ist) die direkte Bindung an „klebrige" oder ionische Träger, chemischen Crosslinking; die Synthese des Proteins oder der Substanz auf der Oberfläche, etc. Im Anschluss an die Bindung des Proteins oder der Substanz wird überschüssiges nicht-gebundenes Material durch Waschen entfernt. Die Bereiche für die Probenaufnahme können dann durch Inkubation mit bovines Serumalbumin (BSA), Casein oder ein anderes harmloses Protein oder eine andere Einheit blockiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Zellproliferationsprotein an den Träger gebunden und eine einen Kandidaten darstellende bioaktive Substanz wird dem Assay zugefügt in Gegenwart oder in Abwesenheit von Mikrotubuli. Alternativ ist die einen Kandidaten darstellende Substanz an den Träger gebunden und das Zellproliferationsprotein wird zugesetzt. Neue Bindungssubstanzen beinhalten spezifische Antikörper, nicht natürliche Bindungssubstanzen, die in Screens von chemischen Bibliotheken identifiziert worden sind, Peptidanaloga etc. Zu diesem Zweck kann eine große Zahl von Assays eingesetzt werden beinhaltend die markierten in vitro Protein-Protein-Bindungsassays, elektrophoretische Beweglichkeitsänderungsassays, Imunoassays für Proteinbindung, funktionelle Assays (Phosphorylierungsassays etc.) und ähnliches mehr.
Darüber hinaus werden in einem anderen Aspekt Screening-Assays hier durchgeführt, bei denen weder das einen Kandidaten darstellende Arzneimittel noch das zelluläre Proliferationspro tein an den festen Träger gebunden ist. Lösliche Assays sind im Stand de Technik bekannt. In einer Ausführungsform kann die Bindung eines zellulären Proliferationsproteins oder eines Fragments davon an ein einen Kandidaten darstellendes Arzneimittel durch Änderungen in der Fluoreszenz von entweder dem zellulären Proliferationsprotein oder dem einen Kandidaten darstellenden Arzneimittel oder von beiden bestimmt werden. Fluoreszenz kann intrinsisch sein oder durch Markierung eines der Komponenten mit einem Fluorophor übertragen werden. Als ein Beispiel, das die Allgemeinheit nicht beschränken soll, kann die Bindung durch Fluoreszenz-Polarisation detektiert werden.
Die Bestimmung der Bindung der einen Kandidaten darstellenden bioaktiven Substanz zum zellulären Proliferationsprotein kann in einer Reihe von Wegen durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die einen Kandidaten darstellende bioaktive Substanz markiert, und die Bindung wird direkt bestimmt. Dies kann zum Beispiel durchgeführt werden durch die Anheftung eines ganzen oder eines Teils vom zellulären Proliferationsprotein an einen festen Träger, Zugabe einer markierten einen Kandidaten darstellende Substanz (zum Beispiel eine Fluoreszenzmarkierung), Auswaschen von überschüssigem Reagenz, und der Bestimmung, ob die Markierung auf dem festen Träger präsent ist. Verschiedene Blockierungs- und Waschschritte können benutzt werden wie es im Stand der Technik bekannt ist.
Mit „markiert" ist hier gemeint, dass die Verbindung entweder direkt oder indirekt mit einer Markierung markiert ist, die ein detektierbares Signal bereit stellt, z.B. ein Radioisotop, Fluorophore beinhaltend metallorganische fluoreszente Verbindungen, Enzyme, Antikörper, Partikel, solche wie zum Beispiel magnetische Partikel, chemilumineszentes Material, oder spezifisch bindende Moleküle, etc. Spezifisch bindende Moleküle beinhalten Paare, wie zum Beispiel Biotin und Streptavidin, Digoxin und Antidigoxin, etc. Für die spezifisch bindenden Mitglieder wird das komplementäre Mitglied normalerweise mit einem Molekül markiert sein, welches eine Detektion sicher stellt, in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren, wie sie oben umrissen wurden. Die Markierung kann direkt oder indirekt ein detektierbares Signal zur Verfügung stellen.
In einigen Ausführungsformen ist nur eine der Komponenten markiert. Zum Beispiel können die Proteine (oder die proteinogenen, einen Kandidaten darstellenden Substanzen) an Tyrosin-Positionen mit ¹²⁵I oder mit Fluorophoren markiert werden. Alternativ können mehr als eine Komponente mit verschiedenen Markierungen markiert werden; zum Beispiel Verwendung von ¹²⁵I für die Proteine und eines Fluorophors für den Kandidaten für die Substanz.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Bindung der einen Kandidaten darstellenden bioaktiven Substanz durch die Verwendung von kompetitiven Bindungsassays bestimmt. In dieser Ausführungsform ist der Wettbewerber eine bindende Einheit, die dafür bekannt ist, an das Zielmolekül (d.h. das zelluläre Proliferationsprotein) zu binden, wie zum Beispiel ATP, Mikrotubuli, ein Antikörper, Peptide, Bindungspartner, ein Ligand, etc. Unter bestimmten Umständen kann es zur kompetitiven Bindung zwischen der bioaktiven Substanz und der bindenden Einheit kommen, wobei die bindende Einheit die bioaktive Substanz freisetzt.
In einer Ausführungsform ist die einen Kandidaten darstellende bioaktive Substanz markiert. Entweder wird die einen Kandidaten darstellende bioaktive Substanz oder der Wettbewerber oder beide zuerst zu dem Protein gegeben für eine Zeit, die hinreichend ist, um Bindung zu erlauben, falls das Protein zugegen ist. Die Inkubationen können bei jeder Temperatur durchgeführt werden, die optimale Aktivität erleichtert, typischerweise zwischen 4 und 40°C. Die Inkubationszeiten sind für eine optimale Aktivität ausgewählt, können jedoch auch so optimiert werden, dass sie ein schnelles Hochdurchsatz-Screening erleichtern. Typischerweise ist zwischen 0,1 und 1 Stunde ausreichend. Überschüssiges Reagenz wird im allgemeinen entfernt oder weggewaschen. Die zweite Komponente wird dann zugesetzt, und die Anwesenheit oder die Abwesenheit der markierten Komponente wird verfolgt, um eine Bindung anzuzeigen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Wettbewerber zunächst zugesetzt, gefolgt von der einen Kandidaten darstellenden bioaktiven Substanz. Die Verdrängung des Wettbewerbers ist ein Anzeichen dafür, dass die einen Kandidaten darstellende bioaktive Substanz an das zelluläre Proliferationsprotein bindet und damit fähig ist, an das zelluläre Proliferationsprotein zu binden und potentiell die Aktivität des zellulären Proliferationsproteins zu modulieren. In dieser Ausführungsform kann jede der Komponenten markiert sein. So zeigt zum Beispiel die Gegenwart einer Markierung in der Waschlösung die Verdrängung des Wettbewerbers durch die Substanz an, wenn de Wettbewerber markiert ist. Alternativ zeigt die Gegenwart der Markierung auf dem Träger die Verdrängung an, wenn die einen Kandidaten darstellende bioaktive Substanz markiert ist.
In einer alternativen Ausführungsform wird die einen Kandidaten darstellende bioaktive Substanz zunächst zugesetzt mit Inkubation und Waschen, gefolgt vom Wettbewerber. Die Abwesenheit der Bindung durch den Wettbewerber kann anzeigen, dass die bioaktive Substanz mit einer höheren Affinität an das zelluläre Proliferationsprotein gebunden ist. Daher kann sofern die einen Kandidaten darstellende bioaktive Substanz markiert ist die Gegenwart der Markierung auf dem Träger, gekoppelt mit dem Fehlen der Wettbewerberbindung, anzeigen, dass die einen Kandidaten darstellende Substanz fähig ist, an das zelluläre Proliferationsprotein zu binden.
In einem anderen hier beschriebenen Aspekt werden Proteine identifiziert, die an KSP oder ein Fragment davon binden. Genetische Systeme wurden beschrieben für die Detektion von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Erste Arbeiten wurden an Hefesystemen durchgeführt, namentlich am „yeast two hybrid" System. Das ursprüngliche System benötigt eine Protein-Protein-Wechselwirkung, um die Transkription eines Reporter-Gens einzuschalten. Nachfolgende Arbeiten wurden in Säugetierzellen durchgeführt. Siehe Fields et al., Nature, 340: 245 (1989); Vasavada et al., PNAS USA, 88: 10686 (1981); Fearon et al., PNAS USA, 89: 7958 (1992); Dang et al., Mol. Cell. Biol., 11: 954 (1991); Chien et al., PNAS USA, 88: 9578 (1991) und U.S. Patent Nr. 5,283,173, 5,667,973, 5,468,614, 5,525,490 and 5,637,463.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Bindungsstelle des zellulären Proliferationsproteins identifiziert und hier bereit gestellt. Dies kann in einer Vielzahl von Wegen gemacht werden. Zum Beispiel wird das zelluläre Proliferationsprotein fragmentiert oder modifiziert nachdem es durch die Bindung an eine bioaktive Substanz identifiziert wurde, und die Assays werden dann wiederholt, um die notwendigen Komponenten für die Bindung zu identifizieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform bestehen die Methoden in einem differentiellen Screening zur Identifikation bioaktiver Substanzen, die in der Lage sind, die Aktivität der zellulären Proliferationsproteine zu modulieren. In dieser Ausführungsform bestehen die Methoden in der Kombination eines zellulären Proliferationsproteins mit einem Wettbewerber in einer ersten Probe. Eine zweite Probe besteht aus einer einen Kandidaten darstellenden bioaktiven Substanz, einem zellulären Proliferationsprotein und einem Wettbewerber. Die Bindung des Wettbewerbers wird in beiden Proben bestimmt, und eine Änderung oder ein Unterschied in der Bindung zwischen den beiden Proben zeigt die Gegenwart einer Substanz an, die in der Lage ist, an das zelluläre Proliferationsprotein zu binden, und, in einer Ausführungsform, dessen Aktivität zu modulieren. Die Methoden zur Bestimmung der Modulation der Aktivität sind weiterhin unten beschrieben. Das heißt, dass die Substanz in der Lage ist, an das zelluläre Proliferationsprotein zu binden, wenn die Bindung des Wettbewerbers in der zweiten Probe anders ist als in der ersten Probe.
Alternativ verwendet eine bevorzugte Ausführungsform ein differentielles Screening, um Kandidaten für Wirkstoffe zu identifizieren, die in der Anwesenheit oder in der Abwesenheit von Mikrotubuli an das native zelluläre Proliferationsprotein binden, jedoch nicht an modifizierte zelluläre Proliferationsproteine binden können. Die Struktur des zellulären Proliferationsproteins kann modelliert werden und in einem rationalen Wirkstoff-Design für die Synthese von Substanzen verwendet werden, die mit dieser Stelle in Interaktion treten. Kandidaten für Wirkstoffe, die die Bioaktivität der zellulären Proliferation beeinflussen, werden ebenfalls identifiziert, wenn Wirkstoff auf ihre Fähigkeit hin gescreent werden, die Aktivität des Proteins in der Gegenwart oder in der Abwesenheit von Mikrotubuli entweder zu verstärken oder zu reduzieren.
Positive Kontrollen und negative Kontrollen können in den Assays benutzt werden. Bevorzugt werden alle Kontrollen und Testproben in mindestens dreifacher Ausfertigung durchgeführt, um statistisch signifikante Resultate zu erhalten. Die Inkubation aller Proben wird über eine Zeitraum durchgeführt, der hinreichend lang ist, um die Bindung der Substanz an das Protein zu gewährleisten. Nach der Inkubation werden alle Proben von unspezifisch gebundenem Material freigewaschen, und die Menge von gebundener, im allgemeinen markierter Substanz wird bestimmt. Zum Beispiel werden die Proben, sofern sie eine radioaktive Markierung tragen, mit einem Scintillationszähler ausgezählt, um die Menge an gebundener Verbindung zu bestimmen.
Eine Vielzahl von anderen Reagenzien kann in den Screening Assays beinhaltet sein. Diese beinhalten Reagentien wie Salze, neutrale Proteine, z.B. Albumin, Detergentien usw., die verwendet werden können, um eine optimale Protein-Protein Bindung zu erleichtern und/oder die unspezifische Wechselwirkungen oder Hintergrundwechselwirkungen reduzieren. Auch andere Reagentien wie zum Beispiel Protease-Inhibitoren, Nuklease-Inhibitoren, antimikrobielle Substanzen etc. können verwendet werden, um auf anderem Wege die Effizienz des Assays zu verbessern. Die Mischung der Komponenten kann in jedweder Reihenfolge vorgenommen werden, die die Bedingungen für erforderliche Bindung zur Verfügung stellen.
Ein Screening nach Substanzen, die die Aktivität von zellulären Proliferationsproteinen modulieren, kann ebenfalls durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform bestehen die Methoden für das Screening nach einer bioaktiven Substanz, die in der Lage ist, die Aktivität von zellulären Proliferationsproteinen zu modulieren, in den Schritten der Zugabe einer einen Kandidaten darstellenden bioaktiven Substanz zu einer Probe von zellulären Proliferationsproteinen in der Gegenwart oder in der Abwesenheit von Mikrotubuli, wie oben, und der Bestimmung einer Änderung in der biologischen Aktivität von zellulären Proliferationsproteinen. „Modulation der Aktivität von zellulärer Proliferation" beinhaltet eine Erhöhung in der Aktivität, eine Erniedrigung in der Aktivität, oder ein Wechsel im Typ oder in der Art der gegenwärtigen Aktivität. Daher sollte in dieser Ausführungsform die einen Kandidaten darstellende Substanz beides verrichten, die Bindung an zelluläre Proliferationsproteine (wenngleich dies nicht notwendig sein muß) und die Veränderung der biologischen oder biochemischen Aktivität, wie sie hierin definiert ist. Die Methoden beinhalten beides, die in vitro Screening Methoden wie sie oben allgemein umrissen wurden und das in vivo Screening von Zellen nach Änderungen in der Gegenwart, der Verteilung, der Aktivität oder der Menge von zellulären Proliferationsproteinen.
Somit bestehen in dieser Ausführungsform die Methoden in der Kombination einer zellulären Proliferationsprobe und einer einen Kandidaten darstellenden bioaktiven Substanz, und in der Evaluation des Einflusses auf die Aktivität der zellulären Proliferation. Mit „zelluläre Proliferationsprotein-Aktivität" oder grammatikalischen Äquivalenten davon ist hier mindestens eine der biologischen Aktivitäten des zellulären Proliferationsproteins gemeint, beinhaltend, aber nicht begrenzt durch Kinesin Aktiviät, Regulation der Spindelpol Separation, Mitose, mitotischer Aufbau des Spindelapparats, Befriedigung des mitotischen Zellzyklus-Checkpoints, Zellzyklus Progression, Apoptose, zelluläre Proliferation, mitotisches Wachstum und Mitwirkung im Tumorwachstum. Ein Inhibitor der zellulären Proliferationsaktivität inhibiert auch irgendeine oder mehrere andere der Aktivitäten des zellulären Proliferationsproteins.
Die Kinesin-Aktivität ist im Stand der Technik bekannt und umfasst eine oder mehrere Kinesin-Aktivitäten. Kinesin-Aktivitäten beinhalten die Fähigkeit zur Beeinflussung der ATP Hydrolyse, die Bindung an Mikrotubuli, das Gleiten und die Polymerisation/Depolymerisation (Effekte auf die Mikrotubuli-Dynamik), die Bindung an andere Proteine des Spindelapparates, die Bindung an Proteine, die in der Kontrolle des Zellzyklus involviert sind, oder die Funktion als Substrat für andere Enzyme wie zum Beispiel Kinasen oder Proteasen, und spezifische zelluläre Aktivitäten von Kinesin, wie zum Beispiel Spindel-Separation.
Methoden für die Durchführung von Mobilitätsassays sind dem Fachmann bestens bekannt (siehe z.B. Hall et al., (1996), Biophys. J., 71: 3467–3476; Turner et al., 1996, Anal. Biochem. 242 (1): 20–5; Gittes et al., 1996, Biophys. J. 70 (1): 418–29; Shirakawa et al., 1995, J. Exp. Biol. 198: 1809-15; Winkelmann et al., 1995, Biophys. J. 68: 2444–53; Winkelmann et al., 1995, Biophys. J. 68: 72S, und dergleichen mehr.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Assays können Methoden, die im Stand der Technik bekannt sind, für die Bestimmung von ATPase Aktivität verwendet werden. Bevorzugt werden lösungsbasierte Assays hierzu herangezogen. Alternativ können auch konventionelle Methoden verwendet werden. Zum Beispiel kann die P_i Freisetzung von Kinesin quantitativ erfaßt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden für den ATPase Aktivitätsassay 0.3 M PCA (perchloric acid, Perchlorsäure) und Malachitgrün Reagenz (8.27 mM Natriummolybdat II, 0.33 mM Malachitgrün-oxalat und 0.8 M Triton X-100) verwendet. Um den Assay durchzuführen werden 10 ☐L der Reaktionsmischung mit 90 ☐L einer kalten 0.3 M PCA gequencht. Phosphat-Standards werden verwendet, so daß die Daten in die Angabe mM anorganisches, freigesetztes Phosphat konvertiert werden können. Nachdem alle Reaktionsmischungen und Standards mit PCA gequencht sind werden 100 ☐L des Malachitgrün Reagenzes in die betreffenden Vertiefungen von z.B. einer Mikrotiterplatte gegeben. Die Mischung wird für 10–15 Minuten entwickelt, und die Platte wird bei einer Absorptionswellenlänge von 650 nm ausgelesen. Sofern Phosphat-Standards verwendet wurden können die Absorptionswerte in mM P_i konvertiert und über die Zeit geplottet werden. Zusätzlich beinhalten die im Stand der Technik bekannten ATPase Assays den Luziferase Assay.
In einer anderen bevorzugten Methode wird die Kinesin Aktivität durch Methoden bestimmt, die in Serial Nr. 09/314,464, angemeldet am 18. Mai 1999, unter dem Titel Compositions and Assay Utilizing ADP or Phosphate for Detecting Protein Modulators, offenbart sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Aktivität des zellulären Proliferationsproteins erhöht; in einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Aktivität des zellulären Proliferationsproteins erniedrigt. So sind bioaktive Substanzen, die als Antagonisten angesprochen werden können, in einigen Ausführungsformen bevorzugt, und bioaktive Substanzen, die als Agonisten angesprochen werden können, in anderen Ausführungsformen bevorzugt.
In einem Aspekt von dieser Erfindung werden zelluläre Proliferationssequenzen in Wirkstoff Screening Assays dadurch verwendet, dass der Einfluß von Kandidaten für Wirkstoffe auf die zelluläre Proliferation evaluiert wird. Die Zelltypen beinhalten normale Zellen, und mehr bevorzugt Zellen mit abnormen Proliferationsraten, beinhaltend Tumorzellen, am meisten bevorzugt humane Tumorzellen. Die Methoden zur Beurteilung der zellulären Proliferation sind im Stand der Technik bekannt und beinhalten Wachstums- und Lebensfähigkeitsassays, wobei kulturierte Zellen verwendet werden. In solchen Assays werden Zellpopulationen bezüglich ihres Wachstums und der Lebensfähigkeit beobachtet, was häufig in Abhängigkeit der Zeit, durch den Vergleich von Proben, die mit verschiedenen Konzentrationen der bioaktiven Substanz oder ohne die bioaktive Substanz inkubiert wurden. Die Zahl der Zellen kann mit Hilfe von Substanzen wie 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromid (MTT), 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) [U.S. Pat. Nr. 5,185,450] und Alamar Blau dadurch quantifiziert werden, dass diese Substanzen in der Gegenwart metabolisch aktiver Zellen zu gefärbten oder fluoreszierenden Verbindungen konvertiert werden. Alternativ können Farbstoffe wie Sulforhodamin B (SRB) oder Kristallviolett, die an zelluläre Proteine binden, verwendet werden, um die Anzahl der Zellen zu ermitteln. Alternativ können Zellen direkt gezählt werden unter Verwendung eines Partikelzählers, wie zum Beispiel eines Coulter Counter^®, der von Beckman Coulter hergestellt wird, oder sie können mit einem Hämozytometer unter einem Mikroskop gezählt werden. Bevorzugt werden Zellen, die unter Verwendung eines Hämozytometers gezählt werden, in einer Lösung von Trypan Blau beobachtet, um lebende von toten Zellen unterscheiden zu können. Andere Methoden für die Quantifizierung der Anzahl von Zellen sind dem Fachmann geläufig. Diese Assays können an jeder dieser Zellen durchgeführt werden, beinhaltend diejenigen, die sich im Zustand der Nekrose befinden.
Zudem kann die Apoptose durch Methoden bestimmt werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Zum Beispiel sind Markierungen für die Apoptose bekannt, und TUNEL- (TdT-mediated dUTP-fluorescein nick end labeling) Kits können kommerziell erhalten werden, zum Beispiel der Boehringer Mannheim-Kit, Katalog Nr. 168795.
In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Methode in der Zugabe einer einen Kandidaten darstellenden bioaktiven Substanz, wie oben definiert, zu einer Zelle, in der sich zelluläre Proliferationsproteine befinden. Bevorzugte Zelltypen beinhalten nahezu jede Zelle. Die Zellen enthalten eine Nukleinsäure, bevorzugt eine rekombinante Nukleinsäure, die ein zelluläres Proliferationsprotein kodiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Bibliothek von einen Kandidaten darstellenden Substanzen an einer Vielzahl von Zellen getestet.
In einem Aspekt werden die Assays in der Gegenwart oder der Abwesenheit oder bei vorhergehender oder nachträglicher Exposition zu physiologischen Signalen, zum Beispiel Hormone, Antikörper, Peptide, Antigene, Zytokine, Wachstumsfaktoren, Aktionspotentiale, pharmakologische Substanzen beinhaltend Chemotherapeutika, Strahlung, Carcinogene oder andere Zellen (d.h. Zell-Zell Kontakte) bewertet. In einem anderen Beispiel werden die Bestimmungen an unterschiedlichen Stellen des Zellzyklus bestimmt.
In einem Aspekt von der Erfindung werden die zellulären Proliferationssequenzen und Zellen, die die zellulären Proliferationssequenzen enthalten, in Wirkstoff Screening Assays benutzt, indem der Einfluß der Kandidaten für Wirkstoffe auf ein „Genexpressionsprofil" oder auf Expressionsprofil-Gene bewertet wird. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Expressionsprofile benutzt, bevorzugt in Kombination mit Hochdurchsatz Screening Techniken, um Expressionsprofil-Gene nach der Behandlung mit der einen Kandidaten darstellenden Substanz zu untersuchen. Siehe Zlokarnik et al., Science 279, 84–8 (1998).
In einem Aspekt werden die Expressionsniveaus von Genen in verschiedenen zellulären Stadien des zellulären Proliferationsphänotyps bestimmt; das heißt, dass die Expressionsniveaus von Genen in normalem Gewebe in Proliferations- und Nichtproliferationszuständen, und in abnormen zellulären Proliferationsgewebe (und in einigen Fällen mit veränderlicher Schwere von zellulärer Proliferation, die mit der Prognose zusammenhängt, wie unten umrissen) bewertet werden, um Expressionsprofile bereit zu stellen. Abnome Zustände beinhalten Krebszustände und andere Hyper- oder Hypoproliferationszustände, wie im weiteren näher erläutert.
Ein Expressionsprofil von einem besonderen Zellzustand oder einem Punkt der Entwicklung ist im Grundsatz ein „Fingerprint" dieses Zustands; während zwei Zustände jedes spezielle Gene ähnlich exprimiert haben können, erlaubt die simultane Bewertung einer Anzahl von Genen die Erzeugung eines Genexpressionsprofils, welches einzigartig für den Zustand der Zelle ist. Durch den Vergleich der Expressionsprofile von Zellen in verschiedenen Zuständen werden Informationen bezüglich der Frage, welche Gene in jedem dieser Zustände wichtig sind (beinhaltend beides, die Hochregulation und die Herunterregulation von Genen), erhalten. Dann kann die Diagnose durchgeführt oder bestätigt werden, ob Gewebe von einem speziellen Patienten das Genexpressionsprofil von normalem oder abnormem zellulärem Proliferationsgewebe hat.
„Differentielle Expression" oder grammatikalische Äquivalente davon wie sie hier gebraucht werden bezieht sich auf beides, sowohl auf qualitative wie auch auf quantitative Unterschiede in temporären und/oder zellulären Expressionsmustern von Genen innerhalb der Zelle und unter mehreren Zellen. So kann die Expression eines differentiell exprimierten Gens qualitativ in, zum Beispiel, normalem versus abnomem zellulären Proliferationsgewebe, verändert sein, beinhaltend eine Aktivierung oder Inaktivierung. Das heißt, das Gene in einem bestimmten Zustand relativ zu einem anderen Zustand angeschaltet oder ausgeschaltet sein können oder ein verschiedenes Zeitmuster aufweisen, zum Beispiel können Krebszellen Gene haben, die angeschaltet bleiben. Wie dem Fachmann offensichtlich ist kann jeder Vergleich von zwei oder mehr Zuständen an verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt und wiederholt werden. Solch ein qualitativ reguliertes Gen wird ein Expressionsmuster innerhalb eines Zustands oder eines Zelltyps zeigen, dass in diesem einen Zustand oder diesem einen Zelltyp mit Standardtechniken detektierbar ist, aber das nicht in beiden detektierbar ist. Alternativ ist die die Bestimmung dahingehend quantitativ als dass die Expression erhöht oder erniedrigt ist; das heißt, dass die Expression von diesem Gen entweder hochreguliert ist, was in einer vermehrten Menge des Transkripts resultiert, oder dass die Expression herunterreguliert ist, was in einer verringerten Menge des Transskripts resultiert. Der Grad, zu dem die Expression verändert ist muß nur groß genug sein, um mit Standard Charakterisierungstechniken, wie zum Beispiel durch die Verwendung von Affymetrix GeneChip^TM Expressionsarrays, Lockhart, Nature Biotechnology, 14: 1675–1680 (1996), hiermit ausdrücklich durch Referenz hier eingefügt, wie unten näher umrissen quantifiziert werden zu können. Andere Techniken beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf, quantitative Reverse Transkriptase PCR, Northern Analyse und RNase Protektion. Wie oben umrissen ist die Änderung der Expression (d.h. Hochregulation oder Herunterregulation) bevorzugt mindestens etwa 50%, mehr bevorzugt mindestens etwa 100%, bevorzugt mindestens etwa 150%, mehr bevorzugt mindestens etwa 200%, besonders bevorzugt von 300 bis mindestens etwa 1000%.
Wie dem Fachmann bekannt ist kann dies durch eine Bewertung entweder auf dem Gentranskriptionsniveau oder auf dem Protein-Level durchgeführt werden; das heißt, dass die Menge der Genexpression mit Hilfe von Nukleinsäuresonden für die DNA oder RNA-Äquivalente des Gentranskripts beobachtet werden kann, und dass die Quantifizierung der Genexpressionsniveaus oder, alternativ, das finale Genprodukt selbst (Protein) beobachtet werden kann, zum Beispiel durch die Verwendung von Antikörpern für das zelluläre Proliferationsprotein und durch Standard Immunassays (ELISAs, etc.), oder durch andere Techniken, beinhaltend massenspektroskopischen Assays, 2D Gelelektrophorese Assays etc. Damit können die Proteine, die zu den zellulären Proliferationsgenen korrespondieren, d.h. diejenigen, die als wichtig für einen zellulären Proliferationsphänotyp identifiziert wurden, in einem für zelluläre Proliferation diagnostischen Test bewertet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Nukleinsäuren detektiert, die das zelluläre Proliferationsprotein kodieren. Wenngleich hierbei die DNA oder RNA, die das zelluläre Proliferationsprotein kodieren, detektiert werden können, sind Methoden von besonderem Interesse, mit denen die mRNA, die das zelluläre Proliferationsprotein kodiert, detektiert wird. Die Gegenwart von mRNA in einer Probe ist ein Anzeichen dafür, dass das zelluläre Proliferationsgen unter Bildung der mRNA transkribiert worden ist, und legt nahe, dass das Protein exprimiert wurde. Eine Sonde für die Detektion der mRNA kann jede Nukleotid/Deoxynukleotid-Sonde sein, die komplementär ist zu und die Basen paart mit der mRNA und beinhaltet, aber ist nicht beschränkt auf Oligonukleotide, cDNA oder RNA. Sonden sollten auch eine detektierbare Markierung enthalten, wie hierin definiert. In einem Verfahren wird die mRNA nach der Immobilisierung der zu untersuchenden Nukleinsäure an einen festen Träger, wie zum Beispiel Nylon-Membranen, und Hybridisierung der Sonde mit der Probe detektiert. Nach dem Waschen zur Entfernung der unspezifisch gebundenen Sonde wird die Markierung detektiert. In einem anderen Verfahren wird die Detektion der mRNA in situ durchgeführt. In diesem Verfahren werden permeablisierte Zellen oder Gewebeproben mit einer detektierbar markierten Nukleinsäureprobe für eine hinreichende Zeit in Kontakt gebracht, die erlaubt, dass die Sonde mit der Ziel-RNA hybridisiert. Nach dem Waschen zur Entfernung der unspezifisch gebundenen Sonde wird die Markierung detektiert. Zum Beispiel wird eine mit Digoxygenin markierte Ribo-Sonde (RNA Sonde), die zu der mRNA komplementär ist, die ein zelluläres Proliferationsprotein kodiert, durch die Bindung des Dioxygenins mit einem anti Dioxygenin Sekundärantikörper und Entwicklung mit Nitroblau-Tetrazolium und 5-Bromo-4-chloro-3-indoylphosphat detektiert.
In einem Fall können einen Kandidaten darstellende bioaktiven Substanzen auf die Modulation der Antwort eines Gens gescreent werden, wenn dieses bestimmte Gen als die zelluläre Proliferation hochregulierend identifiziert worden ist; Bevorzugt zur Herunterregulierung des Gens, obwohl unter einigen Umständen zur Hochregulierung des Gens. „Modulation" beinhaltet daher beides, eine Zunahme und eine Abnahme in der Genexpression oder einen Wechsel im temporären Muster. Die bevorzugte Menge von Modulation wird abhängen von der originären Änderung der Genexpression in normalem versus Tumorgewebe mit Änderungen von mindestens 10%, bevorzugt 50%, besonders bevorzugt 100–300%, und in einigen Ausführungsform 300–1000% oder größer. Somit ist, wenn ein Gen im Tumor eine gegenüber dem normalen Gewebe vierfache Erhöhung zeigt, eine ungefähr vierfache Erniedrigung gewünscht; eine zehnfache Erniedrigung im Tumor verglichen mit normalem Gewebe ergibt eine zehnfache Erhöhung der Expression als gewünschten Wert für die einen Kandidaten darstellende Substanz.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Genexpression beobachtet, und eine Anzahl von Genen, d.h. ein Expressionsprofil, wird simultan beobachtet, wenngleich eine multiple Beobachtung der Proteinexpression ebenfalls durchgeführt werden kann.
In einer Ausführungsform sind die zellulären Proliferations-Nukleinsäure Sonden für die Detektion und Quantifizierung von zellulären Proliferationssequenzen in einer bestimmten Zelle an Biochips angeheftet, wie weiter unten umrissen.
Im allgemeinen ist in einer bevorzugten Ausführungsform die einen Kandidaten darstellende bioaktive Substanz vor der Analyse den Zellen zugesetzt worden. Jede Zelle kann benutzt werden, beinhaltend normale und abnorme Zellen, beinhaltend Tumor und nicht-Tumor Säugetier-, bevorzugt humane Zellen. In einigen Fällen werden Pflanzenzellen verwendet. Nachdem die einen Kandidaten darstellende Substanz zugesetzt wurde und die Zellen für einige Zeit inkubiert wurden, wird die Probe, die die zu analysierende Zielsequenz enthält, zu dem Biochip gegeben. Wenn nötig wird die Zielsequenz mittels bekannter Techniken dargestellt. Zum Beispiel kann die Probe so behandelt werden, dass sich die Zellen auflösen, unter Verwendung bekannter Auflösepuffer, der Elektroporation, etc., bei Bedarf mit Reinigung und/oder einer Verstärkung wie zum Beispiel PCR, wie es dem Fachmann bekannt ist. Zum Beispiel wird eine in vitro Transkription mit Markierungen, die kovalent an die Nukleoside geheftet sind, durchgeführt. Im allgemeinen sind die Nukleinsäuren mit Biotin-FITC oder PE, oder mit cy3 oder cy5 markiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zielsequenz mit zum Beispiel einem fluoreszierenden, einem chemilumineszierenden, einem chemischen oder einem radioaktiven Signal markiert, um eine Möglichkeit zur Detektion der spezifischen Bindung der Zielsequenz an die Sonde bereit zu stellen. Die Markierung kann auch ein Enzym sein, wie zum Beispiel alkalische Phosphatase oder Meerrettich Peroxidase, welches ein detektierbares Produkt erzeugt, wenn es mit einem passenden Substrat versetzt wird. Alternativ kann die Markierung eine markierte Verbindung oder ein markiertes kleines Molekül wie zum Beispiel ein Enzym Inhibitor sein, das zwar bindet aber von dem Enzym weder katalysiert noch verändert wird. Die Markierung kann auch eine Einheit oder eine Verbindung sein wie zum Beispiel ein Epitop Tag oder Biotin, welches spezifisch an Streptavidin bindet. Für das Beispiel des Biotins ist das Streptavidin wie oben beschrieben markiert und liefert so ein detektierbares Signal für die gebundene Zielsequenz. Wie es dem Fachmann bekannt ist wird nicht gebundenes markiertes Streptavidin vor der Analyse entfernt.
Wie es dem Fachmann bekannt ist, können diese Assays direkte Hybridisierungsassays sein oder aus „Sandwich Assays" bestehen, die die Verwendung vieler Sonden beinhalten, wie es allgemein umrissen ist in U.S. Patent Nr. 5,681,702, 5,597,909, 5,545,730, 5,594,117, 5,591,584, 5,571,670, 5,580,731, 5,571,670, 5,591,584, 5,624,802, 5,635,352, 5,594,118, 5,359,100, 5,124,246 und 5,681,697, die alle hiermit durch Referenz hier eingefügt werden. In dieser Ausführungsform wird im allgemeinen die Zielnukleinsäure so, wie oben umrissen, dargestellt und dann unter Bedingungen, die die Bildung eines Hybridisierungskomplexes erlauben, zu dem Biochip gegeben, der aus einer Vielzahl von Nukleinsäure Sonden besteht.
Eine Vielzahl von Hybridisierungsbedingungen kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, beinhaltend hoch, moderat und niedrig stringente Bedingungen, wie oben umrissen. Die Assays werden im allgemeinen unter Stringenz Bedingungen durchgeführt, die die Bildung eines Markierungs-Sonden Hybridisierungskomplexes nur in der Gegenwart des Targets erlauben. Stringenz kann durch die Veränderung eines gestuften Parameters kontrolliert werden, welcher eine thermodynamische Variable darstellt, beinhaltend aber nicht begrenzt auf Temperatur, Konzentration von Formamid, Konzentration von Salz, chaotrope Salzkonzentration, pH, Konzentration an organischem Solvenz etc.
Diese Parameter können auch zur Kontrolle nicht spezifischer Bindung verwendet werden, wie es allgemein umrissen ist in U.S. Patent Nr. 5,681,697. Daher kann es wünschenswert sein, bestimmte Schritte bei höher stringenten Bedingungen durchzuführen, um nicht spezifische Bindung zu reduzieren.
Die hier umrissenen Reaktionen können auf einer Vielzahl von Wegen erreicht werden, wie dies dem Fachmann bekannt ist. Die Komponenten der Reaktionen können simultan oder sequentiell in jedweder Reihenfolge zugesetzt werden, mit bevorzugten Ausführungsformen unten umrissen. Zusätzlich kann die Reaktion eine Vielzahl von anderen Reagentien beinhalten. Diese beinhalten Reagentien wie Salze, Puffer, neutrale Proteine, z.B. Albumin, Detergentien etc., die verwendet werden können, um eine optimale Hybridierung und Detektion zu erleichtern, und/oder um unspezifische oder Hintergrundwechselwirkungen zu reduzieren. Auch Reagentien, die sonst die Effizienz des Assays verbessern, wie zum Beispiel Protease Inhibitoren, Nuklease Inhibitoren, antimikrobielle Substanzen etc., können verwendet werden in Abhängigkeit von den Methoden der Probenpräparation und der Reinheit des Targets.
Nachdem der Assay durchgeführt worden ist werden die Daten analysiert, um die Expressionsniveaus und Änderungen der Expressionsniveaus bei individuellen Genen zwischen den Stadien zu bestimmen und so ein Genexpressionsprofil zu erhalten.
In einem Aspekt werden die Screens durchgeführt, um Medikamente oder bioaktive Substanzen zu identifizieren, die den zellulären Proliferationsphänotyp modulieren. Im Besonderen gibt es viele Arten von Screens, die durchgeführt werden können. Eine bevorzugte Ausführungsform liegt im Screening von einen Kandidaten darstellenden Substanzen, die ein bestimmtes Expressionsprofil induzieren oder unterdrücken können und dabei bevorzugt den assoziierten Phänotyp erzeugen. Das heißt, dass von den einen Kandidaten darstellenden Substanzen, die ein Expressionsprofile in der zellulären Proliferation nachahmen oder erzeugen können, dass dem Expressionsprofil von normalem, Nicht-Krebsgewebe ähnelt, erwartet wird, die Unterdrückung des zellulären Proliferationsphänotyps zu bewirken. Daher ist in dieser Ausführungsform das Ziel, ein Expressionsprofil nachzuahmen oder ein Profil in ein anderes zu überführen.
In einer bevorzugten Ausführungsform, wie für die Anwendungen bei der Diagnose und der Prognose, die unten diskutiert werden, können Screens durchgeführt werden, um die Expression der Gene individuell zu verändern, sofern die differentiell exprimierten Gene, die in jedwedem Stadium wichtig sind, wie weiter unten beschrieben identifiziert wurden. Das heißt, dass ein Screening zur Modulation der Regulation der Expression eines einzelnen Gens durchgeführt werden kann; das heißt, dass anstelle des Versuchs, ein ganzes oder ein Teil eines Expressionsprofils nachzuahmen, ein Screening zur Regulation eines einzelnen Gens durchgeführt werden kann. Damit kann zum Beispiel insbesondere im Fall von Zielgenen, deren Präsenz, Absenz oder zeitliches Muster zwischen zwei Stadien einzigartig ist, ein Screening nach Modulatoren für die Expression des Zielgens durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kodiert das Zielgen das zelluläre Proliferationsprotein, welches hierin beschrieben wird. Daher kann ein Screening von einen Kandidaten darstellenden Substanzen, die den zellulären Proliferationsphänotyp entweder auf dem Niveau der Genexpression oder auf dem Niveau des Proteins modulieren, durchgeführt werden.
Zusätzlich hierzu können Screens für neue Gene durchgeführt werden, die als Antwort auf die einen Kandidaten darstellende Substanz induziert werden. Nach der Identifikation eines einer Kandidaten darstellenden Substanz aufgrund ihrer Fähigkeit, ein Expressionsmuster der zellulären Proliferation zu unterdrücken und zu einem normalen Expressionsmuster zurückzuführen, oder das Expressionsprofil eines einzelnen zellulären Proliferationsgens so zu modulieren, dass es die Expression dieses Gens von normalem Gewebe nachahmt, kann ein Screen wie oben beschrieben durchgeführt werden, um Gene zu identifizie ren, die als Antwort auf die Substanz spezifisch moduliert werden. Der Vergleich der Expressionsprofile von normalem Gewebe und mit Substanz behandeltem zellulären Proliferationsgewebe legt die Gene offen, die in normalem Gewebe oder in zellulärem Proliferationsgewebe nicht exprimiert werden, wohl aber in mit Substanz behandeltem Gewebe exprimiert werden. Diese für die Substanz spezifischen Sequenzen können identifiziert und von jeder der Methoden, die hier für zelluläre Proliferationsgene oder -proteine beschrieben sind, genutzt werden. Im Besonderen finden diese Sequenzen und die Proteine, die sie kodieren, Anwendung in der Markierung oder Identifizierung von mit Agenz behandelten Zellen. Zusätzlich können Antikörper gegen die vom Agenz induzierten Proteine erhalten werden, die wiederum zur zielgerichteten Hinführung neuer Therapeutika zur behandelten zellulären Proliferationsgewebeprobe dienen könne.
In einer Ausführungsform wird ein eine Kandidaten darstellende Substanz einer Population von zellulären Proliferationszellen verabreicht, welche dadurch ein assoziiertes Expressionsprofil der zellulären Proliferation erhält. Mit „verabreichen" oder „kontaktieren" ist hier gemeint, dass die einen Kandidaten darstellende Substanz in solcher weise zu den Zellen gegeben wird, dass der Substanz ermöglicht ist, auf die Zellen einzuwirken, entweder durch die Aufnahme und eine intrazelluläre Wirkung, oder durch eine Wirkung auf der Oberfläche der Zelle. In einigen Ausführungsformen können Nukleinsäuren, die eine proteinogene, einen Kandidaten darstellende Substanz (d.h. ein Peptid) kodieren, in ein virales Konstrukt wie zum Beispiel ein retrovirales Konstrukt eingebracht und zu einer Zelle gegeben werden, so dass die Expression der peptidischen Substanz bewirkt wird; siehe PCT US97/01019, hiermit ausdrück lich durch Referenz hier eingeführt. Die Phrase „unter Bedingungen, die der Zelle erlauben, die einen Kandidaten darstellende Substanz aufzunehmen" bedeutet, dass die Zelle biologisch in der Aufnahme und der intrazellulären Wirkung involviert ist, oder durch Wirkung an der Oberfläche der Zelle, sofern die Substanz nicht in die Zelle injiziert wird. Es ist bekannt, dass zielführende Liganden und biochemische Substanzen zur Erleichterung der Aufnahme herangezogen werden können; wie auch immer, dieses Vorgehen unterscheidet sich von der mechanischen Injektion. Mechanische Injektion ist explizit ausgenommen von der Definition des „aufgenommen durch die Zelle" so wie sie hier verwendet wird, und ist ebenfalls ausgenommen von den Bedingungen, die zu Hochdurchsatz-Assays führen, wie sie hierin benutzt werden.
Nachdem die einen Kandidaten darstellende Substanz zu den Zellen zugegeben worden ist, können die Zellen gewaschen werden, sofern dies erwünscht ist, und werden dann zur Inkubation für einige Zeit unter vorzugsweise physiologischen Bedingungen stehen gelassen. Die Zellen werden dann geerntet und ein neues Genexpressionsprofil wird erzeugt, wie hier umrissen.
Daher kann zum Beispiel zelluläres Proliferationsgewebe auf Substanzen gescreent werden, die den zellulären Proliferationsphänotyp reduzieren oder unterdrücken. Eine Änderung in mindestens einem Gen des Expressionsprofil zeigt an, dass die Substanz einen Einfluss auf die zelluläre Proliferationsaktivität ausübt. Durch die Definition einer solchen Signatur für den zellulären Proliverationsphänotyp können Screens für neue Wirkstoffe erdacht werden, die diesen Phänotyp verändern. Mit diesem Ansatz muss der Zielort des Wirkstoffs nicht bekannt sein und muss auch nicht in der originären Plattform des Ex pressions-Screening vortreten sein, noch muss das Niveau der Transkription für das Zielprotein verändert werden.
In all den Methoden, die hierin bereitgestellt werden, werden bioaktive Substanzen identifiziert. Auf ähnliche Weise können Verbindungen, die mit die Bindung oder die Wechselwirkung zwischen dem zellulären Proliferationsprotein und einer identifizierten bindenden oder modulierenden Substanz stören, identifiziert werden. Zudem können transgene Modelle, wie sie unten diskutiert werden, eingesetzt werden, um bioaktive Substanzen zu identifizieren. Verbindungen mit pharmakologischer Aktivität sind in der Lage, die Aktivität des zellulären Proliferationsproteins zu verstärken oder zu stärken. Die Verbindungen können derart in weiteren Assays eingesetzt werden, dass sie dann die Aktivität bestätigen, wenn die notwendigen oder optimalen Bedingungen eine Variation der identifizieren Moleüle beinhaltet. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Substanzen als Therapeutika eingesetzt, wie unten diskutiert.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Methoden zur Verfügung gestellt, die die zelluläre Proliferation in Zellen oder in Organismen modulieren. In einer Ausführungsform bestehen diese Methoden aus der Verabreichung eines antizellulären Proliferations-Antikörpers, wie weiter unten diskutiert, an die Zelle, der die biologische Aktivität eines endogenen zellulären Proliferationsproteins reduziert oder eliminiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Nukleinsäure verabreicht, die den besagten Antikörper kodiert. Substanzen, die identifiziert wurden, die zelluläre Proliferation zu modulieren, können ebenfalls eingesetzt werden. Alternativ bestehen die Methoden aus der Verabreichung einer Kompo sition, die eine zelluläre Proliferationssequenz enthält, an eine Zelle oder einen Organismus.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird, wenn zum Beispiel die zelluläre Proliferationssequenz bei der zellulären Proliferation herunter reguliert wird, die Aktivität des zellulären Proliferationsgens durch die Erhöhung der Menge der zellulären Proliferation in der Zelle erhöht, zum Beispiel durch die Überexprimierung der endogenen zellulären Proliferation oder durch die Verabreichung eines Gens, das die zelluläre Proliferationssequenz kodiert, wozu zum Beispiel bekannte gentherapeutische Techniken eingesetzt werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform beinhalten die gentherapeutischen Techniken zum Beispiel die Inkorporation des exogenen Gens durch die Nutzung der Enhanced Homologous Recombination (EHR), wie zum Beispiel beschrieben in PCT/US93/03868, hiermit durch Referenz in ihrer Gänze hier eingeführt. Alternativ wird zum Beispiel wenn die zelluläre Proliferationssequenz bei der zellulären Proliferation hoch reguliert ist, die Aktivität des endogenen zellulären Proliferationsgens vermindert, zum Beispiel durch die Verabreichung einer zellulären Proliferations-Antisense-Nukleinsäure. Bevorzugt wird, wie unten diskutiert, die zelluläre Proliferation ganz verhindert.
So wird in einer Ausführungsform eine Methode zur Verfügung gestellt, die die Zellteilung verhindert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Methode zur Verfügung gestellt, die das Tumorwachstum verhindert. In einer weiteren Ausführungsform werden Methoden zur Verfügung gestellt, mit denen Zellen oder Individuen mit Krebserkrankung behandelt werden können. Die Methode besteht in der Verabreichung eines zellulären Proliferationsinhibitors.
In einer Ausführungsform ist ein zellulärer Proliferationsinhibitor ein Antikörper wie oben diskutier und weiterhin unten näher beschrieben. In einer anderen Ausführungsform ist der zelluläre Proliferationsinhibitor ein Antisense Molekül wie oben diskutiert. Antisense Moleküle wie hier verwendet beinhalten Antisense oder Sense Oligonukleotide, die aus einer einzelsträngigen Nukleinsäuresequenz (entweder RNA oder DNA) bestehen und in der Lage sind, an mRNA (Sense) oder DNA (Antisense) Zielsequenzen zu binden, die zelluläre Proliferationsmoleküle kodieren. Ein bevorzugtes Antisense Molekül ist eines für KSP oder für einen Liganden oder einen Aktivator davon. Antisense oder Sense Oligonukleotide mit Bezug auf die vorliegende Erfindung bestehen aus einem Fragment, welches im allgemeinen mindestens etwa 14 Nukleotide, bevorzugt zwischen etwa 14 und 30 Nukleotide groß ist. Die Möglichkeit, ein Antisense oder ein Sense Oligonukleotid basierend auf einer cDNA Sequenz zu erhalten, welche ein gegebenes Protein kodiert, ist zum Beispiel beschrieben in Stein und Cohen (Cancer Res. 48: 2659, 1988) und van der Krol et al. (Bio Techniques 6: 958, 1988).
Antisense Moleküle können in eine Zelle, die die Ziel-Nukleotidsequenz enthält, durch Bildung eines Konjugats mit einem Liganden bindenden Molekül eingebracht werden, wie es in WO 91/04753 beschrieben ist. Passende Ligand bindende Moleküle beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf, Zelloberflächen Rezeptoren, Wachstums Faktoren, andere Zytokine, oder andere Liganden, die an Zelloberflächen Rezeptoren binden. Bevorzugt stört die Konjugation des Ligand bindenden Moleküls die Fähigkeit des Ligand bindenden Moleküls, an sein korrespondierendes Molekül oder den Rezeptor zu binden, nicht substantiell, oder blockiert nicht den Eintritt des Sense oder Antisense Oligonukleotids oder seiner konjugierten Version in die Zelle.
Alternativ kann ein Sense oder ein Antisense Oligonukleotid in eine Zelle, die die Ziel Nukleinsäuresequenz enthält, durch die Bildung eines Oligonukleotid-Lipid Komplexes eingeführt werden, wie es in WO 90/10448 beschrieben ist. Es ist bekannt, dass Antisense Moleküle oder Knockout und Knockin Modelle zusätzlich zu den Behandlungsmethoden in Screening Assays Verwendung finden können, wie weiter oben diskutiert. Zudem können Knockout Modelle auch solche beinhalten, die die Expression anstelle des Genoms ausschalten, wie zum Beispiel bei der Verwendung von Ribozymen. In einem Fall sind die Ribozyme ein bevorzugter KSP Inhibitor.
Wie oben diskutiert sind die Methoden und Kompositionen hierin nicht auf Krebs limitiert. Krankheitszustände, die mit den Methoden und Kompositionen, die hier bereit gestellt werden, behandelt werden können, beinhalten, aber sind nicht begrenzt auf, Krebs (unten weiter diskutiert), Restenose, Autoimmunkrankheiten, Arthritis, Abstoßung eines Transplantats, entzündliche Darmkrankheiten, durch medizinische Behandlungen induzierte Proliferation, einschließlich, aber nicht beschränkt auf chirurgische Eingriffe, Angioplastie und ähnliche Behandlungen. Es ist bekannt, dass sich in einigen Fällen die Zellen nicht in einem Hyper- oder Hypoproliferationszustand (einem abnormen Zustand) befinden und dennoch einer Behandlung bedürfen. Zum Beispiel können die Zellen während der Wundheilung „normal" proliferieren, aber eine Beschleunigung der Proliferation kann erwünscht sein. Ähnlich und wie weiter oben diskutiert können Zellen im agrikulturellen Bereich in einem „normalen" Zustand sein, aber die Modulation der Proliferation kann erwünscht sein, um die Ernte durch die direkte Verstärkung des Fruchtwachstums zu erhöhen, oder aber durch Inhibierung des Wachstums von einer Pflanze oder von einem Organis mus, der die Ernte negativ beeinflusst. Daher beinhaltet in einer Ausführungsform die vorliegende Erfindung die Anwendung auf Zellen oder Individuen, die von irgendeiner dieser Störungen oder Zustände geplagt werden oder die von einer solchen Plage bedroht sind.
Die Kompositionen und Methoden, die hier bereit gestellt werden, werden insbesondere für die Behandlung von Krebs als nützlich erachtet, beinhaltend solide Tumoren wie zum Beispiel Hauttumore, Brusttumore, Hirntumore, Gebärmutterhalskrebs, Hodenkrebs. Insbesondere umfassen Krebsarten, die mit den Kompositionen und Methoden von dieser Erfindung behandelt werden können, ohne Beschränkung der Allgemeinheit: das Herz betreffend: Sarkom (Angiosarkom, Firbrosarkom, Rhabdomyosarkom, Liposarkom), Myxom, Rhabdomyom, Fibrom, Lipom und Teratom; die Lunge betreffend: Bronchialkarzinom (schuppenartige Zelle, undifferenzierte kleine Zelle, undifferenzierte große Zelle, Adenokarzinom), Alveolar- (Bronchiolar-) Krebs, Bronchialadenom, Sarkom, Lymphom, chondromatisches Hamartom, Mesotheliom; den Magen-Darm betreffend: Speiseröhre (schuppenartiges Zellkarzinom, Adenokarzinom, Leiomyosarkom, Lymphom), Magen (Karzinom, Lymphom, Leiomyosarkom), Bauchspeicheldrüse (ductales Adenokarzinom, Insulinom, Glukagonom, Gastrinom, karzinoide Tumore, VIPom), Dünndarm (Adenokarzinom, Lymphom, karzinoide Tumore, Karposi's Sarkom, Leiomyom, Hemangiom, Lipom, Neurofibrom, Fibrom), Dickdarm (Adenokarzinom, röhrenförmiges Adenom, zottiges Adenom, Hamartom, Leiomyom); den Urigenitaltrakt betreffend: Niere (Adenokarzinom, Wilm's Tumor [Nephroblastom], Lymphom, Leukämie), Harnblase und Harnröhre (schuppenartiges Zellkarzinom, durchquerendes Zellkarzinom, Adenokarzinom), Prostata (Adenokarzinom, Sarkom), Hoden (Seminom, Teratom, embryonales Karzinom, Teratokarzinom, Choriokar zinom, Sarkom, interstitielles Zellkarzinom, Fibrom, Fibroadenom, adenomartige Tumore, Lipom), die Leber betreffend: Hepatom (hepatozelluläres Karzinom), Cholangiokarzinom, Hepablastom, Angiosarkom, hepatozelluläres Adenom, Hemangiom; die Knochen betreffend: osteogenes Sarkom (Osteosarkom), Fibrosarkom, bösartiges faserförmiges Histiocytom, Chondrosarkom, Ewing's Sarkom, bösartiges Lymphom (retikuläres Zellsarkom), multiples Myelom, bösartiges großes Zelltumor-Chordom, Osteochronfrom (osteokartilaginäre Exostose), gutartiges Chondrom, Chondroblastom, Chondromyxofibrom, osteoides Osteom und große Zelltumore; das Nervensystem betreffend: Schädel (Osteom, Hemangiom, Granulom, Xanthom, Osteitis derformans), Hirnhaut (Meningiom, Meningiosakom, Gliomatosis), Gehirn (Astrocytom, Medulioblastom, Gliom, Ependymom, Germinom [Pinealom], multiform Glioblastom, Oligodendrogliom, Schwannom, Retinoblastom, kongenitale Tumore), Rückenmark (Neurofibrom, Meningiom, Gliom, Sarkom); das Gynäkologische betreffend: Gebärmutter (Gebärmutterhaltkarzinom, Pre-Tumor Gebärmutterhals Fehlbildung), Eierstöcke (Eierstockkarzinom [seröses Cystadenokarzinom, schleimiges Cystadenokarzinom, nicht-klassifiziertes Karzinom], Granulosa-thecal Zelltumore, Sertoli-Leydig Zelltumore, Dysgerminom, bösartiges Teratom), Vulva (schuppenartiges Zellkarzinom, intraepitheles Karzinom, Adenokarzinom, Fibrosarkom, Melanom), Vagina (klares Zellkarzinom, schuppenartiges Zellkarzinom, traubenförmiges Sarkom [embryonales Rhabdomyosarkom]), Eileiter (Karzinom); das Hämatologische betreffend: Blut (myeloische Leukämie [akute und chronische], akute lymphoblastische Leukämie, chronische lymphocytische Leukämie, myeloproliferative Krankheiten, multiples Myelom, myelodysplatisches Syndrom), Hodgkin's Krankheit, Non-Hodgkin's Lymphom [bösartiges Lymphom]; die Haut betreffend: bösartiges Melanom, basales Zellkarzinom, schuppenartiges Zellkarzinom, Karposi's Sarkom, Leberfleck dysplastische Nävi, Lipom, Angiom, Dermatofibrom, Keloide, Psoriasis; und die Nebennieren betreffend: Neuroblastom. Der Krebs kann als solider Tumor oder metastatisch in Erscheinung treten. Daher beinhaltet der Begriff „Krebszelle" wie hier verwendet eine Zelle, die von irgendeiner der oben identifizierten Konditionen betroffen ist.
In einem anderen Aspekt hierin werden diagnostische Assays hier zur Verfügung gestellt. In einer Ausführungsform werden die zellulären Proliferationssequenzen in den diagnostischen Assays verwendet. Dieses kann auf einem individuellen Gen- oder dem korrespondierenden Polypeptid-Niveau durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Expressionsprofile verwendet, bevorzugt in Verbindung mit Hochdurchsatz Screening Techniken, um eine Übersicht über die Gene des Expressionsprofils und/oder der korrespondierenden Polypeptide zu erhalten. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine in situ Hybridisierung von markierten zellulären Proliferationsnukleinsäure-Sonden an Gewebe-Assays durchgeführt. Zum Beispiel werden Arrays von Gewebeproben, beinhaltend zelluläres Proliferationsgewebe in verschiedenen Zuständen und/oder zu verschiedenen Zeitpunkten und/oder normales Gewebe, hergestellt. In situ Hybridisierung, wie es im Stand der Technik bekannt ist, kann dann durchgeführt werden. Es ist bekannt, dass konventionelle Antikörper- und Proteinlokalisierungsmethoden auch hier in diagnostischen Assays verwendet werden können.
Es ist bekannt, dass ein Fachmann eine Diagnose und auch eine Prognose durchführen kann, wenn er den Fingerprint der individuellen Probe mit dem eines Standards vergleicht. Es ist zudem bekannt, dass die Gene, die für die Diagnose entscheidend sind, von denen unterschiedlich sein können, die für die Prognose entscheidend sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die zellulären Proliferationssequenzen in prognostischen Assays verwendet. Wie oben können Genexpressionsprofile erzeugt werden, die mit der zellulären Proliferations-Schwere (severity) im Sinne einer Langzeitprognose korrelieren. Wiederum kann dies entweder auf dem Protein- oder dem Gen-Niveau durchgeführt werden, wobei die Verwendung von Genen bevorzugt ist. In beiden, dem diagnostischen und dem prognostischen Assay, können die zellulären Proliferations-Sonden an Biochips angebracht werden, wie unten für die Detektion und Quantifizierung von zellulären Proliferationssequenzen in Gewebe oder Patient beschrieben.
Dementsprechend können Fehlordnungen, die auf Mutantionen oder Variationen von zellulären Proliferationsgenen basieren, ebenfalls bestimmt werden. In einer Ausführungsform liefert die Erfindung Methoden zur Identifizierung von Zellen, die Variationen von zellulären Proliferationsgenen enthalten, die die Bestimmung der gesamten Sequenz oder einer Teilsequenz von mindestens einem endogenen zellulären Proliferationsgen in einer Zelle umfassen. Wie dem Fachmann bekannt kann dies durch jedwede Anzahl von Sequenzierungstechniken durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform liefert die Erfindung Methoden zur Identifikation des zellulären Proliferations-Genotyps eines Individuums, die die Bestimmung der gesamten Sequenz oder einer Teilsequenz von mindestens einem endogenen zellulären Proliferationsgen des Individuums umfassen. Dies wird üblicherweise in mindestens einem Gewebe des Individuums durchgeführt und kann die Evaluierung einer Anzahl von Geweben oder unterschiedlicher Proben des gleichen Gewebes beinhalten. Die Methode kann den Vergleich der Sequenz des sequenzierten zellulären Proliferationsgens mit einem bekannten zellulären Proliferationsgen, d.h. einem Wild-Typ Gen, beinhalten.
Die Sequenz des gesamten zellulären Proliferationsgens oder eines Teils davon kann dann mit der Sequenz eines bekannten zellulären Proliferationgens verglichen werden, um zu bestimmen, ob irgendwelche Unterschiede bestehen. Dies kann getan werden durch die Benutzung jedweder Anzahl von bekannten Homologie-Programmen, so wie Bestfit usw.. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Gegenwart eines Unterschieds in der Sequenz zwischen dem zellulären Proliferationgen des Patienten und dem bekannten zellulären Proliferationgen ein Indikator für einen Krankheitszustand oder für die Anfälligkeit für einen Krankheitszustand, wie hier beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die zellulären Proliferationgene als Sonden genutzt, um die Zahl der Kopien des zellulären Proliferationsgens im Genom zu bestimmen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden zellulären Proliferationgene als Sonden genutzt, um die Lokalisation der zellulären Proliferationsgene auf dem Chromosom zu bestimmen. Informationen wie die Lokalisation der zellulären Proliferationsgene auf dem Chromosom finden Anwendungen in der Bereitstellung einer Diagnose oder einer Prognose, insbesondere, wenn chromosomale Abnormitäten wie Translokationen und ähnliches mehr in den zellulären Proliferationsgenorten identifiziert werden.
Sobald eine Bestimmung bezüglich des Proliferationszustands einer Zelle durchgeführt worden ist können, wenn gewünscht, die hier beschriebenen Kompositionen oder Substanzen verabreicht werden. Die Verbindungen mit der gewünschten pharmako logischen Aktivität können in einem physiologisch akzeptablen Träger (auch pharmazeutisch akzeptabler Träger genannt) einem Wirt verabreicht werden. In Abhängigkeit von der Art der Einführung können die Verbindungen in einer Vielzahl von Arten formuliert werden, wie unten diskutiert. Die Konzentration der therapeutisch aktiven Verbindung in der Formulierung kann von etwa 0.1–100% variieren. Die Substanzen können allein oder in Kombination mit anderen Behandlungen, z.B. Strahlung, verabreicht werden.
Dementsprechend werden in einer bevorzugten Ausführungsform zellulären Proliferationsproteine und Modulatoren als therapeutische Substanzen verabreicht. Ähnlich können zelluläre Proliferationsgene (entweder die vollständigen Sequenzen, Partialsequenzen oder regulatorische Sequenzen der zellulären Proliferations-kodierenden Abschnitte) in Gentherapie-Anwendungen verabreicht werden, wie es im Stand der Technik bekannt ist. Diese zellulären Proliferationsgene können Antisense-Anwendungen beinhalten, entweder als Gentherapie (d.h. für die Inkorporation in das Genom) oder als Antisense-Kompositionen, wie es dem Fachmann bekannt ist.
In der bevorzugten Ausführungsform sind die pharmazeutischen Kompositionen in wasserlöslicher Form, wie zum Beispiel als pharmazeutisch akzeptable Salze vorliegend, was bedeuten soll, dass Säure- und Basenzusatz-Salze eingeschlossen sind. „Pharmazeutisch akzeptables Säurezusatz-Salz" bezieht sich auf solche Salze, die die biologische Effektivität der freien Basen erhalten und die nicht biologisch oder anderweitig unerwünscht sind, gebildet mit anorganischen Säuren wie zum Beispiel Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure und ähnliche, und organische Säuren wie zum Beispiel Essigsäure, Propionsäure, Glykol säure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Maleinsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Salicylsäure und ähnliches mehr. „Pharmazeutisch akzeptable Basenzusatz-Salze" beinhalten solche, die von anorganischen Basen wie zum Beispiel Natrium-, Kalium-, Lithium-, Ammonium-, Calcium-, Magnesium-, Eisen-, Zink-, Kupfer-, Mangan-, Aluminiumsalzen und ähnlichem abgeleitet sind. Besonders bevorzugt sind die Ammonium-, Kalium-, Natrium-, Calcium- und Magnesiumsalze. Salze abgeleitet von pharmaceutisch akzeptablen organischen, nicht-toxischen Basen beinhalten Salze von primären, sekundären und tertiären Aminen, substituierten Aminen beinhaltend natürlich vorkommende substituierte Amine, Zyklische Amine und basische Ionenaustauscherharze, wie zum Beispiel Isopropylamin, Trimethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Tripropylamin und Ethanolamin.
Die pharmazeutischen Kompositionen können in verschiedener Form hergestellt werden wie zum Beispiel Körnchen, Tabletten, Pillen, Zäpfchen, Kapseln, Suspensionen, Salben, Lotionen und ähnliches mehr. Pharmazeutisch reine organische oder anorganische Träger und/oder Verdünner, die für die orale oder topische Anwendung geeignet sind, können benutzt werden, um Kompositionen herzustellen, die die therapeutisch aktiven Verbindungen enthalten. Verdünner, die im Stand der Technik bekannt sind, beinhalten wässriges Medium sowie pflanzliche und tierische Öle und Fette. Stabilisatoren, Befeuchter, Emulgatoren, Salze zur Variation des osmotischen Drucks oder Puffer zur Sicherstellung eines adäquaten pH-Werts und Hautdurchdringungsverstärker können als Hilfssubstanzen eingesetzt werden. Die pharmazeutischen Kompositionen können zudem ein oder mehrere der folgenden Stoffe enthalten: Trägerproteine wie zum Beispiel Serumalbumin; Puffer; Füllstoffe wie zum Beispiel mikrokristalline Zellulose, Lactose, Maisstärke oder andere Stärke; Bindemittel; Süßstoffe und andere Geschmacksstoffe; Farbstoffe; Polyethylenglykol. Additive sind im Stand der Technik wohlbekannt und werden in einer Vielzahl von Formulierungen eingesetzt.
Die Verabreichung der zellulären Proliferationsproteine und Modulatoren der vorliegenden Erfindung kann in einer Vielzahl von Arten erfolgen wie oben diskutiert, beinhaltend, aber nicht begrenzt auf orale, subkutane, intravenöse, intranasale, transdermale, intraperitonale, intramuskuläre, intrapulmonäre, vaginale, rektale oder intraokulare Verabreichung. In einigen Fällen, zum Beispiel bei der Behandlung von Wunden und Entzündungen, können die zellulären Proliferationsproteine und Modulatoren direkt als Lösung oder Spray angewandt werden.
In einer Ausführungsform wird eine therapeutisch effektive Dosis eines zellulären Proliferationsproteins oder eines Modulators davon einem Patienten verabreicht. Mit „therapeutisch effektive Dosis" ist hier eine Dosis gemeint, die den Effekt erzielt, für den sie verabreicht wurde. Die genaue Dosis wird von der Absicht der Behandlung abhängen, und wird von einem Fachmann mittels bekannter Techniken ermittelt werden. Wie im Stand der Technik bekannt ist, ist eine Anpassung an den zellulären Proliferationsabbau, systemische versus lokale Bereitstellung, Geschwindigkeit der neuen Protease-Synthese, sowie an das Alter, Körpergewicht, Gesundheitszustand, Geschlecht, Ernährung, Verabreichungszeit, Arzneiwechselwirkung und die Schwere der Krankheit notwendig und wird für den Fachmann mittels Routineexperimenten ermittelbar sein.
Ein „Patient" beinhaltet für den Zweck der vorliegenden Erfindung beides, Menschen und andere Tiere, insbesondere Säugetiere, und Organismen. Daher sind die Methoden anwendbar für beides, Humantherapie und Veterinärtherapie. In der bevorzugten Ausführungsform ist der Patient ein Säugetier, und in der meist bevorzugten Ausführungsform ist der Patient menschlich.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden zelluläre Proliferationsgene als DNA-Impfstoffe verabreicht, entweder einzelne Gene oder Kombinationen von zellulären Proliferationsgenen. Reine DNA-Impfstoffe sind allgemein im Stand der Technik bekannt. Brower, Nature Biotechnology, 16: 1304–1305 (1998).
In einer Ausführungsform werden zelluläre Proliferationsgene der vorliegenden Erfindung als DNA-Impfstoffe benutzt. Methoden für die Benutzung von Genen als DNA-Impfstoffe sind dem Fachmann wohlbekannt und beinhalten die Stellung eines zellulären Proliferationsgens oder eines Abschnitts eines zellulären Proliferationsgens unter die Kontrolle eines Promoters für die Expression in einem zellulären Proliferationspatienten. Die zellulären Proliferationsgene, die für DNA-Impfstoffe benutzt werden, können vollständige zelluläre Proliferationsproteine kodieren, kodieren aber bevorzugt Teile der zellulären Proliferationsproteine, inklusive Peptide, die vom zellulären Proliferationsprotein abgeleitet sind. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Patient mit einem DNA-Impfstoff immunisiert, der eine Vielzahl von Nukleotid-Sequenzen enthält, die von einem zellulären Proliferationsgen abgeleitet sind. In ähnlicher Weise ist es möglich, einen Patienten mit einer Vielzahl von zellulären Proliferationsgenen oder Teilen davon wie hier definiert zu immunisieren. Ohne an die Theorie gebunden zu sein werden die Expression des Polypeptids, welches durch den DNA-Impfstoff kodiert ist, sowie zytotoxische T-Zellen, Helfer-T-Zellen und Antikörper induziert, die die Zellen erkennen und zerstören oder eliminieren, die zelluläre Proliferationsproteine exprimieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet der DNA-Impfstoff ein Gen, dass ein Adjuvans des DNA-Impfstoffes kodiert. Solche Adjuvantien schließen Zytokine mit ein, die die Immunantwort auf das zelluläre Proliferationspolypeptid, welches durch den DNA-Impfstoff kodiert ist, verstärken. Zusätzliche oder alternative Adjuvantien sind dem Fachmann bekannt und finden Anwendung in dieser Erfindung.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden zelluläre Proliferationsgene benutzt, um Tiermodelle der zellulären Proliferation zu erzeugen. Dem Fachmann ist bekannt, dass, wenn das identifizierte zelluläre Proliferationsgen im zellulären Proliferationsgewebe unterdrückt oder vermindert ist, auch die Gentherapie-Technologie, bei der Antisense-RNA zum zellulären Proliferationsgen geführt wird, die Expression des Gens unterdrücken oder vermindern wird. Ein so erzeugtes Tier dient als Tiermodel der zellulären Proliferation und findet Anwendung im Screening bioaktiver einen Kandidaten darstellenden Wirkstoffe. Ähnlich wird die Gen-Knockout-Technologie, zum Beispiel als Ergebnis homologer Rekombination mit einem passenden Gen-targeting Vektor, zur Abwesenheit des zellulären Proliferationsproteins führen. Wenn gewünscht kann eine gewebespezifische Expression oder ein Knockout des zellulären Proliferationsproteins notwendig sein.
Es ist auch möglich, dass das zelluläre Proliferationsprotein bei der zellulären Proliferation überexprimiert wird. Dazu können transgene Tiere erzeugt werden, die das zellulären Proliferationsprotein überexprimieren. In Abhängigkeit des gewünschten Expressionslevels können Promoter unterschiedlicher Stärke zur Expression des Transgens eingesetzt werden. Auch kann die Zahl der Kopien des integrierten Transgens ermittelt und verglichen werden, um den Expressionslevel des Transgens zu ermitteln. Tiere, die durch solche Methoden erzeugt wurden, finden Anwendung als Tiermodelle für die zelluläre Proliferation und sind zudem nützlich beim Screening bioaktiver Moleküle für die Behandlung der zellulären Proliferation.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden hier Biochips zur Verfügung gestellt. Nukleinsäure-Sonden für zelluläre Proliferations-Nukleinsäuren (beides, die Nukleinsäuresequenzen, die in den Abbildungen dargelegt sind, und/oder die Komplementärstränge hierzu) sind hergestellt worden. Die Nukleinsäure-Sonden, die am Biochip befestigt sind, sind so entworfen, dass sie substantiell komplementär zu den zellulären Proliferationsnukleinsäuren, d.h. zu den Zielmolekülen (entweder den Zielsequenzen einer Probe oder anderen Sonden-Sequenzen, zum Beispiel in Sandwich-Assays) sind, so dass eine Hybridisierung der Zielsequenzen mit den Sonden der vorliegenden Erfindung stattfindet. Wie unten erläutert muss diese Komplementarität nicht perfekt sein; es kann jede Zahl von Basenpaar-Fehlpaarungen zugegen sein, die die Hybridisierung zwischen den Zielsequenzen und den Einzelstrangnukleinsäuren der vorliegenden Erfindung stören. Wie auch immer, wenn die Zahl der Mutationen so groß ist, dass auch unter den am wenigsten stringenten Hybridisierungsbedingungen keine Hybridisierung mehr stattfinden kann, dann ist die Sequenz nicht eine komplementäre Zielsequenz. Daher ist mit „substantiell komplementär" hier gemeint, dass die Sonden hinreichend komplementär mit der Zielsequenz sind, um unter normalen Reaktionsbedingungen, insbesondere hoch stringenten Bedingungen wie hier erläutert, zu hybridisieren.
Eine Nukleinsäure-Sonde ist allgemein einzelsträngig, kann jedoch auch partiell einzel- und partiell doppelsträngig sein. Die Strängigkeit einer Sonde wird durch die Struktur, Zusammensetzung und die Eigenschaften der Zielsequenz vorgegeben. Im allgemeinen sind die Nukleinsäure-Sonden von etwa 8 bis etwa 100 Basen lang, wobei eine Länge von etwa 10 bis etwa 80 Basen bevorzugt ist, und eine Länge von etwa 30 bis etwa 50 Basen besonders bevorzugt ist. Dies heißt, dass normalerweise keine ganzen Gene benutzt werden. In einigen Ausführungsformen können auch viel längere Nukleinsäuren mit bis zu Hunderten von Basen benutzt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird mehr als eine Sonde pro Sequenz eingesetzt, wobei entweder überlappende Sonden oder Sonden zu verschiedenen Abschnitten des Zielmoleküls benutzt werden. Dies heißt, dass zwei, drei oder vier Sonden, bevorzugt drei Sonden, benutzt werden um eine Redundanz für ein bestimmtes Zielmolekül einzubauen. Die Sonden können überlappend sein (d.h. sie haben gemeinsame Sequenzabschnitte), oder separat.
Dem Fachmann ist bekannt, dass Nukleinsäuren auf eine große Vielzahl von Arten an einen festen Träger angebracht oder immobilisiert werden können. Mit „immobilisiert" und grammatischen Äquivalenten davon ist hier gemeint, dass die Assoziation oder Bindung zwischen der Nukleinsäuren-Sonde und dem festen Träger hinreichend ist, um unter den unten ausgeführten Bedingungen des Anbindens, Waschens, Analysierens und Abtrennens stabil zu sein. Die Anbindung kann kovalent oder nicht-kovalent erfolgen. Mit „nicht-kovalent" und grammatischen Äquivalenten davon ist hier eine oder mehrere der elektrostatischen, hydrophilen und hydrophoben Wechselwirkung gemeint. Eingeschlossen in nicht-kovalenter Bindung ist die kovalente Anbindung eines Moleküls, wie zum Beispiel Steptavidin, an den Träger und die nicht-kovalente Bindung der biotinylierten Sonde an das Streptavidin. Mit „kovalente Bindung" und grammatikalischen Äquivalenten hiervon ist hier gemeint, dass die beiden Einheiten, der feste Träger und die Sonde, mit mindestens einer Bindung, die eine sigma-Bindung, eine pi-Bindung oder eine koordinative Bindung sein kann, aneinander befestigt sind. Kovalente Bindungen können direkt zwischen der Sonde und dem festen Träger gebildet werden, oder sie können durch einen Crosslinker gebildet werden, oder durch den Einbau einer spezifischen reaktive Gruppe entweder am festen Träger oder an der Sonde oder an beiden Molekülen. An einer Immobilisierung kann auch eine Kombination aus kovalenten und nicht-kovalenten Wechselwirkungen beteiligt sein.
Im allgemeinen werden die Sonden in einer Vielzahl von Arten am Biochip befestigt, wie dem Fachmann bekannt ist. Wie hier beschrieben können die Nukleinsäuren entweder zuerst synthetisiert und dann nachfolgend am Biochip befestigt werden, oder sie können direkt am Biochip synthetisiert werden.
Der Biochip besteht aus einem passenden festen Substrat. Mit „Substrat" oder „fester Träger" oder anderen grammatikalischen Äquivalenten hiervon ist jedes Material gemeint, welches so modifiziert werden kann, dass es diskrete, individuelle Stellen enthält, die für die Befestigung oder die Assoziation der Nukleinsäure-Sonden geeignet sind, und welches auch mindestens eine Detektionsmethode anschlägt. Wie dem Fachmann bekannt ist, ist die Zahl möglicher Substrate sehr groß und umfasst, ist aber nicht begrenzt auf, Glas, modifiziertes oder funktio nalisiertes Glas, Kunststoff (beinhaltend Acryl, Polystyrol und Copolymere von Styrol und anderen Materialien, Polypropylen, Polyethylen, Polybutylen, Polyurethane, Teflon, usw.), Polysaccharide, Nylon oder Nitrozellulose, Harze, Siliziumdioxid oder Siliziumdioxid-basierte Materialien, beinhaltend Silizium und modifiziertes Silizium, Kohlenstoff, Metalle, anorganische Gläser, Kunststoffe usw.. Im allgemeinen erlauben die Substrate eine optische Detektion und fluoreszieren nicht deutlich; ein bevorzugtes Substrat ist beschrieben in einer anhängenden Anmeldung mit dem Titel Reusable Low Fluorescent Plastic Biochip, angemeldet am 15 März 1999, und durch Referenz in seiner Ganzheit hier eingefügt.
Im allgemeinen ist das Substrat flach, wenngleich dem Fachmann bekannt ist, dass auch andere Substrat-Formen benutzt werden können. Zum Beispiel können die Sonden auf der Innenseite einer Röhre angebracht sein, um bei der Durchfluß-Probenanalyse die Probevolumina zu minimieren. In ähnlicher Weise kann das Substrat flexibel sein, wie zum Beispiel ein flexibler Schaum, beinhaltend geschlossenzellige Schäume, die aus speziellen Kunststoffen hergestellt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Oberfläche des Biochips und die Sonde mit funktionellen chemischen Gruppen für die nachfolgende Anbindung derivatisiert. So wird, zum Beispiel, der Biochip mit einer funktionellen chemischen Gruppe umfassend, aber nicht begrenzt auf Aminogruppen, Carboxygruppen, Oxogruppen und Thiolgruppen, besonders bevorzugt Aminogruppen, derivatisiert. Mittels dieser funktioneller Gruppen können die Sonden über funktionelle Gruppen an den Sonden angeheftet werden. Zum Beispiel können Nukleinsäuren, die Aminogruppen enthalten, an Oberflächen angeheftet werden, die aus Aminogruppen bestehen, zum Beispiel durch die Nutzung von Linkern, wie es im Stand der Technik bekannt ist; zum Beispiel sind homo- oder hetero-bifunktionale Linker bestens bekannt (siehe 1994 Pierce Chemical Company Catalog, Technischer Abschnitt über Crosslinker, Seiten 155–200, durch Referenz hier eingefügt). Zusätzlich können in einigen Fällen weitere Linker wie zum Beispiel Alkylgruppen (beinhaltend substituierte und Heteroalkylgruppen) verwendet werden.
In dieser Ausführungsform werden die Oligonukleotide synthetisiert wie es im Stand der Technik bekannt ist, und dann an die Oberfläche des festen Trägers angeheftet. Wie dem Fachmann bekannt ist kann entweder der 5'- oder der 3'-Terminus an den festen Träger angebracht werden, oder die Verknüpfung erfolgt über ein internes Nukleosid.
In einer zusätzlichen Ausführungsform kann die Immobilisierung an den festen Träger sehr stark, aber nicht-kovalent sein. Zum Beispiel können biotinylierte Oligonukleotide hergestellt werden, die an eine kovalent mit Streptavidin belegte Oberfläche binden, was in einer Verknüpfung resultiert.
Alternativ können die Oligonukleotide an der Oberfläche synthetisiert werden, wie es im Stand der Technik bekannt ist. Zum Beispiel werden Photoaktivierungstechniken benutzt, die Photopolymerisationsverbindungen und Techniken verwenden. In einer bevorzugten Ausführungsform können die Nukleinsäuren in situ synthetisiert werden unter Verwendung wohlbekannter photolithographischer Techniken, wie zum Beispiel solche beschrieben in WO 95/25116; WO 95/35505; U.S. Patent Nrn. 5,700,637 und 5,445,934; und Referenzen hierin zitiert, die alle ausdrücklich durch Referenz hier eingeführt werden; diese Anheftungsmethoden bilden die Basis der Affimetrix GeneChip^TM Technologie.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden antizelluläre Proliferations-Antikörper bereitgestellt. In einem Fall wird das zelluläre Proliferationsprotein verwendet, um Antikörper zu erzeugen, zum Beispiel für die Immuntherapie. Wenn hierzu ein Fragment des zellulären Proliferationsproteins genutzt wird, sollte das zelluläre Proliferationsprotein mindestens ein Epitop oder einen ausschlaggebenden Faktor mit dem vollständigen Protein teilen. Mit „Epitop" oder „ausschlaggebender Faktor" ist hier ein Abschnitt eines Proteins gemeint, dass einen Antikörper oder T-Zellenrezeptor im Kontext von MHC erzeugt und/oder bindet. Daher werden in den meisten Fällen die Antikörper zu einem kleineren zellulären Proliferationsprotein in der Lage sein, das vollständige Protein zu binden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Epitop einzigartig; dies bedeutet, dass Antikörper gegen ein einzigartiges Epitop wenig oder gar keine Kreuzreaktivität aufweisen.
In einer Ausführungsform beinhaltet der Begriff „Antikörper" Antikörperfragmente wie sie im Stand der Technik bekannt sind, beinhaltend Fab, Fab₂, Einzelstrang-Antikörper (Fv zum Beispiel), Chimären-Antikörper usw., die entweder durch Modifikation ganzer Antikörper erzeugt oder mittels rekombinanter DNA-Technologien de novo dargestellt werden.
Methoden für die Präparation polyklonaler Antikörper sind dem Fachmann bekannt. Polyklonale Antikörper können im Säugetier erzeugt werden zum Beispiel durch eine oder mehrere Injektionen einer immunisierenden Substanz und, wenn gewünscht, eines Adjuvans. Typischerweise wird die immunisierende Substanz und/oder das Adjuvans dem Säugetier durch mehrfache subkutane oder intraperitonale Injektionen injiziert. Die immunisierende Substanz kann KSP oder ein Fragment davon oder ein Fusionsprotein davon beinhalten. Es kann nützlich sein, die immunisie rende Substanz mit einem Protein zu konjugieren, von dem bekannt ist, dass es in dem zu immunisierenden Säugetier immunogene Eigenschaften besitzt. Beispiele für solche immunogenen Proteine beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf das Hämocyanin der Schlüssellochschnecke (keyhole limpet), Serumalbumin, bovines Thyroglobulin und den Trypsin-Inhibitor der Sojabohne. Beispiele für Adjuvantien die benutzt werden können beinhalten das vollständige Freundsche Adjuvans und das MPL-TDM Adjuvans (Monophosphoryl-Lipid a, synthetisches Trehalose-Dicorynomycolat). Das Immunisierungs-Protokoll kann von einem Fachmann ohne unangemessenes Experimentieren ausgewählt werden.
Alternative können die Antikörper auch monoklonale Antikörper sein. Monoklonale Antikörper können mittels Hybridom-Methoden dargestellt werden, so wie zum Beispiel diejenigen beschrieben von Kohler und Milstein, Nature, 256: 495 (1975). In einer Hybridom-Methode wird eine Maus, ein Hamster oder ein anderes passendes Wirtstier typischerweise mit einer immunisierenden Substanz immunisiert, um Lymphozyten hervorzurufen, die Antikörper produzieren oder in der Lage sind, Antikörper zu produzieren, welche spezifisch an die immunisierende Substanz binden. Alternativ werden die Lymphozyten in vitro immunisiert. Die immunisierende Substanz beinhaltet typischerweise das KSP Polypeptid, oder ein Fragment davon, oder ein Fusionsprotein davon. Im allgemeinen werden entweder periphere Blutlymphozyten („PBLs") genutzt, wenn Zellen humanen Ursprungs gewünscht sind, oder Spleenzellen oder Lymphknoten-Zellen werden verwendet, wenn nicht-humane Säugetierquellen gewünscht sind. Die Lymphozyten werden dann mithilfe eines passenden Fusionsmittels, wie zum Beispiel Polyethylenglykol, mit einer immortalisierten Zelllinie fusioniert unter Bildung einer Hybridom- Zelle [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) S. 59–103]. Immortalisierte Zelllinien sind üblicherweise transformierte Säugetierzellen, insbesondere Myelom-Zellen von Nagetier-, Rind- oder humanem Ursprung. Üblicherweise werden Myelomzelllinien von Ratten oder Mäusen verwendet. Die Hybridom-Zellen können in einem passenden Kulturmedium kultiviert werden, welches vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder das Überleben der nichtfusionierten, immortalisierten Zellen verhindert. Wenn zum Beispiel den Elternzellen das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phophoribosyl-Transferase (HGPRT oder HPRT) fehlt, beinhaltet das Kulturmedium für die Hybridomzellen typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin („HAT medium"), da diese Substanzen das Wachstum von HGPRT-defizienten Zellen verhindern.
In einer Ausführungsform sind die Antikörper bispezifische Antikörper. Bispezifische Antikörper sind monoklonale, bevorzugt humane oder humanisierte Antikörper, die Bindungsspezifitäten für mindenstens zwei verschiedene Antigene aufweisen. Im vorliegenden Fall ist eine der Bindungsspezifitäten für das KSP oder ein Fragment davon, die andere Bindungsspezifität ist für jedwedes andere Antigen, und bevorzugt für ein Zelloberflächen-Protein oder einen Zelloberflächen-Rezeptor oder eine Rezeptor-Untereinheit, bevorzugt mit Tumor-Spezifität.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Antikörper zur zellulären Proliferation fähig zur Reduktion oder Eliminierung der biologischen Funktion der zellulären Proliferation, wie unten beschrieben. Das heißt, dass die Zugabe von anti-KSP-Antikörpern (entweder polyklonal oder bevorzugt monoklonal) zur zellulären Proliferation (oder zu Zellen, die zelluläre Proliferation beinhalten) die zelluläre Proliferationsaktivi tät reduzieren oder eliminieren kann. Im allgemeinen ist zumindest ein Rückgang der Aktivität um 25% bevorzugt, ein Rückgang der Aktivität um etwa 50% besonders bevorzugt, und ein Rückgang der Aktivität um etwa 95–100% ganz besonders bevorzugt.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Antikörper zu den zellulären Proliferationsproteinen humanisierte Antikörper. Humanisierte Formen von nicht-humanen (z.B. murinen) Antikörpern sind Chimären-Moleküle von Immunglobulinen, Immunglobulin-Ketten oder fragmente davon (wie zum Beispiel Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere Antigen-bindende Untersequenzen von Antikörpern), die eine Minimalsequenz enthalten, die von nicht-humanem Immunglobulin abstammt. Humanisierte Antikörper beinhalten humane Immunglobuline (Empfänger-Antikörper), in denen die Reste, die eine komplementäre Bestimmungsregion (complementary determining region, CDR) des Empfängers bilden, durch Reste einer CDR einer nicht-humanen Spezies wie Maus, Ratte oder Kaninchen ausgetauscht sind (Spender-Antikörper), die die gewünschte Spezifität, Affinität und Kapazität aufweisen. In einigen Fällen sind die Fv-Gerüstreste des humanen Immunoglobulins durch korrespondierende nicht-humane Reste ausgetauscht. Humanisierte Antikörper können auch Reste enthalten, die weder im Empfänger-Antikörper noch in der importierten CDR oder Gerüstsequenz gefunden werden. Im allgemeinen besteht der humanisierte Antikörper substantiell vollständig aus zumindest einer, und typischerweise zwei variablen Domänen, in denen alles oder substantiell alles der CDR-Regionen zu der eines nicht-humanen Immunglobulins korrespondiert, und alles oder substantiell alles der FR-Regionen dasjenige einer humanen Immunglobulin Konsensus-Sequenz ist. Der humanisierte Antikörper wird im Optimalfall auch mindestens einen Teil einer konstanten Immunglobulin-Region (Fc) enthalten, typischerweise die von einem humanen Immunglobulin [Jones et al., Nature, 321: 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323–329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593–596 (1992)].
Methoden für die Humanisierung nicht-humaner Antikörper sind im Stand der Technik wohlbekannt. Im allgemeinen hat ein humanisierter Antikörper ein oder mehr Aminosäurereste von einer nicht-humanen Quelle eingeführt. Diese nicht-humanen Aminosäurereste werden häufig als Import-Reste bezeichnet, und stammen typischerweise aus einer variablen Import-Domäne. Die Humanisierung kann im Wesentlichen nach der Methode von Winter und Mitarbeiter durchgeführt werden [Jones et al., Nature, 321: 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323–329 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534–1536 (1988)] durch Substitution von Nagetier CDRs oder CDR Sequenzen gegen die korrespondierenden Sequenzen eines humanen Antikörpers. Dementsprechend sind solche humanisierten Antikörper Chimären-Antikörper (U.S. Patent Nr. 4,816,567), in denen substantiell weniger als eine intakte humane variable Domäne durch die korrespondierende Sequenz einer nicht-humanen Spezies substituiert wurde. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise humane Antikörper, bei denen einige CDR-Reste und möglicherweise einige FR-Reste durch Reste analoger Stellen von Nagetierantikörpern substituiert sind.
Humane Antikörper können auch durch verschiedene Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, produziert werden, beinhaltend die Phagendisplay Bibliotheken [Hoogenboom und Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)]. Die Techniken von Cole et al. und Boerner et al. sind auch verfügbar für die Darstellung humaner monoklonaler Antikörper (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, S. 77 (1985) und Boerner et al., J. Immunol., 147 (1): 86–95 (1991)]. Ähnlich können humane Antikörper durch die Einführung humaner Immunoglobulin-Loci in transgene Tiere, dargestellt werden, z.B. in Mäusen, bei denen die endogenen Immunglobulin-Gene partiell oder vollständig deaktiviert wurden. Als immunologische Antwort wird hier eine Produktion humaner Antikörper beobachtet, die in allen Belangen der in Menschen entspricht, inklusive der Genumlagerung, Zusammenbau und Antikörper-Repertoire. Dieser Ansatz ist zum Beispiel beschrieben in U.S. Patent Nrn. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, und in den folgenden wissenschaftlichen Publikationen: Marks et al., Bio/Technology 10, 779–783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856–859 (1994); Morrison, Nature 368 812–13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845–51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg und Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65–93 (1995).
Mit Immuntherapie ist die Behandlung der zellulären Proliferation mit einem Antikörper, der gegen zelluläre Proliferationsproteine hergestellt wurde, gemeint. Wie hierin benutzt kann Immuntherapie passiv oder aktiv sein. Passive Immuntherapie ist definiert hier als der passive Transfer eines Antikörpers zu einem Empfänger (Patienten). Aktive Immunisierung ist die Induktion einer Antikörper- und/oder T-Zellenantwort in einem Empfänger (Patienten). Die Induktion einer Immunantwort ist das Ergebnis der Bereitstellung eines Antigens für den Empfänger, so dass sich Antikörper bilden konnten. Wie der Fachmann versteht kann das Antigen durch Injektion eines Polypeptids bereitgestellt werden, gegen welches die Bildung von Antikörpern im Empfänger gewünscht wird, oder durch Kontakt des Empfängers mit einer Nukleinsäure, die in der Lage ist, das Antigen unter den Bedingungen für die Expression des Antigens zu exprimieren.
Wie der Fachmann versteht kann der Antikörper ein kompetitiver, nicht-kompetitiver oder unkompetitiver Inhibitor der Proteinbindung an das zelluläre Proliferationsprotein sein. Vorzugsweise ist der Antikörper auch ein Antagonist zum zellulären Proliferationsprotein. In einem Aspekt verhindert der Antikörper das Wachstum der Zelle, wenn der Antikörper die Bindung anderer Moleküle an das zelluläre Proliferationsprotein verhindert. Der Antikörper sensitiviert die Zelle auch gegenüber zytotoxischen Substanzen, beinhaltend, aber nicht begrenzt auf TNF-α, TNF-β, IL-1, INF-γ und IL-2, oder chemotherapeutischen Substanzen beinhaltend 5FU, Vinblastin, Actinomycin D, Cisplatin, Methotrexat und ähnliches mehr.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der Antikörper an eine therapeutische Einheit gebunden. In einem Aspekt ist die therapeutische Einheit ein kleines Molekül, dass die Aktivität des zellulären Proliferationsproteins moduliert. In einem anderen Aspekt moduliert die therapeutische Einheit die Aktivität von Molekülen, die mit dem zellulären Proliferationsprotein assoziiert sind oder sich in unmittelbarer Nachbarschaft hierzu befinden.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die therapeutische Einheit auch eine zytotoxische Substanz sein. Dieser Methode des gezielten Hinführens der zytotoxischen Substanz zum Tumorgewebe oder zur Tumorzelle resultiert in einer Verminderung der Zahl der in Mitleidenschaft gezogenen Zellen und reduziert so die Symptome, die mit der zellulären Proliferation assozi iert sind. Zytotoxische Substanzen sind zahlreich und unterschiedlich und beinhalten, aber sind nicht begrenzt auf, zytotoxische Metikamente oder Toxine oder aktive Fragmente von solchen Toxinen. Passende Toxine und deren korrespondierende Fragmente beinhalten die Diphterie a-Kette, die die Exotoxin a-Kette, die Ricin a-Kette, die Abrin a-Kette, Curcin, Crotin, Phenomycin, Enmycin und ähnliches mehr. Zytotoxische Substanzen beinhalten auch Radiochemikalien, die durch die Konjugation von Radioisotopen an Antikörper, die gegen zelluläre Proliferationsproteine wirksam sind, hergestellt werden, oder die Bindung von einem Radionuklid an eine chelatisierende Einheit, die kovalent an einen Antikörper angebunden worden ist. Die gezielte Hinführung der therapeutischen Einheit an die zellulären Proliferationsproteine dient nicht nur der Erhöhung der lokalen Konzentration der therapeutischen Einheit in der von der zellulären Proliferation betroffenen Gegend, sondern dient auch zur Reduktion schädlicher Nebenwirkungen, die mit der therapeutischen Einheit verbunden sein können.
Bevorzugt ist der Antikörper an ein Protein konjugiert, dass den Eintritt in die Zelle erleichtert. In einem Fall gelangt der Antikörper durch Endozytose in die Zelle. In einer anderen Ausführungsform wird dem Individuum oder der Zelle eine Nukleinsäure verabreicht, die den Antikörper kodiert. Diese Nukleinsäure wird basierend auf der Sequenz des Antikörpers identifiziert und mit rekombinanten Standardtechniken bestimmt. Zudem beinhaltet ein Antikörper, der zur Bindung an das zelluläre Proliferationsprotein geeignet ist, ein Signal für die Ziellokalisation, d.h. ein Zellkern Lokalisationssignal, weil das zelluläre Proliferationsprotein in der Zelle geortet werden kann, und zwar im Zellkern.
In einer bevorzugten Ausführungsform binden die zellulären Proliferationsantikörper aus dieser Erfindung spezifisch an die zellulären Proliferationsproteine. Mit „spezifisch binden" ist hier gemeint, dass die Antikörper an das Proein mit einer Bindungskonstanten im Bereich von mindestens 10^–4–10^–5 M^–1 binden, mit einem bevorzugten Bereich von 10^–7–10^–9 M^–1.
Es ist verstanden, dass die Beispiele, die oben beschrieben sind, in keiner Weise dazu dienen können, die wahre Breite dieser Erfindung einzuschränken, sondern dass sie vielmehr für illustrative Zwecke präsentiert wurden. Alle Referenzen, die hierin zitiert wurden, werden durch Referenz in ihrer Ganzheit hier eingefügt, ebenso wie die Sequenzen, die darin zitiert sind oder die eine GenBank Zugangsnummer haben.

Claims

Screeningverfahren für einen bioaktiven Stoff, der die Aktivität eines zellularen Proliferationsproteins ändern kann, wobei das zelluläre Proliferationsprotein menschliches KSP oder ein Fragment hiervon ist, welches Kinesinaktivität hat, wobei das Verfahren ein in vitro-Kombinieren des zellulären Proliferationsproteins in gereinigter Form und eines einen Kandidaten darstellenden bioaktiven Stoffes und ein Bestimmen der Wirkung des eines Kandidaten darstellenden Stoffes auf die Aktivität des zellularen Proliferationsproteins umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bestimmung eine Bestimmung der Wirkung des bioaktiven Stoffes auf eine Polymerisation oder Depolymerisation von Mikrotubuli umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bestimmung eine Bestimmung der Wirkung des bioaktiven Stoffes auf ein Gleiten von Mikrotuboli umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bestimmung eine Bestimmung der Wirkung des bioaktiven Stoffes auf eine ATP-Hydrolyse umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bestimmung eine Bestimmung der Wirkung des bioaktiven Stoffes auf ein Binden an Spindelproteine oder Zellzyklussteuerproteine umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bestimmung eine Bestimmung der Wirkung des bioaktiven Stoffes auf KSP umfasst, das als Substrat für Kinasen oder Proteasen dient.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das menschliche KSP oder ein Fragment hiervon ein Fragment ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus KSPL360, KSP-K491, KSP-S553 und KSP-K368 besteht.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das menschliche KSP oder ein Fragment hiervon KSPL360 ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Fragment in Bakterien exprimiert wurde.
Verfahren zur Diagnose einer hyperproliferativen Störung in einem Individuum, umfassend eine Bestimmung des Expressionsniveaus eines KSP-Gens in einer Gewebeprobe eines Individuums und Vergleichen des Niveaus mit einem Expressionsstandard oder -kontrollniveau, wobei ein Anstieg anzeigt, dass das Individuum eine hyperproliferative Unordnung hat.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Störung ein Karzinom ist.