DE69813194T2

DE69813194T2 - Assay, verbindungen, therapie und nachweisverfahren um zelluläre dns-reparatur-aktivität zu modulieren

Info

Publication number: DE69813194T2
Application number: DE69813194T
Authority: DE
Inventors: Philip Stephen Jackson; Elizabeth Susan CRITCHLOW
Original assignee: Kudos Pharmaceuticals Ltd
Current assignee: Kudos Pharmaceuticals Ltd
Priority date: 1997-01-13
Filing date: 1998-01-13
Publication date: 2004-02-05
Anticipated expiration: 2018-01-14
Also published as: ES2197453T3; GB2322193B; ATE237136T1; GB2322193A; DK0966683T3; EP0966683A1; EP0966683B1; AU724108B2; PT966683E; WO1998030902A1; DE69813194D1; CA2277481A1; AU5568198A; GB9800663D0; US6753158B1; JP2001508868A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Screeningverfahren, Peptide und Mimetika sowie Verwendungsverfahren auf Basis der überraschenden Entdeckung und Charakterisierung einer Wechselwirkung zwischen bekannten Proteinen und der Feststellung, dass eine derartige Wechselwirkung eine Schlüsselrolle bei der DNA-Reparatur und somit bei zahlreichen zellulären Prozessen spielt, die im therapeutischen Kontext von Interesse sind. Zwei Proteine, um die es geht, sind XRCC4 und DNA-Ligase IV. Die Wechselwirkung zwischen XRCC4 und DNA-PKcs/Ku ist ebenfalls indiziert.
Die Erfindung entstand auf Basis der Arbeit der Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes, die erstmals entscheidende Informationen über XRCC4 ermittelten. Es waren einige Informationen über die physiologische Funktion dieses Proteins vorhanden, wonach es am Ku-assoziierten DNA-Doppelstrang-Bruchreparatur- (KADR-) Apparat beteiligt war. Es war jedoch sehr wenig über seine biologische Aktivität und darüber bekannt, welche Rolle es tatsächlich im KADR-Apparat spielt. Bevor die vorliegende Erfindung gemacht worden war, war es nicht möglich, Tests bereitzustellen, die als Primärscreens auf XRCC4-Inhibitoren nützlich sind.
Weiters ist durch die neue Klonierungsarbeit der Erfinder ein Hefe-Homolog von Säugetier-DNA-Ligase IV identifiziert worden. Zuvor war Säugetier-DNA-Ligase IV keine physiologische Funktion zugeordnet worden, aber die Arbeit der Erfinder in Bezug auf Hefe, einschließlich der Analyse der Wirkung von Knockout-Mutation bei Hefe, belegt nun die physiologische Relevanz von DNA-Ligase IV und liefert somit einen Hinweis auf therapeutische Kontexte, in denen die Modulation seiner Funktion bewirkt werden kann.
Die hierin offenbarte Arbeit, die Wechselwirkung zwischen XRCC4 und DNA-Ligase IV, Wechselwirkung zwischen XRCC4 und DNA-PKcs/Ku und auch die biologische Rolle derartiger Wechselwirkungen belegt, lässt nun Screeningverfahren entstehen, um Verbindungen zu identifizieren, die die Wechselwirkung beeinflussen, insbesondere jene, die sie stören, und die bestimmte Aspekte zellulärer DNA-Reparaturaktivität beeinflus sen oder modulieren können, die im therapeutischen Kontext nützlich ist, beispielsweise bei der Behandlung von proliferativen Störungen, Krebsarten und Tumoren, Störungen, an denen Retroviren beteiligt sind, wie z. B. AIDS, T-Zellen-Leukämie/Lymphom bei Erwachsenen, Typ I-Diabetes und Multiple Sklerose, sowie auch bei Strahlentherapie. Weiters ermöglicht sie auch die rationale Konstruktion von Peptiden und Mimetika oder funktionellen Analogen, die diese Funktion erfüllen.
Eine der gefährlichsten Formen der Schädigung, von denen eine Zelle befallen werden kann, ist der DNA-Doppelstrang-Bruch (DSB), der die wichtigste letale Läsion darstellt, die durch ionisierende Strahlung und radiomimetische Mittel herbeigeführt wird. Als Folge haben Zellen sehr wirksame und komplexe Systeme entwickelt, um diese Art von DNA-Schädigung zu erkennen und zu gewährleisten, dass sie effizient und präzise repariert wird. Für die Reparatur von DNA-DSBs bei Eukaryoten haben sich zwei Hauptwege entwickelt, homologe Rekombination und nichthomologe Endverbindung (NHEJ) von DNA.
Viel von dem, was heute über DNA-NHEJ in Säugetier-Systemen bekannt ist, wurde durch Untersuchungen einer Serie mutanter Nagetier-Zelllinien erhalten, die ursprünglich als überempfindlich für ionisierende Strahlung identifiziert wurden und schwere Defekte bei der DNA-DSB-Reparatur zeigen (zusammengefasst in Jeggo et al., 1995; Roth et al., 1995). Die Charakterisierung dieser Zelllinien hat gezeigt, dass sie in drei Komplementationsgruppen fallen, die als IR4, IR5 und IR7 bezeichnet werden. Die Hamster-Zelllinie XR-1 definiert IR4, IR5 besteht aus einer Anzahl unabhängig voneinander isolierter Hamster-Zeltmutanten, und IR7 enthält die Hamster-Zelllinie V3 und Zellen, die von der Scid- ("severe combined immune-deficient") Maus stammen. Verschiedene Untersuchungen haben gezeigt, dass IR4-, IR5- und IR5-Zellen Defekte bei der Antikörper- und T-Zellen-Rezeptor V(D)J-Rekombination aufweisen.
Es sind beträchtliche Bemühungen unternommen worden, die Beschaffenheit der Genprodukte zu ermitteln, die Defekte in IR4-, IR5- und IR7-Zellen aufweisen, und zu be stimmen, wie sie bei DNA-NHEJ funktionieren. Als Ergebnis solcher Untersuchungen wurde gezeigt, dass IR5- und IR7-Zellen eine Defizienz bei Komponenten der DNA-abhängigen Proteinkinase (DNA-PK) (Ku80 bzw. DNA-PKcs) aufweisen. DNA-PK ist eine nukleare Protein-Ser/Thr-Kinase, die die ungewöhnliche Eigenschaft aufweist, bei Bindung an DNA-DSBs oder andere Störungen der DNA-Doppelhelix aktiviert zu werden (Jackson, 1997). Im Lichte der biochemischen Eigenschaften von DNA-PK, die ermittelt worden sind, besteht eine attraktive Hypothese darin, dass dieses Enzym als DNA-Schädigungssensor in vivo dient.
Im Gegensatz zu IR5- und IR7-Zellen weisen IR4-Zellen keine Defizienz in einer DNA-PK-Komponente auf, wie aus der Tatsache ersichtlich ist, dass Extrakte dieser Zellen normale DNA-Endenbindungsaktivität (Getts und Stamato, 1994; Rathmell und Chu, 1994; Finnie et al., 1996) und DNA-PK-Aktivität (Blunt et al., 1995) aufweisen und dass weder die Expression von Ku80 noch von DNA-PKcs die V(D)J-Rekombinations- oder Strahlungsempfindlichkeitsdefekte von XR-1-Zellen komplementiert (Taccioli et al., 1994; Blunt et al., 1995). Statt dessen ist gezeigt worden, dass DNA von der Human-Chromosomenregion 5q13–14 XR-1-Zellen komplementiert, wobei das Komplementierungsgen als XRCC4 bezeichnet wird (Otevrel und Stamato, 1995).
Weiters haben (Li et al., 1995) das XRCC4-Gen vor kurzem durch seine Fähigkeit identifiziert, normale V(D)J-Rekombinationsaktivität zu verleihen und den DSB-Reparaturdefekt auf XR-1-Zellen teilweise wiederherzustellen, und haben gezeigt, dass der XRCC4-Locus bei XR-1-Zellen deletiert ist.
Interessanterweise kodiert XRCC4 für ein kleines Protein mit 334 Aminosäureresten mit einem berechneten Molekulargewicht von 38 kDa, und es ist gezeigt worden, dass die Human- und Maus-Homologe dieses Proteins zu etwa 75% identisch sind (Li et al., 1995). Vielleicht überraschenderweise zeigen Sequenzanalysen jedoch, dass XRCC4 nicht wesentlich mit irgendwelchen zuvor charakterisierten Proteinen in Zusammenhang steht. Daher hat, obwohl klar ist, dass XRCC4 eine entscheidende Rolle bei der DNA-DSB-Reparatur und V(D)J-Rekombination spielt, die Klonierung und Sequenzierung der cDNA für diesen Faktor bisher kaum Hinweise auf seinen Wirkmechanismus geliefert.
Die Arbeit von Li et al. ist die einzige Arbeit, die vor dem Prioritätsdatum der vorliegenden Erfindung über das XRCC4-Protein veröffentlicht wurde. Sie berichtet, dass XRCC4 nicht mit anderen Proteinen in Zusammenhang steht und seine Sequenz daher keine klaren Hinweise auf seine Funktion gibt. Vor der vorliegenden Arbeit waren daher die einzigen Tests, die für XRCC4 zur Verfügung standen, zelluläre Strahlungsempfindlichkeits- und zelluläre V(D)J-Rekombinationstests, die nicht als Primärscreens für Inhibitoren verwendet werden können. Folglich war es unmöglich, an ein biochemisches Screen für die Aktivität dieses Faktors zu denken.
Es ist auch anzumerken, dass die Arbeit von Li et al. keinen Hinweis darauf liefert, dass XRCC4 ein nukleares Protein ist (wie hierin gezeigt) und auf Seite 1.084 erörtert, dass XRCC4 mutmaßliche Stellen für zytoplasmische Proteintyrosinkinasen aufweist. Somit ist klar, dass tatsächlich nichts darüber bekannt war, wie dieses Protein möglicherweise wirkt.
Die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes haben gezeigt, dass XRCC4 zumindest teilweise im Zellkern vorliegt, und überzeugend demonstriert, dass es mit DNA-Ligase IV und auch DNA-PKcs/Ku in Wechselwirkung tritt. Belege werden im Experimentellen Teil der vorliegenden Beschreibung geliefert, und eine Bestätigung liefert auch Mizuta et al., 1997, Grawunder et al., 1997, haben ebenfalls Belege für die Wechselwirkung zwischen XRCC4 und DNA-Ligase IV geliefert. Siehe auch die Veröffentlichungen der Erfinder, Teo und Jackson, 1997, sowie Critchlow et al. 1997.
DNA-Ligasen sind Katalysatoren, die Okazaki-Fragmente während der Lagging-Strang-DNA-Synthese verbinden, Austauschereignisse zwischen homologen Duplex-DNA-Molekülen vervollständigen und Einzel- oder Doppelstrangbrüche in der DNA abdichten, die entweder durch die direkte Wirkung von DNA schädigenden Mitteln oder durch DNA-Reparaturenzyme erzeugt werden, die DNA-Läsionen beseitigen (ein Überblick findet sich in Lindahl und Barnes, 1992). Im Gegensatz zu prokaryotischen und Hefe-Systemen, wo zuvor nur eine einzelne Spezies der DNA-Ligase beschrieben worden ist (Johnston und Nasmyth, 1978), sind bei Säugetierzellen vier biochemisch unterschiedliche DNA-Ligasen identifiziert worden (Tomkinson et al., 1991; Wei et al., 1995; Robins und Lindahl, 1996). In vitro-Tests und Untersuchungen von Hefe- und Menschenzellen, die mutierte Allen von DNA-Ligase I enthalten, lassen darauf schließen, dass dieses Enzym während der DNA-Replikation Okazaki-Fragmente verbindet (Henderson et al., 1985; Malkas et al., 1990; Tomkinson et al., 1991; Barnes et al., 1992; Li et al., 1994; Pirgent et al., 1994; Waga et al., 1994). Weiters weist die Empfindlichkeit von mutanten DNA-Ligase I-Zellen für UV-Bestrahlung und einige DNA schädigende Mittel darauf hin, dass DNA-Ligase I an der Nucleotidausschnittreparatur und Basenausschnittreparatur beteiligt ist (Henderson et al., 1985; Lehmann et al., 1988; Malkas et al., 1990; Tomkinson et al., 1991; Barnes et al., 1992; Li et al., 1994; Prigent et al., 1994; Waga et al., 1994).
Es ist jedoch viel weniger über die Funktion der anderen drei Säugetier-DNA-Ligasen bekannt. Es ist zurzeit unklar, ob DNA-Ligase I und II aus unterschiedlichen Genen oder durch alternatives Spleißen des selben Gens entstehen (Roberts et al., 1994; Wang et al., 1994; Husain et al., 1995). Ligase II wird jedoch als Reaktion auf Alkylierungsschädigung verursacht (Creisson und Shall, 1982), was auf eine Rolle bei der DNA-Reparatur hinweist. Auf ähnliche Weise stehen der Anstieg der Mengen einer Spleißvariante von Ligase III (Ligase III-β) bei Spermatozyten, die meiotische Rekombination erfahren (Chen et al., 1995; Husain et al., 1995; Mackey et al., 1997) und die Assoziation einer anderen Spleißvariante (Ligase III-α) mit dem DNA-Reparaturprotein XRCC1 (Caldecott et al., 1994; Thompson et al., 1990) in Einklang damit, dass dieses Enzym DNA-Strangbrüche mit vollständiger DNA-Rekombination und Reparatur verbindet (Jessberger et al., 1993). Tatsächlich kann DNA-Ligase III, wenn sie in einem Komplex mit XRCC-1 vorhanden ist, das Ligationsereignis rekonstituieren, das für die vollständige Basenausschnittreparatur in vitro notwendig ist (Kubota et al., 1996).
Ein viertes Enzym, DNA-Ligase IV, ist vor kurzem aus Menschenzellen gereinigt worden und weist von anderen Ligasen unterschiedliche biochemische Eigenschaften auf (Robins und Lindahl, 1996). Die physiologische Funktion von Säugetier-Ligase IV ist jedoch unbekannt.
Bei den meisten Prokaryoten ist nur eine DNA-Ligase vorhanden, und dieses Enzym katalysiert alle DNA-Bindungsereignisse während der Replikation, Rekombination und Reparatur (Lindahl und Barnes, 1992). Ebenso weisen genetische und biochemische Daten darauf hin, dass bei Saccharomyces cerevisiae nur eine DNA-Ligase vorhanden ist (Lindahl und Barnes, 1992), aber die Fraktionierung von Hefe-Zellextrakten hat Hinweise auf eine zweite DNA-Ligase-Aktivität ergeben (Tomkinson et al., 1992).
Die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes haben DNA-Ligase-Homologe im S. cerevisiae-Genom gesucht, das vor kurzem vollständig sequenziert wurde (Goffeau et al., 1996; Oliver, 1996). Bei dieser Suche wurde ein bisher uncharakterisierter offener Leserahmen (ORF) identifiziert, der entlang seiner gesamte Länge Sequenz-Ähnlichkeit mit Säugetier-DNA-Ligase IV aufweist. Der nachstehende Experimentelle Teil beschreibt die Wirkungen des Aufbrechens dieses Gens, das die Erfinder als LIG4 bezeichnet haben, auf die DNA-Replikation, homologe Rekombination und DNA-Reparatur als Reaktion auf eine Vielzahl von DNA schädigenden Mitteln. Diese Untersuchungen zeigen, dass LIG4 eine entscheidende Rolle bei der DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur über den Weg der nicht homologen Endenverbindung NHEJ) spielt, aber keine wesentliche Rolle bei anderen untersuchten DNA-Reparaturwegen hat.
Weiters wird gezeigt, dass LIG4 auf dem gleichen DNA-Reparaturweg funktioniert, bei dem das DNA-Endenbindungsprotein Ku zum Einsatz kommt. Der Phänotyp von mutanten lig4-Hefen ist jedoch nicht identisch mit jenen von Hefen, deren Ku-Funktion zerstört ist, was zeigt, dass Ku eine zusätzliche Rolle bei der Beibehaltung des Genoms spielt.
Zusammenfassend war von XRCC4 bekannt, dass es auf irgendeine Weise an der Ku-assoziierten DNA-Doppelstrangbruchreparatur (KADR) beteiligt ist, aber seine biologische Aktivität war ungewiss. Die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes haben erstmals biologische Aktivität von XRCC4 nachgewiesen, nämlich die Bindung an DNA-Ligase IV. Weiters war die physiologische Relevanz von DNA-Ligase IV nicht bekannt. Die Erfinder haben nun ermittelt, dass DNA-Ligase IV für die Doppelstrang-DNA-Bruchreparatur über nichthomologe Endenbindung (NHEJ) wichtig ist – indem sie unerwarteterweise ein Hefe-Homologgen identifizieren und klonieren und dann mutieren konnten, und indem sie eine starke Wechselwirkung zwischen XRCC4 und CNA-Ligase IV ermittelten.
Die Erfinder haben auch festgestellt, dass XRCC4 mit DNA-PKcs/Ku in Wechselwirkung tritt und gezeigt, dass DNA-PKcs XRCC4 phosphorylieren kann.
Auf Basis dieser und anderer Arbeiten, die nachstehend beschrieben werden, sieht die vorliegende Erfindung in verschiedenen Aspekten die Modulation der Wechselwirkung zwischen XRCC4 und DNA-Ligase IV vor.
Verschiedene Aspekte der vorliegenden Erfindung sehen die Verwendung von XRCC4 und DNA-Ligase IV bei Screeningverfahren und -tests für Mittel vor, die die Wechselwirkung zwischen XRCC4 und DNA-Ligase IV modulieren.
Weitere Aspekte sehen die Modulation der Wechselwirkung zwischen XRCC4 und DNA-PKcs/Ku und die Verwendung dieser Moleküle bei Screeningverfahren und -tests für Mittel vor, die die Wechselwirkung zwischen XRCC4 und DNA-PKcs/Ku modulieren. Der Einfachheit halber wir in einem Großteil der vorliegenden Offenbarung auf XRCC4 und DNA-Ligase IV Bezug genommen. Wenn der Kontext jedoch nicht etwas anderes verlangt, sollte jede Bezugnahme so interpretiert werden, dass sie gleichermaßen auf die Wechselwirkung zwischen XRCC4 und DNA-PKcs/Ku anwendbar ist.
Zu den Verfahren zum Erhalten von Mitteln, die die Wechselwirkung zwischen XRCC4 und DNA-Ligase IV (oder, wie erinnerlich, XRCC4 und DNA-PKcs/Ku) modulieren können, gehören Verfahren, worin ein geeigneter Endpunkt verwendet wird, um die Wechselwirkung in Gegenwart und Abwesenheit einer Testsubstanz zu bewerten. Eine detaillierte Offenbarung in dieser Hinsicht erfolgt weiter unten. Es ist jedoch anzumerken, dass die Technik der kombinatorischen Bibliothek eine effiziente Möglichkeit bietet, eine potentiell enorme Anzahl unterschiedlicher Substanzen auf die Fähigkeit zu testen, die Bindung an ein und/oder Aktivität eines Polypeptids zu modulieren. Derartige Bibliotheken und ihre Verwendung sind nach dem Stand der Technik unter anderem für jede Art natürlicher Produkte, kleiner Moleküle und Polypeptide bekannt. Die Verwendung von Peptid-Biliotheken kann unter bestimmten Umständen bevorzugt werden.
Geeignete Mittel können für beliebige Zwecke erhalten, konstruiert und verwendet werden.
Einer davon ist die Antitumor- oder Antikrebs-Therapie, insbesondere die Unterstützung von Strahlentherapie oder Chemotherapie. Ionisierende Strahlung und radiomimetische Arzneimittel werden üblicherweise verwendet, um Krebs zu behandeln, indem DNA-Schädigung herbeigeführt wird. Zellen mit mangelnder DNA-Reparatur, insbesondere was den KADR-Weg betrifft, sind überempfindlich für ionisierende Strahlung und Radiomimetika. Hierin gelieferte Beweise zeigen, dass am KADR-Weg XRCC4 und DNA-Ligase IV beteiligt sind, was darauf hinweist, dass die Hemmung ihrer Funktion, beispielsweise durch Hemmen ihrer Wechselwirkung, eine Auswirkung auf den KADR-Weg, die DNA-Reparatur und die zelluläre Empfindlichkeit für ionisierende Strahlung und Radiomimetika hat.
Ein weiterer Zweck ist die Verbesserung der Wirkung von Gen-Targeting und Gentherapie. Die Hemmung von KADR kann eingesetzt werden, um die Wirksamkeit von Gen-Targeting zu erhöhen, was für die Gentherapie von Interesse und optimaler Verwendung ist. Es gibt zwei Wege, um DNA-Doppelstrang-Brüche (DSBs) zu reparieren. Einer ist jener durch das Verfahren der illegitimen Rekombination (auch als nichthomologe Endenverbindung von DNA oder NHEJ) bekannt, und dieser wird durch das KADR-System katalysiert, von dem nun bekannt ist, dass XRCC4 und DNA-Ligase IV daran beteiligt sind. Das andere System ist das Verfahren der homologen Rekombination, durch das das geschädigte DNA-Molekül Informationen mit einem ungeschädigten homologen Partner-DNA-Molekül austauscht. Bei Säugetierzellen ist tendenziell der illegitime Weg vorherrschend. Das Hemmen des KADR-Systems führt dazu, dass der Anteil der durch homologe Rekombination reparierten DSBs zunimmt. Somit haben Anti-KADR-Faktor-Mittel, einschließlich jener, die gemäß vorliegender Erfindung bereitgestellt werden, diese Wirkung. Homologes Gen-Targeting wird verwendet, um Knockout-Mäuse und andere transgene Tiere herzustellen, aber es ist nicht sehr effizient, und daher ist eine Erhöhung dieser Effizienz gemäß vorliegender Erfindung von großem Vorteil. Schlussendlich möchte der Gentherapeut das mutierte Gen präzise durch ein funktionelles ersetzen. Zurzeit hat es Priorität, das funktionelle Gen überhaupt dazu zu verlassen, sich irgendwo im Genom zu integrieren, aber das langfristige Ziel besteht in der Integration an der richtigen Stelle. KADR- (z. B. XRCC4 und/oder Ligase IV, oder XRCC4 und/oder DNA-PKcs/Ku) Inhibitoren haben daher in diesem Kontext ein hohes therapeutisches Potential.
Ein weiterer verwandter Zweck liegt in der antiretroviralen Therapie, da DNA-Reparaturwege, wie jene, an denen KADR und die Komponenten XRCC4 und DNA-Ligase IV beteiligt sind, daran beteiligt sind, retrovirale und Retrotransposonintegration in das Genom einer Wirtszelle zu bewirken. Retroviren stellen ein beträchtliches Risiko für die Gesundheit von Mensch und Tier dar und verursachen unter anderem AIDS, verschiedene Krebsarten und T-Zellen-Leukämie/Lymphom beim Erwachsenen. Die Integration retroviraler DNA in das Genom ist für die effiziente virale Ausbreitung wesentlich, und es kann durch die Hemmung von DNA-Reparaturweg-Komponenten darauf abgezielt werden.
Außerdem können Modulatoren von KADR-Komponenten, wie XRCC4 und DNA-Ligase IV, DNA-PKcs/Ku bei der Modulation der Immunsystemfunktion verwendet werden, da solche Faktoren für die Erzeugung von reifen Immunoglobulin- und T-Zellen-Rezeptorgenen durch stellenspezifische V(D)J-Rekombination erforderlich sind.
Verbindungen, die die Wechselwirkung zwischen zwei Komponenten, wie XRCC4 und DNA-Ligase IV oder XRCC4 und DNA-PKcs/Ku, stabilisieren, und die die Aktivität nach oben regulieren können, können gescreent werden, um Tests zu verwendet, in denen die Bedingungen für die relevante Wechselwirkung zu streng sind. Es können Mittel identifiziert werden, die die Wechselwirkung stabilisieren. Eine Alternative besteht darin, bezüglich Substanzen zu screenen, die die katalytische Aktivität von DNA-Ligase IV verstärken und die wie an anderer Stelle erörtert bestimmt werden können. Ein die Aktivität nach oben regulierendes Mittel kann verwendet wird, um die DNA-Reparatur weiter zu verstärken, und das kann bei normalen Individuen erfolgen, mit möglichen langfristigen positiven Auswirkungen, wobei berücksichtigt wird, dass viele der üblichen Manifestationen der Alterung durch die allmähliche und unausweichliche Anhäufung von Mutationen in Somazellen entstehen. Mittel zur Regulierung nach oben können bei der Behandlung von Patienten verwendet werden, die in Bezug auf den KADR-Weg oder einen anderen DNA-Reperaturweg geschwächt sind.
Die Wechselwirkung zwischen XRCC4 und DNA-Ligase IV oder XRCC4 und DNA-PKcs/Ku kann durch die Hemmung der Produktion des relevanten Proteins gehemmt werden. Beispielsweise kann die Produktion einer oder mehrerer dieser Komponenten durch die Verwendung einer geeigneten Nucleinsäure gehemmt werden, um die Expression durch Antisense-Regulierung zu beeinflussen. Die Verwendung von Antisense-Genen oder partiellen Gensequenzen, um die Gen-Expression nach unten zu regulieren, ist nun allgemein anerkannt. Doppelstrangige DNA wird unter die Steuerung eines Promotors in einer "reversen Ausrichtung" gestellt, so dass die Transkription des "Antisense"-Strangs der DNA RNA ergibt, die zu normaler mRNA komplementär ist, die aus dem "Sense"-Strang des Zielgens transkribiert ist. Es wird angenommen, dass sich die kom plementäre Antisense-RNA-Sequenz dann mir mRNA verbindet, um einen Duplex zu bilden, wodurch die Translation der endogenen mRNA aus dem Zielgen in Protein gehemmt wird. Ob es sich dabei um den tatsächlichen Wirkmodus handelt, ist immer noch ungewiss. Es ist jedoch eine erwiesene Tatsache, dass die Technik funktioniert.
Eine weitere Möglichkeit besteht darin, Nucleinsäure zu verwenden, die bei der Transkription ein Ribozym erzeugt, das in der Lage ist, Nucleinsäure an einer bestimmten Stelle zu spalten - und somit auch für die Beeinflussung der Genexpression nützlich ist. Hintergrundverweise in Bezug auf Ribozyme sind Kashani-Sabet und Scanlon, Cancer Gene Therapy 2(3), 213–223 (1995), und Mercola und Cohen, Cancer Gene Therapy 2(1), 47–59 (1995).
Somit werden als weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung verschiedene Verfahren und Verwendungen für Modulatoren, insbesondere Inhibitoren der Wechselwirkung und/oder Aktivität von XRCC4 und DNA-Ligase IV oder XRCC4 und DNA-PKcs/Ku bereitgestellt. Der Zweck der Zerstörung, Störung oder Modulation der Wechselwirkung zwischen XRCC4 und DNA-Ligase IV und/oder XRCC4 und DNA-PKcs/Ku kann darin bestehen, jegliche Aktivität zu modulieren, die aufgrund einer solchen Wechselwirkung vermittelt wird, wie oben und detaillierter weiter unten erörtert wird.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 veranschaulicht die gleichzeitige Reinigung von XRCC4 und DNA-Ligase IV aus HeLa-Zellen.
1A zeigt die Ergebnisse von quantitativen Western-Immunoblot-Analysen für DNA-Ligase IV (Rauten) und XRCC4 (Quadrate) (Prozent an Protein) für verschiedene Fraktionen in jedem Chromatographiestadium von Gelchromatographiefiltration für DNA-Ligase IV-Reinigung aus HeLa-Zellen.
1B zeigt die Ergebnisse von quantitativen Western-Immunoblot-Analysen für DNA-Ligase IV (Rauten), XRCC4 (Quadrate und DNA-Ligase III (Kreise) Prozent an Protein) für verschiedene Fraktionen in jedem Stadium der Mono-S-Säulenfraktionierung auf der in 1A mit einem Sternchen gekennzeichneten Fraktion.
2 zeigt, dass YOR005c für ein Homolog von Säugetier-DNA-Ligase IV kodiert, was Aminosäuresequenz-Ähnlichkeiten zwischen S. cerevisiae Lig4p (scLIG4; das Produkt des YOR005c ORF) und Human-DNA-Ligase IV (hLIGIV) anzeigt. Die Ausrichtung wurde unter Verwendung des PILEUP-Programms auf dem GCG-Paket (Genetics Computer Group, Wisconsin) erzeugt, und identische und ähnliche Aminosäurereste werden durch Reverse-Shading bzw. Grauschattierung unter Einsatz des BOXSHADE-Programms angezeigt. Aminosäurereste sind von den Amino-Endgruppen der Polypeptide voller Länge aus nummeriert. Zur maximalen Ausrichtung wurden Zwischenräume eingeführt. Der Aktivstellen-Lysinrest ist mit einer Pfeilspitze markiert. Die konservierte "Kern"-Region von DNA-Ligasen von Eukaryoten und eukaryotischen Viren ist mit einem Balken begrenzt.
3 zeigt, das LIG4 im Ku-abhängigen Weg funktioniert, um durch ionisierende Strahlung herbeigeführte DNA-Schädigung zu reparieren. Die Empfindlichkeit verschiedener Hefestämme für die Abtötung durch ionisierende Strahlung wurde durch das Einwirken verschiedener Strahlungsdosen beurteilt. Aus Gründen der Vereinfachung sind keine Fehlerbalken gezeigt; die Standardabweichung beträgt < 5% jedes Wertpunkts.
3A zeigt die prozentuelle Überlebensrate der Zellen für die Wildform, lig4-Mutanen und rad52-Mutanten bei verschiedenen Dosen in kRad ionisierender Strahlung.
3B zeigt die prozentuelle Überlebensrate der Zellen für lig4/yku70-Mutanten, rad-52-Mutanen, rad52/lig4-Mutanten, rad52/yku70-Mutanten und rad52/lig4/yku70-Mutanten bei verschiedenen Dosen in kRad ionisierender Strahlung.
4 zeigt, dass die Zerstörung von LIG4 zu einer dramatischen Reduktion der Fähigkeit zur Reparatur von durch Restriktionsenzym erzeugten kohäsiven DNA-DSBs in Plasmid (pBTM116)-DNA führt, wobei die Transformantenerholung in Bezug auf ungeschnittenes Kontrollplasmid aufgetragen ist, worin verschiedene Hefestämme, Wildform und Mutante mit mit EcoRl (linkes Bild) oder Pstl (rechtes Bild) verdautem pBTM116 transformiert wurden.
5 zeigt ein Modell, bei dem XRCC4 als Molekularbrücke, um mit DNA-Ligase IV auf ein DNA-DSB abzuzielen.
6 zeigt die Aminosäuresequenz und kodierende Nucleotidsequenz für S. cerevisiae LIG4, die gemäß Aspekten der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird. Die Translation beginnt an der durch den Pfeil markierten Startstelle.
Aminosäure- und Nucleinsäuresequenzen von Polypeptiden, die bei verschiedenen Aspekten der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind von GenBank unter den folgenden Hinterlegungsnummern erhältlich: Human-Ku70-J04611; Human-Ku80-M30938; S. cerevisiae-Ku70–X70379; S. cerevisiae-Ku80–Z49702; Human-Ligase IV-X83441; S. cerevisiae-Ligase IV – YOR005c am rechten Arm von S. cerevisiae-Chromosom XV, Hinterlegungsnummer Z74913; Human-XRCC4–U40622 (offener Leserahmen mit 334 Aminosäureresten); Human-DNA-Pkcs–U470077 (Hartley et al. haben die Sequenz ursprünglich bereitgestellt, aber ohne Intron. Poltoratsky et al. haben eine partielle Sequenz bereitgestellt, die das Intron enthält, dass in der Sequenz von Hartley et al. nicht enthalten ist. Die von GenBank erhältliche Sequenz ist vollständig.).
Alle Dokumente und GenBank-Sequenzen, die an irgendeiner Stelle in der vorliegenden Beschreibung genannt sind, sind durch Verweis hierin aufgenommen.
Die vorliegende Erfindung sieht in verschiedenen Aspekten das Modulieren, Stören oder Zerstören der Wechselwirkung zwischen dem XRCC4-protein und DNA-Ligase IV unter Verwendung eines geeigneten Mittels vor. Die vorliegende Erfindung sieht in analogen Aspekten auch das Modulieren, Stören oder Zerstören der Wechselwirkung zwischen dem XRCC4-Protein und DNA-PKcs/Ku unter Verwendung eines geeigneten Mittels vor.
Ein solches Mittel, das fähig ist, die Wechselwirkung zwischen XRCC4 und DNA-Ligase IV zu modulieren, kann fähig sein, die Bindung zwischen einer Stelle, die sich innerhalb der Aminosäurereste 550–884 von Human-DNA-Ligase IV befindet, oder zwischen den BRCT-Domänen und einer Stelle auf Human-XRCC4 zu blockieren. Die Stelle auf DNA-Ligase IV kann die Reste 677–727 umfassen. Die volle Aminosäuresequenz des XRCC4-Proteins ist geklärt worden und ist in Li et al. (Cell 83, 1079–1089 (1995)) dargelegt, das durch Verweis hierin aufgenommen ist und dessen Aminosäurerest-Nummerierung gemeinsam mit der kodierenden Nucleinsäuresequenz verwendet wird. Der GenBank-Verweis ist oben angeführt. Die DNA-Ligase IV-Aminosäure- und -Nucleotid-Kodierungssequenzen sind in Wei et al., angeführt, dessen Aminosäurerest-Nummerierung verwendet wird, wobei die Hefe-LIG4-Sequenzen in 6 gezeigt werden. Die GenBank-Verweise sind oben angeführt.
Es ist anzumerken dass vor kurzem T. E. Wilson, Nature 388, 495–498 (1997), die Meinung vertreten hat, dass sich das initiierende Methionin für Human-DNA-Ligase IV stromauf von jenem befindet, das Wei et al., 1995 angegeben haben, deren Aminosäuresequenz-Nummerierung hierin verwendet wird. Details sind der Arbeit von Wilson zu entnehmen. Die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes verfügen über vorläufige Daten, die denen von Wilson widersprechen. Sollte sich jedoch herausstellen, dass Wilson Recht hat, hätte das keine Auswirkung auf irgendeinen Aspekt der vorliegenden Erfindung. Es ist unwahrscheinlich, dass das Vorhandensein oder Fehlen zusätzlicher Aminosäuren am N-Terminus von DNA-Ligase IV irgendein Wirkung auf seien Wechselwirkung mit XRCC4 hat, und es bleibt die Tatsache bestehen, dass die Arbeit der Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes eine Wechselwirkung von XRCC4 mit der DNA-Ligase IV zeigt, die in Menschenzellen auftritt.
Mittel können durch Screeningtechniken identifiziert werden, die es beinhalten, zu bestimmen, ob ein getestetes Mittel die Bindung von DNA-Ligase IV-Protein oder eines geeigneten Fragments davon (z. B. einschließlich der Aminosäurereste 550–884, der Reste 591–676, der Reste 728–844 oder der Reste 677–727 oder eines kleineren Fragments einer dieser Regionen), von Human-DNA-Ligase IV mit XRCC4 oder einem Fragment davon oder einem geeigneten Analog, Fragment oder Variante davon hemmt oder zerstört.
Geeignete Fragmente von XRCC4 oder DNA-Ligase IV sind jene, die Reste umfassen, die mit dem Protein-Gegenstück in Wechselwirkung treten. Kleinere Fragmente sowie Analoge und Varianten dieses Fragments können auf ähnliche Weise eingesetzt werden, beispielsweise wie unter Einsatz von Techniken wie Deletionsanalyse oder Alanin-Scanning identifiziert.
Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Peptidfragment von XRCC4 bereit, das fähig ist, DNA-Ligase IV zu binden und/oder die Wechselwirkung zwischen XRCC4 und DNA-Ligase IV zu hemmen, und stellt ein Peptid-Fragment von DNA-Ligase IV bereit, das fähig ist, DNA-Ligase IV zu binden und/oder die Wechselwirkung zwischen DNA-Ligase IV und XRCC4 zu hemmen, wobei derartige Peptidfragmente durch Deletionsanalyse und/oder Alanin-Scanning des relevanten Proteins erhältlich sind – wobei eine geeignete Sequenzmutation vorgenommen wird, ein mutiertes Fragment eines der Proteine mit dem anderen oder einem Fragment davon zusammengebracht wird und die Wechselwirkung ermittelt wird. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist das Peptid kurz, wie nachstehend erörtert. und kann ein minimaler Abschnitt sein, der mit dem relevanten Protein-Gegenstück in Wechselwirkung treten und/oder die relevante Wechselwirkung hemmen kann.
Natürlich gelten ähnliche Überlegungen für XRCC4 und DNA-PKcs/Ku-Wechselwirkungsabschnitte.
Screeningverfahren und -tests werden nachstehend detaillierter erörtert.
Eine Klasse von Mitteln, die verwendet werden können, um die Bindung von XRCC4 und DNA-Ligase IV aufzubrechen, sind Peptide auf Basis der Sequenzmotive von XRCC4 oder DNA-Ligase IV, die mit dem DNA-Ligase IV- oder XRCC4-Gegenstück in Wechselwirkung treten. Derartige Peptide sind tendenziell kurz und können eine Länge von etwa 40 Aminosäuren oder weniger, vorzugsweise eine Länge von etwa 35 Aminosäuren oder weniger, mehr bevorzugt eine Länge von etwa 30 Aminosäuren oder weniger, mehr bevorzugt eine Länge von etwa 25 Aminosäuren oder weniger, mehr bevorzugt etwa 20 Aminosäuren oder weniger, mehr bevorzugt etwa 15 Aminosäuren oder weniger, mehr bevorzugt etwa 10 Aminosäuren oder weniger, oder eine Länge von 9, 8, 7, 6, 5 oder weniger aufweisen. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Peptide, die Sequenzvarianten oder Derivate einer XRCC4- oder DNA-Ligase IV-Sequenz der Wildform sind, die aber die Fähigkeit, (je nach Fall jeweils) mit DNA-Ligase IV oder XRCC4 in Wechselwirkung zu treten und/oder die Fähigkeit beibehalten, die Wechselwirkung zwischen XRCC4 und DNA-Ligase IV zu modulieren.
Anstelle der Verwendung eines XRCC4- oder DNA-Ligase IV-Fragments der Wildform kann ein Peptid oder Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfassen, die sich durch eines oder mehrere von Addition, Insertion, Deletion und Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren um einen oder mehrere Aminosäurereste von der Aminosäuresequenz der Wildform unterscheidet. Somit sind Varianten, Derivate, Allele, Mutanten und Homologe beispielsweise von anderen Organismen enthalten.
Vorzugsweise weist die Aminosäuresequenz Homologie mit einem Fragment der relevanten gezeigten XRCC4- oder DNA-Ligase IV-Fragmentsequenz auf, vorzugsweise zumindest etwa 30% oder 40% oder 50% oder 60% oder 70% oder 75% oder 80 oder 85% Homologie, oder zumindest etwa 90% oder 95% Homologie. So kann ein Peptidfragment von XRCC4 oder DNA-Ligase IV 1, 2, 3, 4, 5, mehr als 5 oder mehr als 10 Aminosäure-Änderungen, beispielsweise Substitutionen, in Bezug auf die Sequenz der Wildform, aufweisen.
Ein Derivat eines Peptids, für das die spezifische Sequenz hierin offenbart wird, kann bei bestimmten Ausführungsformen die gleiche Länge wie das spezifische Peptid aufweisen oder kürzer sein. Bei anderen Ausführungsformen kann die Peptidsequenz oder eine Variante davon in einem größeren Peptid enthalten sein, wie oben erörtert, das einen zusätzlichen Abschnitt von XRCC4 oder DNA-Ligase IV enthalten kann oder nicht. 1, 2, 3, 4 oder 5 oder mehr zusätzliche Aminosäuren, die an das relevante spezifische Peptidfragment in XRCC4 oder DNA-Ligase IV angrenzen oder dazu heterolog sind können an einem Ende oder an beiden Enden des Peptids vorhanden sein.
(Es sollte nicht vergessen werden, dass Bezugnahmen auf XRCC4 und DNA-Ligase IV gleichermaßen für XRCC4 und DNA-PKcs/Ku gelten.) Wie allgemein verstanden wird, ist mit Homologie auf Ebene der Aminosäure im Allgemeinen Aminosäure-Ähnlichkeit oder -Identität gemeint. Ähnlichkeit lässt Spielraum für "konservative Variation", d. h. Substitution eines hydrophoben Rests, wie Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin, anstelle eines anderen, oder die Substitution eines polaren Rests durch einen anderen, wie z. B. Arginin anstelle von Lysin, Glutamin anstelle von Asparaginsäure oder Glutamin anstelle von Asparagin. Ähnlichkeit kann durch das TBLASTN-Programm von Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403–10 (1990), definiert und bestimmt sein, das nach dem Stand der Technik standardmäßig verwendet wird. Homologie kann über die gesamte Länge des relevanten Peptids oder über eine zusammenhängende Sequenz von etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 50, 75, 100 oder mehr Aminosäuren im Vergleich zur relevanten Aminosäuresequenz der Wildform bestehen.
Wie angeführt, können Peptidsequenz-Varianten und Peptid- und Nicht-Peptid-Analoge und Mimetika eingesetzt werden, wie nachstehend weiter erörtert.
Verschiedene Aspekte der vorliegenden Erfindung stellen eine Substanz bereit, wobei es sich um ein einzelnes Molekül oder eine Zusammensetzung handeln kann, die zwei oder mehr Komponenten umfasst, die ein Peptidfragment von XRCC4 oder DNA-Ligase IV umfasst, das eine Sequenz, wie im relevanten GenBank-Eintrag enthalten, ein Peptid, das im Wesentlichen aus einer solchen Sequenz besteht, ein Peptid, das eine Variante, ein Derivat oder eine analoge Sequenz umfasst, oder ein Nicht-Peptid-Analog oder Mimetikum umfasst, das die Fähigkeit aufweist, XRCC4 oder DNA-Ligase IV zu binden und/oder die Wechselwirkung zwischen XRCC4 oder DNA-Ligase IV zu modulieren, zu zerstören oder zu stören.
Zu den Varianten gehören Peptide, in denen einzelne Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt erden können, die eng verwandt sind, wie es nach dem Stand der Technik verstanden wird und oben angeführt ist.
Nicht-Peptid-Mimetika von Peptiden werden nachstehend weiter erörtert.
Wie angeführt, kann ein Peptid gemäß vorliegender Erfindung und zur Verwendung bei verschiedenen Aspekten der vorliegenden Erfindung ein Fragment von XRCC4 oder DNA-Ligase IV wie offenbart umfassen oder im Wesentlichen daraus bestehen, beispielsweise ein Fragment, dessen Sequenz im relevanten GenBank-Eintrag enthalten ist. Wenn eine oder mehrere zusätzliche Aminosäuren enthalten sind, können derartige Aminosäuren von XRCC4 oder DNA-Ligase IV stammen oder zu XRCC4 oder DNA-Ligase IV heterolog oder fremd sein. Ein Peptid kann auch innerhalb eines größeren Fusionsproteins enthalten sein, insbesondere, wenn das Peptid an eine Nicht-XRCC4- oder DNA-Ligase IV- (d. h. eine heterologe oder fremde) Sequenz, wie z. B. eine Polypeptidoder Proteindomäne, fusioniert ist.
Die Erfindung umfasst auch Derivate der Peptide, einschließlich des an einen Kopplungspartner, beispielsweise ein Effektormolekül, eine Markierung, ein Arzneimittel, ein Toxin und/oder ein Träger- oder Transportmolekül gebundenen Peptids, und/oder eine Targeting-Moleküls, wie z. B. eines Antikörpers oder Bindungsfragments davon oder eines anderen Liganden. Techniken zum Koppeln der erfindungsgemäßen Peptide sowohl an Peptidyl- als auch Nicht-Peptidyl-Kopplungspartner sind nach dem Stand der Technik bekannt. Gemäß einer Ausführungsform ist das Trägermolekül eine 16 aa-Peptidsequenz, die von der Homöodomäne von Antennapedia (wie beispielsweise unter der Bezeichnung "Penetratin" vertrieben) stammt, die über einen endständigen Cys-Rest an ein Peptid gebunden werden kann. Das "Penetratin"-Molekül und seine Eigenschaften werden in der WO 91/18981 beschrieben.
Peptide können ganz oder teilweise durch chemische Synthese hergestellt werden. Die Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung können leicht nach allgemein bekannten, standardmäßigen Flüssig- oder vorzugsweise Festphasen-Peptid-Syntheseverfahren hergestellt werden, für die allgemeine Beschreibungen weitverbreitet verfügbar sind (siehe beispielsweise in J. M. Stewart und J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Aufl., Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984), in M. Bodanzsky und A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984); und Applied Biosystems 430A Users Manual, ABI Inc., Foster City, California), oder sie können in Lösung durch das Flüssigphasenverfahren oder durch eine Kombination aus Festphasen-, Flüssigphasen- und Lösungschemie hergestellt werden, beispielsweise indem zuerst der jeweilige Peptidabschnitt fertiggestellt wird und dann, falls erwünscht und angemessen, nach dem Entfernen etwaiger vorhandener Schutzgruppen, durch Einführen von Rest X durch Umsetzung der jeweiligen Carbon- oder Sulfonsäure oder eines reaktiven Derivats davon.
Ein weiterer zweckmäßiger Weg zur Herstellung eines Peptidylmoleküls gemäß vorliegender Erfindung (Peptid oder Polypeptid) besteht darin, durch die Verwendung von Nucleinsäure in einem Expressionssystem Nucleinsäure zu exprimieren, die dafür kodiert.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung in verschiedenen Aspekten auch Nucleinsäure bereit, die für die Polypeptide und Peptide gemäß vorliegender Erfindung kodiert.
Im Allgemeinen wird Nucleinsäure gemäß vorliegender Erfindung als Isolat, in isolierter und/oder gereinigter Form oder frei oder im Wesentlichen frei von Material bereitgestellt, mit dem sie auf natürliche Weise assoziiert ist, wie z. B. frei oder im Wesentlichen frei von Nucleinsäure, die das Gen im humanen Genom flankiert, möglicherweise mit Ausnahme einer oder mehrerer Regulationssequenzen zur Expression. Nucleinsäure kann ganz oder teilweise synthetisch sein oder kann genomische DNA, cDNA oder RNA umfassen. Wenn Nucleinsäure gemäß vorliegender Erfindung RNA umfasst, sollte Bezugnahme auf die gezeigte Sequenz als Bezugnahme auf das RNA-Äquivalent verstanden werden, wobei T durch U ersetzt ist.
Nucleinsäuresequenzen, die für ein Polypeptid oder Peptid gemäß vorliegender Erfindung kodieren, können in Hinblick auf die Nucleinsäuresequenz und die verfügbaren Klone von Fachleuten leicht unter Verwendung der hierin enthaltenen Informationen und Verweise sowie unter nach dem Stand der Technik bekannten Techniken hergestellt werden (siehe beispielsweise Sambrook, Fritsch und Maniatis, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, und Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1992). Zu diesen Techniken gehören (i) der Einsatz der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Amplifizieren von Proben einer solchen Nucleinsäure, z. B. aus genomischen Quellen, (ii) chemische Synthese oder (iii) die Herstellung von cDNA-Sequenzen. DNA, die für XRCC4 und DNA-Ligase IV-Fragmente kodiert, kann erzeugt und auf jede geeignete Weise erzeugt werden, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, darunter durch Verwendung von kodierender DNA, Identifizierung geeigneter Restriktionsenzym-Erkennungsstellen an beiden Seiten des zu exprimierenden Abschnitts und Ausschneiden des Abschnitts aus der DNA. Der Abschnitt kann dann in einem standardmäßigen im Handel erhältlichen Expressionssystem operabel an einen geeigneten Promotor gebunden werden. Ein anderer rekombinanter Ansatz besteht darin, den relevanten Abschnitt der DNA mit geeigne ten PCR-Primern zu amplifizieren. Modifikationen an den XRCC4- oder DNA-Ligase IV-Sequenzen können beispielsweise unter Einsatz von stellengerichteter Mutagenese vorgenommen werden, um zur Expression von modifiziertem XRCC4- oder DNA-Ligase IV-Peptid zu führen oder Kodon-Präferenz in den zum Exprimieren der Nucleinsäure verwendeten Wirtszellen zu berücksichtigen.
Um die Expression der Nucleinsäuresequenzen zu erreichen, können die Sequenzen in einen Vektor aufgenommen werden, der eine oder mehrere Steuerungssequenzen aufweist, die operabel an die Nucleinsäure gebunden sind, um ihre Expression zu steuern. Die Vektoren können andere Sequenzen wie Promotoren und Verstärker umfassen, um die Expression der inserieren Nucleinsäure anzutreiben, Nucleinsäuresequenzen, damit das Polypeptid oder Peptid als Fusion erzeugt wird, und/oder Nucleinsäure, die für Sekretionssignale kodiert, damit das in der Wirtszelle erzeugte Polypeptid aus der Zelle ausgeschieden wird. Polypeptid kann dann erhalten werden, indem die Vektoren in Wirtszellen transformiert werden, in denen der Vektor funktionell ist, die Wirtszellen kultiviert werden, so dass das Polypeptid erzeugt wird, und das Polypeptid aus den Wirtszellen oder dem umgebenden Medium gewonnen wird. Prokarotische und eukaryotische Zellen werden nach dem Stand der Technik für diesen Zweck verwendet, darunter Stämme von E. coli, Hefe und eukaryotischen Zellen wie COS- oder CHO-Zellen.
Somit umfasst die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids oder Peptids (wie offenbart), wobei das Verfahren die Expression aus Nucleinsäure umfasst, die für das Polypeptid oder Peptid kodiert (im Allgemeinen Nucleinsäure gemäß vorliegender Erfindung). Das kann zweckmäßig erfolgen, indem eine Wirtszelle in Kultur, die einen solchen Vektor enthält, unter geeigneten Bedingungen gezüchtet wird, die die Expression des Polypeptids bewirken oder zulassen. Polypeptide und Peptide können auch in In-vitro-Systemen, wie z. B. Reticulozyt-Lysat, exprimiert werden.
Systeme zum Klonieren und Exprimieren eines Polypeptids in einer Vielzahl verschiedener Wirtszellen sind bekannt. Geeignete Wirtszellen sind Bakterien, eukaryotische Zel len, wie z. B. Säugetier- und Hefezellen, sowie Bacullovirus-Systeme. Zu den Säugetier-Zelllinien, die nach dem Stand der Technik zur Expression eines heterologen Polypeptids verfügbar sind, gehören Chinahamster-Eierstockzellen, HeLa-Zellen, Babyhamster-Nierenzellen, COS-Zellen und viele andere. Ein üblicher bevorzugter bakterieller Wirt ist E. coli.
Es können geeignete Vektoren gewählt oder konstruiert werden, die angemessene Regulationssequenzen enthalten, einschließlich Promotorsequenzen, Terminatorfragmenten, Polyadenylierungssequenzen, Verstärkersequenzen, Markergenen und andere Sequenzen, wie angemessen. Vektoren können nach Maßgabe Plasmide, virale Vektoren, z. B. Phagen oder Phagemide, sein. Weitere Details siehe beispielsweise Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 2. Aufl., Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Viele bekannte Techniken und Protokolle zur Manipulation von Nucleinsäure, beispielsweise bei der Herstellung von Nucleinsäurekonstrukten, Mutagenese, Sequenzierung, Einführung von DNA in Zellen und Genexpression, sowie Analyse von Proteinen, werden, im Detail in Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1992, beschrieben.
Somit stellt ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Wirtszelle bereit, die heterologe Nucleinsäure wie hierin offenbart enthält.
Die erfindungsgemäße Nucleinsäure kann in das Genom (z. B. Chromosom) der Wirtszelle integriert werden. Die Integration kann nach Standardtechniken durch die Aufnahme von Sequenzen gefördert werden, die die Rekombination mit dem Genom fördern. Die Nucleinsäure kann sich auf einem extrachromosomalen Vektor innerhalb der Zelle befinden oder auf andere Weise identifizierbar heterolog oder fremd gegenüber der Zelle sein.
Ein wieder anderer Aspekt stellt ein Verfahren bereit, das das Einführen der Nucleinsäure in eine Wirtszelle umfasst. Für das Einführen, das (insbesondere beim Einführen in vi tro) allgemein ohne Einschränkung als "Transformation" bezeichnet werden kann, kann jede verfügbare Technik eingesetzt werden. Bei eukaryotischen Zellen können geeignete Techniken Calciumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextran, Elektroporation, Liposomvermittelte Transfektion und Transduktion unter Verwendung von Retrovirus oder eines anderen Virus, z. B. Vaccinia oder, bei Insektenzellen, Baculovirus, umfassen. Für bakterielle Zellen können geeignete Techniken Calciumchlorid-Transformation, Elektroporation und Transfektion unter Verwendung von Bacteriophagen umfassen. Als Alternative könnte direkte Injektion der Nucleinsäure eingesetzt werden.
Markergene, wie Antiobiotikaresistenz- oder -empfindlichkeitsgene, können beim Identifizieren von Klonen verwendet werden, die Nucleinsäure von Interesse enthalten, wie nach dem Stand der Technik bekannt ist.
Dem Einführen kann das Bewirken oder Zulassen von Expression aus der Nucleinsäure folgen, beispielsweise durch Kultivieren von Wirtszellen (die Zellen umfassen können, die tatsächlich transformiert sind, wobei es jedoch wahrscheinlicher ist, dass die Zellen Nachkommen der transformierten Zellen sind) unter Bedingungen zur Expression des Gens, so dass das Polypeptid (oder Peptid) erzeugt wird, für das kodiert wird. Wenn das Polypeptid an ein geeigneter Signalleaderpeptid gekoppelt exprimiert wird, kann es aus der Zelle in das Kulturmedium ausgeschieden werden. Nach der Produktion durch Expression kann ein Polypeptid oder Peptid je nach Fall aus der Wirtszelle und/oder Kulturmedium isoliert und/oder gereinigt werden, und daraufhin nach Wunsch verwendet werden, beispielsweise bei der Formulierung einer Zusammensetzung, die eine oder mehrere zusätzliche Komponenten umfassen kann, wie z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen) oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Exzipienten, Vehikel oder Träger umfasst (siehe beispielsweise unten).
Das Einführen von Nucleinsäure, die für ein Peptidylmolekül gemäß vorliegender Erfindung kodiert, kann in vivo durch Gentherapie erfolgen, um die Wechselwirkung zwischen XRCC4 oder DNA-Ligase IV zu zerstören oder zu stören.
So kann eine Wirtszelle, die Nucleinsäure gemäß vorliegender Erfindung enthält, beispielsweise als Ergebnis des Einführens der Nucleinsäure in die Zelle oder in einen Vorfahren der Zelle und/oder genetischer Veränderung der Sequenz, die für die Zelle oder den Vorfahren endogen ist (wobei das Einführen oder die Veränderung in vivo oder ex vivo erfolgen kann) innerhalb eines Organismus (beispielsweise in der Soma) enthalten sein, der ein Tier, insbesondere ein Säugetier ist, das ein Mensch oder ein anderes Tier sein kann, beispielsweise Kaninchen, Meerschweinchen, Ratte, Maus oder ein anderes Nagetier, Katze, Hund, Schwein, Schaf, Ziege, Rind oder Pferd, oder ein Vogel ist, wie z. B. ein Huhn. Genetisch modifiziere oder transgenische Tiere oder Vögel, die eine solche Zelle umfassen, werden als weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung ebenfalls bereitgestellt.
Das kann ein therapeutisches Ziel haben. (Gentherapie wird nachstehend erörtert.) Auch kann das Vorhandensein einer Mutanten-, Allelen-, Derivat- oder Varianten-Sequenz innerhalb von Zellen eines Organismus, insbesondere anstelle einer homologen endogenen Sequenz, es zulassen, den Organismus als Modell beim Testen und/oder Untersuchen von Substanzen zu verwenden, die die Aktivität des kodierten Polypeptids in vitro modulieren oder auf andere Weise als therapeutisches Potential aufweisend indiziert sind. Beispielsweise können Knockout-Mäuse verwendet werden, um in Bezug auf Strahlenempfindlichkeit zu testen. Zweckmäßig können jedoch zumindest vorläufige Tests für solche Substanzen in vitro durchgeführt werden, d. h. innerhalb von Wirtszellen oder in zellfreien Systemen. Wenn eine Wirkung einer Testverbindung an Zellen in vitro festgestellt worden ist, können diese Zellen oder Zellen eines gleichen oder ähnlichen Typs zum Testen in vivo in ein geeignetes Wirtstier eingepflanzt werden.
Geeignete Screeningverfahren sind nach dem Stand der Technik bekannt. Dazu gehören Techniken wie Radioimmuntest, Szintillationsproximetrietest und ELISA-Verfahren. Geeigneterweise werden entweder das XRCC4-Protein oder ein Fragment oder DNA-Ligase IV oder ein Fragment oder ein Analog, ein Derivat, eine Variante oder ein funktionelles Mimetikum davon immobilisiert, woraufhin das andere in Gegenwart der getesteten Mittel angewandt wird. Bei eine Szintillationsproximetrietest wird ein biotinyliertes Proteinfragment an mit Streptavidin beschichtete szintilierend imprägnierte Perlen (hergestellt von Amersham) gebunden. Die Bindung von radiomarkiertem Peptid wird dann durch die Bestimmung von durch Radioaktivität herbeigeführter Szintillation gemessen, wenn sich das radioaktive Peptid an das immobilisierte Fragment bindet. Mittel, die das stören, sind somit Inhibitoren der Wechselwirkung. Weitere Wege und Mittel zum Screenen auf Mittel, die die Wechselwirkung zwischen XRCC4 und DNA-Ligase IV modulieren, werden nachstehend erörtert.
Gemäß einem allgemeinen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Testverfahren für eine Substanz mit der Möglichkeit bereit, die Wechselwirkung oder Bindung zwischen XRCC4 und DNA-Ligase IV zu modulieren, beispielsweise zu zerstören oder zu stören, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:

(a) das In-Kontakt-Bringen einer Substanz gemäß vorliegender Erfindung, die ein Peptidfragment von XRCC4 oder ein Derivat, eine Variante oder ein Analog davon umfasst, wie offenbart, einer Substanz, die das relevante Fragment von DNA-Ligase IV oder eine Variante, ein Derivat oder ein Analog davon umfasst, und einer Testverbindung, unter Bedingungen, worin, wenn die Testverbindung kein Inhibitor für Wechselwirkung oder Bindung zwischen den Substanzen ist, die Substanzen in Wechselwirkung treten oder sich verbinden; und
(b) das Bestimmen der Wechselwirkung oder Bindung zwischen den Substanzen.

Daher kann eine Testverbindung identifiziert werden, die die Bindung oder Wechselwirkung zwischen den Substanzen (beispielsweise einschließlich eines XRCC4-Frgemnts und einschließlich eines DNA-Ligase IV-Fragments) zerstört, verringert, stört oder ganz oder teilweise beseitigt, und die XRCC4- und/oder DNA-Ligase IV-Aktivität modulieren kann.
Ein weiterer allgemeiner Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht ein Testverfahren für eine Substanz vor, die fähig ist, die relevante Region von XRCC4 und DNA-Ligase IV je nach Fall zu binden, wobei das Verfahren umfasst:

(a) das In-Kontakt-Bringen einer Substanz, die ein Peptidfragment von XRCC4, das mit DNA-Ligase IV in Wechselwirkung tritt, wie offenbart, oder ein Peptidfragment von DNA-Ligase IV, das mit XRCC4 in Wechselwirkung tritt, oder eine Variante, ein Derivat oder ein Analog eines solchen Peptidfragments umfasst, wie offenbart, mit einer Testverbindung; und
(b) das Bestimmen der Wechselwirkung zwischen den Substanzen und der Testverbindung.

Eine Testverbindung, von der festgestellt wird, dass sie sich an den relevanten Abschnitt von XRCC4 bindet, kann auf die Fähigkeit getestet werden, die XRCC4-Wechselwirkung oder Bindung mit DNA-Ligase IV zu modulieren, z. B. zu zerstören oder zu stören, und/ oder auf die Fähigkeit, DNA-Ligase IV- und/oder XRCC4-Aktivität oder eine andere Aktivität zu beeinflussen, die von XRCC4 oder DNA-Ligase IV vermittelt wird, wie oben bereits erörtert.
Auf ähnliche Weise kann eine Testverbindung, von der festgestellt wird, dass sie sich an den relevanten Abschnitt von DNA-Ligase IV bindet, auf die Fähigkeit getestet werden, DNA-Ligase IV-Wechselwirkung oder Bindung mit XRCC4 zu modulieren, z. B. zu zerstören oder zu stören, und/oder die Fähigkeit, XRCC4- und/oder DNA-Ligase IV-Aktivität oder eine andere Aktivität zu beeinflussen, die von DNA-Ligase IV oder XRCC4 vermittelt wird, wie oben bereits erörtert.
Diese Aspekte gelten gleichermaßen für die Wechselwirkung zwischen DNA-PKcs/Ku und XRCC4. Weiters kann, da DNA-PKcs XRCC4 phosphoryliert, das Bestimmen der derartigen Phosphorylierung in einem geeigneten Test eingesetzt werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Testverfahren bereit, das Folgendes umfasst:

(a) das In-Kontakt-Bringen einer Substanz, die zumindest ein Fragment von DNA-PKcs/Ku umfasst, das XRCC4 phosphoryliert, einer Substanz, die zumindest ein Fragment von XRCC4 umfasst, das eine von DNA-PKcs/Ku phosphorylierte Stelle umfasst, und einer Testverbindung; und
(b) das Bestimmen der Phosphorylierung an dieser Stelle Selbstverständlich kann bei einem solchen Test jede geeignete Variante oder jedes geeignete Derivat von DNA-PKcs/Ku und/oder XRCC4 eingesetzt werden.

Die Phosphorylierung kann beispielsweise durch das Immobilisieren von XRCC4 oder eines Fragments, einer Variante oder eines Derivats davon beispielsweise auf einer Perle oder Platte und durch Detektieren der Phosphorylierung unter Verwendung eines Antikörpers oder eines anderen Bindungsmoleküls erfolgen, der bzw. das sich mit einer anderen Affinität an die relevante Phosphorylierungsstelle bindet, wenn die Stelle phosphoryliert ist, als dann, wenn die Stelle nicht phosphoryliert ist. Derartige Antikörper können durch jede Standardtechniken wie an anderer Stelle in der vorliegenden Beschreibung erörtert erhalten werden, beispielsweise unter Verwendung eines phosphorylierten Peptids (wie eines XRCC4-Fragments). Die Bindung eines Bindungsmoleküls, das zwischen der phosphorylierten und der nicht phosphorylierten Form von XRCC4 oder eines bzw. einer relevanten Fragments, Variante oder Derivats davon unterscheidet, kann unter Einsatz einer jeden Technik bewertet werden, die für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung zur Verfügung steht, die die Bestimmung des Vorhandenseins einer geeigneten Markierung, wie Fluoreszenz, umfassen kann. Die Phosphorylierung kann durch Immobilisierung von XRCC4 oder eines Fragments, einer Variante oder eines Derivats davon auf einem geeigneten Substrat, wie einer Perle oder Platte, bestimmt werden, worin das Substrat mit Szintillierungsmittel imprägniert ist, wie bei einem Standard-Szintillationsproximetrietest, wobei die Phosphorylierung über die Messung der Aufnahme von radioaktivem Phosphat bestimmt wird. Anstelle der Immobili sierung von XRCC4 kann seine Phosphorylierung durch DNA-PKcs/Ku getestet werden, indem seine Radio- oder andere Markierung in Lösung zugelassen werden, wobei ein geeignetes spezifisches Bindungselement, wie ein Antikörper oder DNA-Ligase IV oder ein XRCC4-Bindungsfragment davon verwendet wird, um es zum Bestimmen der Markierung herauszuziehen. Die Phosphataufnahme in XRCC4 oder ein Fragment, eine Variante oder ein Derivat davon kann durch Fällung mit Säure, wie z. B. Trichloressigsäure, und Sammeln des Präzipitats auf einem geeigneten Material, wie z. B. Nitrozellulose-Filterpapier, gefolgt vom Messen der Aufnahme von radiomarkiertem Phosphat, bestimmt werden. SDS-PAGE-Trennung des Substrats kann gefolgt von der Detektion der Radiomarkierung eingesetzt werden.
Ein weiterer allgemeiner Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Testverfahren für eine Substanz beriet, die in der Lage ist, die Aktivität von DNA-Ligase IV bei Wechselwirkung mit XRCC4 zu beeinflussen, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

(a) das In-Kontakt-Bringen von DNA-Ligase IV mit einer Testverbindung in Gegenwart von XRCC4 ; und
(b) das Bestimmen von DNA-Ligase IV-Aktivität.

DNA-Ligase IV kann in Gegenwart oder Abwesenheit von XRCC4 bestimmt werden, um zu ermöglichen, dass eine Wirkung einer Testverbindung auf die Aktivität einer Wirkung auf die Wechselwirkung zwischen DNA-Ligase IV und XRCC4 zugeschrieben wird.
DNA-Ligase IV-Aktivität kann zweckmäßig durch seine Adenylierung bestimmt werden. DNA-Ligase IV kann mit radiomarkiertem ATP (z. B. wie nachstehend beschrieben) oder jedem geeigneten ATP-Analog inkubiert werden, das auf analoge Weise mit DNA-Ligase IV in Wechselwirkung tritt, so dass Radiomarkierung in die Ligase aufgenommen wird. (Die Ligase durchläuft einen Enzym-AMP-adenyliertes Zwischenstadium.) Eine derartige Aufnahme von Radiomarkierung kann durch verschiedene Ansätze detektiert werden, darunter beispielsweise Szintillationsproximetrietest. So kann die Radiomarkierung von DNA-Ligase IV in Gegenwart und Abwesenheit von Testverbindung und in Gegenwart und Abwesenheit von XRCC4 bestimmt werden. Präadenylierung von DNA-Ligase IV mit Radiomarkierung ermöglicht das Testen auf Abgabe der Radiomarkierung.
Eine weitere Aktivität von DNA-Ligase IV, die bestimmt werden kann, ist DNA-Ligase IV-vermittelte DNA-Strangverbindung. Beispielsweise können zwei DNA-Moleküle bereitgestellt werden, die jeweils eine Stelle umfassen, an die ein PCR-Primer unter geeigneten Bedingungen anneliert wird. Wenn die beiden DNA-Moleküle durch DNA-Ligase IV kovalent verbunden sind, um ein einzelnes DNA-Molekül zu bilden, entsteht ein PCR-Templat, das unter Verwendung der Primer amplifiziert werden kann. Ohne Ligation entsteht kein PCR-Produkt. Die bei einer bestimmten Reaktion erhaltene Menge an PCR-Produkt kann in Bezug auf die DNA-Ligase-Aktivität quantifiziert werden. Eine weitere Option besteht darin, ein DNA-Molekül an einen unlöslichen Träger zu binden und ein weiteres markierte DNA-Molekül hinzuzufügen. Nach der Zugabe von DNA-Ligase IV in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung und einem Waschschritt kann das Binden des zweiten Moleküls an den Träger, das nur über Ligation an das an den Träger gebundene DNA-Molekül stattfinden kann, durch die Markierung bestimmt und mit DNA-Ligase IV-Aktivität in Bezug gesetzt werden. Ein weiterer Test kann DNA-Endenverbindung umfassen, wie beispielsweise von Gawunder et al., 1997, beschrieben.
Eine Substanz, von der festgestellt wird, dass sie DNA-Ligase IV-Aktivität in Gegenwart von XRCC4 modulieren kann, kann bei einem ähnlichen Test und Verwendung von DNA-Ligase 1 und/oder DNA-Ligase III eingesetzt werden, um die Spezifität für DNA-Ligase IV zu beurteilen.
Der Durchführung eines Testverfahrens gemäß vorliegender Erfindung kann das Isolieren und/oder die Herstellung und/oder Verwendung einer Verbindung, einer Substanz oder eines Moleküls folgen, das einen positiven Test bezüglich der Fähigkeit ergibt, die Wechselwirkung zwischen XRCC4 und DNA-Ligase IV zu modulieren und/oder XRCC4 oder DNA-Ligase IV-Aktivität oder eine vermittelte Aktivität zu hemmen.
Das genaue Format eines erfindungsgemäßens Tests kann von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung unter Einsatz von Routinefähigkeiten und -wissen variiert werden. Beispielsweise kann die Wechselwirkung zwischen Substanzen in vitro untersucht werden, indem eine mit einer detektierbaren Markierung markiert und mit der anderen in Kontakt gebracht wird, die auf einem festen Träger immobilisiert worden ist. Zu den geeigneten detektierbaren Markierungen, insbesondere für Peptidylsubstanzen, gehört ³⁵S-Methionin, das in rekombinant erzeugte Peptide und Polypeptide aufgenommen werden kann. Rekombinant erzeugte Peptide und Polypeptide können auch als Fusionsprotein exprimiert werden, das ein Epitop enthält, das mit einem Antikörper markiert werden kann.
Das Protein, das auf einem festen Träger immobilisiert wird, kann unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Protein immobilisiert werden, der an einen festen Träger gebunden ist, oder über andere Techniken, die an sich bekannt sein. Bei einer bevorzugten Wechselwirkung in vitro kann ein Fusionsprotein verwendet werden, das Glutathion-S-transferase (GST) umfasst. Diese kann auf Glutathionagarose-Perlen immobilisiert sein. Bei einem In vitro-Testformat des oben beschriebenen Typs kann eine Testverbindung getestet werden, indem ihre Fähigkeit bestimmt wird, die Menge an markiertem Peptid oder Polypeptid bestimmt wird, die sich an das immobilisierte GST-Fusionspolypeptid bindet. Diese kann bestimmt werden, indem die Glutathion-Agaroseperlen durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese fraktioniert werden. Alternativ dazu können die Perlen gespült werden, um ungebundenes Protein zu entfernen, und die Proteinmenge, die gebunden worden ist, kann durch Zählen der vorhandenen Menge an Markierung beispielsweise in einem geeigneten Szintillationszähler bestimmt wird.
Ein Test gemäß vorliegender Erfindung kann auch die Form eines Tests in vivo haben. Der In-vivo-Test kann in einer Zelllinie, wie einem Hefestamm oder einer Säugetier-Zelllinie, durchgeführt werden, in der die relevanten Polypeptide oder Peptide aus einem oder mehreren Vektoren exprimiert werden, die in die Zelle eingeführt werden.
Die Fähigkeit einer Testverbindung, die Wechselwirkung oder Bindung zwischen XRCC4 und DNA-Ligase IV zu modulieren, kann unter Verwendung eines sogenannten Zwei-Hybrid-Tests bestimmt werden.
Beispielsweise kann ein Polypeptid oder Peptid, das je nach Fall ein Fragment von XRCC4 oder DNA-Ligase IV enthält, oder ein Peptidyl-Analog oder eine Variante davon, wie offenbart, an eine DNA-Bindungsdomäne fusioniert werden, wie jene des Hefe-Transkriptionsfaktors GAL 4. Der GAL 4-Transkriptionsfaktor umfasst zwei funktionelle Domänen. Diese Domänen sind die DNA-Bindungsdomäne (GAL4DBD) und die GAL4-Transkriptionsaktivierungsdomäne (GAL4TAD). Durch Fusionieren eines Polypeptids oder Peptids an eine dieser Domänen und eines anderen Polypeptids oder Peptids an das jeweilige Gegenstück wird ein funktioneller GAL 4-Transkriptionsfaktor nur dann wiederhergestellt, wenn zwei Polypeptide oder Peptid von Interesse in Wechselwirkung treten. Somit kann die Wechselwirkung der Polypeptide oder Peptide unter Verwendung eines Reportergens gemessen werden, das vermutlich an eine GAL 4-DNA-Bindungsstelle gebunden ist, die fähig ist, die Transkription des Reportergens zu aktivieren. Dieses Testformat wird von Fields und Song, Nature 340, 245–246 (1989), beschrieben. Dieser Typ von Testformat kann sowohl bei Säugetierzellen als auch bei Hefe verwendet werden. Andere Kombinationen von DNA-Bindungsdomäne und Transkriptionsaktivierungsdomäne sind nach dem Stand der Technik erhältlich und können bevorzugt werden, wie die LexA-DNA-Bindungsdomäne und die VP60-Transkriptionsaktivierungsdomäne.
Um beispielsweise zur Veranschaulichung ein Lex/VP60-Zwei-Hybrid-Screen herzunehmen, können Hefe- oder Säugetierzellen mit einer Reportergen-Konstruktion transformiert werden, die ein selektives Markerprotein exprimiert (das z. B. für (3-Galactosidase oder Luciferase kodiert). Der Promotor dieses Gens ist so konstruiert, dass er eine Bindungsstelle für das LexA-DNA-Bindungsprotein enthält. Die Genexpression aus diesem Plasmid ist üblicherweise sehr gering. Zwei weitere Expressionsvektoren können in die Hefe transformiert werden, die das selektierbare Marker-Expressionsplasmid enthält, wo bei eine die Kodierungssequenz für das LexA-Gen voller Länge an eine Mehrfachklonierungsstelle gebunden enthält. Diese Mehrfachklonierungsstelle wird verwendet, um ein Gen von Interesse, d. h. das für ein XRCC4- oder DNA-Ligase IV-Polypeptid oder Peptid gemäß vorliegender Erfindung kodiert, im Rahmen auf die LexA-Kodierungsregion zu klonieren. Der zweite Expressionsvektor enthält dann die Aktivierungsdomäne des Herpes simplex-Transaktivators VP16, fusioniert an eine Testpeptidsequenz oder mehr bevorzugt eine Biblitothek von Sequenzen, die für Peptide mit diversen, z. B. statistischen Sequenzen kodieren. Diese zwei Plasmide vereinfachen die Expression aus dem Reporter-Konstrukt, das die selektierbare Markierung enthält, nur dann, wenn das LexA-Fusionskonstrukt mit einer Polypeptid- oder Peptidsequenz in Wechselwirkung tritt, die von der Peptidbibliothek stammt.
Bei einer Modifikation davon, wenn Peptide oder andere Substanzen gesucht werden, die die Wechselwirkung zwischen einem XRCC4-Polypeptid oder Peptid und DNA-Ligase IV-Polypeptid oder Peptid stören, wird das XRCC4- oder DNA-Ligase IV-Polypeptid oder Peptid als Fusion mit der LexA-DNA-Bindungsdomäne und das DNA-Ligase IVoder XRCC4-Polypeptid- oder Peptid-Gegenstück als Fusion mit VP60 eingesetzt, und es umfasst eine dritte Expressionskassette, die sich auf einem eigenen Expressionvektor befinden kann, aus dem ein Peptid oder eine Bibliothek aus Peptiden mit diverser und/ oder statistischer Sequenz exprimiert werden können. Eine Reduktion bei der Reportergen-Expression (z. B. im Fall von β-Galactosidase eine Schwächung der Blaufärbung) resultiert aus dem Vorhandensein eines Peptids, das XRCC4/DNA-Ligase IV-Wechselwirkung zerstört, wobei diese Wechselwirkung für die Transkriptionsaktivierung des β-Galactosidasegens erforderlich ist. Wenn eine Testsubstanz kein Peptidyl ist und nicht aus kodierender Nucleinsäure innerhalb einer solchen dritten Expressionskassette exprimiert werden kann, kann ein ähnliches System eingesetzt werden, wobei die Testsubstanz exogen zugeführt wird.
Wie angeführt können anstelle der Verwendung von LexA und VP60 andere ähnliche Kombinationen von Proteinen eingesetzt werden, die gemeinsam einen funktionellen Transkriptionsaktivator bilden, wie z. B. die GAL4-DNA-Bindungsdomäne und die GAL4-Transkriptionsaktivierungsdomäne.
Wenn ein Zwei-Hybrid-Test durchgeführt wird, um Substanzen zu suchen, welche die Wechselwirkung zwischen zwei Polypeptiden oder Peptiden stören, können vorzugsweise anstelle von Hefezellen Säugetierzellen verwendet werden. Es gelten die gleichen Prinzipien, und geeignete Verfahren sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
Die Menge an Testsubstanz oder -verbindung, die einen erfindungsgemäßen Test zugeführt werden kann, wird normalerweise durch Versuch und Irrtum in Abhängigkeit vom Typ der verwendeten Verbindung bestimmt. Typischerweise können von etwa 0,01 nM bis 100 μM oder höhere Konzentrationen eingesetzt werden, wenn ein Peptid die Testsubstanz ist. Auch ein Molekül mit schwacher Bindung kann eine nützliche Leitverbindung für die weitere Untersuchung und Entwicklung sein.
Verbindungen, die eingesetzt werden können, können natürliche oder synthetische chemische Verbindungen sein, die bei Arzneimittel-Screeningprogrammen zum Einsatz kommen. Extrakte von Pflanzen, die mehrere charakterisierte oder uncharakterisierte Komponenten enthalten, können ebenfalls verwendet werden.
Antikörper, die auf eine Stelle der Wechselwirkung in einem der Proteine gerichtet sind, bilden eine weitere Klasse mutmaßlicher Inhibitorverbindungen. Kandidaten-Inhibitor-Antikörper können charakterisiert und ihre Bindungsregionen bestimmt werden, um Einketten-Antikörper und Fragmente davon bereitzustellen, die für das Abbrechen der Wechselwirkung verantwortlich sind.
Antikörper können unter Einsatz von Techniken erhalten werden, die dem Stand der Technik entsprechen. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern umfassen das Immunisieren eines Säugetiers (z. B. Maus, Ratte, Kaninchen, Pferd, Ziege, Schaf oder Affe) mit dem Protein oder einem Fragment davon. Antikörper können von immunisierten Tieren unter Einsatz einer Vielzahl von Techniken erhalten werden, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, und gescreent werden, vorzugsweise unter Einsatz der Bindung von Antikörper an Antigen von Interesse. Beispielsweise können Western-Blotting-Techniken oder Immunfällung eingesetzt werden (Armitage et al., Nature 357, 80–82 (1992)). Die Isolation von Antikörpern und/oder Antikörper erzeugenden Zellen von einem Tier kann von einem Schritt des Tötens des Tieres begleitet sein.
Als Alternative oder Ergänzung zum Immunisieren eines Säugetiers mit einem Peptid kann ein für ein Protein spezifischer Antikörper von einer rekombinant erzeugten Bibliothek von exprimierten variablen Immunglobulindomänen beispielsweise unter Verwendung von λ-Bakteriophagen oder filamentösem Bakteriophagen erhalten werden, die funktionelle Immunglobulinbindungsdomänen an ihren Oberflächen aufweisen; siehe beispielsweise WO 92/01047. Die Bibliothek kann naiv sein, d. h. aus einer Sequenz konstruiert, die von einem Organismus erhalten wird, der nicht mit einem der Proteine (oder Fragmente) immunisiert worden ist, oder es kann sich um eine handeln, die unter Einsatz von Sequenzen konstruiert wurde, die von einem Organismus erhalten wurden, der dem Antigen von Interesse ausgesetzt worden ist.
Antikörper gemäß vorliegender Erfindung können auf eine Reihe von Arten modifiziert sein. Tatsächlich ist der Begriff "Antikörper" so zu verstehen, dass er jegliche Bindungssubstanz abdeckt, die eine Bindungsdomäne mit der erforderlichen Spezifität aufweist. So umfasst die Erfindung Antikörperfragmente, Derivate, funktionelle Äquivalente und Homologe von Antikörpern, einschließlich synthetischer Moleküle und Moleküle, deren Gestalt die eines Antikörpers nachahmt, der es ihm ermöglicht, sich an ein Antigen oder Epitop zu binden.
Beispiele für Antikörperfragmente, die zur Bindung eines Antigens oder anderen Bindungspartners fähig sind, sind das Fab-Fragment, das aus den VL-, VH-, C1- und CH1-Domänen besteht; das Fd-Fragment, das aus den VH- und CH1-Domänen besteht; das Fv-Fragment, das aus den VL- und VH-Domänen eines einzelnen Arms eines Antikörpers besteht; das dAb-Fragment, das aus einer VH-Domäne besteht; isolierte CDR-Regionen und F(ab')2-Fragmente, eines zweiwertigen Fragments, das zwei Fab-Fragmente umfasst, die durch eine Disulfidbrücke an der Gelenksregion verbunden sind. Einketten-Fv-Fragmente sind ebenfalls enthalten.
Ein Hybridom, das einen monoklonalen Antikörper gemäß vorliegender Erfindung erzeugt, kann genetischer Mutation oder anderen Veränderungen unterzogen werden. Weiters werden Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung verstehen, dass ein monoklonaler Antikörper den Techniken rekombinanter DNA-Technologie unterzogen werden kann, um andere Antikörper oder chimärische Moleküle zu erzeugen, die die Spezifität des ursprünglichen Antikörpers beibehalten. Derartige Techniken können das Einführen von DNA, die für die variable Immunglobulinregion, oder der Komplementarität bestimmenden Regionen (CDRs) eines Antikörpers zu den konstanten Regionen, oder konstanten Regionen plus Rahmenregionen, eines anderen Immunglobulins umfassen. Siehe beispielsweise EP-A-184.187, GB-A-2.188.638 oder EP-A-0.239.400. Klonierung und Expression chimärer Antikörper werden in der EP-A-0.120.694 und der EP-A-0.125.023 beschrieben.
Hybridome, die zur Erzeugung von Antikörper mit erwünschten Bindungseigenschaften fähig sind, liegen im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, ebenso wie Wirtszellen, eukaryotische oder prokaryotische, die für Nucleinsäure kodierende Antikörper (einschließlich Antikörperfragmente) enthalten und zu ihrer Expression fähig sind. Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Herstellung der Antikörper bereit, einschließlich des Züchtens einer Zelle, die fähig ist, den Antikörper unter Bedingungen zu erzeugen, in denen der Antikörper erzeugt und vorzugsweise sekretiert wird.
Die Reaktivitäten von Antikörpern auf einer Probe können durch jedes geeignete Mittel bestimmt werden. Tagging mit individuellen Reportermolekülen ist eine Möglichkeit. Die Reportermoleküle könne direkt oder indirekt detektierbare und vorzugsweise mess bare Signale erzeugen. Die Bindung von Reportermolekülen kann direkt oder indirekt, kovalent, z. B. über eine Peptidbindung, oder nicht kovalent erfolgen. Bindung über eine Peptidbindung kann als Ergebnis der rekombinanten Expression einer Genfusion erfolgen, die für Antikörper und Reportermolekül kodiert.
Ein bevorzugter Modus ist jener durch kovalente Bindung eines jeden Antikörpers mit einem individuellen Fluorochrom-, Phospor- oder Laserfarbstoff mit spektral isolierten Absorptions- oder Emissionseigenschaften. Geeignete Fluorochrome sind Fluorescein, Rhodamin, Phycoerythrin und Texas Red. Zu den geeigneten chromogenen Farbstoffen gehört Diaminobenzidin.
Andere Reporter sind makromolekulare kolloidale Teilchen oder Teilchenmaterial wie Latexperlen, die gefärbt, magnetisch oder paramagnetisch sind, und biologisch oder chemisch aktive Mittel, wie direkt oder indirekt detektierbare Signale erzeugen können, die visuell zu beobachten, elektronisch zu detektieren oder auf andere Weise aufzuzeichnen sind. Diese Moleküle können beispielsweise Enzyme sein, die Reaktionen katalysieren, die Farben entwickeln oder Veränderungen oder Veränderungen in den elektrischen Eigenschaften verursachen. Sie können molekular anregbar sein, so dass Elektronenübergänge zwischen Energiezuständen zu charakteristischen Spektralabsorptionen oder -emissionen führen. Sie können chemische Einheiten umfassen, die in Verbindung mit Biosensoren verwendet werden. Biotin/Avidin- oder Biotin/Streptavidin- und Alkalische Phosphatase-Detektionssysteme können eingesetzt werden.
Die Art des Bestimmens von Bindung ist kein Merkmal der vorliegenden Erfindung, und Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung sind in der Lage, einen geeigneten Modus entsprechend ihrer Präferenz und ihres allgemeinen Wissens zu wählen.
Antikörper können auch beim Reinigen und/oder Isolieren eines Polypeptids oder Peptids gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden, beispielsweise nach der Produktion des Polypeptids oder Peptids durch Expression aus dafür kodierender Nucleinsäure.
Antikörper können in einem therapeutischen Kontext (einschließlich Prophylaxe) nützlich sein, um XRCC4/DNA-Ligase IV-Wechselwirkung in Hinblick darauf abzubrechen, ihre Aktivität zu hemmen. Antikörper können beispielsweise durch Mikroinjektion in eine Zelle, beispielsweise an einer Tumorstelle, eingebracht werden. Antikörper können gemäß vorliegender Erfindung für andere therapeutische und nicht therapeutische Zwecke eingesetzt werden, die an anderer Stelle hierin erörtert werden.
Andere Kandidaten-Inhibitorverbindungen können auf dem Modellieren der dreidimensionalen Struktur eines Polypeptid- oder Peptidfragments und unter Verwendung rationeller Arzneimittelkonstruktion basieren, um potentielle Inhibitorverbindungen mit spezieller Molekülgestalt, -größe und -ladungseigenschaft bereitzustellen.
Eine Verbindung, von der festgestellt wurde, dass sie die Fähigkeit hat, XRCC4- und/ oder DNA-Ligase IV-Aktivität zu beeinflussen, weist in einer Reihe von Kontexten therapeutisches und anderes Potential auf, wie erörtert. Zur therapeutischen Behandlung kann eine solche Verbindung in Kombination mit einer jeden anderen aktiven Substanz verwendet werden, beispielsweise zur Anti-Tumortherapie einer anderen Anti-Tumor-Verbindung oder Therapie, wie Strahlentherapie oder Chemotherapie. In einem solchen Fall muss der Test gemäß vorliegender Erfindung, wenn er in vivo durchgeführt wird, nicht den Grad der Hemmung der Bindung oder der Modulation von DNA-Ligase IV-Aktivität messen, der durch die getestete Verbindung bewirkt wird. Stattdessen kann die Wirkung auf die DNA-Reparatur, homologe Rekombination, Zell-Lebensfähigkeit, Zell-Abtötung (z. B. in Gegenwart oder Abwesenheit von Strahlen- und/oder Chemotherapie), retrovirale Integration usw. gemessen werden. Es kann sein, dass ein solcher modifizierter Test parallel zum oder nach dem Haupttest gemäß vorliegender Erfindung durchgeführt wird, um zu bestätigen, dass eine solche Wirkung das Ergebnis der Hemmung der Bindung oder Wechselwirkung zwischen XRCC4 und DNA-Ligase IV ist, die durch die Inhibitorverbindung erfolgt, und nicht lediglich eine allgemeine toxische Wirkung.
Es sei in Erinnerung gerufen, dass die Erfinder festgestellt haben, dass die Wechselwirkung zwischen XRCC4 und DNA-PKcs/Ku und das Beeinflussen dieser Wechselwirkung ein Teil der verschiedenen Aspekte der vorliegenden Erfindung auf analoge Weise zur Beeinflussung der Wechselwirkung zwischen XRCC4 und DNA-Ligase IV ist. Das Ergebnis der Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes in dieser Hinsicht wird von Leber et al., "The XRCC4 gene product is a target for and interacts with the DNA-dependent protein kinase", J. Biol. Chem. 273(3), 1794 (16. Jan. 1998), bestätigt – gemäß der am 12. Jänner 1998 dem World Wide Web entnommenen Information.
Ein Mittel, das unter Verwendung eines oder mehrerer Primärscreens (z. B. in einem zellfreien System) als eines identifiziert wurde, das die Fähigkeit aufweist, XRCC4 und/ oder DNA-Ligase IV zu binden und/oder die Aktivität von XRCC4 und/oder DNA-Ligase IV zu modulieren, kann unter Einsatz eins oder mehrerer Sekundärscreens weiter bewertet werden. Ein Sekundärscreen kann das Testen bezüglich zellulärer Strahlensensibilisierung und/oder Sensibilisierung für radiomimetische Arzneimittel, das Testen bezüglich einer Beeinträchtigung von V(D)J-Rekombination in einem Transfektionstest und/ oder das Testen bezüglich der Fähigkeit umfassen, durch homologe Rekombination vermitteltes Gen-Targeting zu verstärken. Das kann direkt und/oder unter Verwendung eines Transfektionstests getestet werden, der eine Ablesung erst ergibt, nachdem homologe Rekombination stattgefunden hat (z. B. Co-Transformation oder Co-Transfektion eines zellulären Systems mit zwei Plasmiden umfasst, die homologe Rekombination erfahren müssen, um ein aktives Reportergen zu ergeben (wie Luciferase oder grünes fluoreszierendes Protein), oder homologe Integration transfizierter DNA in das Genom.
Nach der Identifizierung einer Substanz oder eines Mittels, die bzw. das XRCC4- und/ oder DNA-Ligase IV-Aktivität moduliert oder beeinflusst, kann die Substanz oder das Mittel weiter untersucht werden. Weiters kann sie hergestellt und/oder bei der Zubereitung, d. h. Herstellung oder Formulierung, einer Zusammensetzung wie eines Medikaments, einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines Arzneimittels verwendet werden. Diese können an Individuen beispielsweise für einen der an anderer Stelle hierin erörterten Zwecke verabreicht werden.
Wie angeführt, kann das Mittel ein Peptidyl sein, z. B. ein Peptid, das eine Sequenz wie oben angeführt umfasst, oder es kann sich um ein funktionelles Analog eines solchen Peptids handeln.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "funktionelles Analog" auf Peptidvarianten oder organische Verbindungen mit der gleichen funktionellen Aktivität wie das fragliche Peptid, die die Bindung zwischen XRCC4 und DNA-Ligase IV stören können. Beispiele für solche Analoge sind chemische Verbindungen, die so modelliert sind, dass sie der dreidimensionalen Struktur der XRCC4- oder DNA-Ligase IV-Domäne im Kontaktbereich ähnlich sind, und insbesondere der Anordnung der Schlüssel-Aminosäurereste, wie sie in XRCC4 und DNA-Ligase IV erscheinen.
Gemäß einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung die Verwendung der obigen Substanzen bei Verfahren zum Konstruieren oder Screenen bezüglich Mimetika der Substanzen vor.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Konstruieren von Mimetika von XRCC4 oder DNA-Ligase IV bereit, die die biologische Aktivität von DNA-Ligase IV- oder XRCC4-Bindung oder Hemmung, die Aktivität allosterischer Hemmung von DNA-Ligase IV oder XRCC4 und/oder die Aktivität des Modulierens, z. B. Hemmens, von XRCC4/DNA-Ligase IV-Wechselwirkung aufweisen, wobei das Verfahren umfasst:

(i) das Analysieren einer Substanz, die die biologische Aktivität aufweist, um die Aminosäurereste zu bestimmen, die für die Aktivität grundlegend und wichtig sind, zur Definition eines Pharmacophors; und
(ii) das Modellieren des Pharmacophors, um Kandidaten-Mimetika zu konstruieren und/oder zu screenen, die die biologische Aktivität aufweisen.

Geeignete Modellierungstechniken sind nach dem Stand der Technik bekannt. Dazu gehört die Konstruktion sogenannter "Mimetika", die die Untersuchung der funktionellen Wechselwirkungen, des fluorogenen Oligonucleotids und der Moleküle umfasst, und die Konstruktion von Verbindungen, die funktionelle Gruppen enthalten, die auf solche Weise angeordnet sind, dass sie diese Wechselwirkungen reproduzieren könnten.
Das Konstruieren von Mimetika für eine bekannte pharmazeutisch aktive Verbindung ist ein bekannter Ansatz für die Entwicklung von Pharmazeutikas auf Basis einer "Leit"-Verbindung. Das könnte wünschenswert sein, wenn die Synthese der aktiven Verbindung schwierig oder teuer ist oder für ein bestimmtes Verabreichungsverfahren ungeeignet ist, beispielsweise eignen sich Peptide nicht gut als aktive Mittel für orale Zusammensetzungen, da sie dazu neigen, rasch durch Proteasen im Ernährungstrakt abgebaut zu werden. Mimetika-Konstruktion, Synthese und Tests können eingesetzt werden, um das statistische Screenen einer großen Anzahl an Molekülen bezüglich einer Zieleigenschaft zu vermeiden.
Es gibt mehrere Schritte, die üblicherweise bei der Konstruktion eines Mimetikums aus einer Verbindung mit einer bestimmten Zieleigenschaften vorgenommen werden. Zunächst werden die speziellen Teile der Verbindung bestimmt, die entscheidend und/ oder wichtig sind, um die Zieleigenschaft zu bestimmen. Im Fall eines Peptids kann dies gemacht werden, indem systematisch die Aminosäurereste im Peptid variiert werden, beispielsweise indem ein Rest nach dem anderen substituiert wird. Diese Teile oder Reste, die die aktive Region der Verbindung bilden, sind als ihr "Pharmacophor" bekannt.
Sobald das Pharmacophor gefunden worden ist, wird seine Struktur nach seinen physikalischen Eigenschaften modelliert, beispielsweise Stereochemie, Bindung, Größe und/ oder Ladung, wobei Daten von einer Bandbreite von Quellen eingesetzt werden, z. B. spektroskopische Techniken, Röntgenbeugungsdaten und NMR. Computeranalyse, Ähnlichkeitskartierung (welche die Ladung und/oder das Volumen eines Pharmacophors und nicht die Bindung zwischen Atomen modelliert) sowie andere Techniken können bei diesem Modellierungsvorgang eingesetzt werden.
Bei einer Variante dieses Ansatzes werden die dreidimensionale Struktur des Liganden und sein Bindungspartner modelliert. Da kann besonders nützlich sein, wenn der Ligand und/oder der Bindungspartner ihre Ausbildung bei der Bindung ändern, wodurch es dem Modell ermöglicht wird, dies bei der Konstruktion des Mimetikums zu berücksichtigen.
Dann wird ein Templatmolekül ausgewählt, auf das chemische Gruppen aufgepfropft werden können, die das Pharmacophor imitieren. Das Templatmolekül und die darauf aufgepfropften chemischen Gruppen können zweckmäßig so ausgewählt werden, dass das Mimetikum leicht zu synthetisieren ist, wahrscheinlich pharmakologisch annehmbar ist und in vivo nicht abgebaut wird, während es die biologische Aktivität der Leitverbindung beibehält. Das Mimetikum oder die Mimetika, das bzw. die bei diesem Ansatz gefunden wird bzw. werden, kann/können dann gescreent werden, um festzustellen, ob oder in welchem Ausmaß es/sie die Zieleigenschaft aufweist/aufweisen. Weitere Optimierung oder Modifizierung kann dann durchgeführt werden, um ein oder mehrere fertige Mimetika zum Testen in vivo oder zum klinischen Testen zu erhalten.
Das Mimetikum oder die Mimetika, die bei diesem Ansatz gefunden werden, können dann gescreent werden, um festzustellen, ob sie die Zieleigenschaft aufweisen oder in welchem Ausmaß sie sie aufweisen. Weitere Optimierung oder Modifizierung kann dann durchgeführt werden, um ein oder mehrere fertige Mimetika zum Testen in vivo oder zum klinischen Testen zu erhalten.
Mimetika dieses Typs gemeinsam mit ihrem Einsatz in der Therapie bilden einen weiteren Aspekt der Erfindung.
Die vorliegende Erfindung sieht weiters die Verwendung eines Peptids, das eine Sequenz wie offenbart umfasst, oder ein Derivat, einen aktiven Abschnitt, ein Analog, eine Variante oder einen Mimetikum davon, das fähig ist, XRCC4 oder DNA-Ligase IV zu binden und/oder die Wechselwirkung zwischen XRCC4 und DNA-Ligase IV zu modulieren, z. B. zu hemmen, und/oder XRCC4- und/oder DNA-Ligase IV-Aktivität zu modulieren, z. B. zu hemmen, beim Screenen bezüglich einer Substanz vor, die fähig ist, DNA-Ligase IV und/oder XRCC4 zu binden und/oder die Wechselwirkung zwischen XRCC4 und DNA-Ligase IV zu modulieren, z. B. zu hemmen, und/oder XRCC4 und/oder DNA-Ligase IV-Aktivität zu hemmen.
Im Allgemeinen wird eine solche Substanz, beispielsweise ein Inhibitor gemäß vorliegender Erfindung in einer isolierten und/oder gereinigten Form, d. h. im Wesentlichen rein, bereitgestellt. Das kann umfassen, dass es sich um eine Zusammensetzung handelt, wo sie zumindest etwa 90% Wirkbestandteil, mehr bevorzugt zumindest etwa 95 %, mehr bevorzugt zumindest etwa 98% umfasst. Eine solche Zusammensetzung kann jedoch inerte Trägermaterialien oder andere pharmazeutisch und physiologisch annehmbare Exzipienten umfassen. Wie nachstehend angeführt, kann eine Zusammensetzung gemäß vorliegender Erfindung zusätzlich zu einer Inhibitorverbindung wie offenbart ein oder mehrere andere Moleküle zur therapeutischen Verwendung, wie z. B. ein Anti-Tumor-Mittel, umfassen.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich in verschiedenen Aspekten nicht nur auf eine Substanz, die als Modulator für XRCC4- und DNA-Ligase IV-Wechselwirkung und/oder XRCC4- oder DNA-Ligase IV-vermittelte Aktivität, Eigenschaft oder Weg gemäß dem hierin offenbarten identifiziert wird, sondern auch auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, ein Medikament, ein Arzneimittel oder eine andere Zusammensetzung, die eine solche Substanz umfasst, ein Verfahren, das die Verabreichung einer solchen Zusammensetzung an einen Patienten beispielsweise für einen Zweck, der an anderer Stelle hierin offenbar ist, wozu präventive Behandlung gehören kann, die Verwendung einer solchen Substanz bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Verabreichung, beispielsweise für einen an anderer Stelle hierin erörterten Zweck, und ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, das das Mischen einer solchen Substanz mit einem pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten, Vehikel oder Träger und gegebenenfalls anderen Ingredienzien umfasst.
Eine Substanz gemäß vorliegender Erfindung, wie in Inhibitor von XRCC4- und DNA-Ligase IV-Wechselwirkung oder Bindung kann zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder eines Tierkörpers durch Therapie bereitgestellt werden, die die DNA-Reparatur oder andere XRCC4- oder DNA-Ligase IV-vermittelte Aktivität in Zellen, z. B. Tumorzellen, beeinflusst. Andere Zwecke eines Behandlungsverfahrens, bei dem eine Substanz gemäß vorliegender Erfindung eingesetzt wird, werden an anderer Stelle hierin erörtert.
Somit stellt die Erfindung weiters ein Verfahren zum Modulieren von DNA-Reparaturaktivität, insbesondere DSB-Endenverbindung, oder anderer XRCC4- und/oder DNA-Ligase IV-vermittelter Aktivität bereit, beispielsweise für einen an derer Stelle hierin offenbarten Zweck, das die Verabreichung eines Mittels umfasst, das die Bindung von XRCC4 an DNA-Ligase IV-Protein moduliert, hemmt oder blockiert, wobei ein solches Verfahren bei einer Behandlung nützlich ist, bei der eine solche Modulation, Hemmung oder Blockierung wünschenswert ist.
Die Erfindung stellt weiters ein Behandlungsverfahren bereit, das die Verabreichung eines Mittels an einen Patienten umfasst, das die Bindung von XRCC4 an DNA-Ligase IV stört. Beispiele für Zwecke einer solchen Behandlung werden an anderer Stelle hierin erörtert.
Gleichgültig, ob es sich um ein Polypeptid, einen Antikörper, ein Peptid, ein Nucleinsäuremoleküle, ein kleines Molekül, ein Mimetikum oder eine andere pharmazeutisch nützliche Verbindung gemäß vorliegender Erfindung handelt, die an ein Individuum zu verabreichen ist, die Verabreichung erfolgt vorzugsweise in einer "prophylaktisch wirk- Samen Menge" oder einer "therapeutisch wirksamen Menge" (je nach Fall, obwohl die Prophylaxe auch als Therapie betrachtet werden kann), wobei diese ausreicht, um einen Nutzen für das Individuum zu zeigen. Die tatsächlich verabreichte Menge, die Rate und der Zeitverlauf der Verabreichung hängen von der Art und Schwere dessen ab, was behandelt wird. Die Vorschreibung der Behandlung, beispielsweise Entscheidungen bezüglich Dosierung usw., liegt in der Verantwortung von praktischen Ärzten und anderen Medizinern.
Eine Zusammensetzung kann allein oder in Kombination mit anderen Behandlungen verabreicht werden, entweder gleichzeitig oder nacheinander in Abhängigkeit von der zu behandelnden Affektion.
Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß vorliegender Erfindung und zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung können zusätzlich zum Wirkbestandteil einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten, Träger, Puffer, Stabilisator oder andere Materia-lien enthalten, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Derartige Materialien sollten nicht toxisch sein und sollten die Wirksamkeit des Wirkbestandteils nicht beeinträchtigen. Die genaue Beschaffenheit des Trägers oder anderen Materials hängt vom Verabreichungsweg ab, der oral, oder durch Injektion, beispielsweise kutan, subkutan oder intravenös verlaufen kann.
Pharmazeutische Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung können in Tabletten-, Kapsel-, Pulver- oder flüssiger Form vorliegen. Eine Tablette kann einen festen Träger, wie z. B. Gelatine, oder ein Adjuvans umfassen. Flüssige pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen im Allgemeinen einen flüssigen Träger, wie z. B. Wasser, Petroleum, Tier- oder Pflanzenöle, Mineralöl oder synthetisches Öl. Physiologische Kochsalzlösung, Dextrose oder eine andere Saccharidlösung, oder Glykole, wie z. B. Ethylenglykol, Propylenglykol oder Polyethylenglykol, können enthalten sein.
Zur intravenösen, kutanen oder subkutanen Injektion oder Injektion an der betroffenen Stelle liegt der Wirkbestandteil in Form einer parenteral annehmbaren wässrigen Lösung vor, die Pyrogen-frei ist und einen geeigneten pH-Wert, geeignete Isotonie und Stabilität aufweist. Fachleute auf dem Fachgebiet der Erfindung sind durchaus in der Lage, geeignete Lösungen beispielsweise unter Einsatz isotonischer Vehikel, wie z. B. Natriumchlorid-Injektion, Ringer-Injektion, laktierter Ringer-Injektion, herzustellen. Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Puffer, Oxidationshemmer und/oder andere Additive können nach Bedarf enthalten sein.
Liposomen, insbesondere kationische Liposomen, können in Trägerformulierungen verwendet werden.
Beispiele für die oben genannten Techniken und Vorschriften sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., A. Osol (Hrsg.), 1980, zu finden.
Das Mittel kann auf lokalisierte Weise an eine Tumorstelle oder eine andere erwünschte Stelle verabreicht werden oder kann auf eine Art abgegeben werden, in der sie auf Tumor- oder andere Zellen abzielt.
Targeting-Therapien können eingesetzt werden, um die Wirksubstanz spezifischer an bestimmte Zelltypen abzugeben, indem Targeting-Systeme wie Antikörper oder zellspezifische Liganden verwendet werden. Targeting kann aus einer Vielzahl von Gründen wünschenswert sein, beispielsweise, wenn das Mittel inakzeptabel toxisch ist oder wenn es auf andere Weise eine zu hohe Dosis erfordern würde oder wenn es andernfalls nicht in die Zielzellen eindringen könnte.
Anstelle der direkten Verabreichung dieser Mittel können sie in den Zielzellen durch Expression aus einem kodierenden Gen erzeugt werden, das in die Zellen eingeführt wird, beispielsweise in einem viralen Vektor (eine Variante der VDEPT-Technik–siehe unten). Der Vektor kann auf die zu behandelnden spezifischen Zielen abgezielt sein, oder er kann Regulationselemente enthalten, die von den Zielzellen mehr oder weniger selektiv eingeschaltet werden.
Das Mittel (beispielsweise ein kleines Molekül, Mimetikum) kann in einer Vorläuferform verabreicht werden, um durch ein Aktivierungsmittel in die aktive Form umgewandelt zu werden, das in den zu behandelten Zellen erzeugt wird oder darauf abzielt. Diese Art von Ansatz ist manchmal als ADEPT oder VDEPT bekannt, wobei ersteres das Targeting des Aktivators auf die Zellen durch Konjugation an einen zellspezifischen Antikörper umfasst, während letzteres die Produktion des Aktivators, z. B. eines Enzyms, in einem Vektor durch Expression aus kodierender DNA in einem viralen Vektor umfasst (siehe beispielsweise die EP-A-415.731 und WO 90/07936).
Ein Mittel kann in einer Form verabreicht werden, die inaktiv ist aber im Körper in eine aktive Form umgewandelt wird. Beispielsweise kann das Mittel phosphoryliert werden (z. B. um die Löslichkeit zu verbessern), wobei das Phosphat gespalten wird, um eine aktive Form des Mittels im Körper bereitzustellen.
Eine Zusammensetzung kann allein oder in Kombination mit anderen Behandlungen entweder gleichzeitig oder nacheinander verabreicht werden, in Abhängigkeit von der zu behandelnden Affektion, wie Krebs, Virusinfektion oder einer anderen Affektion, bei der eine XRCC4- oder DNA-Ligase IV-vermittelte Wirkung wünschenswert ist.
Nucleinsäure gemäß vorliegender Erfindung, die für ein Polypeptid oder Peptid kodiert, das fähig ist, XRCC4- und DNA-Ligase IV-Wechselwirkung oder Bindung zu modulieren, beispielsweise zu stören, und/oder Aktivität oder anderen XRCC4- oder DNA-Ligase IV-vermittelten zellulären Weg oder Funktion herbeizuführen oder zu modulieren, kann bei Verfahren zur Gentherapie eingesetzt werden, beispielsweise bei der Behandlung von Individuen, beispielsweise mit dem Ziel, eine Störung (ganz oder teilweise) zu verhindern oder zu heilen, oder für einen anderen Zweck, wie an anderer Stelle hierin erörtert.
Vektoren, wie z. B. virale Vektoren, sind nach dem Stand der Technik eingesetzt worden, um Nucleinsäure in eine große Vielzahl verschiedener Zielzellen einzuführen. Typischerweise werden die Vektoren den Zielzellen ausgesetzt, so dass Transfektion in einem ausreichenden Anteil der Zellen stattfinden kann, um für eine nützliche therapeutische oder prophylaktische Wirkung von der Expression des erwünschten Polypeptids zu sorgen. Die transfizierte Nucleinsäure kann permanent in das Genom einer jeden der Target-Zellen aufgenommen werden, wodurch für eine lang andauernde Wirkung gesorgt wird, oder alternativ dazu kann die Behandlung periodisch zu wiederholen sein.
Nach dem Stand der Technik sind eine Vielzahl von Vektoren, sowohl virale Vektoren als auch Plasmidvektoren, bekannt, siehe US-Patent Nr. 5.252.479 und WO 93/07282. Insbesondere sind eine Anzahl von Viren als Gentransfervektoren verwendet worden, einschließlich Papovaviren, wie z. B. SV40, Vaccinia-Virus, Herpesviren, einschließlich HSV und EBV, sowie Retroviren. Bei vielen Gentherapieprotokollen nach dem Stand der Technik sind unwirksam gemachte Mäuse-Retroviren verwendet worden.
Andere bekannte Verfahren zum Einbringen von Nucleinsäure in Zellen als Alternative zur Verwendung viraler Vektoren sind Elektroporation, Cacliumphosphat-Copräzipitation, mechanische Techniken, wie z. B. Mikroinjektion, durch Liposomen vermittelter Transfer und direkte DNA-Aufnahme sowie Rezeptor-vermittelter DNA-Transfer.
Rezeptor-vermittelter Gentransfer, bei dem die Nucleinsäure über Polylysin an einen Proteinliganden gebunden ist, wobei der Ligand für einen Rezeptor spezifisch ist, der auf der Oberfläche der Zielzellen vorhanden ist, ist ein Beispiel für eine Technik zum spezifischen Abzielen mit Nucleinsäure auf bestimmte Zellen.
Ein Polypeptid, Peptid oder eine andere Substanz, die fähig ist, die Wechselwirkung des relevanten Polypeptids, Peptids oder einer anderen Substanz, wie hierin offenbart, zu modulieren oder zu stören, oder ein Nucleinsäuremolekül, das für ein solches Peptidyl-Molekül kodiert, kann in einem Set bereitgestellt sein, beispielsweise dicht in einem ge eigneten Behälter abgeschlossen, der seinen Inhalt vor der Außenumgebung schützt. Ein solches Set kann Anweisungen für die Verwendung enthalten.
BEISPIEL 1
BESTIMMUNG DER BIOLOGISCHEN AKTIVITÄT VON XRCC4
Erzeugung von Antiseren, die XRCC4 erkennen
Mit dem Ziel, Einsichten in den Mechanismus der XRCC4-Wirkung zu erhalten, wurde beschlossen zu versuchen, das menschliche Protein biochemisch zu charakterisieren. Zu diesem Zweck wurden Human-XRCC4 voller Länge und die C-terminate Region von XRCC4, die die Reste 201 bis 344 umfasst, in Escherichia coli als Proteine mit Hexahistidin-Tag exprimiert. Nach der Reinigung bis zur Homogenität wurde jedes Antigen dann verwendet, um polyklonale Antiseren in Kaninchen zu züchten.
Im Verlauf dieser Untersuchungen wurde beobachtet, dass rekombinantes XRCC4 voller Länge auf SDS-PAGE anomal läuft, mit einer scheinbaren Molekülmasse von ~ 55 kDa, was beträchtlich größer als das vorhergesagte Molekulargewicht von 38 kDa ist. Es wurde festgestellt, dass sich Versionen von XRCC4 ohne Tag und mit His-Tag ähnlich verhalten. Der Grund dafür ist zurzeit nicht klar, aber es könnte die Tatsache widerspiegeln, dass XRCC4 einen ungewöhnlich hohen Anteil an Glutaminsäure-Aminosäureresten enthält, wodurch die negative Ladung des Proteins erhöht wird. Ein mögliches Ergebnis davon wäre eine Netto-Verringerung der Menge an SDS, die an das Protein gebunden ist, was die Mobilität von XRCC4 bei SDS-PAGE-Analyse verringert würde.
Westernblot-Analysen zeigten, dass jedes der gezüchteten Anti-XRCC4-Antiseren fähig war, weniger als 1 ng rekombinanten XRCC4-Protein zu erkennen. Um festzustellen, ob diese Antiseren in der Lage sind, endogenes XRCC4 in Säugetier-Zelllysaten zu erken nen, wurden rohe HeLa-Zellkernextrakte SDS-PAGE gefolgt von Western-Immunblot-Analyse unterzogen.
Wichtigerweise wurde von jedem Antiserum, aber keinem der Präimmunantiseren festgestellt, dass es ein HeLa-Zelprotein mit 55 bis 60 kDa erkennt, was gut mit der Größe von rekombinantem XRCC4 übereinstimmt. Außerdem detektiert jedes Immunserum auch schwach mehrere andere Polypeptide. Obwohl die Identitäten dieser nicht ermittelt sind, können einige alternativen Formen von XRCC4 oder seinen proteolytischen Abbauprodukten entsprechen. Beispielsweise stellt eine Bande mit besonderer Wahrscheinlichkeit ein proteolytisches N-terminates XRCC4-Produkt dar, weil es von allen Seren, die gegen das Protein voller Länge gezüchtet wurden, aber nicht von Serum SJ5 erkannt wird, das gegen die C-terminale XRCC4-Region gezüchtet wurde. Interessanterweise war es trotz des hohen Grads an Sequenz-Beibehaltung zwischen XRCC4 bei Nagetieren und Menschen (Li et al., 1995) nicht möglich, XRCC4 in Extrakten von Mäuseoder Hamsterzellen durch direktes Westernblotting unter Verwendung dieser Antikörper zu detektieren. Das könnte teilweise geringe immunologische Kreuzreaktivität zwischen den Menschen- und den Nagetierproteinen widerspiegeln. Jedoch besteht in Hinblick auf die evolutionäre Konservierung von XRCC4 das Modell, das zurzeit bevorzugt wird, darin, dass, wie das bei anderen DNA-DSB-Reparaturfaktoren, wie Ku und DNA-PKcs (Blunt et al., 1995; Finnie et al., 1995; Danska et al., 1996) der Fall ist, XRCC4 in Nagetierzellen in viel geringeren Mengen exprimiert wird als in Menschenzellen (siehe auch unten).
Um die Spezifität von Anti-XRCC4-Antiserum SJ4B weiter zu verstärkten, wurde es Immunaffinitätschromatographie unter Verwendung von XRCC4 unterzogen, das kovalent an Sepharose-Perlen gebunden worden war. Signifikanterweise wird, während das rohe Serum eine Anzahl von Polypeptiden in HeLa-Gesamtzellextrakten zusätzlich zu XRCC4 voller Länge erkennt, ein Großteil der Reaktivität gegenüber den anderen Proteinen in den Durchflussfraktionen erzielt, was dazu führt, dass das affinitätsgereinigte An tikörpermaterial (Eluat) im Vergleich zum unfraktionierten Serum verbesserte Spezifität und Selektivität aufweist.
XRCC4 ist ein nukleares Phosphoprotein und dient als wirksames Substrat für DN-PK in vitro Als erster Schritt zum Bestimmen der biochemischen Funktion von XRCC4 haben die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes beschlossen, zu versuchen, seine subzelluläre Lokalisation zu bestimmen. Nukleare und zytosolische Fraktionen wurden aus HeLa-Zellen hergestellt und wurden Westernblot-Analyse unter Einsatz von affinitätsgereinigtem XRCC4-Antikörper XJ4B unterzogen. Die Integrität der Fraktionen wurde bestimmt, in dem auch mit Antiseren gegen Sp1 sondiert wurde, das sich vorwiegend in der nuklearen Fraktion befindet.
Bemerkenswerterweise zeigten diese Untersuchungen, dass XRCC4 im nuklearen Extrakt vorliegt, wobei geringe Mengen in der zytosolischen Fraktion detektierbar sind. Diese Daten zeigen daher, dass XRCC4 in nukleares Protein ist, und stehen in Einklang mit Modellen, bei denen XRCC4 als Teil eines DNA-DSB-Reparaturapparats dient, beispielsweise wie in 5 dargestellt.
In diesem Modell (das vorgeschlagen wird, ohne das Wesen oder den Schutzumfang irgendeines Aspekts der vorliegenden Erfindung oder einer Ausführungsform davon in irgendeiner Weise einzuschränken) bindet sich Ku an die freien DNA-Enden und rekrutiert DNA-PKcs, wobei die katalytische Kinase-Funktion des Letzteren aktiviert wird. Ein DNA-Ligase IV/XRCC4-Komplex wird dann zum DNA-DSB rekrutiert. Es können ein oder mehrere zusätzliche Komponenten beteiligt sein: einige Möglichkeiten sind durch Fragezeichen angezeigt. Aktives DNA-PK kann auch DNA-Schädigung-Signalisierungsereignisse auslösen oder kann andere DNA-DSB-Reparaturkomponenten phosphorylieren, wie XRCC4, wie von den Erfindern gezeigt worden ist, wodurch ihre Aktivität reguliert wird. Die Stöchiometrie des XRCC4-DNA-Ligase IV-Komplexes dient nur zu Veran schaulichungszwecken. XRCC4 kann mit DNA-Ligase IV an einer beliebigen Stelle innerhalb der Reste 550 bis 884 von Human-DNA-Ligase IV in Wechselwirkung treten, beispielsweise an oder zwischen den BRCT-Domänen.
Während des Verlaufs der obigen Untersuchungen haben die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes beobachtet, das HeLa-XRCC4 reproduzierbar langsamer wandert als rekombinantes XRCC4 auf SDS-PAGE, was darauf hinweist, dass Human-XRCC4 post-translational modifiziert wird. Um zu bestimmen, ob das XRCC4-Phosphorylierung widerspiegelt, wurde HeLa-Nuklearextrakt entweder mock-behandelt, mit λ-Protein- phosphatase behandelt, oder wurde mit λ-Phosphatase in Gegenwart von Phosphataseinhibitoren behandelt.
Signifikanterweise zeigte Western-Analyse dieser Proben, dass λ-Phosphatase die SDS-PAGE-Mobilität von HeLa-XRCC4 erhöht, so dass sie nun der des rekombinanten Proteins entspricht, während diese Wirkung durch Phosphataseinhibitoren aufgehoben wird. Diese Daten zeigen daher, dass XRCC4 in HeLa-Zellen zu hoher Stöchiometrie phosphoryliert wird und weisen darauf hin, dass diese Modifikation eingesetzt wird, um XRCC4-Aktivität in vivo zu modulieren.
Im Lichte dessen und da Zellen mit XRCC4-Defizienz sehr ähnliche Phenotypen wie jene aufweisen, die in Bezug auf Komponenten von DNA-PK defektiv sind, haben die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes getestet, ob DNA-PK XRCC4 in vitro phosphorylieren kann. XRCC4 dient tatsächlich als wirksames Substrat für DNA-abhängige Phosphorylierung durch DNA-PK, und so kann DNA-PK XRCC4-Aktivität innerhalb der Zelle steuern.
Endogenes XRCC4 scheint mit einem anderen Protein bzw. anderen Proteinen komplexiert zu werden Es gibt verschiedene Möglichkeiten, wie XRCC4 bei der DNA-DSB-Reparatur und V(D)J-Rekombination funktionieren könnte.
Eine Möglichkeit, die die Erfinder in Erwägung gezogen haben, besteht darin, dass es direkt mit DNA in Wechselwirkung tritt und eine Rolle bei der Reparatur von DNA-Schädigung oder Signalisierung ihres Vorliegens an die Zelle spielt. Es war jedoch nicht möglich, Bindung von rekombinantem XRCC4 an verschiedene DNA-Spezies in elektrophoretischen Mobilitätsverlagerungstests zu detektieren. Weiters strömt, wenn HeLa-Nuklearextrakte durch DNA-Agarosesäulen unter Salzkonzentrationen hindurchgeschickt werden, in denen viele DNA-Bindungsproteine beibehalten werden, der Großteil des endogenen XRCC4 hindurch.
Diese Daten sprechen daher dafür, dass sich XRCC4 nicht besonders leicht an DNA bindet.
Eine weitere mögliche Rolle für XRCC4, die die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes in Betracht gezogen haben, besteht darin, dass es mit einer anderen Komponente des DNA-DSB-Reparaturapparats in Wechselwirkung tritt. Als Ansatz zur Beschäftigung mit diesem Gedanken wurde die biochemische Fraktionierung von XRCC4 und anderen bekannten und potentiellen DNA-DSB-Reparaturfaktoren bei Gelfiltrationschromatographie auf Superose-6 untersucht. Um mögliche nicht-spezifische Protein-Protein-Assoziationen zu zerstören, wurden derartige Versuche unter verschärften Bedingungen von 1 M NaCl durchgeführt.
Diese Untersuchungen zeigten, dass rekombinantes XRCC4 ohne Tag auf eine Weise eluiert, die mit einer Masse von knapp über 66 kDa in Einklang steht, was größer als das vorhergesagte XRCC4-Monomer-Molekulargewicht (Li et al., 1995) und seine scheinba re Masse wie durch SDS-PAGE ermittelt ist. Das weist entweder darauf hin, dass XRCC4 ein monomeres Protein mit Gestalteigenschaften ist, die bewirken, dass es sich bei Gelfiltration anormal verhält, oder in Lösung als Multimer, am wahrscheinlichsten als Dimer, vorliegt.
Am signifikantesten ist, dass Gelfiltrationsanalyse von HeLa-Nuklearextrakt in Gegenwart von 1 M NaCl zeigt, dass endogenes XRCC4 auf eine Art fraktioniert, die mit einer Molekülmasse von etwa 200 kDa in Einklang steht, was deutlich höher als jene für rekombinantes XRCC4 ist. Diese Daten weisen daher stark darauf hin, dass HeLa mit einem anderen Protein oder anderen Proteinen assoziiert ist. Es wurde der gleiche Satz Gelfiltrationsfraktionen wie oben für XRCC4 getestet verwendet und auf das Vorhandensein von Ku, DNA-PK_CS und DNA-Ligase I, III und IV untersucht.
Signifikanterweise war, obwohl in jedem Fall eine gewisse Überlappung erkennbar war, das XRCC4-Eluierungsprofil nicht parallel zu jenen, die sich für DNA-Ligase I, Ku oder DNA-PK_CS zeigten. So erreichte Ligase I einen Spitzenwert bei ~ 150 kDa, was etwas größer als das vorhergesagte Molekulargewicht von 1–2 kDa ist, DNA-PK_CS (465 kDa) eluierte bei etwa 200 kDa, was darauf hinweisen kann, dass die Tertiärstruktur von DNA-PK unter diesen Bedingungen aufgebrochen wird, und die Ku-Eluierung erreichte einen Spitzenwert bei ~ 150 kDa, was mit der vorhergesagten Größe eines Ku70/Ku80-Heterodimers in Einklang steht.
Im deutlichen Gegensatz wurde festgestellt, dass das Eluierungsprofil von XRCC4 weitgehend identisch mit jenen von DNA-Ligase III und IV war. Diese Ergebnisse ließen daher die Möglichkeit erkennen, dass XRCC4 in stabiler Assoziation mit DNA-Ligase III oder IV vorliegt.
HeLa-Zellen-XRCC4 wird mit DNA-Ligase IV co-immungefällt Um weiter auf mögliche Wechselwirkungen zwischen XRCC4 und den oben beschriebenen Faktoren zu testen, wurde XRCC4 von seinen Spitzen-Gelfiltrationsfraktionen in Gegenwart von 1 M NaCl und 50 μg/ml Ethidiumbromid immungefällt (um nicht-spezifische, über DNA vermittelte Wechselwirkung zu beseitigen) und das resultierende gefällte Material auf das Vorhandensein von Ku, DNA-PK_CS sowie die Ligasen I, III und IV getestet. Signifikanterweise zeigten Westernimmunblot-Analysen, dass DNA-PK_CS, Ku und DNA-Ligase I, die in den XRCC4-Fraktionen vorhanden waren, nicht mit XRCC4 coimmungefällt wurden, was bestätigt, dass XRCC4 unter diesen Testbedingungen nicht stabil mit einem dieser Faktoren in Wechselwirkung tritt. Es ist jedoch anzumerken, dass die Erfinder, wie an anderer Stelle hierin erörtert, festgestellt haben, dass DNA-PKcs/Ku mit XRCC4 unter anderen Bedingungen in Wechselwirkung treten kann. Sie haben auch gezeigt, dass es XRCC4 phosphoryliert, was natürlich eine gewisse Wechselwirkung zwischen den Proteinen erfordert. Das wird von Leber et al. "The XRCC4 gene product is a target for and interacts with the DNA-dependent protein kinase", ). Biol. Chem 273(3), 1794 (16. Jan. 1998) bestätigt – nach Informationen, die am 12. Jänner 1998 dem World Wide Web entnommen wurden.
Um auf mögliche Wechselwirkungen zwischen XRCC4 und einem DNA-Ligaseenzym zu testen, wurde die Tatsache genutzt, dass Säugetier-DNA-Ligasen kovalent gebundene Adenylatkomplexe bilden (Tomkinson et al., 1991; Wei et al., 1995; Danska et al., 1996; Robins und Lindahl, 1996). Wenn die XRCC4 enthaltende Gelfiltrationsfraktion mit [α-³²P]-ATP inkubiert wurde und dann durch SDS-PAGE gefolgt von Autoradiographie untersucht wurde, wurden adenylierte Proteine mit etwa 120 kDa und 100 kDA detektiert, was DNA-Ligase f bzw. einem Gemisch aus den DNA-Ligasen III und IV entspricht.
Um festzustellen, ob sich eine dieser Ligasen mit XRCC4 assoziiert, wurde unmarkierter Extrakt mit Präimmun- oder Anti-XRCC4-Antiseren in Gegenwart von 1 M NaCl inku biert, und dann, nach Waschen unter verschärften Bedingungen wurde das immungefällte Material mit [α -³²P]-ATP inkubiert und auf radioaktiv markierte adenylierte Proteine getestet.
Signifikanterweise zeigten diese Untersuchungen, dass eine adenylierte Proteinspezies mit 100 kDa, was DNA-Ligase III und/oder IV entspricht, effizient durch das affinitätsgereinigte XRCC4-Antiserum immungefällt wird, aber nicht durch Präimmunseren. Im Gegensatz dazu wird die adenylierte Spezies, die DNA-Ligase I entspricht, nicht gewonnen. Es ist wichtig und steht in Einklang mit der Tatsache, dass die Adenylatgruppierung von adenylierten DNA-Ligase-Komplexen in Gegenwart von ligierbaren Polynucleotidsubstraten abgegeben wird, dass Radiomarkierung, die mit dem XRCC4-gefällten Material assoziiert ist, bei Inkubation in Gegenwart von DNA verloren geht, die durch Behandlung mit DNase l genickt worden ist.
Um die Möglichkeit auszuschließen, dass die immungefällte Ligase direkt durch das Anti-XRCC4-Antiserum erkannt wurde, wurden parallele Immunpräzipitationsreaktionen an Extrakten durchgeführt, die von den Hamsterzellllinien K1 und XR-1 stammten, die XRCC4-Protein enthalten bzw. nicht enthalten. Es ist wichtig, dass die adenylierte Ligasespezies mit 100 kDa von K1-Extrakten, aber nicht von XR-1-Extrakten gewonnen wird. Diese Daten zeigen daher, dass die Ligase nicht direkt vom Antiserum erkannt wird und statt dessen über ihre Assoziation mit XRCC4 immungefällt wird.
Zusammengenommen zeigen die obigen Ergebnisse, dass XRCC4 eine feste Salz-stabile Wechselwirkung mit DNA-Ligase III und/oder DNA-Ligase IV bildet. Um zu ermitteln, welches dieser beiden Enzyme mit XRCC4 assoziiert ist, wurde die Tatsache genutzt, dass die Ligasen III und IV unterschiedliche Fähigkeiten haben, einstrangige Brüche in Polynucleotidsubstraten zu verbinden, die einen DNA-Strang und einen RNA-Strang enthalten. So kann, während DNA-Ligase III die Verbindung sowohl bei Oligo(RA)•poly(dT)- als auch Oligo(dT)•poly(rA)-Substraten katalysieren kann, die Ligase IV nur die Verbindung von letzterem vermitteln (Robins, 1996).
Im Lichte dessen wurden Adenylierungstest an Material durchgeführt, das mit XRCC4 immungefällt wurde, und dann die markierten Immunpräzipitate entweder mit Oligo(RA)•poly(rA) oder Oligo(dT)•poly(dT) inkubiert. Bemerkenswerterweise führte nur Oligo(dT)•poly(rA) zur Dissoziation der Adenylatgruppe von der Ligase, die mit XRCC4 immungefällt wird.
Diese Ergebnisse weisen daher stark darauf hin, dass XRCC4 fest und spezifisch mit DNA-Ligase IV in Wechselwirkung tritt, nicht aber mit DNA-Ligase III.
XRCC4 und Ligase IV werden umfassend gemeinsam gereinigt Um die Wechselwirkung zwischen XRCC4 und DNA-Ligase IV zu bestätigen und Einblick darin zu erhalten, welcher Anteil der beiden Proteine in diesem Komplex vorliegt, wurde DNA-Ligase IV unter Einsatz festgelegter Protokolle (Robins, 1996) gereinigt und durch quantitative Western-Immunblot-Analysen in jedem Chromatographieschritt auf das Vorhandensein von Ligase IV und XRCC4 getestet.
Fraktionen, die von den Chromatographiesäulen entnommen wurden, wurden auf SDS-Polyacrylamidgelen analysiert, und die spezifische Bindung von Antikörpern wurde durch Immunblots detektiert. Die Menge an angegebenem Protein in jeder Fraktion wurde durch densiometrische Scans der Gels quantifiziert. Die Menge jedes Proteins in analysierten Fraktionen als Anteil ihrer Gesamtmenge wurde für die durch Gelchromatographiefraktionierung getrennten Proben aufgetragen (1A), gefolgt von einer Mono-S-Säule (1B).
Wie zuvor gezeigt, wurde beobachtet, dass die DNA-Ligasen III und IV während der Gelfiltrationschromatographie coeluieren (1A), aber voneinander durch Chromatographie auf Mono-S gelöst werden (1B). Signifikanterweise lässt sich XRCC4 während all dieser Verfahren gemeinsam mit Ligase IV verfolgen, wird aber im Gegensatz dazu im Mono-S-Chromatographieschritt von DNA-Ligase III getrennt (1A und 1B).
Weiters ist XRCC4 auch in stärker gereinigten Proben von DNA-Ligase IV vorhanden, die über die nachfolgende Chromatographie auf Mono Q erzeugt werden, und Immunblot-Analysen von annähernd homogenen Ligase IV-Präparaten, die zuvor hergestellt worden waren, zeigten das Vorhandensein von XRCC4. Proben, die weiters auf einer Mono Q-Säule gereinigt wurden (Robins, 1996) wurden auf einem 10% SDS-Polyacrylamidgel durch Immunblots analysiert, die auf das Vorhandensein von XRCC4 oder DNA-Ligase IV testen. Die Molekülgrößen wurden aufgrund der Wanderung von vorgefärbten Kaleidoskop-Markern abgeschätzt.
Bei zusätzlichen Untersuchungen wurde auch beobachtet, dass XRCC4 und DNA-Ligase IV gemeinsam auf Phenyl-Sepharose gereinigt werden. Tatsächlich muss mangels Inkubation mit starken ionischen Detergenzien noch ein Verfahren gefunden werden, um diese beiden Proteine zu trennen.
Interessanterweise entspricht das XRCC4, das gemeinsam mit Ligase IV gereinigt wird, der phosphorylierten Form des Proteins, wie durch seine SDS-PAGE-Mobilität und durch die Tatsache gezeigt, dass diese Mobilität durch Phosphatasebehandlung erhöht wird.
Schließlich ist es besonders bemerkenswert, dass XRCC4 und Ligase IV annähernd quantitativ gemeinsam miteinander gereinigt werden und dass keine freien Pools eines der Faktoren erkennbar-sind (siehe beispielsweise 1A und 1B). Das weist daher darauf hin, dass XRCC4 und DNA-Ligase IV in ähnlichen Mengen in der Zelle vorhanden sind und dass so gut wie alles eines jeden Polypeptids in einem Komplex mit seinem Partner vorliegt.
XRCC4 tritt mit dem C-terminalen Abschnitt von DNA-Ligase IV in Wechselwirkung, der zwei BRCT-Homologieregionen umfasst Um Einsichten in die Basis für die hochspezifische Bindung von DNA-Ligase IV an XRCC4 zu erlangen, entschlossen sich die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegen standes, zu versuchen, zu bestimmen, welche Regionen) von Ligase IV an dieser Wechselwirkung beteiligt ist bzw. sind.
DNA-Ligase I, III und IV weisen ein hohes Ausmaß an Sequenzähnlichkeit miteinander innerhalb eines Abschnitts auf, der als katalytische Kern-Ligasedomäne definiert worden ist (Wei et al., 1995). Außerdem weist jede Ligase diskrete N- und/oder C-terminale Fortsätze auf, von denen behauptet worden ist, dass sie den drei Enzymen einzigartige Eigenschaften verleihen. Obwohl die C-terminalen Fortsätze der DNA-Ligasen III und IV auf der primärem Sequenzniveau sehr geringe Homologie aufweisen, verfügen sie signifikanterweise über eine bzw. zwei Kopien der vor kurzem identifizierten BRCT-Homologiedomäne (Koonin et al., 1996; Callebaut und Nornon, 1997); siehe die nachstehende Diskussion).
Mit dem Ziel, herauszufinden, welche Regionen) von Ligase IV mit XRCC4 in Wechselwirkung tritt bzw. treten, wurde das Ligase IV-Polypeptid in drei Abschnitte unterteilt: eine N-terminale Region (die den Aminosäureresten 1 bis 198 entspricht), die Homologie mit Ligase I und III aufweist, eine mittlere Region (Reste 199 bis 549), die die höchsten Grade an Homologie mit Ligase I und III aufweist und die die katalytische Ligasestelle enthält, und eine C-terminale Region (Reste 550–844), die die zwei BRCT-Homologiedomänen enthält. Nachdem die drei Regionen getrennt in vitro transkribiert und translatiert worden sind, wurden sie auf die Fähigkeit getestet, sich an Sepharoseperlen oder an Sepharoseperlen, die kovalent gebundenes XRCC4 enthalten, zu binden. Proben von LigIV(1–198), Lig IV(199–549), Lig IV(550–844) und Luciferase wurden auf XRCC4-Sepharoseperlen oder negative Kontrollperlen (ON) aufgebracht und ungebundene Proteine gesammelt (FT). Nach Wäschen mit 0,1 M oder 1,0 M NaCl wurden gebundene Proteine mit Gelbeladungspuffer eluiert (SDS). Nach SDS-PAGE wurden die [³⁵S]Methioninmarkierten Fragmente durch Autoradiographie detektiert.
Das N-terminate und das mittlere Fragment von DNA-Ligase IV binden sich nicht detektierbar an die XRCC4-Perlen, wie das bei Luciferaseprotein der Fall ist, das als Kontrolle eingesetzt wurde. Im deutlichen Gegensatz dazu wird das C-terminate Ligase IV-Fragment annähernd quantitativ auf den XRCC4-Perlen zurückgehalten, aber nicht auf Kontrollperlen, denen XRCC4 fehlt. Darüber hinaus scheint die Bindung des C-terminalen Abschnitts von Ligase I an XRCC4 sehr stark zu sein, wie durch die Tatsache ersichtlich, dass die C-terminate Ligase IV-Region durch das Waschen mit 1 M NaCl nicht eluiert wird und erst nach der Zugabe des ionischen Detergens SDS gewonnen wird.
Schließlich wird, um weiter die Spezifität der obigen Wechselwirkung zu untersuchen, bewertet, ob XRCC4 enthaltende Perlen verwendet werden konnten, um die C-terminale Region von Ligase IV aus rohen bakteriellen Lysaten zu reinigen. Zu diesem Zweck wurde ein unfraktionierter Extrakt von E. coli, der diese Region exprimiert (LIGIV (550-844)) in sehr geringen Mengen mit XRCC4 enthaltenden Sepharoseperlen inkubiert und ungebundene Proteine gesammelt. Gebundenes Material wurde dann mit schrittweisen Zunahmen an Salzkonzentrationen eluiert, gefolgt von einer abschließenden Eluierung in Gegenwart von Gelbeladungspuffer, SDS.
Überraschenderweise führt, wie durch Gesamt-Coomassie-blue-Proteinfärbung eines SDS-Polyacrylamidgels gezeigt, das diese Fraktionen enthält, dieses Verfahren dazu, dass die C-terminate Region von Ligase IV in einem einzigen Schritt bis zu annähernder Homogenität gereinigt wird. Die Identität dieses Polypeptids als Ligase IV-C-Terminus wurde durch Westernblot-Analysen bestätigt, und dieses Protein wurde nicht durch Sepharoseperlen allein zurückgehalten.
Gemeinsam genommen attestieren diese Ergebnisse die extreme Stärke und Spezifität der Wechselwirkung zwischen der C-terminalen Ligase IV-Region und XRCC4.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Enzyme, Antikörper und DNA
pET-30b und pQE-30 wurden von Novagen bzw. Qiagen erhalten. Gereinigter monoklonaler Maus-MRGS.His-Antikörper (Qiagen), der von pQE-30 stammende Proteine mit His-Tag erkennt, wurde nach den Anweisungen des Herstellers verwendet. Ku70, Ku80 und DNA-PK_CS-Antiseren wurden wie zuvor beschrieben verwendet (Hartley et al., 1959; Finnie et al., 1996). Antikörper gegen Ligase I (TL5), Ligase III (TL25) und Ligase IV (TL18) wurden wie beschrieben verwendet (Lasko et al., 1990; Robins und Lindahl, 1996). Antigen-Antikörper-Komplexe wurden durch verstärkte Chemolumineszenz (Amersham) nach den Anweisungen des Herstellers detektiert. HeLa-Nuklearextrakt wurde von Computer Cell Culture Centre, Mons. Belgien, erhalten. Alle Plasmidkonstrukte wurden durch automatisierte DNA-Sequenzierung verifiziert.
Expression und Reinigung von XRCC4-Derivaten
Um rekombinantes XRCC4 ohne Tag zu erzeugen, wurde die XRCC4-Kodierungsregion voller Länge aus pBlueScript, das das Human-XRCC4-Gen enthielt, durch PCR amplifiziert und in pET-30a (Novagen) inseriert, das mit Nde I/Sal I verdaut war, so dass die Nterminalen His/S-Tags nicht vorhanden sind und so dass das XRCC4-Stopcodon die Zugabe des C-terminalen His-Tags verhindert. Für die Proteinexpression wurden BL21(DE3)-Zellen, die das resultierende Plasmid (pET30XRCC4) enthielten, in 500 ml Kultur αLB/Kanamycin (50 μg/ml) bis Mitte-log gezüchtet, bevor Induktion mit 0,4 mM IPTG für 4 h bei 37°C durchgeführt wurde. nach dem Lysieren des gesammelten Zellpellets durch Beschallung wurden 30,2 g Ammoniumsulfat langsam pro 100 ml Überstand zugegeben und unter Rühren bei 4 °C für 30 min inkubiert. Nach dem Zentrifugieren wurde das Pellet in TED (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 mM DTT und 1 mM EDTA) resuspendiert und ausgiebig gegen TED dialysiert. Protein wurde dann auf eine Heparin-Sepharosesäule aufgeladen, die mit TED voräquilibriert worden war, und Protein wurde mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,6 M NaCl eluiert. Fraktionen, die XRCC4 enthielten, wurden gepoolt und gegen TED dialysiert, das 1,0 M Amoniumsulfat enthielt, und wurden dann auf eine vor-äquilibrierte Phenyl-Sepharosesäule geladen. Proteine wurden mit einem linearen 100 ml-Gradienten von 1,0 bis 0 M (NH₄)₂SO₄ eluiert. XRCC4 enthaltende Fraktionen, die bei ~ 0,2 M (NH₄)₂SO₄ eluierten, wurden gepoolt und gegen 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 2 mM DTT, 1 mM EDTA und 10% (Gew./Vol.) Glycerin dialysiert und bei –80°C gelagert.
Anti-XRCC4-Antikörper-Produktion und Reinigung
Regionen des XRCC4-Gens wurden durch PCR aus pBlueScript amplifiziert, das das Human-XRCC4-Gen enthielt, wurden dann im Rahmen stromab vom Hexa-Histidin-(His-)-Tag von pQE-30 (Qigen, USA) inseriert und wurden nach den Anweisungen des Herstellers aus der löslichen Fraktion bakterieller Lysate exprimiert und gereinigt. Antikörper gegen die löslichen rekombinanten Proteine wurden in Kaninchen unter Einsatz von Standardverfahren (Harlow und Lane, 1988) gezüchtet und sind im Handel von Serotec, UK, erhältlich. Western-Immunblot-Analysen wurden wie zuvor beschrieben (Harlow und Lane, 1988) durchgeführt, und Blots wurden durch verstärke Chemolumineszenz (Amersham) entwickelt. Rekombinantes XRCC4 voller Länge mit His-Tag wurde an Sulfolink Coupling Gel (Pierce, USA) gebunden und wurde verwendet, um Anti-XRCC4-Antikörper durch Immunaffinitätsreinigung aus rohem SJ4-Serum zu reinigen, wie zuvor beschrieben (Lakin et al., 1996).
Phosphatase-Behandlung von HeLa-Zeltextrakten
Um auf XRCC4-Phosphorylierung zu analysieren, wurde HeLa-Kernextrakt (50 μg) mit λ-Proteinphosphatase (New England Biolabs) in Gegenwart von 2 mM MnCl₂ behandelt und vor SDS-PAGE und Westernblotting für 30 min bei 30 °C inkubiert.
Co-Immunfällung und Ligaseadenylylierungstests
XRCC4 wurde aus HeLa-Kernextrakt unter Einsatz von polyklonaler Anti-XRCC4 und einer Präimmun-Kontrolle immungefällt. Spezifisch wurden HeLa-Kernextrakte in Puffer D*(20 mM HEPES-KOH, 20% (Gew./Vol.) Glycerol, 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 0,2 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5 mM PMSF, 1 mM Natriumetabisulphot und 0,1% NP-40) dialysiert und dann entweder mit Präimmun- oder Immunserum 1 h bei 4°C in Gegenwart von 50 μg/ml Ethidiumbromid inkubiert, um nichtspezifische Wechselwirkungen zu zerstören (Lai und Herr, 1992). Immunkomplexe wurden an Protein A-Sepharose-Perlen (Pharmacia) gebunden, gefolgt von ausgiebigem Waschen mit Puffer D*, der 0,15 bis 1 M NaCl enthielt. Die Protein A-Sepharose-Perlen wurden schließlich vor der Analyse in Puffer D* gewaschen, der 0,15 M NaCl enthielt. Die Proben wurden dann auf die Fähigkeit getestet DNA-Ligase-adenylierte Komplexe zu bilden, wie zuvor beschrieben (Robins und Lindahl, 1996). Die Polynucleotidsubstrate OligodT•polyrA und Oligo(RA)•polydT wurden wie beschrieben hergestellt (Tomkinson et al., 1991). Die Reaktivität der gebildeten Enzymadenylat-Zwischenprodukte wurden untersucht, indem 0,8 μg unmarkiertes OligodT•polyrA oder Oligo(RA)•polydT für 1 h bei 30°C zugegeben wurden. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet und adenylylierte Proteine durch Autoradiographie nach SDS-PAGE detektiert.
Gelfiltrationschromatographie
Gesamt-HeLa-Kernextrakt (6 mg Protein) wurde ausgiebig gegen Puffer A (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 10% (Gew./Vol.) Glycerol) dialysiert, der 1 M NaCl enthielt. Das Protein wurde dann auf eine Superose 6 (Pharmacia) Säule (60 × 1,5 cm) aufgeladen, die mit Puffer A vor-äquilibriert war, das 1 M NaCl enthielt. Bei einem identischen Gelfiltrationsdurchgang wurden 0,2 mg reines rekombinantes XRCC4 ohne Tag in Puffer A analysiert, der 1 M NaCl enthielt.
Reinigung von DNA-Ligase IV IV aus HeLa-Zellen
DNA-Ligase IV wurde aus HeLa-Zellen gereinigt, wie zuvor beschrieben (Robins, 1996). Fraktionen, die von jeder der Säulen abgenommen wurden, wurden durch Immunblots mit Antikörpern analysiert, die für die DNA-Ligasen III und IV und XRCC4 spezifisch sind.
Expression von rekombinanten Ligase IV-Derivaten
Zur Erzeugung rekombinanter Ligase IV-Derivate wurden Fragmente der Human-Ligase IV-Gen-Kodierungsregion durch PCR aus reverser transkribierter HeLa-RNA amplifiziert. Jedes PCR-Produkt enthielt eine Bam HI-Stelle am 5'-Ende und ein Stopcodon gefolgt von einer Sal I-Stelle am 3'-Ende, und wurde nach Verdau in pET30b ligiert, das mit Bam HI/Sal I verdaut war. Das 550–844-Fragment von Ligase IV wurde ebenfalls in pQE-30 kloniert, und der resultierende Klon wurde in E. coli M15(Rep4) exprimiert. Zur Transkription und Translation in vitro von Ligase IV-Fragmenten wurde 1 μg pET30LigIV (1-198) pET30LigIV(199–549), pET30LigIV(550–844) oder eine Luciferase-Kontrolle (Promega) in vitro transkribiert und unter Einsatz des TnT-Kaninchen-Reticulozytlysat-Sets (Promega) nach den Anweisungen des Herstellers translatiert. Die resultierenden Ligase IV-Produkte mit N-terminalem His-Tag wurden durch Ni²⁺-NTa-Agarose-Chromatographie gereinigt.
Kurz zusammengefasst wurde ein 100 μl-Bettvolumen von Qiagen Ni²⁺-NTA-AGarose in Waschpuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 20 mM Imidazol, 10% (Gew./Vol.) Glyerol und 0,5 M NaCl) vor-äquilibriert, bevor 20 μl des rohen [³⁵S]Methionin-markierten in vitro translatierten Ligasefragments zugegeben wurden. Ungebundene Proteine wurden nach dem Zentrifugieren mit langsamer Geschwindigkeit entfernt, und das Harz wurde dreimal mit Waschpuffer gewaschen, um nicht spezifisch gebundene Proteine zu entfernen. Schließlich wurden Ligase IV-Proteine mit 100 μl Eluierungspuffer eluiert, der aus 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM Imidazol und 10%(Gew./Vol.) Glycerol bestand.
Wechselwirkungstests zwischen rekombinantem XRCC4 und Ligase IV-Derivaten
XRCC4 voller Länge wurde auf Sepharose-4B-Gel-Perlen (Pharmacia) immobilisiert, wobei das Bromcyanverfahren nach den Anweisungen des Herstellers eingesetzt wurde. Als negative Kontrolle wurde Kopplung auch ohne XRCC4-Protein durchgeführt. Ein 30 μl-Bettvolumen Perlen (mit und ohne XRCC4) wurde mit Bindungspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, 10% (Gew./Vol.) Glycerol, 0,1% NP-40 und 0,365 mg/ml BSA) vor-äquilibriert, bevor die Zugabe des in vitro gereinigten His-Tags Ligaseprodukte oder Luciferase translatierte. Ungebundenes Material wurde nach dem Zentrifugieren gesammelt, und die Perlen wurden mit Bindungspuffer gewaschen, der 0,1 M NaCl und 1,0 M NaCl enthielt. Die Perlen wurden als Vorbereitung zur Analyse durch SDS-PAGE in Gelladepuffer resuspendiert und gekocht. Schließlich wurden SDS-PAGE-Gels in 10% Essigsäure 30 min lang fixiert und getrocknet, und markierte Proteine wurden durch Autoradiographie detektiert. Die Fähigkeit des rekombinanten C-terminalen Fragments von Ligase IV (Reste 550–844), XRCC4-Sepharose-Perlen zu binden, wurde wie oben getestet, mit der Ausnahme, dass die Analyse durch Coomassie-Brilliantblau-Färbung und Immunblotting mit dem Anti-Ligase IV-Antikörper erfolgte.
BEISPIEL 2
BESTIMMUNG DER BIOLOGISCHEN AKTIVITÄT VON DNA-LIGASE IV
Identifizierung einer zweiten, bisher uncharakterisierten Hefe-DNA-Ligase
Unter Einsatz einer Konsenssequenz innerhalb der katalytischen Kerndomäne aller veröffentlichten DNA-Ligasen durchsuchten die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes das vor kurzem vollständig sequenzierte S. cerevisiae-Genom (Goffeau et al., 1996).
Zusätzlich zur Detektion von CDC9, das für DNA-Ligase I kodiert, identifizierten diese Suchen einen ORF (YOR005c), der auf Chromosom XV vorhanden ist, als hochsignifikanten Treffer.
Dieser ORF kodiert für ein Polypeptid mit 944 Aminosäureresten mit vorhergesagtem Molekulargewicht von 109 kDa, der umfassende Ähnlichkeit (24% Identität; 43% Ähnlichkeit) in seiner zentralen Region mit der konservierten "Kern"-Ligasedomäne von DNA-Ligase I (2) aufweist.
Phylogenetische Analysen von Proteinausrichtungen über diese Region zeigen, dass YOR005c beträchtlich näher mit DNA-Ligasen von Eukaryoten und eukaryotischen Viren verwandt ist als mit jenen von Prokaryoten und insbesondere am engsten mit Human-Ligase IV verwandt ist. Ein Phenogramm wurde unter Verwendung der PHYLIP-Packung mit der konservierten ausgerichtete "Kern"-Sequenz eines jeden Proteins, wie in 2 bezeichnet, unter Einsatz des UPGMA-Verfahrens erzeugt. Die Hinterlegungsnummern sind folgende: A. thaliana I (X97924); C. albicans (X95001); C. elegans I (Z73970), Fowlpox-Virus (000761); H. sapiens I (M36067), III (X84740) und IV (X83441); M. muculus I (U04674); Kaninchen-Fibromavirus (Z29716); S. cerevisiae I (X03246); IV (Z74913); S. pombe I (X05107); T7-Bacteriophage (P00969); Vaccinia-Virus (16512); X. laevis I (L43496).
In Einklang damit hat YOR005c einen N-terminalen Fortsatz mit den Säugetierenzymen gemeinsam, dem prokaryotische DNA-Ligasen fehlen. Weiters weist es einen zusätzlichen C-terminalen Fortsatz auf, der über seine gesamte Länge homolog zu dem von Säugetier-Ligase IV ist. Die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes kommen somit zu dem Schluss, dass YO%005c für ein Homolog von Säugetier-DNA-Ligase IV kodiert und bezeichnen diesen Locus als LIG4.
Zerstörung von Lig 4 führt nicht zu deutlicher Überempfindlichkeit für eine Vielzahl von DNA schädigenden Mitteln
Um die LIG4-Funktion zu untersuchen, wurde dieses Gen im haploiden Hefestamm W303α durch eine Einschritt-Genzerstörung inaktiviert.
Bemerkenswerterweise weisen die resultierenden Lig4-Mutanten keine leicht erkennbaren Wachstumsdefekte auf, wenn sie bei Temperaturen im Bereich von 18°C bis 37°C vermehrt werden. Das steht im deutlichen Kontrast zu CDC9, dem Gen, das für Hefe-Ligase I kodiert, dessen Zerstörung zu Letalität führt, da es unfähig ist, durch S-Phase hindurchzugehen (Johnston und Nasmyth, 1978). Es wird so geschlossen, dass LIG4 keine wesentliche Rolle bei der DNA-Replikation spielt und dass Hefe-Ligase I die einzige DNA-Ligase ist, die für dieses Verfahren erforderlich ist.
Als nächstes wurde getestet, ob lig4-mutante Hefen in einem der überwiegenden DNA-Reparaturwege vorherrschen, indem ihre Empfindlichkeit für das Abtöten durch verschiedene DNA schädigende Mittel bewertet wurde. Bemerkenswerterweise sind lig4-mutante Stämme nicht überempfindlich für DNA-Schädigung, die durch das Einwirken von UV-Strahlung herbeigeführt wird, was zeigt, dass sie nicht wesentlich für die Nukleotid-Ausschnittreparatur ist. Außerdem sind Stämme, deren LIG4 zerstört ist, in einer Bandbreite an Konzentration des radiomimetischen Arzneimittels, Methylmethansulfonat (MMS) im Wachstumsmedium nicht überempfindlich. Schließlich weisen lig4-mutierte Hefen auch keine deutlich erhöhte Empfindlichkeit für das Abtöten durch ionisierende Strahlung in einer Bandbreite von Dosen (0 bis 45 kRad) auf. Anders als rad52-Mutanten sind lig4-mutante Hefen gegen ionisierende Strahlung so widerstandsfähig wie parentale Stämme: lig4-Mutanten waren auch in hohen Dosen (bis zu 45 kRad) nicht wesentlich empfindlicher (3A).
Da durch Strahlung herbeigeführte DNA-Doppelstrang-Brüche (DSBs) in S. cerevisiae primär durch homologe Rekombination repariert werden, weisen diese Daten darauf hin, dass LIG4 für den letzteren Zweck nicht wesentlich ist. In Einklang damit wurde festgestellt, dass die Effizienz von durch homologe Rekombination vermittelter abgezielter Integration in verschiedene Loci im Hefe-Genom zwischen Stämmen der Wildform und lig4-mutanten Stämmen nicht zu unterscheiden ist.
LIG4 funktioniert im Ku-abhängigen NHEJ-Weg von DNA-Doppelstrang-Bruch-Reparatur Bei S. cerevisiae werden durch Strahlung herbeigeführte DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) primär durch homologe Rekombination repariert, die durch Gene in der RAD52-Epistasengruppe vermittelt wird (Friedberg et al., 1995). So macht die Zerstörung von RAD52 Hefezellen für ionisierende Strahlung empfindlich (3A). Eukaryotische Zellen können DNA-DSBs jedoch auf einem zweiten Weg reparieren, nämlich nicht homologe Endenverbindung (NHEJ), bei der Genprodukte eingesetzt werden, die sich von den bei der homologen Rekombination verwendeten unterscheiden. Sowohl bei Hefe als auch bei Säugetieren ist eine dieser Komponenten das DNA-Bindungsprotein Ku, das Untereinheiten mit ~ 70 kDa und ~ 80 kDa umfasst [Ku70 und Ku80 bei Säugetieren (Jackson und Jeggo, 1995); Yku70p/Hdflp und Yku80p/Hdf2p bei Hefe (Feldmann und Winnacker, 1993; Boulton und Jackson, 1996a; 1996b; Feldmann et al., 1996; Mages et al., 1996; Milne et al., 1996; Siede et al., 1996; Tsukamoto et al., 1996)]. NHEJ scheint der vorherrschende Weg für DSB-Reparatur bei Säugetieren zu sein, stellt aber bei Hefe einen untergeordneten Weg dar; folglich führt die Zerstörung von S. cerevisiae-YKU70 oder -YKU80 nur zu einer signifikant erhöhten Empfindlichkeit für ionisierende Strahlung oder MMS, wenn homologe Rekombination nicht stattfindet (Boulton und Jackson, 1996a; 1996b; Milne et al., 1996; Siede et al., 1996).
Die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes haben festgestellt, dass lig4/ rad52-Doppelmutanten wesentlich strahlenempfindlicher sind als bei Stämmen mit zerstörtem RAD52 allein (3B). Wie im Fall von YKU70 (Mutante in der Ku70-Untereinheit von Hefe-Ku), macht die Zerstörung von LIG4 Hefe für ionisierende Strahlung in rad52-Mutanten-Hintergründen überempfindlich. Weiters sind lig4/yku70/rad52-Dreifachmutanten nicht wesentlich strahlenempfindlicher als yku70/rad52-Doppelmutanten oder lig4/rad52-Doppelmutantenstämme, was darauf hinweist, dass Lig4p und Yku70p auf dem gleichen von RAD52 unabhängigen Reparaturweg arbeiten. Das liefert einen Hinweis dafür, dass LIG4 an der Reparatur von durch ionisierende Strahlung herbeigeführter DNA-Schädigung beteiligt ist und dass es auf einem von RAD52 unabhängigen Weg arbeitet.
Da die Wirkungen der Zerstörung von LIG4 ähnlich sind wie jene, die durch Zerstörung von YKU70 oder YKU80 erzielt wurden, wurde die Strahlungsempfindlichkeit von lig4/ yku70/rad52-Dreifachmutanten bewertet. Derartige Mutantenstämme sind nicht empfindlicher für ionisierende Strahlung als die lig4/rad52- oder yku70/rad52-Mutantenstämme (3B).
Gemeinsam liefern diese Daten einen Hinweis dafür, dass Ku- und LIG4 auf dem gleichen DNA-Reparaturweg arbeiten.
Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Ku in DNA-NHEJ arbeitet und dass dieses Verfahren gemessen werden kann, indem ein Plasmidreparaturtest in vivo eingesetzt wird (Boult und und Jackson, 1996a; 1996b; Milne et al., 1996). Bei diesem Test wird ein Hefe-E. coli-Shuttle-Plasmid pBTM116 (Boulton und Jackson, 1996a; 1996b) durch Restriktionsenzymverdau linearisiert und wird dann durch Transformation in S. cerevisiae eingeführt. Das Plasmid enthält den selektierbaren Hefe-Marker TRP1, das β-Lactamase-Gen, den ADH1-Promotor sowie EcoRl- und Pstl-Restriktionsstellen. Da das Plasmid rezirkularisiert werden muss, um verbreitet zu werden, quantifiziert die erhaltene Anzahl an Hefe-Transformantenkolonien die Fähigkeit des Stamms, das Plasmid zu reparieren. Weiters wird, da sich der bei diesen Untersuchungen erzeugte DNA-DSB in einer Region befindet, die für das Hefe-Genom nicht homolog ist, homologe Rekombination unterdrückt, und die Reparatur funktioniert vorwiegend über NHEJ.
Daher wurde die Fähigkeit von lig4-Mutantenhefen analysiert, pBTM116 nach der Spaltung mit verschiedenen Restriktionsendonucleasen zu reparieren. Es wurden Hefestämme der Wildform, lig4-, yku70- und lig4/yku70-Hefestämme verwendet. Zellen für jeden Stamm wurden parallel mit superspiralisiertem pBTM116 oder mit einer äquivalenten Menge an pBTM116 transformiert, das bis zur Vollständigkeit mit EcoRl (linkes Bild von 4) oder Pstl (rechtes Bild von 4) verdaut worden war. Für jeden Versuch ist der aufgetragene Wert die Anzahl an Transformanten, die mit dem linearen Plasmid erhalten wurden, ausgedrückt als Prozentsatz der für superspiralisierte DNA erhaltenen Anzahl. Jeder Versuch wurde zumindest dreimal wiederholt, und in jedem Fall wurden Zellen doppelt plattiert und gezählt.
Wie bei Stämmen mit YKU70- oder YKU80-Zerstörung weisen lig4-Mutantenstämme eine starke Schwächung der Plasmid-NHEJ auf, und das ist sowohl bei 5'- als auch 3'-überhängenden DNA-Enden zu beobachten. Interessanterweise zeigen diese Untersuchungen, dass die Wirkung von lig4-Mutationen bei 3'-überhängenden DNA-Enden weniger ausgeprägt ist als bei 5'-überhängenden Enden. Obwohl andere Alternativen bestehen, ist es möglich, dass das Unterschiede in den Mechanismen widerspiegelt, durch die die beiden Typen von DNA-Enden repariert werden können, oder auf unterschiedliche Empfindlichkeiten der verschiedenen Endenstrukturen für Nuclease-Angriff zurückzuführen ist. Bemerkenswerterweise wird die DNA-Reparatur bei yku70/lig4-Doppelmutantenstämmen nicht weiter beeinträchtigt (4). Außerdem wurde, obwohl der genaue Grund für diese Wirkung nicht bekannt ist, wie das bei yku70- und yku80-Mutanten der Fall ist, festgestellt, dass Hefen mit lig4-Mutation eine etwas erhöhte Fähigkeit haben, sich wieder mit pBTM116 zu verbinden, das stumpfe Enden aufweist.
Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass Lig4p eine entscheidende Rolle bei der Reparatur von Plasmidmolekülen spielen, die kohäsive DNA-Doppelstrangbrüche in vivo aufweisen. Zweitens zeigen sie, dass, obwohl gezeigt worden, ist, dass gereinigte DNA-Ligase I (CDC9) fähig ist, DSB-Verbindung in vitro zu katalysieren (Tomkinson et al., 1992) dieses Enzym keine wesentliche Rolle bei diesem Weg spielt, wie durch In vivo-Plasmid-DSB-Wiederverbindung getestet, und nicht fähig ist, in diesem Verfahren effizient für Lig4p zu substituieren. Schließlich zeigen diese Ergebnisse auch, dass Lig4p eine wichtige Rolle im von Ku abhängigen NHEJ-Weg spielt.
Obwohl die Plasmidreparatur bei den lig4-mutanten Stämmen dramatisch verringert ist, wird sie nicht beseitigt. Um die Typen der DNA-Reparaturereignisse präzise zu bestimmen, die von LIG4 abhängig oder unabhängig sind, wurden reparierte Plasmide gewonnen und dann durch Restriktionsenzymverdau und DNA-Sequenzierung analysiert. Ohne funktionelles LIG4 werden die kohäsiven DNA-Termini durch einen ineffizienten fehleranfälligen DNA-Reparaturweg repariert. Das Plasmid pBTM116 enthält den ADH1-Promotor, und einige Reparaturprodukte werden durch das Lücken-Reparaturverfahren erzeugt, an dem das chromosomale ADH1-Gen beteiligt ist. Von der großen Anzahl an Plasmiden, die von parentalen Stämmen gewonnen worden waren, waren alle durch direkte Ligation der kohäsiven DNA-Termini repariert worden, wodurch die Restriktionsenzym-Spaltungsstelle regeneriert wurde (Boulton und Jackson, 1996a; 1996b). Es wurde jedoch festgestellt, dass Plasmidreparaturprodukte, die von yku70- oder lig4-Mutantenstämmen gewonnen wurden, in mehrere Kategorien fallen. Einige davon entsprechen "Lücken-Reparatur"-Produkten, von denen gezeigt wurde, dass sie über RAD52-abhängige homologe Rekombination mit genomischer Hefe-DNA erzeugt werden (Sequenzanalysen zeigen, dass homologe Rekombination bei der Erzeugung dieser Produkte eingesetzt wird und ihre Produktion durch die Zerstörung von RAD52 beseitigt wird; Boulton und Jackson, 1996a; 1996b und nicht gezeigte Daten). Das liefert daher weitere Hinweise dafür, dass LIG4, wie YKU70 und YKU80, keine entscheidende Rolle in homologen Rekombinationsprozessen spielt. Bei yku70- oder yku80-Mutantenstämmen wurde festgestellt, dass so gut wie alle der verbleibenden Reparaturprodukte Deletionen erfahren haben (Boultun und Jackson, 1996a; 1996b). Im Gegensatz dazu wurden, obwohl viele der verbleibenden Reparaturprodukte, die in lig4-Mutanten erzeugt wurden, ebenfalls Deletion von endständigen Sequenzen erfahren hatten, einige präzise aneinandergefügt.
Gemeinsam liefern diese Ergebnisse Einsichten in die unterschiedlichen Rollen, die Lig4p und Ku bei DNA-NHE) spielen (siehe die nachstehende Diskussion).
Lig4p scheint anders als Ku bei der Telomerlängen-Beibehaltung keine Rolle zu spielen.
Telomere treten an den Enden eukaryotischer Chromosomen auf, sind strukturell unterschiedlich und weisen ungewöhnliche Replikationszwischensubstanzen auf, bei denen es unklar ist, ob eine bestimmte DNA-Ligase erforderlich ist (Blackburn, 1991; Zakian, 1995; Lundblad und Wright, 1996). Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass Ku bei Telomer-Homöostase wirkt, da die Zerstörung von YKU70 oder YKU80 zu einer dramatischen Reduktion der Telomerlänge führt (Boulton und Jackson, 1996b; Porter et al., 1996).
In Hinblick darauf, dass Lig4p und Ku gemeinsam bei DNA-NHE) wirken, wurde getestet, ob LIG4 an der Telomerlängen-Regulierung beteiligt ist.
Zu diesem Zweck wurde genomische Hefe-DNA mit dem Restriktionsenzym Xhol verdaut, das in Stämmen der Wildform ein vorherrschendes telomeres Fragment mit ~1,3 kb erzeugt, das durch Southern-Hybridisierung an eine Oligonucleotidsonde detektiert wird, die sich an die repetitiven telomeren Sequenzen bindet, einschließlich ~400 bp Wiederholungs-(C_1–3A)-Sequenz, und durch Southern-Hybridisierung unter Verwendung eines radiomarkierten Poly(GT)₂₀-Oligonucleotids detektiert wird. Bemerkenswerterweise hat, während die Zerstörung von YKU70 zu telomerer Verkürzung führt, der Verlust von LIG4-Funktion keine detektierbare Wirkung.
Diese Daten zeigen daher, dass, obwohl Ku und Lig4p bei der DNA-DSB-Reparatur gemeinsam wirksam sind, Ku, nicht aber Lig4p eine zusätzliche wesentliche Funktion bei der Telomerlängen-Homöostase erfüllt.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Gen-Zerstörungen
LIG4 voller Länge wurde durch PCR mit den Primern LIG4-1 und LIG4-2 (5' TCAGTA-GTTGACTACGGGAAAGTCT 3' bzw. 5' ATGATATACAGCACTAGATTCTATAC 3') amplifiziert, wobei die Expand High Fidelity DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim) eingesetzt wurde. Nach dem Klonieren in pGEM-T (Promega) wurde das resultierende Plasmid mit EcoR1 verdaut, mit Pfu DNA-Polymerase behandelt und dann mit Xbal verdaut. Der HIS3-Marker wurde inseriert, um den LIG4-ORF zwischen den Resten 289 und 592 zu ersetzen. Das Zerstörungsfragment wurde mit Sphl und Spel ausgeschnitten und wurde verwendet, um die entsprechenden Hefestämme in His⁺ zu transformieren. Gen-Zerstörung wurde unter Verwendung von LIG4- und HIS3-Primern in PCR verifiziert. Zwei RAD52-Zerstörungskonstrukte wurden von D. Weaver bereitgestellt und weisen TRP1-bzw. URA3-Selektion auf.
Bewertung der Empfindlichkeit für Temperatur und DNA schädigende Mittel
Allquote (15 μl) serieller 5fach-Verdünnungen von Hefekulturen in Mittel-Log-Phase wurden als Punkte auf YPDA-Platten aufgebracht und wurden für 36 h bei 30°C oder 37°C gezüchtet. Stämme auf einer Platte wurden 50 J/m2 Ultraviolett-(UV-C) Strahlung ausgesetzt (Stratalinker; Stratagene). Auf einer anderen Platte enthielt YPDA-Medium 0,0025% Methylmethansulfonat. Bei anderen Untersuchungen zeigten lig4-Mutantenstämme keine Überempfindlichkeit für MMS (0,0005% und 0,005% im Wachstumsmedium), und ebensowenig für UV-C (20–150 J/m²).
Überlebentests bei ionisierender Strahlung
Drei unabhängige Isolate eines jeden Stamms wurden entweder in Minimalmedium, dem die entsprechende(n) Aminosäure(n) fehlten, oder in YPDA eingeimpft und wurden über Nacht bei 30°C gezüchtet. Die Kulturen wurden in sterilem Wasser auf einen O.D._600nm-Wert gleich 1 × 10⁷Zellen/ml verdünnt, und 1 ml-Aliquote wurden unter Einsatz einer ¹³⁷Cs-Quelle in einer Dosis von 0,18 kRad/min bestrahlt. Bestrahlte Proben und unbestrahlte Kontrollen wurden dann doppelt verdünnt und unter Verwendung eines automatisierten Spiral-Platens (Whitley) auf YPDA oder Minimalmedium plattiert. Die Kolonienanzahl wurde nach der Inkubation bei 30°C für 3 bis 4 Tage bestätigt.
Plasmidreparaturtest
Plasmidreparaturtests wurden durchgeführt, wie zuvor beschrieben (Boulton und Jackson, 1996a; 1996b). Kurz zusammengefasst wurde das Hefe-Escherichia coli.-Shuttleplasmid pBTM116 (2 bis 5 μg), das TRP1 für die Selektion in Hefe enthält, mit dem entsprechenden Restriktionsenzym bis zur Vollständigkeit verdaut, und das Enzym wurde durch Behandlung bei 65°C für 20 inaktiviert. Linearisierte DNA wurde dann verwendet, um Hefe durch das Lithiumacetatverfahren zu transformieren (Ausubel et al., 1987). Parallele Transformationen wurden mit einer äquivalenten Menge an ungeschnittenem Plasmid durchgeführt, um die Normalisierung für Unterschiede in der Transformationseffizienz zu ermöglichen. Verdünnte Proben wurden doppelt auf Minimalmedium plattiert, dem die entsprechenden Aminosäuren fehlten, und Kolonien wurden nach der Inkubation bei 30°C für 3 bis 4 Tage gefällt. Um Plasmid-Reparaturprodukte zu analysieren, wurde DNA von einzelnen Hefe-Transformanten über das Yeast DNA Isolation-Set (Stratagene) isoliert, und diese wurde verwendet, um E. coli XL1-Blue-Zellen (Stratagene) zu Ampicillin-Resistenz zu transformieren. Plasmid-DNA wurde dann isoliert und wurde durch Restriktionsenzymanalyse und durch DNA-Sequenzierung analysiert.
Hefe-DNA-Extraktion und Analen telomerer DNA
Genomische DNA von S. cerevisiae wurde im Wesentlichen wie beschrieben isoliert (Ausubel et al., 1987). Für Telomer-Analysen wurden 2 μg genomische DNA mit 30 E Xhol (Boehringer Mannheim) bei 37°C über Nacht verdaut. Die verdaute DNA wurde dann auf einem 1,2% Agarose 1 × TAE-Gel getrennt und wurde durch Kapillarübertragung in 20 × SSC auf Hybond NFp⁺-Membran (Amersham) übertragen, wie vom Hersteller vorgeschlagen. Die Membranen wurden in 0,5 M Natriumphosphat, pH 7,2, 1% SDS vorhybridisiert und dann mit 3 ng/ml ³²P-Enden-markiertem Poly(GT)₂₀-Oligonucleotid (spezifisch Aktivität > 10⁹/μg) in einem Puffer auf Church-Basis (0,2 M Natriumphosphat, pH 7,2, 1% BSA, 6% Polyethylenglykol 6000, 1% SDS) über Nacht bei 62°C hybridisiert. Schließlich wurden die Membranen zweimal bei Raumtemperatur 30 min lang in 0,2 M Natriumphosphat, 0,1% SDS, gewaschen und dann vorbelichtetem Röntgenfilm bei –70°C ausgesetzt.
DISKUSSION
Die Arbeit der Erfinder mit XRCC4 weist darauf hin, dass es sich um ein vorwiegend nukleares Protein handelt. Darüber hinaus wurde durch eine Vielzahl von Ansätzen gezeigt, dass XRCC4 extrem feste und spezifische Wechselwirkungen mit DNA-Ligase IV vermittelt. Beispielsweise werden diese beiden Komponente in hohem Maße spezifisch miteinander von HeLA-Zellextrakten gemeinsam gefällt, auch in Gegenwart von 1 M NaCl. Weiters werden derartige Wechselwirkungen durch Ethidiumbromid nicht aufgehoben, was darauf hinweist, dass die Wechselwirkung zwischen XRCC4 und Ligase IV nicht durch ein DNA-Zwischenprodukt vermittelt wird. Tatsächlich zeigen die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes, dass sich bakteriell exprimiertes XRCC4 und Ligase IV ebenfalls fest aneinander binden, was zeigt, dass die Wechselwirkung direkt ist. Außerdem werden XRCC4 und Ligase IV über jedes chromatographische Fraktionierungsverfahren, das eingesetzt wurde, gemeinsam gereinigt, einschließlich Gelfiltration in Gegenwart von 1 M NaCl, Anionen- und Kationenaustauschchromatographie und Hydrophobchromatographie. Tatsächlich wurden diese beiden Proteine bisher nur durch die Zugabe von starken ionischen Detergenzien gelöst.
Die Tatsache, dass XRCC4 fest mit Ligase IV in Wechselwirkung tritt, nicht aber mit anderen DNA-Ligasen, die analysiert wurden, hat dazu geführt, die Basis für diese Bindungsspezifität zu untersuchen. Bemerkenswerterweise enthalten zwar alle charakterisierten Säugetier-DNA-Ligasen eine gemeinsam in hohem Maße in Beziehung stehende katalytische Kernregion, jedoch weist jede einzigartige N- und/oder C-terminate Fortsätze auf. Die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes haben festgestellt, dass es diese einzigartige C-terminale Domäne und nicht die katalytische Ligase-Region von Ligase IV ist, die mit XRCC4 in Wechselwirkung tritt. Interessanterweise enthält diese Region von Ligase IV zwei Tandem-Kopien der schwach konservierten BRCT-Homologiedomäne (Koonin et al., 1996; Callebaut und Mornon, 1997), was zu der Spekulation führt, dass es eine dieser Domänen oder beide sind, die die Wechselwirkung mit XRCC4 vermitteln. BRCT-Domänen liegen auch in einer Vielzahl anderer Faktoren und sind erforderlich, damit diese Faktoren in Wechselwirkung treten (Mackey et al., 1997; Nash et al.; 1997), was darauf hinweist, dass die BRCT-Domäne eines Proteins mit einer BRCT-Domäne des anderen in Wechselwirkung tritt. Somit kann im Lichte der Arbeit der Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes, die Wechselwirkung zwischen XRCC4 und DNA-Ligase IV zeigt, erwartet werden, dass XRCC4 auch eine oder mehrere Kopien des BRCT-Konsens aufweist. Obwohl vorherige Analysen nicht gezeigt haben, dass XRCC4 ein BRCT-Domäne enthaltendes Protein ist, sind manuelle und computergestützte Untersuchungen der XRCC4-Sequenz eingesetzt worden, um begrenzte Homologien zu anderen BRCT-Domänen zu zeigen, was darauf hinweist, dass XRCC4 eine oder mehrere divergente Kopien dieser mutmaßlichen Proteinstruktureinheit enthalten könnte.
In Anbetracht der Tatsache, dass XRCC4 bei DNA-NHE) klar eine Funktion erfüllt, weisen die Daten der Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes klar darauf hin, dass DNA-Ligase IV in diesem Verfahren ebenfalls eine entscheidende Rolle spielt. XRCC4 kann als Molekülbrücke dienen, um auf Ligase IV und DNA-DSBs abzuzielen, möglicherweise dadurch, dass XRCC4 auch mit anderen Komponenten des DNA-NHEJ-Apparats in Wechselwirkung tritt (5). In Hinblick auf eine solche mutmaßliche Überbrückungsfunktion für XRCC4 ist anzumerken, dass Immunfällungsuntersuchungen darauf schließen lassen, dass XRCC4 mit Ku und/oder DNA-PK_CS in Wechselwirkung treten kann, obwohl diese Wechselwirkung nur bei niedrigen Salzkonzentrationen auftreten und somit im Vergleich zu jenen, die zwischen XRCC4 und Ligase IV auftreten, schwach sind. Eine mögliche physikalische Bindung zwischen XRCC4 und DNA-PK ist im Lichte der Tatsache, dass die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes gezeigt haben, dass HeLa-Zelle XRCC4 ein Phosphoprotein ist, und ein wirksames Substrat für DNA-PK in vitro ist, attraktiv. Da XRCC4 ein DNA-PK-Kinase-Konsensmotiv aufweist (Li et al., 1959), kann die Mutation dieser Stelle XRCC4-Funktion in vivo beeinflussen.
In Einklang mit der Vermutung, dass Ligase IV eine wichtige Rolle bei DNA-DSB-Reparatur spielt, wurde ein S. cerevisiae-Homolog von DNA-Ligase IV identifiziert (das umfassende Sequenzähnlichkeit entlang seiner Länge mit Säugetier-DNA-Ligase IV aufweist) und gezeigt, dass die Inaktivierung dieses Faktors DNA-NHEJ auf eine Weise abschwächt, die mit Mutationen in den Hefe-Homologen von Ku70 und Ku80 epistatisch ist (Boulton und Jackson, 1996; Boulton und Jackson, 1996; Teo und Jackson, 1997). Im Gegensatz dazu wurde festgestellt, dass Hefe-Ligase IV keine wesentliche Rolle bei der Reparatur von durch UV-Licht herbeigeführte DNA-Schädigung oder bei der Reparatur von DNA-DSBs durch homologe Rekombination spielt (Teo und Jackson, 1997). Gemeinsam mit den Daten über XRCC4 liefert das einen Hinweis dafür, dass Ligase IV für DA-NHEJ bestimmt ist und dass die Funktion bei allen Eukaryoten konserviert ist.
Das Hefe-Gen, das die Bezeichnung LIG4 erhalten hat, ist weder für DNA-Replikation, noch RAD52-abhängige homologe Rekombination oder die Wege der Nucleotid-Ausschnittreparatur und Basen-Ausschnittreparatur wesentlich. Statt dessen ist gezeigt worden, dass LIG4 spezifisch am Wiederverbinden von DNA-Doppelstrangbrüchen durch das DNA-NHEJ-Verfahren beteiligt ist, das kein Homologie zwischen den beiden rekombinanten DNA-Molekülen verlangt und kein RAD52 verlangt. Bemerkenswerterweise zeigen genetische Epistasen-Versuche, dass LIG4 auf dem gleichen DNA-Reparaturweg arbeitet wie Ku, ein nukleares Protein, das spezifisch DNA-Strang-Brüche erkennt. Somit ist eine neue S. cerevisiae-DNA-Ligase identifiziert und gezeigt worden, dass sie spezifisch am von Ku abhängigen NHEJ-Weg der DNA-DSB-Reparatur beteiligt ist.
Im Lichte dessen und in Anbetracht der Tatsache, dass Mutationen in YKU70 oder YKU80 zu einer dramatischen telomeren Verkürzung bei Hefe führen (Boulton et al., 1996b; Porter et al., 1996) haben die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstan des auch die potentielle Beteiligung von LIG4 an Telomerlängen-Homöostase bewertet. Telomere sind die Protein-DNA-Strukturen an den Enden eukaryotischer Chromosomen, die die vollständige Replikation von Chromosomenenden gewährleisten, diese Enden vor Abbau schützen und verhindern, dass chromosomale Termini DNA-Schädigung signalisierende Wege aktivieren oder sich an Fusions- und Rekombinationsreaktionen mit anderen Loci beteiligen [siehe Blackburn, 1991; Zakian, 1995; Lundblad und Wright, 1996]. Bei den meisten Organismen bestehen Telomere aus variablen Zahlen einfacher Wiederholungssequenzen, und zumindest bei S. cerevisiae wird die Länge dieser Sequenzanordnungen durch eine Kombination aus Telomeaseaktivität und RAD52-abhängiger und -unabhängiger Rekombination beibehalten. Bei Hefe führen Ku-Defizienzen zu einer etwa 70%igen Reduktion der Anzahl an telomeren Wiederholungssequenzen (Boulton et al., 1996b; Porter et al.; 1996). In Anbetracht der Tatsache, dass sich Ku an die Enden doppelstrangiger DNA bindet (Mimori und Hardin, 1986; Paillard und Strauss, 1991), besteht eine Möglichkeit darin, dass Ku direkt mit telomeren DNA-Enden in Wechselwirkung treten und die Telomerverlängerung potenzieren kann, indem telomere DNA-Termini vor Nucleasen geschützt oder indem Telomerase-Rekrutierung erhöht wird. Eine alternative Erklärung ist, dass die Wirkung der Ku-Inaktivierung auf Telomerlänge indirekt ist – vielleicht führen die DNA-Reparaturdefekte, die mit Hefen mit Ku-Defizienz verbunden sind, zu Änderungen der Zellphysiologie, die indirekt auf die Telomer-Längenregulierung einwirken. Obwohl es zurzeit nicht möglich ist, präzise zu identifizieren, wie Ku die Telomerlänge beeinflusst, spricht die Tatsache, dass Mutationen in LIG4 im Wesentlichen den gleichen DNA-Reparatur-Defekt aufweisen wie Ku, aber die Telomerlänge nicht verändern, dafür, dass Ku eine spezifische Rolle bei der Telomer-Homöostase hat, die sich von seinen Aktivitäten bei der DNA-DSB-Reparatur unterscheidet. In diesem Zusammenhang wird es von Interesse sein, herauszufinden, ob mutierte Ku-Derivate erzeugt werden können, die keine Wirkung auf die DNA-Reparatur haben, aber zu defektiver telomerer Beibehaltung führen.
In LIG4 mutierte Hefezellen weisen ausgeprägte Defekte bei DNA-NHEJ auf, was zeigt, dass Lig4p eine entscheidende Rolle in diesem Verfahren spielt, die nicht effizient von Hefe-DNA-Ligase I ergänzt werden kann. Umgekehrt weisen Hefe-CDC9- und Human-DNA-Ligase I-Mutanten defektive DNA-Replikation auf, und zumindest in vitro wird diese Funktion nicht effizient von anderen Enzymen erfüllt. Das weist darauf hin, dass die Hefe-DNA-Ligase I und IV deutliche und weitgehend getrennte zelluläre Funktionen aufweisen und einander nicht wirksam ersetzen können. Somit spielt DNA-Ligase I eine entscheidende Rolle bei der DNA-Replikation und scheint auch Einstrang-DNA-Brüche zu schließen, die die Endprodukte von Nucleotid- und Basen-Ausschnittreparatur sind, und wird darüber hinaus wahrscheinlich Rekombinationsereignisse zwischen homologen Duplex-DNA-Molekülen vervollständigen. Es gibt auch Daten, die darauf hinweisen, dass Säugetier-DNA-Ligase III für bestimmte Funktionen spezialisiert ist. Eine Spleißvariante (DNA-Ligase III-α) kann auf einem eigenen Weg für Basen-Ausschnittreparatur arbeiten, während eine andere Variante (DNA-Ligase III-(β) mit der meiotischen Rekombination in Zusammenhang gebracht worden ist. Es ist festzustellen, dass es keine offensichtlichen Homologe von Säugetier-DNA-Ligase II/III in S. cerevisiae gibt. Sequenzanalysen (1; Colinas et al.; 1990; Kerr et al., 1991; Husain et al., 1995) zeigen jedoch, dass diese Ligasen enger mit DNA-Ligasen verwandt sind, für die zytoplasmische Pockenviren kodieren, als mit DNA-Ligase I, was darauf hinweist, dass die Ligasen II und III erst ziemlich spät in der Wirbeltier-Evolution entstanden sind. Interessanterweise und weitgehend in Einklang mit den vorgeschlagenen Funktionen für Säugetier-Ligase III beeinflusst die Inaktivierung von Pockenvirus-DNA-Ligase die virale DNA-Replikation oder Rekombination nicht, sondern macht das mutante Virus anfälliger für durch UV oder Bleomycin herbeigeführte DNA-Schädigung (Colinas et al., 1990; Kerr et al., 1991). Kollektiv weisen diese Daten darauf hin, dass DNA-Ligase I und vielleicht DNA-Ligase II/III vorwiegend an der Wiederverbindung von einstrangigen Nicks beteiligt sind, während DNA-Ligase IV das Hauptenzym ist, dass die Verbindung doppelstrangiger Brüche katalysiert.
Im Lichte dieser Punkte und in Anbetracht der Tatsache, dass LIG4 im in hohem Maße evolutionär konservieren Ku-abhängigen NHEJ-Weg eine Funktion erfüllt, ist angezeigt, dass Säugetier-DNA-Ligase IV eine Schlüsselrolle bei Ku-abhängiger DNA-DSB-Verbindung spielt. Wie das bei Ku der Fall ist (siehe Jackson und Jeggo, 1995) kann eine Defizienz von Säugetier-Ligase IV zu zellulärer Strahlenempfindlichkeit und zu einer Unfähigkeit führen, stellenspezifische V(D)J-Rekombinationszwischenverbindungen wieder zu verbinden.
Obwohl die verfügbaren Daten auf eine Diversifizierung der Funktion für die verschiedenen eukaryotischen DNA-Ligasen hindeuten, ist unklar, ob diese aus den der katalytischen Aktivität innewohnenden Unterschieden entstehen oder aus Unterschieden, die beispielsweise durch die unterschiedlichen C- und N-terminalen Fortsätze der Enzyme verliehen werden. Zumindest in vitro weisen die gereinigten Human-DNA-Ligasen I, III und IV unterschiedliche Kapazitäten zur Verbindung einstrangiger Brüche in Hybrid-Polynucleotidsubstraten auf (Arrand et al., 1986; Tomkinson et al., 1991; Robins und Lindahl, 1996). Weiters unterscheiden sich gereinigte Säugetier-DNA-Ligasen in ihren Fähigkeiten, DNA-DSBS wieder zu verbinden. Es ist jedoch anzumerken, dass diese Untersuchungen im Gegensatz zu den verfügbaren in vivo-Daten zeigen, dass gereinigte Ligase I, aber keine andere Säugetier-DNA-Ligase die Verbindung stumpfer DNA-Enden in vitro wirksam katalysieren kann (Arrand et al., 1986; Tomkinson et al., 1991; Tomkinson et al., 1992; Robins und Lindahl, 1996). Eine mögliche Erklärung für diese Diskrepanz zwischen den in vitro- und den in vivo-Daten besteht darin, dass möglicherweise zumindest einigen der eukaryotischen DNA-Ligasen keine hohe Affinität für DNA innewohnt und sie innerhalb der Zelle durch zusätzliche Faktoren auf entsprechende DNA-Läsionen abzielen. In Einklang damit steht, dass gemäß vorliegender Erfindung die starke Wechselwirkung zwischen DNA-Ligase IV und XRCC4 identifiziert wurde.
Die Inkaktivierung von Hefe-Ku oder von Lig4p führt gleichermaßen zu einer ähnlichen dramatischen Reduktion von NHEJ im in vivo-Plasmid-DNA-DSB-Reparaturtest. Deswegen, und da das Ausmaß an DNA-Reparatur bei Hefestämmen, die sowohl in Bezug auf Ku als auch Lig4p defektiv sind, nicht weiter fällt, kommen die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes zu dem Schluss, dass diese beiden Faktoren auf dem gleichen illegitimen Rekombinationsweg arbeiten. Es ist jedoch offensichtlich, dass Ku und Lig4p unterschiedliche Funktionen bei DNA-NHEJ erfüllen, wie durch die unterschiedlichen Spektren verbleibender Plasmidreparaturprodukte gezeigt, die in den jeweiligen mutanten Stämmen erzeugt werden. Während annähernd alle verbleibenden Plasmidreparaturprodukte, die in yku70-Mutanten entstehen, Deletionen erleiden, entsprechen diese somit bei lig4-Mutantenstämmen einem Gemisch aus Deletionsprodukten und Produkten, die durch präzise DNA-Endenverbindung erzeugt werden. Gemeinsam weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass Ku auf zumindest zwei Arten arbeiten kann, um DNA-Reparatur zu verstärken. Erstes kann es freiliegende DNA-Enden vor Nuclease-Angriff schützen. Zweitens kann es dazu dienen, spezifisch Lig4p direkt oder indirekt zu den Stellen der DNA-Schädigung zu rekrutieren, möglicherweise über den C-terminalen Lig4p-Fortsatz, der bei DNA-Ligase I fehlt. Folglich können die Phänotypen von Stämmen, die Ku- oder Lig4p-Defizienz aufweisen, beide als Ergebnis der Unfähigkeit erklärt werden, mit einer Ligase effizient auf DNA-DSBs abzuzielen. Bei Ku-defizienten Stämmen kann der leichte Zugang von Nucleasen zu den DNA-Enden zu Deletionen in so gut wie allen verbleibenden NHJEJ-Reparaturprodukten führen, die vermutlich über ineffiziente DNA-Endenverbindung durch Ligase I oder Lig4p ohne Target entstehen. Im Gegensatz dazu kann, wenn Lig4p fehlt, Ku immer noch die DNA-Enden schützen, und das kann erklären, wie immer noch eine gewisse präzise Reparatur auftreten kann – wobei diese vermutlich durch DNA-Ligase I vermittelt wird. Die reduzierte Reparatur-Kinetik bei lig4-mutanten Hefe kann jedoch bedeuten, dass auch in Gegenwart von Ku Nucleasen schlussendlich Zugang zu den DNA-Termini bekommen und Deletionen in einem großen Anteil der verbleibenden Reparaturprodukte anführen. In Einklang mit dem obigen Modell wird festgestellt, dass so gut wie alle der verbleibenden NHEJ-Pro dukte, die in yku70/lig4-Doppelmutanten erzeugt wurden, beständige endständige Deletionen aufweisen.
Wechselwirkung zwischen XRCC4 und Ku/DNA-PKcs-Komplex
XRCC4-Wechselwirkung mit DNA-PKcs/Ku wurde durch Inkubation von HeLa-Zellkernextrakten mit Anti-XRCC4 oder Präimmun-Antiserum mit Reinigung der resultierenden Immunkomplexe durch Adsorption auf Protein A-Sepharose und anschließendes Analysieren durch Western-Immunblotting gezeigt.
Sowohl DNA-PKcs als auch die beiden Untereinheiten von Ku werden durch das Anti-XRCC4-Antiserum, aber nicht das Präimmunserum, immungefällt.
Bei diesen Untersuchungen wurden Immunkomplexe unter relativ milden Bedingungen von 0,25 M NaCl und 0,1% Nonidet-P40 gewaschen. Wenn jedoch Wäschen unter verschärften Bedingungen eingesetzt wurden (beispielsweise in Gegenwart von 1 M NaCl, 0,1% Nonidet-P40 und 50 μg/ml Ethidiumbromid) wurde die Wechselwirkung zwischen XRCC4 und Ku/DNaPkcs beseitigt.
Gemeinsam genommen zeigen diese Daten, dass, obwohl die Wechselwirkung zwischen Ku/DNA-PKcs und XRCC4 spezifisch zu sein scheint, sie relativ schwach ist.
Die Wechselwirkung kann unter Einsatz geeigneter Mittel gehemmt werden, einschließlich Peptidfragmenten der jeweiligen Proteine. Derartige Mittel können unter Einsatz von Testverfahren identifiziert und erhalten und in therapeutischen und anderen Kontexten eingesetzt werden, wie oben offenbart.
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Claims

Testverfahren auf eine Verbindung, die fähig ist, die Wechselwirkung oder Bindung zwischen XRCC4 und DNA-Ligase IV oder XRCC4 und DNA-PK_CS/Ku oder XRCC4, DNA-Ligase IV und DNA-PK_CS/Ku zu modulieren, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (a) das In-Kontakt-Bringen einer Substanz, die XRCC4 oder ein Peptidfragment von XRCC4 oder ein Derivat, eine Variante oder ein Analog davon umfasst, das bzw. die zur Bindung von DNA-Ligase IV oder DNA-PK_CS/Ku fähig ist, einer Substanz, die DNA-Ligase IV oder ein Peptidfragment von DNA-Ligase IV oder eine Variante, ein Derivat oder ein Analog davon, die bzw. das zur Bindung von XRCC4 fähig ist, und/oder DNA-PK_CS/Ku oder ein Peptidfragment von DNA-PK_CS/Ku oder eine Variante, ein Derivat oder ein Analog davon umfasst, die bzw. das zur Bindung von XRCC4 fähig ist, mit einer Testverbindung, unter Bedingungen, worin, wenn die Testverbindung kein Inhibitor für Wechselwirkung oder Bindung zwischen den Substanzen ist, die Substanzen in Wechselwirkung treten oder sich verbinden; und (b) das Bestimmen der Wechselwirkung oder Bindung zwischen den Substanzen.
Testverfahren auf eine Verbindung, die fähig ist, die Wechselwirkung oder Bindung zwischen XRCC4 und DNA-Ligase IV oder XRCC4 und DNA-PK_CS/Ku oder XRCC4, DNA-Ligase IV und DNA-PK_CS/Ku zu modulieren, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (a) das In-Kontakt-Bringen einer Substanz, die XRCC4 oder ein Peptidfragment von XRCC4, das mit DNA-Ligase IV oder DNA-PK_CS/Ku in Wechselwirkung tritt, oder ein Derivat, eine Variante oder ein Analog davon umfasst, das mit DNA-Ligase IV oder DNA-PK_CS/Ku in Wechselwirkung tritt, oder die DNA-Ligase IV oder DNA-PK_CS/Ku oder ein Peptidfragment von DNA-Ligase IV oder DNA-PK_CS/Ku, das mit XRCC4 in Wechselwirkung tritt, oder ein Derivat, eine Variante oder ein Analog davon umfasst, das bzw. die mit XRCC4 in Wechselwirkung tritt, mit einer Testverbindung; und (b) das Bestimmen der Wechselwirkung zwischen den Substanzen und der Testverbindung.
Testverfahren auf eine Verbindung, die fähig ist, die Aktivität von DNA-Ligase IV zu beeinflussen, wenn sie mit XRCC4 in Wechselwirkung tritt, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (a) das In-Kontakt-Bringen von DNA-Ligase IV und einer Testverbindung in Gegenwart von XRCC4; und (b) das Bestimmen von DNA-Ligase-Aktivität.
Testverfahren nach Anspruch 3, worin die Aktivität von DNA-Ligase durch Adenylierung oder Markierung derselben unter Verwendung eines ATP-Analogs oder durch ihre Fähigkeit bestimmt wird, Stränge von DNA oder DNA-Analogen zu verbinden.
Testverfahren, umfassend: (a) das In-Kontakt-Bringen einer Substanz, die DNA-PK_CS/Ku oder geeignete Peptidfragmente von DNA-PK_CS/Ku oder ein Derivat, eine Variante oder ein Analog davon umfasst, das bzw. die zur Phosphorylierung von XRCC4 fähig ist, einer Substanz, die XRCC4 oder ein Peptidfragment von XRCC4 oder ein Derivat, eine Variante oder ein Analog davon umfasst, das bzw. die eine durch DNA-PK_CS phosphorylierte Stelle umfasst, mit einer Testverbindung; und (b) das Bestimmen der Phosphorylierung an der Stelle.
Peptidfragment von DNA-Ligase IV, das zum Modulieren der Wechselwirkung zwischen XRCC4 und DNA-Ligase IV oder XRCC4 und DNA-Ligase IV und DNA-PK_CS/ Ku fähig ist und eine Sequenz aufweist, die in Human-DNA-Ligase IV zwischen den Aminosäureresten 677–727 der in 2 gezeigten Human-DNA-Ligase IV-Sequenz zu finden ist.
Isolierte Nucleinsäure, die für ein Peptid nach Anspruch 6 kodiert.
Peptidfragment oder isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 6 oder 7 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung durch Therapie, welches das Modulieren zellulärer DNA-Reparaturaktivität umfasst.
Verwendung eines Peptidfragments oder einer isolierten Nucleinsäure nach Anspruch 6 oder 7 zur Herstellung eines Medikaments zum Modulieren zellulärer DNA-Reparaturaktivität.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, das nach dem Erhalt einer Verbindung, die fähig ist, die Wechselwirkung oder Bindung zwischen XRCC4 und DNA-Ligase IV oder XRCC4 und DNA-PK_CS/Ku oder XRCC4 und DNA-Ligase IV und DNA-PK_CS/Ku zu modulieren, weiters das Formulieren der Verbindung zu einer Zusammensetzung umfasst, die einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, das nach dem Erhalt einer Verbindung, die fähig ist, die Wechselwirkung oder Bindung zwischen XRCC4 und DNA-Ligase IV oder XRCC4 und DNA-PK_CS/Ku oder XRCC4 und DNA-Ligase IV und DNA-PK_CS/Ku zu modulieren, weiters das Bereitstellen der Verbindung für eine Zelle umfasst, um die zelluläre DNA-Reparaturaktivität zu modulieren, wobei die Zelle nicht Teil des menschlichen oder eines Tierkörpers ist.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, das nach dem Erhalt einer Verbindung, die fähig ist, DNA-Ligase IV-Aktivität zu beeinflussen, weiters das Formulieren der Verbindung zu einer Zusammensetzung umfasst, die einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten umfasst.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, das nach dem Erhalt einer Verbindung, die fähig ist, DNA-Ligase IV-Aktivität zu beeinflussen, weiters das Bereitstellen einer Verbindung für eine Zelle umfasst, um die zelluläre DNA-Reparaturaktivität zu modulieren, wobei die Zelle nicht Teil des menschlichen oder eines Tierkörpers ist.
Verfahren nach Anspruch 5, das nach dem Erhalt einer Verbindung, die fähig ist, DNA-PK_CS/Ku-Phosphorylierung von XRCC4 zu beeinflussen, weiters das Formulieren der Verbindung zu einer Zusammensetzung umfasst, die einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten umfasst.
Verfahren nach Anspruch 5, das nach dem Erhalt einer Verbindung, die fähig ist, DNA-PK_CS/Ku-Phosphorylierung von XRCC4 zu beeinflussen, weiters das Bereitstellen der Verbindung für eine Zelle umfasst, um die zelluläre DNA-Reparaturaktivität zu modulieren, wobei die Zelle nicht Teil des menschlichen oder eines Tierkörpers ist.