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Die vorliegende Erfindung betrifft
Verfahren, durch die Retroviren und Retrotransposone (Retroposone)
ihr genetisches Material in das Genom einer eukaryotischen Wirtszelle
insertieren, um einen produktiven Infektionszyklus durchzuführen. Genauer gesagt
betrifft sie Proteine der Wirtszelle, von denen nun festgestellt
worden ist, dass sie für
effiziente Retrotransposition erforderlich sind, die im gesamten eukaryotischen
Bereich in hohem Maße
konserviert werden, aber für
das Funktionieren der Zelle unter den meisten normalen Bedingungen
nicht erforderlich sind. Diese Proteine stellen neue Ziele für antiretrovirale
Arzneimittel dar. Außerdem
werden Testsysteme bereitgestellt, mit denen antiretrovirale Arzneimittel
in vivo und in vitro gescreent und getestet werden können.
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Die Erfindung basiert auf der den
Lehren nach dem Stand der Technik widersprechenden überraschenden
Entdeckung, dass Ku-assoziierte DNA-Reparaturmechanismen an Retrovirus-
und Retrotransposon-Nucleinsäureintegration
beteiligt sind. Durch experimentelle Arbeit, die hierin beschrieben ist,
wird gezeigt, dass Retrovirus- und/oder Retrotransposon-Aktivität sowohl
bei Hefe- als auch Säugetier-Zellen
gehemmt wird, wenn die Ku-Funktion in den Zellen reduziert ist.
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Retroviren und Retrotransposone
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Retroviren sind RNA-Viren, die eine DNA-Kopie
(cDNA) ihres Genoms in das Wirtschromosom insertieren müssen, um
eine produktive Infektion durchzuführen. Im integrierten Zustand
wird das Virus als Provirus bezeichnet (Varmus, 1988). Einige eukaryotische
transponierbare DNA-Elemente stehen insofern mit Retroviren in Zusammenhang, als
sie über
ein RNA-Zwischenprodukt transponieren. Diese Elemente, die als Retrotransposone
oder Retroposone bezeichnet werden, werden in RNA transkribiert,
die RNA wird in doppelstrangige (ds) DNA kopiert, dann wird die
dsDNA in das Genom der Wirtszelle insertiert.
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Verfügbare Belege sprechen dafür, dass
die Integration von Retroviren und Retrotransposonen durch vollkommen
analoge Mechanismen stattfindet und dass Retroviren als Retrotransposone
mit einer extrazellulären
Phase ihres Lebenszyklus betrachtet werden können. Beispielsweise sind von
den Ty1- und Ty5-Retrotransposonen der Hefe Saccharomyces cerevisiae
gezeigt worden, dass sie durch einen Mechanismus desselben Typs
in das Wirts-Hefegenom integriert werden, wie er von Säugetier-Retrotransposonen
und Retroviren eingesetzt wird, um sich in Säugetier-Wirtszellen-DNA zu
integrieren (Boeke et al., 1985; Garfinkel, 1985; Grandgenett und Mumm,
1990; Boeke und Sandmeyer, 1991).
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Retroviren stellen ein beträchtliches
Risiko für
die Gesundheit von Mensch und Tier dar, wie aus der Tatsache ersichtlich
ist, dass Retroviren Krankheiten wie erworbenes Immunschwächesyndrom (AIDS;
verursacht durch Human-Immunschwäche-Virus,
HIV-1 ), verschiedene Arten von Krebs bei Tieren und T-Zellen-Leukämie/Lymphom
bei Erwachsenen (Varmus, 1988) verursachen; außerdem sind Retroviren mit
einer Vielzahl anderer häufiger
Störungen
in Verbindung gebracht worden, darunter Typ-I-Diabetes und Multiple
Sklerose (Conrad et al., 1997; Perron et al.; 1997 und Benoist und
Mathis, 1997). In vielen, aber nicht in allen Fällen ist die Krebsbildung durch
bestimmte Retroviren eine Folge dessen, dass sie Oncogene tragen.
Weiters kann retrovirale Integration und Retrotransposition zu mutagener
Inaktivierung von Genen am Ort ihrer Einfügung führen oder kann zur abweichenden
Expression von benachbarten Wirtszellen führen, was in beiden Fällen schädliche Folgen
für den
Wirtsorganismus haben kann. Retroviren werden auch immer häufiger für die Genabgabe
eingesetzt und es ist wahrscheinlich, dass sie immer wichtigere
Rollen bei der Gentherapie spielen werden. Es ist daher von großer kommerzieller
und medizinischer Bedeutung zu verstehen, wie Retroviren funktionieren
und wie sie gesteuert werden können.
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In den letzten Jahren sind enorme
Bemühungen
unternommen worden, um Inhibitoren für retrovirale Infektion zu
identifizieren, da diese Mittel potentielle Verwendung bei der Bekämpfung von
auf Retroviren zurückzuführende Erkrankungen
haben. Bisher haben sich die meisten Arzneimittel-Entwicklungsprogramme
auf auf viral kodierte Produkte konzentriert. In Anbetracht des
kurzen Lebenszyklus von Retroviren und der ihnen innewohnenden hohen
Raten genetischer Veränderung
ist jedoch vorherzusehen, dass ein häufiges Problem bei derartigen
Strategien darin bestehen wird, dass Arzneimittelresistente Virusderivate
durch Veränderungen
des viral kodierten Zielmoleküls
entstehen werden (siehe beispielsweise Sandstrom und Folks, 1996,
und die darin angeführten
Verweise). Daher können
die meisten antiretroviralen Arzneimittel, die viral kodierte Proteine
stören, nur
eine begrenzte nützliche
Lebensdauer aufweisen. Eine weitere Beschränkung für Arzneimittel, die auf Virusproteine
abzielen, besteht darin, dass viele keine breite Anwendbarkeit haben
und inhärent
in hohem Maße
spezifisch für
ein bestimmtes Virus oder sogar einen bestimmten Stamm eines bestimmten Virus
sein werden.
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Retrovirale Integration
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In Anbetracht dessen, was über den
retroviralen Lebenszyklus bekannt ist, besteht ein attraktives Ziel
für antiretrovirale
Therapeutika darin, die Integration der viralen cDNA in das Wirtsgenom
zu stören.
Am wichtigsten ist dabei, dass dieses Ereignis wesentlich für die effiziente
Viren-Verbreitung ist (beispielsweise Sakai et al., 1993; ein Überblick
ist Varmus, 1988; Grandgenett und Mumm, 1990, zu entnehmen). Außerdem wäre, da nicht
angenommen wird, dass ähnliche
Typen von Prozessen für
das Funktionieren der meisten sich normal vermehrenden Wirtszellen
wesentlich sind, nicht zu erwarten, dass Inhibitoren retroviraler
Integration für
den Wirt besonders toxisch sind.
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Im Lichte dieser und anderer Überlegungen sind
retrovirale reverse Transkriptasen und Integrasen für die Arzneimittel-Entwicklung
anvisiert worden. Obwohl damit gewisse Erfolge erzielt werden konnten,
ist es wahrscheinlich, dass hohe Raten genetischer Veränderung
durch das anvisierte Virus und Variationen zwischen verschiedenen
viralen Stämmen
den Anwendungsbereich für
Anti-Reverse-Transkriptase- und Anti-Integrase-Arzneimittel, insbesondere langfristig
gesehen, einschränken.
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Ein Weg, die oben dargelegten Probleme
zu überwinden,
bestünde
darin, Wirtszellenproteine zu identifizieren, die für die effiziente
retrovirale Integration erforderlich sind, und Arzneimittel abzuleiten,
die diese Moleküle
hemmen. Erstens wäre
es sehr schwie rig oder unmöglich
für das
Virus, auf solche Weise zu mutieren, dass es der Arzneimittel-Wirkung ausweichen
könnte.
Zweitens wäre
zu erwarten, dass solche Wirtszellenproteine für die Verbreitung der meisten
Retroviren notwendig ist, was bedeutet, dass Arzneimittel, die sie
stören,
gegen ein breites Spektrum von Retrovirus-Typen wirksam wären.
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Bisher schien es unwahrscheinlich,
dass es einen Wirtsfaktor (oder Wirtsfaktoren) geben könnte, der
für die
retrovirale Integration erforderlich, aber für normales Wirtszellenwachstum
nicht notwendig ist. Der Grund dafür ist, dass mehrere Forschungsreihen darauf
hindeuten, dass alle Schritte, die für das kovalente Binden von
Retrovirus- oder Retrotransposon-cDNA an das Ziel-DNA-Molekül erforderlich sind,
in vitro durch gereinigtes retrovirales Integraseprotein durchgeführt werden
können
(siehe beispielsweise Craigie et al., 1990; Bushman et al., 1990;
Katheter et al., 1990; Grandgenett und Mumm, 1990). Außerdem wurde,
obwohl angenommen wurde, dass Wirtsfaktoren die virale Integration
unterstützen,
angenommen, dass diese "Haushaltungsproteinen" entsprechen würden, die
für die
Lebensfähigkeit
der Wirtszelle wesentlich sind. Daher wurde, wenn tatsächlich Wirts-"Helfer"-Proteine
vorhanden sind, erwartet, dass es in einem therapeutischen Kontext nicht
der Mühe
wert wäre,
sie mit Arzneimitteln zu hemmen, da dies auch die Zellen den Wirts
abtöten würde.
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Ungeachtet dieser Vorhersagen begründet sich
die vorliegende Erfindung überraschenderweise auf
der Entdeckung, dass eine Reihe von Wirtszellenproteinen für die effiziente
Retrotransposonintegration wesentlich sind, obwohl sie unter den
meisten Umständen
für die
Lebensfähigkeit
der Wirtszelle nicht notwendig sind. Diese Faktoren, die Komponenten
eines Systems sind, das als Ku-assoziierter DNA-Reparaturapparat
bezeichnet wird, sind daher sehr attraktive Ziele für die antiretrovirale
Therapie.
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Das Ku-assoziierte DNA-Reparatursystem
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Frühere Arbeiten haben gezeigt,
dass das Protein Ku bei Organismen von Menschen über Drosophilia melanogaster
bis S. cerevisiae eine essentielle Komponente des DNA- Reparaturapparats
ist (Jackson und Jeggo, 1995; Boulton und Jackson, 1996; Boulton
und Jackson, 1996 und die darin genannten Verweise). Spezifisch
wird der Typ von DNA-Reparaturprozess, an dem Ku beteiligt ist,
als illegitime DNA-Endenverbindung oder DNA-Doppelstrangbruch- (DSB-)
Reparatur bezeichnet. Da sich Ku in vitro an DNA-DSBs bindet, ist
vermutet worden, dass sich Ku an DNA-DSBs bindet, wenn sie in vivo auftreten,
und dazu beiträgt,
ihre effiziente Ligation zu fördern.
Außerdem
ist Ku für
V(D)J-Rekombination erforderlich, ein DNA-"Schneide-und-Anklebe"-Verfahren,
das ein Antigen-Bindungsmolekül
des Immunsystems von Wirbeltieren erzeugt (Überblicke sind Lewis, 1994;
Jackson und Jeggo, 1995 zu entnehmen).
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Bei allen Organismen, bei denen es
identifiziert worden ist, liegt Ku als ein Heterodimer aus zwei Polypeptiden
mit etwa 70 kDa (bei Menschen als Ku70 bezeichnet; bei S. cerevisiae
alsYku70p oder Hdf1 p) und 80 kDa (bei Menschen Ku80 oder Ku86; bei
S. cerevisiae Yku80p oder Hdf2p) vor. Literaturstellen dafür sind nachstehend
angeführt.
Zellen mit Ku-Defekt sind überempfindlich
für das
Abtöten durch
ionisierende Strahlung oder durch radiomimetische Mittel. Jedoch
hat das Fehlen von Ku-Funktion sowohl in Hefe- als auch in Säugetier-Systemen
unter normalen Bedingungen minimale oder nicht nachweisbare Auswirkungen
auf die Lebensfähigkeit
der Zelle und die Zeltwachstumsraten (Boulton und Jackson, 1996a,
Milne et al., Blunt et al.; Jackson und Jeggo und die darin genannten
Verweise; Nussenzweig et al. und Zhu et al.).
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Vor kurzen sind zusätzliche
Komponente des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs identifiziert worden.
Eine davon ist das Säugetierprotein
XRCC4, dessen Mangel Defekte bei der DSB-Reparatur und V(D)J-Rekombination
hervorruft (Li et al., 1995). Andere identifizierte sind die Hefefaktoren
Rad50p, Mre11 p und Xrs2p (siehe unten) und die DNA-Ligase Lig4p
(siehe unten). Da menschliche Zellen Homologe aller dieser letztgenannten
Faktoren aufweisen, sollten sie im Wesentlichen bei allen Eukaryoten
bei der DSB-Reparatur und verwandten Prozessen funktionieren.
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Reeves und Sthoeger sowie Chan et
al. offenbaren cDNA und Aminosäuresequenzen
von Human-Ku70. Cai et al. offenbaren die chromosomale Position
und Expression der für
Ku70 und Ku80 kodierenden Gene in Human-Zelllinien und normalen Geweben,
während
Yaneva et al. die von cDNA abgeleitete Aminosäuresequenz von Human-Ku80 offenbaren.
Drosophila Ku (Eidotterproteinfaktor 1) wird von Jacoby und Wensink
offenbart. Feldmann und Winnaker, Milne et al., Beall et al. sowie
Boulton und Jackson (1996a, 199b) nennen Sequenz- und funktionelle
Information über
Hefe (Saccharomyces cerevisiae) Ku70 und Ku80.
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Alani et al. offenbart die Nucleinsäure- und Aminosäuresequenzen
von Hefe RAD50. Human-RAD50 und MRE11 werden in Dolganov et al. bzw.
Petrini et al. beschrieben. Ivanov et al. beschreibt XRS2 von Hefe.
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Ku-assoziierte DNA-Reparatur, die
ein illegitimer DNA-Endenreparatur-Mechanismus ist, erfordert einen
diskreten Satz von Genprodukten (wie erörtert) und ist ein von anderen
DNA-Reparaturwegen getrennter Weg, der homologe Rekombinationsreparatur,
Nucleotidausschnittsreparatur, Basenausschnittsreparatur und DNA-Fehlübereinstimmungsreparaturumfasst.
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Überlegungen für den experimentellen
Ansatz, der bei der vorliegenden Erfindung angewandt wurde
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Die vorliegende Erfindung wurde gemacht, indem
getestet wurde, ob Ku im normalen Lebenszyklus von Retrotransposonen
eine positive oder negative Rolle spielt, obwohl mehrere Hinweisketten
darauf hindeuten, dass dies sehr unwahrscheinlich ist.
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Ein Grund für das Interesse der Erfinder
bestand darin, dass lineare cDNA als Zwischenprodukt während des
Lebenszyklus von Retroviren und Retrotransposonen erzeugt wird,
was die Möglichkeit erkennen
ließ,
dass sich Ku daran binden kann. Die vorherrschende Ansicht ist jedoch
die, dass Ku nicht fähig
ist, sich an die virale cDNA zu binden, da angenommen wird, dass
dies immer eng mit viral kodierten Faktoren verbunden ist.
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Dennoch war man der Ansicht, dass
nicht ausgeschlossen werden kann, dass Ku zur Retrotransposon-cDNA
Zugang finden kann, da unveröffentlichte
biochemische Daten aus dem Labor der Erfinder darauf hinweisen,
dass sich Ku mit einer Hartnäckigkeit,
an die beinahe kein anderes charakterisiertes Protein herankommt,
an DNA-Enden binden kann.
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Die zweite Überlegung, die zu den Untersuchungen
führte,
war der Glaube der Erfinder an eine Möglichkeit, dass der Ku-assoziierte
DNA-DSB-Reparaturapparat des Wirts eine Rolle bei der Retrovirus-
und Retrotransposon-Integration spielen könnte. Obwohl die Retrotransposon-
oder Retrovirus-Integrase alle Schritte durchführt, die notwendig sind, um die
cDNA kovalent an das Ziel-DNA-Molekül zu binden (beispielsweise
Craigie et al., 1990; Bushman et al., 1990; Katz et al., 1990),
sind "Einstrang-Lückenfüllungs-
und Ligations-" Schritte erforderlich, bevor die retrovirale/Retrotransposon-DNA
stabil aufgenommen werden kann. Ungeachtet der Tatsache, dass nicht
bekannt ist, dass der Ku-assoziierte DNA-Reparaturapparat bei Einstrang-Lückenfüllungs-
und Ligationsreaktionen eine Funktion erfüllt, wird nachstehend dennoch
gezeigt, dass er tatsächlich
für die
effiziente Integration der Hefe- Ty1- und Ty5-Retrotransposone erforderlich
ist und auch die Integration retroviraler cDNA in Säugetierzellen
beeinflusst.
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Diese überraschenden Ergebnisse liefern
einen Hinweis dafür,
dass der Ku-assoziierte DNA-Reparaturapparat eine allgegenwärtige Rolle
bei Retrotransposon-Integrationsprozessen spielt und eröffnen neue
Möglichkeiten
für die
antiretrovirale Arbeit, wie erörtert
wurde.
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Ein weiterer Aspekt der vorliegenden
Erfindung sieht die Verwendung einer Substanz, die als Inhibitor
von Ku-assoziierter DNA-Reparatur identifiziert ist, bei der Herstellung
eines Medikaments zum Hemmen von Retrovirus- und/oder Retrotransposonaktivität vor.
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Ein weiterer Aspekt der vorliegenden
Erfindung sieht das Bereitstellen der als Inhibitor von Ku-assoziierter
DNA-Reparatur identifizierten Substanz beim Hemmen von Retrovirus-
und/oder Retrotransposon-Aktivität
für eine
Zelle vor.
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Das Verfahren kann das Bereitstellen
einer Zusammensetzung umfassen, die zumindest eine andere Komponente,
beispielsweise einen pharmazeutisch annehmbaren Exizipienten, umfasst,
wie nachstehend näher
erörtert.
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Die Substanz kann durch Therapie
(die Prophylaxe einschließen
kann) in vivo Zellen in einem Menschen- oder Tierkörper zugeführt werden,
oder in planta, ex vivo oder in vitro. Das wird ebenfalls an derer
Stelle hierin näher
erörtert.
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Die Integration eines Retrovirus
und/oder Retrotransposons in das Genom einer Zelle kann durch Behandlung
der Zelle mit einer Substanz gehemmt werden, die ein Inhibitor für Ku-assoziierte DNA-Reparatur
ist. Beispiele für
solche Substanzen sind Wortmannin und LY294002 (Hartley et al., 1995).
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Die Hemmung von Ku-assoziierter DNA-Reparatur
kann auf zahlreiche verschiedene Arten erreicht werden, ohne dass
dies das Wesen und den Schutzumfang der Erfindung einschränkt.
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Bei bestimmten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung ist Ku selbst das Ziel für die Hemmung,
d.h. die Beteiligung von Ku an der Ku-assoziierten DNA-Reparatur
wird gehemmt, um die Ku-assoziierte DNA-Reparatur zu hemmen. Ku
funktioniert nur als Heterodimer (der Untereinheiten Ku70 und Ku80).
Daher besteht eine Möglichkeit,
die Ku-Aktivität
zu hemmen, darin, die Wechselwirkung zwischen den beiden Untereinheiten
zu hemmen. Eine weitere Möglichkeit
besteht darin, eine Substanz zu verwenden, die die Wechselwirkung
von Ku mit DNA oder einer anderen Komponente des Ku-assoziierten
DNA-Reparaturwegs hemmt. Andernfalls muss nicht auf Ku selbst abgezielt
werden, und es kann die Funktion einer oder mehrerer anderer Komponenten
des Ku-asso ziierten DNA-Reparaturwegs gehemmt werden (wie weiter
unten detaillierter erörtert).
Selbstverständlich
kann eine Substanz die Aktivität
einer Komponente des Wegs, wie Ku, nicht (oder nicht nur) durch
hemmen der physikalischen Wechselwirkung zwischen der Komponente
und einer anderen hemmen, sondern auch durch Bindung an eine aktive
Stelle oder durch Bindung auf eine Weise, die eine sterische Wirkung
auf die Kosformation einer aktiven Stelle und somit auf die Aktivität der Komponente
hat. Wie genau die Aktivität
oder Funktion einer Komponente des Wegs gehemmt wird, muss für die praktische
Umsetzung der vorliegenden Erfindung nicht relevant sein.
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Die Sequenzen verschiedener Komponenten
des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs bei Menschen und Hefe sind
von der GenBank-Datenbank unter den folgenden Hinterlegungsnummern
erhältlich:
Human-Ku70 – J04611;
Human-Ku80 – M30938;
S. cerevisiae-Ku 70 – X70379;
S. cerevisiae-Ku80 – Z49702;
Human-Ligase IV -X83441; S. cerevisiae-Ligase IV – YOR005c
am rechten Arm von S. cerevisiae-Chromosom XV, Hinterlegungsnummer Z74913;
Human-Rad50 – U63139;
S. cerevisiae-Rad50p – X14814;
Human-Mre11 – U37359;
S. cerevisiae Mre11 – D11463;
Human-XRCC4 – U40622
(offener Leserahmen mit 334 Aminosäuren); S. cerevisiae Xrs2p – L22856.
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Die Aktivität oder Funktion einer Komponente
des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs (wie Ku) kann wie angeführt, durch
eine Substanz gehemmt werden, die auf irgendeine Weise mit der Komponente
in Wechselwirkung tritt. Bei einer Alternative wird die Regulierung
auf Nucleinsäureebene
eingesetzt, um die Aktivität
oder Funktion durch Herabregulierung der Produktion der Komponente
zu hemmen.
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Beispielsweise kann Unterexpression
eines Gens unter Einsatz von Antisense-Technologie erreicht werden.
Die Verwendung von Antisense-Genen oder partiellen Gensequenzen
zum Herabregulieren der Genexpression ist nun bekannt.
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Antisense-Oligonucleotide können so
konstruiert sein, dass sie sich an die komplementäre Sequenz
von Nucleinsäure,
Prä-mRNA
oder reifer mRNA hybridisieren, wodurch die Produktion einer Komponente
des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs, wie Ku, oder einer Einheit
davon, für
die eine bestimmte DNA-Sequenz kodiert, gestört wird, so dass ihre Expression
verringert oder teilweise oder im Wesentlichen vollständig verhindert
wird. Zusätzlich
zum Abzielen auf Kodierungssequenz können Antisense-Techniken eingesetzt
werden, um auf Kontrollsequenzen eines Gens abzuzielen, beispielsweise
in einer 5'-Flankierungssequenz, wodurch die Antisense-Oligonucleotide
die Expression von Kontrollsequenzen stören können. Die Konstruktion von Antisense-Sequenzen
und ihre Verwendung werden beispielsweise in Peyman und Ulman, Chemical
Review 90, 543–584
(1990), und Crooke, Ann. Retrovirus. Pharmacol. Toxicol. 32, 329–376 (1992),
beschrieben.
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Oligonucleotide können in vitro oder ex vivo zur
Verabreichung erzeugt werden, oder Antisense-RNA kann in vivo innerhalb
von Zellen erzeugt werden, in denen Herabregu-lierung erwünscht ist.
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Dann kann Doppelstrang-DNA unter
die Kontrolle eines Promotors in einer "reversen Ausrichtung" gestellt
werden, so dass die Transkription des Antisense-Strangs der DNA
RNA ergibt, die zu normaler mRNA komplementär ist, die aus dem Sense-Strang
des Zielgens transkribiert wird. Es wird angenommen, dass sich die
komplementäre
Antisense-RNA-Sequenz dann an mRNA bindet, um einen Duplex zu bilden,
wodurch die Translation der endogenen mRNA aus dem Zielgen in Protein
gehemmt wird. Ob es sich dabei um den tatsächliche Wirkmechanismus handelt,
ist immer noch unsicher. Es ist jedoch eine erwiesene Tatsache,
dass die Technik funktioniert.
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Es muss nicht die komplette Sequenz
verwendet werden, die der Kodierungssequenz in der reversen Ausrichtung
entspricht. Beispielsweise können
Fragmente mit ausreichender Länge
verwendet werden. Für
Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung ist es Routine, Fragmente
verschiedener Größen und von
verschiedenen Teilen der Kodierungsoder Flankierungssequenzen eines
Gens zu screenen, um das Ausmaß der
Antisense-Hemmung
zu optimieren. Es kann vorteilhaft sein, das Initialions-Methionin-ATG-Codon und
vielleicht ein oder mehrere Nucleotide stromauf vom Initiationscodon
aufzunehmen. Ein geeignetes Fragment kann etwa 14 bis 23 Nucleotide
aufweisen, z. B. etwa 15, 16 oder 17.
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Viele bekannte Techniken und Vorschriften zur
Manipulation von Nucleinsäure,
beispielsweise bei der Herstellung von Nucleinsäurekonstrukten, Mutagenese,
Sequenzierung, Einführung
von DNA und Zellen sowie Genexpression und Analyse von Proteinen,
werden im Detail in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel
et al. (Hrsg.), John Wiley & Sons,
1992, und in Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 2. Aufl. Sambrook
et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.
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Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass Nucleinsäure verwendet
wird, die bei der Transkription ein Ribozym erzeugt, das fähig ist,
Nucleinsäure an
einer spezifischen Stelle zu spalten – und somit auch bei der Beeinflussung
von Genexpression nützlich
ist. Literatur zum Hintergrund für
Ribozyme ist z. B. Kashani-Sabet und Scanlon, Cancer Gene Therapy
2(3), 213–223
(1995), sowie Mercola und Cohen,. Cancer Gene Therapy 2(1), 47–59 (1995).
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Es ist bekannt, dass pharmazeutische
Forschung, die zur Identifizierung eines neuen Arzneimittels führt, das
Screenen einer sehr großen
Anzahl von Kandidaten-Substanzen sowohl bevor als auch nachdem eine
Leitsubstanz gefunden worden ist, umfassen kann. Das ist ein Faktor,
der pharmazeutische Forschung sehr teuer und zeitaufwendig machen
kann. Mittel, um das Screening-Verfahren zu unterstützen, können beträchtliche
kommerzielle Bedeutung und Nützlichkeit
haben. Ein solches Mittel zum Screenen bezüglich Substanzen, die potentiell nützlich sind,
um retrovirale und/oder Retrotransposon-Aktivität zu hemmen, wird durch die
vorliegende Erfindung bereitgestellt. Substanzen, die als Modulatoren
für Ku-assoziierte
DNA-Reparatur identifiziert worden sind, stellen einen Fortschritt
im Kampf (beispielsweise) gegen retrovirale Erkrankungen dar, da sie
die Basis für
die Konstruktion und Untersuchung von Therapiemitteln zur Verwendung
in vivo liefern.
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Ein Verfahren zum Screenen bezüglich einer Substanz,
die Retrovirus- und/oder Retrotransposon-Aktivität hemmt, kann das Kontaktieren
einer oder mehrerer Testsubstanzen mit einer oder mehreren Komponenten
des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs eines Organismus von Interesse
in einem geeigneten Reaktionsmedium Testen bezüglich Wechselwirkung zwischen
Substanz und Komponente umfasst, beispielsweise durch Bewerten der
Aktivität
des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs oder einer Komponente davon
und das Vergleichen dieser Aktivität mit der Aktivität in vergleichbarem
Reaktionsmedium, das nicht mit der bzw. den Testsubstanzen) behandelt
ist. Ein Unterschied in der Aktivität zwischen den behandelten
und den unbehandelten Proben ist ein Indikator für einen Modulationseffekt der
relevanten Testsubstanz oder -substanzen. Es kann zumindest vorläufig ausreichen,
anstelle der tatsächlichen
biochemischen Aktivität
nur die physikalische Wechselwirkung zwischen Testsubstanz und Wegkomponente
oder Untereinheit davon in Testproben zu bewerten.
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Gemäß weiterer Aspekte betrifft
die vorliegende Erfindung das Screenen von Kandidatensubstanzen
auf ihr Potential als Inhibitoren für Retrovirus- und/oder Retrotransposon-Aktivität. Im Speziellen stellt
sie ein Verfahren bereit, mit dem Testsubstanzen auf die Hemmung
oder Aktivierung des Wegs gescreent werden können, obwohl klarerweise Inhibitoren
des Wegs von primärem
Interesse sind.
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Gemäß einem weiteren Aspekt der
vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Screenen bezüglich einer
Substanz bereitgestellt, die ein Inhibitor für Retrovirus- und/ oder Retrotransposon-Aktivität ist, insbesondere
Nucleinsäure-Integration
oder Transposition von Retrovirus und/oder Retrotransposon, welches
Verfahren umfasst:
das Bereitstellen eines Ku-assoziierten
DNA-Reparaturwegs;
das Einwirkenlassen einer Testsubstanz auf
den Weg unter Bedingungen, die normalerweise zur Aktivierung des
Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs führen würden; und
das Suchen nach
einem Endpunkt, der die Aktivierung des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs anzeigt; wodurch
die Hemmung dieses Endpunkts die Hemmung des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs durch
die Testsubstanz anzeigt.
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Der Weg kann in einer Zelle vorgesehen sein,
die der Testsubstanz auszusetzen ist,. oder der Test kann in einem
Ku-assoziierten DNA-Reparatur-System in vitro durchgeführt werden,
das die Genauigkeit und Effizienz der Verbindung von DNA-Strangbrüchen misst,
die durch das Behandeln intakter DNA mit Restriktionsendonucleasen,
Chemikalien oder Strahlung erzeugt worden sind.
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Die Aktivierung des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs
kann durch DNA-Doppelstrangbrüche
(DSBs), Einstranglücken
in der DNA-Doppelhelix oder durch andere Unterbrechungen an der DNA-Doppelhelix
verursacht werden. Diese Strukturen befinden sich an den Enden von
retroviraler und Retrotransposon-DNA und treten als Zwischenprodukt
im retroviralen Integrations- und Retrotranspositionsprozess auf.
Um auf Ku-assoziierte Reparatur, Retrovirus oder retrovirale DNA
zu testen, können Zwischenprodukte
bei der retroviralen Integration oder Retrotransposon-Integration
oder synthetische Präparate
von DNA bereitgestellt werden, die eines davon nachahmen. Die Aktivierung
des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs führt zum Schutz von DNA vor übermäßigem Abbau
und führt
zu Störungen
der DNA-Doppelhelix über
die Ligation von DNA-DSBs oder Einstrangbrüchen.
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Der Endpunkt des Screens kann daher
die Reparatur derartiger Störungen
sein. Dass eine Substanz den Ku-assoziierten DNA-Reparaturweg hemmt,
kann durch die Überempfindlichkeit
von Säugetierzellen
gegen ionisierende Strahlung verifiziert werden (z. B. Jackson und
Jeggo und die darin angeführten
Verweise) oder durch Wiederverbinden von Doppelstrangbrüchen (z.
B. in einem Plasmid) in vivo (Boulton und Jackson, 1996a, 1996b).
Biochemische Verfahren, wie PCR oder Nucleinsäure-Hybridisierungs/Detektionsverfahren
können
beispielsweise eingesetzt werden, um die chemische Struktur von Integrationsprodukten
zu detektieren. Die retrovirale Integration und/oder Retro transposition
durch die Detektion unter Einsatz genetischer, biochemischer oder
histologischer Standardtechniken bewertet werden.
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Es sollte angemerkt werden, dass
beim Testen auf die Fähigkeit
einer Testsubstanz, den Ku-assoziierten DNA-Reparaturweg zu beeinflussen,
der Endpunkt, der im Test für
die Bestimmung gewählt wird,
nicht der tatsächliche
Endpunkt des DNA-Reparaturwegs (der DNA-Reparatur) sein muss, sondern die
Aktivität
sein kann, die eine Komponente des Wegs im Weg aufweist. So können beispielsweise Substanzen
auf die Fähigkeit
gescreent werden, die DNA-PK-Phosphorylierung anderer Komponenten des
Wegs, wie etwa XRCC4, zu beeinflussen.
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Selbstverständlich kann, wie an anderer Stelle
angeführt,
die Bezugnahme auf eine Komponente des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs
als Bezugnahme auf ein Derivat, eine Variante oder ein Analog der
relevanten Komponente verstanden werden, das bzw. die die erforderliche
testbare Eigenschaft oder Aktivität aufweist (z. B. die Fähigkeit,
eine andere Komponente des Wegs zu binden).
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In Hinblick der hierin bereitgestellten
Lehre, dass es möglich
ist, retrovirale und/oder Retrotransposon-Aktivität durch
Manipulation des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs zu hemmen, können Fachleute
auf dem Gebiet der Erfindung Tests für antiretrovirale Mittel konstruieren,
indem in der Erwartung, dass Substanzen, die die Aktivität des Homologs
beeinflussen, auch fähig
sein werden, die Aktivität
der Komponente zu beeinflussen, Proteine oder Fragmente davon eingesetzt
werden, die zu einer Komponente des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs
homolog sind.
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Vor, neben oder statt dem Screenen
auf die Fähigkeit,
die Ku-assoziierte DNA-Reparatur-Aktivität tatsächlich zu beeinflussen, können Testsubstanzen
auf die Fähigkeit
gescreent werden, mit einer Komponente des Wegs (wie z. B. Ku oder
einer oder beiden Untereinheiten davon) in Wechselwirkung zu treten,
beispielsweise in einem Hefe-Zweihybrid-System
(das erfordert, dass sowohl die Polypeptidkomponente als auch die Testsubstanz
in Hefe aus kodierender Nucleinsäure
exprimiert werden können).
Das kann beispielsweise als grobes Screen eingesetzt werden, bevor
eine Substanz auf die tatsächliche
Fähigkeit
getestet wird, die Aktivität
zu modulieren.
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Somit stellt die vorliegende Erfindung
gemäß einem
weiteren Aspekt ein Verfahren zum Screenen bezüglich einer Substanz bereit,
die ein Inhibitor für Retrovirus-
und/oder Retrotransposon-Aktivität,
insbesondere Nucleinsäure-Integration
von Retrovirus und/oder Retrotransposon ist, welches umfasst:
das
Bereitstellen einer Komponente eines Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs;
das
Einwirkenlassen einer Testsubstanz auf die Komponente;
das
Bestimmen der Wechselwirkung zwischen der Komponente und der Testsubstanz.
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Eine Hefe-Zweihybrid-System (z. E.
Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5, 3610–3616 (1985); Fields & Song, Nature
340, 245–246
(1989)) kann eingesetzt werden, um Substanzen zu identifizieren,
die mit einer Ku-assoziierten DNA-Reparaturweg-Komponente oder einer
Untereinheit davon in Wechselwirkung treten. Bei diesem System wird
oft eine Hefe eingesetzt, die einen auf GAL4 ansprechenden Promotor enthält, der
an β-Galactosidase-Gen
und an ein Gen (HIS3) gebunden ist, das es der Hefe ermöglicht,
sich in Abwesenheit der Aminosäure
Histidin zu vermehren und sich in Gegenwart der toxischen Verbindung 3-Aminotriazol
zu vermehren. Die Wegkomponente oder Untereinheit kann in einen
Hefevektor kloniert werden, der das Protein als Fusion mit der DNA-Bindungsdomäne von GAL4
exprimiert. Die Hefe kann dann mit DNA-Bibliotheken transformiert
werden, die so konstruiert sind, dass sie Testpolypeptide oder -peptide
als GAL4-Aktivator-Fusionen exprimieren. Hefen, die (aufgrund der
Aktivierung von β-Galactosidase)
eine Blaufärbung
auf Indikatorplatten aufweisen und sich in Abwesenheit von Histidin
(und in Gegenwart von 3-Aminotriazol) vermehren, können ausgewählt und
das Bibliotheksplasmid isoliert werden. Das Bibliotheksplasmid kann
für eine
Substanz kodieren, die mit der Komponente des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs
oder ihrer Untereinheit in Wechselwirkung treten kann.
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Eine Variation des obigen Verfahrens
kann eingesetzt werden, um auf Substanzen zu screenen, die fähig sind,
die Wechselwirkung zwischen zwei Komponenten des Ku-assoziierten
DNA-Reparaturwegs oder den Untereinheiten einer solchen Komponente
zu unterbrechen (beispielsweise den Ku70- und Ku80-Untereinheiten
von Ku; Ku ist nur als Heterodimer funktionell). Beispielsweise
können
die beiden Komponenten oder Untereinheiten in einem Hefe-Zweihybrid-System
exprimiert werden (z. B. eine als GLA4-DNA-Bindungsdomänen-Fusion, die andere als
GAL4-Aktivator-Fusion), die mit Testsubstanzen behandelt wird. Das
Fehlen des Endpunkts, der normalerweise Wechselwirkung zwischen
den Komponenten oder Untereinheiten anzeigt (z. B. das Fehlen einer
Blaufärbung
im oben dargelegten exemplarischen System), wenn eine Testsubstanz
angewandt wird, weist darauf hin, dass diese Substanz die Wechselwirkung
zwischen den beiden Komponenten oder Untereinheiten unterbricht
und daher die Ku-assoziierte DNA-Reparatur hemmen kann, was auf
ein Potential als Inhibitor für
Retrovirus- und/oder Retrotransposon-Aktivität hinweist.
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Für
potentielle therapeutische Zwecke können der Ku-assoziierte DNA-Reparaturweg
oder ein oder mehrere Komponenten (oder Untereinheiten) davon vom
Menschen oder in Hinblick auf Anwendungen im Veterinärbereich
einem Säugetier
oder Vogel stammen. Jedoch kann in Anbetracht der einfachen Manipulation
von Hefe und der guten Konservierung zwischen Ku-assoziierten DNA-Reparatur-Komponenten
bei verschiedenen Eukaryoten ein Test gemäß vorliegender Erfindung das
Anwenden von Testsubstanzen auf ein Hefesystem in der Erwartung
umfassen, dass unter Verwendung der Substanzen in Säugetier-,
z. B. menschlichen, Systemen ähnliche
Ergebnisse erzielt werden. Mit anderen Worten, es ist wahrscheinlich,
dass eine Substanz, bei der festgestellt wurde, dass sie fähig ist,
Ku-assoziierte DNA-Reparatur in Hefe zu hemmen, in der Lage ist,
Kuassoziierte DNA-Reparatur bei anderen Eukaryoten zu hemmen. Ein
weiterer Ansatz, wie erörtert,
besteht darin, Hefezellen zu verwenden, die eine oder mehrere Komponenten
(z. B. Ku) oder Untereinheiten (z. B. Ku70/Ku80) des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs
eines anderen Eukaryoten, z. B. des Menschen, exprimieren. Ein Ku-assoziierter Reparaturweg
einer Pflanze oder eine oder mehrere Komponenten davon können bei einem
Test gemäß vorliegender
Erfindung eingesetzt werden, um auf eine Substanz zu testen, die
nützlich
ist, um die retrovirale und/oder Retrotransposon-Aktivität in der Pflanze
oder Pflanzen allgemein zu hemmen.
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Nach dem Identifizieren einer Substanz,
die die Ku-assoziierte DNA-Reparatur und/oder Wechselwirkung zwischen
Komponenten des Wegs oder Untereinheiten davon moduliert oder beeinflusst, kann
die Substanz näher
untersucht werden, insbesondere auf ihre Fähigkeit, die retrovirale und/oder Retrotransposon-Aktivität zu hemmen.
Weiters kann sie hergestellt und/oder bei der Zubereitung, d.h. Herstellung
oder Formulierung, einer Zusammensetzung, wie eines Medikaments,
einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines Arzneimittels verwendet
werden. Diese können
an Individuen verabreicht werden.
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Somit erstreckt sich die vorliegende
Erfindung in verschiedenen Aspekten nicht nur auf eine Substanz,
die gemäß der vorliegenden
Offenbarung als Inhibitor für
retrovirale und/ oder Retrotransposon-Aktivität identifiziert worden ist,
sondern auch auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, ein Medikament,
ein Arzneimittel oder eine andere Zusammensetzung, das bzw. die
eine solche Substanz umfasst, auf ein Verfahren, das die Verabreichung
einer solchen Zusammensetzung an einen Patienten umfasst, beispielsweise
zur Behandlung (einschließlich Präventivbehandlung)
einer retroviralen Störung,
auf die Verwendung einer solchen Substanz bei der Herstellung einer
Zusammensetzung zur Verabreichung, beispielsweise zur Behandlung
einer retroviralen Störung,
sowie auf ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, die
das Mischen einer solchen Substanz mit einem pharmazeutisch annehmbaren
Exzipienten, Vehikel oder Träger
und gegebenenfalls anderen Ingredienzien umfasst.
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Eine Substanz, die bei einem Test
gemäß vorliegender
Erfindung ein positives Testergebnis ergibt oder von der auf andere
Weise festgestellt wurde, dass sie retrovirale und/oder Retrotransposon-Aktivität durch
Hemmung von Ku-assoziierter DNA-Reparatur hemmt, kann die Beschaffenheit
eines Peptid haben oder auch nicht. "Kleine Moleküle" die
kei ne peptidartige Beschaffenheit haben, werden für viele
pharmazeutische Einsätze
in vivo oft bevorzugt. Demgemäß kann ein
Mimetikum oder eine Nachahmung der Substanz (insbesondere, wenn
es sich um ein Peptid handelt) zur pharmazeutischen Verwendung konstruiert
werden.
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Die Konstruktion von Mimetika für eine bekannte
pharmazeutisch aktive Verbindung ist ein bekannter Ansatz bei der
Entwicklung von Pharmazeutikas auf Basis einer "Leit"-Verbindung. Das kann wünschenswert
sein, wenn die Synthese der aktiven Verbindung schwierig oder teuer
ist oder wo sie für ein
bestimmtes Verabreichungsverfahren nicht geeignet ist; beispielsweise
sind Peptide ungeeignete Wirkstoffe für orale Zusammensetzungen,
da sie dazu neigen, durch Proteasen im Nahrungsaufnahmetrakt rasch
abgebaut zu werden. Die Konstruktion, die Synthese und das Testen
von Mimetika wird im Allgerneinen eingesetzt, um das statistische
Screenen einer großen
Anzahl von Molekülen
auf eine Zieleigenschaft zu vermeiden.
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Bei der Konstruktion eines Mimetikums
aus einer Verbindung mit einer bestimmten Zieleigenschaft werden üblicherweise
mehrere Schritte durchgeführt.
Zunächst
werden die bestimmten Teile der Verbindung bestimmt, die für das Bestimmen
der Zieleigenschaft entscheidend und/oder wichtig sind. Im Fall
eines Peptids kann das erfolgen, indem systematisch die Aminosäurereste
im Peptid variiert werden, beispielsweise durch Substituieren jedes
Rests nacheinander. Peptid-Alanin-Scans werden üblicherweise eingesetzt, um
solche Peptidmotive zu verfeinern. Diese Teile oder Reste, die die
aktive Region der Verbindung bilden, sind als ihr "Pharmacophor" bekannt.
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Sobald das Pharmacophor gefunden
worden ist, wird seine Struktur gemäß seiner physikalischen Eigenschaften,
z. B. Stöchiometrie,
Bindung, Größe und/oder
Ladung modelliert, wobei Daten von unterschiedlichen Quellen, z.
B. Spektroskopietechniken, Röntgenbeugungsdaten
und NMR, eingesetzt werden. Computeranalyse, Ähnlichkeitskartierung (das die
Ladung und/oder das Volumen eines Pharmakophors und nicht die Bin dung
zwischen den Atomen modelliert) sowie andere Techniken können bei
diesem Modellierungsverfahren eingesetzt werden.
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Bei einer Variante dieses Ansatzes
werden die dreidimensionale Struktur des Liganden und seines Bindungspartners
modelliert. Das kann besonders nützlich
sein, wenn der Ligand und/oder der Bindungspartner ihre Konformation
bei der Bindung ändern,
wobei das Modell das bei der Konstruktion des Mimetikums berücksichtigen
kann.
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Dann wird ein Templatmolekül ausgewählt, auf
das chemische Gruppen, die das Pharmacophor nachahmen, aufgepfropft
werden können.
Das Templatmolekül
und die darauf aufgepfropften chemischen Gruppen können zweckmäßig so gewählt werden,
dass das Mimetikum leicht zu synthetisieren ist, wahrscheinlich
pharmakologisch annehmbar ist und in vivo nicht abgebaut wird, während es
die biologische Aktivität
der Leitverbindung beibehält.
Alternativ dazu kann, wenn das Mimetikum eines auf Peptid-Basis
ist, weitere Stabilität
durch Zyklisierung des Peptids erreicht werden, wodurch seine Starrheit
erhöht
wird. Das Mimetikum oder die Mimetika, die durch diesen Ansatz gefunden
werden, können
dann gescreent werden, um festzustellen, ob sie die Zieleigenschaft
aufweisen oder in welchem Ausmaß sie sie
aufweisen. Dann kann weitere Optimierung oder Modifikation vorgenommen
werden, um ein oder mehrere fertige Mimetika für Invivo- oder klinische Tests
zu erhalten.
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Eine Substanz zum Hemmen von Retrovirus-
und/oder Retrotransposon-Aktivität
gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung kann in einer Zusammensetzung
formuliert werden. Eine Zusammensetzung kannzusätzlich zur Substanz einen pharmazeutisch
annehmbaren Exzipienten, Träger, Puffer,
Stabilisator oder ein oder mehrere andere Materialien umfassen,
die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Derartige
Materialien sollten nicht toxisch sein und sollten die Wirksamkeit des
Wirkbestandteils nicht beeinträchtigen.
Die genaue Beschaffenheit des Trägers
oder anderen Materials kann vom Weg der Verabreichung abhängen, die
z. B. oral, intravenös,
kutan oder subkutan, nasal, intramuskulär, intraperitoneal erfolgen
kann.
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Pharmazeutische Zusammensetzungen
zur oralen Verabreichung können
in Tabletten-, Kapsel-, Pulver- oder flüssiger Form vorliegen. Eine
Tablette kann einen festen Träger,
wie z. B. Gelatine, oder ein Adjuvans umfassen. Flüssige pharmazeutische
Zusammensetzungen umfassen im Allgemeinen einen flüssigen Träger, wie
z. B. Wasser, Petroleum, Tier- oder Pflanzenöle, Mineralöl oder synthetisches Öl. Physiologische
Kochsalzlösung,
Dextrose oder eine andere Saccharidlösung, oder Glykole, wie z.
B. Ethylenglykol, Propylenglykol oder Polyethylenglykol, können enthalten
sein.
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Zur intravenösen, kutanen oder subkutanen Injektion
oder Injektion an einer bestimmten betroffenen Stelle liegt der
Wirkbestandteil in Form einer parenteral annehmbaren wässrigen
Lösung
vor, die Pyrogen-frei ist und einen geeigneten pH-Wert, geeignete
Isotonie und Stabilität
aufweist. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung werden in der Lage
sein, geeignete Lösungen
beispielsweise unter Einsatz isotonischer Vehikel, wie z. B. Natriumchlorid-Injektion,
Ringer-Injektion oder Lactierte Ringer-Injektion, herzustellen.
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Gleichgültig, ob es sich um ein Polypeptid, ein
Peptid, ein Nucleinsäuremoleküle, ein
kleines Molekül
oder eine andere pharmazeutisch nützliche Verbindung gemäß vorliegender
Erfindung handelt, die an ein Individuum zu verabreichen ist, die
Verabreichung erfolgt vorzugsweise in einer "prophylaktisch wirksamen
Menge" oder einer "therapeutisch wirksamen Menge" (je nach Fall,
obwohl die Prophylaxe auch als Therapie betrachtet werden kann),
wobei diese ausreicht, um einen Nutzen für das Individuum zu zeigen.
Die tatsächlich
verabreichte Menge, die Rate und der Zeitverlauf der Verabreichung
hängen
von der Art und Schwere dessen ab, was behandelt wird. Die Vorschreibung
der Behandlung, beispielsweise Entscheidungen bezüglich Dosierung usw.,
liegt in der Verantwortung von praktischen Ärzten und anderen Medizinern
und berücksichtigt
typischerweise die zu behandelnde Störung, den Zustand des einzelnen
Patienten, die Stelle der Abgabe, das Verabreichungsverfahren und
andere Faktoren, die Praktikern bekannt sind. Beispiele für die oben
genannten Techniken und Vorschriften sind Remington's Pharmaceutical
Sciences, 16. Aufl., Hrsg. A. Osol, 1980, zu entnehmen.
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Targeting-Therapien können eingesetzt
werden, um die Wirksubstanz spezifischer an bestimmte Zelttypen
abzugeben, indem Targeting-Systeme wie Antikörper oder zeltspezifische Liganden
verwendet werden. Targeting kann aus einer Vielzahl von Gründen wünschenswert
sein, beispielsweise, wenn das Mittel inakzeptabel toxisch ist oder
wenn es auf andere Weise eine zu hohe Dosis erfordern würde oder wenn
es andernfalls nicht in die Zielzellen eindringen könnte.
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Anstelle der direkten Verabreichung
dieser Mittel können
sie in den Zielzellen durch Expression aus einem kodierenden Gen
erzeugt werden, das in die Zellen eingeführt wird. Der Vektor kann auf
die zu behandelnden spezifischen Zellen abgezielt sein, oder er
kann Regulationselemente enthalten, die von den Zielzellen mehr
oder weniger selektiv eingeschaltet werden.
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Das Mittel kann in einer Vorläuferform
verabreicht werden, um durch ein Aktivierungsmittel in die aktive
Form umgewandelt zu werden, das in den zu behandelten Zellen erzeugt
wird oder darauf abzielt.
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Eine Zusammensetzung kann in Abhängigkeit
von der zu behandelnden Affektion allein oder in Kombination mit
anderen Behandlungen entweder gleichzeitig oder nacheinander verabreicht
werden.
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Die experimentelle Grundlage für die Erfindung
und die veranschaulichenden Ausführungsformen
der Erfindung wird nun detaillierter unter Bezugnahme auf die beiliegenden
Zeichnungen beschrieben. Alle im Text erwähnten Publikationen sind durch Verweis
hierin aufgenommen.
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1 zeigt,
dass die Inaktivierung von YKU70 oder YKU80 zu verringerter Häufigkeit
der Ty1-Transposition führt.
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1A zeigt
die Transpositionshäufigkeiten von
Ty1 bei Saccharoyces cerevisiae-Stamm W303-1A der Wildform (Wildform),
bei einem von W303-1A stammenden yku70-Mutanten-Hefestamm (yku70)
und im yku70-Mutantenstamm, der ein episomales Plasmid enthält, das
das YKU70-Gen der Wildform exprimiert (yku70/pYKU70), berechnet
in Bezug auf Hefe der Wildform (Details zu Hefe-Stämmen und
YKU70-Plasmid sind Boulton und Jackson, 1996) zu entnehmen.
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1 B
zeigt, dass die Inaktivierung von YKU80, aber nicht RAD52 oder SGS1,
zu verringerter Häufigkeit
der Ty1-Transposition führt.
Die von Stamm W3031A der Wildform (Wildform) oder W303-1A stammenden
Stämme
mit YKU80- (yku80), RAD52- (rad52) oder SGS1-Defizienz (sgs1) wurden auf
ihre Fähigkeit
getestet, Ty1-Retrotransposition zu unterstützen. Die Transpositionshäufigkeiten
werden normalisiert auf den Stamm der Wildform gezeigt.
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1 C
zeigt Ty1-Transpositionshäufigkeiten
in yku70, yku70/rad52 und yku70/rad52 mit Ty1-in2600 in Bezug auf
die Wildform.
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1 D
zeigt Ty1-Transpositionshäufigkeiten
in rad50- und lig4-Mutantenstämmen
in Bezug auf die Wildform.
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2 zeigt,
dass Transposition durch Ty5 durch Mutationen in YKU70, nicht aber
RAD52, geschwächt
wird. Die relativen Transpositionshäufigkeiten werden für Zellen
der Wildform, yku70-, rad52- und yku70/rad52-Zellen gezeigt, die
in jedem Fall mit einem Plasmid transformiert wurden (pSZ152, Zou
et al., 1996), das das Ty5-Retrotransposon aufweist und das gleiche
H153-artifizielle Intronkonstrukt enthält wie pGTy1 H3m-HIS3A1 (Curcio und
Garfinkel, 1991). Die Häufigkeiten
sind in Bezug auf die Wildform angeführt, die eine mittlere Ty5-Transpositionshäufigkeit
von 3,2 × 10–4 aufwies.
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3 zeigt,
das Ku die Erzeugung von Ty1 VLPs nicht zu beeinflussen scheint.
Der Graph zeigt reverse Transkriptase-Aktivität (aufgenommenes 32P; cpm)
für Saccharose gradientenfraktionen.
Dreiecke bezeichnen die Aktivität
für Zellen,
die yku70 + Ty1 sind, von denen gezeigt wird, dass sie Zellen ähnlich sind,
die Zellen der Wildform + Ty1 sind (Ovale). Die Aktivität für Kontrollen
der Wildform (kein Ty1) ist mit Quadraten aufgetragen.
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4 zeigt,
dass von Hefen mit Yku70p-Defizienz isolierte VLPs für Ty1-Integrase-
vermittelte Transposition in vitro kompetent sind. Die Transpositionshäufigkeit
(× 10–3)
ist für
Zellen der Wildform und yku70-Zellen aufgetragen.
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5 zeigt
die Ergebnisse der Analyse von 3'-5'-Abbau von Ty1-cDNA. Von Hefezellen
der Wildform oder yku70-Hefezellen isolierte Ty1-VLP-DNA wurde mit
Klenow (dem Exonucleaseaktivität
fehlt) und radioaktiven dNTPs inkubiert. Die Klenow-vermittelte
(5'-3') Nucleotidaufnahme wurde durch Szintillationszählung gemessen,
und die Ergebnisse werden als in Bezug auf die Wildform aufgenommene 32P-Zählungen
gezeigt.
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6 zeigt,
dass die Abbauaktivität
für VLP-assoziierte
DNA bei von Stämmen
der Wildform isolierten VLPs niedriger ist als bei von yku70-Stämmen isolierten.
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6a zeigt
die Quantifizierung von Ty1-cDNA, die von Stämmen der Wildform oder yku70-Stämmen isoliert
ist (% Ty1-Element voller Länge)
zu verschiedenen Zeitpunkten (Minuten). Durch RT-Aktivität normalisierte
VLPs wurden bei Raumtemperatur für
die beabsichtigte Zeitspanne inkubiert. Für jeden Zeitpunkt ist die Figur
für Zellen
der Wildform als der linke Block gezeigt, wobei die Figur für yku70-Zellen
als der rechte Block gezeigt wird.
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6b zeigt,
dass VLP-Präparate
von Stämmen
der Wildform und yku70-Mutantenstämmen ein äquivalentes Ausmaß an ihnen
eigener Nucleaseaktivität
aufweisen. Stumpfendige Plasmid-DNA wurde mit Puffer allein (linker
Block für
jeden Zeitpunkt) oder VLPs von Zellen der Wildform (mittlerer Block
für jeden
Zeitpunkt) oder yku70-Zellen (rechter Block für jeden Zeitpunkt) inkubiert.
Der Prozentsatz für
Plasmid-DNA voller Länge
wird für
jeden Zeitpunkt gezeigt.
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7 zeigt
die Anzahl an Kolonien verschiedener Zelttypen, die für β-Galactosidase-Aktivität positiv
färben,
48 h nach der Infektion mit VSV G-Glykoprotein-pseudotypisiertem
retroviralem Vektor auf MoMLV-Basis, der LacZ exprimiert.
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HEFEZELLEN
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Um die potentielle Beteiligung von
Ku an der Retrotransposition zu testen, wurde die Hefe S. cerevisiae
als Modellsystem verwendet. Bemerkenswerterweise haben jüngere Untersuchungen
gezeigt, dass das Ku-assoziierte DNA-DSB-Reparatursystem zwischen
Hefe und Menschen in hohem Maße
konserviert ist (Boulton und Jackson, 1996a; Boult und Jackson,
1996b und die darin genannten Verweise). Weiters ist klar, dass
die Hefe-Transposone
Ty1 und Ty5 durch Mechanismen transponieren, die in eng verwandt
mit jenen von Retrotransposonen und Retroviren in anderen Organismen,
einschließlich
des Menschen, sind (Boeke et al., 1985; Garfinkel, 1985; Boeke und
Sandmeyer, 1991).
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Um die Effizienz der Retrotransposition
zu bewerten, wurde zunächst
das Galactoseinduzierbare Ty1-Transpositionssystem (Curcio und Garfinkel 1991)
eingesetzt. Bei diesem System wird ein his3-Mutantenderivat des
untersuchten Hefestamms erzeugt, so dass es ein episomales replizierendes Plasmid
enthält,
das die Expression von Ty1-RNA aus einem Galactose-induzierbaren
Promotor lenkt. Wichtigerweise trägt das Ty1-EIement in sich
das S. cerevisiae-HIS3-Gen, das von einem Intron in der reversen
(Antisense-) Ausrichtung unterbrochen ist. Somit ist der Hefestamm
phänotypisch
his- und kann in Abwesenheit von Histidin im Wachstumsmedium nicht
wachsen. Da sich das Intron jedoch in der Sense-Ausrichtung in Bezug
auf das Ty1-Retroelement befindet, kann es durch Spleißen der
Ty1-RNA entfernt werden, wenn diese in Gegenwart von Galactose erzeugt
wird. Wenn diese gespleißte
RNA daraufhin revers transkribiert und von der Ty1-Integrase in das
Hefegenom integriert wird, kann das nun Intron-lose Hefe-HIS3-Gen nun exprimiert
werden, und der resultierende Hefestamm wird in einen HIS+-Phänotyp umgewandelt.
Somit ermöglicht
es dieses Testsystem, die Effizienz der Retrotransposition zu bestimmen,
indem die Fähigkeit
des getesteten Hefestamms quantifiziert wird, HIS+-Kolonien nach der
Galactose-Induktion zu erzeugen.
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Transpositionstests wurden wie folgt
durchgeführt.
Hefestämme
wurden mit pGTy1-H3mHISAI (Curcio
und Garfinkel, 1991) oder pSZ152 transformiert und plattiert, um
bezüglich
des URA3-Gens auf diesem Plasmid zu selektionieren (auf synthetischem Medium
ohne Uracil, SC-ura). Diese Plasmide enthalten ein Galctose-induzierbares
Ty1-bzw. Ty5-Element
unter der Kontrolle des Galactose-induzierbaren GAL1-10-Promotors,
und ein HIS3-Gen mit einem künstlichen
Intron in der reversen Ausrichtung. Die Expression des HIS3-Gens
hängt von
der Transkription und Transposition des Ty1-Elements ab (Curcio
und Garfinkel, 1991). Individuelle Kolonien wurden genommen und
in Galactose-hältigem
Medium über
Nacht bei 30°C
gezüchtet.
Die optische Dichte von Kulturen wurde bei 595 nm gemessen, um die
Zeltdichte zu bestimmen, und Plattierung auf synthetisches vollständiges Medium,
dem Uracil fehlt, wurde eingesetzt, um die Lebensfähigkeit
der Zelle zu bestimmen. Die Zellen wurden auch auf synthetisches
vollständiges
Medium plattiert, das Glucose enthält und dem Histidin fehlt,
und die Anzahl der entstandenen Kolonien dividiert durch die Gesamt-Zeltzählung wurde
als Maß für die Ty1-Transpositionshäufigkeit
in jedem getesteten Stamm erhalten. Die Häufigkeiten werden (in den 1 A, 1 B, 1 C und 1 D) in Bezug auf die
Wildform gezeigt, die eine mittlere Transpositionshäufigkeit
von 1,5 × 10–4 aufweist.
Alle Tests wurden mindestens dreimal durchgeführt.
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Yku70p ist für die wirksame
Transposition durch Ty1 erforderlich
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Wie in 1A gezeigt,
ergibt ein Hefestamm, dem das Gen für Hefe-Ku70 (YKU70) fehlt, Retrotranspositionsraten,
die um das 5- bis 170fache niedriger (das entspricht einer Abnahme
von > 80 %) sind als
die des Kontroll-Hefestamms. Dass dieser Defekt auf die Inaktivierung
von YKU70 zurückzuführen ist,
zeigt sich durch die Tatsache, dass der Defekt bei mehreren unabhängig abgeleiteten
yku70-Mutantenstämmen
beobachtet wird (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus wird der Transpositionsdefekt
vollkommen komplementiert, wenn der yku70-Mutantenstamm ein Episomalplasmid
enthält,
das das YKU70-Gen enthält
(1A). Das zeigt, dass Yku70p eine
wichtige Rolle bei der Ty-Retrotransposition
spielt.
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Yku80p ist ebenfalls für die wirksame
Transposition durch Ty1 erforderlich, aber Komponenten anderer getesteter
DNA-Reparaturwege sind es nicht Um festzustellen, ob der oben beobachtete
Transpositionsdefekt für
Mutationen in YKU70 spezifisch ist, wurden Hefen mit Defekten bezüglich anderer DNA-Reparatur-Komponenten auf Ty1-Transposition getestet.
Wie in 1 B gezeigt, führt die
Inaktivierung von YKU80, des Gens für Hefe-Ku80, auch zu einer
dramatischen Verringerung der Retrotranspositionshäufigkeiten.
Im Gegensatz dazu hat die Inaktivierung des DNA-Reparaturgens RAD52 oder des Gens für den mutmaßlichen
DNA-Reparaturfaktor Sgs1 p keine signifikante Wirkung auf die Retrotranspositionshäufigkeit.
-
Es wird daher geschlossen, dass Ty1-Retrotransposition
durch Mutationen in den Genen für Yku70p
und Yku80p negativ beeinflusst wird, nicht aber durch Mutationen
in anderen analysierten DNA-Reparaturwegen.
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Verbleibende Integration
in yku70-Stämme
wird über homologe
Rekombination nicht vermittelt
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Frühere Arbeiten haben gezeigt,
dass Ty1-DNA über
homologe Rekombination in geringen Mengen in das Hefe-Genom integriert
wird (Melamed, et al., 1992; Sharon, et al. 1994). Retrotransposition
in yku70-Mutantenstämmen
wird jedoch bei Inaktivierung von RAD52 nicht weiter verringert (1C), was darauf hinweist, dass die verbleibende Integration
in yku70-Stämme
nicht über
homologe Rekombination vermittelt wird. Es ist auch gezeigt worden,
dass dieser His+-Phänotyp
im Ty1-Retrotranspositionstest durch einen Mechanismus erreicht werden
kann, der sowohl von Integrase als auch homologer Rekombination
unabhängig
ist, und dass viele His+-Kolonien, die aus diesem Mechanismus resultieren,
HIS3 auf dem Plasmid tragen (Sharon, et al. 1994). Wenn jedoch verbleibende
His+-Zellen, die in yku70-Mutanten-Hefe entstanden, durch Selektion auf Fluororotsäure dazu
gebracht wurden, das Ty1-tragende Plasmid zu verlieren, waren alle überlebenden
Kolonien immer noch His+ (120/120 für die Wildform, 118/118 für yku70),
was zeigt, das HIS3 in das Genom insertiert wurde. Außerdem wurden
Retrotranspositionstests unter Einsatz eines Ty1-Elements mit Integrase-Defizienz
durchgeführt
[in-2600; (Sharon, et al., 1994)]. Bemerkenswerterweise führt bei
yku70-Mutantenstämmen
der Verlust sowohl von RAD52 als auch einer funktionellen Integrase
zu einer Aufhebung der Retrotranspositionsraten beim eingesetzten
Test (1 C). Daher resultiert die große Mehrheit
der verbleibenden in yku70 erzeugten His+-Zellen aus Integrase-vermittelten
Ereignissen.
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Ku ist für die effiziente Transposition
durch andere Retrotransposon-Typen erforderlich Um festzustellen,
ob die Wirkung von Ku auf die Retrotransposition für Ty1 spezifisch
ist oder ob sie sich auf andere retrotransponierbare Elemente erstreckt,
wurde auch die Transposition des divergenten Retrotransposons Ty5
bewertet. Hefe-Stämme
wurden mit einem Plasmid transformiert, das das Ty5-Element unter
der Kontrolle des GAL1-Promotors enthielt und das das gleiche künstliche
HIS3-Intronkonstrukt wie pGTyl-H3mHIS-3AI enthielt (Plasmid psz52 Zou et al.,
1996), und Tests wurden wie oben beschrieben unter Bezugnahme auf 1 durchgeführt.
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Auffälligerweise wird die Effizienz
der Ty5-Transposition um das etwa 100fache verringert, wenn Hefe-Stämme Mutationen
in YKU70 oder YKU80 aufweisen (2).
Im Gegensatz dazu hat die Inaktivierung des DNA-Reparaturgens RAD52 weder
in einem Wildform- noch in einem yku70-Mutanten-Hintergrund eine
signifikante Wirkung auf die Ty5-Transpositionsraten. Andere Untersuchungen weisen
darauf hin, dass eine Mutation in YKU80 oder Mutatin in SIR2, SIR3
oder SIR4 die Ty5-Retrotransposition beträchtlich senkt, und dass YKU70
oder YKU80 auch die Transposition durch das Hefe-Retrotransposon Ty3 abschwächen (Daten
nicht gezeigt). Gemeinsam genommen zeigen diese Daten, dass Defekte
an Ku zu dramatisch verringerten Transpositionshäufigkeiten von drei divergierenden
Retrotransposonen führen.
Das zeigt daher, dass Ku einen grundlegenden Aspekt des Retrotransposon-Lebenszyklus
beeinflusst Hefe-Ku beeinflusst die Bildung funktikoneller virusartiger
Teilchen nicht Es gibt mehrere Stadien im Ty-Lebenszyklus, in denen
Ku eine Funktion erfüllen
könnte.
Zunächst
könnte
Ku die Synthese der virusartigen Teilchen (VLPs) beeinflussen, indem
es die Synthese der Ty-RNA, die Synthese anderer viraler Komponenten
oder die reverse Transkription der RNA und ihren Einbau in ein infektives
VLP beeinflusst. Zweitens könnte
Ku die Stabilität
des VLP oder der cDNA beeinflussen, die es enthält. Drittens könnte Ku
die Fähigkeit
des VLP beeinflussen, in Ziel-DNA zu integrieren. Viertens könnte Ku
an DNA-Reparaturschritten beteiligt sein, die nach der anfänglichen
Integrase-vermittelten DNA-Strangspaltung und Transferreaktionen
auftreten.
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Um den Mechanismus zu untersuchen, durch
den Ku die Retrotransposition für
Ty1 beeinflusst, wurden Ty1-VLPs von aktiv transponierenden Zellen
isoliert und analysiert. Bemerkenswerterweise wiesen VLPs, die von
Zellen der Wildform und yku70-Zellen isoliert waren, über einen
Saccharosegradienten, der bei ihrer Isolation verwendet wurde, ähnliche
RT-Aktivitätsprofile
auf (3; Zellen der Wildform
ohne das Ty1-Element wurden ebenfalls analysiert, um Hintergrund-RT-Aktivitätsausmaße zu liefern).
Da sich Ku an DNA-Enden bindet, wurde die Vermutung angestellt,
dass Ku an die lineare Ty1-cDNA
in den VLPs gebunden sein könnte.
Um zu bestimmen, ob Ku mit dem VLPs assoziiert ist, wurden Westernblot-Analysen
auf Saccharosegradienten-Fraktionen unter Verwendung eines polyklonalen Anti-Yku70p-Antikörpers durchgeführt. Yku70p
wurde somit in den Fraktionen 1 und 2 von Extrakt
von Zellen der Wildform detektiert, denen entweder aktiv transponierendes
Ty1 fehlt oder die es enthalten. Am signifikantesten ist jedoch,
das yku70p auch in Fraktion 8 von Ty-hältigen Extrakten der Wildform
detektiert wurde, die Spitzen-RT-Aktivität enthält, aber in der äquivalenten
Fraktion, die von Zellen stammte, denen Ty1 fehlte, nicht detektiert
wurde. Das Vorhandensein von Yku-70p
in Fraktionen, die Spitzen-RT-Mengen enthielten, wurde in drei unabhängigen VLP-Präparaten
beständig
festgestellt. Weiters zeigte Westernblot-Analyse ähnlicher
Präparate
von Zellen, die aktiv transponierendes Ty5 enthielten, auch eine
Assoziation von Yku70p mit Spitzen-RT-Mengen. Gemeinsam weisen diese
Daten stark darauf hin, dass Ykui70p mit Ty-VLPs assoziiert..
-
Gesamtzellextrakte, die aus den angegebenen
Hefestämmen
hergestellt wurden, wurden über einen
Saccharosegradienten fraktioniert und auf RT-Aktivität getestet.
Die Isolation von VLPs wurde von Eichinger und Boeke (1988) übernommen.
Kurz zusammengefasst wurden 5 ml Über-Nacht-Hefe-Kultur, die
pGTyH1mHIS3Al enthielt (gezüchtet
in SCa-ura, die Glucose enthielt), pelletiert, mit Wasser gewaschen
und verwendet, um 50 ml SC-ura zu impfen, die Galactose enthielt.
Zellen der Wildform, die kein Plasmid enthielten, wurden in SC gezüchtet (das entweder
Glucose oder Galactose enthielt, wie oben) und parallel dazu behandelt.
Nach dem Züchten
für 24
h bei 22 °C
wurden die Zellen geerntet, mit Wasser gewaschen und durch Glasperlen-Zerstörung in Gegenwart
von 1 ml Puffer B/Mg (100 mM HEPES, pH 7,6, 15 mM KCl, 3 mM DTT,
0,01 mg/ml Aprotinin, 5 mM MgCl2) lysiert.
Das Lysat wurde mit 12.000 g zentrifugiert und der Überstand
auf einen Saccharosegradienten (1 ml 70% Saccharose in Puffer 8
ohne MgCl2 und mit 10 mM EDTA, 1 ml 30%ig
und 4 ml 20%ig) aufgeladen. Gradienten wurden in einem Beckman SW-40-Rotor
bei 4°C
4 h lang zentrifugiert. Fraktionen (0,75 ml) wurden abgenommen und
auf RT-Aktivität
getestet. Positive Fraktionen wurden bei 50.000 g über Nach
bei 4°C
pelletiert, in 10 μl
Puffer B/Mg resuspendiert und bei 4°C gelagert.
-
Westernblot-Analyse wurde auf den
Saccharosegradienen-Fraktionen mit Anti-Yku70p-Antikörper durchgeführt. Zellkernextrakte
von Stämmen
der Wildform oder yku70-Stämmen
wurden ebenfalls analysiert. Hefeextrakte wurden geerntet und über Saccharosegradienten
wie oben fraktioniert. Alle Fraktionen wurden mit 100.000 g über Nacht
bei 4°C pelletiert
und in 10 μl
Puffer B/Mg2+ resuspendiert. 5 μl einer jeden
Fraktion wurden durch 8% SDS PAGE analysiert und auf eine Nylon-Membran übertragen. Die
Membran wurde mit polyklonalem Kaninchen-ani-Yku70p-Antiserum inkubiert
und mit an Meerrettichperoxidase gekoppeltem Anti-Kaninchen-IgG
und verstärkter
Chemolumineszenz sichtbar gemacht (Amersham). Yku70p ist ein ∼67 kDa-Protein,
das in Extrakten der Wildform erkannt wird, aber in yku70-Extrakten
nicht zu sehen ist.
-
Um festzustellen, ob sich die von
Ku-positiven und Ku-negativen Hefezellen isolierten VLPs funktionell
unterscheiden, wurden die Fähigkeiten der
beiden VLP-Präparate
unterschieden, in ein Plasmid-DNA-Molekül in vitro zu integrieren.
Wie in 4 gezeigt, sind
von Ku-defizienten Zellen isolierte VLPs bei der Vermittlung von
cDNA-Integration nicht weniger aktiv als die von Ku-positiven Hefen isolierten
VLPs.
-
In vitro-Transposition wurde unter
Verwendung von VLPs getestet, die aus einem Hefestamm der Wildform
oder einem yku70-Mutanten- (yku70) Hefestamm isoliert worden waren,
wie oben unter Bezugnahme auf 3 beschrieben.
Die Reaktionen enthielten 3 ml VLPs oder Puffer B/Mg2 (negative Kontrolle),
10 mM Tris pH 8,0, 15 mM MgCl2, 1 mM DTT,
5% Poylethylenglykol und 1 mg superspiralisierte Plasmid-DNA (pRS5416;
Stratagene). Die Reaktionen wurden für 30 min bei 25°C inkubiert
und durch die Zugabe von Proteinase K bis auf 0,5 mg/ml und SDS
bis auf 1,4% gestoppt, gefolgt von einer weiteren Inkubation bei
25°C für 3 h. Als
nächstes
wurde die DNA mit Phenol/ Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt, mit
70% Ethanol gewaschen, in 10 mM Tris, pH 8,0 resuspendiert und in
XL-1-Zellen (Stragagene) transformiert. Kolonie-Hybridisierung wurde unter
Verwendung einer statistisch geprimten Sonde, die dem HIS3-Gen entsprach,
durchgeführt.
Positive Kolonien wurden in Bezug auf die Gesamt-Kolonien gezählt, was
die mittlere Transpositionshäufigkeit
ergab. Positive Kolonien wurden genommen, um zu gewährleisten,
dass sie das Ty1-Element enthielten; wie erwartet, ergaben Reaktionen,
die keine VLPs enthielten, kein positiv hybridiserenden Kolonien.
-
Gemeinsam genommen deuten diese Daten darauf
hin, dass Ku die Synthese, Stabilität oder inhärente katalytische Aktivität von Ty-Element-VLPs nicht
beeinflusst.
-
Identifizierung des Schritts des
Retrotransposon/Retrovirus-Lebenszyklus, der durch den Ku-assoziierten
DNA-Reparaturapparat beeinflusst wird Es gibt mehrere Möglichkeiten
dafür,
wie Ku die Retrotransposition verstärkt, und alle sind testbar.
-
- (1) Es ist möglich,
dass sich Ku an die Retrotransposon- oder Retrovirus-cDNA in den
VLPs oder das Retrovirusteilchen (RP) auf solche Weise bindet, dass die
Teilchenstabilität
oder Rate des Zusammenbaus erhöht
wird. Diese Möglichkeit
kann getestet werden, indem Antikörper gegen Ku-Untereinheiten
in Immunfällungs-
und Westernblotting-Untersuchungen mit VLPs und Virusteilchen verwendet
werden.
- (2) Ku könnte
die Enden der cDNA vor Nucleasen oder anderen DNA-modifizierenden
Enzymen schützen.
Das könnte
auftreten, wenn sich die cDNA im VLP oder (retroviralen Teilchen)
RP befindet, und kann einfach getestet werden, indem die präzise Sequenz
von Ty-cDNA-Enden durch Klonieren und Sequenzieren der cDNA-Enden
bestimmt wird, die von VLPs oder RPs stammen, oder Tests wie Primerverlängerungen,
Ribonuclease- oder S1-Nuclease-Mappingverfahren (Ausubel et al.,
1991):
- (3) Ku kann "Autointegrations"-Prozesse verhindern, die zu einer
Zerstörung
der VLPoder RP-cDNA durch ein Molekül führt, das in ein anderes integriert
wird. Autointegrationsereignisse sind zuvor gezeigt worden (Lee
und Craigie, 1994 und die Verweise darin), so dass es leicht möglich ist,
zu testen, ob Ku diesen Prozess beeinflussen kann. Bei derartigen
Tests werden VLPs oder infektive RPs in Transpositionsreaktionen
in vitro in Gegenwart oder Abwesenheit von gereinigtem Hefe-Ku (Feldmann
und Winnacker, 1993) oder Human-Ku (Dvir et al., 1993; Hartley et
al., 1995) verwendet.
- (4) Ku könnte
in vivo die Funktion erfüllen,
die Integrationsmaschinerie an Stellen auf der chromosomalen DNA
anzubinden (es ist gezeigt worden, dass dieser Verfahrenstyp die
Effizienz der Transposition beeinflusst; Bushman, 1994). Um das
zu testen, kann die Fähigkeit
von Ku, mit VLPs oder RPs in Wechselwirkung zu treten, in vitro
durch biochemische Standardtests oder durch Proteinaffinitätschromatographie-Verfahren
bewertet werden (z. B. Anbinden von Ku an einen unlöslichen
Träger
und feststellen, ob dieser VLPs oder RPs zurückhält).
- (5) Ku könnte
die Integrationseffizienz beeinflussen oder die Reaktion zum Abschluss
treiben, indem verhindert wird, dass reverse Reaktionen stattfinden (das
Umkehren der Integration kann in vitro stattfinden; z. B. Chow et
al., 1992). Das kann getestet werden, indem die Wirkung der Zugabe
von gereinigtem Hefe- oder Säugetier-Ku
zu Retrotranspositionsrekationen in vitro unter Verwendung von gereinigten
Integraseproteinen oder mit VLPs oder RPs bewertet wird (beispielsweise
Brown et al., 1987; Eichinger und Boeke, 1988; Fujiware und Mizuuchi
1988; Fujiwara und Craigie 1989; Craigie et al., 1990; Bushman et
al., 1990; Katz et al., 190; Bushman und Craigie, 1991; Pryciak
et al., 1992; Moore und Garfinkel 1994; und die darin genannten
Verweise). Außerdem
können
die Wirkungen von Ku auf Integrationsreaktionen untersucht werden,
indem die Wirkungen von Extrakten von Ku-hältigen oder Ku-defizienten
Säugetier- oder
Hefezellen für
Invitro-Integrationstests getestet werden.
- (6) Ku könnte
an der Reparatur der integrierten Produkte beteiligt sein – Integrase
kann die virale cDNA an ein anderes DNA-Molekül binden, aber diese Produkte
behalten Nicks und/oder Lücken,
und diese müssen
bearbeitet werden, bevor die DNA verbreitet werden kann (beispielsweise
Bushman et al., 1990; Craigie et al., 1990). Es ist möglich, dass
der Ku-assoziierte DNA-Reparaturapparat diese Funktionen erfüllt. Derartige
Modelle können
getestet werden, indem die Nick-hältigen Zwischenprodukte von
in vitro Retrotransposon/Retorvirus-Integrationsreaktionen in Ku-positive
oder Ku-negative Hefeoder Menschenzellen eingeführt werden, und dann ihre Reparatur
in vivo analysiert wird. Diese Art von Analyse kann auch mit künstlichen
Substraten durchgeführt
werden, die durch genickte Integrase erzeugte Retrovirus/Retrotransposon-Integrationszwischenprodukte
nachahmen. Eine andere Möglichkeit,
das zu bewältigen,
besteht darin, die Verarbeitung natürlich oder künstlich genickerter
Substate in vitro unter Verwendung von Extrakten von Hefe- oder
Menschenzellen zu analysieren, die Komponenten des Ku-assoziierten DNA-Reparatursystems
aufweisen oder in Bezug darauf defizient sind, oder indem (teilweise)
gereinigte Komponenten des Ku-assoziierten DNA-Reparatursystems
verwendet werden.
-
Es ist wichtig, festzustellen, das
es für
die Durchführung
der vorliegenden Erfindung in verschiedenen Aspekten nicht notwendig
ist, zu wissen, wie Ku am Retrovirus/Retrotransposon-Lebenszyklus
beteiligt ist. Es kann einfach festgestellt werden, dass es derart
beteiligt ist und das, wie hierin gezeigt, die Unterbrechung der
Ku-Funktion eine antiretrovirale/Anti-Transposon-Wirkung hat.
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Hemmung von Hefe-Ku-Aktivität führt zu verringerten
Ty-Transpositionshäufigkeiten
Der Verlust von Hefe-Ku-Funktion beeinflusst die Ty-Transpositionsraten
(oben ermittelt), was einen Hinweis dafür liefert, dass Ty-Transpositionshäufigkeiten
bei Ku-positiven Zellen durch Inhibitoren von Ku-Wirkung verringert
werden.
-
Ein Ansatz, um dieses Prinzip zu
veranschaulichen, umfasst das Einführen von Plasmidmolekülen, die
die Expression mutierten Derivate von Yku70p oder Yku80p in YKU70/
YKU80-Stämme (unter
Einsatz von Vektoren wie den zuvor beschriebenen; Boulton und Jackson,
1996a; Boulton und Jackson, 1996b). Die untersuchten Ku-Mutanten können beispielsweise
N-terminale Deletionsmutanten, C-terminate Deletionsmutanten und
Punktmutanten in Bereichen des Proteins umfassen, die während der
gesamten Evolution konserviert werden (z. B. Feldmann und Winnacker,
1993; Boulton und Jackson, 1996b). Da die Untereinheiten von Ku
als Heterodimer wirken und in Verbindung mit verschiedenen anderen
Proteinen arbeiten, bilden verschiedene mutierte Ku-Moleküle, die
in der Lage sind, mit ihrem Partner oder mit anderen Komponenten
des Systems in Wechselwirkung zu treten, nicht-funktionelle Komplexe.
Derartige dominante negative Mutationen liefern, wenn sie in Ty-Transpositionsuntersuchungen
verwendet werden, einen Hinweis dafür, dass die Hemmung der Ku-Funktion
die Ty-Retrotransposition beeinträchtigen kann.
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Definition der Regionen von Yku70p
und Yku80p, die bei der Ty-Integration wirksam sind Die Regionen
der beiden Ku-Untereinheiten, die bei der Ty-Retrotransposition
wirksam sind, können
definiert werden, indem die Fähigkeiten
mutierter YKU70- und YKU80- Derivate
bewertet werden, die Transpositionsdefizienzen von yku70- bzw. yku80-Mutantenstämmen zu
ergänzen
(Unter Einsatz von Vektoren wie den zuvor beschriebenen; Boulton
und Jackson, 1996a; Boulton und Jackson, 1996b). Die Fähigkeit der
mutierten Yku70p- und Yku80p-Derivate, die DNA-Reparatur zu ergänzen, Strahlenempfindlichkeit
und Telomer-Verlustphänotypen
von Hefen mit Ku-Defizienz können
auch unter Einsatz von Standardverfahren getestet werden (Boulton
und Jackson, 1996a; Boulton und Jackson, 1996b; Porten et al., 1996). Ähnliche
Ansätze
können
auch eingesetzt werden, um wichtige funktionelle Regionen von Säugetier-Ku70
und Ku80 zu definieren und funktionelle Regionen anderer Komponenten
des Ku-assoziierten DNA-Reparaturapparats zu definieren (siehe unten).
-
Die Identifizierung von Regionen,
die die Retrotransposition selektiv beeinflussen, kann zur Entwicklung
von Arzneimitteln führen,
die die Retrotransposition stören,
aber andere Ku-abhängige
Prozesse nicht beeinflussen.
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Wirkungen anderer Komponenten
des Ku-assoziierten DNA-Reparaturapparats auf die Retrotransposition
-
Die mit Ku erzielten Ergebnisse lassen
erwarten, dass andere Proteine, die in Ku-assoziierten Prozessen
wirken, eine Rolle bei der Retrotransposon- und der retroviralen
Integration spielen. Unveröffentlichte
Daten aus dem Labor der Erfinder weisen darauf hin, dass die Produkte
der Hefegene RAD50, XRS2 und MRE11 mit Yku70p und Yku80p bei der DNA-DSB-Wiederverbindung
wirken. So führt
die Unterbrechung der MRE11-, XRS2- oder RAD50-Gene zu Defekten
bei der illegitimen Endenverbindung, wie durch Plasmidreparaturtests
und in Strahlenempfindlichkeitsversuchen wie den zuvor beschriebenen (Boulton
und Jackson, 1996a, 1996b) bestätigt.
Diese Defekte sind die gleichen wie jene, die bei in Bezug auf YKZ70
und YKU80 unterbrochenen Stämmen
beobachtet werden (Boulton und Jackson, 1996a und 1996b). Weiters
wird in Doppelmutantenstämmen,
die in Bezug auf Ku plus einem dieser anderen Gene (MRE11, XRS2,
RAD-50) Defizienz
aufweisen, kein zusätzlicher
Defekt der DNA-Reparatur beobachtet. Diese Daten weisen daher darauf
hin, dass MRE11, XRS2 und RAD50 auf dem gleichen DNA-DSB-Reparaturweg
arbeiten wie Ku. Weitere Ergebnisse zeigen, dass das als LIG4 bezeichnete Hefegen
(Teo et al., 1997) ebenfalls Teil des Ku-assoziierten DNA-Reparaturapparats
ist. Dies entspricht dem offenen Leserahmen YOR005c auf dem rechten
Arm von S. cerevisiae-Chromosom XV, Hinterlegungsnummer Z74913 der
Hefegenom-Datenbank,
und kodiert für
ein Protein mit starker Sequenzähnlichkeit
zu Säugetier-Ligase
IV (Wei et al., 1995). Die Unterbrechung von LIG4 führt zu Defekten bei
illegitimer Endenverbindung, wie durch Plasmidreparaturtests und
in Strahlenempfindlichkeitsversuchen bestätigt, und diese Defekte sind
die gleichen wie jene, die bei in Bezug auf YKU80 unterbrochenen Stämmen beobachtet
wurden (Boulton und Jackson, 1996a, 1996b). Weiters wird bei Doppelmutantenstämmen, die
in Bezug auf Ku plus LIG4 defizient sind, kein zusätzlicher
Defekt der DNA-Reparatur beobachtet, was darauf hinweist, dass diese
Gene auf dem gleichen Weg funktionieren. Die Wirkung des Mutierens
dieser Gene auf die Ty-Retrotranspositionshäufigkeiten können unter
Einsatz von ähnlichen Tests
wie den für
Ku beschriebenen getestet werden.
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Beispielsweise zeigt 2D eine
gewisse Verringerung der Retrotranspositionsraten bei Stämmen, die
Unterbrechungen in RAD50 oder LIG4 aufweisen. Es ist gezeigt worden,
dass diese auf dem gleichen Weg wie Ku bei. der Reparatur von ds-Brüchen in
Hefe arbeiten (Milne et al., 1996; Tsukamoto et al., 1996; Teo et
al., 1997; Shar et al., 1997; Wilson et al., 1997). Diese Verringerungen
waren nicht so groß wie
erwartet, was darauf hinweist, dass Ku die Retrotransposition auf
eine Art erleichtern kann, die sich von seiner Rolle bei der Reparatur
von DNA-ds-Brüchen
unterscheidet. Bei weiteren Untersuchungen führt die Unterbrechung von SIR2,
SIR3 oder SIR4, die ebenfalls bei der Kuassoziierten DNA-DSB-Reparatur
eine Funktion erfüllen
(Tsukamoto et al., 1997; Jackson, 1997) zu verringerten Retrotranspositionsraten.
So liefert die Hemmung von Säugetier-Homologen
solcher Faktoren (Baken et al., 1995) eine weitere Alternative für die Entwicklung antiretroviraler
Mittel.
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Sollte ein Hefehomolog des Säugetier-XRCC4-Proteins
(Li et al., 1995) identifiziert werden, wird von diesem auch erwartet,
dass es an der Ty-Transposition beteiligt ist, da der Säugetier-Faktor als
Teil des Ku-assoziierten DNA-Reparaturapparats wirkt (siehe auch
weiter unten) und Defekte im Säugetier-XRCC4
die Retrovirus-Integration negativ beeinflussen (siehe unten). Wenn
irgendwelche anderen Komponenten des Ku-assoziierten Hefe-DNA-Reparaturapparats
definiert sind, werden auch diese auf ihre Rolle bei der Retrotransposition getestet.
Sollte eine Mutation eines dieser Gene zu verringerter Retrotransposition
führen,
sind die Faktoren und ihre Homologe in anderen Organismen attraktive
Ziel für
die Entwicklung neuer antiretroviraler Mittel.
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Schritte zur Bestimmung des Orts
oder der Orte, die an zusätzlichen
Faktoren bei der Retrotransposition beteiligt sind, und die Entwicklung
von Strategien für
Arzneimittel-Screening
usw. sind zu den oben und unten für die Ku-Untereinheiten beschriebenen
analog.
-
Ku schützt Retroelement-DNA vor zellulären Nucleasen
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Im Lichte der Wirkung von Ku auf
die Retrotransposition, und da sich Ku an DNA-Enden bindet, besteht
eine Möglichkeit
darin, dass Ku die Retrotransposition verstärkt, indem es sich an Retrotransposon-cDNA
bindet und sie vor Nuclease-Angriff schützt. Tatsächlich gibt es, während reverse
Transkription von retroviraler Ty-Element-RNA im Inneren viraler
Teilchen oder VLPs auftritt (Garfinkel et al., 1985; Zang, 1995;
Mellor 1985), Hinweise dafür,
dass die in diesen Teilchen enthaltene DNA für Nucleasen anfällig ist
(Bowerman, 1989). Um zu bestimmen, ob der Mangel an Ku zu Abbau
von Retrotransposon-cDNA führt,
wurde DNA von Ty1-VLP-Präparaten
isoliert, die von Zellen der Wildform oder yku70-Zellen stammten,
mit Spel digeriert, und die resultierenden Moleküle mit Klenow- und radioaktiven
dNTPs inkubiert. Die Spel-Produkte umfassen ein Fragment mit 287
bp, das dem 3'-Ende des Ty1-Elements entspricht. Wenn die Enden
in den von yku70-Zellen stammenden VLPs signifikant beeinträchtigt waren,
wäre zu
erwarten, dass diese Bande schneller läuft oder in bezug auf das entsprechende Fragment
von VLPs der Wildform verschmiert erscheint. Es wurden jedoch keine
detektierbaren Unterschiede zwischen den von Zellen der Wildform
und yku70-Zellen stammenden cDNA-Produkten ermittelt.
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Zur Southern-Analyse von Ty1-cDNA
wurden VLPs von Stämmen
der Wildform oder yku70-Stämmen
durch RT-Aktivität
normalisiert und bei Raumtemperatur in Puffer B/Mg2+
inkubiert (10 mM HEPES, pH 7,6, 15 mM KCl, 3 mM DTT, 10 mg/ml Aprotinin,
5 mM MgCl2). DNA wurde durch Phenol/Chloroform-Extraktion
zu verschiedenen Zeitpunkten isoliert und auf einem 1 %igen Agarosegel
elektrophoresiert. Das Gel wurde transferiert und durch Southernblot-Hybridisierung
gefolgt von Autoradiographie analysiert.
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Gleiche Mengen an VLP-Präparaten,
wie durch RT-Aktivität
bestimmt, wurden für
Analysen von Ty1-DNA verwendet. DNA wurde durch Inkubation mit 50
ng/ml Proteinase K, 12,5 mM EDTA und 0,5 % SDS bei 25 °C für 2 h isoliert,
gefolgt von zwei Phenol/ Chloroform-Extraktionen und Ethanol-Fällung. Für die Southern-Analyse
wurde Ty1-DNA durch 1%-Agarose-Elektrophorese
analysiert und auf GeneScreen Plus (DuPont/ NEN) übertragen.
Die Membran wurde mit dem BamHl/Hindill-Fragment von pGTy1-H3mHIS3Al sondiert,
das durch Nick-Translation markiert war (Promega).
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Obwohl die obigen Daten zeigten,
dass kein umfangreicher Abbau von VLP-DNA in Abwesenheit von Ku
aufgetreten war, wären
kleinen Abbaumengen detektiert worden. Um geringe Abbaumengen zu detektieren,
wurde VLP-DNA mit radioaktiven dNTPs und dem Klenow-Fragment von
E.coli-DNA-Polymerase inkubiert und wurde dann durch Szintillationszählung analysiert.
Da Klenow in 5'-3'-Richtung polymerisiert, ist die Aufnahmemenge
eine Widerspiegelung von DNA-Nicks oder zurückversetzten 3'-Enden. Signifikanterweise
nahm von yku70-VLPs isolierte cDNA um das ∼ zweifache mehr Radiomarkierung auf
als cDNA von VLPs der Wildform (5).
Diese Daten deuten darauf hin, dass Ty1-cDNA in Abwesenheit von
Ku erhöhte
Mengen an DNA-Nicks ansammelt und/oder 5'-3'-Abbau der cDNA-Enden zeigt.
Da Ty1-Integrase entweder stumpfe Enden oder einen überhängendes
3'-OH erfordert, um Strangaustausch zu katalysieren (Eichinger und
Boeke, 1990), könnte
ein solcher 3'-5'-Abbau die Retrotranspositionseffizienz beeinträchtigen.
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Es gibt eine Nucleaseaktivität, die mit
den VLPs über
Saccharosegradienten gemeinsam gereinigt wird (Braiterman und Boeke,
1994). VLP-Präparate,
die von Ku-positiven und Ku-negativen Hefezellen stammten, wurden
bei Raumtemperatur für
unterschiedliche Zeiträume
inkubiert, dann die Ty1-DNA durch Southern-Hybridisierungsanalyse
auf Abbau analysiert. Bemerkenswerterweise zeigten diese Untersuchungen,
dass von yk70-Zellen
stammende VLP-assoziierte Ty1-DA viel rascher abgebaut wird als
die von Zellen der Wildform erhaltene (6b). Die geringere Abbaurate bei Zellen
der Wildform scheint daher nicht auf das Fehlen aktiver Nuclease in
den VLP-Präparaten
zurückzuführen zu
sein, die von yku70-Mutantenzellen stammen. Statt dessen weisen
diese Daten stark darauf hin, dass die Assoziation von Ku mit Ty1-VLPs
Ty1-cDNA vor Nuclease-Angriff schützt. Stumpfendige Plasmid-DNA (pRS416;
2 μg) wurde
mit Puffer allein oder VLPs entweder von der Wildform oder von yku70
inkubiert (die Menge der in den Reaktionen verwendeten VLPs wurde
durch RT-Aktivität
normalisiert). DNA wurde für
die angegebene Zeit inkubiert, auf einem 1 %-Agarosegel elektrophoresiert,
durch Färbung
mit Ethidium sichtbar gemacht und quantifiziert.
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Die oben Ergebnisse weisen darauf
hin, dass Ku bei der Retrotransposition eine Rolle spielt, und lassen
vermuten, dass es zumindest teilweise durch Bindung an die und Schützen der
Retroelement-DNA vor zellulären
Nucleasen arbeitet. In Einklang mit diesem Modell ist gezeigt worden,
dass Ku bei der präzisen
Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBS)
in Hefe eine Funktion erfüllt
und in Abwesenheit von Ku reparierte lineare DNA Deletionen enthält (Mages
et al., 1996; Boulton und Jackson, 1996a; Boulton und Jackson, 1996b;
Milne et al., 1996; Siede et al., 1996; Tsukamoto et al., 1996).
Da die Assoziation von Ku mit DNA-Enden in hohem Maße stabil ist,
ist vorstellbar, dass Ku während
des Transports in den Zellkern mit der Ty1-cDNA assoziiert bleibt
und in den nachfolgenden Schritten im Retrotranspositionsprozess
eine Funktion erfüllt.
Beispielsweise kann Ku, da es sich an DNA-ss-Lücken mit vergleichbarer Affinität zu DNA-ds-Enden
bindet (Paillard und Strauss, 1991; Falson et al., 1993), die Reparatur
der einstrangigen DNA-Lücken
erleichtern, die als Retrotranspositions-Zwischenprodukte entstehen.
Durch die Bindung solcher Strukturen und das Verschieben von Integrase konnte
Ku auch die Umkehr der Transpositionsreaktion verhindern, ein Prozess,
der als Desintegration bezeichnet wird (Moores et al., 1995; Dotan
et al., 1995).
-
SÄUGETIERZELLEN
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Defekte im Ku-assoziierten
DNA-Reparatur-System führen
zu verringerter Infektivität
durch Retroviren in Säugetierzellen
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Um festzustellen, ob Ku die Retrotransposon-
und Retrovirus-Verbreitung in Säugetiersystemen
beeinflusst, wurden die Fähigkeiten
eines Säugetier-Retrovirus
analysiert, sich in das Genom von Säugetierzellen zu integrieren,
die den Ku-assoziierten DNA-Reparaturapparat umfassen oder eine
Defizienz in Bezug darauf aufweisen. Für diese Untersuchungen wurde
ein Derivat des Moloney-Mäuse-Leukämievirus
(Mo-MLV) verwendet, um verschiedene Nagetier-Zelllinien zu infizieren
(um die Infektion zuzulassen, wurde das Virus mit dem Vesikel-Stomatitisvirus
G-Protein "pseudotypisiert", was Überstände mit einem ungefähren Titer
von 1 × 107 ergab; Burns et al., 1993; Hopkins, 1993;
Yee et al., 1994; und die darin genannten Verweise).
-
Es wurden verschiedene Verdünnungen
verwendet, um sub-konfluente Monoschichten von Zelllinien zu infizieren,
und 48 h nach der Infektion wurden die Zellen fixiert, bezüglich β-Galactosidase-Aktivität gefärbt, und
die resultierenden blau gefärbten LacZ-positiven
Kolonien wurden gezählt.
Die bei diesen Untersuchungen verwendeten Zellen waren Chinahamster-Eierstock-
(CHO-) Zelllinie K1 der Wildform, ihr Ku80-defizientes Derivat xrs-6
(beispielsweise Taccioli et al., 1994), XRCC4-defiziente XR-1-Zellen
(XRCC4 erfüllt
gemeinsam mit Ku eine Funktion im DNA-DSB-Reparaturweg; Li et al.,
1995; Critchlow et al., 1997; lirawunder et al., 1997) und Maus-Zelllinie
3T3 der Wildform.
-
Wie in 7 gezeigt,
erzeugten die Zellen mit Ku- oder XRCC4-Defizienz signifikant weniger blaue
Kolonien als die Zellen der Wildform, was darauf hinweist, dass
Ku und XRCC4 tatsächlich
die retrovirale Infektion beeinflussen. Darüber hinaus enthielten von den
blau färbenden
Kolonien, die entstanden, jene, die in de Ku-defizienten oder XRCC4-defizienten
Zellen entstanden, signifikant weniger blau färbende Zellen als dies bei
den Kolonien der Fall war, die in den Zellen der Wildform entstanden.
Daher scheint zusätzlich
zur Verringerung der Gesamtanzahl an infizierten Zeltklonen der
Mangel an Ku oder XRCC4 auch entweder eine Verzögerung der Teilung infizierter
Zellen oder Verzögerungen
im retroviralen Integrationsprozess selbst zu verursachen. Gemeinsam
genommen weisen diese Daten darauf hin, dass die Hemmung von Ku
und der ihm zugeordneten DNA-Reparaturkomponenten tatsächlich dazu
dient, die retrovirale Infektion in Säugetiersystemen zu hemmen.
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In Anbetracht dessen, dass dies auch
bei Hefe der Fall ist, kann durchaus geschlossen werden, dass das
Erfordernis des Ku-assoziierten DNA-Reparaturapparats bei der effizienten
retroviralen und Retrotransposon-Integration im gesamten eukaryotischen
Bereich allgegenwärtig
ist.
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Im Licht der obigen Daten kann die
Beteiligung anderer Komponenten des Ku-assoziierten DNA-Reparaturapparats
bei Säugetieren
an der effizienten retroviralen und Retrotransposon-Integration bestimmt
werden, indem die Effizienz der retroviralen Integration in Zelllinien
bewertet wird, die eine Defizienz bezüglich anderer Komponenten dieses
Systems aufweisen. Beispielsweise gibt es Maus-, Hamster- und Menschen-Zelllinien,
die eine Defizienz bezüglich
der katalytischen Untereinheit von DNA-abhängiger Proteinkinase (NA-PKcs)
aufweisen, die Teil der Ku-assoziierten DNA-Reparatur-Maschinerie
bei Säugetierzellen
ist (siehe z. B. Blunt et al., 1995; Lees-Millen et al., 1995; Überblicke
geben Jackson und Jeggo, 1995; Jackson, 1996).
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Wo natürlich auftretende Säugetier-Mutanten
nicht bereits bestehen, kann die anvisierte Unterbrechung von Loci
durch Standard-"Gen-Knockout"-Ansätze eingesetzt werden, um den
erwünschten
Zelttyp abzuleiten (z. B. defektiv in Bezug auf Säugetier-Ligase
IV oder defektiv in Bezug auf homologes Hefe-Rad50p, Mre11 p, Xrs2p,
Sir2p, Sir3p und Sir4p). Alternativ dazu können Untersuchungen an Zellen
vorgenommen werden, die aufgrund der Expression von dominanten negativen
Mutanten von Faktoren wie Ligase IV, RadSOp, Mre11p undXrs2p in
Bezug auf die Reparatur defizient gemacht wurden. Da Säugetier-Ligase
III eine sehr ähnliche
Sequenz wie Ligase IV aufweist, können Zellen, die in Bezug auf
Ligase III oder das assoziierte XRCC4-Protein defizient sind, auf
ihre Fähigkeit
getestet werden, retrovirale oder Retrotransposon-Integration zu
vermitteln (den Chinahamster-Eierstock-Zelllinienderivaten EM-9
und EM-C11 fehlt funktionelles XRCC1; Thompson et al. 1990; Caldecott
et al., 1996; und die darin genannten Verweise).
-
Unter Verwendung einer Vielzahl von
Säugetier-Retrovirus-Typen
ist auch ohne Umweg zu zeigen, dass der Ku-assoziierte DNA-Reparaturapparat bei
Säugetieren
wie bei Hefe eine wichtige Rolle bei der Integration einer großen Bandbreite
von Retrovirus in Säugetierzellen
spielt. Testviren umfassen andere Tiertumor-Retroviren, Human-T-Zellen-Leukämieviren
und HIV-1, das AIDS verursacht (HIV kann verwendet werden, um Menschenzellen
zu infizieren, oder kann derivatisiert werden, um Nagetierzellen
zu infizieren; z. B. Naldini et al., 1996).
-
Wie oben für das Hefe-System beschrieben, können Untersuchungen
in vivo und in vitro eingesetzt werden, um präzise zu bestimmen, in welchem Schritt
bzw. in welchen Schritten die Ku-assoziierte DNA-Reparaturmaschinerie
bei der retroviralen und Retrotransposon-Integration bei Säugetieren
eine Funktion erfüllt.
Weiters können
bereits verfügbare Tests
eingesetzt werden, um die Rollen zu definieren, die individuelle
Komponenten der Maschinerie erfüllen,
und die präzisen
Regionen der verschiedenen Polypeptide zu definieren, die für die Funktion
kritisch sind. Das sollte die Konstruktion von Tests bezüglich Substanzen
erleichtern, die diese Funktion unterbrechen und somit für den Einsatz
als antiretrovirale Mittel indiziert sind.
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Inhibitoren des Ku-assoziierten
DNA-Reparaturapparats schützen
gegen retrovirale Infektion
-
Wie oben für das Hefesystem beschrieben, können dominante
negative Derivate von Ku-Untereinheiten und anderen Komponenten
des Ku-assoziierten DNA-Reparaturappa rats eingesetzt werden, um
zu zeigen, dass die Hemmung dieses Reparaturapparats bei normalen
Zellen zu einer verringerten Fähigkeit
führt,
Retrovirus stabil in das Wirtszellengenom zu integrieren. Für diese
Untersuchungen werden stabile Säugetier-Zeltlinien
erzeugt, die die dominanten negativen Mutantenproteine exprimieren. Säugetier-Zelllinien
der Wildform werden auch mit verschiedenen Arzneimitteln behandelt,
um zu zeigen, dass dies zur Hemmung retroviraler Integration führt.
-
In dieser Hinsicht ist von den Verbindungen Wortmannin
und LY294002 gezeigt worden, dass sie die Ku-assoziierte DNA-abhängige Proteinkinase- (DNA-PK)
Aktivität
hemmen (Hartley et al., 1995; Vlahos et al., 1994; auch unveröffentlichte
Daten aus dem Labor der Erfinder). Andere DNA-PK-Inhibitoren, die
identifiziert werden, können
in Bezug auf Wirkungen getestet werden. Obwohl es am einfachsten ist,
Mittel zunächst
an Gewebekulturzellen zu testen, können erste Untersuchungen in
der Folge ausgedehnt werden, um Tiere wie Mäuse (es werden Mäuse eingesetzt,
die Defizienz in Bezug Komponenten des Ku-assoziierten DNA-Reparaturapparats
aufweisen oder diese umfassen) oder schlussendlich Menschen als
Versuchssubjekte zu umfassen.
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Entwicklung von Testverfahren
bezüglich
Mittel, die die retrovirale Infektivität verringern, indem sie den Ku-assoziierten
DNA-DSB-Reparaturapparat unterbrechen
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Die Bestimmung des Mechanismus, durch den
die Ku-assoziierte DNA-Reparatur-Maschinerie bei der Retrovirus-
und Retrotransposon-Integration arbeitet, erleichtert die Konstruktion
von Tests, die diese Funktionen in definierten In-vivo- oder In-vitro-Tests
rekapitulieren. Derartige Tests gehören zu jenen, die bei Screens
für Inhibitoren
eingesetzt werden können,
die Substanzen als potentielle antiretrovirale Mittel identifizieren.
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Tests umfassen jene, die die volle
retrovirale Integration messen oder nur den Schritt bzw. die Schritte
des Verfahrens messen, der bzw. die durch die Ku-assoziierte Maschinerie
beeinflusst wird bzw. werden. Obwohl In-vitro-Test bei den Screens
am leichtesten einzusetzen sind, können Hefe- oder Säugetier-Zellinien
nützliche
In-vivo-Systeme bereitstellen, um bezüglich der Wirkungen zu testen.
In Hinblick darauf können
Hu man-Ku70 und Ku80 in Hefezellen exprimiert werden, um Ty-Transposition oder
andere Aspekte Ku-abhängiger
Ereignisse zu bewerten. Ein derartiges "humanisiertes" Hefe-System
kann verwendet werden, um in Bezug auf Moleküle zu screenen, die die Human-Ku-Funktion stören.
-
Ein weiteres Screen, das eingesetzt
werden kann, um neue antiretrovirale Mittel zu identifizieren, ist
eines, das Inhibitoren für
Ku-assoziierte DNA-PK-Aktivität
identifiziert (beispielsweise Dvir et al., 1992; Gottlieb und Jackson,
1993; Finnie et al., 1959; und die darin genannten Verweise).
-
Andere Screens können sich auf Verbindungen
beziehen, die enzymatische Aktivitäten hemmen, die mit den Ligasen
III oder IV, Rad50p oder Mre11 p (beides mutmaßliche Nucleasen) verbunden sind,
die Protein-Protein-Wechselwirkungen innerhalb des Kuassoziierten
Reparaturapparats (beispielsweise zwischen Ku und anderen Komponenten des
Apparats, zwischen Rad50p, Mre11 p und Xrs2p, zwischen XRCC1 und
Ligase III oder zwischen XRCC4 und Ligase IV) stören, oder Assoziationen zwischen
der Reparaturmaschinerie und dem DNA-Substrat stören. Peptide oder Peptid-Mimetika, die
wichtigen Bereichen von Komponenten des Ku-assoziierten Reparatursystems ähnlich sind,
können
zusätzlich
zu Arzneimitteln mit kleinen Molekülen getestet werden.
-
Sobald sie auf solchen Wegen identifiziert worden
sind, können
Arzneimittel (und ihre Derivate) in Zell-, Tier- und schlussendlichen
humanen Systemen auf Wirkungen auf die retrovirale und Retrotransposon-Integration
und auf die retrovirale Infektion getestet werden.
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Andere Anwendungen für Aktivatoren
und Inhibitoren des Ku-assoziierten DNA-Reparaturapparats
-
Abgesehen davon, dass sie bei der
Identifizierung und Konstruktion antiretroviraler Arzneimittel zur
Verwendung bei Wirbeltiersystemen nützlich sind, sind Aktivatoren
oder Inhibitoren von Ku-assoziierten Prozessen auch in anderen Systemen
von Nutzen.
-
Beispielsweise sind Retrotransposone
in den Genomen vieler höherer
Pflanzen sehr häufig
und können
relativ häufig
transponieren (Wessler, 1996). Tatsächlich scheint ein Großteil der
problematischen somaklonalen Variation, die auftritt, nachdem Pflanzen
aus Protoplastgewebekulturen regeneriert worden sind, durch Retrotranspositionsereignisse
zu entstehen (Wessler, 1996). Aspekte der vorliegenden Erfindung
können
eingesetzt werden, um die Erzeugung somaklonaler Variation in Pflanzen
durch die Hemmung des Ku-assoziierten DNA-Reparaturapparats der
Pflanze zu unterdrücken.
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