DE69813193T2

DE69813193T2 - Verfahren und mittel bezogen auf retrotransposon und retrovirale integration

Info

Publication number: DE69813193T2
Application number: DE69813193T
Authority: DE
Inventors: Philip Stephen Jackson; Anne Jessica DOWNS
Original assignee: Kudos Pharmaceuticals Ltd
Current assignee: Kudos Pharmaceuticals Ltd
Priority date: 1997-01-13
Filing date: 1998-01-13
Publication date: 2004-03-04
Anticipated expiration: 2018-01-14
Also published as: DE69813193D1; AU5568498A; GB9700574D0; US6242175B1; EP0965040B1; ATE237135T1; GB2321702A; WO1998030903A1; CA2277483A1; DK0965040T3; EP0965040A1; ES2197454T3; GB2321702B; JP2001508175A; AU729066B2; PT965040E; GB9800660D0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren, durch die Retroviren und Retrotransposone (Retroposone) ihr genetisches Material in das Genom einer eukaryotischen Wirtszelle insertieren, um einen produktiven Infektionszyklus durchzuführen. Genauer gesagt betrifft sie Proteine der Wirtszelle, von denen nun festgestellt worden ist, dass sie für effiziente Retrotransposition erforderlich sind, die im gesamten eukaryotischen Bereich in hohem Maße konserviert werden, aber für das Funktionieren der Zelle unter den meisten normalen Bedingungen nicht erforderlich sind. Diese Proteine stellen neue Ziele für antiretrovirale Arzneimittel dar. Außerdem werden Testsysteme bereitgestellt, mit denen antiretrovirale Arzneimittel in vivo und in vitro gescreent und getestet werden können.
Die Erfindung basiert auf der den Lehren nach dem Stand der Technik widersprechenden überraschenden Entdeckung, dass Ku-assoziierte DNA-Reparaturmechanismen an Retrovirus- und Retrotransposon-Nucleinsäureintegration beteiligt sind. Durch experimentelle Arbeit, die hierin beschrieben ist, wird gezeigt, dass Retrovirus- und/oder Retrotransposon-Aktivität sowohl bei Hefe- als auch Säugetier-Zellen gehemmt wird, wenn die Ku-Funktion in den Zellen reduziert ist.
Retroviren und Retrotransposone
Retroviren sind RNA-Viren, die eine DNA-Kopie (cDNA) ihres Genoms in das Wirtschromosom insertieren müssen, um eine produktive Infektion durchzuführen. Im integrierten Zustand wird das Virus als Provirus bezeichnet (Varmus, 1988). Einige eukaryotische transponierbare DNA-Elemente stehen insofern mit Retroviren in Zusammenhang, als sie über ein RNA-Zwischenprodukt transponieren. Diese Elemente, die als Retrotransposone oder Retroposone bezeichnet werden, werden in RNA transkribiert, die RNA wird in doppelstrangige (ds) DNA kopiert, dann wird die dsDNA in das Genom der Wirtszelle insertiert.
Verfügbare Belege sprechen dafür, dass die Integration von Retroviren und Retrotransposonen durch vollkommen analoge Mechanismen stattfindet und dass Retroviren als Retrotransposone mit einer extrazellulären Phase ihres Lebenszyklus betrachtet werden können. Beispielsweise sind von den Ty1- und Ty5-Retrotransposonen der Hefe Saccharomyces cerevisiae gezeigt worden, dass sie durch einen Mechanismus desselben Typs in das Wirts-Hefegenom integriert werden, wie er von Säugetier-Retrotransposonen und Retroviren eingesetzt wird, um sich in Säugetier-Wirtszellen-DNA zu integrieren (Boeke et al., 1985; Garfinkel, 1985; Grandgenett und Mumm, 1990; Boeke und Sandmeyer, 1991).
Retroviren stellen ein beträchtliches Risiko für die Gesundheit von Mensch und Tier dar, wie aus der Tatsache ersichtlich ist, dass Retroviren Krankheiten wie erworbenes Immunschwächesyndrom (AIDS; verursacht durch Human-Immunschwäche-Virus, HIV-1 ), verschiedene Arten von Krebs bei Tieren und T-Zellen-Leukämie/Lymphom bei Erwachsenen (Varmus, 1988) verursachen; außerdem sind Retroviren mit einer Vielzahl anderer häufiger Störungen in Verbindung gebracht worden, darunter Typ-I-Diabetes und Multiple Sklerose (Conrad et al., 1997; Perron et al.; 1997 und Benoist und Mathis, 1997). In vielen, aber nicht in allen Fällen ist die Krebsbildung durch bestimmte Retroviren eine Folge dessen, dass sie Oncogene tragen. Weiters kann retrovirale Integration und Retrotransposition zu mutagener Inaktivierung von Genen am Ort ihrer Einfügung führen oder kann zur abweichenden Expression von benachbarten Wirtszellen führen, was in beiden Fällen schädliche Folgen für den Wirtsorganismus haben kann. Retroviren werden auch immer häufiger für die Genabgabe eingesetzt und es ist wahrscheinlich, dass sie immer wichtigere Rollen bei der Gentherapie spielen werden. Es ist daher von großer kommerzieller und medizinischer Bedeutung zu verstehen, wie Retroviren funktionieren und wie sie gesteuert werden können.
In den letzten Jahren sind enorme Bemühungen unternommen worden, um Inhibitoren für retrovirale Infektion zu identifizieren, da diese Mittel potentielle Verwendung bei der Bekämpfung von auf Retroviren zurückzuführende Erkrankungen haben. Bisher haben sich die meisten Arzneimittel-Entwicklungsprogramme auf auf viral kodierte Produkte konzentriert. In Anbetracht des kurzen Lebenszyklus von Retroviren und der ihnen innewohnenden hohen Raten genetischer Veränderung ist jedoch vorherzusehen, dass ein häufiges Problem bei derartigen Strategien darin bestehen wird, dass Arzneimittelresistente Virusderivate durch Veränderungen des viral kodierten Zielmoleküls entstehen werden (siehe beispielsweise Sandstrom und Folks, 1996, und die darin angeführten Verweise). Daher können die meisten antiretroviralen Arzneimittel, die viral kodierte Proteine stören, nur eine begrenzte nützliche Lebensdauer aufweisen. Eine weitere Beschränkung für Arzneimittel, die auf Virusproteine abzielen, besteht darin, dass viele keine breite Anwendbarkeit haben und inhärent in hohem Maße spezifisch für ein bestimmtes Virus oder sogar einen bestimmten Stamm eines bestimmten Virus sein werden.
Retrovirale Integration
In Anbetracht dessen, was über den retroviralen Lebenszyklus bekannt ist, besteht ein attraktives Ziel für antiretrovirale Therapeutika darin, die Integration der viralen cDNA in das Wirtsgenom zu stören. Am wichtigsten ist dabei, dass dieses Ereignis wesentlich für die effiziente Viren-Verbreitung ist (beispielsweise Sakai et al., 1993; ein Überblick ist Varmus, 1988; Grandgenett und Mumm, 1990, zu entnehmen). Außerdem wäre, da nicht angenommen wird, dass ähnliche Typen von Prozessen für das Funktionieren der meisten sich normal vermehrenden Wirtszellen wesentlich sind, nicht zu erwarten, dass Inhibitoren retroviraler Integration für den Wirt besonders toxisch sind.
Im Lichte dieser und anderer Überlegungen sind retrovirale reverse Transkriptasen und Integrasen für die Arzneimittel-Entwicklung anvisiert worden. Obwohl damit gewisse Erfolge erzielt werden konnten, ist es wahrscheinlich, dass hohe Raten genetischer Veränderung durch das anvisierte Virus und Variationen zwischen verschiedenen viralen Stämmen den Anwendungsbereich für Anti-Reverse-Transkriptase- und Anti-Integrase-Arzneimittel, insbesondere langfristig gesehen, einschränken.
Ein Weg, die oben dargelegten Probleme zu überwinden, bestünde darin, Wirtszellenproteine zu identifizieren, die für die effiziente retrovirale Integration erforderlich sind, und Arzneimittel abzuleiten, die diese Moleküle hemmen. Erstens wäre es sehr schwie rig oder unmöglich für das Virus, auf solche Weise zu mutieren, dass es der Arzneimittel-Wirkung ausweichen könnte. Zweitens wäre zu erwarten, dass solche Wirtszellenproteine für die Verbreitung der meisten Retroviren notwendig ist, was bedeutet, dass Arzneimittel, die sie stören, gegen ein breites Spektrum von Retrovirus-Typen wirksam wären.
Bisher schien es unwahrscheinlich, dass es einen Wirtsfaktor (oder Wirtsfaktoren) geben könnte, der für die retrovirale Integration erforderlich, aber für normales Wirtszellenwachstum nicht notwendig ist. Der Grund dafür ist, dass mehrere Forschungsreihen darauf hindeuten, dass alle Schritte, die für das kovalente Binden von Retrovirus- oder Retrotransposon-cDNA an das Ziel-DNA-Molekül erforderlich sind, in vitro durch gereinigtes retrovirales Integraseprotein durchgeführt werden können (siehe beispielsweise Craigie et al., 1990; Bushman et al., 1990; Katheter et al., 1990; Grandgenett und Mumm, 1990). Außerdem wurde, obwohl angenommen wurde, dass Wirtsfaktoren die virale Integration unterstützen, angenommen, dass diese "Haushaltungsproteinen" entsprechen würden, die für die Lebensfähigkeit der Wirtszelle wesentlich sind. Daher wurde, wenn tatsächlich Wirts-"Helfer"-Proteine vorhanden sind, erwartet, dass es in einem therapeutischen Kontext nicht der Mühe wert wäre, sie mit Arzneimitteln zu hemmen, da dies auch die Zellen den Wirts abtöten würde.
Ungeachtet dieser Vorhersagen begründet sich die vorliegende Erfindung überraschenderweise auf der Entdeckung, dass eine Reihe von Wirtszellenproteinen für die effiziente Retrotransposonintegration wesentlich sind, obwohl sie unter den meisten Umständen für die Lebensfähigkeit der Wirtszelle nicht notwendig sind. Diese Faktoren, die Komponenten eines Systems sind, das als Ku-assoziierter DNA-Reparaturapparat bezeichnet wird, sind daher sehr attraktive Ziele für die antiretrovirale Therapie.
Das Ku-assoziierte DNA-Reparatursystem
Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass das Protein Ku bei Organismen von Menschen über Drosophilia melanogaster bis S. cerevisiae eine essentielle Komponente des DNA- Reparaturapparats ist (Jackson und Jeggo, 1995; Boulton und Jackson, 1996; Boulton und Jackson, 1996 und die darin genannten Verweise). Spezifisch wird der Typ von DNA-Reparaturprozess, an dem Ku beteiligt ist, als illegitime DNA-Endenverbindung oder DNA-Doppelstrangbruch- (DSB-) Reparatur bezeichnet. Da sich Ku in vitro an DNA-DSBs bindet, ist vermutet worden, dass sich Ku an DNA-DSBs bindet, wenn sie in vivo auftreten, und dazu beiträgt, ihre effiziente Ligation zu fördern. Außerdem ist Ku für V(D)J-Rekombination erforderlich, ein DNA-"Schneide-und-Anklebe"-Verfahren, das ein Antigen-Bindungsmolekül des Immunsystems von Wirbeltieren erzeugt (Überblicke sind Lewis, 1994; Jackson und Jeggo, 1995 zu entnehmen).
Bei allen Organismen, bei denen es identifiziert worden ist, liegt Ku als ein Heterodimer aus zwei Polypeptiden mit etwa 70 kDa (bei Menschen als Ku70 bezeichnet; bei S. cerevisiae alsYku70p oder Hdf1 p) und 80 kDa (bei Menschen Ku80 oder Ku86; bei S. cerevisiae Yku80p oder Hdf2p) vor. Literaturstellen dafür sind nachstehend angeführt. Zellen mit Ku-Defekt sind überempfindlich für das Abtöten durch ionisierende Strahlung oder durch radiomimetische Mittel. Jedoch hat das Fehlen von Ku-Funktion sowohl in Hefe- als auch in Säugetier-Systemen unter normalen Bedingungen minimale oder nicht nachweisbare Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zelle und die Zeltwachstumsraten (Boulton und Jackson, 1996a, Milne et al., Blunt et al.; Jackson und Jeggo und die darin genannten Verweise; Nussenzweig et al. und Zhu et al.).
Vor kurzen sind zusätzliche Komponente des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs identifiziert worden. Eine davon ist das Säugetierprotein XRCC4, dessen Mangel Defekte bei der DSB-Reparatur und V(D)J-Rekombination hervorruft (Li et al., 1995). Andere identifizierte sind die Hefefaktoren Rad50p, Mre11 p und Xrs2p (siehe unten) und die DNA-Ligase Lig4p (siehe unten). Da menschliche Zellen Homologe aller dieser letztgenannten Faktoren aufweisen, sollten sie im Wesentlichen bei allen Eukaryoten bei der DSB-Reparatur und verwandten Prozessen funktionieren.
Reeves und Sthoeger sowie Chan et al. offenbaren cDNA und Aminosäuresequenzen von Human-Ku70. Cai et al. offenbaren die chromosomale Position und Expression der für Ku70 und Ku80 kodierenden Gene in Human-Zelllinien und normalen Geweben, während Yaneva et al. die von cDNA abgeleitete Aminosäuresequenz von Human-Ku80 offenbaren. Drosophila Ku (Eidotterproteinfaktor 1) wird von Jacoby und Wensink offenbart. Feldmann und Winnaker, Milne et al., Beall et al. sowie Boulton und Jackson (1996a, 199b) nennen Sequenz- und funktionelle Information über Hefe (Saccharomyces cerevisiae) Ku70 und Ku80.
Alani et al. offenbart die Nucleinsäure- und Aminosäuresequenzen von Hefe RAD50. Human-RAD50 und MRE11 werden in Dolganov et al. bzw. Petrini et al. beschrieben. Ivanov et al. beschreibt XRS2 von Hefe.
Ku-assoziierte DNA-Reparatur, die ein illegitimer DNA-Endenreparatur-Mechanismus ist, erfordert einen diskreten Satz von Genprodukten (wie erörtert) und ist ein von anderen DNA-Reparaturwegen getrennter Weg, der homologe Rekombinationsreparatur, Nucleotidausschnittsreparatur, Basenausschnittsreparatur und DNA-Fehlübereinstimmungsreparaturumfasst.
Überlegungen für den experimentellen Ansatz, der bei der vorliegenden Erfindung angewandt wurde
Die vorliegende Erfindung wurde gemacht, indem getestet wurde, ob Ku im normalen Lebenszyklus von Retrotransposonen eine positive oder negative Rolle spielt, obwohl mehrere Hinweisketten darauf hindeuten, dass dies sehr unwahrscheinlich ist.
Ein Grund für das Interesse der Erfinder bestand darin, dass lineare cDNA als Zwischenprodukt während des Lebenszyklus von Retroviren und Retrotransposonen erzeugt wird, was die Möglichkeit erkennen ließ, dass sich Ku daran binden kann. Die vorherrschende Ansicht ist jedoch die, dass Ku nicht fähig ist, sich an die virale cDNA zu binden, da angenommen wird, dass dies immer eng mit viral kodierten Faktoren verbunden ist.
Dennoch war man der Ansicht, dass nicht ausgeschlossen werden kann, dass Ku zur Retrotransposon-cDNA Zugang finden kann, da unveröffentlichte biochemische Daten aus dem Labor der Erfinder darauf hinweisen, dass sich Ku mit einer Hartnäckigkeit, an die beinahe kein anderes charakterisiertes Protein herankommt, an DNA-Enden binden kann.
Die zweite Überlegung, die zu den Untersuchungen führte, war der Glaube der Erfinder an eine Möglichkeit, dass der Ku-assoziierte DNA-DSB-Reparaturapparat des Wirts eine Rolle bei der Retrovirus- und Retrotransposon-Integration spielen könnte. Obwohl die Retrotransposon- oder Retrovirus-Integrase alle Schritte durchführt, die notwendig sind, um die cDNA kovalent an das Ziel-DNA-Molekül zu binden (beispielsweise Craigie et al., 1990; Bushman et al., 1990; Katz et al., 1990), sind "Einstrang-Lückenfüllungs- und Ligations-" Schritte erforderlich, bevor die retrovirale/Retrotransposon-DNA stabil aufgenommen werden kann. Ungeachtet der Tatsache, dass nicht bekannt ist, dass der Ku-assoziierte DNA-Reparaturapparat bei Einstrang-Lückenfüllungs- und Ligationsreaktionen eine Funktion erfüllt, wird nachstehend dennoch gezeigt, dass er tatsächlich für die effiziente Integration der Hefe- Ty1- und Ty5-Retrotransposone erforderlich ist und auch die Integration retroviraler cDNA in Säugetierzellen beeinflusst.
Diese überraschenden Ergebnisse liefern einen Hinweis dafür, dass der Ku-assoziierte DNA-Reparaturapparat eine allgegenwärtige Rolle bei Retrotransposon-Integrationsprozessen spielt und eröffnen neue Möglichkeiten für die antiretrovirale Arbeit, wie erörtert wurde.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht die Verwendung einer Substanz, die als Inhibitor von Ku-assoziierter DNA-Reparatur identifiziert ist, bei der Herstellung eines Medikaments zum Hemmen von Retrovirus- und/oder Retrotransposonaktivität vor.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht das Bereitstellen der als Inhibitor von Ku-assoziierter DNA-Reparatur identifizierten Substanz beim Hemmen von Retrovirus- und/oder Retrotransposon-Aktivität für eine Zelle vor.
Das Verfahren kann das Bereitstellen einer Zusammensetzung umfassen, die zumindest eine andere Komponente, beispielsweise einen pharmazeutisch annehmbaren Exizipienten, umfasst, wie nachstehend näher erörtert.
Die Substanz kann durch Therapie (die Prophylaxe einschließen kann) in vivo Zellen in einem Menschen- oder Tierkörper zugeführt werden, oder in planta, ex vivo oder in vitro. Das wird ebenfalls an derer Stelle hierin näher erörtert.
Die Integration eines Retrovirus und/oder Retrotransposons in das Genom einer Zelle kann durch Behandlung der Zelle mit einer Substanz gehemmt werden, die ein Inhibitor für Ku-assoziierte DNA-Reparatur ist. Beispiele für solche Substanzen sind Wortmannin und LY294002 (Hartley et al., 1995).
Die Hemmung von Ku-assoziierter DNA-Reparatur kann auf zahlreiche verschiedene Arten erreicht werden, ohne dass dies das Wesen und den Schutzumfang der Erfindung einschränkt.
Bei bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist Ku selbst das Ziel für die Hemmung, d.h. die Beteiligung von Ku an der Ku-assoziierten DNA-Reparatur wird gehemmt, um die Ku-assoziierte DNA-Reparatur zu hemmen. Ku funktioniert nur als Heterodimer (der Untereinheiten Ku70 und Ku80). Daher besteht eine Möglichkeit, die Ku-Aktivität zu hemmen, darin, die Wechselwirkung zwischen den beiden Untereinheiten zu hemmen. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, eine Substanz zu verwenden, die die Wechselwirkung von Ku mit DNA oder einer anderen Komponente des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs hemmt. Andernfalls muss nicht auf Ku selbst abgezielt werden, und es kann die Funktion einer oder mehrerer anderer Komponenten des Ku-asso ziierten DNA-Reparaturwegs gehemmt werden (wie weiter unten detaillierter erörtert). Selbstverständlich kann eine Substanz die Aktivität einer Komponente des Wegs, wie Ku, nicht (oder nicht nur) durch hemmen der physikalischen Wechselwirkung zwischen der Komponente und einer anderen hemmen, sondern auch durch Bindung an eine aktive Stelle oder durch Bindung auf eine Weise, die eine sterische Wirkung auf die Kosformation einer aktiven Stelle und somit auf die Aktivität der Komponente hat. Wie genau die Aktivität oder Funktion einer Komponente des Wegs gehemmt wird, muss für die praktische Umsetzung der vorliegenden Erfindung nicht relevant sein.
Die Sequenzen verschiedener Komponenten des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs bei Menschen und Hefe sind von der GenBank-Datenbank unter den folgenden Hinterlegungsnummern erhältlich: Human-Ku70 – J04611; Human-Ku80 – M30938; S. cerevisiae-Ku 70 – X70379; S. cerevisiae-Ku80 – Z49702; Human-Ligase IV -X83441; S. cerevisiae-Ligase IV – YOR005c am rechten Arm von S. cerevisiae-Chromosom XV, Hinterlegungsnummer Z74913; Human-Rad50 – U63139; S. cerevisiae-Rad50p – X14814; Human-Mre11 – U37359; S. cerevisiae Mre11 – D11463; Human-XRCC4 – U40622 (offener Leserahmen mit 334 Aminosäuren); S. cerevisiae Xrs2p – L22856.
Die Aktivität oder Funktion einer Komponente des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs (wie Ku) kann wie angeführt, durch eine Substanz gehemmt werden, die auf irgendeine Weise mit der Komponente in Wechselwirkung tritt. Bei einer Alternative wird die Regulierung auf Nucleinsäureebene eingesetzt, um die Aktivität oder Funktion durch Herabregulierung der Produktion der Komponente zu hemmen.
Beispielsweise kann Unterexpression eines Gens unter Einsatz von Antisense-Technologie erreicht werden. Die Verwendung von Antisense-Genen oder partiellen Gensequenzen zum Herabregulieren der Genexpression ist nun bekannt.
Antisense-Oligonucleotide können so konstruiert sein, dass sie sich an die komplementäre Sequenz von Nucleinsäure, Prä-mRNA oder reifer mRNA hybridisieren, wodurch die Produktion einer Komponente des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs, wie Ku, oder einer Einheit davon, für die eine bestimmte DNA-Sequenz kodiert, gestört wird, so dass ihre Expression verringert oder teilweise oder im Wesentlichen vollständig verhindert wird. Zusätzlich zum Abzielen auf Kodierungssequenz können Antisense-Techniken eingesetzt werden, um auf Kontrollsequenzen eines Gens abzuzielen, beispielsweise in einer 5'-Flankierungssequenz, wodurch die Antisense-Oligonucleotide die Expression von Kontrollsequenzen stören können. Die Konstruktion von Antisense-Sequenzen und ihre Verwendung werden beispielsweise in Peyman und Ulman, Chemical Review 90, 543–584 (1990), und Crooke, Ann. Retrovirus. Pharmacol. Toxicol. 32, 329–376 (1992), beschrieben.
Oligonucleotide können in vitro oder ex vivo zur Verabreichung erzeugt werden, oder Antisense-RNA kann in vivo innerhalb von Zellen erzeugt werden, in denen Herabregu-lierung erwünscht ist.
Dann kann Doppelstrang-DNA unter die Kontrolle eines Promotors in einer "reversen Ausrichtung" gestellt werden, so dass die Transkription des Antisense-Strangs der DNA RNA ergibt, die zu normaler mRNA komplementär ist, die aus dem Sense-Strang des Zielgens transkribiert wird. Es wird angenommen, dass sich die komplementäre Antisense-RNA-Sequenz dann an mRNA bindet, um einen Duplex zu bilden, wodurch die Translation der endogenen mRNA aus dem Zielgen in Protein gehemmt wird. Ob es sich dabei um den tatsächliche Wirkmechanismus handelt, ist immer noch unsicher. Es ist jedoch eine erwiesene Tatsache, dass die Technik funktioniert.
Es muss nicht die komplette Sequenz verwendet werden, die der Kodierungssequenz in der reversen Ausrichtung entspricht. Beispielsweise können Fragmente mit ausreichender Länge verwendet werden. Für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung ist es Routine, Fragmente verschiedener Größen und von verschiedenen Teilen der Kodierungsoder Flankierungssequenzen eines Gens zu screenen, um das Ausmaß der Antisense-Hemmung zu optimieren. Es kann vorteilhaft sein, das Initialions-Methionin-ATG-Codon und vielleicht ein oder mehrere Nucleotide stromauf vom Initiationscodon aufzunehmen. Ein geeignetes Fragment kann etwa 14 bis 23 Nucleotide aufweisen, z. B. etwa 15, 16 oder 17.
Viele bekannte Techniken und Vorschriften zur Manipulation von Nucleinsäure, beispielsweise bei der Herstellung von Nucleinsäurekonstrukten, Mutagenese, Sequenzierung, Einführung von DNA und Zellen sowie Genexpression und Analyse von Proteinen, werden im Detail in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (Hrsg.), John Wiley & Sons, 1992, und in Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 2. Aufl. Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.
Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass Nucleinsäure verwendet wird, die bei der Transkription ein Ribozym erzeugt, das fähig ist, Nucleinsäure an einer spezifischen Stelle zu spalten – und somit auch bei der Beeinflussung von Genexpression nützlich ist. Literatur zum Hintergrund für Ribozyme ist z. B. Kashani-Sabet und Scanlon, Cancer Gene Therapy 2(3), 213–223 (1995), sowie Mercola und Cohen,. Cancer Gene Therapy 2(1), 47–59 (1995).
Es ist bekannt, dass pharmazeutische Forschung, die zur Identifizierung eines neuen Arzneimittels führt, das Screenen einer sehr großen Anzahl von Kandidaten-Substanzen sowohl bevor als auch nachdem eine Leitsubstanz gefunden worden ist, umfassen kann. Das ist ein Faktor, der pharmazeutische Forschung sehr teuer und zeitaufwendig machen kann. Mittel, um das Screening-Verfahren zu unterstützen, können beträchtliche kommerzielle Bedeutung und Nützlichkeit haben. Ein solches Mittel zum Screenen bezüglich Substanzen, die potentiell nützlich sind, um retrovirale und/oder Retrotransposon-Aktivität zu hemmen, wird durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt. Substanzen, die als Modulatoren für Ku-assoziierte DNA-Reparatur identifiziert worden sind, stellen einen Fortschritt im Kampf (beispielsweise) gegen retrovirale Erkrankungen dar, da sie die Basis für die Konstruktion und Untersuchung von Therapiemitteln zur Verwendung in vivo liefern.
Ein Verfahren zum Screenen bezüglich einer Substanz, die Retrovirus- und/oder Retrotransposon-Aktivität hemmt, kann das Kontaktieren einer oder mehrerer Testsubstanzen mit einer oder mehreren Komponenten des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs eines Organismus von Interesse in einem geeigneten Reaktionsmedium Testen bezüglich Wechselwirkung zwischen Substanz und Komponente umfasst, beispielsweise durch Bewerten der Aktivität des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs oder einer Komponente davon und das Vergleichen dieser Aktivität mit der Aktivität in vergleichbarem Reaktionsmedium, das nicht mit der bzw. den Testsubstanzen) behandelt ist. Ein Unterschied in der Aktivität zwischen den behandelten und den unbehandelten Proben ist ein Indikator für einen Modulationseffekt der relevanten Testsubstanz oder -substanzen. Es kann zumindest vorläufig ausreichen, anstelle der tatsächlichen biochemischen Aktivität nur die physikalische Wechselwirkung zwischen Testsubstanz und Wegkomponente oder Untereinheit davon in Testproben zu bewerten.
Gemäß weiterer Aspekte betrifft die vorliegende Erfindung das Screenen von Kandidatensubstanzen auf ihr Potential als Inhibitoren für Retrovirus- und/oder Retrotransposon-Aktivität. Im Speziellen stellt sie ein Verfahren bereit, mit dem Testsubstanzen auf die Hemmung oder Aktivierung des Wegs gescreent werden können, obwohl klarerweise Inhibitoren des Wegs von primärem Interesse sind.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Screenen bezüglich einer Substanz bereitgestellt, die ein Inhibitor für Retrovirus- und/ oder Retrotransposon-Aktivität ist, insbesondere Nucleinsäure-Integration oder Transposition von Retrovirus und/oder Retrotransposon, welches Verfahren umfasst:
das Bereitstellen eines Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs;
das Einwirkenlassen einer Testsubstanz auf den Weg unter Bedingungen, die normalerweise zur Aktivierung des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs führen würden; und
das Suchen nach einem Endpunkt, der die Aktivierung des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs anzeigt; wodurch die Hemmung dieses Endpunkts die Hemmung des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs durch die Testsubstanz anzeigt.
Der Weg kann in einer Zelle vorgesehen sein, die der Testsubstanz auszusetzen ist,. oder der Test kann in einem Ku-assoziierten DNA-Reparatur-System in vitro durchgeführt werden, das die Genauigkeit und Effizienz der Verbindung von DNA-Strangbrüchen misst, die durch das Behandeln intakter DNA mit Restriktionsendonucleasen, Chemikalien oder Strahlung erzeugt worden sind.
Die Aktivierung des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs kann durch DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs), Einstranglücken in der DNA-Doppelhelix oder durch andere Unterbrechungen an der DNA-Doppelhelix verursacht werden. Diese Strukturen befinden sich an den Enden von retroviraler und Retrotransposon-DNA und treten als Zwischenprodukt im retroviralen Integrations- und Retrotranspositionsprozess auf. Um auf Ku-assoziierte Reparatur, Retrovirus oder retrovirale DNA zu testen, können Zwischenprodukte bei der retroviralen Integration oder Retrotransposon-Integration oder synthetische Präparate von DNA bereitgestellt werden, die eines davon nachahmen. Die Aktivierung des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs führt zum Schutz von DNA vor übermäßigem Abbau und führt zu Störungen der DNA-Doppelhelix über die Ligation von DNA-DSBs oder Einstrangbrüchen.
Der Endpunkt des Screens kann daher die Reparatur derartiger Störungen sein. Dass eine Substanz den Ku-assoziierten DNA-Reparaturweg hemmt, kann durch die Überempfindlichkeit von Säugetierzellen gegen ionisierende Strahlung verifiziert werden (z. B. Jackson und Jeggo und die darin angeführten Verweise) oder durch Wiederverbinden von Doppelstrangbrüchen (z. B. in einem Plasmid) in vivo (Boulton und Jackson, 1996a, 1996b). Biochemische Verfahren, wie PCR oder Nucleinsäure-Hybridisierungs/Detektionsverfahren können beispielsweise eingesetzt werden, um die chemische Struktur von Integrationsprodukten zu detektieren. Die retrovirale Integration und/oder Retro transposition durch die Detektion unter Einsatz genetischer, biochemischer oder histologischer Standardtechniken bewertet werden.
Es sollte angemerkt werden, dass beim Testen auf die Fähigkeit einer Testsubstanz, den Ku-assoziierten DNA-Reparaturweg zu beeinflussen, der Endpunkt, der im Test für die Bestimmung gewählt wird, nicht der tatsächliche Endpunkt des DNA-Reparaturwegs (der DNA-Reparatur) sein muss, sondern die Aktivität sein kann, die eine Komponente des Wegs im Weg aufweist. So können beispielsweise Substanzen auf die Fähigkeit gescreent werden, die DNA-PK-Phosphorylierung anderer Komponenten des Wegs, wie etwa XRCC4, zu beeinflussen.
Selbstverständlich kann, wie an anderer Stelle angeführt, die Bezugnahme auf eine Komponente des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs als Bezugnahme auf ein Derivat, eine Variante oder ein Analog der relevanten Komponente verstanden werden, das bzw. die die erforderliche testbare Eigenschaft oder Aktivität aufweist (z. B. die Fähigkeit, eine andere Komponente des Wegs zu binden).
In Hinblick der hierin bereitgestellten Lehre, dass es möglich ist, retrovirale und/oder Retrotransposon-Aktivität durch Manipulation des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs zu hemmen, können Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung Tests für antiretrovirale Mittel konstruieren, indem in der Erwartung, dass Substanzen, die die Aktivität des Homologs beeinflussen, auch fähig sein werden, die Aktivität der Komponente zu beeinflussen, Proteine oder Fragmente davon eingesetzt werden, die zu einer Komponente des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs homolog sind.
Vor, neben oder statt dem Screenen auf die Fähigkeit, die Ku-assoziierte DNA-Reparatur-Aktivität tatsächlich zu beeinflussen, können Testsubstanzen auf die Fähigkeit gescreent werden, mit einer Komponente des Wegs (wie z. B. Ku oder einer oder beiden Untereinheiten davon) in Wechselwirkung zu treten, beispielsweise in einem Hefe-Zweihybrid-System (das erfordert, dass sowohl die Polypeptidkomponente als auch die Testsubstanz in Hefe aus kodierender Nucleinsäure exprimiert werden können). Das kann beispielsweise als grobes Screen eingesetzt werden, bevor eine Substanz auf die tatsächliche Fähigkeit getestet wird, die Aktivität zu modulieren.
Somit stellt die vorliegende Erfindung gemäß einem weiteren Aspekt ein Verfahren zum Screenen bezüglich einer Substanz bereit, die ein Inhibitor für Retrovirus- und/oder Retrotransposon-Aktivität, insbesondere Nucleinsäure-Integration von Retrovirus und/oder Retrotransposon ist, welches umfasst:
das Bereitstellen einer Komponente eines Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs;
das Einwirkenlassen einer Testsubstanz auf die Komponente;
das Bestimmen der Wechselwirkung zwischen der Komponente und der Testsubstanz.
Eine Hefe-Zweihybrid-System (z. E. Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5, 3610–3616 (1985); Fields & Song, Nature 340, 245–246 (1989)) kann eingesetzt werden, um Substanzen zu identifizieren, die mit einer Ku-assoziierten DNA-Reparaturweg-Komponente oder einer Untereinheit davon in Wechselwirkung treten. Bei diesem System wird oft eine Hefe eingesetzt, die einen auf GAL4 ansprechenden Promotor enthält, der an β-Galactosidase-Gen und an ein Gen (HIS3) gebunden ist, das es der Hefe ermöglicht, sich in Abwesenheit der Aminosäure Histidin zu vermehren und sich in Gegenwart der toxischen Verbindung 3-Aminotriazol zu vermehren. Die Wegkomponente oder Untereinheit kann in einen Hefevektor kloniert werden, der das Protein als Fusion mit der DNA-Bindungsdomäne von GAL4 exprimiert. Die Hefe kann dann mit DNA-Bibliotheken transformiert werden, die so konstruiert sind, dass sie Testpolypeptide oder -peptide als GAL4-Aktivator-Fusionen exprimieren. Hefen, die (aufgrund der Aktivierung von β-Galactosidase) eine Blaufärbung auf Indikatorplatten aufweisen und sich in Abwesenheit von Histidin (und in Gegenwart von 3-Aminotriazol) vermehren, können ausgewählt und das Bibliotheksplasmid isoliert werden. Das Bibliotheksplasmid kann für eine Substanz kodieren, die mit der Komponente des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs oder ihrer Untereinheit in Wechselwirkung treten kann.
Eine Variation des obigen Verfahrens kann eingesetzt werden, um auf Substanzen zu screenen, die fähig sind, die Wechselwirkung zwischen zwei Komponenten des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs oder den Untereinheiten einer solchen Komponente zu unterbrechen (beispielsweise den Ku70- und Ku80-Untereinheiten von Ku; Ku ist nur als Heterodimer funktionell). Beispielsweise können die beiden Komponenten oder Untereinheiten in einem Hefe-Zweihybrid-System exprimiert werden (z. B. eine als GLA4-DNA-Bindungsdomänen-Fusion, die andere als GAL4-Aktivator-Fusion), die mit Testsubstanzen behandelt wird. Das Fehlen des Endpunkts, der normalerweise Wechselwirkung zwischen den Komponenten oder Untereinheiten anzeigt (z. B. das Fehlen einer Blaufärbung im oben dargelegten exemplarischen System), wenn eine Testsubstanz angewandt wird, weist darauf hin, dass diese Substanz die Wechselwirkung zwischen den beiden Komponenten oder Untereinheiten unterbricht und daher die Ku-assoziierte DNA-Reparatur hemmen kann, was auf ein Potential als Inhibitor für Retrovirus- und/oder Retrotransposon-Aktivität hinweist.
Für potentielle therapeutische Zwecke können der Ku-assoziierte DNA-Reparaturweg oder ein oder mehrere Komponenten (oder Untereinheiten) davon vom Menschen oder in Hinblick auf Anwendungen im Veterinärbereich einem Säugetier oder Vogel stammen. Jedoch kann in Anbetracht der einfachen Manipulation von Hefe und der guten Konservierung zwischen Ku-assoziierten DNA-Reparatur-Komponenten bei verschiedenen Eukaryoten ein Test gemäß vorliegender Erfindung das Anwenden von Testsubstanzen auf ein Hefesystem in der Erwartung umfassen, dass unter Verwendung der Substanzen in Säugetier-, z. B. menschlichen, Systemen ähnliche Ergebnisse erzielt werden. Mit anderen Worten, es ist wahrscheinlich, dass eine Substanz, bei der festgestellt wurde, dass sie fähig ist, Ku-assoziierte DNA-Reparatur in Hefe zu hemmen, in der Lage ist, Kuassoziierte DNA-Reparatur bei anderen Eukaryoten zu hemmen. Ein weiterer Ansatz, wie erörtert, besteht darin, Hefezellen zu verwenden, die eine oder mehrere Komponenten (z. B. Ku) oder Untereinheiten (z. B. Ku70/Ku80) des Ku-assoziierten DNA-Reparaturwegs eines anderen Eukaryoten, z. B. des Menschen, exprimieren. Ein Ku-assoziierter Reparaturweg einer Pflanze oder eine oder mehrere Komponenten davon können bei einem Test gemäß vorliegender Erfindung eingesetzt werden, um auf eine Substanz zu testen, die nützlich ist, um die retrovirale und/oder Retrotransposon-Aktivität in der Pflanze oder Pflanzen allgemein zu hemmen.
Nach dem Identifizieren einer Substanz, die die Ku-assoziierte DNA-Reparatur und/oder Wechselwirkung zwischen Komponenten des Wegs oder Untereinheiten davon moduliert oder beeinflusst, kann die Substanz näher untersucht werden, insbesondere auf ihre Fähigkeit, die retrovirale und/oder Retrotransposon-Aktivität zu hemmen. Weiters kann sie hergestellt und/oder bei der Zubereitung, d.h. Herstellung oder Formulierung, einer Zusammensetzung, wie eines Medikaments, einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines Arzneimittels verwendet werden. Diese können an Individuen verabreicht werden.
Somit erstreckt sich die vorliegende Erfindung in verschiedenen Aspekten nicht nur auf eine Substanz, die gemäß der vorliegenden Offenbarung als Inhibitor für retrovirale und/ oder Retrotransposon-Aktivität identifiziert worden ist, sondern auch auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, ein Medikament, ein Arzneimittel oder eine andere Zusammensetzung, das bzw. die eine solche Substanz umfasst, auf ein Verfahren, das die Verabreichung einer solchen Zusammensetzung an einen Patienten umfasst, beispielsweise zur Behandlung (einschließlich Präventivbehandlung) einer retroviralen Störung, auf die Verwendung einer solchen Substanz bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Verabreichung, beispielsweise zur Behandlung einer retroviralen Störung, sowie auf ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, die das Mischen einer solchen Substanz mit einem pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten, Vehikel oder Träger und gegebenenfalls anderen Ingredienzien umfasst.
Eine Substanz, die bei einem Test gemäß vorliegender Erfindung ein positives Testergebnis ergibt oder von der auf andere Weise festgestellt wurde, dass sie retrovirale und/oder Retrotransposon-Aktivität durch Hemmung von Ku-assoziierter DNA-Reparatur hemmt, kann die Beschaffenheit eines Peptid haben oder auch nicht. "Kleine Moleküle" die kei ne peptidartige Beschaffenheit haben, werden für viele pharmazeutische Einsätze in vivo oft bevorzugt. Demgemäß kann ein Mimetikum oder eine Nachahmung der Substanz (insbesondere, wenn es sich um ein Peptid handelt) zur pharmazeutischen Verwendung konstruiert werden.
Die Konstruktion von Mimetika für eine bekannte pharmazeutisch aktive Verbindung ist ein bekannter Ansatz bei der Entwicklung von Pharmazeutikas auf Basis einer "Leit"-Verbindung. Das kann wünschenswert sein, wenn die Synthese der aktiven Verbindung schwierig oder teuer ist oder wo sie für ein bestimmtes Verabreichungsverfahren nicht geeignet ist; beispielsweise sind Peptide ungeeignete Wirkstoffe für orale Zusammensetzungen, da sie dazu neigen, durch Proteasen im Nahrungsaufnahmetrakt rasch abgebaut zu werden. Die Konstruktion, die Synthese und das Testen von Mimetika wird im Allgerneinen eingesetzt, um das statistische Screenen einer großen Anzahl von Molekülen auf eine Zieleigenschaft zu vermeiden.
Bei der Konstruktion eines Mimetikums aus einer Verbindung mit einer bestimmten Zieleigenschaft werden üblicherweise mehrere Schritte durchgeführt. Zunächst werden die bestimmten Teile der Verbindung bestimmt, die für das Bestimmen der Zieleigenschaft entscheidend und/oder wichtig sind. Im Fall eines Peptids kann das erfolgen, indem systematisch die Aminosäurereste im Peptid variiert werden, beispielsweise durch Substituieren jedes Rests nacheinander. Peptid-Alanin-Scans werden üblicherweise eingesetzt, um solche Peptidmotive zu verfeinern. Diese Teile oder Reste, die die aktive Region der Verbindung bilden, sind als ihr "Pharmacophor" bekannt.
Sobald das Pharmacophor gefunden worden ist, wird seine Struktur gemäß seiner physikalischen Eigenschaften, z. B. Stöchiometrie, Bindung, Größe und/oder Ladung modelliert, wobei Daten von unterschiedlichen Quellen, z. B. Spektroskopietechniken, Röntgenbeugungsdaten und NMR, eingesetzt werden. Computeranalyse, Ähnlichkeitskartierung (das die Ladung und/oder das Volumen eines Pharmakophors und nicht die Bin dung zwischen den Atomen modelliert) sowie andere Techniken können bei diesem Modellierungsverfahren eingesetzt werden.
Bei einer Variante dieses Ansatzes werden die dreidimensionale Struktur des Liganden und seines Bindungspartners modelliert. Das kann besonders nützlich sein, wenn der Ligand und/oder der Bindungspartner ihre Konformation bei der Bindung ändern, wobei das Modell das bei der Konstruktion des Mimetikums berücksichtigen kann.
Dann wird ein Templatmolekül ausgewählt, auf das chemische Gruppen, die das Pharmacophor nachahmen, aufgepfropft werden können. Das Templatmolekül und die darauf aufgepfropften chemischen Gruppen können zweckmäßig so gewählt werden, dass das Mimetikum leicht zu synthetisieren ist, wahrscheinlich pharmakologisch annehmbar ist und in vivo nicht abgebaut wird, während es die biologische Aktivität der Leitverbindung beibehält. Alternativ dazu kann, wenn das Mimetikum eines auf Peptid-Basis ist, weitere Stabilität durch Zyklisierung des Peptids erreicht werden, wodurch seine Starrheit erhöht wird. Das Mimetikum oder die Mimetika, die durch diesen Ansatz gefunden werden, können dann gescreent werden, um festzustellen, ob sie die Zieleigenschaft aufweisen oder in welchem Ausmaß sie sie aufweisen. Dann kann weitere Optimierung oder Modifikation vorgenommen werden, um ein oder mehrere fertige Mimetika für Invivo- oder klinische Tests zu erhalten.
Eine Substanz zum Hemmen von Retrovirus- und/oder Retrotransposon-Aktivität gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung kann in einer Zusammensetzung formuliert werden. Eine Zusammensetzung kannzusätzlich zur Substanz einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten, Träger, Puffer, Stabilisator oder ein oder mehrere andere Materialien umfassen, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Derartige Materialien sollten nicht toxisch sein und sollten die Wirksamkeit des Wirkbestandteils nicht beeinträchtigen. Die genaue Beschaffenheit des Trägers oder anderen Materials kann vom Weg der Verabreichung abhängen, die z. B. oral, intravenös, kutan oder subkutan, nasal, intramuskulär, intraperitoneal erfolgen kann.
Pharmazeutische Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung können in Tabletten-, Kapsel-, Pulver- oder flüssiger Form vorliegen. Eine Tablette kann einen festen Träger, wie z. B. Gelatine, oder ein Adjuvans umfassen. Flüssige pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen im Allgemeinen einen flüssigen Träger, wie z. B. Wasser, Petroleum, Tier- oder Pflanzenöle, Mineralöl oder synthetisches Öl. Physiologische Kochsalzlösung, Dextrose oder eine andere Saccharidlösung, oder Glykole, wie z. B. Ethylenglykol, Propylenglykol oder Polyethylenglykol, können enthalten sein.
Zur intravenösen, kutanen oder subkutanen Injektion oder Injektion an einer bestimmten betroffenen Stelle liegt der Wirkbestandteil in Form einer parenteral annehmbaren wässrigen Lösung vor, die Pyrogen-frei ist und einen geeigneten pH-Wert, geeignete Isotonie und Stabilität aufweist. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung werden in der Lage sein, geeignete Lösungen beispielsweise unter Einsatz isotonischer Vehikel, wie z. B. Natriumchlorid-Injektion, Ringer-Injektion oder Lactierte Ringer-Injektion, herzustellen.
Gleichgültig, ob es sich um ein Polypeptid, ein Peptid, ein Nucleinsäuremoleküle, ein kleines Molekül oder eine andere pharmazeutisch nützliche Verbindung gemäß vorliegender Erfindung handelt, die an ein Individuum zu verabreichen ist, die Verabreichung erfolgt vorzugsweise in einer "prophylaktisch wirksamen Menge" oder einer "therapeutisch wirksamen Menge" (je nach Fall, obwohl die Prophylaxe auch als Therapie betrachtet werden kann), wobei diese ausreicht, um einen Nutzen für das Individuum zu zeigen. Die tatsächlich verabreichte Menge, die Rate und der Zeitverlauf der Verabreichung hängen von der Art und Schwere dessen ab, was behandelt wird. Die Vorschreibung der Behandlung, beispielsweise Entscheidungen bezüglich Dosierung usw., liegt in der Verantwortung von praktischen Ärzten und anderen Medizinern und berücksichtigt typischerweise die zu behandelnde Störung, den Zustand des einzelnen Patienten, die Stelle der Abgabe, das Verabreichungsverfahren und andere Faktoren, die Praktikern bekannt sind. Beispiele für die oben genannten Techniken und Vorschriften sind Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., Hrsg. A. Osol, 1980, zu entnehmen.
Targeting-Therapien können eingesetzt werden, um die Wirksubstanz spezifischer an bestimmte Zelttypen abzugeben, indem Targeting-Systeme wie Antikörper oder zeltspezifische Liganden verwendet werden. Targeting kann aus einer Vielzahl von Gründen wünschenswert sein, beispielsweise, wenn das Mittel inakzeptabel toxisch ist oder wenn es auf andere Weise eine zu hohe Dosis erfordern würde oder wenn es andernfalls nicht in die Zielzellen eindringen könnte.
Anstelle der direkten Verabreichung dieser Mittel können sie in den Zielzellen durch Expression aus einem kodierenden Gen erzeugt werden, das in die Zellen eingeführt wird. Der Vektor kann auf die zu behandelnden spezifischen Zellen abgezielt sein, oder er kann Regulationselemente enthalten, die von den Zielzellen mehr oder weniger selektiv eingeschaltet werden.
Das Mittel kann in einer Vorläuferform verabreicht werden, um durch ein Aktivierungsmittel in die aktive Form umgewandelt zu werden, das in den zu behandelten Zellen erzeugt wird oder darauf abzielt.
Eine Zusammensetzung kann in Abhängigkeit von der zu behandelnden Affektion allein oder in Kombination mit anderen Behandlungen entweder gleichzeitig oder nacheinander verabreicht werden.
Die experimentelle Grundlage für die Erfindung und die veranschaulichenden Ausführungsformen der Erfindung wird nun detaillierter unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen beschrieben. Alle im Text erwähnten Publikationen sind durch Verweis hierin aufgenommen.
1 zeigt, dass die Inaktivierung von YKU70 oder YKU80 zu verringerter Häufigkeit der Ty1-Transposition führt.
1A zeigt die Transpositionshäufigkeiten von Ty1 bei Saccharoyces cerevisiae-Stamm W303-1A der Wildform (Wildform), bei einem von W303-1A stammenden yku70-Mutanten-Hefestamm (yku70) und im yku70-Mutantenstamm, der ein episomales Plasmid enthält, das das YKU70-Gen der Wildform exprimiert (yku70/pYKU70), berechnet in Bezug auf Hefe der Wildform (Details zu Hefe-Stämmen und YKU70-Plasmid sind Boulton und Jackson, 1996) zu entnehmen.
1 B zeigt, dass die Inaktivierung von YKU80, aber nicht RAD52 oder SGS1, zu verringerter Häufigkeit der Ty1-Transposition führt. Die von Stamm W3031A der Wildform (Wildform) oder W303-1A stammenden Stämme mit YKU80- (yku80), RAD52- (rad52) oder SGS1-Defizienz (sgs1) wurden auf ihre Fähigkeit getestet, Ty1-Retrotransposition zu unterstützen. Die Transpositionshäufigkeiten werden normalisiert auf den Stamm der Wildform gezeigt.
1 C zeigt Ty1-Transpositionshäufigkeiten in yku70, yku70/rad52 und yku70/rad52 mit Ty1-in2600 in Bezug auf die Wildform.
1 D zeigt Ty1-Transpositionshäufigkeiten in rad50- und lig4-Mutantenstämmen in Bezug auf die Wildform.
2 zeigt, dass Transposition durch Ty5 durch Mutationen in YKU70, nicht aber RAD52, geschwächt wird. Die relativen Transpositionshäufigkeiten werden für Zellen der Wildform, yku70-, rad52- und yku70/rad52-Zellen gezeigt, die in jedem Fall mit einem Plasmid transformiert wurden (pSZ152, Zou et al., 1996), das das Ty5-Retrotransposon aufweist und das gleiche H153-artifizielle Intronkonstrukt enthält wie pGTy1 H3m-HIS3A1 (Curcio und Garfinkel, 1991). Die Häufigkeiten sind in Bezug auf die Wildform angeführt, die eine mittlere Ty5-Transpositionshäufigkeit von 3,2 × 10^–4 aufwies.
3 zeigt, das Ku die Erzeugung von Ty1 VLPs nicht zu beeinflussen scheint. Der Graph zeigt reverse Transkriptase-Aktivität (aufgenommenes ³²P; cpm) für Saccharose gradientenfraktionen. Dreiecke bezeichnen die Aktivität für Zellen, die yku70 + Ty1 sind, von denen gezeigt wird, dass sie Zellen ähnlich sind, die Zellen der Wildform + Ty1 sind (Ovale). Die Aktivität für Kontrollen der Wildform (kein Ty1) ist mit Quadraten aufgetragen.
4 zeigt, dass von Hefen mit Yku70p-Defizienz isolierte VLPs für Ty1-Integrase- vermittelte Transposition in vitro kompetent sind. Die Transpositionshäufigkeit (× 10^–3) ist für Zellen der Wildform und yku70-Zellen aufgetragen.
5 zeigt die Ergebnisse der Analyse von 3'-5'-Abbau von Ty1-cDNA. Von Hefezellen der Wildform oder yku70-Hefezellen isolierte Ty1-VLP-DNA wurde mit Klenow (dem Exonucleaseaktivität fehlt) und radioaktiven dNTPs inkubiert. Die Klenow-vermittelte (5'-3') Nucleotidaufnahme wurde durch Szintillationszählung gemessen, und die Ergebnisse werden als in Bezug auf die Wildform aufgenommene ³²P-Zählungen gezeigt.
6 zeigt, dass die Abbauaktivität für VLP-assoziierte DNA bei von Stämmen der Wildform isolierten VLPs niedriger ist als bei von yku70-Stämmen isolierten.
6a zeigt die Quantifizierung von Ty1-cDNA, die von Stämmen der Wildform oder yku70-Stämmen isoliert ist (% Ty1-Element voller Länge) zu verschiedenen Zeitpunkten (Minuten). Durch RT-Aktivität normalisierte VLPs wurden bei Raumtemperatur für die beabsichtigte Zeitspanne inkubiert. Für jeden Zeitpunkt ist die Figur für Zellen der Wildform als der linke Block gezeigt, wobei die Figur für yku70-Zellen als der rechte Block gezeigt wird.
6b zeigt, dass VLP-Präparate von Stämmen der Wildform und yku70-Mutantenstämmen ein äquivalentes Ausmaß an ihnen eigener Nucleaseaktivität aufweisen. Stumpfendige Plasmid-DNA wurde mit Puffer allein (linker Block für jeden Zeitpunkt) oder VLPs von Zellen der Wildform (mittlerer Block für jeden Zeitpunkt) oder yku70-Zellen (rechter Block für jeden Zeitpunkt) inkubiert. Der Prozentsatz für Plasmid-DNA voller Länge wird für jeden Zeitpunkt gezeigt.
7 zeigt die Anzahl an Kolonien verschiedener Zelttypen, die für β-Galactosidase-Aktivität positiv färben, 48 h nach der Infektion mit VSV G-Glykoprotein-pseudotypisiertem retroviralem Vektor auf MoMLV-Basis, der LacZ exprimiert.
HEFEZELLEN
Um die potentielle Beteiligung von Ku an der Retrotransposition zu testen, wurde die Hefe S. cerevisiae als Modellsystem verwendet. Bemerkenswerterweise haben jüngere Untersuchungen gezeigt, dass das Ku-assoziierte DNA-DSB-Reparatursystem zwischen Hefe und Menschen in hohem Maße konserviert ist (Boulton und Jackson, 1996a; Boult und Jackson, 1996b und die darin genannten Verweise). Weiters ist klar, dass die Hefe-Transposone Ty1 und Ty5 durch Mechanismen transponieren, die in eng verwandt mit jenen von Retrotransposonen und Retroviren in anderen Organismen, einschließlich des Menschen, sind (Boeke et al., 1985; Garfinkel, 1985; Boeke und Sandmeyer, 1991).
Um die Effizienz der Retrotransposition zu bewerten, wurde zunächst das Galactoseinduzierbare Ty1-Transpositionssystem (Curcio und Garfinkel 1991) eingesetzt. Bei diesem System wird ein his3-Mutantenderivat des untersuchten Hefestamms erzeugt, so dass es ein episomales replizierendes Plasmid enthält, das die Expression von Ty1-RNA aus einem Galactose-induzierbaren Promotor lenkt. Wichtigerweise trägt das Ty1-EIement in sich das S. cerevisiae-HIS3-Gen, das von einem Intron in der reversen (Antisense-) Ausrichtung unterbrochen ist. Somit ist der Hefestamm phänotypisch his- und kann in Abwesenheit von Histidin im Wachstumsmedium nicht wachsen. Da sich das Intron jedoch in der Sense-Ausrichtung in Bezug auf das Ty1-Retroelement befindet, kann es durch Spleißen der Ty1-RNA entfernt werden, wenn diese in Gegenwart von Galactose erzeugt wird. Wenn diese gespleißte RNA daraufhin revers transkribiert und von der Ty1-Integrase in das Hefegenom integriert wird, kann das nun Intron-lose Hefe-HIS3-Gen nun exprimiert werden, und der resultierende Hefestamm wird in einen HIS+-Phänotyp umgewandelt. Somit ermöglicht es dieses Testsystem, die Effizienz der Retrotransposition zu bestimmen, indem die Fähigkeit des getesteten Hefestamms quantifiziert wird, HIS+-Kolonien nach der Galactose-Induktion zu erzeugen.
Transpositionstests wurden wie folgt durchgeführt. Hefestämme wurden mit pGTy1-H3mHISAI (Curcio und Garfinkel, 1991) oder pSZ152 transformiert und plattiert, um bezüglich des URA3-Gens auf diesem Plasmid zu selektionieren (auf synthetischem Medium ohne Uracil, SC-ura). Diese Plasmide enthalten ein Galctose-induzierbares Ty1-bzw. Ty5-Element unter der Kontrolle des Galactose-induzierbaren GAL1-10-Promotors, und ein HIS3-Gen mit einem künstlichen Intron in der reversen Ausrichtung. Die Expression des HIS3-Gens hängt von der Transkription und Transposition des Ty1-Elements ab (Curcio und Garfinkel, 1991). Individuelle Kolonien wurden genommen und in Galactose-hältigem Medium über Nacht bei 30°C gezüchtet. Die optische Dichte von Kulturen wurde bei 595 nm gemessen, um die Zeltdichte zu bestimmen, und Plattierung auf synthetisches vollständiges Medium, dem Uracil fehlt, wurde eingesetzt, um die Lebensfähigkeit der Zelle zu bestimmen. Die Zellen wurden auch auf synthetisches vollständiges Medium plattiert, das Glucose enthält und dem Histidin fehlt, und die Anzahl der entstandenen Kolonien dividiert durch die Gesamt-Zeltzählung wurde als Maß für die Ty1-Transpositionshäufigkeit in jedem getesteten Stamm erhalten. Die Häufigkeiten werden (in den 1 A, 1 B, 1 C und 1 D) in Bezug auf die Wildform gezeigt, die eine mittlere Transpositionshäufigkeit von 1,5 × 10^–4 aufweist. Alle Tests wurden mindestens dreimal durchgeführt.
Yku70p ist für die wirksame Transposition durch Ty1 erforderlich
Wie in 1A gezeigt, ergibt ein Hefestamm, dem das Gen für Hefe-Ku70 (YKU70) fehlt, Retrotranspositionsraten, die um das 5- bis 170fache niedriger (das entspricht einer Abnahme von > 80 %) sind als die des Kontroll-Hefestamms. Dass dieser Defekt auf die Inaktivierung von YKU70 zurückzuführen ist, zeigt sich durch die Tatsache, dass der Defekt bei mehreren unabhängig abgeleiteten yku70-Mutantenstämmen beobachtet wird (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus wird der Transpositionsdefekt vollkommen komplementiert, wenn der yku70-Mutantenstamm ein Episomalplasmid enthält, das das YKU70-Gen enthält (1A). Das zeigt, dass Yku70p eine wichtige Rolle bei der Ty-Retrotransposition spielt.
Yku80p ist ebenfalls für die wirksame Transposition durch Ty1 erforderlich, aber Komponenten anderer getesteter DNA-Reparaturwege sind es nicht Um festzustellen, ob der oben beobachtete Transpositionsdefekt für Mutationen in YKU70 spezifisch ist, wurden Hefen mit Defekten bezüglich anderer DNA-Reparatur-Komponenten auf Ty1-Transposition getestet. Wie in 1 B gezeigt, führt die Inaktivierung von YKU80, des Gens für Hefe-Ku80, auch zu einer dramatischen Verringerung der Retrotranspositionshäufigkeiten. Im Gegensatz dazu hat die Inaktivierung des DNA-Reparaturgens RAD52 oder des Gens für den mutmaßlichen DNA-Reparaturfaktor Sgs1 p keine signifikante Wirkung auf die Retrotranspositionshäufigkeit.
Es wird daher geschlossen, dass Ty1-Retrotransposition durch Mutationen in den Genen für Yku70p und Yku80p negativ beeinflusst wird, nicht aber durch Mutationen in anderen analysierten DNA-Reparaturwegen.
Verbleibende Integration in yku70-Stämme wird über homologe Rekombination nicht vermittelt
Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Ty1-DNA über homologe Rekombination in geringen Mengen in das Hefe-Genom integriert wird (Melamed, et al., 1992; Sharon, et al. 1994). Retrotransposition in yku70-Mutantenstämmen wird jedoch bei Inaktivierung von RAD52 nicht weiter verringert (1C), was darauf hinweist, dass die verbleibende Integration in yku70-Stämme nicht über homologe Rekombination vermittelt wird. Es ist auch gezeigt worden, dass dieser His+-Phänotyp im Ty1-Retrotranspositionstest durch einen Mechanismus erreicht werden kann, der sowohl von Integrase als auch homologer Rekombination unabhängig ist, und dass viele His+-Kolonien, die aus diesem Mechanismus resultieren, HIS3 auf dem Plasmid tragen (Sharon, et al. 1994). Wenn jedoch verbleibende His+-Zellen, die in yku70-Mutanten-Hefe entstanden, durch Selektion auf Fluororotsäure dazu gebracht wurden, das Ty1-tragende Plasmid zu verlieren, waren alle überlebenden Kolonien immer noch His+ (120/120 für die Wildform, 118/118 für yku70), was zeigt, das HIS3 in das Genom insertiert wurde. Außerdem wurden Retrotranspositionstests unter Einsatz eines Ty1-Elements mit Integrase-Defizienz durchgeführt [in-2600; (Sharon, et al., 1994)]. Bemerkenswerterweise führt bei yku70-Mutantenstämmen der Verlust sowohl von RAD52 als auch einer funktionellen Integrase zu einer Aufhebung der Retrotranspositionsraten beim eingesetzten Test (1 C). Daher resultiert die große Mehrheit der verbleibenden in yku70 erzeugten His+-Zellen aus Integrase-vermittelten Ereignissen.
Ku ist für die effiziente Transposition durch andere Retrotransposon-Typen erforderlich Um festzustellen, ob die Wirkung von Ku auf die Retrotransposition für Ty1 spezifisch ist oder ob sie sich auf andere retrotransponierbare Elemente erstreckt, wurde auch die Transposition des divergenten Retrotransposons Ty5 bewertet. Hefe-Stämme wurden mit einem Plasmid transformiert, das das Ty5-Element unter der Kontrolle des GAL1-Promotors enthielt und das das gleiche künstliche HIS3-Intronkonstrukt wie pGTyl-H3mHIS-3AI enthielt (Plasmid psz52 Zou et al., 1996), und Tests wurden wie oben beschrieben unter Bezugnahme auf 1 durchgeführt.
Auffälligerweise wird die Effizienz der Ty5-Transposition um das etwa 100fache verringert, wenn Hefe-Stämme Mutationen in YKU70 oder YKU80 aufweisen (2). Im Gegensatz dazu hat die Inaktivierung des DNA-Reparaturgens RAD52 weder in einem Wildform- noch in einem yku70-Mutanten-Hintergrund eine signifikante Wirkung auf die Ty5-Transpositionsraten. Andere Untersuchungen weisen darauf hin, dass eine Mutation in YKU80 oder Mutatin in SIR2, SIR3 oder SIR4 die Ty5-Retrotransposition beträchtlich senkt, und dass YKU70 oder YKU80 auch die Transposition durch das Hefe-Retrotransposon Ty3 abschwächen (Daten nicht gezeigt). Gemeinsam genommen zeigen diese Daten, dass Defekte an Ku zu dramatisch verringerten Transpositionshäufigkeiten von drei divergierenden Retrotransposonen führen. Das zeigt daher, dass Ku einen grundlegenden Aspekt des Retrotransposon-Lebenszyklus beeinflusst Hefe-Ku beeinflusst die Bildung funktikoneller virusartiger Teilchen nicht Es gibt mehrere Stadien im Ty-Lebenszyklus, in denen Ku eine Funktion erfüllen könnte. Zunächst könnte Ku die Synthese der virusartigen Teilchen (VLPs) beeinflussen, indem es die Synthese der Ty-RNA, die Synthese anderer viraler Komponenten oder die reverse Transkription der RNA und ihren Einbau in ein infektives VLP beeinflusst. Zweitens könnte Ku die Stabilität des VLP oder der cDNA beeinflussen, die es enthält. Drittens könnte Ku die Fähigkeit des VLP beeinflussen, in Ziel-DNA zu integrieren. Viertens könnte Ku an DNA-Reparaturschritten beteiligt sein, die nach der anfänglichen Integrase-vermittelten DNA-Strangspaltung und Transferreaktionen auftreten.
Um den Mechanismus zu untersuchen, durch den Ku die Retrotransposition für Ty1 beeinflusst, wurden Ty1-VLPs von aktiv transponierenden Zellen isoliert und analysiert. Bemerkenswerterweise wiesen VLPs, die von Zellen der Wildform und yku70-Zellen isoliert waren, über einen Saccharosegradienten, der bei ihrer Isolation verwendet wurde, ähnliche RT-Aktivitätsprofile auf (3; Zellen der Wildform ohne das Ty1-Element wurden ebenfalls analysiert, um Hintergrund-RT-Aktivitätsausmaße zu liefern). Da sich Ku an DNA-Enden bindet, wurde die Vermutung angestellt, dass Ku an die lineare Ty1-cDNA in den VLPs gebunden sein könnte. Um zu bestimmen, ob Ku mit dem VLPs assoziiert ist, wurden Westernblot-Analysen auf Saccharosegradienten-Fraktionen unter Verwendung eines polyklonalen Anti-Yku70p-Antikörpers durchgeführt. Yku70p wurde somit in den Fraktionen 1 und 2 von Extrakt von Zellen der Wildform detektiert, denen entweder aktiv transponierendes Ty1 fehlt oder die es enthalten. Am signifikantesten ist jedoch, das yku70p auch in Fraktion 8 von Ty-hältigen Extrakten der Wildform detektiert wurde, die Spitzen-RT-Aktivität enthält, aber in der äquivalenten Fraktion, die von Zellen stammte, denen Ty1 fehlte, nicht detektiert wurde. Das Vorhandensein von Yku-70p in Fraktionen, die Spitzen-RT-Mengen enthielten, wurde in drei unabhängigen VLP-Präparaten beständig festgestellt. Weiters zeigte Westernblot-Analyse ähnlicher Präparate von Zellen, die aktiv transponierendes Ty5 enthielten, auch eine Assoziation von Yku70p mit Spitzen-RT-Mengen. Gemeinsam weisen diese Daten stark darauf hin, dass Ykui70p mit Ty-VLPs assoziiert..
Gesamtzellextrakte, die aus den angegebenen Hefestämmen hergestellt wurden, wurden über einen Saccharosegradienten fraktioniert und auf RT-Aktivität getestet. Die Isolation von VLPs wurde von Eichinger und Boeke (1988) übernommen. Kurz zusammengefasst wurden 5 ml Über-Nacht-Hefe-Kultur, die pGTyH1mHIS3Al enthielt (gezüchtet in SCa-ura, die Glucose enthielt), pelletiert, mit Wasser gewaschen und verwendet, um 50 ml SC-ura zu impfen, die Galactose enthielt. Zellen der Wildform, die kein Plasmid enthielten, wurden in SC gezüchtet (das entweder Glucose oder Galactose enthielt, wie oben) und parallel dazu behandelt. Nach dem Züchten für 24 h bei 22 °C wurden die Zellen geerntet, mit Wasser gewaschen und durch Glasperlen-Zerstörung in Gegenwart von 1 ml Puffer B/Mg (100 mM HEPES, pH 7,6, 15 mM KCl, 3 mM DTT, 0,01 mg/ml Aprotinin, 5 mM MgCl₂) lysiert. Das Lysat wurde mit 12.000 g zentrifugiert und der Überstand auf einen Saccharosegradienten (1 ml 70% Saccharose in Puffer 8 ohne MgCl₂ und mit 10 mM EDTA, 1 ml 30%ig und 4 ml 20%ig) aufgeladen. Gradienten wurden in einem Beckman SW-40-Rotor bei 4°C 4 h lang zentrifugiert. Fraktionen (0,75 ml) wurden abgenommen und auf RT-Aktivität getestet. Positive Fraktionen wurden bei 50.000 g über Nach bei 4°C pelletiert, in 10 μl Puffer B/Mg resuspendiert und bei 4°C gelagert.
Westernblot-Analyse wurde auf den Saccharosegradienen-Fraktionen mit Anti-Yku70p-Antikörper durchgeführt. Zellkernextrakte von Stämmen der Wildform oder yku70-Stämmen wurden ebenfalls analysiert. Hefeextrakte wurden geerntet und über Saccharosegradienten wie oben fraktioniert. Alle Fraktionen wurden mit 100.000 g über Nacht bei 4°C pelletiert und in 10 μl Puffer B/Mg²+ resuspendiert. 5 μl einer jeden Fraktion wurden durch 8% SDS PAGE analysiert und auf eine Nylon-Membran übertragen. Die Membran wurde mit polyklonalem Kaninchen-ani-Yku70p-Antiserum inkubiert und mit an Meerrettichperoxidase gekoppeltem Anti-Kaninchen-IgG und verstärkter Chemolumineszenz sichtbar gemacht (Amersham). Yku70p ist ein ∼67 kDa-Protein, das in Extrakten der Wildform erkannt wird, aber in yku70-Extrakten nicht zu sehen ist.
Um festzustellen, ob sich die von Ku-positiven und Ku-negativen Hefezellen isolierten VLPs funktionell unterscheiden, wurden die Fähigkeiten der beiden VLP-Präparate unterschieden, in ein Plasmid-DNA-Molekül in vitro zu integrieren. Wie in 4 gezeigt, sind von Ku-defizienten Zellen isolierte VLPs bei der Vermittlung von cDNA-Integration nicht weniger aktiv als die von Ku-positiven Hefen isolierten VLPs.
In vitro-Transposition wurde unter Verwendung von VLPs getestet, die aus einem Hefestamm der Wildform oder einem yku70-Mutanten- (yku70) Hefestamm isoliert worden waren, wie oben unter Bezugnahme auf 3 beschrieben. Die Reaktionen enthielten 3 ml VLPs oder Puffer B/Mg² (negative Kontrolle), 10 mM Tris pH 8,0, 15 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 5% Poylethylenglykol und 1 mg superspiralisierte Plasmid-DNA (pRS5416; Stratagene). Die Reaktionen wurden für 30 min bei 25°C inkubiert und durch die Zugabe von Proteinase K bis auf 0,5 mg/ml und SDS bis auf 1,4% gestoppt, gefolgt von einer weiteren Inkubation bei 25°C für 3 h. Als nächstes wurde die DNA mit Phenol/ Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt, mit 70% Ethanol gewaschen, in 10 mM Tris, pH 8,0 resuspendiert und in XL-1-Zellen (Stragagene) transformiert. Kolonie-Hybridisierung wurde unter Verwendung einer statistisch geprimten Sonde, die dem HIS3-Gen entsprach, durchgeführt. Positive Kolonien wurden in Bezug auf die Gesamt-Kolonien gezählt, was die mittlere Transpositionshäufigkeit ergab. Positive Kolonien wurden genommen, um zu gewährleisten, dass sie das Ty1-Element enthielten; wie erwartet, ergaben Reaktionen, die keine VLPs enthielten, kein positiv hybridiserenden Kolonien.
Gemeinsam genommen deuten diese Daten darauf hin, dass Ku die Synthese, Stabilität oder inhärente katalytische Aktivität von Ty-Element-VLPs nicht beeinflusst.
Identifizierung des Schritts des Retrotransposon/Retrovirus-Lebenszyklus, der durch den Ku-assoziierten DNA-Reparaturapparat beeinflusst wird Es gibt mehrere Möglichkeiten dafür, wie Ku die Retrotransposition verstärkt, und alle sind testbar.

(1) Es ist möglich, dass sich Ku an die Retrotransposon- oder Retrovirus-cDNA in den VLPs oder das Retrovirusteilchen (RP) auf solche Weise bindet, dass die Teilchenstabilität oder Rate des Zusammenbaus erhöht wird. Diese Möglichkeit kann getestet werden, indem Antikörper gegen Ku-Untereinheiten in Immunfällungs- und Westernblotting-Untersuchungen mit VLPs und Virusteilchen verwendet werden.
(2) Ku könnte die Enden der cDNA vor Nucleasen oder anderen DNA-modifizierenden Enzymen schützen. Das könnte auftreten, wenn sich die cDNA im VLP oder (retroviralen Teilchen) RP befindet, und kann einfach getestet werden, indem die präzise Sequenz von Ty-cDNA-Enden durch Klonieren und Sequenzieren der cDNA-Enden bestimmt wird, die von VLPs oder RPs stammen, oder Tests wie Primerverlängerungen, Ribonuclease- oder S1-Nuclease-Mappingverfahren (Ausubel et al., 1991):
(3) Ku kann "Autointegrations"-Prozesse verhindern, die zu einer Zerstörung der VLPoder RP-cDNA durch ein Molekül führt, das in ein anderes integriert wird. Autointegrationsereignisse sind zuvor gezeigt worden (Lee und Craigie, 1994 und die Verweise darin), so dass es leicht möglich ist, zu testen, ob Ku diesen Prozess beeinflussen kann. Bei derartigen Tests werden VLPs oder infektive RPs in Transpositionsreaktionen in vitro in Gegenwart oder Abwesenheit von gereinigtem Hefe-Ku (Feldmann und Winnacker, 1993) oder Human-Ku (Dvir et al., 1993; Hartley et al., 1995) verwendet.
(4) Ku könnte in vivo die Funktion erfüllen, die Integrationsmaschinerie an Stellen auf der chromosomalen DNA anzubinden (es ist gezeigt worden, dass dieser Verfahrenstyp die Effizienz der Transposition beeinflusst; Bushman, 1994). Um das zu testen, kann die Fähigkeit von Ku, mit VLPs oder RPs in Wechselwirkung zu treten, in vitro durch biochemische Standardtests oder durch Proteinaffinitätschromatographie-Verfahren bewertet werden (z. B. Anbinden von Ku an einen unlöslichen Träger und feststellen, ob dieser VLPs oder RPs zurückhält).
(5) Ku könnte die Integrationseffizienz beeinflussen oder die Reaktion zum Abschluss treiben, indem verhindert wird, dass reverse Reaktionen stattfinden (das Umkehren der Integration kann in vitro stattfinden; z. B. Chow et al., 1992). Das kann getestet werden, indem die Wirkung der Zugabe von gereinigtem Hefe- oder Säugetier-Ku zu Retrotranspositionsrekationen in vitro unter Verwendung von gereinigten Integraseproteinen oder mit VLPs oder RPs bewertet wird (beispielsweise Brown et al., 1987; Eichinger und Boeke, 1988; Fujiware und Mizuuchi 1988; Fujiwara und Craigie 1989; Craigie et al., 1990; Bushman et al., 1990; Katz et al., 190; Bushman und Craigie, 1991; Pryciak et al., 1992; Moore und Garfinkel 1994; und die darin genannten Verweise). Außerdem können die Wirkungen von Ku auf Integrationsreaktionen untersucht werden, indem die Wirkungen von Extrakten von Ku-hältigen oder Ku-defizienten Säugetier- oder Hefezellen für Invitro-Integrationstests getestet werden.
(6) Ku könnte an der Reparatur der integrierten Produkte beteiligt sein – Integrase kann die virale cDNA an ein anderes DNA-Molekül binden, aber diese Produkte behalten Nicks und/oder Lücken, und diese müssen bearbeitet werden, bevor die DNA verbreitet werden kann (beispielsweise Bushman et al., 1990; Craigie et al., 1990). Es ist möglich, dass der Ku-assoziierte DNA-Reparaturapparat diese Funktionen erfüllt. Derartige Modelle können getestet werden, indem die Nick-hältigen Zwischenprodukte von in vitro Retrotransposon/Retorvirus-Integrationsreaktionen in Ku-positive oder Ku-negative Hefeoder Menschenzellen eingeführt werden, und dann ihre Reparatur in vivo analysiert wird. Diese Art von Analyse kann auch mit künstlichen Substraten durchgeführt werden, die durch genickte Integrase erzeugte Retrovirus/Retrotransposon-Integrationszwischenprodukte nachahmen. Eine andere Möglichkeit, das zu bewältigen, besteht darin, die Verarbeitung natürlich oder künstlich genickerter Substate in vitro unter Verwendung von Extrakten von Hefe- oder Menschenzellen zu analysieren, die Komponenten des Ku-assoziierten DNA-Reparatursystems aufweisen oder in Bezug darauf defizient sind, oder indem (teilweise) gereinigte Komponenten des Ku-assoziierten DNA-Reparatursystems verwendet werden.

Es ist wichtig, festzustellen, das es für die Durchführung der vorliegenden Erfindung in verschiedenen Aspekten nicht notwendig ist, zu wissen, wie Ku am Retrovirus/Retrotransposon-Lebenszyklus beteiligt ist. Es kann einfach festgestellt werden, dass es derart beteiligt ist und das, wie hierin gezeigt, die Unterbrechung der Ku-Funktion eine antiretrovirale/Anti-Transposon-Wirkung hat.
Hemmung von Hefe-Ku-Aktivität führt zu verringerten Ty-Transpositionshäufigkeiten Der Verlust von Hefe-Ku-Funktion beeinflusst die Ty-Transpositionsraten (oben ermittelt), was einen Hinweis dafür liefert, dass Ty-Transpositionshäufigkeiten bei Ku-positiven Zellen durch Inhibitoren von Ku-Wirkung verringert werden.
Ein Ansatz, um dieses Prinzip zu veranschaulichen, umfasst das Einführen von Plasmidmolekülen, die die Expression mutierten Derivate von Yku70p oder Yku80p in YKU70/ YKU80-Stämme (unter Einsatz von Vektoren wie den zuvor beschriebenen; Boulton und Jackson, 1996a; Boulton und Jackson, 1996b). Die untersuchten Ku-Mutanten können beispielsweise N-terminale Deletionsmutanten, C-terminate Deletionsmutanten und Punktmutanten in Bereichen des Proteins umfassen, die während der gesamten Evolution konserviert werden (z. B. Feldmann und Winnacker, 1993; Boulton und Jackson, 1996b). Da die Untereinheiten von Ku als Heterodimer wirken und in Verbindung mit verschiedenen anderen Proteinen arbeiten, bilden verschiedene mutierte Ku-Moleküle, die in der Lage sind, mit ihrem Partner oder mit anderen Komponenten des Systems in Wechselwirkung zu treten, nicht-funktionelle Komplexe. Derartige dominante negative Mutationen liefern, wenn sie in Ty-Transpositionsuntersuchungen verwendet werden, einen Hinweis dafür, dass die Hemmung der Ku-Funktion die Ty-Retrotransposition beeinträchtigen kann.
Definition der Regionen von Yku70p und Yku80p, die bei der Ty-Integration wirksam sind Die Regionen der beiden Ku-Untereinheiten, die bei der Ty-Retrotransposition wirksam sind, können definiert werden, indem die Fähigkeiten mutierter YKU70- und YKU80- Derivate bewertet werden, die Transpositionsdefizienzen von yku70- bzw. yku80-Mutantenstämmen zu ergänzen (Unter Einsatz von Vektoren wie den zuvor beschriebenen; Boulton und Jackson, 1996a; Boulton und Jackson, 1996b). Die Fähigkeit der mutierten Yku70p- und Yku80p-Derivate, die DNA-Reparatur zu ergänzen, Strahlenempfindlichkeit und Telomer-Verlustphänotypen von Hefen mit Ku-Defizienz können auch unter Einsatz von Standardverfahren getestet werden (Boulton und Jackson, 1996a; Boulton und Jackson, 1996b; Porten et al., 1996). Ähnliche Ansätze können auch eingesetzt werden, um wichtige funktionelle Regionen von Säugetier-Ku70 und Ku80 zu definieren und funktionelle Regionen anderer Komponenten des Ku-assoziierten DNA-Reparaturapparats zu definieren (siehe unten).
Die Identifizierung von Regionen, die die Retrotransposition selektiv beeinflussen, kann zur Entwicklung von Arzneimitteln führen, die die Retrotransposition stören, aber andere Ku-abhängige Prozesse nicht beeinflussen.
Wirkungen anderer Komponenten des Ku-assoziierten DNA-Reparaturapparats auf die Retrotransposition
Die mit Ku erzielten Ergebnisse lassen erwarten, dass andere Proteine, die in Ku-assoziierten Prozessen wirken, eine Rolle bei der Retrotransposon- und der retroviralen Integration spielen. Unveröffentlichte Daten aus dem Labor der Erfinder weisen darauf hin, dass die Produkte der Hefegene RAD50, XRS2 und MRE11 mit Yku70p und Yku80p bei der DNA-DSB-Wiederverbindung wirken. So führt die Unterbrechung der MRE11-, XRS2- oder RAD50-Gene zu Defekten bei der illegitimen Endenverbindung, wie durch Plasmidreparaturtests und in Strahlenempfindlichkeitsversuchen wie den zuvor beschriebenen (Boulton und Jackson, 1996a, 1996b) bestätigt. Diese Defekte sind die gleichen wie jene, die bei in Bezug auf YKZ70 und YKU80 unterbrochenen Stämmen beobachtet werden (Boulton und Jackson, 1996a und 1996b). Weiters wird in Doppelmutantenstämmen, die in Bezug auf Ku plus einem dieser anderen Gene (MRE11, XRS2, RAD-50) Defizienz aufweisen, kein zusätzlicher Defekt der DNA-Reparatur beobachtet. Diese Daten weisen daher darauf hin, dass MRE11, XRS2 und RAD50 auf dem gleichen DNA-DSB-Reparaturweg arbeiten wie Ku. Weitere Ergebnisse zeigen, dass das als LIG4 bezeichnete Hefegen (Teo et al., 1997) ebenfalls Teil des Ku-assoziierten DNA-Reparaturapparats ist. Dies entspricht dem offenen Leserahmen YOR005c auf dem rechten Arm von S. cerevisiae-Chromosom XV, Hinterlegungsnummer Z74913 der Hefegenom-Datenbank, und kodiert für ein Protein mit starker Sequenzähnlichkeit zu Säugetier-Ligase IV (Wei et al., 1995). Die Unterbrechung von LIG4 führt zu Defekten bei illegitimer Endenverbindung, wie durch Plasmidreparaturtests und in Strahlenempfindlichkeitsversuchen bestätigt, und diese Defekte sind die gleichen wie jene, die bei in Bezug auf YKU80 unterbrochenen Stämmen beobachtet wurden (Boulton und Jackson, 1996a, 1996b). Weiters wird bei Doppelmutantenstämmen, die in Bezug auf Ku plus LIG4 defizient sind, kein zusätzlicher Defekt der DNA-Reparatur beobachtet, was darauf hinweist, dass diese Gene auf dem gleichen Weg funktionieren. Die Wirkung des Mutierens dieser Gene auf die Ty-Retrotranspositionshäufigkeiten können unter Einsatz von ähnlichen Tests wie den für Ku beschriebenen getestet werden.
Beispielsweise zeigt 2D eine gewisse Verringerung der Retrotranspositionsraten bei Stämmen, die Unterbrechungen in RAD50 oder LIG4 aufweisen. Es ist gezeigt worden, dass diese auf dem gleichen Weg wie Ku bei. der Reparatur von ds-Brüchen in Hefe arbeiten (Milne et al., 1996; Tsukamoto et al., 1996; Teo et al., 1997; Shar et al., 1997; Wilson et al., 1997). Diese Verringerungen waren nicht so groß wie erwartet, was darauf hinweist, dass Ku die Retrotransposition auf eine Art erleichtern kann, die sich von seiner Rolle bei der Reparatur von DNA-ds-Brüchen unterscheidet. Bei weiteren Untersuchungen führt die Unterbrechung von SIR2, SIR3 oder SIR4, die ebenfalls bei der Kuassoziierten DNA-DSB-Reparatur eine Funktion erfüllen (Tsukamoto et al., 1997; Jackson, 1997) zu verringerten Retrotranspositionsraten. So liefert die Hemmung von Säugetier-Homologen solcher Faktoren (Baken et al., 1995) eine weitere Alternative für die Entwicklung antiretroviraler Mittel.
Sollte ein Hefehomolog des Säugetier-XRCC4-Proteins (Li et al., 1995) identifiziert werden, wird von diesem auch erwartet, dass es an der Ty-Transposition beteiligt ist, da der Säugetier-Faktor als Teil des Ku-assoziierten DNA-Reparaturapparats wirkt (siehe auch weiter unten) und Defekte im Säugetier-XRCC4 die Retrovirus-Integration negativ beeinflussen (siehe unten). Wenn irgendwelche anderen Komponenten des Ku-assoziierten Hefe-DNA-Reparaturapparats definiert sind, werden auch diese auf ihre Rolle bei der Retrotransposition getestet. Sollte eine Mutation eines dieser Gene zu verringerter Retrotransposition führen, sind die Faktoren und ihre Homologe in anderen Organismen attraktive Ziel für die Entwicklung neuer antiretroviraler Mittel.
Schritte zur Bestimmung des Orts oder der Orte, die an zusätzlichen Faktoren bei der Retrotransposition beteiligt sind, und die Entwicklung von Strategien für Arzneimittel-Screening usw. sind zu den oben und unten für die Ku-Untereinheiten beschriebenen analog.
Ku schützt Retroelement-DNA vor zellulären Nucleasen
Im Lichte der Wirkung von Ku auf die Retrotransposition, und da sich Ku an DNA-Enden bindet, besteht eine Möglichkeit darin, dass Ku die Retrotransposition verstärkt, indem es sich an Retrotransposon-cDNA bindet und sie vor Nuclease-Angriff schützt. Tatsächlich gibt es, während reverse Transkription von retroviraler Ty-Element-RNA im Inneren viraler Teilchen oder VLPs auftritt (Garfinkel et al., 1985; Zang, 1995; Mellor 1985), Hinweise dafür, dass die in diesen Teilchen enthaltene DNA für Nucleasen anfällig ist (Bowerman, 1989). Um zu bestimmen, ob der Mangel an Ku zu Abbau von Retrotransposon-cDNA führt, wurde DNA von Ty1-VLP-Präparaten isoliert, die von Zellen der Wildform oder yku70-Zellen stammten, mit Spel digeriert, und die resultierenden Moleküle mit Klenow- und radioaktiven dNTPs inkubiert. Die Spel-Produkte umfassen ein Fragment mit 287 bp, das dem 3'-Ende des Ty1-Elements entspricht. Wenn die Enden in den von yku70-Zellen stammenden VLPs signifikant beeinträchtigt waren, wäre zu erwarten, dass diese Bande schneller läuft oder in bezug auf das entsprechende Fragment von VLPs der Wildform verschmiert erscheint. Es wurden jedoch keine detektierbaren Unterschiede zwischen den von Zellen der Wildform und yku70-Zellen stammenden cDNA-Produkten ermittelt.
Zur Southern-Analyse von Ty1-cDNA wurden VLPs von Stämmen der Wildform oder yku70-Stämmen durch RT-Aktivität normalisiert und bei Raumtemperatur in Puffer B/Mg²+ inkubiert (10 mM HEPES, pH 7,6, 15 mM KCl, 3 mM DTT, 10 mg/ml Aprotinin, 5 mM MgCl₂). DNA wurde durch Phenol/Chloroform-Extraktion zu verschiedenen Zeitpunkten isoliert und auf einem 1 %igen Agarosegel elektrophoresiert. Das Gel wurde transferiert und durch Southernblot-Hybridisierung gefolgt von Autoradiographie analysiert.
Gleiche Mengen an VLP-Präparaten, wie durch RT-Aktivität bestimmt, wurden für Analysen von Ty1-DNA verwendet. DNA wurde durch Inkubation mit 50 ng/ml Proteinase K, 12,5 mM EDTA und 0,5 % SDS bei 25 °C für 2 h isoliert, gefolgt von zwei Phenol/ Chloroform-Extraktionen und Ethanol-Fällung. Für die Southern-Analyse wurde Ty1-DNA durch 1%-Agarose-Elektrophorese analysiert und auf GeneScreen Plus (DuPont/ NEN) übertragen. Die Membran wurde mit dem BamHl/Hindill-Fragment von pGTy1-H3mHIS3Al sondiert, das durch Nick-Translation markiert war (Promega).
Obwohl die obigen Daten zeigten, dass kein umfangreicher Abbau von VLP-DNA in Abwesenheit von Ku aufgetreten war, wären kleinen Abbaumengen detektiert worden. Um geringe Abbaumengen zu detektieren, wurde VLP-DNA mit radioaktiven dNTPs und dem Klenow-Fragment von E.coli-DNA-Polymerase inkubiert und wurde dann durch Szintillationszählung analysiert. Da Klenow in 5'-3'-Richtung polymerisiert, ist die Aufnahmemenge eine Widerspiegelung von DNA-Nicks oder zurückversetzten 3'-Enden. Signifikanterweise nahm von yku70-VLPs isolierte cDNA um das ∼ zweifache mehr Radiomarkierung auf als cDNA von VLPs der Wildform (5). Diese Daten deuten darauf hin, dass Ty1-cDNA in Abwesenheit von Ku erhöhte Mengen an DNA-Nicks ansammelt und/oder 5'-3'-Abbau der cDNA-Enden zeigt. Da Ty1-Integrase entweder stumpfe Enden oder einen überhängendes 3'-OH erfordert, um Strangaustausch zu katalysieren (Eichinger und Boeke, 1990), könnte ein solcher 3'-5'-Abbau die Retrotranspositionseffizienz beeinträchtigen.
Es gibt eine Nucleaseaktivität, die mit den VLPs über Saccharosegradienten gemeinsam gereinigt wird (Braiterman und Boeke, 1994). VLP-Präparate, die von Ku-positiven und Ku-negativen Hefezellen stammten, wurden bei Raumtemperatur für unterschiedliche Zeiträume inkubiert, dann die Ty1-DNA durch Southern-Hybridisierungsanalyse auf Abbau analysiert. Bemerkenswerterweise zeigten diese Untersuchungen, dass von yk70-Zellen stammende VLP-assoziierte Ty1-DA viel rascher abgebaut wird als die von Zellen der Wildform erhaltene (6b). Die geringere Abbaurate bei Zellen der Wildform scheint daher nicht auf das Fehlen aktiver Nuclease in den VLP-Präparaten zurückzuführen zu sein, die von yku70-Mutantenzellen stammen. Statt dessen weisen diese Daten stark darauf hin, dass die Assoziation von Ku mit Ty1-VLPs Ty1-cDNA vor Nuclease-Angriff schützt. Stumpfendige Plasmid-DNA (pRS416; 2 μg) wurde mit Puffer allein oder VLPs entweder von der Wildform oder von yku70 inkubiert (die Menge der in den Reaktionen verwendeten VLPs wurde durch RT-Aktivität normalisiert). DNA wurde für die angegebene Zeit inkubiert, auf einem 1 %-Agarosegel elektrophoresiert, durch Färbung mit Ethidium sichtbar gemacht und quantifiziert.
Die oben Ergebnisse weisen darauf hin, dass Ku bei der Retrotransposition eine Rolle spielt, und lassen vermuten, dass es zumindest teilweise durch Bindung an die und Schützen der Retroelement-DNA vor zellulären Nucleasen arbeitet. In Einklang mit diesem Modell ist gezeigt worden, dass Ku bei der präzisen Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBS) in Hefe eine Funktion erfüllt und in Abwesenheit von Ku reparierte lineare DNA Deletionen enthält (Mages et al., 1996; Boulton und Jackson, 1996a; Boulton und Jackson, 1996b; Milne et al., 1996; Siede et al., 1996; Tsukamoto et al., 1996). Da die Assoziation von Ku mit DNA-Enden in hohem Maße stabil ist, ist vorstellbar, dass Ku während des Transports in den Zellkern mit der Ty1-cDNA assoziiert bleibt und in den nachfolgenden Schritten im Retrotranspositionsprozess eine Funktion erfüllt. Beispielsweise kann Ku, da es sich an DNA-ss-Lücken mit vergleichbarer Affinität zu DNA-ds-Enden bindet (Paillard und Strauss, 1991; Falson et al., 1993), die Reparatur der einstrangigen DNA-Lücken erleichtern, die als Retrotranspositions-Zwischenprodukte entstehen. Durch die Bindung solcher Strukturen und das Verschieben von Integrase konnte Ku auch die Umkehr der Transpositionsreaktion verhindern, ein Prozess, der als Desintegration bezeichnet wird (Moores et al., 1995; Dotan et al., 1995).
SÄUGETIERZELLEN
Defekte im Ku-assoziierten DNA-Reparatur-System führen zu verringerter Infektivität durch Retroviren in Säugetierzellen
Um festzustellen, ob Ku die Retrotransposon- und Retrovirus-Verbreitung in Säugetiersystemen beeinflusst, wurden die Fähigkeiten eines Säugetier-Retrovirus analysiert, sich in das Genom von Säugetierzellen zu integrieren, die den Ku-assoziierten DNA-Reparaturapparat umfassen oder eine Defizienz in Bezug darauf aufweisen. Für diese Untersuchungen wurde ein Derivat des Moloney-Mäuse-Leukämievirus (Mo-MLV) verwendet, um verschiedene Nagetier-Zelllinien zu infizieren (um die Infektion zuzulassen, wurde das Virus mit dem Vesikel-Stomatitisvirus G-Protein "pseudotypisiert", was Überstände mit einem ungefähren Titer von 1 × 10⁷ ergab; Burns et al., 1993; Hopkins, 1993; Yee et al., 1994; und die darin genannten Verweise).
Es wurden verschiedene Verdünnungen verwendet, um sub-konfluente Monoschichten von Zelllinien zu infizieren, und 48 h nach der Infektion wurden die Zellen fixiert, bezüglich β-Galactosidase-Aktivität gefärbt, und die resultierenden blau gefärbten LacZ-positiven Kolonien wurden gezählt. Die bei diesen Untersuchungen verwendeten Zellen waren Chinahamster-Eierstock- (CHO-) Zelllinie K1 der Wildform, ihr Ku80-defizientes Derivat xrs-6 (beispielsweise Taccioli et al., 1994), XRCC4-defiziente XR-1-Zellen (XRCC4 erfüllt gemeinsam mit Ku eine Funktion im DNA-DSB-Reparaturweg; Li et al., 1995; Critchlow et al., 1997; lirawunder et al., 1997) und Maus-Zelllinie 3T3 der Wildform.
Wie in 7 gezeigt, erzeugten die Zellen mit Ku- oder XRCC4-Defizienz signifikant weniger blaue Kolonien als die Zellen der Wildform, was darauf hinweist, dass Ku und XRCC4 tatsächlich die retrovirale Infektion beeinflussen. Darüber hinaus enthielten von den blau färbenden Kolonien, die entstanden, jene, die in de Ku-defizienten oder XRCC4-defizienten Zellen entstanden, signifikant weniger blau färbende Zellen als dies bei den Kolonien der Fall war, die in den Zellen der Wildform entstanden. Daher scheint zusätzlich zur Verringerung der Gesamtanzahl an infizierten Zeltklonen der Mangel an Ku oder XRCC4 auch entweder eine Verzögerung der Teilung infizierter Zellen oder Verzögerungen im retroviralen Integrationsprozess selbst zu verursachen. Gemeinsam genommen weisen diese Daten darauf hin, dass die Hemmung von Ku und der ihm zugeordneten DNA-Reparaturkomponenten tatsächlich dazu dient, die retrovirale Infektion in Säugetiersystemen zu hemmen.
In Anbetracht dessen, dass dies auch bei Hefe der Fall ist, kann durchaus geschlossen werden, dass das Erfordernis des Ku-assoziierten DNA-Reparaturapparats bei der effizienten retroviralen und Retrotransposon-Integration im gesamten eukaryotischen Bereich allgegenwärtig ist.
Im Licht der obigen Daten kann die Beteiligung anderer Komponenten des Ku-assoziierten DNA-Reparaturapparats bei Säugetieren an der effizienten retroviralen und Retrotransposon-Integration bestimmt werden, indem die Effizienz der retroviralen Integration in Zelllinien bewertet wird, die eine Defizienz bezüglich anderer Komponenten dieses Systems aufweisen. Beispielsweise gibt es Maus-, Hamster- und Menschen-Zelllinien, die eine Defizienz bezüglich der katalytischen Untereinheit von DNA-abhängiger Proteinkinase (NA-PKcs) aufweisen, die Teil der Ku-assoziierten DNA-Reparatur-Maschinerie bei Säugetierzellen ist (siehe z. B. Blunt et al., 1995; Lees-Millen et al., 1995; Überblicke geben Jackson und Jeggo, 1995; Jackson, 1996).
Wo natürlich auftretende Säugetier-Mutanten nicht bereits bestehen, kann die anvisierte Unterbrechung von Loci durch Standard-"Gen-Knockout"-Ansätze eingesetzt werden, um den erwünschten Zelttyp abzuleiten (z. B. defektiv in Bezug auf Säugetier-Ligase IV oder defektiv in Bezug auf homologes Hefe-Rad50p, Mre11 p, Xrs2p, Sir2p, Sir3p und Sir4p). Alternativ dazu können Untersuchungen an Zellen vorgenommen werden, die aufgrund der Expression von dominanten negativen Mutanten von Faktoren wie Ligase IV, RadSOp, Mre11p undXrs2p in Bezug auf die Reparatur defizient gemacht wurden. Da Säugetier-Ligase III eine sehr ähnliche Sequenz wie Ligase IV aufweist, können Zellen, die in Bezug auf Ligase III oder das assoziierte XRCC4-Protein defizient sind, auf ihre Fähigkeit getestet werden, retrovirale oder Retrotransposon-Integration zu vermitteln (den Chinahamster-Eierstock-Zelllinienderivaten EM-9 und EM-C11 fehlt funktionelles XRCC1; Thompson et al. 1990; Caldecott et al., 1996; und die darin genannten Verweise).
Unter Verwendung einer Vielzahl von Säugetier-Retrovirus-Typen ist auch ohne Umweg zu zeigen, dass der Ku-assoziierte DNA-Reparaturapparat bei Säugetieren wie bei Hefe eine wichtige Rolle bei der Integration einer großen Bandbreite von Retrovirus in Säugetierzellen spielt. Testviren umfassen andere Tiertumor-Retroviren, Human-T-Zellen-Leukämieviren und HIV-1, das AIDS verursacht (HIV kann verwendet werden, um Menschenzellen zu infizieren, oder kann derivatisiert werden, um Nagetierzellen zu infizieren; z. B. Naldini et al., 1996).
Wie oben für das Hefe-System beschrieben, können Untersuchungen in vivo und in vitro eingesetzt werden, um präzise zu bestimmen, in welchem Schritt bzw. in welchen Schritten die Ku-assoziierte DNA-Reparaturmaschinerie bei der retroviralen und Retrotransposon-Integration bei Säugetieren eine Funktion erfüllt. Weiters können bereits verfügbare Tests eingesetzt werden, um die Rollen zu definieren, die individuelle Komponenten der Maschinerie erfüllen, und die präzisen Regionen der verschiedenen Polypeptide zu definieren, die für die Funktion kritisch sind. Das sollte die Konstruktion von Tests bezüglich Substanzen erleichtern, die diese Funktion unterbrechen und somit für den Einsatz als antiretrovirale Mittel indiziert sind.
Inhibitoren des Ku-assoziierten DNA-Reparaturapparats schützen gegen retrovirale Infektion
Wie oben für das Hefesystem beschrieben, können dominante negative Derivate von Ku-Untereinheiten und anderen Komponenten des Ku-assoziierten DNA-Reparaturappa rats eingesetzt werden, um zu zeigen, dass die Hemmung dieses Reparaturapparats bei normalen Zellen zu einer verringerten Fähigkeit führt, Retrovirus stabil in das Wirtszellengenom zu integrieren. Für diese Untersuchungen werden stabile Säugetier-Zeltlinien erzeugt, die die dominanten negativen Mutantenproteine exprimieren. Säugetier-Zelllinien der Wildform werden auch mit verschiedenen Arzneimitteln behandelt, um zu zeigen, dass dies zur Hemmung retroviraler Integration führt.
In dieser Hinsicht ist von den Verbindungen Wortmannin und LY294002 gezeigt worden, dass sie die Ku-assoziierte DNA-abhängige Proteinkinase- (DNA-PK) Aktivität hemmen (Hartley et al., 1995; Vlahos et al., 1994; auch unveröffentlichte Daten aus dem Labor der Erfinder). Andere DNA-PK-Inhibitoren, die identifiziert werden, können in Bezug auf Wirkungen getestet werden. Obwohl es am einfachsten ist, Mittel zunächst an Gewebekulturzellen zu testen, können erste Untersuchungen in der Folge ausgedehnt werden, um Tiere wie Mäuse (es werden Mäuse eingesetzt, die Defizienz in Bezug Komponenten des Ku-assoziierten DNA-Reparaturapparats aufweisen oder diese umfassen) oder schlussendlich Menschen als Versuchssubjekte zu umfassen.
Entwicklung von Testverfahren bezüglich Mittel, die die retrovirale Infektivität verringern, indem sie den Ku-assoziierten DNA-DSB-Reparaturapparat unterbrechen
Die Bestimmung des Mechanismus, durch den die Ku-assoziierte DNA-Reparatur-Maschinerie bei der Retrovirus- und Retrotransposon-Integration arbeitet, erleichtert die Konstruktion von Tests, die diese Funktionen in definierten In-vivo- oder In-vitro-Tests rekapitulieren. Derartige Tests gehören zu jenen, die bei Screens für Inhibitoren eingesetzt werden können, die Substanzen als potentielle antiretrovirale Mittel identifizieren.
Tests umfassen jene, die die volle retrovirale Integration messen oder nur den Schritt bzw. die Schritte des Verfahrens messen, der bzw. die durch die Ku-assoziierte Maschinerie beeinflusst wird bzw. werden. Obwohl In-vitro-Test bei den Screens am leichtesten einzusetzen sind, können Hefe- oder Säugetier-Zellinien nützliche In-vivo-Systeme bereitstellen, um bezüglich der Wirkungen zu testen. In Hinblick darauf können Hu man-Ku70 und Ku80 in Hefezellen exprimiert werden, um Ty-Transposition oder andere Aspekte Ku-abhängiger Ereignisse zu bewerten. Ein derartiges "humanisiertes" Hefe-System kann verwendet werden, um in Bezug auf Moleküle zu screenen, die die Human-Ku-Funktion stören.
Ein weiteres Screen, das eingesetzt werden kann, um neue antiretrovirale Mittel zu identifizieren, ist eines, das Inhibitoren für Ku-assoziierte DNA-PK-Aktivität identifiziert (beispielsweise Dvir et al., 1992; Gottlieb und Jackson, 1993; Finnie et al., 1959; und die darin genannten Verweise).
Andere Screens können sich auf Verbindungen beziehen, die enzymatische Aktivitäten hemmen, die mit den Ligasen III oder IV, Rad50p oder Mre11 p (beides mutmaßliche Nucleasen) verbunden sind, die Protein-Protein-Wechselwirkungen innerhalb des Kuassoziierten Reparaturapparats (beispielsweise zwischen Ku und anderen Komponenten des Apparats, zwischen Rad50p, Mre11 p und Xrs2p, zwischen XRCC1 und Ligase III oder zwischen XRCC4 und Ligase IV) stören, oder Assoziationen zwischen der Reparaturmaschinerie und dem DNA-Substrat stören. Peptide oder Peptid-Mimetika, die wichtigen Bereichen von Komponenten des Ku-assoziierten Reparatursystems ähnlich sind, können zusätzlich zu Arzneimitteln mit kleinen Molekülen getestet werden.
Sobald sie auf solchen Wegen identifiziert worden sind, können Arzneimittel (und ihre Derivate) in Zell-, Tier- und schlussendlichen humanen Systemen auf Wirkungen auf die retrovirale und Retrotransposon-Integration und auf die retrovirale Infektion getestet werden.
Andere Anwendungen für Aktivatoren und Inhibitoren des Ku-assoziierten DNA-Reparaturapparats
Abgesehen davon, dass sie bei der Identifizierung und Konstruktion antiretroviraler Arzneimittel zur Verwendung bei Wirbeltiersystemen nützlich sind, sind Aktivatoren oder Inhibitoren von Ku-assoziierten Prozessen auch in anderen Systemen von Nutzen.
Beispielsweise sind Retrotransposone in den Genomen vieler höherer Pflanzen sehr häufig und können relativ häufig transponieren (Wessler, 1996). Tatsächlich scheint ein Großteil der problematischen somaklonalen Variation, die auftritt, nachdem Pflanzen aus Protoplastgewebekulturen regeneriert worden sind, durch Retrotranspositionsereignisse zu entstehen (Wessler, 1996). Aspekte der vorliegenden Erfindung können eingesetzt werden, um die Erzeugung somaklonaler Variation in Pflanzen durch die Hemmung des Ku-assoziierten DNA-Reparaturapparats der Pflanze zu unterdrücken.
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Claims

Verfahren zum Screenen auf ein Mittel, das ein Inhibitor für Retrovirus- und/oder Retrotransposon-Aktivität ist, welches Folgendes umfasst: Bereitstellen einer Substanz, die eine Komponente eines Ku-abhängigen DNA-Reparaturwegs oder ein Fragment einer solchen Komponente umfasst; Einwirkenlassen einer Testverbindung auf die Substanz daraus; Bestimmen der Wechselwirkung zwischen der Substanz und der Testverbindung.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend das Bestimmen der Fähigkeit einer mit der Komponente oder dem Fragment davon in Wechselwirkung tretenden Testverbindung, den Ku-abhängigen DNA-Reparaturweg zu hemmen und/oder Retrovirus- und/ oder Retrotransposon-Aktivität zu hemmen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Komponente Ku oder die Ku70-oder Ku80-Untereinheit davon ist.
Verfahren zum Screenen auf ein Mittel, das ein Inhibitor für Retrovirus- und/oder Retrotransposon-Aktivität ist, welches Folgendes umfasst: Bereitstellen einer ersten und einer zweiten Substanz, wobei die erste Substanz eine erste Komponente eines Ku-abhängigen DNA-Reparaturwegs oder ein Peptidfragment, ein Derivat, eine Variante oder ein Analog davon umfasst, das bzw. die zur Bindung einer zweiten Komponente des Ku-abhängigen DNA-Reparaturwegs fähig ist, wobei die zweite Substanz die zweite Komponente des Ku-abhängigen DNA-Reparaturwegs oder ein Peptidfragment, ein Derivat, eine Variante oder ein Analog davon umfasst, das bzw. die zur Bindung der ersten Komponente fähig ist, unter Bedingungen, unter denen die Komponenten normalerweise in Wechselwirkung treten; Einwirkenlassen einer Testverbindung auf die Substanz; Bestimmen der Wechselwirkung zwischen den beiden Substanzen in Gegenwart der Testverbindung.
Verfahren nach Anspruch 4, umfassend das Bestimmen der Fähigkeit einer die Wechselwirkung zwischen den beiden Komponenten unterbrechenden Testverbindung, den Ku-abhängigen DNA-Reparaturweg zu hemmen und/oder Retrovirus- und/oder Retrotransposon-Aktivität zu hemmen.
Verfahren zum Screenen auf ein Mittel, das ein Inhibitor für Retrovirus- und/oder Retrotransposon-Aktivität ist, welches Folgendes umfasst: Bereitstellen eines Ku-abhängigen DNA-Reparaturwegs; Einwirkenlassen einer Testverbindung auf den Weg unter Bedingungen, die normalerweise zur Aktivierung des Ku-abhängigen DNA-Reparaturwegs führen würden; und Suchen nach einem Endpunkt, der die Aktivierung des Ku-abhängigen DNA-Reparaturwegs anzeigt; wodurch die Hemmung dieses Endpunkts die Hemmung des Ku-abhängigen DNA-Reparaturwegs durch die Testverbindung anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 6, umfassend das Bestimmen der Fähigkeit einer Testverbindung, Retrovirus- und/oder Retrotransposon-Aktivität zu hemmen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend die Durchführung der in diesem Anspruch genannten Schritte, um ein Mittel zu erhalten, das ein Inhibitor für Retrovirus- und/oder Retrotransposon-Aktivität ist, und weiters umfassend das Formulieren des Inhibitors zu einer Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend die Durchführung der in diesem Anspruch genannten Schritte, um ein Mittel zu erhalten, das ein Inhibitor für Retrovirus- und/oder Retrotransposon-Aktivität ist, und weiters umfassend das Bereitstellen des Inhibitors für eine Zelle, die nicht Teil des menschlichen oder eines Tierkörpers ist, um Retrovirus- und/oder Retrotransposon-Aktivität in der Zelle zu hemmen.