DE69824165T2

DE69824165T2 - Verwendung von chelerythrin und strahlung in der tumortherapie

Info

Publication number: DE69824165T2
Application number: DE69824165T
Authority: DE
Inventors: R. Ralph WEICHSELBAUM; Jose Quintans; J. Steven CHMURA; W. Donald KUFE
Original assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc; Arch Development Corp
Current assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc; Arch Development Corp
Priority date: 1997-03-25
Filing date: 1998-03-25
Publication date: 2005-06-09
Anticipated expiration: 2018-03-26
Also published as: EP0971710B1; DK0971710T3; PT971710E; CN1255061A; US6025365A; DE69824165D1; CA2284992A1; AU6869398A; AU737613B2; EP0971710A1; ES2218814T3; ATE267599T1; JP2001521552A; CN1172668C; WO1998042339A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Krebsbehandlung und Strahlentherapie. Im Besonderen betrifft sie eine Kombination geringer Dosen des Proteinkinase C(PKC)-Inhibitors Chelerythrin mit geringen Dosen ionisierender Strahlen, so dass ein unerwartet wirksames Abtöten strahlenresistenter Tumorzellen bewirkt wird.
Bestimmte Krebsbehandlungsverfahren, einschließlich der Strahlentherapie, gehen mit einer Schädigung der DNA der Krebszelle einher. Die zelluläre Reaktion auf eine DNA-Schädigung beinhaltet eine Aktivierung der DNA-Reparatur, eine Zellzyklusarretierung und Letalität (Hall, 1988). Das durch ionisierende Strahlen (IR; Röntgen-Bestrahlung) vermittelte Abtöten von Säugetierzellen wird häufig durch den Verlust der reproduktiven Integrität nach einer oder mehr Zellteilung(en) beschrieben (Chang und Little, 1992a, 1991, 1992b; Bussink et al., 1996). Die Induktion von DNA-Doppelstrangbrüchen führt zu letalen Chromosomenaberrationen, die Deletionen, dizentrische Chromosomen, Ringe und Anaphasenbrücken beinhalten (Hall, 1994). Die morphologischen Charakteristiken von Zellen, die nach einer IR-Bestrahlung einen mitotischen Tod sterben, beinhalten, wie im Fall eines nekrotischen Todes, vielkernige Riesenzellen, Zell-Zell-Fusionen (Hall, 1994) sowie den Verlust der Membranintegrität (Quintans et al., 1994; Maity et al., 1994; Harmon und Allan, 1988; Radford und Murphy, 1994). Im Unterschied zum nekrotischen Tod beinhalten die morphologischen Charakteristiken einer durch IR induzierten Apoptose (Quintans et al., 1994; Maity et al., 1994; Harmon und Allan, 1988; Radford und Murphy, 1994) die Aktivierung eines genetischen Programms, das durch zytoplasmatische oder nukleäre Ereignisse initiiert werden kann, und welches eine zytoplasmatische Blasenbildung, Chromatinkondensation und DNA-Fragmentierung zur Folge hat (Jacobson et al., 1994; Raff et al., 1994).
Untersuchungen in Tumorsystemen legen nahe, dass die Erhöhung des Anteils an Tumorzellen, die in die Apoptose eingehen, die Tumorregression und Tumorheilungen mit IR verbessert (Meyn et al., 1993; 1994; 1995; Martin und Green, 1994; Indap und Rao, 1995; Dewey et al., 1995; Lowe et al., 1993b; Stephens et al., 1991; 1993). Wirkstoffe, welche die DNA schädigen, die DNA-Reparatur stören oder Kontrollpunkte des Zellzyklus verändern, wurden mit begrenztem klinischen Erfolg in Studien am Menschen angewendet, um die strahlungsvermittelte Tumorreaktion zu modifizieren (Hall, 1988; Vokes und Weichselbaum, 1990; Rosenthal et al., 1995). Wahrscheinlich teilweise deswegen, weil der Verlust der apoptotischen Reaktion auf Röntgen-Bestrahlung mit einem strahlungsresistenten Phänotyp in Verbindung gebracht werden konnte. Eine Strahlungsresistenz des Tumors kann durch eine Aktivierung von DNA-Reparaturgenen und von Zellzyklus-Kontrollpunkten auftreten (Maity et al., 1994; Sanchez und Elledge, 1995; Szumiel, 1994; Park, 1995; Shen et al., 1996; McKenna et al., 1991). Beispielsweise ist ein Verlust der p53-Funktion in Folge einer verminderten Fähigkeit, in die Apoptose einzugehen, mit einem strahlungsresistenten Phänotyp (Boise et al., 1995) und häufig mit einer Behandlungsresistenz und einem Tumorrezidiv verbunden (Lowe et al., 1993a; 1993b; 1994). Ein erhöhtes Verhältnis von anti-apoptotischen zu pro-apoptotischen Proteinen vermindert ebenfalls die IR-induzierte Apoptose.
Es wurde gezeigt, dass eine Aktivierung der Sphingomyelinase und anschließende Ceramidproduktion einer durch Röntgenstrahlen induzierten Apoptose in mehreren Zelltypen vorausgeht (Quintans et al., 1994; Haimovitz-Friedman et al., 1994; Verheij et al., 1996; Kolesnick, 1994; Jarvis und Kolesnick, 1996; Santana et al., 1996). Kürzlich wurde gezeigt, dass der auf Röntgenstrahlen folgende Verlust der Ceramidproduktion Zellen, die aus einer Knockout-Maus für eine saure Sphingomyelinase stammen, und Tumorzellen, die auf Grund eines Defekts in der Produktion einer neutralen Sphingomyelinase ausgewählt wurden, einen strahlungsresistenten Phänotyp verleiht. Darüber hinaus induzieren Chelerythrinchlorid (Herbert et al., 1990) und Calphostin C (Kobayashi et al., 1989b), Inhibitoren von PKC-Isoformen, die Apoptose und Ceramidproduktion durch die Aktivierung einer neutralen Sphingomyelinase (Chmura et al., 1996a; Chmura et al., 1996b).
Ionisierende Strahlung induziert PKC- und Protein-Tyrosin-Kinase-Aktivitäten (Hallahan et al., 1990; Uckun et al., 1995). Allerdings sind die für diese Aktivitäten verantwortlichen spezifischen Kinasen und ihre Substrate nicht vollständig verstanden. Die PKC-Aktivierung ist funktional mit der Geninduktion verwandt, die erfolgt, wenn Säugetierzellen IR ausgesetzt werden (Young et al., 1994; Kondratyev et al., 1996; Hallahan et al., 1995; Hallahan et al., 1994). Die Proteinkinase C-Familie von Serin/Threonin-Kinasen umfasst mindestens 13 verwandte Isoformen (Magnuson et al., 1994) mit unterschiedlicher Sensitivität gegenüber Calzium und Lipid-Aktivatoren. Von der PKC-Aktivierung wurde auch berichtet, dass sie die Produktion von Ceramid aus der Hydrolyse von Sphingomyelin limitiert und Zellen aus der IR-vermittelten Apoptose rettet (Kolesnick et al., 1994; Haimovitz-Friedman et al., 1994).
Bezüglich der Beziehung zwischen PKC-Inhibitoren und der Induktion des programmierten Zelltods in humanen Tumorzellen ist wenig Information verfügbar, und die Ergebnisse, die in den bestehenden Berichten beschrieben sind, sind inkonsistent. Beispielsweise wurde von dem potenten, aber unspezifischen, PKC-Inhibitor Staurosporin berichtet, die Apoptose in HL-60-Zellen sowohl zu antagonisieren (Cotter et al., 1992) als auch zu initiieren (Bertrand et al., 1993); ebenso sind widersprüchliche Berichte über die Wirkung des Inhibitors H7 aufgetaucht (Ojeda et al., 1990; Forbes et al., 1992). Detaillierte Vergleiche von Konzentrations-/Reaktionsbeziehungen verschiedener PKC-Inhibitoren bei der Modulation der Apoptose fehlen im Allgemeinen. Jarvis et al. (1994) zeigen, dass, während die Effekte dieser Wirkstoffe variabel und in hohem Maß von der Konzentration abhängig sind, eine transiente Exposition von HL-60-Zellen gegenüber ausgewählten PKC-Inhibitoren, im Besonderen Chelerythrin, eindeutig eine apoptotische DNA-Fragmentation und den Zelltod in HL-60-Zellen induziert und dass eine akute (d. h. 6 h) Exposition gegenüber Chelerythrin ausreichend ist, um in der humanen myeloischen Leukämie-Zelllinie HL-60 Apoptose zu induzieren. Darüber hinaus erhöht eine in vitro Behandlung bestimmter Zellen mit PKC-Inhibitoren und anderen Serin/Threonin-Kinasen die IR-vermittelte Abtötung mittels undefinierter Mechanismen (Hallahan et al., 1992).
Neueste Forschungen deuten darauf hin, dass Signalisierungsereignisse, die einer Exposition gegenüber Tumornekrosefaktor alpha (TNFα), Fas-Ligand, einer IgM-Vernetzung, einer Bestrahlung und anderen DNA-schädigenden Wirkstoffen folgen, die Apoptose auf dem Weg der Hydrolyse von Membran-Sphingomyelin, die zur Herstellung von Ceramid führt, auslösen (Quintanas et al., 1994; Nagata und Golstein, 1995; Dressler et al., 1992). Die Aktivierung der Proteinkinase C durch Phorbolester oder Wachstumsfaktoren wirkt der Ceramid-induzierten Apoptose entgegen, und indirekte Indizien weisen darauf hin, dass die PKC-Aktivierung die Ceramidproduktion limitieren kann (Fuks et al., 1994; Haimovitz-Friedman et al., 1994a; Haimovitz-Friedman et al., 1994b). Eine mögliche Wirkung von Ceramid und seinem Metaboliten Sphingosin besteht darin, dass die Aktivierung spezifischer PKC-Isoformen verhindert wird (Chmura et al., 1996b; Jones und Murray, 1995; Kolesnick, 1989; Ohta et al., 1994). Zusammen genommen legen diese Studien nahe, dass eine PKC-Aktivierung den Wirkungen der Ceramidproduktion im Apoptotoseweg entgegenwirkt.
Neuste Studien, welche die Mechanismen der strahlungsvermittelten Apoptose untersuchen, zeigen, dass die sofort nach den Röntgenstrahlen folgende Produktion des sekundären Lipid-Botenstoffs Ceramid aus der Hydrolyse von Sphingomyelin zur apoptotischen Reaktion beiträgt (Kolesnick et al., 1994; Haimovitz-Friedman et al., 1994b; Verheij et al., 1996). Zwei Formen der Sphingomyelinase sind mit der Herstellung von Ceramid nach Röntgenstrahlen in Zusammenhang gebracht worden. Die Beteiligung der Mg⁺⁺-abhängigen neutralen Sphingomyelinase wurde zuerst als Quelle der Ceramidherstellung an der Membran nach ionisierender Strahlung in Endothelzellen nahe gelegt (Haimovitz-Friedman et al., 1994). Kürzlich zeigten Santana et al., dass Gewebe und Zellen aus Knockout-Mäusen für eine saure Sphingomyelinase resistenter gegenüber einer ionisierender Strahlung folgenden Apoptose sind (Santana et al., 1996). Diese Studie brachte die saure Sphingomyelinase als ein Bestandteil der apoptotischen Reaktion in einigen Geweben ins Spiel.
Ein großer Teil der Signalwechselwirkung der PKC-Isoformen innerhalb von Tumorzellen muss noch aufgeklärt werden. Es ist klar, dass die PKC-Wege eine Schlüsselrolle in der Kontrolle der Apoptose durch Tumorzellen spielen. Es ist auch offensichtlich, dass diese Wege in strahlungsresistenten Tumorzellen verändert sind, was zu einer erhöhten Erschwernis bei der Behandlung dieser Tumortypen führt. Es gibt ein derzeitiges Bedürfnis, neue und verbesserte Behandlungen zu entwickeln, welche die Resistenz gegenüber Apoptose in strahlungsresistenten Tumoren überwinden.
Die Erfindung stellt die Verwendung von Chelerythrin für die Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung des Wachstums einer Tumorzelle bereit, wobei Chelerythrin auf eine Weise formuliert ist, die seine Verabreichung in Kombination mit ionisierender Strahlung erlaubt.
Um das Wachstum einer Tumorzelle zu inhibieren, wird sie mit Chelerythrin in Berührung gebracht bevor sie mit der ionisierenden Strahlung in Berührung gebracht wird. Alternativ wird die Tumorzelle mit ionisierender Strahlung in Berührung gebracht, bevor sie mit Chelerythrin in Berührung gebracht wird, oder das Chelerythrin und die ionisierende Strahlung werden gleichzeitig mit der Tumorzelle in Berührung gebracht.
Die Erfindung sieht vor, dass die Dosis von Chelerythrin etwa 0,5 mg/kg bis etwa 10 mg/kg ist, und vorzugsweise, dass die Dosis von Chelerythrin etwa 1 mg/kg bis etwa 4 mg/kg ist.
Die Erfindung sieht ferner vor, dass die ionisierende Strahlung aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus γ-Strahlung, Röntgen-Strahlung, Mikrowellenstrahlung und Ultraviolettstrahlung besteht, wobei die Gesamtdosis der ionisierenden Strahlung etwa 1 Gy bis etwa 80 Gy ist, aber die Gesamtdosis der Ionisierung vorzugsweise etwa 70 Gy ist. Die Gesamtdosis der ionisierenden Strahlung wird vorzugsweise in einer Reihe von Einzeldosen verabreicht.
Es wird bevorzugt, dass sowohl das Chelerythrin als auch die ionisierende Strahlung wenigstens zwei Mal mit der Tumorzelle in Berührung gebracht werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Tumorzelle aus der Gruppe ausgewählt, die aus einer Hautkrebszelle, einer Prostatakrebszelle, einer Lungenkrebszelle, einer Hirntumorzelle, einer Brustkrebszelle, einer Eierstockkrebszelle, einer Gebärmutterhalskrebszelle, einer Leberkrebszelle, einer Bauchspeicheldrüsenkrebszelle, einer Dickdarmkrebszelle, einer Magenkrebszelle und einer Leukämiezelle besteht. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Tumorzelle eine humane Tumorzelle.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung ist das Chelerythrin formuliert, wie es im Anspruch 8 spezifiziert ist.
Die Erfindung stellt auch die Verwendung von Chelerythrin für die Herstellung eines Medikaments zur Induktion von Apoptose in einer Tumorzelle bereit, wobei Chelerythrin auf eine Weise formuliert ist, die seine Verabreichung in Kombination mit ionisierender Strahlung erlaubt.
Schließlich ist das Medikament zum Abtöten einer Tumorzelle.
Die Erfindung stellt ferner die Verwendung von Chelerythrin für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs in einem humanen Patienten bereit, wobei Chelerythrin auf eine Weise formuliert ist, die seine Verabreichung in Kombination mit ionisierender Strahlung erlaubt.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird der Krebs aus der Gruppe ausgewählt, die aus Hautkrebs, Prostatakrebs, Lungenkrebs, Hirntumor, Brustkrebs, Eierstockkrebs, Gebärmutterhalskrebs, Leberkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Dickdarmkrebs, Magenkrebs und Leukämie besteht.
Mit anderen Worten potenziert Chelerythrin den Effekt ionisierender Strahlung auf eine Tumorzelle, wenn die Tumorzelle mit Chelerythrin in Berührung gebracht wird und dann die Tumorzelle mit ionisierender Strahlung in Berührung gebracht wird.
Wie hierin definiert, betrifft die Behandlung eines Krebses, eines Tumors, einer Tumorzelle, einer Krebszelle, eines Gewebes, das von einem Tumor abstammt, oder eines kanzerösen Gewebes jegliche Verbesserung im Vergleich mit dem unbehandelten Zustand, was Stabilisierung, Remission, Regression, Schrumpfung oder verringertes Volumen des Krebses, Tumors, Gewebes oder der Zelle beinhaltet, ist aber nicht darauf begrenzt.
Die folgenden Abbildungen sind Teil der vorliegenden Beschreibung und werden eingebunden, um bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung weiter darzulegen. Die Erfindung kann mit Bezug auf eine oder mehrere dieser Abbildungen in Kombination mit der detaillierten Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen, die hierin präsentiert sind, besser verstanden werden.
1: Chemische Struktur von Chelerythrin
2: Chelerythrinchlorid verstärkte die IR-vermittelte Abtötung von Zellen durch Teilungstod. Das clonogenische Überleben wurde nach Exposition gegenüber steigenden Konzentrationen von Chelerythrin und ionisierender Strahlung gemessen. Zellen wurden in Zellzahlen zwischen etwa 500 Zellen/Platte und etwa 2000 Zellen/Platte plattiert und vor der Bestrahlung für 30 Minuten mit 0 μM, 0,5 μM oder 1.0 μM Chelerythrinchlorid behandelt. Nach 2 Wochen wurden die Kolonien als überlebend gewertet, wenn sie aus mehr als 50 Zellen bestanden. Die Resultate stellen die Mittelwerte dreier Einzelexperimente mit Doppel- oder Dreifachbestimmungen dar. Fehlerbalken stellen den +/– Standardfehler der Mittelwerte (SEM) dar.
3A–3E: Propidiumiodidfärbung Chelerythrin-behandelter SQ20-B-Zellen zeigt, dass zVAD-fmk den programmierten Zelltod inhibiert. M1 definiert die % apoptotischer Zellen, wie sie durch (a) die Propidiumiodidaufnahme von 1 log, oder mehr, Fluoreszenz und (b) einer Abnahme der Zellgröße um 50% oder mehr definiert sind. FL3-Höhe gibt die Aufnahme von Propidium durch die Zelle an. In 3A, M1 = 5%; 3B, M1 = 22%; 3C, M1 = 73%; 3D, M1 = 16%; 3E, M1 = 24%.
4: Lebensfähigkeit von SQ20B-Zellen 72 Stunden nach Behandlung mit Bestrahlung und Chelerythrin in vitro.
5A: Aktivität der neutralen und sauren Sphingomyelinase wurde nach einer gleichzeitigen Behandlung mit Chelerythrin und ionisierender Strahlung verstärkt. Für die Sphingomyelinaseaktivität wurde der gemischte Mizellenassay verwendet, um die erhöhte enzymatische Aktivität zu quantifizieren. Im Vergleich zur Kontrolle zeigte Bestrahlung alleine keine erhöhte Sphingomyelinaseaktivierung. Die Behandlung der Zellen mit Chelerythrin erhöhte die Sphingomyelinaseaktivität auf etwa 212% und etwa 179% bezüglich der neutralen bzw. sauren Sphingomyelinase im Vergleich zur Kontrolle. Die kombinierte Behandlung von Zellen mit Röntgenstrahlen und Chelerythrin erhöhte sowohl die neutralen als auch sauren Sphingomyelinaseaktivitäten auf durchschnittlich etwa 200% bzw. etwa 170% der Kontrolle.
5B: Wirkungen von Bestrahlung (20 Gy), von Tumornekrosefaktor alpha (TNFα) und von der Kombination von Bestrahlung (20 Gy) und TNFα (5 ng) auf die Aktivierung der neutralen und sauren Sphingomyelinase im SQ20B-Modell, wie sie mit dem Sphingomyelinase-Assay 5 Minuten nach der Bestrahlung gemessen wurden.
5C: Die Zugabe von Ceramid zu bestrahlten Kulturen verringerte das clonogenische Überleben. Geschlossene Kreise stellen Strahlung alleine dar; geschlossene Rechtecke stellen die Zugabe von 20 μM C2-Ceramid 30 Minuten vor Röntgenbestrahlung dar.
6: Das SQ-20B Xenograftsystem wurde verwendet, um die therapeutische Wirksamkeit der kombinierten Behandlungsweise über 30 Tage hinweg zu bewerten. Vierzig Tiere (n = 40) wurden in jeder Gruppe behandelt, und das %-durchschnittliche Tumorwachstum wurde für alle Tiere bestimmt. Um das Tumorwachstum zu messen, wurden Greifzirkel verwendet. Die Kombination einer nicht-letalen Dosis Chelerythrin (Wirkstoff) mit 50 Gy IR (5 Gy-Einzeldosen über 2 Wochen) verringerte das Tumorvolumen und erhöhte die Zellabtötung im Vergleich zu jeder Behandlung alleine (P < 0,001 Mann-Whitney Rank Summentest).
7A: Die Inhibierung von PKC verursacht eine Erhöhung der Ceramidproduktion durch die Aktivierung einer neutralen Sphingomyelinase und senkt die Sphingomyelinkonzentration. Die Ceramidproduktion wurde unter Verwendung des DAG-Kinase-Assays in WEHI-231 JM-Zellen quantifiziert, und eine Gesamtlipidextraktion wurde verwendet, um die Sphingomyelinmasse zu ermitteln. Nach Zugabe von 10 μM Chelerythrin wurden die Zellen zu geeigneten Zeitpunkten wie hierin beschrieben lysiert. Jeder Messpunkt stellt die von einem Basiswert ausgehende durchschnittliche prozentuale Veränderung in der Ceramid- oder Sphingomyelinherstellung dar, die für alle, mit Ausnahme der mit * markierten, Zeitpunkte aus wenigstens 8 unabhängigen Untersuchungen stammt. Standardabweichungen sind mit Fehlerbalken angegeben. Beim Zeitpunkt ,2 Stunden' war keine Veränderung der Lebensfähigkeit oder Zellgröße zu ermitteln, wie mittels des Propidiumiodid-Ausschlusses und FACS untersucht wurde.
7B: Calphostin C-induzierte Ceramidproduktion und verringerte Sphigomyelinkonzentrationen. Die Ceramidproduktion und Sphingomyelinmasse wurde identisch zu der im Fall von Chelerythrin quantifiziert. Zellen wurden 2 Stunden nach Zugabe von 250 nM Calphostin C lysiert. Die von einem Basiswert ausgehende durchschnittliche prozentuale Veränderung in der Ceramid- und Sphingomyelinherstellung stammt aus wenigstens drei unabhängigen Untersuchungen. Standardabweichungen sind mit Fehlerbalken angegeben.
7C: Graph der Aktivität neutraler und saurer Sphingomyelinase, normalisiert auf Prozent der Kontrolle. Zellen (2 × 10⁷) wurden vor der Messung der Aktivität neutraler und saurer Sphingomyelinase 30 Minuten mit Chelerythrin behandelt. Fehlerbalken stellen den +/– SEM aus 4 einzelnen Untersuchungen mit Doppelbestimmungen dar.
8A–8C: Exogene Ceramid- und PKC-Inhibierung induziert oxidative Veränderungen in WEHI-231-Zellen. WEHI-231-Zellen (1 × 10⁶) wurden 2 Stunden mit anti-IgM-Antikörpern (8A), 15 Minuten mit 30 μM exogenem Ceramid (8B) oder 15 Minuten mit 10 μM Chelerythrin (8C) behandelt. Die reaktive Sauerstoffspezies wurde anschließend unter Verwendung von Dichloridhydrofluorescein (DCHF-DA) gemessen und unter Verwendung einer FACS-Analyse quantifiziert. Die Histogrammanalyse der Fluoreszenz ist als LOG-Funktion aufgetragen. Der graue Bereich stellt die Kontrollzellen dar, während die darüber gelegte linienförmige graphische Darstellung die behandelten Zellen darstellt.
9A: Zeitverlauf der Ceramidproduktion in bestrahlten (8 Gy) WEHI-231 JM(Rauten)- und OE(schwarze Quadrate)-Zellen. Die Daten (mittlere +/– Standardabweichung) stellen wenigstens 4 unabhängige Untersuchungen dar, in denen *p < 0,002 im Vergleich mit unbestrahlten Kontrollen ist.
9B: Graph der in vitro-Aktivität neutraler und saurer Sphingomyelinase, normalisiert auf Prozent der Kontrolle. Die Daten (mittlere +/– SEM) stammen aus 4 unabhängigen Untersuchungen mit 2 oder mehr Bestimmungen, in denen p < 0,04 für die Aktivität neutraler Sphingomyelinase in WEHI-231 JM-Zellen (t-Test nach Student) im Vergleich mit unbestrahlten Kontrollen ist.
10A: WEHI-231 OE-Zellen waren relativ apoptoseresistent im Vergleich mit den JM-Zellen, bleiben jedoch sensitiv gegenüber Ceramid-induzierter Apoptose. Terminale Transferase- und FACS-Analyse von WEHI-231 JM- und OE-Zellen 24 Stunden nach der Behandlung (+/–) mit 10 Gy zu den angezeigten Zeitpunkten. Zellen wurden mittels Flusscytometrie (FACS) auf einem FACScan (Becton-Dickson) unter Verwendung der Lysis II-Sofware analysiert, wobei die FL2- und FSH-Kompensation auf 50% bzw. 25% gesetzt war. Abszisse: Zellanzahl; Ordinate: log der Fluoreszenz der DNA-Fragmentierung. R2 enthält die apoptotischen Zellen, wie sie gegen F15-12-Zellen der Positivkontrolle gewertet wurden, und ist graphisch als geschwungene Linie dargestellt. Der geschätzte Prozentsatz der in R2 eingerahmten apoptotischen Zellen ist gezeigt (%) und beruht auf den ursprünglichen Zellzählungsdaten.
10B: WEHI-231 OE-Zellen proliferieren nach einer Bestrahlung mit 8 Gy weiter. 4–5 × 10⁵ exponentiell wachsende JM- oder OE-Zellen wurden bestrahlt und für Zeitabschnitte zwischen 6 und 72 Stunden zurück in den Inkubator gebracht. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden die Zellen, die das Tryptan-Blau ausscheiden, unter Verwendung eines Hämocytometers gezählt und als lebensfähig gewertet. Die Daten (Mittelwert aus wenigstens 2 Experimenten mit Doppelbestimmungen +/– Standardabweichung) sind als Prozentsatz der ursprünglich gezählten Zellzahl an überlebenden Zellen ausgedrückt.
11A: Exogenes Ceramid kann WEHI-231 OE-Zellen gegenüber strahlungsvermittelter Apoptose sensibilisieren. C2-Ceramid (Cer) wurde zu 3 × 10⁵ WEHI-231 OE-Zellen 30 Minuten vor der Behandlung mit 8 Gy hinzugefügt. Apoptose wurde unter Verwendung von Propidiumiodidfärbung (PI) und FACS-Analyse quantifiziert. Prozent apoptotischer Zellen sind in R2 eingerahmt vierundzwanzig Stunden nach der Bestrahlung gezeigt.
11B: WEHI-231 JM- und OE-Zellen sind gleich sensitiv gegenüber der Inhibierung der Sphingosinkinase und gegenüber exogenem Ceramid. Zellen wurden mit steigenden Konzentrationen von C2-Ceramid oder DL-Threo-dihydrosphingosin – einem potenten Inhibitor der Sphingosinkinase – behandelt. Die Lebensfähigkeit wurde 24 Stunden nach der Behandlung unter Verwendung von PI-Färbung und FACS-Analyse bestimmt. Der Graph zeigt den Mittelwert von 3 Untersuchungen mit Doppelbestimmungen.
12: Lebensfähigkeit resistenter WEHI-231 OE(JM)-, MG(MG)- und WEHI-231-Zellen, die mit bcl-x(bcl-x)-Zellen transfiziert wurden, 30 Minuten nach Exposition gegenüber steigenden Konzentrationen Chelerythrin.
Die vorliegende Erfindung zeigt, dass Chelerythrinchlorid nach einer IR den apoptotischen Schwellenwert in Tumorzellen, besonders in strahlungsresistenten Zellen, herabsetzt. Der Induktion der Apoptose durch die Kombination von Chelerythrin und IR geht die Aktivierung sowohl von neutralen als auch sauren Sphingomyelinasen voraus. Überraschenderweise findet diese Induktion der Apoptose durch die Kombination einer Chelerythrin- und IR-Behandlung bei Dosen statt, die viel niedriger sind als man sie auf Grund konventioneller Technologie und Behandlungen erwarten würde.
Die Kombinationsbehandlung von Tumorzellen mit IR und Chelerythrin erhöht die Apoptose und ist von einer Aktivierung der Kaspasen abhängig. Diese Daten sind mit neuesten Berichten konsistent, die zeigen, dass IR und Ceramid Apoptose durch die Aktivierung von CPP32 und anderen Kaspasen induzieren (Kufe, 1996). Chelerythrinchlorid verstärkt die durch ionisierende Strahlung induzierte Apoptose, indem es auf die üblichen Komponenten des Zelltodregulationswegs abzielt, die für die Apoptose benötigt werden, und überwindet das Unvermögen der Zellen, in vitro und in vivo in die durch Strahlung induzierte Apoptose einzugehen.
Der beobachtete mit der Teilung und Mitose verbundene Tod nach IR bei geringen Chelerythrinkonzentrationen trägt zur Reduktion des Tumorvolumens in vivo bei. Das Ansteigen der mitotischen Todesrate nach einer kombinierten Strahlungs- und Chelerythrinbehandlung stellt einen nicht-apoptotischen und daher nicht-überlappenden Mechanismus der Tumorzellabtötung dar. Die vorliegende Erfindung zeigt ein Ansteigen der Tumorzellzerstörung im Vergleich zum umgebenden normalen Gewebe und weist darauf hin, dass Chelerythrin in Verbindung mit IR ein klinisch nützliches Werkzeug darstellt, um die letalen Effekte ionisierender Strahlung in Populationen resistenter Tumorzellen zu verstärken.
A. Kombination geringer Dosen von Chelerytrin und Bestrahlung
Die Resistenz von Tumorzellen gegenüber DNA-schädigenden Wirkstoffen stellt ein Hauptproblem in der klinischen Onkologie dar. Das Ziel der gegenwärtigen Krebsforschung besteht darin, Wege zu finden, die Wirksamkeit von Chemo- und Strahlungstherapie zu verbessern. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird in Erwägung gezogen, dass die Kombination einer Chemotherapie mit einem PKC-Inhibitor, vorzugsweise Chelerythrin oder Chelerythrinchlorid, mit einer Strahlungstherapie für einen therapeutischen Eingriff verwendet werden kann. Ein überraschendes und unerwartetes Ergebnis der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die Kombination von Chelerythrin und Strahlung die Verwendung geringerer Dosen jeder einzelnen Komponente erlaubt, um einen höheren Grad der Reduktion des Tumorwachstums zu erreichen als auf Grund gegenwärtiger konventioneller Strahlungs- und Chemotherapien vorauszusagen gewesen wäre. Daher können toxische und andere ungünstige Wirkungen, die Strahlung auf gesunde Zellen, welche der Strahlung während der Behandlung ausgesetzt sein müssen, besitzt, durch die Verwendung einer solchen Kombination vermindert werden.
Hierin wird unter Behandlung mit Chelerythrin vorzugsweise die Behandlung mit Chelerythrinchlorid verstanden.
Um Zellen, wie bösartige oder metastatische Zellen, zu inhibieren oder sogar abzutöten, würde man im Allgemeinen eine „Zielzelle" mit einem PKC-Inhibitor, wie Chelerythrin, und mit einer niedrig dosierten ionisierenden Strahlung in Kontakt bringen. Diese Komponenten würden in einer kombinierten Menge bereitgestellt werden, die wirksam ist, um die Proliferation zu inhibieren oder die apoptotische Funktion wiederherzustellen oder sogar die Zelle abzutöten. Dieses Verfahren kann das gleichzeitige In-Kontakt-Bringen der Zellen mit Chelerythrin und Bestrahlung beinhalten; oder mit Chelerythrin und dann Bestrahlung; oder mit Bestrahlung und dann Chelerythrin. Die Zellen können mit einer einzigen Zusammensetzung oder pharmakologischen Formulierung von Chelerythrin oder mit zwei oder mehr unterschiedlichen Zusammensetzungen oder Formulierungen von Chelerythrin in Kontakt gebracht werden.
Bestrahlungsquellen beinhalten Wellen, die DNA-Schäden induzieren, wie γ-Strahlung, Röntgenstrahlung, UV-Strahlung, Mikrowellen, elektronische Emissionen und Ähnliches. Bei der Behandlung von Krebs mit dem Medikament gemäß der Erfindung würde man die Tumorzellen mit Strahlung mittels der Bestrahlung der lokalisierten Tumorstelle mit DNA-schädigender Strahlung, wie Röntgenstrahlung, UV-Licht, γ-Strahlen oder sogar Mikrowellen, in Kontakt bringen.
Es ist vorgesehen, dass die lokale Zufuhr von Chelerythrin bei Krebspatienten ein sehr wirksames Verfahren für die Zufuhr einer therapeutisch wirksamen Menge der Verbindung, die der klinischen Krankheit entgegenwirken soll, sein wird. In ähnlicher Weise wird die Strahlungstherapie auf eine besondere, betroffene Region des Körpers des Patienten gerichtet. Alternativ ist eine systemische Zufuhr von entweder Chelerythrin oder Bestrahlung, oder beidem, unter bestimmten Umständen geeignet, zum Beispiel, wo eine ausgedehnte Metastasierung stattgefunden hat.
B. Chelerytrin, ein Benzophenanthridinalkaloid
Das Benzophenanthridinalkaloid Chelerythrin (1,2-Dimethoxy-12-methyl[1,3]benzodioxol[5,6-c]phenanthridinium; C₂₁H₁₈NO₄), auch bekannt als Toddalin, ist entweder in reiner Form oder als Gemisch mit anderen Benzophenanthridinalkaloiden aus Chelidonium majus L., Zanthoxylum simulans, Sanguinaria canadensis (oder kanadisches Blutkraut), Macleaya cordata, Carydali sevctocozii, Carydali ledebouni, Chelidonium majus M. und anderen Mitgliedern der Papaveracaceae zu extrahieren. Das Hauptalkaloid in Zanthoxylum simulans ist Chelerythrin mit geringeren Mengen an Dihydro- und Oxychelerythrin, N-Acetylanomin, Skimmianin, Fagarin, Sitosterol und Sesamin. Gray et al., (1980) beschreiben die Extraktion und Identifizierung von Chelerythrin und anderen Bestandteilen aus Zanthoxylum simulans.
Andere Benzo-c-phenanthridinalkaloide, die in den Pflanzen mit Chelerythrin vorhanden sein können, beinhalten unter anderem Sanguinarin, Sanguirubin, Sanguilutin, Homochelidonen, Chelirubin und Protopin. Reines Chelerythrin ist ebenfalls, obwohl selten, von einigen Zulieferern für Chemikalien erhältlich. Teilaufgereinigte Formen von Benzo-c-phenanthridinalkaloiden sind kommerziell erhältlich, und diese sind im Allgemeinen als Sanguinarinnitrat und Sanguinarinsulfat bezeichnet. Diese Salze sind die Salze der gemischten Alkaloide der Pflanze Sanguinaria und umfassen hauptsächlich Sanguinarin, Chelerythrin und Protopin.
Während in der Literatur nur wenige Hinweise auf die Verwendung irgendeines der reinen Benzo-c-phenanthridinalkaloide gefunden werden können, werden Pflanzen, die solche Verbindungen enthalten, seit einiger Zeit zu medizinischen Zwecken bei einer großen Vielzahl von Beschwerden verwendet. Zum Beispiel offenbart das US-Patent 209,331 die Verwendung von Blutkraut, Zinkchlorid und Paraffinöl in gleichen Anteilen für die Behandlung offener Wunden. US-Patent 433,257 beschreibt eine Salbe aus pulverisiertem Blutkraut, armenischem Holz (armenian bole), pulverisiertem Harz, Schweinefett und Stockholmer Teer (Stockholm tar) für die Verwendung in der Behandlung von Hämorrhoiden, und US-Patent 2,344,830 offenbart die Verwendung eines Gemisches aus Zinkchlorid, Stibnit (Antimonglanz) und Blutkraut, um abgestorbenes Gewebe für seine operative Entfernung zu fixieren und abzugrenzen. Einige der Patente, welche die Verwendung von Sanguinaria-Extrakten als antimikrobielle Wirkstoffe beschreiben sind das US-Patent 4,145,412, das US-Patent 4,406,881 und das US-Patent 4,376,115. Chelerythrin wird auch für die Behandlung peridontaler Erkrankungen, US-Patent 5,324,520, und in der Thrombosebehandlung, US-Patent 5,137,912 verwendet. Von Benzo-c-phenanthridinalkaloiden wurde auch gezeigt, dass sie einige gegen Pilze und Protozoen gerichtete Eigenschaften besitzen und dass sie die nach einer akuten Krankheit verbleibende leichte Anämie und die mit einer rheumatoiden Arthritis assoziierte Anämie lindern.
In China verwenden die Menschen die Beeren von Zanthoxylum simulans, um Schweinefleisch zu würzen. Die lange und weit verbreitete Verwendung dieses Extrakts in China zeigt, dass der Extrakt für den menschlichen Genuss sicher ist. Der Extrakt besitzt keine bemerkenswerten Nebenwirkungen und bewirkt keine Irritation des Gastrointestinaltrakts. Vielmehr wurde herausgefunden, dass der Extrakt hilft, gastrointestinale Irritationen zu mildern, die wegen der Verwendung der anti-inflammatorischen Wirkstoffe auftreten können, wenn diese gemeinsam verabreicht werden.
Chelerythrin inhibiert spezifisch die Proteinkinase C (PKC) in einer konzentrationsabhängigen Weise und inhibiert stark die durch starke Aggregationsauslöser, wie Arachidonsäure und Kollagen, hervorgerufene Plättchenaggregation. Seine chemische Struktur ist in 1 gezeigt.
Inhibitoren der PKC können mit der Substratbindestelle (ATP oder Protein) oder mit der regulatorischen Domäne, an der die Aktivierung erfolgt (Diacylglycerin- oder Phorbolesterbindestelle), interagieren. Chelerythrin interagiert direkt mit der katalytischen Domäne der PKC. Es ist einer der potentesten bislang identifizierten Inhibitoren der PKC und inhibiert keine andere der bislang untersuchten Proteinkinasen. Chelerythrin zeigt starke cytotoxische Effekte gegenüber L-1210 Tumorzellen mit einem IC₅₀-Wert von 0,053 μM durch die Inhibierung des Zellwachstums und der Differenzierung (Herbert et al., 1990).
Chelerythrin weist zweiphasische Konzentrationsreaktionsbeziehungen auf, so dass die DNA-Fragmentierung nachlässt und letzten Endes absinkt, wenn die Wirkstoffkonzentrationen bis über die maximal wirksamen Konzentrationen hinaus angehoben werden (Jarvis et al., 1994). Eine Reduktion des DNA-Schadens ist allerdings nicht mit einer Wiederherstellung der zellulären Lebensfähigkeit assoziiert, was darauf hinweist, dass andere letale Ereignisse unvermindert voranschreiten.
Unter den von Herbert et al. (1990) beschriebenen Bedingungen ist der IC₅₀-Wert (Konzentration, die eine 50%-ige Inhibierung verursacht) für Chelerythrin 0,66 μM in Ratten. Die Basalaktivität des Enzyms (die Aktivität in Abwesenheit von Ca⁺⁺, Phosphatidylserin und Diolein) war nicht beeinträchtigt. In der vorliegenden Erfindung war die LD₅₀ (Dosis, die eine 50%-ige Mortalität verursacht) 20 mg/kg intraperitoneal (IP) in Mäusen.
Eine wirksame Dosis von Chelerythrin ist sehr von dem verwendeten Weg der Verabreichung und der Größe und Art des behandelten Tieres abhängig. Im Allgemeinen können bei jedem Individuum die oral zugeführten Dosen höher sein als die injizierten Dosen. Wie hierin definiert ist, besteht eine wirksame Dosis in einer Dosis, die in einer behandelten Zelle Apoptose induzieren kann. Besonders wünschenswerte Zellen, die behandelt werden sollen, beinhalten Tumor- und Krebszellen und insbesondere strahlungsresistente Tumor- oder Krebszellen. Beispielsweise entspricht ein wirksamer Dosisbereich etwa 0,5–10 mg/kg (IP) in einer Maus und bevorzugterweise 1–4 mg/kg (IP) in einer Maus.
C. Ionisierende Strahlung
Ionisierende Strahlung verursacht DNA-Schäden und Zellabtötung im Allgemeinen proportional zur Dosisrate. Es wird postuliert, dass ionisierende Strahlung multiple biologische Effekte durch die direkte Interaktion mit DNA oder durch die Bildung freier Radikalspezies, die zu DNA-Schäden führen, induziert (Hall et al., 1988). Diese Effekte beinhalten Genmutationen, maligne Transformationen und Zellabtötung. Obwohl von ionisierender Strahlung gezeigt wurde, dass sie in einigen prokaryotischen und niederen eukaryotischen Zellen die Expression bestimmter DNA-Reparaturgene induziert, ist wenig über die Effekte ionisierender Strahlung auf die Regulation der Genexpression von Säugetieren bekannt (Borek, 1985). Mehrere Untersuchungen haben Änderungen des Musters der Proteinsynthese beschrieben, die nach Bestrahlung von Säugertierzellen beobachtet wurden. Zum Beispiel ist die Behandlung von humanen malignen Melanomzellen mit ionisierender Strahlung mit der Induktion mehrerer nicht identifizierter Proteine assoziiert (Boothman et al., 1989). Die Synthese von Zyklin und koregulierten Polypeptiden wird in REF52-Zellen der Ratte durch ionisierende Strahlung supprimiert, jedoch nicht in Onkogen-transformierten REF52-Zelllinien (Lambert und Borek, 1988). Andere Untersuchungen haben gezeigt, dass bestimmte Wachstumsfaktoren oder Zytokine bei der durch Röntgenstrahlen induzierten DNA-Schädigung involviert sein können. Diesbezüglich wird der Thrombozytenwachstumsfaktor (platelet-derived growth factor) aus Endothelzellen nach Bestrahlung abgegeben (Witte et al., 1989).
In der vorliegenden Erfindung bedeutet „ionisierende Strahlung" eine Strahlung, die Partikel oder Photonen umfasst, die eine ausreichende Energie besitzen oder mittels nukleärer Interaktionen eine ausreichende Energie produzieren können, um eine Ionisierung (Gewinn oder Verlust von Elektronen) hervorzurufen. Eine beispielhafte und bevorzugte ionisierende Strahlung ist Röntgenstrahlung. Vorrichtungen für die Zufuhr von Röntgenstrahlung an das Zielgewebe oder die Zielzelle sind dem Fachmann gut bekannt. Ebenso bedeutet der Ausdruck „wirksame expressionsinduzierende Dosis ionisierender Strahlung" die Dosis ionisierender Strahlung, die benötigt wird, um einen „strahlungsreaktiven Enhancer-Promotor" zu stimulieren oder einzuschalten, der eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt.
1. Strahlungsreaktive Enhancer-Promotoren
Ein strahlungsreaktiver Enhancer-Promotor (wie in US-Patent 5,571,797 beschrieben) ist ein Promotor, dessen transkriptionskontrollierende Funktion durch ionisierende Strahlung beeinflusst wird. Die Enhancer-Promotor-Region wird als ein Schalter verwendet, um selektiv die Expression eines Polypeptids zu beeinflussen, das von dieser Sequenz kodiert wird. Die Regulation einer spezifischen Polypeptidexpression in einer bestimmten Zielzelle oder einem Zielgewebe veschafft Möglichkeiten, diese Zelle oder dieses Gewebe therapeutisch zu zerstören, zu verändern oder zu inaktivieren.
Ein Promotor ist eine Region eines DNA-Moleküls, die typischerweise innerhalb von etwa 100 Nukleotidpaaren vor (stromaufwärts) dem Punkt liegt, an dem die Transkription beginnt (d. h. einer Transkriptionsstartstelle). Diese Region enthält üblicherweise mehrere Arten von DNA-Sequenzelementen, die in ähnlichen relativen Positionen in unterschiedlichen Genen liegen. Wie hierin verwendet, beinhaltet der Ausdruck „Promotor" das, was in Fachkreisen als eine stromaufwärtsgelegene Promotorregion, eine Promotorregion oder ein Promotor einer allgemeinen eukaryotischen RNA-Polymerase II-Transkriptionseinheit bezeichnet wird. Beispielhafte und bevorzugte Promotoren sind die TATA-Box, die CAAT-Box und GC-reiche Sequenzelemente.
Ein weiterer Typ eines diskreten transkriptionsregulatorischen Sequenzelements ist ein Enhancer. Ein Enhancer sorgt für eine zeitspezifische, ortsspezifische und mengenspezifische Expression einer bestimmten kodierenden Region (z. B. eines Gens). Eine Hauptfunktion eines Enhancers besteht darin, die Stärke der Transkription einer kodierenden Region in einer Zelle zu erhöhen, die einen oder mehrere Transkriptionsfaktor(en) enthält, der (die) an diesen Enhancer bindet(n). Anders als ein Promotor kann ein Enhancer funktionieren, wenn er in verschiedenen Abständen von Transkriptionsstartstellen positioniert ist, solange ein Promotor vorhanden ist.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck „Enhancer-Promotor" eine zusammengesetzte Einheit, die sowohl Enhancer- als auch Promotorelemente enthält. Wie hierin verwendet, bezeichnet ein „strahlungsreaktiver Enhancer-Promotor" einen Enhancer-Promotor, dessen transkriptionskontrollierende Funktion durch ionisierende Strahlung beeinflusst wird. Üblicherweise stimuliert oder erhöht ein strahlungsreaktiver Enhancer-Promotor in Folge einer Exposition gegenüber einer wirksamen Dosis ionisierender Strahlung die Transkriptionsrate einer kodierenden Region, die durch diesen Enhancer-Promotor kontrolliert wird. Ein beispielhafter und bevorzugter Enhancer-Promotor für die Verwendung in einem DNA-Molekül gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine CarG-Domäne eines Egr-1-Promotors, ein Promotor für Tumornekrosefaktor alpha(TNFα)-Gen oder ein c-Jun-Promotor.
Ein strahlungsreaktiver Enhancer-Promotor ist operativ mit einer kodierenden Region verbunden, die für wenigstens ein Polypeptid kodiert. Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck „operativ verbunden", dass ein Enhancer-Promotor so mit einer kodierenden Region verknüpft ist, dass die Trankription dieser kodierenden Region durch diesen Enhancer-Promotor kontrolliert und reguliert wird. Mittel und Wege für die operative Verbindung eines Enhancer-Promotors mit einer kodierenden Region sind dem Fachmann gut bekannt. Ebenso ist dem Fachmann gut bekannt, dass die genaue Orientierung und Positionierung relativ zu einer kodierenden Region, deren Transkription kontrolliert wird, unter anderem von der spezifischen Natur des Enhancer-Promotors abhängig ist. Daher wird ein TATA-Box-Minimalpromotor üblicherweise etwa 25 bis etwa 30 Basenpaare stromaufwärts einer Transkriptionsinitiationsstelle positioniert sein, und ein stromaufwärtsgelegenes Promotorelement wird üblicherweise etwa 100 bis etwa 200 Basenpaare stromaufwärts einer Transkriptionsinitiationsstelle positioniert sein. Im Unterschied dazu kann ein Enhancer stromabwärts der Initiationsstelle positioniert sein und in einem bemerkenswerten Abstand zu dieser Stelle liegen.
2. Dosierung und Zufuhr ionisierender Strahlung
Die Menge ionisierender Strahlung, die für eine bestimmte Zelle benötigt wird, hängt im Allgemeinen von der Natur dieser Zelle ab. Üblicherweise entspricht eine wirksame expressionsinduzierende Dosis weniger als einer Dosis ionisierender Strahlung, die direkt Zellschäden oder den Tod verursacht. Mittel, mit denen eine wirksame Menge an Strahlung bestimmt werden kann, sind dem Fachmann gut bekannt. Die Menge ionisierender Strahlung, die für eine bestimmte Zelle benötigt wird, hängt natürlich von der Natur dieser Zelle ab. Wie auch hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck „wirksame Dosis" ionisierender Strahlung eine Dosis ionisierender Strahlung, die eine Erhöhung des Zellschadens oder Todes bewirkt, wenn sie in Verbindung mit einem Virus verabreicht wird.
In bestimmten Ausführungsformen ist eine wirksame expressionsinduzierende Menge etwa 1 bis etwa 30 Gray (Gy), die mit einer Rate von etwa 0,5 bis etwa 4 Gy/Minute verabreicht wird. Sogar noch bevorzugter ist eine wirksame expressionsinduzierende Menge ionisierender Strahlung von etwa 1 Gy bis etwa 80 Gy (Gasamtdosis). In anderen Ausführungsformen werden Dosen von etwa 1–9 Gy in Einzeldosen verwendet. Eine wirksame Dosis ionisierender Strahlung ist etwa 4,5 Gy bis etwa 100 Gy, mit einer bevorzugten Gesamtdosis von etwa 70 Gy (entweder einzeln oder bevorzugter in mehreren Aliquot-Dosen). Diese Dosisbereiche liegen deutlich unter den Dosen, die in einer herkömmlichen Strahlentherapie verwendet werden und verringern dadurch die schädlichen Nebenwirkungen, die mit höheren Strahlungsdosen assoziiert sind.
Zusätzlich zu externen Geräten kann jedes geeignete Gerät für die Zufuhr der Strahlung an ein Gewebe angewendet werden. Zum Beispiel kann die Strahlung zugeführt werden, indem zuerst ein strahlenmarkierter Antikörper bereitgestellt wird, der mit einem Antigen des Tumors immunreagiert, gefolgt von der Zufuhr einer wirksamen Menge des strahlenmarkierten Antikörpers an den Tumor. Darüber hinaus können Radioisotope verwendet werden, um einem Gewebe oder einer Zelle ionisierende Strahlung zuzuführen.
Tumore, die behandelt werden können, beinhalten Tumore des Gehirns (Glioblastome, Medulloblastome, Astrocytome, Oligodendrogliome, Ependymome), der Lunge, der Leber, der Milz, der Niere, der Lymphknoten, des Dünndarms, der Bauchspeicheldrüse, der Blutzellen, des Dickdarms, des Magens, der Brust, des Endometriums, der Prostata, des Hodens, des Eierstocks, der Haut, des Kopfes und Halses, des Ösophagus, des Knochenmarks, des Blutes oder anderer Gewebe, sind aber nicht darauf beschränkt. Der Tumor kann in matastatisch und nicht-metastatisch unterschieden werden. Zahlreiche Ausführungsformen beinhalten Tumorzellen aus der Haut, dem Muskel, der Faszie, des Gehirns, der Prostata, der Brust, des Endometriums, der Lunge, des Kopfes & Halses, der Bauchspeicheldrüse, des Dünndarms, der Blutzellen, der Leber, der Hoden, der Eierstöcke, des Dickdarms, der Haut, des Magens, des Ösophagus, der Milz, der Lymphknoten, des Knochenmarks oder der Niere. Andere Ausführungsformen beinhalten flüssige Proben wie peripheres Blut, Lymphflüssigkeit, Aszites, seröse Flüssigkeit, Pleuraexsudat, Sputum, Zerebrospinalflüssigkeit, Tränenflüssigkeit, Stuhl oder Urin.
D. Therapieschemata
Die Behandlung mit Chelerythrin kann einer Bestrahlung in Zeitintervallen, die von Sekunden bis Wochen reichen, vorausgehen oder ihr folgen. In Ausführungsformen, in denen Chelerythrin und Bestrahlung der Zelle getrennt verabreicht werden, wird man im Allgemeinen sicherstellen, dass keine signifikante Zeitspanne zwischen den einzelnen Zeitpunkten der Zufuhr vergangen ist, so dass die Kombination der zwei immer noch einen vorteilhaften Kombinationseffekt auf die Zelle ausüben kann. In solchen Fällen wird erwogen, die Zelle mit beiden Wirkstoffen innerhalb von etwa 0,1 bis 24 Stunden, bevorzugter, innerhalb von etwa 1 bis 4 Stunden, miteinander in Kontakt zu bringen, wobei eine zeitliche Verzögerung von nur etwa 1 Stunde bis etwa 2 Stunden am meisten bevorzugt wird. In einigen Situationen ist es allerdings wünschenswert, die Zeitspanne für die Behandlung beträchtlich zu erweitern, wobei mehrere Tage (2, 3, 4, 5, 6 oder 7) bis zu mehreren Wochen (1, 2, 3,4, 5, 6, 7 oder 8) zwischen den entsprechenden Verabreichungen vergehen.
Es ist auch vorstellbar, dass mehr als eine Verabreichung von entweder Chelerythrin oder Bestrahlung erwünscht wird. Viele verschiedene Kombinationen können angewendet werden, wobei Chelerythrin „A" und Bestrahlung „B" ist:
Um eine Zellabtötung zu erreichen, werden beide Wirkstoffe einer Zelle in einer kombinierten Menge zugeführt, die wirksam ist, die Zelle zu töten.
Die Dosisbereiche für Röntgenstrahlen reichen von täglichen Dosen von 50 bis 200 cGy über längere Zeiträume (6 bis 8 Wochen) bis hin zu Einzeldosen von 2000 bis 6000 cGy. Die Dosisbereiche für Radioisotope variieren stark und hängen von der Halbwertszeit der Isotope, der Stärke und Art der emittierten Strahlung und der Aufnahme durch die neoplastischen Zellen ab.
E. Behandlungswege
Chelerythrin kann intravenös, intraarteriell, intratumoral, parenteral oder intraperitoneal verabreicht werden. Bevorzugte Verabreichungswege sind direkt intratumoral, Injektion in einen resezierten Tumorherd, intravenös (IV), intraarteriell und intraperitoneal (IP). Lösungen der aktiven Verbindungen als freie Base oder pharmakologisch verträgliche Salze können in Wasser, gemischt mit einem oberflächenaktiven Stoff wie Hydroxypropylzellulose, zubereitet werden. Ebenso können Dispersionen in Glyzerin, flüssigen Polyethylenglykolen und Gemischen davon sowie in Ölen zubereitet werden. Unter üblichen Lagerungs- und Verwendungsbedingungen beinhalten diese Zubereitungen ein Konservierungsmittel, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
Die pharmazeutischen Formulierungen, die für eine Verwendung als Injektion geeignet sind, beinhalten sterile Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver für die spontane Zubereitung steriler injizierbarer Lösungen oder Dispersionen. In allen Fällen muss die Formulierung steril und zu einem Ausmaß flüssig sein, dass eine leichte Verwendbarkeit in Spritzen vorliegt. Sie müssen unter den Herstellungs- und Lagerbedingungen stabil sein und vor der Kontaminationswirkung von Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilzen, geschützt sein. Der Träger kann ein Lösungs- oder Dispersionsmittel, enthaltend zum Beispiel Wasser, Ethanol, Polyol (zum Beispiel Glyzerin, Propylenglykol und flüssiges Polyethylenglykol und Ähnliches), geeignete Gemische davon und Pflanzenöle sein. Die passende Fluidität kann zum Beispiel durch die Verwendung einer Ummantelung wie mit Lecithin, durch die Aufrechterhaltung der erforderlichen Partikelgröße im Fall der Dispersion und durch die Verwendung oberflächenaktiver Substanzen aufrechterhalten werden. Der Schutz vor der Wirkung von Mikroorganismen kann durch eine Vielzahl antibakterieller und antimykotischer Wirkstoffe, zum Beispiel Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal und Ähnliches, bewirkt werden. In vielen Fällen wird man bevorzugen, isotonische Wirkstoffe, zum Beispiel Zucker oder Natriumchlorid, einzubeziehen. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch die Verwendung von Wirkstoffen in den Zusammensetzungen bewirkt werden, welche die Absorption verzögern, zum Beispiel Aluminiummonostearat und Gelatine.
Sterile injizierbare Lösungen können durch das Einbringen der aktiven Verbindungen in das geeignete Lösungsmittel in der benötigten Menge zusammen mit einer Vielzahl der oben aufgezählten anderen Ingredienzien, wie sie benötigt werden, zubereitet werden, gefolgt von einer Sterilfiltration. Im Allgemeinen werden Dispersionen zubereitet, indem die Vielzahl sterilisierter aktiver Ingredienzien in ein steriles Vehikel eingebracht werden, welches das grundlegende Dispersionsmittel enthält, und die benötigten anderen Ingredienzien, von denjenigen, die oben aufgezählt sind. Im Fall eines sterilen Pulvers für die Zubereitung steriler Injektionslösungen, sind die bevorzugten Verfahren der Zubereitung die Vakuum- und Gefriertrocknungstechniken, die ein Pulver der aktiven Ingredienzien plus jeder beliebigen erwünschten Ingredienz, aus einer zuvor sterilfiltrierten Lösung daraus, ergeben.
Wie hierin verwendet, beinhaltet ein „pharmazeutisch verträglicher Träger" jedes beliebige Lösungsmittel Dispersionsmittel, Ummantelungen, antibakterielle und antimykotische Wirkstoffe, isotonische und absorptionsverzögernde Wirkstoffe und Ähnliches. Die Verwendung solcher Mittel und Wirkstoffe für die pharmazeutisch wirksamen Substanzen sind dem Fachmann gut bekannt. Insofern wird ihre Verwendung in therapeutischen Verbindungen in Erwägung gezogen, es sei denn, dass ein konventionelles Mittel oder konventioneller Wirkstoff mit der wirksamen Ingredienz unverträglich ist. Zusätzliche wirksame Ingredienzien können ebenfalls in die Zusammensetzungen eingebracht werden.
Chelerythrin kann auch oral verabreicht werden, zum Beispiel mit einem reaktionsträgen Verdünnungsmittel oder mit einem assimilierbaren essbaren Träger, oder in hart- oder weichwandigen Gelatinekapseln verpackt werden, oder in Tabletten gepresst werden, oder direkt in die Nahrung der Diät eingebracht werden. Für eine orale therapeutische Verabreichungsform kann die wirksame Verbindung in Arzneimittelträger eingebracht werden und in der Form verdaubarer Tabletten, bukkaler Tabletten, Pastillen, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirups, Oblaten und Ähnlichem verwendet werden. Solche Zusammensetzungen und Zubereitungen sollten wenigstens 0,1% der wirksamen Verbindung enthalten. Der prozentuale Anteil der Zusammensetzungen und Zubereitungen kann natürlich variiert werden und kann in geeigneter Weise zwischen etwa 2 bis etwa 60% des Gewichts der Einheit liegen. Die Menge der wirksamen Verbindungen in solchen therapeutisch nützlichen Zusammensetzungen ist so, dass eine geeignete Dosierung erreicht wird.
Die Tabletten, Pastillen, Pillen, Kapseln und Ähnliches können auch das Folgende beinhalten: ein Bindemittel wie Gummi-Tragant, Gummi arabicum, Maisstärke oder Gelatine; Arzneimittelträger wie Dicalziumphosphat; einen sich auflösenden Wirkstoff wie Maisstärke, Kartoffelstärke, Alginsäure oder Ähnliches; ein Gleitmittel wie Magnesiumstearat; und ein Süßungsmittel wie Sukrose, Laktose oder Saccharin kann hinzugefügt werden oder ein Geschmacksstoff wie Pfefferminze, das Öl des amerikanischen Immergrüns oder Kirschgeschmack. Wenn die Dosierungseinheit eine Kapsel ist, kann sie, zusätzlich zu den Materialien vom oben genannten Typ, einen flüssigen Träger enthalten. Zahlreiche andere Materialien können als Ummantelungen vorliegen oder um anderweitig die physikalische Form der Dosierungseinheit zu modifizieren. Beispielsweise können Tabletten, Pillen oder Kapseln mit Schelllack, Zucker oder beidem ummantelt sein. Ein Sirup oder Elixier können die wirksamen Verbindungen, Sukrose als ein Süßungsmittel, Methyl- oder Propylparabene als Konservierungsstoffe, einen Farbstoff oder Geschmacksstoffe wie Kirsch- oder Orangengeschmack enthalten. Natürlich sollte jedes Material, das für die Zubereitung einer beliebigen Dosierungseinheit verwendet wird, pharmazeutisch rein und in den eingesetzten Mengen im Wesentlichen ungiftig sein. Zusätzlich können die wirksamen Verbindungen in langzeitwirkende Zubereitungen und Formulierungen eingebracht werden.
F. Überprüfung und Überwachung der Therapieeffektivität
Es wird in Erwägung gezogen, dass im Kontext der vorliegenden Erfindung aus einem Individuum Zellen, entweder Tumor- oder normale Zellen oder sowohl Tumor als auch normale Zellen, entfernt werden, um entweder den Fortschritt der Behandlung zu kontrollieren oder als Teil der Behandlung selbst. Es wird erwartet, dass man die Wirksamkeit der Behandlung durch die Entfernung solcher Zellen und die Behandlung solcher Zellen mit DAPI-Färbung überwachen kann, um das Ausmaß der Chromatinkondensation zu bestimmen, das Ausmaß der Apoptose zu messen, die Stärke der Produktion der neutralen Sphingomyelinase zu messen, oder durch andere Methoden so wie die Folgenden.
Eine besondere Methode zur Bestimmung der Induktion der Apoptose besteht in Desoxynukleotidyltransferase-vermittelten dUTP-Biotin Nick Endmarkierung (TUNEL) Assays, welche die Integrität der DNA messen (Gorczyca, 1993). Dieser Assay misst die Fragmentation der DNA mittels der Bestimmung der Inkorporation von markiertem UTP in gebrochene DNA-Stränge durch das Enzym terminale Transferase. Die Inkorporation kann durch elektroskopische oder durch Zellsortierungsmethoden (z. B. FACS) überwacht werden.
G. Ex vivo Zufuhr
Im Kontext der vorliegenden Erfindung wird in Erwägung gezogen, dass eine systemische Zufuhr von entweder Chelerythrin oder Bestrahlung oder beidem verwendet werden kann. Weiterhin wird in Erwägung gezogen, dass man wünschen wird, betroffene Zellen durch gesunde Zellen des selben Patienten zu ersetzen. Eine ex vivo Gentherapie betrifft die Isolierung von Zellen aus einem Tier oder Patienten, die Zufuhr einer Nukleinsäure in die Zellen in vitro und die anschließende Rückführung der modifizierten Zellen in ein Tier oder ein Individuum. Dies kann die chirurgische Entfernung von Gewebe/Organen aus einem Tier oder Patienten oder die primäre Kultur von Zellen und Geweben beinhalten.
Im Besonderen wird die autologe Knochenmarkszell-(BMC)-Transplantation als ein Heilungsverfahren verwendet, in welchem Blut oder Knochenmark entnommen und vor einer Intensivierung der Strahlung oder Chemotherapie gelagert werden. Bei der Präparation humaner mononukleärer Zellen (MNC) wird ein Aliquot des Kochenmarks in einen Aufnahmebehälter, beispielsweise ein Zentrifugenröhrchen, gelegt. Zunächst können MNC aus einer Quelle für Knochenmark, z. B. den Schienbeinknochen, den Oberschenkelknochen, der Wirbelsäule, den Rippen, den Hüften, dem Brustbein sowie den Oberarmknochen, den Radien, den Ellenknochen, den Schienbeinknochen und den Wadenbeinknochen gewonnen werden. Zusätzlich können diese Zellen auch aus Nabelschnurblut, peripherem Blut oder Zytokin-mobilisiertem peripheren Blut gewonnen werden. Andere Quellen humaner hämatopoetischer Stammzellen beinhalten den embryonalen Dottersack, die fötale Leber, die fötale und erwachsene Milz und das Blut. Die Knochenmarksschicht wird zentrifugiert, so dass am Boden des Röhrchens ein Pellet roter Zellen, eine klare Schicht von Medium, eine Interphasenschicht, welche die MNC enthält, und ganz oben eine Schicht von Plasmamedium erzeugt wird. Die Interphasenschicht kann anschließend zum Beispiel durch Absaugung entfernt werden. Eine Zentrifugation dieser Schicht bei 1000 g führt schließlich zu einem MNC-Pellet. Dieses Pellet kann anschließend in einem geeigneten Puffer für die Zellsortierung durch FACS resuspendiert werden. Die isolierten MNC werden in vitro geklont, um die immunologisch aktiven Zellen zu vermehren. Die vermehrten, therapeutisch wirksamen Zellen werden dann für den Patienten bereitgestellt, um einen therapeutischen Effekt zu erreichen.
Material und Methoden
Wirkstoffe und Reagenzien
Chelerythrin [IC₅₀ (PKC) = 0,66 μM, IC₅₀ (PKA) = 170 μM] und Calphostin C [IC₅₀ (PKC) = 0,50 nM, IC₅₀ (PKA) = 50 μM] zeigen eine hohe Spezifität für die PKC-Familie von Enzymen (Sigma). Diese Inhibitoren sind wenigstens 30-fach spezifischer in der Blockierung der PKC-Aktivität als im Gegensatz dazu die relativ unselektiven, jedoch weithin verwendeten Wirkstoffe Staurosporin und H7. Sie inhibieren offensichtlich keine anderen Kinasen, wie die zyklische AMP-Kinase (PKA) in den Konzentrationen, die in den Untersuchungen der Erfinder verwendet wurden (Kobayashi et al., 1989b; Herbert et al., 1990). 7-Amino-Aktinomycin D, ATP, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), Sphingosin-1-Phosphat, DL-Threo-Dihydrosphingosin und Propidiumiodid wurden von Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO, bezogen. C2-Ceramid und N-Oleoylethanolamin wurde von Matreya Chemicals, PA, bezogen. Reagenzien für den Terminale-Transferase-Assay wurden von Boehringer-Mannheim, Biochemicals, Indianapolis, IN, bezogen. Dünnschicht-chromatographie-Platten wurden von Whatman bezogen (10 cm × 10 cm LHP-K TLC Platte). Der Autoradiographiefilm stammte von Dupont. [³H] Palmitinsäure (60 Ci/mmol), [¹⁴C] Sphingomyelin (60 Ci/mmol) und [γ-³²P] ATP wurden von DuPont NEN bezogen. Alle Lösungsmittel besaßen HPLC-Grad. Chelerythrin wurde für die in vitro Experimente in sterilem Wasser oder in PBS für die intratumoralen Injektionen gelöst.
Zellkultur
Die humane SQ20B Kopf- und Halsplattenepithelkarzinom-Zelllinie wurde in DMEM kultiviert, das mit 25% F5-12, 20% fötalem Kälberserum (Gibco/BRL, Grand Island, NY) und 1% Penicillin-Streptomycinat mit 5% CO₂ kultiviert wurde, wobei Standardverfahren, wie in Chmura et al., 1996a; 1996b, beschrieben, bis auf die unten beschriebenen Modifikationen, eingehalten wurden. WEHI-231 JM wurden bis zu einer Dichte von 3–6 × 10⁵ Zellen/ml in RPMI 1640 Kulturmedium, 1% Penicillin-Streptomycin, 10% hitzeinaktiviertem fötalen Kälberserum (Gibco/BRL, Grand Island, NY und 5 × 10^–5 M β-Mercaptoethanol (Sigma) in 5% CO₂ wachsen gelassen.
Untersuchung der Lebensfähigkeit mit Hilfe des Propidiumiodidausschlusses
Zellen, 2,5–3,5 × 10⁵, wurden für alle Experimente in 24-Well Gewebekulturschalen nach bereits beschriebenen Standardverfahren (Chmura et al., 1996a; 1996b) kultiviert. Die Zellen wurden mit variierenden Konzentrationen von Chelerythrin behandelt, für 30 Minuten bei 37°C inkubiert und anschließend bestrahlt. Die Strahlungsdosis für alle Proben betrug eine Dosisrate von 2,0 Gy/sec., wobei ein ⁶⁰Co-Strahler (Gammacell 220, Atomic Energy of Canada) verwendet wurde. Nach den bezeichneten Zeitpunkten wurden die Zellen geerntet, einmal in PBS gewaschen und in 50 ml PBS resuspendiert, das 100 mg/ml Propidiumiodid enthielt. Lebende Zellen nehmen kein Propidiumiodid auf, während tote Zellen dies tun. Zellen, die sich in der Apoptose befinden, schrumpfen auch in ihrer Größe. Die Zellen wurden mittels einer Flusszytometrie (FACS) auf einem FACScan (Becton-Dickson) analysiert, wobei die in Chmura et al. (1996a; 1996b) beschriebenen Standardverfahren befolgt wurden und die Lysis II Software verwendet wurde.
DAPI-Färbung zur Visualisierung der Zellkerne
Zellen, 5 × 10⁵, wurden bei 1000 rpm zentrifugiert und in ungefähr 100 μl Zellkulturmedium resuspendiert. Die Zellsuspension wurde anschließend mit 100 μl DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindol, Sigma D9542, 1 μg/ml in PBT (PBS + 1% Triton X-100)) gemischt. Ein Tropfen dieses Gemisches wurde auf einem Objektträger mit einem Deckglas platziert. Die Zellen wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie dargestellt, wobei ein Olympus BX-40 Mikroskop mit einer 100 Watt Quecksilberlampe, einem 16 oder 40 × Fluoritobjektiv N. A. 0,75, (Leco #1-UB527) und ein UV-Filterkasten (ex 330–385 nm, em 420 nm, Breitbandpassfilter, Leco #U-M536) verwendet wurde. Die Bilder wurden fotografiert, wobei eine gekühlte Optronics Schwachlichtvideokammera (Leco #DEI-470TB) verwendet wurde, an die ein 2 × Koppler angebracht wurde (Leco #HR200-CMT). Das Bild wurde digital mit einer Auflösung von 72 dpi gespeichert.
DNA-Leiter-Assay
Die DNA-Degradation wurde wie bereits beschrieben (Gottschalk et al., 1993; 1994) ermittelt. Kurz gesagt: Nach einer Behandlung in 100 mm-Platten oder in 24-Well-Platten wurden die Zellen gesammelt und in 0,5 ml Lysis-puffer (0,6% SDS + 10 mM EDTA, pH 7,0) lysiert. NaCl wurde zu einer Endkonzentration 1 M hinzugegeben, durch Inversion gemischt, 12 Stunden bei 4°C inkubiert und anschließend bei 14.000 g für 30 Minuten zentrifugiert. Die Proben wurden mit Chloroform (1 : 1) behandelt und vor der Elektrophorese in einem 3%-igen Agarosegel in Ethanol präzipitiert und mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht.
Koloniebildungs-Assay
Exponentiell wachsende SQ20B Kulturen wurden mit 0,05% Trypsin + 0,02% EDTA trypsinisiert. Zellen (100 bis 50.000) wurden in 100 mm Gewebekulturschalen plattiert. 4 Stunden nach der Plattierung wurde Chelerythrin oder C2-Ceramid hinzugefügt und nach der Hinzufügung von Chelerythrin oder C2-Ceramid für 30 Minuten bestrahlt. Die Zellen wurden bestrahlt, wobei ein GE Maxitron 250 Röntgenstrahlgenerator verwendet wurde, der bei 250 kV und 26 mA mit einer Dosisrate von 114 cGy/min. arbeitet. Nach 12 Tagen wurden die Zellen fixiert und mit Kristallviolett, gemäß der Standardverfahren, gefärbt (Chmura et al., 1996a; 1996b). Kolonien mit mehr als 50 Zellen wurden als Überlebende gewertet.
Ceramid- und DAG-Quantifizierung mittels der DAG-Kinase-Reaktion
Die Quantifizierung von Ceramid durch Diacylglyzerinkinase entsprach der von Dressler und Kolesnick (1990) beschriebenen. Nach Bestrahlung wurden die Lipide extrahiert und mittels Sonifizierung in 20 μl 7,5% n-Octyl-β-D-Glucopyranosid, 5 mM Cardiolipin und 1 mM DETAPAC resuspendiert. 70 μl eines Reaktionsgemisches wurden hinzugefügt und ergab eine Endkonzentration von 0,05 M Imidazol/HCl pH 6,6, 0,05 M NaCl, 12,5 mM MgCl₂, 1 mM EGTA und DAG Kinase bei einer Konzentration von 0,7 U/ml. Die Reaktion wurde durch die Hinzufügung von 10 μl [γ-³²P] ATP (1,0 μCi/Reaktionsgefäß) in 5 mM ATP gestartet und bei Raumtemperatur für 30 min. inkubiert und durch die Extraktion von Lipiden mit 450 μl CHCl₃ : CH₃OH (1 : 2) und 20 μl 1% HClO₄ gestoppt. Die Monophase wurde gemischt, und nach 10 min. wurden 150 μl CHCl₃ und 150 μl 1% HClO₄ hinzugefügt, die Reaktionsgefäße gevortext und bei 5000 g für 5 min. zentrifugiert. Die untere organische Phase wurde 2 Mal mit 1% HClO₄ gewaschen und anschließend in einem Speed Vac Apparat getrocknet. Die Phosphorylierungsprodukte, Ceramid-1-Phosphat und Phosphatidsäure (aus DAG) wurden auf einer 10 cm × 10 cm LH P-K TLC Platte (Whatman) aufgetrennt. Die Daten wurden als pmol Ceramid/10⁶ Zellen mittels Szintillationszählung berechnet. Im Beispiel 6 stellen die Daten (mittlere +/– SD) wenigstens vier unabhängige Untersuchungen dar, in denen *p < 002 war, wenn sie mit den nicht-bestrahlten Kontrollen verglichen wurden.
Markierung, Extraktion und Analyse der mit [³H] Palmitinsäure markierten Lipide
Die Zellen wurden für 24 Stunden mit [³H] Palmitat (10 μCi/ml) bis zum isotopischen Gleichgewicht in 15 ml Glasreaktionsgefäßen vormarkiert, um die Änderungen im zellulären Ceramid und Sphingomyelin, die auf der Behandlung und auf dem Wechsel der Medien beruhen (Borchardt et al., 1994), zu minimieren. Nach der Behandlung der Zellen mit Chelerythrin wurde das gesamte Lipid mittels einer modifizierten Folch-Methode extrahiert. Kurz gesagt: 1 ml MeOH : 2 N HCl (100 : 6, v/v) wurde verwendet, um das Zellpellet zu resuspendieren. Chloroform (2 ml) und Wasser (0,6 ml) wurden zu jedem Reaktionsgefäß hinzugegeben, drei Mal gevortext und für zwanzig Minuten bei 1000 × g zentrifugiert, was zu einer Phasentrennung führte. Gleiche Mengen der organischen Phase wurden aus jedem Reaktionsgefäß entnommen, getrocknet und mit 30 μl Chloroform : Methanol (95 : 5) rekonstiuiert. Ein Aliquot (10 μl) wurde auf einer 10 cm × 10 cm LHP-K TLC Platte (Whatman) verteilt, die zuvor einem Waschschritt in einem Lösungsmittel von CHCl₃ : CH₃OH : H₂O (60 : 40 : 10, v/v) unterzogen wurde. Sphingolipide wurden in CHCl₃ : MeOH : CH₃COOH : H₂O (32,5 : 12,5 : 4,4 : 2,25) aufgetrennt, mit Jod gefärbt, mit En³Hance (DuPont) besprüht und einer Autoradiographie unterzogen. Die Autoradiographien wurden mit einem Epson 1200c 30 Bit Scanner und der NIH Image Software (öffentlich zugängliches Programm, entwickelt am NIH und aus dem Internet mittels FTP von zippy.nimh.nih.gov erhältlich) quantifiziert. Sowohl die Zählung als auch die Dichteanalyse führte zu ähnlichen Resultaten.
Aktivitätsassay neutraler und saurer Sphingomyelinase
Der gemischte Mizellen-Sphingomyelinase-Assay mit ^[14]C markiertem Sphingomyelin wurde wie in Wiegmann et al., 1994 beschrieben ausgeführt, mit kleineren Modifikationen wie sie hierin beschrieben werden. Exponentiell wachsende Zellen, 2 × 10⁷, wurden behandelt, gesammelt und in 200 μl neutralem Puffer (20 mM Hepes, pH 7,4; 10 mM MgCl₂, 2 mM EDTA, 5 mM DTT, 100 mM Na₃VO₄, 100 mM NaMO₄, 10 mM b-Glyzerinphosphat, 750 μM ATP, 1 mM PMSF, Leupeptin, Pepstatin, 2% Triton X-100) oder in sauerem Puffer (pH = 5,5, 2% Triton X-100, 1 mM PMSF, Leupeptin, Pepstatin) lysiert. Nach einer Inkubation für 5 Minuten bei 4°C wurden die Zellen mittels Ultraschallbehandlung homogenisiert, und die Zellreste wurden durch eine Zentrifugation mit geringer Geschwindigkeit (800 × g) entfernt. Die Proteinkonzentration wurde mit einem BioRad Proteinassaysystem (BioRad) gemessen. Protein (50 μg) wurde für zwei Stunden bei 37°C in einem Puffer (1 ml Endvolumen) inkubiert, der 20 mM HEPES, 1 mM MgCl₂ und 0,9 μl [N-Methyl-¹⁴C Sphingomyelin] enthielt. Die Reaktion verlief bei dieser Proteinkonzentration linear. Anschließend wurde Phosphorylcholin mit 800 ml Chloroform : Methanol (2 : 1 v/v) und 250 ml H₂O extrahiert. Radioaktives Phosphorylcholin wurde durch Szintillationszählung gemessen. Die Daten sind als Prozent der Kontrolle für sowohl die saueren als auch neutralen Sphingomyelinasen angegeben. In Beispiel 6 stammen die Daten (Mittelwert +/– SEM) aus vier unabhängigen Untersuchungen mit Doppel- oder mehr Bestimmungen, in denen p > 0,04 für die neutrale Sphingomyelinasen-Aktivität in WEHI-231 JM-Zellen ist (t-Test nach Student), wenn sie mit unbestrahlten Kontrollen verglichen wird.
Wachstum humaner Tumor-Fremdtransplantate
SQ-20B (1–5 × 10⁶) Tumorzellen wurden in den rechten Hinterlauf von Nacktmäusen (Frederick Cancer Research Institute) injiziert. Die Xenotransplantate wurden 2–3 Wochen bis zu einem mittleren Tumorvolumen von 300 mm³ wachsen gelassen. Am Tag 0 wurde das anfängliche Tumorvolumen mit einer direkten Messung mit einer Schieblehre ermittelt. Während der Behandlung wurden die Tumorvolumina mit einer Schieblehre zweimal wöchentlich gemessen und als Prozent des ursprünglichen Tumorvolumens dargestellt. Die Tumorvolumina wurden mit der Formel (a × b × c/2) ermittelt, die von der für ein Ellipsoid (d3/6) abgeleitet wurde. Tumorheilung wurde als Regression bis zu einem Volumen von < 10% der Originalgröße definiert, da es bei diesem Volumen unmöglich ist, restliches Tumorgewebe von Narbengewebe zu unterscheiden. Xenotransplantate wurden mit 2 mg/kg Chelerythrinchlorid an den Tagen 0, 3, 7 und 10 injiziert. Bestrahlte Mäuse wurden in Plexiglaskammern immobilisiert, und der gesamte Körper wurde, mit Ausnahme des tumortragenden Hinterlaufs, mit Blei abgeschirmt. Die Tumoren wurden mit einer Gesamtdosis von 50 Gy (5 Gy/Tag, 4 Tage/Woche) bestrahlt, wobei ein Maxitron-Generator (1,88 Gy/min.) verwendet wurde. Tumore wurden mit Strahlung alleine, Chelerythrin alleine und Puffer oder mit der Kombination von Chelerythrin mit Strahlung behandelt. Die Daten wurden als Prozent des ursprünglichen Tumorvolumens (Tag 0) berechnet und als gestückeltes Tumorvolumen ± SEM grafisch dargestellt.
Histologie von SQ-20B-Fremdtransplantaten
In die Tumore wurde einmal oder zweimal (Tag 0 und Tag 4) Chelerythrin, Chelerythrin und 20 Gy (5 Gy/Tag) injiziert oder mit 20 Gy alleine behandelt, und am Tag 7 herausgeschnitten und in 10% neutral gepuffertem Formalin fixiert. Die Tumore wurden anschließend zurechtgeschnitten und in einem Tissue Tek II Tissue Processor bearbeitet. Die Gewebe wurden in Paraffin eingelegt, geschnitten und mit Hämatoxilin und Eosin oder mit 100 ml DAPI (4',6,-Diamidino-2-Phenylindol, Sigma D9542, 1 μg/ml in PBT (PBS + 1% Triton X-100)) gefärbt, gefolgt von einer Untersuchung auf Apoptose und Nekrose mit einem Lichtmikroskop.
Isolierung von Zellkernen
WEHI-231 JM Zellen (2 × 10⁷) wurden pelletiert und in Extraktionspuffer (20 mM Hepes pH 7,4; 10 mM MgCl₂; 2 mM EDTA; 5 mM DTT; 100 mM Na₃VO₄; 100 mM NaMO₄; 10 mM β-Glyzerinphosphat; 750 μM ATP; 1 mM PMSF, 10 μM Leupeptin, 10 μM Pepstatin; 2% Triton X) resuspendiert. Zellen wurden für 5 Minuten auf Eis inkubiert und anschließend mit 15 Schlägen mit einem Dounce-Homogenisator disrumpiert. Kerne, vor jeder einzelnen Untersuchung frisch präpariert, wurden zweimal mit RPMI während einer Zentrifugation bei 2000 Upm in einer Mikrozentrifuge gewaschen und in Medien resuspendiert, die RPMI und 5 × 10^–5 M β-Mercaptoethanol enthielten. Allen Proben wurde die Strahlung mit einem ⁶⁰Co-Strahler (Gammacell 220, Atomic Energy of Canada) mit einer Dosisrate von 2,0 Gy/sec. verabreicht.
Selektion von OE-Varianten
WEHI-231 JM Zellen (1 × 10⁷) wurden mit zwei aufeinanderfolgenden Behandlungen mit 100 μM und 125 N-Oleoylethanolamin (Matreya), einem potenten Inhibitor der Ceramidase (Coroneos et al., 1995; Ambrosini et al., 1994) behandelt. Zellen wurden in Medien, die N-Oleoylethanolamin enthielten, für 96 Stunden kultiviert. Serielle Verdünnungen isolierten einzelne resistente Zellen, und diese wurden nach jeder Selektion vermehrt. Alle zwei Wochen wurden Zellen mit 125 μM N-Oleoylethanolamin re-selektioniert. Die resultierenden Zelllinien, WEHI-231 OE benannt, sind dreifach resistenter gegenüber Apoptose, wenn sie mit 75 μM des Inhibitors behandelt werden, wobei die Zellen im Vergleich mit der Parentallinie dennoch eine ähnliche Wachstumskinetik besitzen.
Apoptose- und Zelllebensfähigkeits-Untersuchungen
Der TdT-Assay wurde wie zuvor beschrieben ausgeführt (Chmura, 1996). Bestrahlte (10 Gy) und Serum-ausgehungerte FLS-12 bildeten den apoptotischen Bereich, bezeichnet als R2. Zellen wurden mittels Flusscytometrie auf einem FACScan (Becton-Dickson) unter Verwendung der Lysis II Software analysiert, wobei die FL2 und FSH Kompensation auf 50% bzw. 25% gesetzt war.
Um die DNA-Fragmentation nachzuweisen, wurden Zellen gesammelt und in 0,5 ml Lysispuffer (0,6% SDS + 10 mM EDTA, pH 7,0) lysiert. NaCl wurde zu 1 M hinzugefügt, durch Inversion gemischt, für 12 Stunden bei 4°C inkubiert und für 30 Minuten bei 14.000 g zentrifugiert. Die Proben wurden Chloroform- und Ethanol-(1 : 1) präzipitiert und in einem 3% Agarosegel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt.
Für die Lebensfähigkeitsfärbung wurden 2,5–3,5 × 10⁵ Zellen mit variierenden Konzentrationen von C2-Ceramid, Bestrahlung oder beidem behandelt. Nach den angegebenen Zeitpunkten wurden die Zellen geerntet, einmal in Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, in PBS, das 50 μl von 100 μg/ml Propidiumiodid enthielt, resuspendiert und mittels Flusscytrometrie (FACS) analysiert.
BEISPIEL 1
Chelerythrinchlorid potenziert die IR-induzierte Abnahme des clonogenischen Überlebens
SQ20-B, eine humane Kehlkopfkarzinomzelllinie, ist, im Vergleich zu anderen humanen Zelllinien, strahlungsresitent (D₀ = 2,3 Gy) (Nagasawa et al., 1994; Brachman et al.; 1993). Mutationen innerhalb des Exons 5 von p53 in SQ20-B resultieren in einem Verlust der Arretierung des Zellzyklus in G1 und einem fehlenden Anstieg in p53-Protein nach einer IR-Exposition (Brachman et al.; 1993).
Die klonale Überlebensrate wurde nach steigenden Konzentrationen von Chelerythrinchlorid allein (0,5–1,5 μM), IR alleine (1–9 Gy) oder der kombinierten Behandlung von Zellen mit Chelerythrin und IR gemessen. Die Zugabe von Chelerythrin zu exponentiell wachsenden SQ20-B Zellen verringerte das klonale Überleben in einer konzentrationsabhängigen Art und Weise (2). Bei einer Konzentration von 500 nM verringerte Chelerythrin das Überleben der Zellen auf ungefähr 80% der unbehandelten Kontrollzellen (ungefähr 20% Zelltod). Die Kombinationsbehandlung der Zellen mit 500 nM Chelerythrin 30 Minuten vor der Behandlung mit 3 Gy Strahlung verringerte des Überleben der Zellen auf ungefähr 30% der unbehandelten Zellen (ungefähr 70% Zelltod). Der Zelltod wurde durch Chelerythrin über die gesamte Breite der verabreichten Dosis (1–9 Gy) verstärkt und resultierte sowohl in einem verringerten klonalen Überleben als auch in einer erfolglosen Koloniebildung (2). Eine Zellschrumpfung und nukleäre Kondensation, Charakteristiken der Apoptose, wurden bei diesen Konzentrationen von Chelerythrin und IR nicht beobachtet. Diese Daten zeigen, dass nanomolare Konzentrationen von Chelerythrin den IR-vermittelten Zelltod durch Mechanismen verstärken, die von einer Apoptose unabhängig sind.
BEISPIEL 2
SQ20-B-Zellen fehlt eine apoptotische Reaktion auf IR
Es gab keine nachweisbare Chromatinkondensation oder cytoplasmatische Blasenbildung 72 Stunden nach der Exposition von SQ-20B Zellen gegenüber 20 Gy IR, und die Zellen erschienen den nicht behandelten Kontrollen ähnlich. Im Unterscheid dazu induzierten 10 μM Chelerythrin eine Chromatinkondensation, eine cytoplasmatische Blasenbildung und eine internukleosomale DNA-Fragmentation 12 Stunden nach der Exposition gegenüber Chelerythrin. Diese Daten zeigen, dass, während SQ-20B ihre Kapazität behält, in die Apoptose einzutreten, IR alleine nicht ausreicht, um die apoptische Antwort zu initiieren.
Um festzustellen, ob die Induktion von Apoptose durch Chelerythrin die Aktivierung von Kaspasen involviert, wurde der irreversible zVAD-fmk Peptidinhibitor dieser Proteasen verwendet. Die Zugabe von zVAD-fmk blockierte die Chelerythrin induzierte Apoptose. Diese Befunde deuten darauf hin, dass Chelerythrin die Apoptose durch die Aktivierung von CPP32 oder einer verwandten Kaspase initiiert (3A–3E).
BEISPIEL 3
Chelerythrin verstärkt eine IR-induzierte Apoptose nach Sphingomyelinaseaktivierung
Wie durch den Propidiumiodidausschluss und die FACS-Analyse ermittelt wurde, senkt die Behandlung von SQ-20B Zellen mit Röntgenstrahlen (8 Gy) und steigenden Mengen Chelerythrin die Lebensfähigkeit der Zellen um 25% der Kontrollzellen nach 48 Stunden (4). Die Verminderung der Lebensfähigkeit der Zellen stellt die maximale Anzahl von Zellen dar, die bei der ersten post-IR Zellteilung nach einer IR einen apoptotischen Tod gestorben sein könnten. Im Gegensatz dazu senkten 8 Gy IR die klonale Überlebensfähigkeit um 90%. Diese Befunde legen nahe, dass der Hauptmechanismus eines IR-induzierten Zelltodes bei der Teilung eintritt (nekrotisch). Die Kombination von 2,5 μM Chelerythrin und 8 Gy induzierte übereinstimmend mit Apoptose morphologische Änderungen, die denen ähnlich waren, die mit 10 mM Chelerythrin beobachtet wurden und senkte die Überlebensrate der Zellen um 85% (4). Die kombinierten Effekte von IR und Chelerythrin erwiesen sich als größer als das gemeinsame Abtöten mit Konzentrationen von Chelerythrin über 2,5 μM. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der bezeichnete Anstieg des Zelltodes innerhalb von 48 Stunden nach einer Kombinationsbehandlung der Zellen mit Chelerythrin und IR aus einem Anstieg des apoptotischen Schwellenwerts der SQ-20-B Zellen gegenüber IR resultiert.
Der Proteaseinhibitor zVAD-fmk (20 μM) inhibierte die Apoptose nach der Kombinationsbehandlung von Zellen mit IR und Chelerythrin (2,5 μM), ähnlich zu dem, was mit Chelerythrin alleine (10 μM) beobachtet wurde. Frühere Studien legten nahe, dass nicht-spezifische PKC-Inhibitoren die G2/M-Phase des Zellzyklus verkürzen und daher die Abtötung der Zellen durch ionisierende Strahlung verstärken (Thompson und Fields, 1996). In der vorliegenden Erfindung führte eine Behandlung von SQ20-B-Zellen mit 0,5–1 μM Chelerythrin nicht zu einer Verkürzung der G2/M- Phase, die in bestrahlten Zellen beobachtet wurde. Konzentrationen von Chelerythrin alleine, die Apoptose induzierten (5 μM) induzierten allerdings ebenfalls eine Arretierung in der G2/M-Phase des Zellzyklus (Thomson und Fields, 1996). Diese Ergebnisse zeigen, dass Chelerythrin bei Konzentrationen, die unter dem Schwellenwert liegen, der eine Kaspase-abhängige Apoptose induziert, den Tod bei der Zellteilung erhöht.
Frühere Arbeiten haben nahegelegt, dass Chelerythrin die Apoptose teilweise durch die Aktivierung von Sphingomyelinasen verstärkt (Chmura et al., 1996b). Die Aktivitäten der neutralen und saueren Sphingomyelinasen wurden in bestrahlten SQ20B-Zellen gemessen, wobei ein gemischter Mizellenassay verwendet wurde. Die Exposition von SQ20B-Zellen gegenüber 10 Gy führte nicht zu einer Veränderung der Sphingomyelinaseaktivität innerhalb von 30 Minuten der Behandlung (5A). SQ-20B-Zellen wurden für 30 Minuten mit 5 μM Chelerythrin vorbehandelt und anschließend einer Strahlung von 10 Gy exponiert. In Übereinstimmung mit Befunden in anderen Zelllinien (Chmura et al., 1996a; Chmura et al., 1996b) stiegen die neutralen und sauren Sphingomyelinasen innerhalb von 5 Minuten der IR Exposition auf ungefähr 200% (p < 0,03) bzw. auf etwa 170% (p < 0,005) der unbehandelten Kontrolle an (5B). Eine Ceramidproduktion und ein entsprechendes Abfallen der Sphingomyelinmasse folgten dem Anstieg der Sphingomyelinaseaktivität. Signifikanterweise verstärkte 30 Minuten vor der Bestrahlung von außen zugegebenes Ceramid die IR-induzierte Abtötung der Zellen (5C). Diese Untersuchungen zeigen, dass die Kombination von Chelerythrin und IR die Sphingomyelinaseaktivität vor dem Auftreten von Apoptose verstärkt.
BEISPIEL 4
Chelerythrin verstärkte die Apoptose und Zellabtötung durch Röntgenstrahlen in vivo
Der Anstieg der Zellabtötung durch Chelerythrinchlorid nach IR in vivo verstärkte die Abtötung von Tumorzellen von SQ-20B Xenotransplantaten in Nacktmäusen. Tumore mit anfänglichen mittleren Volumina zwischen 305–895 mm³ wurden mit 2 mg/kg Cheletrytrinchlorid (LD₅₀ 25 mg/kg IP) viermal während der Behandlung an den Tagen 0, 3, 7 und 10 injiziert. Strahlung wurde in einer Konzentration von 5 Gy/Tag, 4 Tage in der Woche in einer Gesamtdosis von 50 Gy zugeführt. Die Tiere in allen Behandlungsgruppen erschienen während der gesamten Studie gesund. Wie in 6 gezeigt, zeigen die für 4 separate Experimente aufgestellten Daten, dass Chelerythrinchlorid (n = 43) oder Strahlung alleine (n = 28) zunächst das erneute Wachstum des Tumors im Vergleich mit den Puffer-injizierten Kontrollen (n = 26) inhibierte. Allerdings erreichte bis zum Tag 30 nach der Behandlung das Wachstum des Tumors 138% bzw. 174% des ursprünglichen Volumens in den Gruppen, die mit Strahlung bzw. Chelerythrin alleine behandelt wurden.
In der Gruppe mit der Kombinationsbehandlung zeigten 20/41 Tiere am Tag 31 eine Regression des Tumors auf weniger als 10% seines ursprünglichen Volumens. Im Gegensatz dazu zeigten 1/16 der mit Strahlung + Puffer behandelten Tiere und 13/43 der nur mit Chelerythrin behandelten Tiere eine Regression auf weniger als 10% des ursprünglichen Tumorvolumens. Daher ist der Kombinationseffekt von Chelerythrin und IR größer als die additiven Effekte jeder Behandlung alleine. Eine histologische Analyse der Tumore zeigte bereits 4 Tage nach der Kombinationsbehandlung große Bereiche von verstärkter Tumornekrose im Vergleich zur Röntgenbestrahlung (XRT) oder Chelerythrinbehandlung alleine auf. Charakteristische Schnitte von nicht-nekrotischen Bereichen von Tumoren wurden mit DAPI gefärbt, um nukleäre Veränderungen der Apoptose nachzuweisen. Tumorschnitte wurden am Tag 7 nach der Behandlung mit zwei Injektionen von Chelerythrin alleine, 20 Gy alleine, eine Injektion von Chelerythrin und 20 Gy oder zwei Behandlungen mit Chelerythrin und 20 Gy entnommen. Die Zellkerne aus nicht-nekrotischen Bereichen der Tumore, die mit Strahlung alleine behandelt wurden, erschienen abgerundet und zeigten ein glattes Heterochromatin-Erscheinungsbild. In diesen Bereichen konnten nur wenige apoptotische Zellkerne, wie sie durch eine Verlagerung des Chromatins an den Rand und eine nukleäre Schrumpfung definiert sind, nachgewiesen werden. Die Zellkerne aus Chelerythrin -behandelten Tumoren erschienen ähnlich denen aus strahlungsbehandelten Tumoren.
Im Gegensatz zu den Einzelbehandlungen mit Strahlung oder Chelerythrin alleine, erschienen die Zellkerne aus Tumoren, die mit einer Einzeldosis von Chelerythrin und 20 Gy, aufgeteilt auf 5 Gy/Tag für 4 Tage, behandelt wurden als geschrumpft und fragmentiert innerhalb der nicht-nekrotischen Tumorschnitte. In den Tumoren, die mit zwei Behandlungen von Chelerythrin und Röntgenstrahlung behandelt wurden, konnten keine Bereiche mit lebensfähigem Gewebe gefunden werden. Während die Behandlung der Tumore mit IR in dem darunter liegenden Epidermis- und Muskelgewebe eine typische Entzündungsreaktion und Nekrose induzierte, verstärkte eine Kombinationsbehandlung der Tumore mit Röntgenstrahlung und Chelerythrin diese Reaktion nicht, was nahe legt, dass die verstärkte Abtötung der Zellen durch Chelerythrin auf den Tumorherd begrenzt war. Diese Ergebnisse zeigen, dass, während ionisierende Strahlung Apoptose in vivo nicht induzieren kann, Chelerythrin die strahlungsinduzierte Abtötung von Zellen durch die Induktion von Apoptose innerhalb von Tagen der Behandlung verstärkt und dass die darunter liegenden und umgebenden normalen Gewebe von den Effekten dieser Behandlung relativ verschont bleiben.
BEISPIEL 5
PKC-Inhibierung induziert Apoptose und Ceramidproduktion
Um mögliche Interaktionen zwischen der PKC-Aktivität, Ceramidproduktion und Apoptose zu verstehen, wurden zwei Inhibitoren der PKC, Chelerythrinchlorid und Calphostin-C, eingesetzt. Chelerythrinchlorid und Calphostin-C kompetitieren um die konservierten katalytischen Bereiche bzw. regulatorischen Domänen der PKC und sind potente und spezifische Inhibitoren der PKC-Isoformen (α, β, δ, ε), die in WEHI-231-Zellen gefunden werden (Chmura et al., 1996a; Rotenberg et al., 1995; Herbert et al., 1990; Haggerty und Monroe, 1994). Die PKC-Inhibierung mit Chelerythrin oder Calphostin-C induzierte Apoptose. Ferner verstärkte eine Behandlung der Zellen mit Chelerythrin oder Calphostin-C die Ceramidproduktion nach der Aktivierung einer neutralen Sphingomyelinase, was darauf hindeutet, dass PKC und der sekundäre Lipid-Botenstoff Ceramid entgegengesetzte Rollen in der Bestimmung des Überlebens nach unterschiedlichen zellulären Signalen spielen.
Chelerythrin und Calphostin C induzierten Apoptose
Vierundzwanzig Stunden nach der Zugabe von Chelerythrin (10 μM) oder Calphostin C (250 nM) zu in Komplettmedium wachsenden WEHI-231, zeigte eine Propidiumiodid FACS-Analyse einen über 90%-igen Zelltod. Eine Gelelektrophorese von DNA niedrigen Molekulargewichts und einer DAPI-Fluoreszenzfärbung zeigte DNA-Leiterbildung und nukleäre Kondensation auf. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass WEHI-231 nach der Behandlung mit Inhibitoren der PKC in die Apoptose eintreten.
Von Chelerythrin und Calphostin-C wurde herausgefunden, dass sie mit exogenen Ceramidanalogen synergistisch zusammenwirken, um Apoptose zu induzieren (Chmura et al., 1996a). Dieser Befund ist mit früheren Berichten konsistent, die zeigen, dass Phorbolester die Ceramidtoxizität in WEHI-231 und anderen Zelllinien begrenzen (Haimovitz-Friedman et al., 1994a; Gottschalk und Quintans, 1995; Obeid et al., 1993). Da die Aktivierung der PKC die Ceramidproduktion begrenzen kann (Fuks et al., 1994; Haimovitz-Friedman et al., 1994a; Haimovitz-Friedman et al., 1994b), wurden die Effekte einer verminderten PKC-Aktivität auf die Ceramidakkumulation untersucht.
Ceramidproduktion beruht auf der Aktivierung einer neutralen Sphingomyelinase
Um zu überprüfen, ob eine PKC-Inhibierung die Ceramidproduktion verändert, wurde der DAG-Kinase-Assay verwendet, um das intrazelluläre Ceramid nach einer Chelerythrin- und Calphostin-C-Behandlung zu quantifizieren (Dressler und Kolesnick, 1990; Preiss et al., 1986). 7A zeigt den Zeitverlauf der Ceramidproduktion nach der Zugabe von 10 μM Chelerythrin zu expontentiell wachsenden Zellkulturen. Ungefähr 30 Minuten nach der Zugabe von Chelerythrin stieg die Ceramidproduktion um 100% über den Grundwert und kehrte innerhalb von Stunden fast auf die Menge vor der Behandlung zurück. Dementsprechend induziert eine PKC-Inhibierung die Ceramidakkumulation innerhalb der ersten Stunde nach der Behandlung mit dem Inhibitor.
Um zu untersuchen, ob der Anstieg des Ceramids durch die Hydrolyse seiner entsprechenden Vorläufer oder aus einer Neusynthese von Lipid stammt, wurden die Sphingomyelinkonzentrationen in WEHI-231 nach einer Behandlung mit Chelerythrin untersucht. Zellen (4 × 10⁶) wurden mit [³H]-Palmitat (10 μCi/ml) für 24 Stunden markiert, das gesamte Lipid extrahiert und mit einer Dünnschichtchromatographie wie bereits beschrieben aufgetrennt (Quintans et al., 1994). 7A zeigt, dass die Menge an Sphingomyelin parallel zum Anstieg des Ceramids abnimmt und seine geringste Konzentration (etwa 55% der Kontrolle) 60 Minuten nach der Behandlung mit dem Inhibitor erreicht. Wie in 7B gezeigt ist, besitzt Calphostin-C ähnliche Effekte auf die Cermidproduktion und Sphingomyelinkonzentrationen. Daher verursachte die Inhibierung der PKC nicht nur eine Erhöhung des intrazellulären Ceramids, sondern auch eine gleichzeitige Abnahme des Sphingomyelins, was nahe legt, dass Ceramid durch die Hydrolyse seines Vorläufers durch eine Sphingomyelinase hergestellt wird.
Um zu bestätigen, dass die Ceramidakkumulation auf einer erhöhten Sphingomyelinaseaktivität beruht, wurde ein gemischter Mizellenassay verwendet, um die Enzymaktivität in vitro zu quantifizieren. Vorzugsweise wurde Chelerythrin wegen seiner größeren Löslichkeit und lichtunabhängigen Aktivität für diese Untersuchungen verwendet. 7C zeigt, dass neutrale, aber nicht saure, Sphingomyelinaseaktivität auf 235% (+/–38 SD) der Kontrolle innerhalb von 30 Minuten der Exposition gegenüber Chelerythrin anstieg, was nahe legt, dass ein Großteil der Ceramidakkumulation aus der Hydrolyse von Sphingomyelin resultiert. Hitze-inaktiviertes Chelerythrin besaß weder einen Effekt auf die Lebensfähigkeit der Zellen noch auf die Sphingomyelinaseaktivierung. Ferner induzierte Chelerythrin bei Untersuchungen in Abwesenheit der zellulären Präparationen keine Hydrolyse des markierten Sphingomyelins, was zeigt, dass die erhöhte zelluläre Sphingomyelinaseaktivität für die Sphingoymyelinhydrolyse verantwortlich war.
Die Mechanismen, durch die Ceramid den Zelltod vermitteln kann, sind immer noch unbekannt. Frühere Untersuchungen haben eine Vielzahl von Angriffszielen für den Ceramidsignalweg aufgezeigt, einschließlich einer Serin/Threonin-Kinase (CAPK) und -Phosphatase (CAPP), PKC-Isoformen (Lozano et al., 1994), p54 (Kharbanda et al., 1995) und Phospholipase D (Gomez-Munoz et al., 1994; Venable et al., 1994). Da Veränderungen des oxidativen Status eine große Menge zellulärer Reaktionen induzierte, einschließlich Wachstum und Apoptose in WEHI-231 und anderen Lymphozyten, wurde die Inhibierung der PKC und eine resultierende Akkumulation von Ceramid auf ihren Effekt auf die Konzentration reaktiver Sauerstoffspezies innerhalb der Zelle untersucht, wobei der Farbstoff Dichlordihydrofluoreszein und FACS-Analyse verwendet wurden. Wie in 8A gezeigt ist, induzierte eine IgM Vernetzung auf der Oberfläche eine charakteristische Aktivierung der PKC und die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), was mit früher berichteten Daten konsistent ist (Blumberg, 1988). Die Zugabe von 30 μM exogenen Ceramids (8B) oder 10 μM Chelerythrin (8C) für 15 Minuten reduzierte die ROS in den Zellen, was nahe legt, dass die Akkumulation von Ceramid als ein Reduktionsmittel wirkt. Während eine nicht-toxische Oxidation das Zellwachstum fördern kann, kann eine intrazelluläre Reduktion zu einer Aktivierung von Cysteinproteasen führen, die als Mediatoren der Apoptose im Gespräch sind.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Inhibierung der PKC-Aktivität Apoptose in WEHI-231-Zellen teilweise durch die Aktivierung einer neutralen Sphingomyelinase und eine darauf folgende Akkumulation von Ceramid induzieren kann. Es wurde früher bereits gezeigt, dass eine PKC-Aktivierung durch Phorbolester die Ceramidproduktion begrenzt und die Zellen vor einer durch eine Sphingomyelinhydrolyse induzierten Apoptose schützt (Haimovitz-Friedman et al., 1994a; Gottschalk et al., 1995). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die PKC-Aktivität und der Ceramidsignalweg bei der Bestimmung des Schicksals einer Zelle entgegengesetzte Rollen spielen. Die Produktion von Ceramid und die Aktivierung seiner apoptotischen Signalkaskade kann neuartige therapeutische Angriffsziele für die Verstärkung der Apoptose in Tumorzellen darstellen.
BEISPIEL 6
Verlust der Ceramidproduktion verleiht Resistenz gegenüber strahlungsinduzierter Apoptose
Die nukleären Veränderungen der Apoptose in WEHI-231 JM Lymphomzellen nach einer Bestrahlung wurden durch die Färbung ganzer Zellen mit DAPI untersucht. Die nach 20 Gy folgende charakteristische nukleäre Kondensation wurde in über 95% der mittels des Propidiumiodidausschlusses und einer FACScan-Analyse quantifizierten Zellen innerhalb von 24 Stunden beobachtet. Um festzustellen, ob die ionisierende Strahlung das extranukleäre Kompartiment benötigt, um die nukleären Veränderungen der Apoptose zu induzieren, wurden isolierte WEHI-231 JM Zellkerne bestrahlt. Dosen von 20 bis 40 Gy waren nicht in der Lage, apoptotische Veränderungen weder in der Kernmembran noch im Chromatin über 72 Stunden nach der Bestrahlung zu induzieren. Allerdings erfolgte in isolierten WEHI-231 JM Zellkernen eine DNA-Kondensation und ein nukleärer Zerfall, was für eine Apoptose innerhalb von 5 Stunden nach der Behandlung mit dem Kinaseinhibitor Chelerythrinchlorid charakteristisch ist. Diese Befunde zeigten, dass nukleäre Signale alleine nicht für die Apoptose intakter Zellen nach Röntgenstrahlen ausreichten und legten nahe, dass extranukleäre Ereignisse für eine strahlungsvermittelte Apoptose in diesen Zellen benötigt wurden.
Da Ceramid als extranukleäres Signal im Gespräch ist, das in der Reaktion auf ionisierende Strahlung und andere Mediatoren der Apoptose beteiligt ist (Dressler et al., 1992; Gottschalk et al., 1995; Ji et al., 1995, Martin et al., 1995), wurde die Ceramidproduktion nach Exposition von Zellen gegenüber 8 Gy gemessen, da diese Dosis von Röntgenstrahlen in beinahe 100% der WEHI-231 innerhalb von 72 Stunden Apoptose induziert. 9A zeigt den Zeitverlauf der Ceramidproduktion nach der Bestrahlung von exponentiell wachsenden WEHI-231 JM-Zellen. Die Ceramidproduktion, gemessen mit dem DAG-Kinaseassay, stieg auf 140% (p < 0,002) über dem Grundwert (78 +/– 18 pmols/10⁶ Zellen) ungefähr 30 Minuten nach der Exposition gegenüber Röntgenstrahlen gleichzeitig mit einem Anstieg in der Aktivität neutraler Sphingomyelinase (9B), die in 138% (p < 0,04) der unbestrahlten Kontrolle (9B) gipfelte. Im Gegensatz zu anderen kürzlichen Berichten war die saure Sphingomyelinase mit ihrem Basalwert von 7,6 pmols/mg/min in dieser Zelllinie unverändert. Diese Befunde unterstützen einen zeitlichen Zusammenhang zwischen der Ceramidproduktion, Aktivierung der neutralen Sphingomyelinase und der Induktion von Apoptose nach Bestrahlung. Während andere Berichte eine Dosis-Reaktionsbeziehung zwischen Strahlungsdosis und der Ceramidproduktion anzeigen, waren die beobachteten Unterschiede in der Ceramidproduktion zwischen 1 Gy und 8 Gy nicht statistisch signifikant.
Um festzustellen, ob der beobachtete Anstieg in der Ceramidproduktion zu der strahlungsvermittelten Apoptose beiträgt, wurde eine Variante der WEHI-231-Zelllinie, die gegenüber Veränderungen in der Ceramidproduktion nach einer Röntgenstrahlexposition resistent ist, selektioniert. Es wurde gefolgert, dass eine Inhibierung der Ceramidase auf Zellen selektionieren würde, die gegenüber der Produktion von Ceramid intolerant sind und dass eine Resistenz gegenüber N-Oleoylethanolamin in einer verringerten Ceramidproduktion nach zellulären Stresssituationen resultieren würde. WEHI-231 JM-Zellen wurden mit dem Ceramidaseinhibitor N-Oleoylethanolamin inkubiert (Ambrosini et al., 1994). Die intrazelluläre Ceramidakkumulation stieg im Vergleich zu den Grundwerten innerhalb von 24 Stunden in einer dosisabhängigen Art und Weise an. Die resultierende Zelllinie, WEHI-231 OE, besitzt ähnliche Grundwerte in der Ceramidproduktion (100 +/– 10 pmols/10⁶ Zellen) im Vergleich zu der JM-Linie. 9B zeigt den relativen Anstieg in der Ceramidproduktion, der in wildtypischen WEHI-231 JM-Zellen nach der Exposition gegenüber 8 Gy beobachtet wurde. WEHI-231 OE war nicht in der Lage, die Ceramidproduktion im Vergleich zu nicht-bestrahlten OE Kontrollzellen zu erhöhen. Wie in der JM-Linie beobachtet wurde, wurde die Aktivität der sauren Sphingomyelinase (22 pmols/mg/min) durch ionisierende Strahlung nicht verändert. Dementsprechend führte die Selektion von Zellen mit N-Oleoylethanolamin zu einer Zelllinie mit einer veränderten Aktivität neutraler Sphingomyelinase nach ionisierender Strahlung. Während die Grundkonzentrationen von Ceramid in beiden Zelllinien ähnlich waren, war die OE-Linie nicht in der Lage, die Ceramidproduktion nach Röntgenstrahlen zu erhöhen.
WEHI-231 OE-Zellen waren hinsichtlich ihrer apoptotischen Reaktion nach Röntgenbestrahlung im Vergleich mit den wildtypischen WEHI-231 JM-Zellen verändert. Der Terminale-Transferase-Assay (TdT) zeigte, dass wenigstens 50% der WEHI-231 JM-Zellen 24 Stunden nach 10 Gy in die Apoptose eintreten (10A). Nach 48 Stunden blieben zu wenige intakte Zellen übrig, um weitere Analysen auszuführen. Im Unterschied dazu traten nach 24 bzw. 48 Stunden nur 12% bzw. 19% der WEHI-231 OE-Zellen in die Apoptose ein. Die WEHI-231 JM Parentalzelllinie, aber nicht die WEHI-231 OE-Linie, zeigte eine für Apoptose charakteristische Leiterbildung der DNA bereits 14 Stunden nach der Bestrahlung, was die TdT-Ergebnisse bekräftigte. Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass die Entwicklung eines Apoptose-resistenten Phänotyps durch Veränderungen in der Aktivierung der neutralen Sphingomyelinase und die anschließende Ceramidproduktion auftreten könnte.
Als nächstes wurde die Verringerung der Apoptose untersucht, um festzustellen, ob dies der OE-Linie erlauben würde, nach einer Röntgenbestrahlung weiter zu proliferieren. Nach einer Bestrahlung mit 6 Gy setzten OE-Zellen für über 24 Stunden ihre Proliferation fort, bevor sie in den Wachstumsarrest eintraten (10B). Die verbliebenen Zellen bestanden hauptsächlich aus riesigen, multinukleären Zellen, welche ihre Fähigkeit verloren haben, Lebendfarbstoffe auszuschließen und letztendlich fragmentierten, was mit einem post-mitotischen Tod oder nekrotischen Zelltod konsitent war (Hall, 1994). Das Fehlen einer kontinuierlichen OE-Zellproliferation und der anschließende Zelltod zeigten, dass eine apoptotische Reaktion auf ionisierende Strahlung nur einen Mechanismus darstellt, durch welchen Röntgenstrahlen Zellen töten.
Um die Frage zu beantworten, ob die Resistenz der OE-Sublinie teilweise auf Veränderungen der Ceramidmetaboliten oder anderer Ziele beruhte, wurden drei Untersuchungen unternommen. Eine Vorbehandlung bestrahlter WEHI-231 OE-Zellen mit dem zelldurchlässigen Ceramidanalog C2-Ceramid stellte die apoptotische Reaktion zum Zeitpunkt 24 Stunden wieder her (11A). Des Weiteren waren WEHI-231 JM- und OE-Zellen gegenüber exogenem Ceramid (IC₅₀ = 30 μM) und gegenüber dem Sphingosinkinaseinhibitor DL-Threo-dihydrosphingosin (IC₅₀ = 3 μM) gleichermaßen empfindlich (11B), von dem berichtet wurde, dass er spezifisch die Bildung von Sphingosin-1-Phosphat inhibiert – ein Ceramidmetabolit, von dem berichtet wird, dass er die apoptotischen Effekte der Ceramidproduktion supprimiert (Cuvillier et al., 1996). Beide Zelllinien waren gegenüber den Effekten der Sphingosinkinaseinhibierung und der resultierenden Abnahme des Ceramids gleichermaßen empfänglich. Diese Ergebnisse zeigten, dass die zellulären Bestandteile, die mit Ceramid interagieren, und Apoptose induzieren, in WEHI-231 OE-Zellen unverändert blieben. Daher kann die Strahlungsresistenz dem Fehlen der Sphingomyelinaseaktivierung und dem anschließenden Abfall der Ceramidproduktion nach Bestrahlung zugeschrieben werden.
Diese Ergebnisse zeigen, dass das extranukleäre Kompartiment ein essenzielles apoptotisches Signal nach der Exposition von Zellen gegenüber ionisierender Strahlung beisteuert. Mit diesen Daten stimmen Studien überein, die zeigen, dass extranukleäre Signale benötigt werden, um die charakteristischen cytoplasmatischen und nukleären Veränderungen der Apoptose in Säugetierzellen zu induzieren (Raff et al., 1994; Jacobson et al., 1994). Diese Daten legen nahe, dass erworbene Defekte in der Ceramidproduktion, die auf der Sphingomyelinhydrolyse beruhen, in einem strahlungsresistenten Phänotyp resultieren können. Im Besonderen ist der Verlust der Aktivität der neutralen, aber nicht der sauren Sphingomyelinase mit der Resistenz gegenüber Apoptose nach ionisierender Strahlung assoziiert, was im Gegensatz zu früheren Studien in Knockoutmäusen der sauren Sphingomyelinase steht (Santana et al., 1996), welche die saure Sphingomyelinase als Haupteffektor mit der Apoptose in Verbindung bringen.
Die Aktivität der sauren Sphingomyelinase in den exponentiell wachsenden JM- und OE-Linien war im Vergleich mit anderen veröffentlichten Zelllinien niedrig und zeigte keinen Anstieg nach ionisierender Strahlung. Das Fehlen der Aktivieirung nach Röntgenstrahlen und der relativ niedrige Grundwert der Aktivität legen nahe, dass sie kein Bestandteil der apoptotischen Reaktion auf Röntgenstrahlen in diesem System ist. Diese Daten zusammen genommen liefern ferner den Beweis, dass der Verlust der von der neutralen Sphingomyelinase stammenden Ceramidproduktion einen Mechanismus darstellen kann, durch welchen einige Zelltypen die Resistenz gegenüber Röntgenstrahlen entwickeln.
Von der Umwandlung von Sphingosin zu Sphingosin-1-Phosphat wurde gezeigt, dass sie die ceramidinduzierte Apoptose inhibiert (Cuvillier et al., 1996). Daher können andere Lipidmetaboliten des Ceramids dem Todesweg entgegenwirken, wie kürzlich von Cuvillier et al. (1996) vorgeschlagen wurde. Diese Untersuchungen zeigen, dass eine erhöhte Sphingosinkinaseaktivität einen alternativen Weg darstellen kann, wie Zellen eine Resistenz gegenüber Röntgenstrahlen erwerben können. Diese Daten zeigten, dass sowohl die strahlungsresistenten als auch die wildtypischen Zelllinien gleichermaßen empfindlich sind gegenüber sowohl exogenem Ceramid als auch der Inhibierung der Sphingosinkinase und unterstützen ferner die Hypothese, dass der Verlust der Ceramidsignalgebung nach Röntgenstrahlen für den Resistenzphänotyp verantwortlich ist, was nahe legt, dass Tumorzellen in vivo durch einen ähnlichen Mechanismus resistent gegenüber Apoptose werden können.
Während ein Verlust der Aktivierung neutraler Sphingomyelinase und der Ceramidproduktion die Apoptose verhindert, erleidet die OE-Zelllinie einen mitotischen oder Teilungstod zu einem späteren Zeitpunkt. Die frühe apoptotische Reaktion von JM-Zellen, nach ionisierender Strahlung in die Apoptose einzutreten, ist teilweise abhängig von der Aktivierung neutraler Sphingomyelinase und von einem Anstieg in der Ceramidproduktion. Das Fehlen einer kontinuierlichen Zellproliferation nach der ersten oder zweiten mitotischen Teilung ist dennoch konsistent mit früheren Untersuchungen, die zeigen, dass Röntgenbestrahlung Tumorzellen durch mehrere Mechanismen tötet (Dewey et al., 1995; Szumiel, 1994; Kolesnick et al., 1994; Aldridge et al., 1995).
Von der Ceramidproduktion wird vorgeschlagen, dass sie die Abtötung der Zellen durch mehrere andere DNA-schädigende Wirkstoffe, einschließlich Daunorubizin und 1-β-D-Arabinofuranosylcytosin (ara-C), vermittelt (Strum et al., 1994; Bose et al., 1995). Der Verlust der Ceramidproduktion kann daher einen generellen Mechanismus der Resistenz gegenüber mehreren Formen von antineoplastischen Therapien, die zur Schädigung der DNA dienen, darstellen. Konventionelle Strategien haben sich bislang darauf beschränkt, DNA-schädigende Wirkstoffe als Strahlungssensibilisierer zu verwenden (Vokes und Weichselbaum, 1990; Horton et al., 1995). Diese Daten legen auch nahe, dass die Erhöhung der Ceramidproduktion zur Induktion von Apoptose eine zusätzliche Strategie für die Abtötung von Zellen in der Krebstherapie sein kann.
BEISPIEL 7
Strahlungsresistente Zellen, die immun gegen andere Apoptoseinduktoren sind, sind nicht immun gegenüber Chelerythrin-induzierter Apoptose
Unter Verwendung bereits beschriebener Verfahren (Chmura, 1996; Chmura et al., 1996a; Chmura et al., 1996b) wurden drei verschiedene apoptose-resistente Zelllinien auf ihre Empfindlichkeit gegenüber Apopotose, die durch Chelerythrin induziert wird, untersucht. Die drei verwendeten Zelllinien waren bcl-x WEHI-231, die WEHI-231-Zellen darstellen, die mit bcl-x transfiziert wurden und gegenüber strahlungsinduzierter Apoptose hoch resistent sind, MG-Zellen und die im vorhergehenden beschriebenen WEHI-231 OE(JM)-Zellen.
Alle drei Zelllinien wurden mit Chelerythrin und Röntgenbestrahlung wie im Vorhergehenden beschrieben behandelt (Chmura et al., 1996a; Chmura et al., 1996b), wobei folgende Modifikationen eingefügt wurden: Zellen wurden gegenüber YVAD-cmk (100 μM) prä-exponiert, einem Proteaseinhibitor der Interleukin 1-b konvertierenden Enzym(ICE)-Unterfamilie oder gegenüber ZVAD (20 μM), das die cpp32β-Familie von Proteasen inhibiert, wobei die Prä-Exposition für 30 Minuten vor der Behandlung mit Chelerythrin erfolgte.
Überraschenderweise blockierte die Überexpression des anti-apoptotischen Proteins bcl-x nicht die Chelerythrin-induzierte Apoptose (12). Dieses Ergebnis ist unerwartet, weil bcl-x in der Lage ist, die Induktion von Apoptose durch die meisten bekannten Apoptoseinduktoren zu blockieren (Bose et al., 1995; Chen et al., 1995; Choi et al., 1995; Datta et al., 1996; Datta et al., 1995; Emoto et al., 1995). Die anderen zwei Zelllinien waren ebenfalls nicht resistent gegenüber Chelerythrin (12).
Die Exposition gegenüber YVAD-cmk verhinderte nicht die Chelerythrin-induzierte Apoptose, nicht einmal bei geringen Dosen von Chelerythrin. Jedoch blockierte die Exposition gegenüber ZVAD die Chelerythrin-reduzierte Apoptose, sogar bei Dosen größer als 15 μM Chelerythrin.
Diese Ergebnisse legen nahe, dass bcl-x stromaufwärts von cpp32β wirkt, um Apoptose zu verhindern, und dass Chelerythrin die Protease cpp32β direkt aktiviert.
LITERATURHINWEISE

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Claims

Verwendung von Chelerythrin für die Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung des Wachstums einer Tumorzelle, für die Induktion der Apoptose in einer Tumorzelle oder zum Abtöten einer Tumorzelle, wobei das Chelerythrin solchermaßen formuliert ist, dass seine Verabreichung in Kombination mit ionisierender Strahlung möglich ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Chelerythrin solchermaßen formuliert ist, dass seine Verabreichung gleichzeitig mit, vor oder nach der Verabreichung dieser ionisierenden Strahlung möglich ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Medikament so formuliert ist, dass eine Verabreichung einer Dosis von etwa 0,5 bis etwa 10 mg Chelerythrin/kg, insbesondere einer Dosis von etwa 1 bis etwa 4 mg Chelerythrin/kg möglich ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die ionisierende Strahlung ausgewählt wird aus γ-Bestrahlung, Röntgenbestrahlung, Mikrowellenbestrahlung und ultravioletter Bestrahlung.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die ionisierende Strahlung solchermaßen formuliert ist, dass eine Verabreichung einer Gesamtdosis der ionisierenden Strahlung von etwa 1 Gy bis etwa 80 Gy, insbesondere von etwa 70 Gy möglich ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Tumorzelle eine Hautkrebszelle, eine Prostatakrebszelle, eine Lungenkrebszelle, eine Gehirnkrebszelle, eine Brustkrebszelle, eine Eierstockkrebszelle, eine Gebärmutterhalskrebszelle, eine Leberkrebszelle, eine Bauchspeicheldrüsenkrebszelle, eine Dickdarmkrebszelle, eine Magenkrebszelle oder eine Blutkrebszelle ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Tumorzelle eine menschliche Tumorzelle ist.
Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei das Chelerythrin für eine systemische oder lokale Verabreichung oder für eine direkte Verabreichung an eine Tumorgeschwulst, die die Tumorzelle enthält, oder für eine direkte Verabreichung an einen resezierten Tumorherd, der diese Tumorzelle enthält, formuliert ist.
Verwendung von Chelerythrin für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer menschlichen Krebserkrankung, wobei das Chelerythrin solchermaßen formuliert ist, dass seine Verabreichung in Kombination mit ionisierender Strahlung möglich ist.
Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei das Medikament solchermaßen formuliert ist, dass eine Verabreichung einer Dosis von etwa 0,5 bis etwa 10 mg Chelerythrin/kg, insbesondere einer Dosis von etwa 1 bis etwa 4 mg Chelerythrin/kg möglich ist.
Verwendung gemäß Anspruch 9 oder 10, wobei die ionisierende Strahlung ausgewählt wird aus γ-Bestrahlung, Röntgenbestrahlung, Mikrowellenbestrahlung und ultravioletter Bestrahlung.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die ionisierende Strahlung solchermaßen formuliert ist, dass eine Verabreichung einer Gesamtdosis der ionisierenden Strahlung von etwa 1 Gy bis etwa 80 Gy, insbesondere von etwa 70 Gy möglich ist.