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Die
vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Krebsbehandlung
und Strahlentherapie. Im Besonderen betrifft sie eine Kombination
geringer Dosen des Proteinkinase C(PKC)-Inhibitors Chelerythrin
mit geringen Dosen ionisierender Strahlen, so dass ein unerwartet
wirksames Abtöten
strahlenresistenter Tumorzellen bewirkt wird.
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Bestimmte
Krebsbehandlungsverfahren, einschließlich der Strahlentherapie,
gehen mit einer Schädigung
der DNA der Krebszelle einher. Die zelluläre Reaktion auf eine DNA-Schädigung beinhaltet
eine Aktivierung der DNA-Reparatur, eine Zellzyklusarretierung und
Letalität
(Hall, 1988). Das durch ionisierende Strahlen (IR; Röntgen-Bestrahlung)
vermittelte Abtöten
von Säugetierzellen
wird häufig
durch den Verlust der reproduktiven Integrität nach einer oder mehr Zellteilung(en)
beschrieben (Chang und Little, 1992a, 1991, 1992b; Bussink et al.,
1996). Die Induktion von DNA-Doppelstrangbrüchen führt zu letalen Chromosomenaberrationen, die
Deletionen, dizentrische Chromosomen, Ringe und Anaphasenbrücken beinhalten
(Hall, 1994). Die morphologischen Charakteristiken von Zellen, die
nach einer IR-Bestrahlung einen mitotischen Tod sterben, beinhalten,
wie im Fall eines nekrotischen Todes, vielkernige Riesenzellen,
Zell-Zell-Fusionen (Hall, 1994) sowie den Verlust der Membranintegrität (Quintans
et al., 1994; Maity et al., 1994; Harmon und Allan, 1988; Radford und
Murphy, 1994). Im Unterschied zum nekrotischen Tod beinhalten die
morphologischen Charakteristiken einer durch IR induzierten Apoptose
(Quintans et al., 1994; Maity et al., 1994; Harmon und Allan, 1988;
Radford und Murphy, 1994) die Aktivierung eines genetischen Programms,
das durch zytoplasmatische oder nukleäre Ereignisse initiiert werden
kann, und welches eine zytoplasmatische Blasenbildung, Chromatinkondensation
und DNA-Fragmentierung zur Folge hat (Jacobson et al., 1994; Raff
et al., 1994).
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Untersuchungen
in Tumorsystemen legen nahe, dass die Erhöhung des Anteils an Tumorzellen,
die in die Apoptose eingehen, die Tumorregression und Tumorheilungen
mit IR verbessert (Meyn et al., 1993; 1994; 1995; Martin und Green,
1994; Indap und Rao, 1995; Dewey et al., 1995; Lowe et al., 1993b;
Stephens et al., 1991; 1993). Wirkstoffe, welche die DNA schädigen, die
DNA-Reparatur stören
oder Kontrollpunkte des Zellzyklus verändern, wurden mit begrenztem
klinischen Erfolg in Studien am Menschen angewendet, um die strahlungsvermittelte
Tumorreaktion zu modifizieren (Hall, 1988; Vokes und Weichselbaum,
1990; Rosenthal et al., 1995). Wahrscheinlich teilweise deswegen,
weil der Verlust der apoptotischen Reaktion auf Röntgen-Bestrahlung
mit einem strahlungsresistenten Phänotyp in Verbindung gebracht
werden konnte. Eine Strahlungsresistenz des Tumors kann durch eine
Aktivierung von DNA-Reparaturgenen und von Zellzyklus-Kontrollpunkten
auftreten (Maity et al., 1994; Sanchez und Elledge, 1995; Szumiel,
1994; Park, 1995; Shen et al., 1996; McKenna et al., 1991). Beispielsweise
ist ein Verlust der p53-Funktion in Folge einer verminderten Fähigkeit, in
die Apoptose einzugehen, mit einem strahlungsresistenten Phänotyp (Boise
et al., 1995) und häufig
mit einer Behandlungsresistenz und einem Tumorrezidiv verbunden
(Lowe et al., 1993a; 1993b; 1994). Ein erhöhtes Verhältnis von anti-apoptotischen zu
pro-apoptotischen Proteinen vermindert ebenfalls die IR-induzierte
Apoptose.
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Es
wurde gezeigt, dass eine Aktivierung der Sphingomyelinase und anschließende Ceramidproduktion
einer durch Röntgenstrahlen
induzierten Apoptose in mehreren Zelltypen vorausgeht (Quintans
et al., 1994; Haimovitz-Friedman et al., 1994; Verheij et al., 1996;
Kolesnick, 1994; Jarvis und Kolesnick, 1996; Santana et al., 1996).
Kürzlich
wurde gezeigt, dass der auf Röntgenstrahlen
folgende Verlust der Ceramidproduktion Zellen, die aus einer Knockout-Maus
für eine
saure Sphingomyelinase stammen, und Tumorzellen, die auf Grund eines
Defekts in der Produktion einer neutralen Sphingomyelinase ausgewählt wurden,
einen strahlungsresistenten Phänotyp
verleiht. Darüber
hinaus induzieren Chelerythrinchlorid (Herbert et al., 1990) und
Calphostin C (Kobayashi et al., 1989b), Inhibitoren von PKC-Isoformen,
die Apoptose und Ceramidproduktion durch die Aktivierung einer neutralen
Sphingomyelinase (Chmura et al., 1996a; Chmura et al., 1996b).
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Ionisierende
Strahlung induziert PKC- und Protein-Tyrosin-Kinase-Aktivitäten (Hallahan
et al., 1990; Uckun et al., 1995). Allerdings sind die für diese
Aktivitäten
verantwortlichen spezifischen Kinasen und ihre Substrate nicht vollständig verstanden.
Die PKC-Aktivierung ist funktional mit der Geninduktion verwandt,
die erfolgt, wenn Säugetierzellen
IR ausgesetzt werden (Young et al., 1994; Kondratyev et al., 1996;
Hallahan et al., 1995; Hallahan et al., 1994). Die Proteinkinase
C-Familie von Serin/Threonin-Kinasen umfasst mindestens 13 verwandte
Isoformen (Magnuson et al., 1994) mit unterschiedlicher Sensitivität gegenüber Calzium
und Lipid-Aktivatoren. Von der PKC-Aktivierung wurde auch berichtet,
dass sie die Produktion von Ceramid aus der Hydrolyse von Sphingomyelin
limitiert und Zellen aus der IR-vermittelten Apoptose rettet (Kolesnick
et al., 1994; Haimovitz-Friedman et al., 1994).
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Bezüglich der
Beziehung zwischen PKC-Inhibitoren und der Induktion des programmierten
Zelltods in humanen Tumorzellen ist wenig Information verfügbar, und
die Ergebnisse, die in den bestehenden Berichten beschrieben sind,
sind inkonsistent. Beispielsweise wurde von dem potenten, aber unspezifischen,
PKC-Inhibitor Staurosporin berichtet, die Apoptose in HL-60-Zellen
sowohl zu antagonisieren (Cotter et al., 1992) als auch zu initiieren
(Bertrand et al., 1993); ebenso sind widersprüchliche Berichte über die
Wirkung des Inhibitors H7 aufgetaucht (Ojeda et al., 1990; Forbes
et al., 1992). Detaillierte Vergleiche von Konzentrations-/Reaktionsbeziehungen
verschiedener PKC-Inhibitoren
bei der Modulation der Apoptose fehlen im Allgemeinen. Jarvis et al.
(1994) zeigen, dass, während
die Effekte dieser Wirkstoffe variabel und in hohem Maß von der
Konzentration abhängig
sind, eine transiente Exposition von HL-60-Zellen gegenüber ausgewählten PKC-Inhibitoren,
im Besonderen Chelerythrin, eindeutig eine apoptotische DNA-Fragmentation
und den Zelltod in HL-60-Zellen induziert und dass eine akute (d.
h. 6 h) Exposition gegenüber
Chelerythrin ausreichend ist, um in der humanen myeloischen Leukämie-Zelllinie
HL-60 Apoptose zu induzieren. Darüber hinaus erhöht eine
in vitro Behandlung bestimmter Zellen mit PKC-Inhibitoren und anderen
Serin/Threonin-Kinasen die IR-vermittelte
Abtötung mittels
undefinierter Mechanismen (Hallahan et al., 1992).
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Neueste
Forschungen deuten darauf hin, dass Signalisierungsereignisse, die
einer Exposition gegenüber
Tumornekrosefaktor alpha (TNFα),
Fas-Ligand, einer IgM-Vernetzung, einer Bestrahlung und anderen DNA-schädigenden
Wirkstoffen folgen, die Apoptose auf dem Weg der Hydrolyse von Membran-Sphingomyelin,
die zur Herstellung von Ceramid führt, auslösen (Quintanas et al., 1994;
Nagata und Golstein, 1995; Dressler et al., 1992). Die Aktivierung
der Proteinkinase C durch Phorbolester oder Wachstumsfaktoren wirkt der
Ceramid-induzierten Apoptose entgegen, und indirekte Indizien weisen
darauf hin, dass die PKC-Aktivierung die Ceramidproduktion limitieren
kann (Fuks et al., 1994; Haimovitz-Friedman et al., 1994a; Haimovitz-Friedman
et al., 1994b). Eine mögliche
Wirkung von Ceramid und seinem Metaboliten Sphingosin besteht darin,
dass die Aktivierung spezifischer PKC-Isoformen verhindert wird (Chmura et
al., 1996b; Jones und Murray, 1995; Kolesnick, 1989; Ohta et al.,
1994). Zusammen genommen legen diese Studien nahe, dass eine PKC-Aktivierung
den Wirkungen der Ceramidproduktion im Apoptotoseweg entgegenwirkt.
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Neuste
Studien, welche die Mechanismen der strahlungsvermittelten Apoptose
untersuchen, zeigen, dass die sofort nach den Röntgenstrahlen folgende Produktion
des sekundären
Lipid-Botenstoffs Ceramid aus der Hydrolyse von Sphingomyelin zur
apoptotischen Reaktion beiträgt
(Kolesnick et al., 1994; Haimovitz-Friedman et al., 1994b; Verheij
et al., 1996). Zwei Formen der Sphingomyelinase sind mit der Herstellung
von Ceramid nach Röntgenstrahlen
in Zusammenhang gebracht worden. Die Beteiligung der Mg++-abhängigen neutralen
Sphingomyelinase wurde zuerst als Quelle der Ceramidherstellung
an der Membran nach ionisierender Strahlung in Endothelzellen nahe
gelegt (Haimovitz-Friedman et al., 1994). Kürzlich zeigten Santana et al., dass
Gewebe und Zellen aus Knockout-Mäusen
für eine
saure Sphingomyelinase resistenter gegenüber einer ionisierender Strahlung
folgenden Apoptose sind (Santana et al., 1996). Diese Studie brachte
die saure Sphingomyelinase als ein Bestandteil der apoptotischen
Reaktion in einigen Geweben ins Spiel.
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Ein
großer
Teil der Signalwechselwirkung der PKC-Isoformen innerhalb von Tumorzellen
muss noch aufgeklärt
werden. Es ist klar, dass die PKC-Wege eine Schlüsselrolle in der Kontrolle
der Apoptose durch Tumorzellen spielen. Es ist auch offensichtlich,
dass diese Wege in strahlungsresistenten Tumorzellen verändert sind,
was zu einer erhöhten
Erschwernis bei der Behandlung dieser Tumortypen führt. Es
gibt ein derzeitiges Bedürfnis,
neue und verbesserte Behandlungen zu entwickeln, welche die Resistenz
gegenüber
Apoptose in strahlungsresistenten Tumoren überwinden.
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Die
Erfindung stellt die Verwendung von Chelerythrin für die Herstellung
eines Medikaments zur Inhibierung des Wachstums einer Tumorzelle
bereit, wobei Chelerythrin auf eine Weise formuliert ist, die seine Verabreichung
in Kombination mit ionisierender Strahlung erlaubt.
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Um
das Wachstum einer Tumorzelle zu inhibieren, wird sie mit Chelerythrin
in Berührung
gebracht bevor sie mit der ionisierenden Strahlung in Berührung gebracht
wird. Alternativ wird die Tumorzelle mit ionisierender Strahlung
in Berührung
gebracht, bevor sie mit Chelerythrin in Berührung gebracht wird, oder das
Chelerythrin und die ionisierende Strahlung werden gleichzeitig
mit der Tumorzelle in Berührung
gebracht.
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Die
Erfindung sieht vor, dass die Dosis von Chelerythrin etwa 0,5 mg/kg
bis etwa 10 mg/kg ist, und vorzugsweise, dass die Dosis von Chelerythrin
etwa 1 mg/kg bis etwa 4 mg/kg ist.
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Die
Erfindung sieht ferner vor, dass die ionisierende Strahlung aus
der Gruppe ausgewählt
wird, die aus γ-Strahlung,
Röntgen-Strahlung,
Mikrowellenstrahlung und Ultraviolettstrahlung besteht, wobei die
Gesamtdosis der ionisierenden Strahlung etwa 1 Gy bis etwa 80 Gy
ist, aber die Gesamtdosis der Ionisierung vorzugsweise etwa 70 Gy
ist. Die Gesamtdosis der ionisierenden Strahlung wird vorzugsweise
in einer Reihe von Einzeldosen verabreicht.
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Es
wird bevorzugt, dass sowohl das Chelerythrin als auch die ionisierende
Strahlung wenigstens zwei Mal mit der Tumorzelle in Berührung gebracht
werden.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung wird die Tumorzelle aus der Gruppe ausgewählt, die
aus einer Hautkrebszelle, einer Prostatakrebszelle, einer Lungenkrebszelle,
einer Hirntumorzelle, einer Brustkrebszelle, einer Eierstockkrebszelle,
einer Gebärmutterhalskrebszelle,
einer Leberkrebszelle, einer Bauchspeicheldrüsenkrebszelle, einer Dickdarmkrebszelle,
einer Magenkrebszelle und einer Leukämiezelle besteht. In einer weiteren
Ausführungsform
der Erfindung ist die Tumorzelle eine humane Tumorzelle.
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In
einem weiteren Aspekt der Erfindung ist das Chelerythrin formuliert,
wie es im Anspruch 8 spezifiziert ist.
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Die
Erfindung stellt auch die Verwendung von Chelerythrin für die Herstellung
eines Medikaments zur Induktion von Apoptose in einer Tumorzelle
bereit, wobei Chelerythrin auf eine Weise formuliert ist, die seine Verabreichung
in Kombination mit ionisierender Strahlung erlaubt.
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Schließlich ist
das Medikament zum Abtöten
einer Tumorzelle.
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Die
Erfindung stellt ferner die Verwendung von Chelerythrin für die Herstellung
eines Medikaments zur Behandlung von Krebs in einem humanen Patienten
bereit, wobei Chelerythrin auf eine Weise formuliert ist, die seine
Verabreichung in Kombination mit ionisierender Strahlung erlaubt.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung wird der Krebs aus der Gruppe ausgewählt, die
aus Hautkrebs, Prostatakrebs, Lungenkrebs, Hirntumor, Brustkrebs,
Eierstockkrebs, Gebärmutterhalskrebs,
Leberkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs,
Dickdarmkrebs, Magenkrebs und Leukämie besteht.
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Mit
anderen Worten potenziert Chelerythrin den Effekt ionisierender
Strahlung auf eine Tumorzelle, wenn die Tumorzelle mit Chelerythrin
in Berührung
gebracht wird und dann die Tumorzelle mit ionisierender Strahlung
in Berührung
gebracht wird.
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Wie
hierin definiert, betrifft die Behandlung eines Krebses, eines Tumors,
einer Tumorzelle, einer Krebszelle, eines Gewebes, das von einem
Tumor abstammt, oder eines kanzerösen Gewebes jegliche Verbesserung
im Vergleich mit dem unbehandelten Zustand, was Stabilisierung,
Remission, Regression, Schrumpfung oder verringertes Volumen des
Krebses, Tumors, Gewebes oder der Zelle beinhaltet, ist aber nicht
darauf begrenzt.
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Die
folgenden Abbildungen sind Teil der vorliegenden Beschreibung und
werden eingebunden, um bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung
weiter darzulegen. Die Erfindung kann mit Bezug auf eine oder mehrere
dieser Abbildungen in Kombination mit der detaillierten Beschreibung
der spezifischen Ausführungsformen,
die hierin präsentiert
sind, besser verstanden werden.
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1:
Chemische Struktur von Chelerythrin
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2:
Chelerythrinchlorid verstärkte
die IR-vermittelte Abtötung
von Zellen durch Teilungstod. Das clonogenische Überleben wurde nach Exposition
gegenüber
steigenden Konzentrationen von Chelerythrin und ionisierender Strahlung
gemessen. Zellen wurden in Zellzahlen zwischen etwa 500 Zellen/Platte
und etwa 2000 Zellen/Platte plattiert und vor der Bestrahlung für 30 Minuten
mit 0 μM,
0,5 μM oder
1.0 μM Chelerythrinchlorid
behandelt. Nach 2 Wochen wurden die Kolonien als überlebend
gewertet, wenn sie aus mehr als 50 Zellen bestanden. Die Resultate
stellen die Mittelwerte dreier Einzelexperimente mit Doppel- oder
Dreifachbestimmungen dar. Fehlerbalken stellen den +/– Standardfehler
der Mittelwerte (SEM) dar.
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3A–3E:
Propidiumiodidfärbung
Chelerythrin-behandelter SQ20-B-Zellen zeigt, dass zVAD-fmk den
programmierten Zelltod inhibiert. M1 definiert die % apoptotischer
Zellen, wie sie durch (a) die Propidiumiodidaufnahme von 1 log,
oder mehr, Fluoreszenz und (b) einer Abnahme der Zellgröße um 50% oder
mehr definiert sind. FL3-Höhe
gibt die Aufnahme von Propidium durch die Zelle an. In 3A,
M1 = 5%; 3B, M1 = 22%; 3C,
M1 = 73%; 3D, M1 = 16%; 3E,
M1 = 24%.
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4:
Lebensfähigkeit
von SQ20B-Zellen 72 Stunden nach Behandlung mit Bestrahlung und
Chelerythrin in vitro.
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5A:
Aktivität
der neutralen und sauren Sphingomyelinase wurde nach einer gleichzeitigen
Behandlung mit Chelerythrin und ionisierender Strahlung verstärkt. Für die Sphingomyelinaseaktivität wurde
der gemischte Mizellenassay verwendet, um die erhöhte enzymatische
Aktivität
zu quantifizieren. Im Vergleich zur Kontrolle zeigte Bestrahlung
alleine keine erhöhte
Sphingomyelinaseaktivierung. Die Behandlung der Zellen mit Chelerythrin
erhöhte
die Sphingomyelinaseaktivität
auf etwa 212% und etwa 179% bezüglich
der neutralen bzw. sauren Sphingomyelinase im Vergleich zur Kontrolle.
Die kombinierte Behandlung von Zellen mit Röntgenstrahlen und Chelerythrin
erhöhte
sowohl die neutralen als auch sauren Sphingomyelinaseaktivitäten auf durchschnittlich
etwa 200% bzw. etwa 170% der Kontrolle.
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5B:
Wirkungen von Bestrahlung (20 Gy), von Tumornekrosefaktor alpha
(TNFα) und
von der Kombination von Bestrahlung (20 Gy) und TNFα (5 ng) auf
die Aktivierung der neutralen und sauren Sphingomyelinase im SQ20B-Modell,
wie sie mit dem Sphingomyelinase-Assay 5 Minuten nach der Bestrahlung
gemessen wurden.
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5C:
Die Zugabe von Ceramid zu bestrahlten Kulturen verringerte das clonogenische Überleben. Geschlossene
Kreise stellen Strahlung alleine dar; geschlossene Rechtecke stellen
die Zugabe von 20 μM C2-Ceramid
30 Minuten vor Röntgenbestrahlung
dar.
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6:
Das SQ-20B Xenograftsystem wurde verwendet, um die therapeutische
Wirksamkeit der kombinierten Behandlungsweise über 30 Tage hinweg zu bewerten.
Vierzig Tiere (n = 40) wurden in jeder Gruppe behandelt, und das
%-durchschnittliche Tumorwachstum wurde für alle Tiere bestimmt. Um das
Tumorwachstum zu messen, wurden Greifzirkel verwendet. Die Kombination
einer nicht-letalen Dosis Chelerythrin (Wirkstoff) mit 50 Gy IR
(5 Gy-Einzeldosen über
2 Wochen) verringerte das Tumorvolumen und erhöhte die Zellabtötung im
Vergleich zu jeder Behandlung alleine (P < 0,001 Mann-Whitney Rank Summentest).
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7A:
Die Inhibierung von PKC verursacht eine Erhöhung der Ceramidproduktion
durch die Aktivierung einer neutralen Sphingomyelinase und senkt
die Sphingomyelinkonzentration. Die Ceramidproduktion wurde unter
Verwendung des DAG-Kinase-Assays in WEHI-231 JM-Zellen quantifiziert,
und eine Gesamtlipidextraktion wurde verwendet, um die Sphingomyelinmasse
zu ermitteln. Nach Zugabe von 10 μM
Chelerythrin wurden die Zellen zu geeigneten Zeitpunkten wie hierin
beschrieben lysiert. Jeder Messpunkt stellt die von einem Basiswert
ausgehende durchschnittliche prozentuale Veränderung in der Ceramid- oder
Sphingomyelinherstellung dar, die für alle, mit Ausnahme der mit
* markierten, Zeitpunkte aus wenigstens 8 unabhängigen Untersuchungen stammt.
Standardabweichungen sind mit Fehlerbalken angegeben. Beim Zeitpunkt
,2 Stunden' war
keine Veränderung
der Lebensfähigkeit
oder Zellgröße zu ermitteln,
wie mittels des Propidiumiodid-Ausschlusses
und FACS untersucht wurde.
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7B:
Calphostin C-induzierte Ceramidproduktion und verringerte Sphigomyelinkonzentrationen. Die
Ceramidproduktion und Sphingomyelinmasse wurde identisch zu der
im Fall von Chelerythrin quantifiziert. Zellen wurden 2 Stunden
nach Zugabe von 250 nM Calphostin C lysiert. Die von einem Basiswert
ausgehende durchschnittliche prozentuale Veränderung in der Ceramid- und Sphingomyelinherstellung
stammt aus wenigstens drei unabhängigen
Untersuchungen. Standardabweichungen sind mit Fehlerbalken angegeben.
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7C:
Graph der Aktivität
neutraler und saurer Sphingomyelinase, normalisiert auf Prozent
der Kontrolle. Zellen (2 × 107) wurden vor der Messung der Aktivität neutraler
und saurer Sphingomyelinase 30 Minuten mit Chelerythrin behandelt.
Fehlerbalken stellen den +/– SEM
aus 4 einzelnen Untersuchungen mit Doppelbestimmungen dar.
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8A–8C:
Exogene Ceramid- und PKC-Inhibierung induziert oxidative Veränderungen
in WEHI-231-Zellen. WEHI-231-Zellen (1 × 106)
wurden 2 Stunden mit anti-IgM-Antikörpern (8A), 15
Minuten mit 30 μM
exogenem Ceramid (8B) oder 15 Minuten mit 10 μM Chelerythrin
(8C) behandelt. Die reaktive Sauerstoffspezies
wurde anschließend
unter Verwendung von Dichloridhydrofluorescein (DCHF-DA) gemessen
und unter Verwendung einer FACS-Analyse quantifiziert. Die Histogrammanalyse
der Fluoreszenz ist als LOG-Funktion aufgetragen. Der graue Bereich
stellt die Kontrollzellen dar, während
die darüber
gelegte linienförmige
graphische Darstellung die behandelten Zellen darstellt.
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9A:
Zeitverlauf der Ceramidproduktion in bestrahlten (8 Gy) WEHI-231
JM(Rauten)- und OE(schwarze
Quadrate)-Zellen. Die Daten (mittlere +/– Standardabweichung) stellen
wenigstens 4 unabhängige
Untersuchungen dar, in denen *p < 0,002
im Vergleich mit unbestrahlten Kontrollen ist.
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9B:
Graph der in vitro-Aktivität
neutraler und saurer Sphingomyelinase, normalisiert auf Prozent der
Kontrolle. Die Daten (mittlere +/– SEM) stammen aus 4 unabhängigen Untersuchungen
mit 2 oder mehr Bestimmungen, in denen p < 0,04 für die Aktivität neutraler
Sphingomyelinase in WEHI-231 JM-Zellen (t-Test nach Student) im
Vergleich mit unbestrahlten Kontrollen ist.
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10A: WEHI-231 OE-Zellen waren relativ
apoptoseresistent im Vergleich mit den JM-Zellen, bleiben jedoch sensitiv gegenüber Ceramid-induzierter
Apoptose. Terminale Transferase- und FACS-Analyse von WEHI-231 JM-
und OE-Zellen 24 Stunden nach der Behandlung (+/–) mit 10 Gy zu den angezeigten
Zeitpunkten. Zellen wurden mittels Flusscytometrie (FACS) auf einem
FACScan (Becton-Dickson) unter Verwendung der Lysis II-Sofware analysiert,
wobei die FL2- und FSH-Kompensation
auf 50% bzw. 25% gesetzt war. Abszisse: Zellanzahl; Ordinate: log
der Fluoreszenz der DNA-Fragmentierung. R2 enthält die apoptotischen Zellen,
wie sie gegen F15-12-Zellen der Positivkontrolle gewertet wurden,
und ist graphisch als geschwungene Linie dargestellt. Der geschätzte Prozentsatz
der in R2 eingerahmten apoptotischen Zellen ist gezeigt (%) und beruht
auf den ursprünglichen
Zellzählungsdaten.
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10B: WEHI-231 OE-Zellen proliferieren nach einer
Bestrahlung mit 8 Gy weiter. 4–5 × 105 exponentiell wachsende JM- oder OE-Zellen
wurden bestrahlt und für
Zeitabschnitte zwischen 6 und 72 Stunden zurück in den Inkubator gebracht.
Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden die Zellen, die das Tryptan-Blau ausscheiden,
unter Verwendung eines Hämocytometers
gezählt
und als lebensfähig
gewertet. Die Daten (Mittelwert aus wenigstens 2 Experimenten mit
Doppelbestimmungen +/– Standardabweichung)
sind als Prozentsatz der ursprünglich
gezählten
Zellzahl an überlebenden
Zellen ausgedrückt.
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11A: Exogenes Ceramid kann WEHI-231 OE-Zellen
gegenüber
strahlungsvermittelter Apoptose sensibilisieren. C2-Ceramid (Cer)
wurde zu 3 × 105 WEHI-231 OE-Zellen 30 Minuten vor der Behandlung
mit 8 Gy hinzugefügt.
Apoptose wurde unter Verwendung von Propidiumiodidfärbung (PI)
und FACS-Analyse quantifiziert. Prozent apoptotischer Zellen sind
in R2 eingerahmt vierundzwanzig Stunden nach der Bestrahlung gezeigt.
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11B: WEHI-231 JM- und OE-Zellen sind gleich sensitiv
gegenüber
der Inhibierung der Sphingosinkinase und gegenüber exogenem Ceramid. Zellen
wurden mit steigenden Konzentrationen von C2-Ceramid oder DL-Threo-dihydrosphingosin – einem
potenten Inhibitor der Sphingosinkinase – behandelt. Die Lebensfähigkeit
wurde 24 Stunden nach der Behandlung unter Verwendung von PI-Färbung und FACS-Analyse bestimmt.
Der Graph zeigt den Mittelwert von 3 Untersuchungen mit Doppelbestimmungen.
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12:
Lebensfähigkeit
resistenter WEHI-231 OE(JM)-, MG(MG)- und WEHI-231-Zellen, die mit bcl-x(bcl-x)-Zellen
transfiziert wurden, 30 Minuten nach Exposition gegenüber steigenden
Konzentrationen Chelerythrin.
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Die
vorliegende Erfindung zeigt, dass Chelerythrinchlorid nach einer
IR den apoptotischen Schwellenwert in Tumorzellen, besonders in
strahlungsresistenten Zellen, herabsetzt. Der Induktion der Apoptose
durch die Kombination von Chelerythrin und IR geht die Aktivierung
sowohl von neutralen als auch sauren Sphingomyelinasen voraus. Überraschenderweise
findet diese Induktion der Apoptose durch die Kombination einer Chelerythrin-
und IR-Behandlung bei Dosen statt, die viel niedriger sind als man
sie auf Grund konventioneller Technologie und Behandlungen erwarten
würde.
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Die
Kombinationsbehandlung von Tumorzellen mit IR und Chelerythrin erhöht die Apoptose
und ist von einer Aktivierung der Kaspasen abhängig. Diese Daten sind mit
neuesten Berichten konsistent, die zeigen, dass IR und Ceramid Apoptose
durch die Aktivierung von CPP32 und anderen Kaspasen induzieren
(Kufe, 1996). Chelerythrinchlorid verstärkt die durch ionisierende
Strahlung induzierte Apoptose, indem es auf die üblichen Komponenten des Zelltodregulationswegs
abzielt, die für
die Apoptose benötigt
werden, und überwindet das
Unvermögen
der Zellen, in vitro und in vivo in die durch Strahlung induzierte
Apoptose einzugehen.
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Der
beobachtete mit der Teilung und Mitose verbundene Tod nach IR bei
geringen Chelerythrinkonzentrationen trägt zur Reduktion des Tumorvolumens
in vivo bei. Das Ansteigen der mitotischen Todesrate nach einer
kombinierten Strahlungs- und Chelerythrinbehandlung stellt einen
nicht-apoptotischen und daher nicht-überlappenden Mechanismus der
Tumorzellabtötung
dar. Die vorliegende Erfindung zeigt ein Ansteigen der Tumorzellzerstörung im
Vergleich zum umgebenden normalen Gewebe und weist darauf hin, dass
Chelerythrin in Verbindung mit IR ein klinisch nützliches Werkzeug darstellt,
um die letalen Effekte ionisierender Strahlung in Populationen resistenter
Tumorzellen zu verstärken.
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A. Kombination geringer
Dosen von Chelerytrin und Bestrahlung
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Die
Resistenz von Tumorzellen gegenüber
DNA-schädigenden
Wirkstoffen stellt ein Hauptproblem in der klinischen Onkologie
dar. Das Ziel der gegenwärtigen
Krebsforschung besteht darin, Wege zu finden, die Wirksamkeit von
Chemo- und Strahlungstherapie zu verbessern. Im Zusammenhang mit
der vorliegenden Erfindung wird in Erwägung gezogen, dass die Kombination
einer Chemotherapie mit einem PKC-Inhibitor, vorzugsweise Chelerythrin
oder Chelerythrinchlorid, mit einer Strahlungstherapie für einen
therapeutischen Eingriff verwendet werden kann. Ein überraschendes
und unerwartetes Ergebnis der vorliegenden Erfindung besteht darin,
dass die Kombination von Chelerythrin und Strahlung die Verwendung
geringerer Dosen jeder einzelnen Komponente erlaubt, um einen höheren Grad
der Reduktion des Tumorwachstums zu erreichen als auf Grund gegenwärtiger konventioneller
Strahlungs- und Chemotherapien vorauszusagen gewesen wäre. Daher können toxische
und andere ungünstige
Wirkungen, die Strahlung auf gesunde Zellen, welche der Strahlung während der
Behandlung ausgesetzt sein müssen,
besitzt, durch die Verwendung einer solchen Kombination vermindert
werden.
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Hierin
wird unter Behandlung mit Chelerythrin vorzugsweise die Behandlung
mit Chelerythrinchlorid verstanden.
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Um
Zellen, wie bösartige
oder metastatische Zellen, zu inhibieren oder sogar abzutöten, würde man im
Allgemeinen eine „Zielzelle" mit einem PKC-Inhibitor,
wie Chelerythrin, und mit einer niedrig dosierten ionisierenden
Strahlung in Kontakt bringen. Diese Komponenten würden in
einer kombinierten Menge bereitgestellt werden, die wirksam ist,
um die Proliferation zu inhibieren oder die apoptotische Funktion
wiederherzustellen oder sogar die Zelle abzutöten. Dieses Verfahren kann
das gleichzeitige In-Kontakt-Bringen
der Zellen mit Chelerythrin und Bestrahlung beinhalten; oder mit
Chelerythrin und dann Bestrahlung; oder mit Bestrahlung und dann
Chelerythrin. Die Zellen können
mit einer einzigen Zusammensetzung oder pharmakologischen Formulierung
von Chelerythrin oder mit zwei oder mehr unterschiedlichen Zusammensetzungen
oder Formulierungen von Chelerythrin in Kontakt gebracht werden.
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Bestrahlungsquellen
beinhalten Wellen, die DNA-Schäden
induzieren, wie γ-Strahlung,
Röntgenstrahlung,
UV-Strahlung, Mikrowellen, elektronische Emissionen und Ähnliches.
Bei der Behandlung von Krebs mit dem Medikament gemäß der Erfindung
würde man
die Tumorzellen mit Strahlung mittels der Bestrahlung der lokalisierten
Tumorstelle mit DNA-schädigender
Strahlung, wie Röntgenstrahlung,
UV-Licht, γ-Strahlen
oder sogar Mikrowellen, in Kontakt bringen.
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Es
ist vorgesehen, dass die lokale Zufuhr von Chelerythrin bei Krebspatienten
ein sehr wirksames Verfahren für
die Zufuhr einer therapeutisch wirksamen Menge der Verbindung, die
der klinischen Krankheit entgegenwirken soll, sein wird. In ähnlicher
Weise wird die Strahlungstherapie auf eine besondere, betroffene
Region des Körpers
des Patienten gerichtet. Alternativ ist eine systemische Zufuhr
von entweder Chelerythrin oder Bestrahlung, oder beidem, unter bestimmten
Umständen
geeignet, zum Beispiel, wo eine ausgedehnte Metastasierung stattgefunden
hat.
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B. Chelerytrin, ein Benzophenanthridinalkaloid
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Das
Benzophenanthridinalkaloid Chelerythrin (1,2-Dimethoxy-12-methyl[1,3]benzodioxol[5,6-c]phenanthridinium;
C21H18NO4), auch bekannt als Toddalin, ist entweder
in reiner Form oder als Gemisch mit anderen Benzophenanthridinalkaloiden
aus Chelidonium majus L., Zanthoxylum simulans, Sanguinaria canadensis (oder
kanadisches Blutkraut), Macleaya cordata, Carydali sevctocozii,
Carydali ledebouni, Chelidonium majus M. und anderen Mitgliedern
der Papaveracaceae zu extrahieren. Das Hauptalkaloid in Zanthoxylum
simulans ist Chelerythrin mit geringeren Mengen an Dihydro- und
Oxychelerythrin, N-Acetylanomin, Skimmianin, Fagarin, Sitosterol
und Sesamin. Gray et al., (1980) beschreiben die Extraktion und
Identifizierung von Chelerythrin und anderen Bestandteilen aus Zanthoxylum
simulans.
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Andere
Benzo-c-phenanthridinalkaloide, die in den Pflanzen mit Chelerythrin
vorhanden sein können, beinhalten
unter anderem Sanguinarin, Sanguirubin, Sanguilutin, Homochelidonen,
Chelirubin und Protopin. Reines Chelerythrin ist ebenfalls, obwohl
selten, von einigen Zulieferern für Chemikalien erhältlich.
Teilaufgereinigte Formen von Benzo-c-phenanthridinalkaloiden sind
kommerziell erhältlich,
und diese sind im Allgemeinen als Sanguinarinnitrat und Sanguinarinsulfat
bezeichnet. Diese Salze sind die Salze der gemischten Alkaloide
der Pflanze Sanguinaria und umfassen hauptsächlich Sanguinarin, Chelerythrin
und Protopin.
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Während in
der Literatur nur wenige Hinweise auf die Verwendung irgendeines
der reinen Benzo-c-phenanthridinalkaloide gefunden werden können, werden
Pflanzen, die solche Verbindungen enthalten, seit einiger Zeit zu
medizinischen Zwecken bei einer großen Vielzahl von Beschwerden
verwendet. Zum Beispiel offenbart das US-Patent 209,331 die Verwendung
von Blutkraut, Zinkchlorid und Paraffinöl in gleichen Anteilen für die Behandlung
offener Wunden. US-Patent 433,257 beschreibt eine Salbe aus pulverisiertem Blutkraut,
armenischem Holz (armenian bole), pulverisiertem Harz, Schweinefett
und Stockholmer Teer (Stockholm tar) für die Verwendung in der Behandlung
von Hämorrhoiden,
und US-Patent 2,344,830 offenbart die Verwendung eines Gemisches
aus Zinkchlorid, Stibnit (Antimonglanz) und Blutkraut, um abgestorbenes
Gewebe für
seine operative Entfernung zu fixieren und abzugrenzen. Einige der
Patente, welche die Verwendung von Sanguinaria-Extrakten als antimikrobielle
Wirkstoffe beschreiben sind das US-Patent 4,145,412, das US-Patent
4,406,881 und das US-Patent 4,376,115. Chelerythrin wird auch für die Behandlung
peridontaler Erkrankungen, US-Patent 5,324,520, und in der Thrombosebehandlung,
US-Patent 5,137,912 verwendet. Von Benzo-c-phenanthridinalkaloiden wurde auch gezeigt,
dass sie einige gegen Pilze und Protozoen gerichtete Eigenschaften
besitzen und dass sie die nach einer akuten Krankheit verbleibende
leichte Anämie
und die mit einer rheumatoiden Arthritis assoziierte Anämie lindern.
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In
China verwenden die Menschen die Beeren von Zanthoxylum simulans,
um Schweinefleisch zu würzen.
Die lange und weit verbreitete Verwendung dieses Extrakts in China
zeigt, dass der Extrakt für
den menschlichen Genuss sicher ist. Der Extrakt besitzt keine bemerkenswerten
Nebenwirkungen und bewirkt keine Irritation des Gastrointestinaltrakts.
Vielmehr wurde herausgefunden, dass der Extrakt hilft, gastrointestinale
Irritationen zu mildern, die wegen der Verwendung der anti-inflammatorischen
Wirkstoffe auftreten können, wenn
diese gemeinsam verabreicht werden.
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Chelerythrin
inhibiert spezifisch die Proteinkinase C (PKC) in einer konzentrationsabhängigen Weise und
inhibiert stark die durch starke Aggregationsauslöser, wie
Arachidonsäure
und Kollagen, hervorgerufene Plättchenaggregation.
Seine chemische Struktur ist in 1 gezeigt.
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Inhibitoren
der PKC können
mit der Substratbindestelle (ATP oder Protein) oder mit der regulatorischen
Domäne,
an der die Aktivierung erfolgt (Diacylglycerin- oder Phorbolesterbindestelle),
interagieren. Chelerythrin interagiert direkt mit der katalytischen
Domäne
der PKC. Es ist einer der potentesten bislang identifizierten Inhibitoren
der PKC und inhibiert keine andere der bislang untersuchten Proteinkinasen.
Chelerythrin zeigt starke cytotoxische Effekte gegenüber L-1210
Tumorzellen mit einem IC50-Wert von 0,053 μM durch die Inhibierung
des Zellwachstums und der Differenzierung (Herbert et al., 1990).
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Chelerythrin
weist zweiphasische Konzentrationsreaktionsbeziehungen auf, so dass
die DNA-Fragmentierung
nachlässt
und letzten Endes absinkt, wenn die Wirkstoffkonzentrationen bis über die
maximal wirksamen Konzentrationen hinaus angehoben werden (Jarvis
et al., 1994). Eine Reduktion des DNA-Schadens ist allerdings nicht
mit einer Wiederherstellung der zellulären Lebensfähigkeit assoziiert, was darauf
hinweist, dass andere letale Ereignisse unvermindert voranschreiten.
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Unter
den von Herbert et al. (1990) beschriebenen Bedingungen ist der
IC50-Wert (Konzentration, die eine 50%-ige
Inhibierung verursacht) für
Chelerythrin 0,66 μM
in Ratten. Die Basalaktivität
des Enzyms (die Aktivität
in Abwesenheit von Ca++, Phosphatidylserin
und Diolein) war nicht beeinträchtigt.
In der vorliegenden Erfindung war die LD50 (Dosis,
die eine 50%-ige Mortalität
verursacht) 20 mg/kg intraperitoneal (IP) in Mäusen.
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Eine
wirksame Dosis von Chelerythrin ist sehr von dem verwendeten Weg
der Verabreichung und der Größe und Art
des behandelten Tieres abhängig.
Im Allgemeinen können
bei jedem Individuum die oral zugeführten Dosen höher sein
als die injizierten Dosen. Wie hierin definiert ist, besteht eine
wirksame Dosis in einer Dosis, die in einer behandelten Zelle Apoptose
induzieren kann. Besonders wünschenswerte
Zellen, die behandelt werden sollen, beinhalten Tumor- und Krebszellen
und insbesondere strahlungsresistente Tumor- oder Krebszellen. Beispielsweise
entspricht ein wirksamer Dosisbereich etwa 0,5–10 mg/kg (IP) in einer Maus und
bevorzugterweise 1–4
mg/kg (IP) in einer Maus.
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C. Ionisierende Strahlung
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Ionisierende
Strahlung verursacht DNA-Schäden
und Zellabtötung
im Allgemeinen proportional zur Dosisrate. Es wird postuliert, dass
ionisierende Strahlung multiple biologische Effekte durch die direkte
Interaktion mit DNA oder durch die Bildung freier Radikalspezies,
die zu DNA-Schäden führen, induziert
(Hall et al., 1988). Diese Effekte beinhalten Genmutationen, maligne
Transformationen und Zellabtötung.
Obwohl von ionisierender Strahlung gezeigt wurde, dass sie in einigen
prokaryotischen und niederen eukaryotischen Zellen die Expression
bestimmter DNA-Reparaturgene
induziert, ist wenig über
die Effekte ionisierender Strahlung auf die Regulation der Genexpression
von Säugetieren
bekannt (Borek, 1985). Mehrere Untersuchungen haben Änderungen
des Musters der Proteinsynthese beschrieben, die nach Bestrahlung
von Säugertierzellen beobachtet
wurden. Zum Beispiel ist die Behandlung von humanen malignen Melanomzellen
mit ionisierender Strahlung mit der Induktion mehrerer nicht identifizierter
Proteine assoziiert (Boothman et al., 1989). Die Synthese von Zyklin
und koregulierten Polypeptiden wird in REF52-Zellen der Ratte durch
ionisierende Strahlung supprimiert, jedoch nicht in Onkogen-transformierten
REF52-Zelllinien (Lambert und Borek, 1988). Andere Untersuchungen
haben gezeigt, dass bestimmte Wachstumsfaktoren oder Zytokine bei
der durch Röntgenstrahlen
induzierten DNA-Schädigung
involviert sein können.
Diesbezüglich
wird der Thrombozytenwachstumsfaktor (platelet-derived growth factor)
aus Endothelzellen nach Bestrahlung abgegeben (Witte et al., 1989).
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In
der vorliegenden Erfindung bedeutet „ionisierende Strahlung" eine Strahlung,
die Partikel oder Photonen umfasst, die eine ausreichende Energie
besitzen oder mittels nukleärer
Interaktionen eine ausreichende Energie produzieren können, um
eine Ionisierung (Gewinn oder Verlust von Elektronen) hervorzurufen.
Eine beispielhafte und bevorzugte ionisierende Strahlung ist Röntgenstrahlung. Vorrichtungen
für die
Zufuhr von Röntgenstrahlung
an das Zielgewebe oder die Zielzelle sind dem Fachmann gut bekannt.
Ebenso bedeutet der Ausdruck „wirksame
expressionsinduzierende Dosis ionisierender Strahlung" die Dosis ionisierender Strahlung,
die benötigt
wird, um einen „strahlungsreaktiven
Enhancer-Promotor" zu
stimulieren oder einzuschalten, der eine Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung darstellt.
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1. Strahlungsreaktive
Enhancer-Promotoren
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Ein
strahlungsreaktiver Enhancer-Promotor (wie in US-Patent 5,571,797
beschrieben) ist ein Promotor, dessen transkriptionskontrollierende
Funktion durch ionisierende Strahlung beeinflusst wird. Die Enhancer-Promotor-Region
wird als ein Schalter verwendet, um selektiv die Expression eines
Polypeptids zu beeinflussen, das von dieser Sequenz kodiert wird.
Die Regulation einer spezifischen Polypeptidexpression in einer bestimmten
Zielzelle oder einem Zielgewebe veschafft Möglichkeiten, diese Zelle oder
dieses Gewebe therapeutisch zu zerstören, zu verändern oder zu inaktivieren.
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Ein
Promotor ist eine Region eines DNA-Moleküls, die typischerweise innerhalb
von etwa 100 Nukleotidpaaren vor (stromaufwärts) dem Punkt liegt, an dem
die Transkription beginnt (d. h. einer Transkriptionsstartstelle).
Diese Region enthält üblicherweise
mehrere Arten von DNA-Sequenzelementen,
die in ähnlichen relativen
Positionen in unterschiedlichen Genen liegen. Wie hierin verwendet,
beinhaltet der Ausdruck „Promotor" das, was in Fachkreisen
als eine stromaufwärtsgelegene
Promotorregion, eine Promotorregion oder ein Promotor einer allgemeinen
eukaryotischen RNA-Polymerase
II-Transkriptionseinheit bezeichnet wird. Beispielhafte und bevorzugte
Promotoren sind die TATA-Box, die CAAT-Box und GC-reiche Sequenzelemente.
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Ein
weiterer Typ eines diskreten transkriptionsregulatorischen Sequenzelements
ist ein Enhancer. Ein Enhancer sorgt für eine zeitspezifische, ortsspezifische
und mengenspezifische Expression einer bestimmten kodierenden Region
(z. B. eines Gens). Eine Hauptfunktion eines Enhancers besteht darin,
die Stärke
der Transkription einer kodierenden Region in einer Zelle zu erhöhen, die
einen oder mehrere Transkriptionsfaktor(en) enthält, der (die) an diesen Enhancer
bindet(n). Anders als ein Promotor kann ein Enhancer funktionieren,
wenn er in verschiedenen Abständen
von Transkriptionsstartstellen positioniert ist, solange ein Promotor vorhanden
ist.
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Wie
hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck „Enhancer-Promotor" eine zusammengesetzte
Einheit, die sowohl Enhancer- als auch Promotorelemente enthält. Wie
hierin verwendet, bezeichnet ein „strahlungsreaktiver Enhancer-Promotor" einen Enhancer-Promotor,
dessen transkriptionskontrollierende Funktion durch ionisierende
Strahlung beeinflusst wird. Üblicherweise
stimuliert oder erhöht
ein strahlungsreaktiver Enhancer-Promotor in Folge einer Exposition
gegenüber
einer wirksamen Dosis ionisierender Strahlung die Transkriptionsrate
einer kodierenden Region, die durch diesen Enhancer-Promotor kontrolliert
wird. Ein beispielhafter und bevorzugter Enhancer-Promotor für die Verwendung
in einem DNA-Molekül
gemäß der vorliegenden Erfindung
ist eine CarG-Domäne
eines Egr-1-Promotors, ein Promotor für Tumornekrosefaktor alpha(TNFα)-Gen oder
ein c-Jun-Promotor.
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Ein
strahlungsreaktiver Enhancer-Promotor ist operativ mit einer kodierenden
Region verbunden, die für
wenigstens ein Polypeptid kodiert. Wie hierin verwendet, bedeutet
der Ausdruck „operativ
verbunden", dass ein
Enhancer-Promotor so mit einer kodierenden Region verknüpft ist,
dass die Trankription dieser kodierenden Region durch diesen Enhancer-Promotor
kontrolliert und reguliert wird. Mittel und Wege für die operative Verbindung
eines Enhancer-Promotors mit einer kodierenden Region sind dem Fachmann
gut bekannt. Ebenso ist dem Fachmann gut bekannt, dass die genaue
Orientierung und Positionierung relativ zu einer kodierenden Region,
deren Transkription kontrolliert wird, unter anderem von der spezifischen
Natur des Enhancer-Promotors abhängig
ist. Daher wird ein TATA-Box-Minimalpromotor üblicherweise etwa 25 bis etwa
30 Basenpaare stromaufwärts
einer Transkriptionsinitiationsstelle positioniert sein, und ein
stromaufwärtsgelegenes
Promotorelement wird üblicherweise
etwa 100 bis etwa 200 Basenpaare stromaufwärts einer Transkriptionsinitiationsstelle
positioniert sein. Im Unterschied dazu kann ein Enhancer stromabwärts der
Initiationsstelle positioniert sein und in einem bemerkenswerten
Abstand zu dieser Stelle liegen.
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2. Dosierung und Zufuhr
ionisierender Strahlung
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Die
Menge ionisierender Strahlung, die für eine bestimmte Zelle benötigt wird,
hängt im
Allgemeinen von der Natur dieser Zelle ab. Üblicherweise entspricht eine
wirksame expressionsinduzierende Dosis weniger als einer Dosis ionisierender
Strahlung, die direkt Zellschäden
oder den Tod verursacht. Mittel, mit denen eine wirksame Menge an
Strahlung bestimmt werden kann, sind dem Fachmann gut bekannt. Die
Menge ionisierender Strahlung, die für eine bestimmte Zelle benötigt wird,
hängt natürlich von
der Natur dieser Zelle ab. Wie auch hierin verwendet, bedeutet der
Ausdruck „wirksame
Dosis" ionisierender
Strahlung eine Dosis ionisierender Strahlung, die eine Erhöhung des
Zellschadens oder Todes bewirkt, wenn sie in Verbindung mit einem
Virus verabreicht wird.
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In
bestimmten Ausführungsformen
ist eine wirksame expressionsinduzierende Menge etwa 1 bis etwa 30
Gray (Gy), die mit einer Rate von etwa 0,5 bis etwa 4 Gy/Minute
verabreicht wird. Sogar noch bevorzugter ist eine wirksame expressionsinduzierende
Menge ionisierender Strahlung von etwa 1 Gy bis etwa 80 Gy (Gasamtdosis).
In anderen Ausführungsformen
werden Dosen von etwa 1–9
Gy in Einzeldosen verwendet. Eine wirksame Dosis ionisierender Strahlung
ist etwa 4,5 Gy bis etwa 100 Gy, mit einer bevorzugten Gesamtdosis von
etwa 70 Gy (entweder einzeln oder bevorzugter in mehreren Aliquot-Dosen).
Diese Dosisbereiche liegen deutlich unter den Dosen, die in einer
herkömmlichen
Strahlentherapie verwendet werden und verringern dadurch die schädlichen
Nebenwirkungen, die mit höheren
Strahlungsdosen assoziiert sind.
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Zusätzlich zu
externen Geräten
kann jedes geeignete Gerät
für die
Zufuhr der Strahlung an ein Gewebe angewendet werden. Zum Beispiel
kann die Strahlung zugeführt
werden, indem zuerst ein strahlenmarkierter Antikörper bereitgestellt
wird, der mit einem Antigen des Tumors immunreagiert, gefolgt von
der Zufuhr einer wirksamen Menge des strahlenmarkierten Antikörpers an
den Tumor. Darüber
hinaus können
Radioisotope verwendet werden, um einem Gewebe oder einer Zelle
ionisierende Strahlung zuzuführen.
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Tumore,
die behandelt werden können,
beinhalten Tumore des Gehirns (Glioblastome, Medulloblastome, Astrocytome,
Oligodendrogliome, Ependymome), der Lunge, der Leber, der Milz,
der Niere, der Lymphknoten, des Dünndarms, der Bauchspeicheldrüse, der
Blutzellen, des Dickdarms, des Magens, der Brust, des Endometriums,
der Prostata, des Hodens, des Eierstocks, der Haut, des Kopfes und
Halses, des Ösophagus, des
Knochenmarks, des Blutes oder anderer Gewebe, sind aber nicht darauf
beschränkt.
Der Tumor kann in matastatisch und nicht-metastatisch unterschieden
werden. Zahlreiche Ausführungsformen
beinhalten Tumorzellen aus der Haut, dem Muskel, der Faszie, des
Gehirns, der Prostata, der Brust, des Endometriums, der Lunge, des
Kopfes & Halses,
der Bauchspeicheldrüse,
des Dünndarms,
der Blutzellen, der Leber, der Hoden, der Eierstöcke, des Dickdarms, der Haut,
des Magens, des Ösophagus,
der Milz, der Lymphknoten, des Knochenmarks oder der Niere. Andere
Ausführungsformen
beinhalten flüssige
Proben wie peripheres Blut, Lymphflüssigkeit, Aszites, seröse Flüssigkeit,
Pleuraexsudat, Sputum, Zerebrospinalflüssigkeit, Tränenflüssigkeit, Stuhl
oder Urin.
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D. Therapieschemata
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Die
Behandlung mit Chelerythrin kann einer Bestrahlung in Zeitintervallen,
die von Sekunden bis Wochen reichen, vorausgehen oder ihr folgen.
In Ausführungsformen,
in denen Chelerythrin und Bestrahlung der Zelle getrennt verabreicht
werden, wird man im Allgemeinen sicherstellen, dass keine signifikante
Zeitspanne zwischen den einzelnen Zeitpunkten der Zufuhr vergangen
ist, so dass die Kombination der zwei immer noch einen vorteilhaften
Kombinationseffekt auf die Zelle ausüben kann. In solchen Fällen wird
erwogen, die Zelle mit beiden Wirkstoffen innerhalb von etwa 0,1
bis 24 Stunden, bevorzugter, innerhalb von etwa 1 bis 4 Stunden,
miteinander in Kontakt zu bringen, wobei eine zeitliche Verzögerung von
nur etwa 1 Stunde bis etwa 2 Stunden am meisten bevorzugt wird.
In einigen Situationen ist es allerdings wünschenswert, die Zeitspanne für die Behandlung
beträchtlich
zu erweitern, wobei mehrere Tage (2, 3, 4, 5, 6 oder 7) bis zu mehreren
Wochen (1, 2, 3,4, 5, 6, 7 oder 8) zwischen den entsprechenden Verabreichungen
vergehen.
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Es
ist auch vorstellbar, dass mehr als eine Verabreichung von entweder
Chelerythrin oder Bestrahlung erwünscht wird. Viele verschiedene
Kombinationen können
angewendet werden, wobei Chelerythrin „A" und Bestrahlung „B" ist:
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-
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Um
eine Zellabtötung
zu erreichen, werden beide Wirkstoffe einer Zelle in einer kombinierten
Menge zugeführt,
die wirksam ist, die Zelle zu töten.
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Die
Dosisbereiche für
Röntgenstrahlen
reichen von täglichen
Dosen von 50 bis 200 cGy über
längere Zeiträume (6 bis
8 Wochen) bis hin zu Einzeldosen von 2000 bis 6000 cGy. Die Dosisbereiche
für Radioisotope variieren
stark und hängen
von der Halbwertszeit der Isotope, der Stärke und Art der emittierten
Strahlung und der Aufnahme durch die neoplastischen Zellen ab.
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E. Behandlungswege
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Chelerythrin
kann intravenös,
intraarteriell, intratumoral, parenteral oder intraperitoneal verabreicht werden.
Bevorzugte Verabreichungswege sind direkt intratumoral, Injektion
in einen resezierten Tumorherd, intravenös (IV), intraarteriell und
intraperitoneal (IP). Lösungen
der aktiven Verbindungen als freie Base oder pharmakologisch verträgliche Salze
können
in Wasser, gemischt mit einem oberflächenaktiven Stoff wie Hydroxypropylzellulose,
zubereitet werden. Ebenso können
Dispersionen in Glyzerin, flüssigen
Polyethylenglykolen und Gemischen davon sowie in Ölen zubereitet
werden. Unter üblichen
Lagerungs- und Verwendungsbedingungen beinhalten diese Zubereitungen
ein Konservierungsmittel, um das Wachstum von Mikroorganismen zu
verhindern.
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Die
pharmazeutischen Formulierungen, die für eine Verwendung als Injektion
geeignet sind, beinhalten sterile Lösungen oder Dispersionen und
sterile Pulver für
die spontane Zubereitung steriler injizierbarer Lösungen oder
Dispersionen. In allen Fällen
muss die Formulierung steril und zu einem Ausmaß flüssig sein, dass eine leichte
Verwendbarkeit in Spritzen vorliegt. Sie müssen unter den Herstellungs-
und Lagerbedingungen stabil sein und vor der Kontaminationswirkung
von Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilzen, geschützt sein.
Der Träger
kann ein Lösungs-
oder Dispersionsmittel, enthaltend zum Beispiel Wasser, Ethanol,
Polyol (zum Beispiel Glyzerin, Propylenglykol und flüssiges Polyethylenglykol
und Ähnliches),
geeignete Gemische davon und Pflanzenöle sein. Die passende Fluidität kann zum
Beispiel durch die Verwendung einer Ummantelung wie mit Lecithin,
durch die Aufrechterhaltung der erforderlichen Partikelgröße im Fall
der Dispersion und durch die Verwendung oberflächenaktiver Substanzen aufrechterhalten
werden. Der Schutz vor der Wirkung von Mikroorganismen kann durch
eine Vielzahl antibakterieller und antimykotischer Wirkstoffe, zum
Beispiel Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal und Ähnliches,
bewirkt werden. In vielen Fällen
wird man bevorzugen, isotonische Wirkstoffe, zum Beispiel Zucker
oder Natriumchlorid, einzubeziehen. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren
Zusammensetzungen kann durch die Verwendung von Wirkstoffen in den Zusammensetzungen
bewirkt werden, welche die Absorption verzögern, zum Beispiel Aluminiummonostearat und
Gelatine.
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Sterile
injizierbare Lösungen
können
durch das Einbringen der aktiven Verbindungen in das geeignete Lösungsmittel
in der benötigten
Menge zusammen mit einer Vielzahl der oben aufgezählten anderen
Ingredienzien, wie sie benötigt
werden, zubereitet werden, gefolgt von einer Sterilfiltration. Im
Allgemeinen werden Dispersionen zubereitet, indem die Vielzahl sterilisierter
aktiver Ingredienzien in ein steriles Vehikel eingebracht werden,
welches das grundlegende Dispersionsmittel enthält, und die benötigten anderen
Ingredienzien, von denjenigen, die oben aufgezählt sind. Im Fall eines sterilen
Pulvers für
die Zubereitung steriler Injektionslösungen, sind die bevorzugten
Verfahren der Zubereitung die Vakuum- und Gefriertrocknungstechniken, die
ein Pulver der aktiven Ingredienzien plus jeder beliebigen erwünschten
Ingredienz, aus einer zuvor sterilfiltrierten Lösung daraus, ergeben.
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Wie
hierin verwendet, beinhaltet ein „pharmazeutisch verträglicher
Träger" jedes beliebige
Lösungsmittel
Dispersionsmittel, Ummantelungen, antibakterielle und antimykotische
Wirkstoffe, isotonische und absorptionsverzögernde Wirkstoffe und Ähnliches.
Die Verwendung solcher Mittel und Wirkstoffe für die pharmazeutisch wirksamen
Substanzen sind dem Fachmann gut bekannt. Insofern wird ihre Verwendung
in therapeutischen Verbindungen in Erwägung gezogen, es sei denn,
dass ein konventionelles Mittel oder konventioneller Wirkstoff mit
der wirksamen Ingredienz unverträglich
ist. Zusätzliche
wirksame Ingredienzien können
ebenfalls in die Zusammensetzungen eingebracht werden.
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Chelerythrin
kann auch oral verabreicht werden, zum Beispiel mit einem reaktionsträgen Verdünnungsmittel
oder mit einem assimilierbaren essbaren Träger, oder in hart- oder weichwandigen
Gelatinekapseln verpackt werden, oder in Tabletten gepresst werden,
oder direkt in die Nahrung der Diät eingebracht werden. Für eine orale
therapeutische Verabreichungsform kann die wirksame Verbindung in
Arzneimittelträger eingebracht
werden und in der Form verdaubarer Tabletten, bukkaler Tabletten,
Pastillen, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirups, Oblaten und Ähnlichem
verwendet werden. Solche Zusammensetzungen und Zubereitungen sollten
wenigstens 0,1% der wirksamen Verbindung enthalten. Der prozentuale
Anteil der Zusammensetzungen und Zubereitungen kann natürlich variiert
werden und kann in geeigneter Weise zwischen etwa 2 bis etwa 60%
des Gewichts der Einheit liegen. Die Menge der wirksamen Verbindungen
in solchen therapeutisch nützlichen
Zusammensetzungen ist so, dass eine geeignete Dosierung erreicht
wird.
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Die
Tabletten, Pastillen, Pillen, Kapseln und Ähnliches können auch das Folgende beinhalten:
ein Bindemittel wie Gummi-Tragant, Gummi arabicum, Maisstärke oder
Gelatine; Arzneimittelträger
wie Dicalziumphosphat; einen sich auflösenden Wirkstoff wie Maisstärke, Kartoffelstärke, Alginsäure oder Ähnliches;
ein Gleitmittel wie Magnesiumstearat; und ein Süßungsmittel wie Sukrose, Laktose
oder Saccharin kann hinzugefügt
werden oder ein Geschmacksstoff wie Pfefferminze, das Öl des amerikanischen
Immergrüns
oder Kirschgeschmack. Wenn die Dosierungseinheit eine Kapsel ist,
kann sie, zusätzlich
zu den Materialien vom oben genannten Typ, einen flüssigen Träger enthalten.
Zahlreiche andere Materialien können
als Ummantelungen vorliegen oder um anderweitig die physikalische
Form der Dosierungseinheit zu modifizieren. Beispielsweise können Tabletten,
Pillen oder Kapseln mit Schelllack, Zucker oder beidem ummantelt
sein. Ein Sirup oder Elixier können
die wirksamen Verbindungen, Sukrose als ein Süßungsmittel, Methyl- oder Propylparabene
als Konservierungsstoffe, einen Farbstoff oder Geschmacksstoffe
wie Kirsch- oder Orangengeschmack enthalten. Natürlich sollte jedes Material,
das für
die Zubereitung einer beliebigen Dosierungseinheit verwendet wird,
pharmazeutisch rein und in den eingesetzten Mengen im Wesentlichen
ungiftig sein. Zusätzlich
können
die wirksamen Verbindungen in langzeitwirkende Zubereitungen und
Formulierungen eingebracht werden.
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F. Überprüfung und Überwachung der Therapieeffektivität
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Es
wird in Erwägung
gezogen, dass im Kontext der vorliegenden Erfindung aus einem Individuum
Zellen, entweder Tumor- oder normale Zellen oder sowohl Tumor als
auch normale Zellen, entfernt werden, um entweder den Fortschritt
der Behandlung zu kontrollieren oder als Teil der Behandlung selbst.
Es wird erwartet, dass man die Wirksamkeit der Behandlung durch
die Entfernung solcher Zellen und die Behandlung solcher Zellen
mit DAPI-Färbung überwachen
kann, um das Ausmaß der
Chromatinkondensation zu bestimmen, das Ausmaß der Apoptose zu messen, die
Stärke
der Produktion der neutralen Sphingomyelinase zu messen, oder durch
andere Methoden so wie die Folgenden.
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Eine
besondere Methode zur Bestimmung der Induktion der Apoptose besteht
in Desoxynukleotidyltransferase-vermittelten dUTP-Biotin Nick Endmarkierung
(TUNEL) Assays, welche die Integrität der DNA messen (Gorczyca,
1993). Dieser Assay misst die Fragmentation der DNA mittels der
Bestimmung der Inkorporation von markiertem UTP in gebrochene DNA-Stränge durch
das Enzym terminale Transferase. Die Inkorporation kann durch elektroskopische
oder durch Zellsortierungsmethoden (z. B. FACS) überwacht werden.
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G. Ex vivo Zufuhr
-
Im
Kontext der vorliegenden Erfindung wird in Erwägung gezogen, dass eine systemische
Zufuhr von entweder Chelerythrin oder Bestrahlung oder beidem verwendet
werden kann. Weiterhin wird in Erwägung gezogen, dass man wünschen wird,
betroffene Zellen durch gesunde Zellen des selben Patienten zu ersetzen. Eine
ex vivo Gentherapie betrifft die Isolierung von Zellen aus einem
Tier oder Patienten, die Zufuhr einer Nukleinsäure in die Zellen in vitro
und die anschließende
Rückführung der
modifizierten Zellen in ein Tier oder ein Individuum. Dies kann
die chirurgische Entfernung von Gewebe/Organen aus einem Tier oder
Patienten oder die primäre
Kultur von Zellen und Geweben beinhalten.
-
Im
Besonderen wird die autologe Knochenmarkszell-(BMC)-Transplantation
als ein Heilungsverfahren verwendet, in welchem Blut oder Knochenmark
entnommen und vor einer Intensivierung der Strahlung oder Chemotherapie
gelagert werden. Bei der Präparation
humaner mononukleärer
Zellen (MNC) wird ein Aliquot des Kochenmarks in einen Aufnahmebehälter, beispielsweise
ein Zentrifugenröhrchen,
gelegt. Zunächst
können
MNC aus einer Quelle für Knochenmark,
z. B. den Schienbeinknochen, den Oberschenkelknochen, der Wirbelsäule, den
Rippen, den Hüften,
dem Brustbein sowie den Oberarmknochen, den Radien, den Ellenknochen,
den Schienbeinknochen und den Wadenbeinknochen gewonnen werden.
Zusätzlich
können
diese Zellen auch aus Nabelschnurblut, peripherem Blut oder Zytokin-mobilisiertem
peripheren Blut gewonnen werden. Andere Quellen humaner hämatopoetischer
Stammzellen beinhalten den embryonalen Dottersack, die fötale Leber,
die fötale
und erwachsene Milz und das Blut. Die Knochenmarksschicht wird zentrifugiert,
so dass am Boden des Röhrchens
ein Pellet roter Zellen, eine klare Schicht von Medium, eine Interphasenschicht,
welche die MNC enthält,
und ganz oben eine Schicht von Plasmamedium erzeugt wird. Die Interphasenschicht
kann anschließend
zum Beispiel durch Absaugung entfernt werden. Eine Zentrifugation
dieser Schicht bei 1000 g führt
schließlich
zu einem MNC-Pellet. Dieses Pellet kann anschließend in einem geeigneten Puffer
für die
Zellsortierung durch FACS resuspendiert werden. Die isolierten MNC
werden in vitro geklont, um die immunologisch aktiven Zellen zu
vermehren. Die vermehrten, therapeutisch wirksamen Zellen werden
dann für
den Patienten bereitgestellt, um einen therapeutischen Effekt zu
erreichen.
-
Material und Methoden
-
Wirkstoffe und Reagenzien
-
Chelerythrin
[IC50 (PKC) = 0,66 μM, IC50 (PKA)
= 170 μM]
und Calphostin C [IC50 (PKC) = 0,50 nM,
IC50 (PKA) = 50 μM] zeigen eine hohe Spezifität für die PKC-Familie
von Enzymen (Sigma). Diese Inhibitoren sind wenigstens 30-fach spezifischer
in der Blockierung der PKC-Aktivität als im
Gegensatz dazu die relativ unselektiven, jedoch weithin verwendeten
Wirkstoffe Staurosporin und H7. Sie inhibieren offensichtlich keine
anderen Kinasen, wie die zyklische AMP-Kinase (PKA) in den Konzentrationen,
die in den Untersuchungen der Erfinder verwendet wurden (Kobayashi
et al., 1989b; Herbert et al., 1990). 7-Amino-Aktinomycin D, ATP,
phosphatgepufferte Kochsalzlösung
(PBS), Sphingosin-1-Phosphat, DL-Threo-Dihydrosphingosin und Propidiumiodid
wurden von Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO, bezogen. C2-Ceramid
und N-Oleoylethanolamin wurde von Matreya Chemicals, PA, bezogen.
Reagenzien für
den Terminale-Transferase-Assay wurden von Boehringer-Mannheim, Biochemicals,
Indianapolis, IN, bezogen. Dünnschicht-chromatographie-Platten
wurden von Whatman bezogen (10 cm × 10 cm LHP-K TLC Platte).
Der Autoradiographiefilm stammte von Dupont. [3H]
Palmitinsäure
(60 Ci/mmol), [14C] Sphingomyelin (60 Ci/mmol)
und [γ-32P] ATP wurden von DuPont NEN bezogen. Alle
Lösungsmittel
besaßen
HPLC-Grad. Chelerythrin wurde für
die in vitro Experimente in sterilem Wasser oder in PBS für die intratumoralen
Injektionen gelöst.
-
Zellkultur
-
Die
humane SQ20B Kopf- und Halsplattenepithelkarzinom-Zelllinie wurde
in DMEM kultiviert, das mit 25% F5-12, 20% fötalem Kälberserum (Gibco/BRL, Grand
Island, NY) und 1% Penicillin-Streptomycinat mit 5% CO2 kultiviert
wurde, wobei Standardverfahren, wie in Chmura et al., 1996a; 1996b,
beschrieben, bis auf die unten beschriebenen Modifikationen, eingehalten
wurden. WEHI-231
JM wurden bis zu einer Dichte von 3–6 × 105 Zellen/ml
in RPMI 1640 Kulturmedium, 1% Penicillin-Streptomycin, 10% hitzeinaktiviertem
fötalen Kälberserum
(Gibco/BRL, Grand Island, NY und 5 × 10–5 M β-Mercaptoethanol
(Sigma) in 5% CO2 wachsen gelassen.
-
Untersuchung der Lebensfähigkeit
mit Hilfe des Propidiumiodidausschlusses
-
Zellen,
2,5–3,5 × 105, wurden für alle Experimente in 24-Well
Gewebekulturschalen nach bereits beschriebenen Standardverfahren
(Chmura et al., 1996a; 1996b) kultiviert. Die Zellen wurden mit
variierenden Konzentrationen von Chelerythrin behandelt, für 30 Minuten
bei 37°C
inkubiert und anschließend
bestrahlt. Die Strahlungsdosis für
alle Proben betrug eine Dosisrate von 2,0 Gy/sec., wobei ein 60Co-Strahler (Gammacell 220, Atomic Energy
of Canada) verwendet wurde. Nach den bezeichneten Zeitpunkten wurden
die Zellen geerntet, einmal in PBS gewaschen und in 50 ml PBS resuspendiert,
das 100 mg/ml Propidiumiodid enthielt. Lebende Zellen nehmen kein
Propidiumiodid auf, während
tote Zellen dies tun. Zellen, die sich in der Apoptose befinden,
schrumpfen auch in ihrer Größe. Die
Zellen wurden mittels einer Flusszytometrie (FACS) auf einem FACScan
(Becton-Dickson) analysiert, wobei die in Chmura et al. (1996a;
1996b) beschriebenen Standardverfahren befolgt wurden und die Lysis
II Software verwendet wurde.
-
DAPI-Färbung zur Visualisierung der
Zellkerne
-
Zellen,
5 × 105, wurden bei 1000 rpm zentrifugiert und
in ungefähr
100 μl Zellkulturmedium
resuspendiert. Die Zellsuspension wurde anschließend mit 100 μl DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindol,
Sigma D9542, 1 μg/ml
in PBT (PBS + 1% Triton X-100)) gemischt. Ein Tropfen dieses Gemisches
wurde auf einem Objektträger mit
einem Deckglas platziert. Die Zellen wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie
dargestellt, wobei ein Olympus BX-40 Mikroskop mit einer 100 Watt
Quecksilberlampe, einem 16 oder 40 × Fluoritobjektiv N. A. 0,75,
(Leco #1-UB527) und ein UV-Filterkasten
(ex 330–385
nm, em 420 nm, Breitbandpassfilter, Leco #U-M536) verwendet wurde.
Die Bilder wurden fotografiert, wobei eine gekühlte Optronics Schwachlichtvideokammera
(Leco #DEI-470TB)
verwendet wurde, an die ein 2 × Koppler
angebracht wurde (Leco #HR200-CMT). Das Bild wurde digital mit einer
Auflösung
von 72 dpi gespeichert.
-
DNA-Leiter-Assay
-
Die
DNA-Degradation wurde wie bereits beschrieben (Gottschalk et al.,
1993; 1994) ermittelt. Kurz gesagt: Nach einer Behandlung in 100
mm-Platten oder in 24-Well-Platten wurden die Zellen gesammelt und
in 0,5 ml Lysis-puffer (0,6% SDS + 10 mM EDTA, pH 7,0) lysiert.
NaCl wurde zu einer Endkonzentration 1 M hinzugegeben, durch Inversion
gemischt, 12 Stunden bei 4°C
inkubiert und anschließend
bei 14.000 g für
30 Minuten zentrifugiert. Die Proben wurden mit Chloroform (1 :
1) behandelt und vor der Elektrophorese in einem 3%-igen Agarosegel
in Ethanol präzipitiert
und mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht.
-
Koloniebildungs-Assay
-
Exponentiell
wachsende SQ20B Kulturen wurden mit 0,05% Trypsin + 0,02% EDTA trypsinisiert.
Zellen (100 bis 50.000) wurden in 100 mm Gewebekulturschalen plattiert.
4 Stunden nach der Plattierung wurde Chelerythrin oder C2-Ceramid
hinzugefügt
und nach der Hinzufügung
von Chelerythrin oder C2-Ceramid für 30 Minuten bestrahlt. Die
Zellen wurden bestrahlt, wobei ein GE Maxitron 250 Röntgenstrahlgenerator
verwendet wurde, der bei 250 kV und 26 mA mit einer Dosisrate von
114 cGy/min. arbeitet. Nach 12 Tagen wurden die Zellen fixiert und
mit Kristallviolett, gemäß der Standardverfahren,
gefärbt
(Chmura et al., 1996a; 1996b). Kolonien mit mehr als 50 Zellen wurden
als Überlebende
gewertet.
-
Ceramid- und DAG-Quantifizierung
mittels der DAG-Kinase-Reaktion
-
Die
Quantifizierung von Ceramid durch Diacylglyzerinkinase entsprach
der von Dressler und Kolesnick (1990) beschriebenen. Nach Bestrahlung
wurden die Lipide extrahiert und mittels Sonifizierung in 20 μl 7,5% n-Octyl-β-D-Glucopyranosid,
5 mM Cardiolipin und 1 mM DETAPAC resuspendiert. 70 μl eines Reaktionsgemisches
wurden hinzugefügt
und ergab eine Endkonzentration von 0,05 M Imidazol/HCl pH 6,6,
0,05 M NaCl, 12,5 mM MgCl2, 1 mM EGTA und
DAG Kinase bei einer Konzentration von 0,7 U/ml. Die Reaktion wurde
durch die Hinzufügung
von 10 μl
[γ-32P] ATP (1,0 μCi/Reaktionsgefäß) in 5
mM ATP gestartet und bei Raumtemperatur für 30 min. inkubiert und durch
die Extraktion von Lipiden mit 450 μl CHCl3 :
CH3OH (1 : 2) und 20 μl 1% HClO4 gestoppt.
Die Monophase wurde gemischt, und nach 10 min. wurden 150 μl CHCl3 und 150 μl
1% HClO4 hinzugefügt, die Reaktionsgefäße gevortext
und bei 5000 g für
5 min. zentrifugiert. Die untere organische Phase wurde 2 Mal mit
1% HClO4 gewaschen und anschließend in
einem Speed Vac Apparat getrocknet. Die Phosphorylierungsprodukte,
Ceramid-1-Phosphat und Phosphatidsäure (aus DAG) wurden auf einer
10 cm × 10
cm LH P-K TLC Platte (Whatman) aufgetrennt. Die Daten wurden als
pmol Ceramid/106 Zellen mittels Szintillationszählung berechnet.
Im Beispiel 6 stellen die Daten (mittlere +/– SD) wenigstens vier unabhängige Untersuchungen
dar, in denen *p < 002
war, wenn sie mit den nicht-bestrahlten
Kontrollen verglichen wurden.
-
Markierung, Extraktion
und Analyse der mit [3H] Palmitinsäure markierten
Lipide
-
Die
Zellen wurden für
24 Stunden mit [3H] Palmitat (10 μCi/ml) bis
zum isotopischen Gleichgewicht in 15 ml Glasreaktionsgefäßen vormarkiert,
um die Änderungen
im zellulären
Ceramid und Sphingomyelin, die auf der Behandlung und auf dem Wechsel
der Medien beruhen (Borchardt et al., 1994), zu minimieren. Nach der
Behandlung der Zellen mit Chelerythrin wurde das gesamte Lipid mittels
einer modifizierten Folch-Methode extrahiert. Kurz gesagt: 1 ml
MeOH : 2 N HCl (100 : 6, v/v) wurde verwendet, um das Zellpellet
zu resuspendieren. Chloroform (2 ml) und Wasser (0,6 ml) wurden
zu jedem Reaktionsgefäß hinzugegeben,
drei Mal gevortext und für
zwanzig Minuten bei 1000 × g
zentrifugiert, was zu einer Phasentrennung führte. Gleiche Mengen der organischen
Phase wurden aus jedem Reaktionsgefäß entnommen, getrocknet und
mit 30 μl
Chloroform : Methanol (95 : 5) rekonstiuiert. Ein Aliquot (10 μl) wurde
auf einer 10 cm × 10
cm LHP-K TLC Platte (Whatman) verteilt, die zuvor einem Waschschritt
in einem Lösungsmittel
von CHCl3 : CH3OH
: H2O (60 : 40 : 10, v/v) unterzogen wurde.
Sphingolipide wurden in CHCl3 : MeOH : CH3COOH : H2O (32,5
: 12,5 : 4,4 : 2,25) aufgetrennt, mit Jod gefärbt, mit En3Hance
(DuPont) besprüht
und einer Autoradiographie unterzogen. Die Autoradiographien wurden
mit einem Epson 1200c 30 Bit Scanner und der NIH Image Software
(öffentlich
zugängliches
Programm, entwickelt am NIH und aus dem Internet mittels FTP von
zippy.nimh.nih.gov erhältlich) quantifiziert.
Sowohl die Zählung
als auch die Dichteanalyse führte
zu ähnlichen
Resultaten.
-
Aktivitätsassay
neutraler und saurer Sphingomyelinase
-
Der
gemischte Mizellen-Sphingomyelinase-Assay mit [14]C
markiertem Sphingomyelin wurde wie in Wiegmann et al., 1994 beschrieben
ausgeführt,
mit kleineren Modifikationen wie sie hierin beschrieben werden.
Exponentiell wachsende Zellen, 2 × 107,
wurden behandelt, gesammelt und in 200 μl neutralem Puffer (20 mM Hepes,
pH 7,4; 10 mM MgCl2, 2 mM EDTA, 5 mM DTT,
100 mM Na3VO4, 100
mM NaMO4, 10 mM b-Glyzerinphosphat, 750 μM ATP, 1
mM PMSF, Leupeptin, Pepstatin, 2% Triton X-100) oder in sauerem
Puffer (pH = 5,5, 2% Triton X-100, 1 mM PMSF, Leupeptin, Pepstatin)
lysiert. Nach einer Inkubation für
5 Minuten bei 4°C wurden
die Zellen mittels Ultraschallbehandlung homogenisiert, und die
Zellreste wurden durch eine Zentrifugation mit geringer Geschwindigkeit
(800 × g)
entfernt. Die Proteinkonzentration wurde mit einem BioRad Proteinassaysystem
(BioRad) gemessen. Protein (50 μg)
wurde für
zwei Stunden bei 37°C
in einem Puffer (1 ml Endvolumen) inkubiert, der 20 mM HEPES, 1
mM MgCl2 und 0,9 μl [N-Methyl-14C
Sphingomyelin] enthielt. Die Reaktion verlief bei dieser Proteinkonzentration
linear. Anschließend
wurde Phosphorylcholin mit 800 ml Chloroform : Methanol (2 : 1 v/v)
und 250 ml H2O extrahiert. Radioaktives
Phosphorylcholin wurde durch Szintillationszählung gemessen. Die Daten sind
als Prozent der Kontrolle für
sowohl die saueren als auch neutralen Sphingomyelinasen angegeben.
In Beispiel 6 stammen die Daten (Mittelwert +/– SEM) aus vier unabhängigen Untersuchungen
mit Doppel- oder mehr Bestimmungen, in denen p > 0,04 für die neutrale Sphingomyelinasen-Aktivität in WEHI-231
JM-Zellen ist (t-Test nach Student), wenn sie mit unbestrahlten
Kontrollen verglichen wird.
-
Wachstum humaner Tumor-Fremdtransplantate
-
SQ-20B
(1–5 × 106) Tumorzellen wurden in den rechten Hinterlauf
von Nacktmäusen
(Frederick Cancer Research Institute) injiziert. Die Xenotransplantate
wurden 2–3
Wochen bis zu einem mittleren Tumorvolumen von 300 mm3 wachsen
gelassen. Am Tag 0 wurde das anfängliche
Tumorvolumen mit einer direkten Messung mit einer Schieblehre ermittelt.
Während
der Behandlung wurden die Tumorvolumina mit einer Schieblehre zweimal
wöchentlich
gemessen und als Prozent des ursprünglichen Tumorvolumens dargestellt.
Die Tumorvolumina wurden mit der Formel (a × b × c/2) ermittelt, die von der
für ein
Ellipsoid (d3/6) abgeleitet wurde. Tumorheilung wurde als Regression
bis zu einem Volumen von < 10%
der Originalgröße definiert,
da es bei diesem Volumen unmöglich
ist, restliches Tumorgewebe von Narbengewebe zu unterscheiden. Xenotransplantate
wurden mit 2 mg/kg Chelerythrinchlorid an den Tagen 0, 3, 7 und
10 injiziert. Bestrahlte Mäuse
wurden in Plexiglaskammern immobilisiert, und der gesamte Körper wurde,
mit Ausnahme des tumortragenden Hinterlaufs, mit Blei abgeschirmt.
Die Tumoren wurden mit einer Gesamtdosis von 50 Gy (5 Gy/Tag, 4
Tage/Woche) bestrahlt, wobei ein Maxitron-Generator (1,88 Gy/min.)
verwendet wurde. Tumore wurden mit Strahlung alleine, Chelerythrin
alleine und Puffer oder mit der Kombination von Chelerythrin mit
Strahlung behandelt. Die Daten wurden als Prozent des ursprünglichen
Tumorvolumens (Tag 0) berechnet und als gestückeltes Tumorvolumen ± SEM grafisch
dargestellt.
-
Histologie von SQ-20B-Fremdtransplantaten
-
In
die Tumore wurde einmal oder zweimal (Tag 0 und Tag 4) Chelerythrin,
Chelerythrin und 20 Gy (5 Gy/Tag) injiziert oder mit 20 Gy alleine
behandelt, und am Tag 7 herausgeschnitten und in 10% neutral gepuffertem
Formalin fixiert. Die Tumore wurden anschließend zurechtgeschnitten und
in einem Tissue Tek II Tissue Processor bearbeitet. Die Gewebe wurden
in Paraffin eingelegt, geschnitten und mit Hämatoxilin und Eosin oder mit
100 ml DAPI (4',6,-Diamidino-2-Phenylindol,
Sigma D9542, 1 μg/ml
in PBT (PBS + 1% Triton X-100)) gefärbt, gefolgt von einer Untersuchung
auf Apoptose und Nekrose mit einem Lichtmikroskop.
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Isolierung von Zellkernen
-
WEHI-231
JM Zellen (2 × 107) wurden pelletiert und in Extraktionspuffer
(20 mM Hepes pH 7,4; 10 mM MgCl2; 2 mM EDTA;
5 mM DTT; 100 mM Na3VO4;
100 mM NaMO4; 10 mM β-Glyzerinphosphat; 750 μM ATP; 1
mM PMSF, 10 μM
Leupeptin, 10 μM
Pepstatin; 2% Triton X) resuspendiert. Zellen wurden für 5 Minuten
auf Eis inkubiert und anschließend
mit 15 Schlägen
mit einem Dounce-Homogenisator disrumpiert. Kerne, vor jeder einzelnen
Untersuchung frisch präpariert,
wurden zweimal mit RPMI während
einer Zentrifugation bei 2000 Upm in einer Mikrozentrifuge gewaschen
und in Medien resuspendiert, die RPMI und 5 × 10–5 M β-Mercaptoethanol
enthielten. Allen Proben wurde die Strahlung mit einem 60Co-Strahler
(Gammacell 220, Atomic Energy of Canada) mit einer Dosisrate von
2,0 Gy/sec. verabreicht.
-
Selektion von OE-Varianten
-
WEHI-231
JM Zellen (1 × 107) wurden mit zwei aufeinanderfolgenden Behandlungen
mit 100 μM
und 125 N-Oleoylethanolamin (Matreya), einem potenten Inhibitor
der Ceramidase (Coroneos et al., 1995; Ambrosini et al., 1994) behandelt.
Zellen wurden in Medien, die N-Oleoylethanolamin enthielten, für 96 Stunden
kultiviert. Serielle Verdünnungen
isolierten einzelne resistente Zellen, und diese wurden nach jeder
Selektion vermehrt. Alle zwei Wochen wurden Zellen mit 125 μM N-Oleoylethanolamin
re-selektioniert. Die resultierenden Zelllinien, WEHI-231 OE benannt,
sind dreifach resistenter gegenüber
Apoptose, wenn sie mit 75 μM
des Inhibitors behandelt werden, wobei die Zellen im Vergleich mit
der Parentallinie dennoch eine ähnliche
Wachstumskinetik besitzen.
-
Apoptose- und Zelllebensfähigkeits-Untersuchungen
-
Der
TdT-Assay wurde wie zuvor beschrieben ausgeführt (Chmura, 1996). Bestrahlte
(10 Gy) und Serum-ausgehungerte FLS-12 bildeten den apoptotischen
Bereich, bezeichnet als R2. Zellen wurden mittels Flusscytometrie
auf einem FACScan (Becton-Dickson) unter Verwendung der Lysis II
Software analysiert, wobei die FL2 und FSH Kompensation auf 50%
bzw. 25% gesetzt war.
-
Um
die DNA-Fragmentation nachzuweisen, wurden Zellen gesammelt und
in 0,5 ml Lysispuffer (0,6% SDS + 10 mM EDTA, pH 7,0) lysiert. NaCl
wurde zu 1 M hinzugefügt,
durch Inversion gemischt, für
12 Stunden bei 4°C
inkubiert und für
30 Minuten bei 14.000 g zentrifugiert. Die Proben wurden Chloroform-
und Ethanol-(1 : 1) präzipitiert
und in einem 3% Agarosegel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt.
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Für die Lebensfähigkeitsfärbung wurden
2,5–3,5 × 105 Zellen mit variierenden Konzentrationen
von C2-Ceramid, Bestrahlung oder beidem behandelt. Nach den angegebenen
Zeitpunkten wurden die Zellen geerntet, einmal in Phosphat gepufferter
Salzlösung
(PBS) gewaschen, in PBS, das 50 μl
von 100 μg/ml
Propidiumiodid enthielt, resuspendiert und mittels Flusscytrometrie
(FACS) analysiert.
-
BEISPIEL 1
-
Chelerythrinchlorid potenziert
die IR-induzierte Abnahme des clonogenischen Überlebens
-
SQ20-B,
eine humane Kehlkopfkarzinomzelllinie, ist, im Vergleich zu anderen
humanen Zelllinien, strahlungsresitent (D0 =
2,3 Gy) (Nagasawa et al., 1994; Brachman et al.; 1993). Mutationen
innerhalb des Exons 5 von p53 in SQ20-B resultieren in einem Verlust
der Arretierung des Zellzyklus in G1 und einem fehlenden Anstieg
in p53-Protein nach einer IR-Exposition (Brachman et al.; 1993).
-
Die
klonale Überlebensrate
wurde nach steigenden Konzentrationen von Chelerythrinchlorid allein (0,5–1,5 μM), IR alleine
(1–9 Gy)
oder der kombinierten Behandlung von Zellen mit Chelerythrin und
IR gemessen. Die Zugabe von Chelerythrin zu exponentiell wachsenden
SQ20-B Zellen verringerte das klonale Überleben in einer konzentrationsabhängigen Art
und Weise (2). Bei einer Konzentration
von 500 nM verringerte Chelerythrin das Überleben der Zellen auf ungefähr 80% der
unbehandelten Kontrollzellen (ungefähr 20% Zelltod). Die Kombinationsbehandlung
der Zellen mit 500 nM Chelerythrin 30 Minuten vor der Behandlung
mit 3 Gy Strahlung verringerte des Überleben der Zellen auf ungefähr 30% der
unbehandelten Zellen (ungefähr
70% Zelltod). Der Zelltod wurde durch Chelerythrin über die
gesamte Breite der verabreichten Dosis (1–9 Gy) verstärkt und
resultierte sowohl in einem verringerten klonalen Überleben
als auch in einer erfolglosen Koloniebildung (2).
Eine Zellschrumpfung und nukleäre
Kondensation, Charakteristiken der Apoptose, wurden bei diesen Konzentrationen
von Chelerythrin und IR nicht beobachtet. Diese Daten zeigen, dass
nanomolare Konzentrationen von Chelerythrin den IR-vermittelten
Zelltod durch Mechanismen verstärken,
die von einer Apoptose unabhängig
sind.
-
BEISPIEL 2
-
SQ20-B-Zellen fehlt eine
apoptotische Reaktion auf IR
-
Es
gab keine nachweisbare Chromatinkondensation oder cytoplasmatische
Blasenbildung 72 Stunden nach der Exposition von SQ-20B Zellen gegenüber 20 Gy
IR, und die Zellen erschienen den nicht behandelten Kontrollen ähnlich.
Im Unterscheid dazu induzierten 10 μM Chelerythrin eine Chromatinkondensation, eine
cytoplasmatische Blasenbildung und eine internukleosomale DNA-Fragmentation 12
Stunden nach der Exposition gegenüber Chelerythrin. Diese Daten
zeigen, dass, während
SQ-20B ihre Kapazität
behält,
in die Apoptose einzutreten, IR alleine nicht ausreicht, um die
apoptische Antwort zu initiieren.
-
Um
festzustellen, ob die Induktion von Apoptose durch Chelerythrin
die Aktivierung von Kaspasen involviert, wurde der irreversible
zVAD-fmk Peptidinhibitor dieser Proteasen verwendet. Die Zugabe
von zVAD-fmk blockierte die Chelerythrin induzierte Apoptose. Diese
Befunde deuten darauf hin, dass Chelerythrin die Apoptose durch
die Aktivierung von CPP32 oder einer verwandten Kaspase initiiert
(3A–3E).
-
BEISPIEL 3
-
Chelerythrin verstärkt eine
IR-induzierte Apoptose nach Sphingomyelinaseaktivierung
-
Wie
durch den Propidiumiodidausschluss und die FACS-Analyse ermittelt
wurde, senkt die Behandlung von SQ-20B Zellen mit Röntgenstrahlen
(8 Gy) und steigenden Mengen Chelerythrin die Lebensfähigkeit der
Zellen um 25% der Kontrollzellen nach 48 Stunden (4).
Die Verminderung der Lebensfähigkeit
der Zellen stellt die maximale Anzahl von Zellen dar, die bei der
ersten post-IR Zellteilung nach einer IR einen apoptotischen Tod
gestorben sein könnten.
Im Gegensatz dazu senkten 8 Gy IR die klonale Überlebensfähigkeit um 90%. Diese Befunde
legen nahe, dass der Hauptmechanismus eines IR-induzierten Zelltodes
bei der Teilung eintritt (nekrotisch). Die Kombination von 2,5 μM Chelerythrin
und 8 Gy induzierte übereinstimmend
mit Apoptose morphologische Änderungen,
die denen ähnlich
waren, die mit 10 mM Chelerythrin beobachtet wurden und senkte die Überlebensrate
der Zellen um 85% (4). Die kombinierten Effekte
von IR und Chelerythrin erwiesen sich als größer als das gemeinsame Abtöten mit
Konzentrationen von Chelerythrin über 2,5 μM. Diese Ergebnisse deuten darauf
hin, dass der bezeichnete Anstieg des Zelltodes innerhalb von 48
Stunden nach einer Kombinationsbehandlung der Zellen mit Chelerythrin
und IR aus einem Anstieg des apoptotischen Schwellenwerts der SQ-20-B
Zellen gegenüber
IR resultiert.
-
Der
Proteaseinhibitor zVAD-fmk (20 μM)
inhibierte die Apoptose nach der Kombinationsbehandlung von Zellen
mit IR und Chelerythrin (2,5 μM), ähnlich zu
dem, was mit Chelerythrin alleine (10 μM) beobachtet wurde. Frühere Studien
legten nahe, dass nicht-spezifische PKC-Inhibitoren die G2/M-Phase des Zellzyklus verkürzen und
daher die Abtötung
der Zellen durch ionisierende Strahlung verstärken (Thompson und Fields, 1996).
In der vorliegenden Erfindung führte
eine Behandlung von SQ20-B-Zellen mit 0,5–1 μM Chelerythrin nicht zu einer
Verkürzung
der G2/M- Phase,
die in bestrahlten Zellen beobachtet wurde. Konzentrationen von Chelerythrin
alleine, die Apoptose induzierten (5 μM) induzierten allerdings ebenfalls
eine Arretierung in der G2/M-Phase des Zellzyklus (Thomson und Fields,
1996). Diese Ergebnisse zeigen, dass Chelerythrin bei Konzentrationen,
die unter dem Schwellenwert liegen, der eine Kaspase-abhängige Apoptose
induziert, den Tod bei der Zellteilung erhöht.
-
Frühere Arbeiten
haben nahegelegt, dass Chelerythrin die Apoptose teilweise durch
die Aktivierung von Sphingomyelinasen verstärkt (Chmura et al., 1996b).
Die Aktivitäten
der neutralen und saueren Sphingomyelinasen wurden in bestrahlten
SQ20B-Zellen gemessen, wobei ein gemischter Mizellenassay verwendet wurde.
Die Exposition von SQ20B-Zellen gegenüber 10 Gy führte nicht zu einer Veränderung
der Sphingomyelinaseaktivität
innerhalb von 30 Minuten der Behandlung (5A). SQ-20B-Zellen
wurden für
30 Minuten mit 5 μM
Chelerythrin vorbehandelt und anschließend einer Strahlung von 10
Gy exponiert. In Übereinstimmung mit
Befunden in anderen Zelllinien (Chmura et al., 1996a; Chmura et
al., 1996b) stiegen die neutralen und sauren Sphingomyelinasen innerhalb
von 5 Minuten der IR Exposition auf ungefähr 200% (p < 0,03) bzw. auf etwa 170% (p < 0,005) der unbehandelten
Kontrolle an (5B). Eine Ceramidproduktion
und ein entsprechendes Abfallen der Sphingomyelinmasse folgten dem
Anstieg der Sphingomyelinaseaktivität. Signifikanterweise verstärkte 30
Minuten vor der Bestrahlung von außen zugegebenes Ceramid die
IR-induzierte Abtötung
der Zellen (5C). Diese Untersuchungen zeigen,
dass die Kombination von Chelerythrin und IR die Sphingomyelinaseaktivität vor dem
Auftreten von Apoptose verstärkt.
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BEISPIEL 4
-
Chelerythrin verstärkte die
Apoptose und Zellabtötung
durch Röntgenstrahlen
in vivo
-
Der
Anstieg der Zellabtötung
durch Chelerythrinchlorid nach IR in vivo verstärkte die Abtötung von
Tumorzellen von SQ-20B Xenotransplantaten in Nacktmäusen. Tumore
mit anfänglichen
mittleren Volumina zwischen 305–895
mm3 wurden mit 2 mg/kg Cheletrytrinchlorid
(LD50 25 mg/kg IP) viermal während der
Behandlung an den Tagen 0, 3, 7 und 10 injiziert. Strahlung wurde
in einer Konzentration von 5 Gy/Tag, 4 Tage in der Woche in einer
Gesamtdosis von 50 Gy zugeführt.
Die Tiere in allen Behandlungsgruppen erschienen während der
gesamten Studie gesund. Wie in 6 gezeigt,
zeigen die für
4 separate Experimente aufgestellten Daten, dass Chelerythrinchlorid
(n = 43) oder Strahlung alleine (n = 28) zunächst das erneute Wachstum des
Tumors im Vergleich mit den Puffer-injizierten Kontrollen (n = 26)
inhibierte. Allerdings erreichte bis zum Tag 30 nach der Behandlung
das Wachstum des Tumors 138% bzw. 174% des ursprünglichen Volumens in den Gruppen, die
mit Strahlung bzw. Chelerythrin alleine behandelt wurden.
-
In
der Gruppe mit der Kombinationsbehandlung zeigten 20/41 Tiere am
Tag 31 eine Regression des Tumors auf weniger als 10% seines ursprünglichen
Volumens. Im Gegensatz dazu zeigten 1/16 der mit Strahlung + Puffer
behandelten Tiere und 13/43 der nur mit Chelerythrin behandelten
Tiere eine Regression auf weniger als 10% des ursprünglichen
Tumorvolumens. Daher ist der Kombinationseffekt von Chelerythrin
und IR größer als
die additiven Effekte jeder Behandlung alleine. Eine histologische
Analyse der Tumore zeigte bereits 4 Tage nach der Kombinationsbehandlung
große
Bereiche von verstärkter
Tumornekrose im Vergleich zur Röntgenbestrahlung
(XRT) oder Chelerythrinbehandlung alleine auf. Charakteristische
Schnitte von nicht-nekrotischen Bereichen von Tumoren wurden mit
DAPI gefärbt,
um nukleäre
Veränderungen
der Apoptose nachzuweisen. Tumorschnitte wurden am Tag 7 nach der
Behandlung mit zwei Injektionen von Chelerythrin alleine, 20 Gy
alleine, eine Injektion von Chelerythrin und 20 Gy oder zwei Behandlungen
mit Chelerythrin und 20 Gy entnommen. Die Zellkerne aus nicht-nekrotischen
Bereichen der Tumore, die mit Strahlung alleine behandelt wurden,
erschienen abgerundet und zeigten ein glattes Heterochromatin-Erscheinungsbild.
In diesen Bereichen konnten nur wenige apoptotische Zellkerne, wie
sie durch eine Verlagerung des Chromatins an den Rand und eine nukleäre Schrumpfung
definiert sind, nachgewiesen werden. Die Zellkerne aus Chelerythrin
-behandelten Tumoren erschienen ähnlich
denen aus strahlungsbehandelten Tumoren.
-
Im
Gegensatz zu den Einzelbehandlungen mit Strahlung oder Chelerythrin
alleine, erschienen die Zellkerne aus Tumoren, die mit einer Einzeldosis
von Chelerythrin und 20 Gy, aufgeteilt auf 5 Gy/Tag für 4 Tage, behandelt
wurden als geschrumpft und fragmentiert innerhalb der nicht-nekrotischen
Tumorschnitte. In den Tumoren, die mit zwei Behandlungen von Chelerythrin
und Röntgenstrahlung
behandelt wurden, konnten keine Bereiche mit lebensfähigem Gewebe
gefunden werden. Während
die Behandlung der Tumore mit IR in dem darunter liegenden Epidermis-
und Muskelgewebe eine typische Entzündungsreaktion und Nekrose
induzierte, verstärkte
eine Kombinationsbehandlung der Tumore mit Röntgenstrahlung und Chelerythrin
diese Reaktion nicht, was nahe legt, dass die verstärkte Abtötung der
Zellen durch Chelerythrin auf den Tumorherd begrenzt war. Diese
Ergebnisse zeigen, dass, während
ionisierende Strahlung Apoptose in vivo nicht induzieren kann, Chelerythrin
die strahlungsinduzierte Abtötung
von Zellen durch die Induktion von Apoptose innerhalb von Tagen
der Behandlung verstärkt
und dass die darunter liegenden und umgebenden normalen Gewebe von den
Effekten dieser Behandlung relativ verschont bleiben.
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BEISPIEL 5
-
PKC-Inhibierung induziert
Apoptose und Ceramidproduktion
-
Um
mögliche
Interaktionen zwischen der PKC-Aktivität, Ceramidproduktion und Apoptose
zu verstehen, wurden zwei Inhibitoren der PKC, Chelerythrinchlorid
und Calphostin-C, eingesetzt. Chelerythrinchlorid und Calphostin-C
kompetitieren um die konservierten katalytischen Bereiche bzw. regulatorischen
Domänen der
PKC und sind potente und spezifische Inhibitoren der PKC-Isoformen
(α, β, δ, ε), die in
WEHI-231-Zellen gefunden werden (Chmura et al., 1996a; Rotenberg
et al., 1995; Herbert et al., 1990; Haggerty und Monroe, 1994).
Die PKC-Inhibierung mit Chelerythrin oder Calphostin-C induzierte
Apoptose. Ferner verstärkte
eine Behandlung der Zellen mit Chelerythrin oder Calphostin-C die
Ceramidproduktion nach der Aktivierung einer neutralen Sphingomyelinase,
was darauf hindeutet, dass PKC und der sekundäre Lipid-Botenstoff Ceramid entgegengesetzte
Rollen in der Bestimmung des Überlebens
nach unterschiedlichen zellulären
Signalen spielen.
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Chelerythrin und Calphostin
C induzierten Apoptose
-
Vierundzwanzig
Stunden nach der Zugabe von Chelerythrin (10 μM) oder Calphostin C (250 nM)
zu in Komplettmedium wachsenden WEHI-231, zeigte eine Propidiumiodid
FACS-Analyse einen über
90%-igen Zelltod. Eine Gelelektrophorese von DNA niedrigen Molekulargewichts
und einer DAPI-Fluoreszenzfärbung zeigte
DNA-Leiterbildung und nukleäre
Kondensation auf. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass
WEHI-231 nach der Behandlung mit Inhibitoren der PKC in die Apoptose
eintreten.
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Von
Chelerythrin und Calphostin-C wurde herausgefunden, dass sie mit
exogenen Ceramidanalogen synergistisch zusammenwirken, um Apoptose
zu induzieren (Chmura et al., 1996a). Dieser Befund ist mit früheren Berichten
konsistent, die zeigen, dass Phorbolester die Ceramidtoxizität in WEHI-231
und anderen Zelllinien begrenzen (Haimovitz-Friedman et al., 1994a;
Gottschalk und Quintans, 1995; Obeid et al., 1993). Da die Aktivierung
der PKC die Ceramidproduktion begrenzen kann (Fuks et al., 1994;
Haimovitz-Friedman et al., 1994a; Haimovitz-Friedman et al., 1994b),
wurden die Effekte einer verminderten PKC-Aktivität auf die
Ceramidakkumulation untersucht.
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Ceramidproduktion beruht
auf der Aktivierung einer neutralen Sphingomyelinase
-
Um
zu überprüfen, ob
eine PKC-Inhibierung die Ceramidproduktion verändert, wurde der DAG-Kinase-Assay
verwendet, um das intrazelluläre
Ceramid nach einer Chelerythrin- und Calphostin-C-Behandlung zu quantifizieren (Dressler
und Kolesnick, 1990; Preiss et al., 1986). 7A zeigt
den Zeitverlauf der Ceramidproduktion nach der Zugabe von 10 μM Chelerythrin
zu expontentiell wachsenden Zellkulturen. Ungefähr 30 Minuten nach der Zugabe
von Chelerythrin stieg die Ceramidproduktion um 100% über den
Grundwert und kehrte innerhalb von Stunden fast auf die Menge vor
der Behandlung zurück.
Dementsprechend induziert eine PKC-Inhibierung die Ceramidakkumulation
innerhalb der ersten Stunde nach der Behandlung mit dem Inhibitor.
-
Um
zu untersuchen, ob der Anstieg des Ceramids durch die Hydrolyse
seiner entsprechenden Vorläufer
oder aus einer Neusynthese von Lipid stammt, wurden die Sphingomyelinkonzentrationen
in WEHI-231 nach einer Behandlung mit Chelerythrin untersucht. Zellen
(4 × 106) wurden mit [3H]-Palmitat
(10 μCi/ml)
für 24 Stunden
markiert, das gesamte Lipid extrahiert und mit einer Dünnschichtchromatographie
wie bereits beschrieben aufgetrennt (Quintans et al., 1994). 7A zeigt,
dass die Menge an Sphingomyelin parallel zum Anstieg des Ceramids
abnimmt und seine geringste Konzentration (etwa 55% der Kontrolle)
60 Minuten nach der Behandlung mit dem Inhibitor erreicht. Wie in 7B gezeigt
ist, besitzt Calphostin-C ähnliche
Effekte auf die Cermidproduktion und Sphingomyelinkonzentrationen.
Daher verursachte die Inhibierung der PKC nicht nur eine Erhöhung des intrazellulären Ceramids,
sondern auch eine gleichzeitige Abnahme des Sphingomyelins, was
nahe legt, dass Ceramid durch die Hydrolyse seines Vorläufers durch
eine Sphingomyelinase hergestellt wird.
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Um
zu bestätigen,
dass die Ceramidakkumulation auf einer erhöhten Sphingomyelinaseaktivität beruht,
wurde ein gemischter Mizellenassay verwendet, um die Enzymaktivität in vitro
zu quantifizieren. Vorzugsweise wurde Chelerythrin wegen seiner
größeren Löslichkeit
und lichtunabhängigen
Aktivität
für diese
Untersuchungen verwendet. 7C zeigt,
dass neutrale, aber nicht saure, Sphingomyelinaseaktivität auf 235% (+/–38 SD)
der Kontrolle innerhalb von 30 Minuten der Exposition gegenüber Chelerythrin
anstieg, was nahe legt, dass ein Großteil der Ceramidakkumulation
aus der Hydrolyse von Sphingomyelin resultiert. Hitze-inaktiviertes
Chelerythrin besaß weder
einen Effekt auf die Lebensfähigkeit
der Zellen noch auf die Sphingomyelinaseaktivierung. Ferner induzierte
Chelerythrin bei Untersuchungen in Abwesenheit der zellulären Präparationen
keine Hydrolyse des markierten Sphingomyelins, was zeigt, dass die
erhöhte
zelluläre
Sphingomyelinaseaktivität
für die
Sphingoymyelinhydrolyse verantwortlich war.
-
Die
Mechanismen, durch die Ceramid den Zelltod vermitteln kann, sind
immer noch unbekannt. Frühere
Untersuchungen haben eine Vielzahl von Angriffszielen für den Ceramidsignalweg
aufgezeigt, einschließlich
einer Serin/Threonin-Kinase (CAPK) und -Phosphatase (CAPP), PKC-Isoformen
(Lozano et al., 1994), p54 (Kharbanda et al., 1995) und Phospholipase
D (Gomez-Munoz et al., 1994; Venable et al., 1994). Da Veränderungen
des oxidativen Status eine große
Menge zellulärer
Reaktionen induzierte, einschließlich Wachstum und Apoptose
in WEHI-231 und anderen Lymphozyten, wurde die Inhibierung der PKC
und eine resultierende Akkumulation von Ceramid auf ihren Effekt
auf die Konzentration reaktiver Sauerstoffspezies innerhalb der
Zelle untersucht, wobei der Farbstoff Dichlordihydrofluoreszein
und FACS-Analyse verwendet wurden. Wie in 8A gezeigt
ist, induzierte eine IgM Vernetzung auf der Oberfläche eine
charakteristische Aktivierung der PKC und die Produktion reaktiver
Sauerstoffspezies (ROS), was mit früher berichteten Daten konsistent
ist (Blumberg, 1988). Die Zugabe von 30 μM exogenen Ceramids (8B)
oder 10 μM
Chelerythrin (8C) für 15 Minuten reduzierte die
ROS in den Zellen, was nahe legt, dass die Akkumulation von Ceramid
als ein Reduktionsmittel wirkt. Während eine nicht-toxische Oxidation
das Zellwachstum fördern
kann, kann eine intrazelluläre
Reduktion zu einer Aktivierung von Cysteinproteasen führen, die
als Mediatoren der Apoptose im Gespräch sind.
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass die Inhibierung der PKC-Aktivität Apoptose
in WEHI-231-Zellen
teilweise durch die Aktivierung einer neutralen Sphingomyelinase
und eine darauf folgende Akkumulation von Ceramid induzieren kann.
Es wurde früher
bereits gezeigt, dass eine PKC-Aktivierung durch Phorbolester die
Ceramidproduktion begrenzt und die Zellen vor einer durch eine Sphingomyelinhydrolyse
induzierten Apoptose schützt
(Haimovitz-Friedman et al., 1994a; Gottschalk et al., 1995). Diese
Ergebnisse deuten darauf hin, dass die PKC-Aktivität und der
Ceramidsignalweg bei der Bestimmung des Schicksals einer Zelle entgegengesetzte Rollen
spielen. Die Produktion von Ceramid und die Aktivierung seiner apoptotischen
Signalkaskade kann neuartige therapeutische Angriffsziele für die Verstärkung der
Apoptose in Tumorzellen darstellen.
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BEISPIEL 6
-
Verlust der Ceramidproduktion
verleiht Resistenz gegenüber
strahlungsinduzierter Apoptose
-
Die
nukleären
Veränderungen
der Apoptose in WEHI-231 JM Lymphomzellen nach einer Bestrahlung wurden
durch die Färbung
ganzer Zellen mit DAPI untersucht. Die nach 20 Gy folgende charakteristische
nukleäre
Kondensation wurde in über
95% der mittels des Propidiumiodidausschlusses und einer FACScan-Analyse
quantifizierten Zellen innerhalb von 24 Stunden beobachtet. Um festzustellen,
ob die ionisierende Strahlung das extranukleäre Kompartiment benötigt, um
die nukleären
Veränderungen
der Apoptose zu induzieren, wurden isolierte WEHI-231 JM Zellkerne
bestrahlt. Dosen von 20 bis 40 Gy waren nicht in der Lage, apoptotische
Veränderungen
weder in der Kernmembran noch im Chromatin über 72 Stunden nach der Bestrahlung zu
induzieren. Allerdings erfolgte in isolierten WEHI-231 JM Zellkernen
eine DNA-Kondensation und ein nukleärer Zerfall, was für eine Apoptose
innerhalb von 5 Stunden nach der Behandlung mit dem Kinaseinhibitor Chelerythrinchlorid
charakteristisch ist. Diese Befunde zeigten, dass nukleäre Signale
alleine nicht für
die Apoptose intakter Zellen nach Röntgenstrahlen ausreichten und
legten nahe, dass extranukleäre
Ereignisse für eine
strahlungsvermittelte Apoptose in diesen Zellen benötigt wurden.
-
Da
Ceramid als extranukleäres
Signal im Gespräch
ist, das in der Reaktion auf ionisierende Strahlung und andere Mediatoren
der Apoptose beteiligt ist (Dressler et al., 1992; Gottschalk et
al., 1995; Ji et al., 1995, Martin et al., 1995), wurde die Ceramidproduktion
nach Exposition von Zellen gegenüber
8 Gy gemessen, da diese Dosis von Röntgenstrahlen in beinahe 100%
der WEHI-231 innerhalb von 72 Stunden Apoptose induziert. 9A zeigt
den Zeitverlauf der Ceramidproduktion nach der Bestrahlung von exponentiell
wachsenden WEHI-231 JM-Zellen. Die Ceramidproduktion, gemessen mit
dem DAG-Kinaseassay,
stieg auf 140% (p < 0,002) über dem
Grundwert (78 +/– 18
pmols/106 Zellen) ungefähr 30 Minuten nach der Exposition
gegenüber Röntgenstrahlen
gleichzeitig mit einem Anstieg in der Aktivität neutraler Sphingomyelinase
(9B), die in 138% (p < 0,04) der unbestrahlten Kontrolle
(9B) gipfelte. Im Gegensatz zu anderen kürzlichen
Berichten war die saure Sphingomyelinase mit ihrem Basalwert von
7,6 pmols/mg/min in dieser Zelllinie unverändert. Diese Befunde unterstützen einen
zeitlichen Zusammenhang zwischen der Ceramidproduktion, Aktivierung der
neutralen Sphingomyelinase und der Induktion von Apoptose nach Bestrahlung.
Während
andere Berichte eine Dosis-Reaktionsbeziehung zwischen Strahlungsdosis
und der Ceramidproduktion anzeigen, waren die beobachteten Unterschiede
in der Ceramidproduktion zwischen 1 Gy und 8 Gy nicht statistisch
signifikant.
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Um
festzustellen, ob der beobachtete Anstieg in der Ceramidproduktion
zu der strahlungsvermittelten Apoptose beiträgt, wurde eine Variante der
WEHI-231-Zelllinie, die gegenüber
Veränderungen
in der Ceramidproduktion nach einer Röntgenstrahlexposition resistent
ist, selektioniert. Es wurde gefolgert, dass eine Inhibierung der
Ceramidase auf Zellen selektionieren würde, die gegenüber der
Produktion von Ceramid intolerant sind und dass eine Resistenz gegenüber N-Oleoylethanolamin
in einer verringerten Ceramidproduktion nach zellulären Stresssituationen
resultieren würde.
WEHI-231 JM-Zellen wurden mit dem Ceramidaseinhibitor N-Oleoylethanolamin
inkubiert (Ambrosini et al., 1994). Die intrazelluläre Ceramidakkumulation
stieg im Vergleich zu den Grundwerten innerhalb von 24 Stunden in
einer dosisabhängigen
Art und Weise an. Die resultierende Zelllinie, WEHI-231 OE, besitzt ähnliche
Grundwerte in der Ceramidproduktion (100 +/– 10 pmols/106 Zellen)
im Vergleich zu der JM-Linie. 9B zeigt
den relativen Anstieg in der Ceramidproduktion, der in wildtypischen
WEHI-231 JM-Zellen nach der Exposition gegenüber 8 Gy beobachtet wurde.
WEHI-231 OE war nicht in der Lage, die Ceramidproduktion im Vergleich
zu nicht-bestrahlten OE Kontrollzellen zu erhöhen. Wie in der JM-Linie beobachtet
wurde, wurde die Aktivität
der sauren Sphingomyelinase (22 pmols/mg/min) durch ionisierende
Strahlung nicht verändert.
Dementsprechend führte
die Selektion von Zellen mit N-Oleoylethanolamin zu einer Zelllinie
mit einer veränderten
Aktivität
neutraler Sphingomyelinase nach ionisierender Strahlung. Während die
Grundkonzentrationen von Ceramid in beiden Zelllinien ähnlich waren,
war die OE-Linie nicht in der Lage, die Ceramidproduktion nach Röntgenstrahlen
zu erhöhen.
-
WEHI-231
OE-Zellen waren hinsichtlich ihrer apoptotischen Reaktion nach Röntgenbestrahlung
im Vergleich mit den wildtypischen WEHI-231 JM-Zellen verändert. Der
Terminale-Transferase-Assay
(TdT) zeigte, dass wenigstens 50% der WEHI-231 JM-Zellen 24 Stunden
nach 10 Gy in die Apoptose eintreten (10A).
Nach 48 Stunden blieben zu wenige intakte Zellen übrig, um
weitere Analysen auszuführen.
Im Unterschied dazu traten nach 24 bzw. 48 Stunden nur 12% bzw.
19% der WEHI-231 OE-Zellen in die Apoptose ein. Die WEHI-231 JM
Parentalzelllinie, aber nicht die WEHI-231 OE-Linie, zeigte eine
für Apoptose
charakteristische Leiterbildung der DNA bereits 14 Stunden nach
der Bestrahlung, was die TdT-Ergebnisse bekräftigte. Zusammengenommen zeigten
diese Ergebnisse, dass die Entwicklung eines Apoptose-resistenten
Phänotyps durch
Veränderungen
in der Aktivierung der neutralen Sphingomyelinase und die anschließende Ceramidproduktion
auftreten könnte.
-
Als
nächstes
wurde die Verringerung der Apoptose untersucht, um festzustellen,
ob dies der OE-Linie erlauben würde,
nach einer Röntgenbestrahlung
weiter zu proliferieren. Nach einer Bestrahlung mit 6 Gy setzten
OE-Zellen für über 24 Stunden
ihre Proliferation fort, bevor sie in den Wachstumsarrest eintraten (10B). Die verbliebenen Zellen bestanden hauptsächlich aus
riesigen, multinukleären
Zellen, welche ihre Fähigkeit
verloren haben, Lebendfarbstoffe auszuschließen und letztendlich fragmentierten,
was mit einem post-mitotischen Tod oder nekrotischen Zelltod konsitent
war (Hall, 1994). Das Fehlen einer kontinuierlichen OE-Zellproliferation
und der anschließende
Zelltod zeigten, dass eine apoptotische Reaktion auf ionisierende Strahlung
nur einen Mechanismus darstellt, durch welchen Röntgenstrahlen Zellen töten.
-
Um
die Frage zu beantworten, ob die Resistenz der OE-Sublinie teilweise
auf Veränderungen
der Ceramidmetaboliten oder anderer Ziele beruhte, wurden drei Untersuchungen
unternommen. Eine Vorbehandlung bestrahlter WEHI-231 OE-Zellen mit
dem zelldurchlässigen
Ceramidanalog C2-Ceramid stellte die apoptotische Reaktion zum Zeitpunkt
24 Stunden wieder her (11A). Des Weiteren
waren WEHI-231 JM- und OE-Zellen gegenüber exogenem Ceramid (IC50 = 30 μM)
und gegenüber
dem Sphingosinkinaseinhibitor DL-Threo-dihydrosphingosin (IC50 = 3 μM)
gleichermaßen
empfindlich (11B), von dem berichtet wurde, dass
er spezifisch die Bildung von Sphingosin-1-Phosphat inhibiert – ein Ceramidmetabolit,
von dem berichtet wird, dass er die apoptotischen Effekte der Ceramidproduktion
supprimiert (Cuvillier et al., 1996). Beide Zelllinien waren gegenüber den
Effekten der Sphingosinkinaseinhibierung und der resultierenden
Abnahme des Ceramids gleichermaßen
empfänglich.
Diese Ergebnisse zeigten, dass die zellulären Bestandteile, die mit Ceramid
interagieren, und Apoptose induzieren, in WEHI-231 OE-Zellen unverändert blieben.
Daher kann die Strahlungsresistenz dem Fehlen der Sphingomyelinaseaktivierung
und dem anschließenden
Abfall der Ceramidproduktion nach Bestrahlung zugeschrieben werden.
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass das extranukleäre Kompartiment ein essenzielles
apoptotisches Signal nach der Exposition von Zellen gegenüber ionisierender
Strahlung beisteuert. Mit diesen Daten stimmen Studien überein,
die zeigen, dass extranukleäre
Signale benötigt
werden, um die charakteristischen cytoplasmatischen und nukleären Veränderungen
der Apoptose in Säugetierzellen
zu induzieren (Raff et al., 1994; Jacobson et al., 1994). Diese
Daten legen nahe, dass erworbene Defekte in der Ceramidproduktion,
die auf der Sphingomyelinhydrolyse beruhen, in einem strahlungsresistenten
Phänotyp
resultieren können.
Im Besonderen ist der Verlust der Aktivität der neutralen, aber nicht
der sauren Sphingomyelinase mit der Resistenz gegenüber Apoptose
nach ionisierender Strahlung assoziiert, was im Gegensatz zu früheren Studien
in Knockoutmäusen
der sauren Sphingomyelinase steht (Santana et al., 1996), welche
die saure Sphingomyelinase als Haupteffektor mit der Apoptose in
Verbindung bringen.
-
Die
Aktivität
der sauren Sphingomyelinase in den exponentiell wachsenden JM- und
OE-Linien war im Vergleich mit anderen veröffentlichten Zelllinien niedrig
und zeigte keinen Anstieg nach ionisierender Strahlung. Das Fehlen
der Aktivieirung nach Röntgenstrahlen
und der relativ niedrige Grundwert der Aktivität legen nahe, dass sie kein
Bestandteil der apoptotischen Reaktion auf Röntgenstrahlen in diesem System
ist. Diese Daten zusammen genommen liefern ferner den Beweis, dass
der Verlust der von der neutralen Sphingomyelinase stammenden Ceramidproduktion
einen Mechanismus darstellen kann, durch welchen einige Zelltypen die
Resistenz gegenüber
Röntgenstrahlen
entwickeln.
-
Von
der Umwandlung von Sphingosin zu Sphingosin-1-Phosphat wurde gezeigt,
dass sie die ceramidinduzierte Apoptose inhibiert (Cuvillier et
al., 1996). Daher können
andere Lipidmetaboliten des Ceramids dem Todesweg entgegenwirken,
wie kürzlich
von Cuvillier et al. (1996) vorgeschlagen wurde. Diese Untersuchungen
zeigen, dass eine erhöhte
Sphingosinkinaseaktivität
einen alternativen Weg darstellen kann, wie Zellen eine Resistenz
gegenüber
Röntgenstrahlen
erwerben können.
Diese Daten zeigten, dass sowohl die strahlungsresistenten als auch
die wildtypischen Zelllinien gleichermaßen empfindlich sind gegenüber sowohl
exogenem Ceramid als auch der Inhibierung der Sphingosinkinase und
unterstützen
ferner die Hypothese, dass der Verlust der Ceramidsignalgebung nach
Röntgenstrahlen für den Resistenzphänotyp verantwortlich
ist, was nahe legt, dass Tumorzellen in vivo durch einen ähnlichen
Mechanismus resistent gegenüber
Apoptose werden können.
-
Während ein
Verlust der Aktivierung neutraler Sphingomyelinase und der Ceramidproduktion
die Apoptose verhindert, erleidet die OE-Zelllinie einen mitotischen
oder Teilungstod zu einem späteren
Zeitpunkt. Die frühe
apoptotische Reaktion von JM-Zellen, nach ionisierender Strahlung
in die Apoptose einzutreten, ist teilweise abhängig von der Aktivierung neutraler
Sphingomyelinase und von einem Anstieg in der Ceramidproduktion.
Das Fehlen einer kontinuierlichen Zellproliferation nach der ersten
oder zweiten mitotischen Teilung ist dennoch konsistent mit früheren Untersuchungen,
die zeigen, dass Röntgenbestrahlung
Tumorzellen durch mehrere Mechanismen tötet (Dewey et al., 1995; Szumiel,
1994; Kolesnick et al., 1994; Aldridge et al., 1995).
-
Von
der Ceramidproduktion wird vorgeschlagen, dass sie die Abtötung der
Zellen durch mehrere andere DNA-schädigende Wirkstoffe, einschließlich Daunorubizin
und 1-β-D-Arabinofuranosylcytosin
(ara-C), vermittelt (Strum et al., 1994; Bose et al., 1995). Der
Verlust der Ceramidproduktion kann daher einen generellen Mechanismus
der Resistenz gegenüber
mehreren Formen von antineoplastischen Therapien, die zur Schädigung der
DNA dienen, darstellen. Konventionelle Strategien haben sich bislang
darauf beschränkt, DNA-schädigende
Wirkstoffe als Strahlungssensibilisierer zu verwenden (Vokes und
Weichselbaum, 1990; Horton et al., 1995). Diese Daten legen auch
nahe, dass die Erhöhung
der Ceramidproduktion zur Induktion von Apoptose eine zusätzliche
Strategie für
die Abtötung
von Zellen in der Krebstherapie sein kann.
-
BEISPIEL 7
-
Strahlungsresistente Zellen,
die immun gegen andere Apoptoseinduktoren sind, sind nicht immun
gegenüber Chelerythrin-induzierter
Apoptose
-
Unter
Verwendung bereits beschriebener Verfahren (Chmura, 1996; Chmura
et al., 1996a; Chmura et al., 1996b) wurden drei verschiedene apoptose-resistente
Zelllinien auf ihre Empfindlichkeit gegenüber Apopotose, die durch Chelerythrin
induziert wird, untersucht. Die drei verwendeten Zelllinien waren
bcl-x WEHI-231, die WEHI-231-Zellen darstellen, die mit bcl-x transfiziert
wurden und gegenüber
strahlungsinduzierter Apoptose hoch resistent sind, MG-Zellen und
die im vorhergehenden beschriebenen WEHI-231 OE(JM)-Zellen.
-
Alle
drei Zelllinien wurden mit Chelerythrin und Röntgenbestrahlung wie im Vorhergehenden
beschrieben behandelt (Chmura et al., 1996a; Chmura et al., 1996b),
wobei folgende Modifikationen eingefügt wurden: Zellen wurden gegenüber YVAD-cmk
(100 μM)
prä-exponiert,
einem Proteaseinhibitor der Interleukin 1-b konvertierenden Enzym(ICE)-Unterfamilie
oder gegenüber
ZVAD (20 μM),
das die cpp32β-Familie
von Proteasen inhibiert, wobei die Prä-Exposition für 30 Minuten
vor der Behandlung mit Chelerythrin erfolgte.
-
Überraschenderweise
blockierte die Überexpression
des anti-apoptotischen Proteins bcl-x nicht die Chelerythrin-induzierte
Apoptose (12). Dieses Ergebnis ist unerwartet,
weil bcl-x in der Lage ist, die Induktion von Apoptose durch die
meisten bekannten Apoptoseinduktoren zu blockieren (Bose et al.,
1995; Chen et al., 1995; Choi et al., 1995; Datta et al., 1996;
Datta et al., 1995; Emoto et al., 1995). Die anderen zwei Zelllinien waren
ebenfalls nicht resistent gegenüber
Chelerythrin (12).
-
Die
Exposition gegenüber
YVAD-cmk verhinderte nicht die Chelerythrin-induzierte Apoptose,
nicht einmal bei geringen Dosen von Chelerythrin. Jedoch blockierte
die Exposition gegenüber
ZVAD die Chelerythrin-reduzierte Apoptose, sogar bei Dosen größer als
15 μM Chelerythrin.
-
Diese
Ergebnisse legen nahe, dass bcl-x stromaufwärts von cpp32β wirkt, um
Apoptose zu verhindern, und dass Chelerythrin die Protease cpp32β direkt aktiviert.
-
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