DE60013555T2

DE60013555T2 - Verwendung von 4-h-1-benzopyran-4-on-derivaten als inhibitoren der proliferation von glatten muskelzellen

Info

Publication number: DE60013555T2
Application number: DE60013555T
Authority: DE
Inventors: Campbell Winston PATTERSON; A. Jennifer DUMONT
Original assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc; University of Texas System
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc; University of Texas System
Priority date: 1999-02-01
Filing date: 2000-01-18
Publication date: 2005-09-29
Anticipated expiration: 2020-01-19
Also published as: NZ512822A; RS50242B; OA11755A; AU3209800A; ATE275428T1; CZ300395B6; PL350735A1; WO2000044362A3; NO330512B1; WO2000044362A2; YU54401A; MEP10508A; SI1150746T1; AP1469A; BG65151B1; EP1150746B1; IL144668A; NO20013335L; BG105751A; HUP0200804A2

Description

Sachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von 4-H-1-Benzopyran-4-on-Derivaten als Inhibitoren der Proliferation von glatten Muskelzellen (SMC) in Dosierungen, die weniger als 70 % der Dosierungen, die zur Kontrolle von Tumorwachstum erforderlich wären, betragen.
Erklärung zu föderativ geförderten Forschungsarbeiten beziehungsweise Entwicklungen
Die vorliegende Erfindung wurde mit Unterstützung durch die National Institutes of Health im Rahmen der Stipendien Nr. HL 03658 sowie AG 15234 verwirklicht.
Hintergrund der Erfindung
Die zellulären Antworten auf Gefäßverletzungen – zelluläre Dysfunktion, Aktivierung, Dedifferenzierung, Proliferation und Migration – führen zu klinischen Ereignissen wie der Restenose, die im Anschluss an Bal1on-Angioplastie und die Implantation von Stents zur Behandlung arteriosklerotischer Erkrankungen des Menschen auftritt¹. Die Proliferation von glatten Muskelzellen (SMC) stellt einen allgemeinen – wenngleich möglicherweise verallgemeinernden – Gesichtspunkt von Modellen für Gefäßverletzungen dar und glatte Muskelzellen sind die an Neointima-Läsionen hauptbeteiligten Zellen^2,3. Mit der vermehrten Verwendung von Stents zur Behandlung koronarer Erkrankungen wurde auch der Inhibierung der SMC-Proliferation neuerliches Interesse zuteil, da die In-Stent-Restenose nahezu ausschließlich von der Neointima-Bildung und der SMC-Hyperplasie abhängig ist⁴. Es wird geschätzt, dass allein im Jahr 1997 bei einer Anzahl von 100 000 Patienten eine behandlungsbedürftige In-Stent-Restenose auftrat⁵; insofern hätte ein leicht zu verabreichender, wirkungsvoller Inhibitor der SMC-Hyperplasie weitreichende Auswirkungen auf klinischer wie auch auf wirtschaftlicher Ebene⁶.
Bemühungen, die SMC-Proliferation in Modellen für Gefäßverletzungen entweder durch Modulation von zellulären Mediatoren der proliverativen Antwort oder durch direkten Eingriff in den Mechanismus des Zellzyklus zu inhibieren, haben bedeutenden Einblick in die Neointima-Bildung gewährt. Die Progression des Zellzyklus ist ein streng kontrollierter Vorgang, der in positiver Weise durch Cyclin-abhängige Kinasen (Cdks) sowie deren Cyklin-regulierende Untereinheiten und in negativer Weise durch Cdk-Inhibitoren sowie Tumor-Supressorgene wie das Retinoblastom-Protein (Rb) und p53⁸ reguliert wird.
Eine durch Mediation von Adenoviren erfolgende Überexpression der endogenen Cdk-Inhibitoren p21 und p27^kip1 oder einer konstitutionell aktiven Form von Rb blockiert die Neointima-Bildung im Carotis Injury-Modell der Ratte^9-11; in entsprechender Weise wird durch die Inhibierung der Aktivität des Transkriptionsfaktors E2F durch kompetitive Überexpression von verwandten DNA-Bindungsstellen auch die SMC-Proliferation und die Neointima-Bildung inhibiert¹². Solche Studien stützen die allgemeine Hypothese, dass die Inhibierung des Zellzyklus ein vorteilhaftes Ziel im Hinblick auf die Verhinderung der Bildung von Gefäßläsionen darstellt.
Wenngleich genetische Eingriffe dazu beigetragen haben, die Mechanismen der Regulation der Neointima-Bildung aufzuklären, ist die klinische Eignung dieser genetischen Eingriffe zur Behandlung von Gefäßerkrankungen des Menschen gegenwärtig nicht gegeben. Von breiter Anwendbarkeit sowohl auf experimenteller als – potentiell – auch auf klinischer Ebene wäre eine wasserlösliche Verbindung mit spezifischer, regulatorisch in den Zellzyklus eingreifender Wirkung, die ein niedriges Molekulargewicht aufweist, und dies insbesondere, wenn diese Verbindung über eine Aktivität bei oraler Verabreichung verfügen würde. Das kürzlich identifizierte Flavon Flavopiridol ist ein Cdk-Inhibitor, der die Aktivität von Cdk₂, Cdc₂ und Cdk₄ wirksam blockiert^13-16. Im Gegensatz zu anderen pharmakologischen Inhibitoren von Cdks ist Flavopiridol erwähnenswert auf Grund seiner Kinase-Spezifität, seiner oralen Verfügbarkeit und seiner Wirkungsstärke, da es bereits in nanomolaren Konzentrationen wirksam ist¹⁶. Diese einzigartigen Merkmale ergeben ein günstiges Nebenwirkungsprofil, das zum Test von Flavopiridol in klinischen Phase I-Studien zur Behandlung von behandlungsresistenten Neoplasien geführt hat¹⁷. Unter Berücksichtigung der genannten Eigenschaften haben wir die Fähigkeit von Flavopiridol zur Inhibierung der SMC-Proliferation in vitro sowie nach Ballonverletzungen der Arteria Carotis der Ratte untersucht. Wir zeigen, dass Flavopiridol ein wirksamer und selektiver Inhibitor der Zellzyklus-Progression ist und dass es die SMC-Proliferation sowohl in vivo als auch in vitro blockiert; darüber hinaus wird die Neointima-Bildung durch orale Dosen von Flavopiridol, die unterhalb den Dosen liegen, für die eine toxische Wirkung beim Menschen bekannt sind, wirksam blockiert.
Es wurde nun überraschend festgestellt, dass 4-H-1-Benzopyran-4-on-Derivate geeignete Inhibitoren der SMC-Proliferation darstellen. Es ist bekannt, dass 4-H-1-Benzopyran-4-on-Derivate geeignet sind für die Kontrolle von Tumoren. Dennoch ist es überraschend, dass 4-H-1-Benzopyran-4-on-Derivate entsprechend der vorliegenden Erfindung in Dosierungen, die unter den Dosierungen liegen, die zur Kontrolle von Tumorwachstum eingesetzt werden müssen, wirksam als Inhibitoren der SMC-Proliferation fungieren.
Dementsprechend ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung von 4-H-1-Benzopyran-4-on-Derivaten als Inhibitoren der Proliferation von glatten Muskelzellen.
Abbildung 1: Wirkung von Flavopiridol auf die HASMC-DNA-Synthese
A: Quieszente humane glatte aortale Muskelzellen (HASMC) wurden 24 h in Abwesenheit (-) oder in Gegenwart (+) von bFGF (10 ng/ml) mit den angegebenen Konzentrationen an Flavopiridol (nmol/l) behandelt. Der BrdU-Einbau als ein Maß für die Proliferation wurde mit Hilfe eines Assays auf ELISA-Basis bestimmt und als prozentualer Anteil des Einbaus in Abwesenheit von bFGF-Behandlung ausgedrückt.
*: p < 0,05 im Vergleich zu nicht behandelten Zellen;
p < 0,05 im Vergleich zur Behandlung mit bFGF in Abwesenheit von Flavopiridol.
B: HASMC wurden in Gegenwart oder in Abwesenheit von Flavopiridol (75 nmol/l) mit bFGF (10 ng/ml), Thrombin (2 U/ml) oder Trägersubstanz behandelt und es wurde der BrdU-Einbau bestimmt. *: p < 0,05 im Vergleich zu nicht behandelten Zellen;
**: p < 0,05 im Vergleich zur Behandlung nur mit bFGF;
p < 0,05 im Vergleich zur Behandlung nur mit Thrombin.
Abbildung 2: Wirkung von Flavopiridol auf die HASMC-Proliferation
Quieszente HASMC wurden entweder nur mit bFGF (10 ng/ml) (•), mit bFGF und Flavopiridol (75 nmol/l) (•) oder mit Trägersubstanz (•) behandelt (Anzahl der Behandlungen angegeben) und nach der Behandlung wurden die Zellzahlen bestimmt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Zellen pro Well (× 10³) ausgedrückt.
Abbildung 3: Wirkung von Flavopiridol auf die Cyclin-abhängige Kinase Aktivität in HASMC
Quieszente HASMC wurden in Gegenwart oder in Abwesenheit von Flavopiridol (75 nmol/l) mit bFGF (10 ng/ml), Thrombin (2 U/ml) oder Trägersubstanz behandelt und es wurde die Phosphorylierung von Histon H₁ als ein Maß für die Cdk-Aktivität bestimmt und als prozentualer Anteil der Cdk-Aktivität in Abwesenheit von bFGF-Behandlung ausgedrückt. *: p < 0,05 im Vergleich zu nicht behandelten Zellen; **: p < 0,05 im Vergleich zur Behandlung nur mit bFGF;
p < 0,05 im Vergleich zur Behandlung nur mit Thrombin.
Abbildung 4: Regulierung von Zellzyklus-gekoppelten Proteinen durch Flavopiridol
Quieszente HASMC wurden 24 h in Gegenwart (+) oder in Abwesenheit (-) von bFGF (10 ng/ml), Thrombin (2 U/ml) und/oder Flavopiridol (75 nmol/l) behandelt.
Immunoblotting der Zelllysate erfolgte mit Hilfe spezifischer Antikörper zur Erkennung von Cyclin D₁ (oberes Feld), von PCNA (mittleres Feld) und von phosphoryliertem (pRb) sowie hyperphosphoryliertem (ppRb) Rb (unteres Feld).
Abbildung 5: Wirkung von Flavopiridol auf die Aktivität der MAP-Kinase in HASMC
Quieszente HASMC wurden 30 min in Gegenwart (+) oder in Abwesenheit (-) von bFGF (10 ng/ml), Thrombin (2 U/ml), PD 98059 (30 μmol/l) und/oder Flavopiridol (75 nmol/l1) behandelt. Der Gehalt an phosphoryliertem Erk1 (pErk1) und Erk2 (pErk2) wurde durch Immunoblotting mit Hilfe eines phosphorylierungsspezifischen Antikörpers zur Erkennung beider Proteine bestimmt (oberes Feld). Die Aktivität der MAP-Kinase wurde mit Hilfe eines In-Gel-Kinase-Assays unter Verwendung des Myelin-Basic-Proteins als Substrat bestimmt (unteres Feld).
Abbildung 6: HASMC-Viabilität nach Behandlung mit Flavopiridol
Quieszente HASMC wurden mit Flavopiridol (75 nmol/l), TNF-⎕ (50 ng/ml) oder Trägersubstanz behandelt (Anzahl der Behandlungen angegeben). Die Viabilität der Zellen wurde mittels Trypanblau-Exklusion ermittelt. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als prozentualer Anteil lebensfähiger Zellen, bezogen auf die Gesamtzahl der gezählten Zellen.
Abbildung 7: Inhibierung der Neointima-Bildung an der Arteria Carotis der Ratte durch Flavopiridol nach Ballonverletzung
Die Verhältnisse Neointima/Media wurden anhand von histologischen Schnitten der Arteria Carotis von Ratten, die im Anschluss an die Verletzung 5 Tage mit oder ohne Flavopiridol (5 mg/kg) behandelt wurden, bestimmt. Die Arterien wurden 7 (n=12) und 14 (n=12) Tage nach der Verletzung untersucht. Der prozentuale Anteil PCNA-positiver Kerne (± Standardfehler des Mittelwerts (SEM), ausgedrückt als prozentualer Anteil, bezogen auf die gezählten Kerne) in der Neointima der Arterien zu jedem Zeitpunkt und für jede Behandlungsgruppe ist ebenfalls aufgeführt. *: p < 0,05 im Vergleich zur Behandlung mit Trägersubstanz.
Abbildung 8: Histologische Schnite aus der Arteria Carotis der Ratte
Die Schnitte wurden den Arterien 7 Tage (Felder A und B) und 14 Tage (Felder C und D) nach der Verletzung entnommen. Die in den Feldern A und C gezeigten Arterien stammen von über eine Schlundsonde mit Flavopiridol (5 mg/kg) behandelten Ratten; die in den Feldern B und D gezeigten Arterien stammen von nur mit der Trägersubstanz behandelten Ratten. Vergrößerung des Originals: × 100.
Abbildung 9: Cdk2-Expression in der Arteria Carotis der Ratte nach Ballonverletzung
Die Schnitte wurden den Arterien 7 Tage (Felder A und B) und 14 Tage (Felder C und D) nach der Verletzung entnommen. Die in den Feldern A und C gezeigten Arterien stammen von über eine Schlundsonde mit Flavopiridol (5 mg/kg) behandelten Ratten; die in den Feldern B und D gezeigten Arterien stammen von nur mit der Trägersubstanz behandelten Ratten. Cdk2-positive Kerne, die hauptsächlich in der Neointima vorlagen, wurden nach der Alkalischen Phosphatase-Methode mit Vektorblau gefärbt. Vergrößerung des Originals: × 100.
Geeignete 4-H-1-Benzopyran-Derivate sind Verbindungen der Formel I
Formel I in welcher
R₁ Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Aryl-C₁-C₄-alkyl; durch Halogen, Hydroxy oder Carboxy substituiertes C₁-C₆-Alkyl; C₃-C₆-Cycloalkyl, Pyridyl, Thienyl, C₃-C₆-Cycloalkyl-C₁-C₄-alkyl, C₂-C₆-Alkenyl, C₂-C₆-Alkinyl, Phenyl; durch Halogen, C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Alkoxy, Hydroxyl, Carboxyl, COO-Alkyl, CONH₂, CONH-Alkyl, CON(Alkyl)₂, Nitro, Trifluormethyl, Amino, C₁-C₄-Alkylamino, Di-C₁-C₄-alkylamino oder Phenyl mono- oder polysubstituiertes Phenyl; Naphthyl, Carboxyl, -CHO, COO-C₁-C₄-Alkyl, eine primäre Aminogruppe, Alkylamino, Aralkylamino, Dialkylamino, Amido, Arylamino, Diarylamino oder -CH₂O-C₁-C₄-Alkyl steht;
R₂ für Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Aryl, Nitro, Amino, Di-C₁-C₄-alkylamino, Halogen, Hydroxyl, Alkoxy, -COOH, -COO-C₁-C₄-Alkyl, -CHO, -CH₂OH oder -CH₂O-C₁-C₄-Alkyl steht;
R₃ für Wasserstoff, C₁-C₄-Alkyl; durch Halogen, Hydroxy oder Carboxy substituiertes C₁-C₄-Alkyl; Hydroxyl, Carboxyl, Nitro, Amino, C₁-C₄-Alkylamino, Di-C₁-C₄-alkylamino, Halogen, -O-Alkyl-C(O)-alkyl, -CHO, -CH₂OH, -CH₂O-C₁-C₄-Alkyl oder R₂N-C(O)-O-, wobei R für H, C₁-C₆-Alkyl, Cycloalkyl steht; oder -O-Alkyl-C(O)-alkyl oder Aryl steht;
R₄ für Wasserstoff, Hydroxyl, C₁-C₄-Alkoxy, C₁-C₄-Alkanoyloxy, C₁-C₄-Alkoxycarbonyl, Aryloxy, Amino, C₁-C₄-Alkylamino, Di-C₁-C₄-alkylamino oder R'₂N-C(O)-O- steht, wobei R' für H, C₁-C₆-Alkyl, Cycloalkyl oder Aryl steht;
R₅ für Wasserstoff, C₁-C₆-Alkyl, Aryl-C₁-C₄-alkyl, C₃-C₆-Cycloalkyl, C₃-C₆-Cycloalkyl-C₁-C₄-alkyl, Alkylamino, C₁-C₄-Alkanoyl, -C(O)-O-C₁-C₄-Alkyl oder Aroyl steht,
wobei die Arylgruppe in R₁, R₂, R₃, R₄ und R₅ für unsubstituiertes Phenyl oder Phenyl, das durch Halogen, C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Alkoxy, Hydroxyl, Carboxyl, COO-Alkyl, CONH₂, CONH-Alkyl, CON(Alkyl)₂, Nitro, Trifluormethyl, Amino, C₁-C₄-Alkylamino, Di-C₁-C₄-alkylamino oder Phenyl mono- oder polysubstituiert ist, steht;
m für eine ganze Zahl zwischen 0 und 3 steht und n für 1 steht,
oder ein pharmakologisch unbedenkliches Säureadditionssalz davon.
Die Verbindungen entsprechend der Erfindung weisen zwei Asymmetriezentren auf, eines an der Stelle, über die der Heterocyclus, der das Stickstoffatom enthält, an die Benzopyraneinheit gebunden ist (C-4'), das andere am R₄-substituierten Kohlenstoffatom (C-3'), was bedeutet, dass zwei Paare optischer Isomere möglich sind. Die Definition der Verbindungen entsprechend der Erfindung umfasst alle möglichen Stereoisomere und deren Gemische. Sie umfasst ganz ausdrücklich die racemischen Formen ebenso wie die isolierten optischen Isomere, welche die spezifische Aktivität aufweisen. Die beiden Racemate können mit Hilfe physikalischer Verfahren, wie beispielsweise durch fraktionierte Kristallisation, voneinander getrennt werden. Die einzelnen optischen Isomere können aus den Racematen durch gebräuchliche Verfahren, wie beispielsweise Salzbildung mit einer optisch aktiven Säure und anschließende Kristallisation, erhalten werden.
Beispiele für Alkylgruppen, die für R₁ bis R₅ geeignet sind, sind geradkettige oder verzweigte Reste mit bis zu 6, vorzugsweise bis zu 5 Kohlenstoffatomen, zum Beispiel Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, t-Butyl-, Pentyl- und Isopentylgruppen.
Beispiele für substituierte Alkylgruppen, die für R₁ bis R₅ geeignet sind, sind Haloalkylgruppen, wie Trifluormethyl, Hydroxyalkylgruppen, wie Hydroxyethyl, und Carboxyalkylgruppen, wie Carboxyethyl.
Geeignete Beispiele für eine Cycloalkylgruppe, die 3 bis 6 Kohlenstoffatome aufweist und die durch R₁ bis R₅ dargestellt wird, sind Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl und Cyclohexyl. Cyclopropylmethyl ist ein Beispiel für eine Cycloalkylalkylgruppe.
Ein Beispiel für eine Aralkylgruppe, die durch R₁ bis R₅ dargestellt wird, ist eine Phenylalkylgruppe, in der die Phenylgruppe unsubstituiert oder mit Substituenten wie Halogen, C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Alkoxy, Nitro, einer Trifluormethyl- oder einer gegebenenfalls substituierten Aminogruppe mono- oder polysubstituiert ist.
Beispiele für eine Arylgruppe, die durch R₁ bis R₅ dargestellt wird, sind unsubstituierte oder mit Substituenten wie Halogen, C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Alkoxy, Hydroxyl, Carboxyl, COO-Alkyl, CONH₂, CONH-Alkyl, CON(Alkyl)₂, Nitro, Trifluormethyl, Amino, C₁-C₄-Alkylamino oder Di-C₁-C₄-alkylamino mono- oder polysubstituierte Phenylgruppen; heterocyclische aromatische Gruppen, wie Pyridylgruppen; und polycyclische aromatische Reste, wie Naphthylgruppen.
Ein geeignetes Beispiel für eine Alkylaminogruppe, die durch R₁ bis R₅ dargestellt wird, ist (CH₂)_n-NR₆R₇, wobei n für 1, 2 oder 3 steht und R₆ und R₇ Alkylreste entsprechend den oben für R₁ bis R₅ definierten Alkylresten sind; darüber hinaus können R₆ und R₇ jedoch auch zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen Heterocyclus bilden, der ein oder mehrere Heteroatome aufweist. Geeignete Beispiele für Heterocyclen, die von R₆ und R₇ zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, gebildet werden, sind Piperidin, Pyrrolidin, Morpholin, Piperazin und Imidazol, die alle entweder unsubstituiert oder an einer oder mehreren Positionen mit C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Alkoxy, Aryl, Hydroxyl oder einer Aminogruppe substituiert sein können.
Geeignete Beispiele für Salze der Verbindungen entsprechend der Erfindung mit anorganischen oder organischen Säuren sind Hydrochloride, Hydrobromide, Sulfate, Phosphate, Acetate, Oxalate, Tartrate, Citrate, Maleate und Fumarate.
Bevorzugt werden Verbindungen der Formel Ia
Formel Ia in welcher
R₁ für Wasserstoff, C₁-C₃-Alkyl, Naphthyl, Phenyl; Phenyl, das mit Halogen, C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Alkoxy, Hydroxyl, Carboxyl, COO-Alkyl, CONH₂, CONH-Alkyl, CON(Alkyl)₂, Nitro, Trifluormethyl, Amino, C₁-C₄-Alkylamino, Di-C₁-C₄-alkylamino oder Phenyl mono- oder polysubstituiert ist; Pyridyl oder Thienyl steht;
R₂ für Wasserstoff oder C₁-C₃-Alkyl steht; und
R₅ für C₁-C₃-Alkyl, C₃-C₅-Cycloalkyl oder C₃-C₅-Cycloalkyl-C₁-C₄-alkyl steht.
Besonders bevorzugt werden Verbindungen, der Formel Ia, in welcher
R₁ für Phenyl, Thienyl, Pyridyl, Chlorphenyl, Dichlorphenyl, Methylphenyl, Aminophenyl, Bromphenyl, Hydroxyphenyl oder Naphthyl steht;
R₂ für Wasserstoff steht und
R₅ für Methyl steht.
Eine Verbindung von besonderer Bedeutung ist (–)-cis-5,7-Dihydroxy-2-(2-chlorphenyl)-8-[4-(3-hydroxy-1-methyl)-piperidinyl]-4H-benozopyran-4-on (Flavopiridol), insbesondere in Form des Hydrochlorids.
Die Verbindungen entsprechend der vorliegenden Erfindung können gemäß der Offenlegung der US-Patente Nr. 4 900 727 und Nr. 5 284 856 dargestellt werden. Die Beispiele der genannten US-Patente sind auch für die vorliegende Anmeldung von Bedeutung/Belang.
Die Verbindungen entsprechend der vorliegenden Erfindung inhibieren die Proliferation glatter Muskelzellen. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung bilden daher auch Arzneimittel zur Inhibierung der Proliferation glatter Muskelzellen, die zumindest eine Verbindung der Formel I wie oben definiert oder zumindest ein pharmakologisch unbedenkliches Säureadditionssalz dieser Verbindungen der Formel I enthalten, sowie die Verwendung einer Verbindung der Formel I wie oben definiert zur Herstellung eines Arzneimittels, das eine inhibierende Wirkung auf die Proliferation glatter Muskelzellen aufweist. Typische Anwendungsgebiete für die Verbindungen entsprechend der vorliegenden Erfindung sind Erkrankungen/Störungen/Verletzungen im Zusammenhang mit Läsionen von Gefäßen, die reich an glatten Muskelzellen sind. Ein sehr wichtiges Beispiel hierfür stellen Läsionen nach Ballonverletzungen dar. Ein weiteres wichtiges Anwendungsgebiet ist die Restenose-Vorbeugung nach Stent-Implantationen.
Gemäß der Erfindung werden die 4H-Benzopyran-4-on-Derivate in allgemein bekannter Weise, die dem Fachmann bekannt ist, verwendet. Für Arzneimittel wird eine wirksame Menge der erwähnten aktiven Substanz entweder als solche oder – vorzugsweise – in Kombination mit geeigneten pharmazeutischen Hilfsstoffen in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Suppositorien, Emulsionen, Suspensionen oder Lösungen eingesetzt, wobei der Gehalt an wirksamer Verbindung bis zu 95 % und vorzugsweise 10 bis 75 % beträgt.
Dem Fachmann ist auf Grund seines Fachwissens bekannt, welche Hilfsstoffe für die gewünschte Formulierung des Pharmazeutikums geeignet sind. Neben Hilfsstoffen für Tabletten, Lösungsmitteln, Gelbildnern, Basen für Suppositorien und anderen Trägersubstanzen für die aktive Substanz können beispielsweise Antioxidantien, Dispergiermittel, Emulgatoren, Entschäumer, Geschmacksveränderer, Konservierungsmittel, Lösungsvermittler und Farbstoffe eingesetzt werden.
Die aktive Substanz kann oral, parenteral, intravenös oder rektal verabreicht werden, wobei die orale Verabreichung bevorzugt wird. Für eine Darreichungsform zur oralen Verabreichung kann die aktive Substanz zusammen den für diesen Zweck geeigneten Zusatzstoffen, wie Trägersubstanzen, Stabilisatoren oder inerten Verdünnungsmitteln, mit anderen Verbindungen gemischt werden, wobei die üblichen Verfahren angewandt werden, um die Substanz in geeignete Verabreichungsformen, wie Tabletten, Dragees, Hartgelatine-Kapseln sowie wässerige alkoholische oder ölige Suspensionen oder Lösungen, zu bringen. Beispiele für inerte Trägersubstanzen, die verwendet werden können, sind Gummi arabicum, Magnesia, Lactose, Glucose und Stärke, inbesondere Maisstärke. In diesem Zusammenhang kann die Formulierung in Form von trockenen oder feuchten Granulaten erfolgen. Beispiele für geeignete ölige Trägersubstanzen oder Lösungsmittel sind Öle pflanzlichen oder tierischen Ursprungs, wie Sonnenblumenöl und Lebertran.
Für subkutane oder intravenöse Verabreichung wird, gegebenenfalls unter Verwendung von Substanzen, die für diesen Zweck gebräuchlich sind, wie Lösungsvermittler, Emulgatoren oder andere Hilfsstoffe, eine Lösung, Suspension oder Emulsion der aktiven Substanz hergestellt. Beispiele für geeignete Lösungsmittel sind Wasser, physiologische Natriumchloridlösung und Alkohole, zum Beispiel Ethanol, Propanol und Glycerol, sowie Zuckerlösungen, wie Glucose- und Mannitollösungen, und Gemische der verschiedenen genannten Lösungsmittel.
Die 4H-1-Benzopyran-4-on-Derivate sind in einer Dosis zu verabreichen, die weniger als 70 %, vorzugsweise weniger als 60 % und insbesondere weniger als 50 % der Dosierung, die zur Kontrolle von Tumorwachstum beim entsprechenden Säugetier eingesetzt wird, beträgt. Ein Beispiel wäre – für den Fall eines Nacktmaus-Xenograft-Modells – eine Dosis von etwa 5 mg/kg Körpergewicht, die einmal täglich oral verarbreicht wird. Dies entspricht der Hälfte der Dosierung, die im selben Tiermodell Tumorwachstum inhibiert (Drees et al., Clin. Cancer Res. 1997; 3: 273–279).
Die pharmakokinetischen Eigenschaften der 4H-1-Benzopyran-4-on-Derivate können es erforderlich machen, die besagte Verbindung mehrmals täglich zu verabreichen oder aber Formulierungen zu wählen, aus denen die Verbindung langsam freigesetzt wird.
BEISPIELE
1. Flavopiridol inhibiert die Proliferation glatter Muskelzellen und die Neointima-Bildung in vivo im Carotis Injury-Modell der Ratte, einem Modell für Gefäßverletzungen. Das bewährte Carotis Injury-Modell der Ratte, in dem die Bildung von Neointima-Läsionen nach katheterbedingter Verletzung maßgeblich von der SMC-Proliferation abhängig ist (Clowes et al., Lab. Invest. 1983; 49: 327–333, Clowes et al.; Circ. Res. 1985; 56: 139–145), wurde verwendet, um zu untersuchen, ob Flavopiridol die Blockierung des Wachstums von SMC in vivo ebenso induziert wie dies in vitro der Fall ist. Flavopiridol wurde einmal täglich in einer Dosis von 5 mg/kg oral verabreicht, wobei die Behandlung am Tag der Verletzung begonnen und anschließend für weitere vier Tage fortgeführt wurde, da dieser Zeitraum die Erstinduktion von Cdk2 und die erste Welle der SMC-Proliferation in diesem Modell überspannt (Circ. Res. 1995; 77: 445–465; Circ. Res. 1997; 80: 418–426). 7 und 14 Tage nach der Verletzung wurde eine Quantifizierung der mittleren Intima- und Media-Fläche durchgeführt und die Größe der Neointima-Läsion wurde ausgedrückt als das Verhältnis Neointima-Fläche/Media-Fläche. Jeweils zwölf Tiere bildeten die behandelte und die unbehandelte Gruppe. Nach 7 Tagen betrug das Verhältnis im Falle der Arterien von mit Trägersubstanz behandelten Ratten 1,00 ± 0,05 und im Falle der Arterien von mit Flavopiridol behandelten Ratten 0,65 ± 0,04, was einer Verringerung um 35 % entspricht. Nach 14 Tagen betrug das Verhältnis Neointima/Media bei den mit Trägersubstanz behandelten Ratten 1,08 ± 0,04 und bei den mit Flavopiridol behandelten Ratten 0,66 ± 0,03, entsprechend einer Verringerung um 38,9 %. Diese Wirkung war zu beiden Zeitpunkten statistisch signifikant (P < 0,05).
Verfahren
Materialien
Flavopiridol (L86-8275, (–)-cis-5,7-Dihydroxy-2-(2-chlorphenyl)-8-[4-(3-hydroxy-1-methyl)-piperidinyl]-4H-benzopyran-4-on) wurde von Hoechst Marion Roussel Inc. zur Verfügung gestellt und zur Herstellung einer Vorratslösung für Zellkulturexperimente in einer Konzentraion von 50 mmol/l in Dimethylsulfoxid oder für in vivo-Experimente in Wasser gelöst. Basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) wurde von Collaborative Biochemical und Thrombin von Sigma bezogen. Der MEK1-Inhibitor PD 98059 wurde von New England Biolabs erhalten.
Zellkultur
Humane aortale glatte Muskelzellen (HASMC) wurden von Clonetics erhalten und wie oben beschrieben gezüchtet¹⁸. Die Zellen wurden in den Abschnitten 5–9 verwendet. Vor der Durchführung von Experimenten wurde das Wachstum der Zellen bei 80 % Konfluenz mit Hilfe eines Mediums, das 0,2 % fetales Kälberserum enthielt, für 48 h eingefroren.
Zellproliferations-Bestimmung mittels ELISA
Die Zellproliferation wurde mittels ELISA gemessen (Amersham Life Science). HASMC wurden auf Gelatine-beschichteten 96-Well-Platten gezüchtet und in quieszenten Zustand versetzt. Die Zellen wurden 24 h mit 10 ng/ml bFGF, 2 U/ml Thrombin oder Trägersubstanz behandelt. Flavopiridol (75 nmol/l) wurde 1 h vor der Behandlung mit Wachstumsfaktoren verabreicht. Während der letzten beiden Stunden der Behandlung wurde 5-Brom-2'-desoxyuridin (BrdU) bis zum Erreichen einer Endkonzentration von 10 μmol/l zugegeben. Es wurde der Einbau von BrdU wie beschrieben gemessen¹⁹. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) von 12 Proben pro Zustand aus 2 unabhängigen Experimenten ausgedrückt.
Zellzählungen
Im Wachstum eingefrorene, auf 6-Well-Platten bis 50 % Konfluenz gezüchtete HASMC wurden mit oder ohne Flavopiridol (75 nmol/l) oder bFGF (10 ng/ml) behandelt. Nach der Behandlung wurden die Zellen in Abständen trypsinisiert und die Zellzahlen unter Verwendung eines Hämozytometers bestimmt.
Western Blot-Analyse
Quieszente HASMC wurden in Gegenwart oder in Abwesenheit von Wachstumsfaktoren und/oder von Flavopiridol wie angegeben behandelt. Die Western Blot-Analyse wurde wie bereits beschrieben durchgeführt¹⁸. Die primären Antikörper waren: ein polyklonaler antihumaner Cyclin-D₁-Antikörper (M-20, Santa Cruz), ein monoklonaler anti-humaner PCNA- (proliferating cell nuclear antigen) Antikörper (PC10, Sigma), ein monoklonaler Phosphorylierungs-spezifischer p44/42 (Erk1/Erk2)-MAP-Kinase-Antikörper (New England Biolabs) und ein monoklonaler Anti-Rb-Antikörper (G3-245, Pharmigen), der die phosphorylierten (pRb) und die hoch phosphorylierten (ppRb) Rb-Spezies erkennt. Für Immunoblotting-Studien wurden die Experimente mindestens drei Mal wiederholt.
Cdk-Aktivität
Quieszente HASMC wurden 24 h mit Agonisten und Inhibitoren behandelt, anschließend wurden Ganz-Zelllysate wie für das Western Blotting beschrieben hergestellt. Der Kinase-Nachweis wurde mit Hilfe eines Histon-H₁-Kinase-Assay-Kits (Upstate Biotechnology) unter Beachtung der Vorschriften des Herstellers durchgeführt. Kurz dargestellt, wurden 10 μl der Peptid-Inhibitoren für Protein Kinase C (2 μmol/l) und Protein Kinase A (2 μmol/l), 100 μg Zelllysat, 10 μl Assay-Puffer und 10 μl eines Gemischs, das 75 μmol/l Magnesiumchlorid, 500 μmol/l ATP und 1 μCi/ml [γ-³²P]ATP enthielt, in einem Mikrozentrifugen-Röhrchen gemischt. Nach 10 min Inkubation bei 30 °C wurden Aliquote auf Phosphocellulose-Papiere pipettiert. Die Papiere wurden in 0,75 % Phosphorsäure gewaschen, anschließend erfolgte die cpm-Messung in einem Szintillationszähler (Beckman). Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) von 3 Proben ausgedrückt und repräsentieren drei unabhängige Experimente.
In-Gel-Kinase Assay
Quieszente HASMC wurden 30 min mit Wachstumsfaktoren behandelt und es wurden Ganz-Zelllysate wie für das Western Blotting beschrieben hergestellt. In einigen Experimenten wurden die HASMC 60 min mit 30 μmol/l PD 98059, Flavopiridol oder Trägersubstanz vorbehandelt. Identische Mengen der Proteine (50 μg/Spur) wurden auf einem Polyacrylamid-Gel, das mit 350 μg/ml Myelin Basic Protein copolymerisiert war, getrennt. Das Gel wurde mit [γ-³²P]ATP behandelt und es wurde eine Audioradiographie wie beschrieben¹⁹ durchgeführt.
Trypanblau-Exklusion
HASMC wurden in 5 cm-Schalen bei niedriger Konfluenz gezüchtet und wie beschrieben im Wachstum eingefroren. Die Zellen wurden mehrmals mit Flavopiridol (75 nmol/l) oder Tumor-Nekrosefaktor-⎕ (TNF-⎕; 50 ng/ml) behandelt (Anzahl der Behandlungen angegeben). Nach Entfernen des Mediums wurden 0,4 % Trypanblau in phosphatgepufferter Kochsalzlösung in die Schalen gegeben. Nach 5 min wurden die Zellen in den Schalen unter dem Mikroskop ausgezählt. Blaue Zellen wurden dabei als nicht lebensfähige Zellen gewertet.
Carotis Injury-Modell der Ratte
Verletzung der Arteria Carotis der Ratte erfolgte im Wesentlichen wie beschrieben². Adulte männliche Sprague-Dawley-Ratten (400–500 g, Zivic-Miller) wurden mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (2 mg/kg) und Xylazin (4 mg/kg) narkotisiert. In die linke innere Arteria Carotis wurde nun ein 2F-Embolektomie-Katheter eingeführt. Der Ballon wurde mit Kochsalzlösung aufgeblasen und zur Verursachung einer ausdehnenden und entblößenden Verletzung drei Mal durch die Arterie gezogen. Die rechte Arteria Carotis blieb unverletzt und diente bei jedem Tier als Vergleich zur Verletzung. Unmittelbar nach dem Aufwachen aus der Narkose und über einen Zeitraum von weiteren vier Tagen wurde den Ratten über eine Schlundsonde geblindet Flavopiridol (5 mg/kg in Wasser) oder Wasser verabreicht. Alle Ratten überlebten den Eingriff und es waren keine offenkundigen Anzeichen für Toxizität im Zusammenhang mit der Verabreichung des Arzneimittels in den eingesetzten Dosen zu verzeichnen. Die Ratten wurden zu bestimmten Zeitpunkten nach der Verletzung der Arteria Carotis wie oben narkotisiert und systemisch durch Perfusion mit 4 % Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung fixiert. Die rechte und die linke Arteria Carotis wurden entnommen und durch Injektion von 4 % Paraformaldehyd über das Lumen ausgedehnt, anschließend wurden sie dehydratisiert und bei 4 °C in 70 % Ethanol aufbewahrt.
Die immunohistochemische Analyse erfolgte wie bereits früher beschrieben¹⁸ unter Verwendung des monoklonalen PCNA-Antikörpers und eines polyklonalen anti-humanen Cdk2-Antikörpers (M2-G, Santa Cruz).
Bildanalyse
Die äußersten distalen und proximalen Bereiche jeder Arterie (ungefähr 500 μm) wurden entfernt. Dazwischenliegend wurden aus jeder Arterie zehn Querschnitte (jeweils 8 μm) im Abstand von jeweils 500 μm entnommen und analysiert. Die Schnitte wurden fixiert und wie bereits früher beschrieben¹⁸ mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Mit Hilfe eines Nikon Diaphot 300-Mikroskops sowie eines 4X-Objektivs und unter Verwendung einer Hamamatsu C5985 Videokamera sowie eines TCPro 2.41 (Coreco Inc.) wurde von jedem Querschnitt ein digitales Bild aufgenommen. Die Flächen von Media und Intima wurden unter Verwendung der NIH Image Software bestimmt. Die Grenzen zwischen Media und Intima wurden von einem Begutachter der Schnitte (A.M.) bestimmt und anschließend von einem zweiten Begutachter (C.P.) geblindet nachgeprüft. Die Größe der Läsion wurde ausgedrückt als das Verhältnis Neointima/Media. Für jede Gruppe wurden die Ergebnisse ausgedrückt als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts. Mindestens 92 % der Bilder jeder Gruppe konnten ausgewertet werden, bei den übrigen traten Störungen im Zusammenhang mit der Fixierung auf, sie wurden daher nicht ausgewertet.
Statistische Analyse
Sofern sinnvoll, wurden die Daten der quantitativen Untersuchungen jeweils als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts ausgedrückt. Im Falle von mehreren Behandlungsgruppen wurde eine faktorielle ANOVA, gefolgt von einer Fisher-Abschätzung der kleinsten signifikanten Abweichung durchgeführt. Eine statistische Signifikanz wurde zuerkannt, sofern p < 0,05.
Ergebnisse
Flavopiridol inhibiert die HASMC-Proliferation
Auf Grund der Fähigkeit von Flavopiridol, die Proliferation verschiedener Tumorzelllinien zu inhibieren, untersuchten wir die Hypothese, dass der Einsatz von Flavopiridol das Wachstum von Primärkulturen humaner SMC blockieren würde. Im Wachstum eingefrorene HASMC wurden in Gegenwart steigender Konzentrationen von Flavopiridol 24 h mit dem SMC-Mitogen bFGF (10 ng/ml) behandelt und die Proliferation wurde mit Hilfe eines Assays auf ELISA-Basis gemessen. Im Vergleich zu unbehandelten Zellen war die Proliferation von bFGF-behandelten Zellen auf das 5,4-Fache erhöht (1A).
1-stündige Vorbehandlung mit nur 50 nmol/l Flavopiridol verringerte die HASMC-Proliferation deutlich (auf das 3,9-Fache, p < 0,05), wobei die Wirkung bei Konzentrationen von 75 nmol/l nahezu maximal war. Ähnliche Ergebnisse wurden bei Bestimmung der Thymidin-Aufnahme als ein unabhängiges Maß für die DNA-Synthese erhalten (nicht abgebildet).
Zur Untersuchung der Allgemeingültigkeit der Wirkung von Flavopiridol auf die SMC-Proliferation untersuchten wir auch den Einfluss von Flavopiridol auf die durch Thrombin (2 U/ml) hervorgerufene Mitogenese, wobei das Thrombin über einen G-Proteingekoppelten Rezeptor wirkt, im Gegensatz zum basischen Fibroblastenwachstumsfaktor bFGF, der ein Mitglied der Tyrosin-Kinase-Rezeptor-Familie stimuliert. Flavopiridol (75 nmol/l) inhibierte sowohl die bFGF- als auch die Thrombin-induzierte HASMC-Proliferation in signifikantem und hohem Maße (vom 5,4-Fachen auf das 1,8-Fache beziehungsweise vom 2,4-Fachen auf das 0,7-Fache, p < 0,05, 1B). Um sicherzustellen, dass die Wirkung von Flavopiridol auf die Zellzyklus-Progression in HASMC tatächlich auf einer veränderten Proliferation beruht, führten wir Zellzählungen durch. Der Basische Fibroblastenwachstumsfaktor bFGF (10 ng/ml) bewirkte nach dreitägiger Behandlung eine Erhöhung der Anzahl der Zellen auf das 3-Fache (2). Entsprechend den mit Assays auf ELISA-Basis erzielten Ergebnissen wurde auch in diesem Falle festgestellt, dass Flavopiridol (75 nmol/l) die bFGF-induzierte Proliferation wirksam blockiert.
Flavopiridol inhibiert die Cdk-Aktivität und die Zellzyklus-gekoppelte Genexpression in HASMC
Zur Bestimmung der spezifischen Wirkung von Flavopiridol auf den Mechanismus des Zellzyklus bestimmten wir die Histon-H₁-Kinase-Aktivität in Zelllysaten aus mit Wachstumsfaktoren stimulierten HASMC. Die Phosphorylierung von Histon-H₁ spiegelt die Aktivität von Cdc₂ und Cdk₂ wieder²⁰. Die Behandlung von HASMC mit bFGF und Thrombin führte zu einer Erhöhung der Histon-H₁-Kinase-Aktivität auf das 4,4-Fache beziehungsweise das 3,6-Fache (3). Diese Erhöhungen der Cyclin-abhängigen Kinase-Aktivität wurden durch Vorbehandlung mit Flavopiridol (75 nmol/l) vollständig blockiert.
Die Western-Blot-Analyse diente ebenfalls der Klärung der Frage, ob Flavopiridol die durch Wachstumsfaktoren induzierte Regulierung von Zellzyklus-gekoppelten Proteinen in HASMC beeinflusst. Cyclin-D₁ ist ein G₁-Phase-Cyclin, das mittels Stimulation durch Wachstumsfaktoren heraufreguliert wird und das beim Ausscheiden aus dem Zellzyklus rasch abgebaut wird²¹. Die Gehalte an Cyclin-D₁-Protein wurden infolge 24-stündiger bFGF- und Thrombin-Behandlung auf das 6,3-Fache beziehungsweise das 3,2-Fache heraufreguliert (4), wobei diese Wirkung durch Vorbehandlung mit Flavopiridol vollständig blockiert werden konnte. Entsprechend wurde auch die erhöhte Expression von PCNA, das vorwiegend in Phase S im Zusammenhang mit der DNA-Replikation gebildet wird²², durch Flavopiridol-Vorbehandlung blockiert. Als eine letzte Bestimmung von Zellzyklus-gekoppelten Proteinen untersuchten wir mit Hilfe eines Antikörpers, der phosphoryliertes Rb erkennt, die Rb-Phosphorylierung in Antwort auf die Wachstumsfaktoren-Expression. Rb ist ein Zellzyklus-Regulator, der im nichtphosphorylierten Zustand an den Transkriptionsfaktor E2F anbindet und diesen desaktiviert²³ und der so in vivo das Wachstum von SMC blockiert¹¹. Durch Phosphorylierung wird Rb desaktiviert und die Progression des Zellzyklus durch Phase S kann stattfinden. Die Analyse der Rb-Phosphorylierung ist von besonderer Bedeutung auf Grund der Tatsache, dass Rb einen Angriffspunkt von Dck2 und Cdk4 in vivo darstellt. Sowohl Thrombin als auch bFGF induzierten eine Hyperphosphorylierung von Rb, wohingegen diese Wirkung durch Flavopiridol inhibiert wurde. Insgesamt betrachtet, zeigen diese Ergebnisse, dass Flavopiridol im Zusammenhang mit seiner wachstumsinhibitorischen Wirkung die Expression und die Aktivität von an die G₁- und die S-Phase gekoppelten Regulationselementen des Zellzyklus beeinflusst.
Flavopiridol hat keine Auswirkung auf die Phosphorylierung und die Aktivität der MAP-Kinase
Um sicherzustellen, dass Flavopiridol spezifisch auf der Ebene des Zellzyklus wirkt und nicht in unspezifischer Weise in die Upstream-Signalkaskade der Kinase eingreift, bestimmten wir die Phosphorylierung und die Aktivität von Erk1 (p44 MAP-Kinase) und Erk2 (p42 MAP-Kinase), zwei Vertretern der Familie der MAP-Kinasen. Wir haben diese Kinasen ausgewählt, weil sie unmittelbar upstream von Transkriptionsereignissen, die in Antwort auf Wachstumsstimulantien stattfinden, und downstream von einer Anzahl entscheidender mitogener Signalkaskaden²⁴ auftreten. Eine intakte Antwort der MAP-Kinasen zeigt daher an, dass die mitogenen Upstream-Signalkaskaden ebenfalls intakt sind. Wir bestimmten den Phosphorylierungsstatus von Erk1 und Erk2 mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers, der phosphorylierte und damit aktivierte Formen spezifisch erkennt. Als Kontrollsubstanz verwendeten wir in diesen Experimenten PD 98059, einen wirkungsstarken und selektiven Inhibitor der MAP-Kinase-Aktivierung²⁵. Im Vergleich zu unbehandelten Zellen wurden nach 30-minütiger Behandlung von HASMC mit Thrombin und bFGF erhöhte Mengen an phosphoryliertem Erk1 und Erk2 gefunden (5, oberes Feld). Die Phosphorylierung von Erk1 und Erk2 durch Thrombin wie auch durch bFGF wurde durch Vorbehandlung mit PD 98059 blockiert, nicht jedoch durch Vorbehandlung mit Flavopiridol. Zur Absicherung dieser Ergebnisse bestimmten wir die Erk1- und Erk2-Aktivität mittels In-Gel-Kinase-Assay (5, unteres Feld).
Auch hier stellten wir fest, dass die Aktivität von Erk1 und Erk2 in Antwort auf Thrombin und bFGF erhöht wurde, wobei diese Wirkung durch PD 98059 inhibiert wurden konnte, nicht jedoch durch Flavopiridol. Diese Experimente liefern zusammen mit den in 3 und 4 vorgestellten Ergebnissen den Beweis, dass die Wirkung von Flavopiridol auf die HASMC-Proliferation auf einer spezifischen Blockierung des Zellzyklusmechanismus durch Blockierung der Cdk-Aktivität ohne Beeinträchtigung von Upstream-Signalereignissen beruht.
Flavopiridol verringert nicht die Viabilität von HASMC
Frühere Berichte über die Wirkung von Flavopiridol in anderen Zelltypen haben gezeigt, dass in Abhängigkeit von der Zelllinie Flavopiridol entweder eine Blockierung des Wachstums induzieren kann, ohne dabei die Viabilität zu beeinträchtigen, oder dass es Apoptose verursachen kann^16,26-29. Daher untersuchten wir, ob Flavopiridol die Viabilität von HASMC erniedrigt, indem wir die Trypanblau-Exklusion zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Behandlung bestimmten. Quieszente HASMC wurden mit Flavopiridol (75 nmol/l), Trägersubstanz oder TNF-⎕ (50 ng/ml), einem Cytokin, von dem bekannt ist, dass es in diesem Zelltyp Apoptose verursacht³⁰, behandelt. Während TNF-⎕ die Viabilität von HASMC stark erniedrigte, was zum Tod nahezu aller über einen Zeitraum von 24 h behandelten Zellen führte, zeigte Flavopiridol keine solche Wirkung (6). Wir haben festgestellt, dass bei höheren Konzentrationen und längeren Inkubationszeiten eine gewisse Erniedrigung der Viabilität in Gegenwart von Flavopiridol auftreten kann (nicht abgebildet). Unter den untersuchten Bedingungen führt Flavopiridol jedoch in erster Linie zur Blockierung des Wachstums, ohne dabei die Viabilität der SMC zu beeinträchtigen.
Flavopiridol inhibiert die Proliferation glatter Muskelzellen und die Neointima-Bildung in vivo im Carotis-Injury-Modell der Ratte, einem Modell für Gefäßverletzungen
Wir verwendeten das bewährte Carotis Injury-Modell der Ratte, in dem die Bildung von Neointima-Läsionen nach katheterbedingter Verletzung maßgeblich von der SMC-Proliferation abhängt^2,3, zur Untersuchung der Frage, ob Flavopiridol eine Blockierung des Wachstums von SMC in vivo ebenso induziert wie dies in vitro der Fall ist. Wir verabreichten Flavopiridol in einer Dosis von 5 mg/kg einmal täglich oral, wobei die Behandlung am Tag der Verletzung begonnen und anschließend für weitere vier Tage fortgeführt wurde, da dieser Zeitraum die Erstinduktion von Cdk₂ und die erste Welle der SMC-Proliferation in diesem Modell überspannt^31,32. 7 und 14 Tage nach der Verletzung wurden die mittleren Intima- und Media-Flächen bestimmt und die Größe der Neointima- Läsion wurde ausgedrückt als das Verhältnis Neointima-Fläche/Media-Fläche. Die behandelte und die unbehandelte Gruppe bestanden aus jeweils 12 Tieren. Das Verhältnis Neointima/Media betrug nach 7 Tagen 1,00 ± 0,05 im Falle der Arterien von mit Trägersubstanz behandelten Ratten und 0,65 ± 0,04 im Falle der Arterien von mit Flavopiridol behandelten Ratten, entsprechend einer Verringerung um 35,0 % (7). Nach 14 Tagen betrug das Verhältnis Neointima/Media 1,08 ± 0,04 im Falle der mit der Trägersubstanz behandelten Ratten und 0,66 ± 0,03 im Falle der mit Flavopiridol behandelten Ratten, entsprechend einer Verringerung um 38,9 %. Diese Wirkung war zu beiden Zeitpunkten statistisch signifikant (p < 0,05). Repräsentative Abschnitte der Arterien sind in 8 dargestellt.
Um direkt zu zeigen, dass Flavopiridol die Proliferation glatter Muskelzellen inhibiert, färbten wir Sektionen für die PCNA-Expression in repräsentativen Bereichen jeder Arterie und bestimmten den prozentualen Anteil PCNA-positiver Kerne in der Neointima. Im Falle der unbehandelten Ratten waren nach 7 Tagen 31,1 ± 7,2 % der Kerne in den verletzten Arterien PCNA-positiv, während dies im Falle der mit Flavopiridol behandelten Ratten nur bei 11,8 ± 1,5 % der Kerne der Fall war (7; p < 0,05). Nach 14 Tagen waren PCNA-positive Kerne in 10,4 ± 2,0 % der Neointima-Zellen in den verletzten Arterien von behandelten Ratten vorhanden, während dies im Falle der unbehandelten Ratten wiederum nur bei 4,2 ± 0,5 % der Kerne der Fall war (p < 0,05). (PCNA-positive Kerne waren in unverletzten Arterien unabhängig von der Behandlung selten zu finden). Entsprechend waren sowohl 7 Tage als auch 14 Tage nach der Verletzung Cdk₂-positive Zellen in der Neointima der Arterien von Flavopiridol-behandelten Ratten wesentlich weniger häufig zu finden (9, Felder A und C) als in der Neointima der Arterien von unbehandelten Ratten (Tafeln B und D).
Diskussion
In der vorliegenden Studie haben wir untersucht, ob der neue Cdk-Inhibitor Flavopiridol, der wirksamste und spezifischste bekannte Cdk-Inhibitor, ein geeignetes Mittel zur Inhibierung der SMC-Proliferation in vivo darstellt, insbesondere im Zusammenhang mit Gefäßverletzungen. Mit früheren Versuchen, zur Behandlung von Gefäßerkrankungen therapeutisch in den Mechanismus des Zellzyklus einzugreifen, stand eine logische Grundlage für die vorliegenden Studien zur Verfügung^9-12; die im Hinblick auf dieses Ziel eingesetzten Methoden beruhten jedoch auf Gentransfer-Technologien zur Inhibierung der Zellzyklus-Progression. Gegenwärtig wird die klinische Anwendung dieser Techniken durch immense Hindernisse unterbunden³³. Im Verlauf unserer Studien wurde berichtet, dass CVT-313, eine kürzlich identifizierte Verbindung, die ebenfalls ebenfalls Cdk-inhibitorische Eigenschaften aufweist, dies allerdings in mikromolaren Konzentrationen, auch die Neointima-Bildung inhibieren kann; zur Erzielung dieser Wirkung war es jedoch erforderlich, das CVT-313 zum Zeitpunkt der Verletzung in die Arteria Carotis einzubringen³⁴. Im Gegensatz dazu zeigen wir, dass Flavopiridol die Neointima-Bildung bei oraler Verabreichung stark inhibieren kann, und zwar in mit anderen klinisch relevanten Mitteln vergleichbarem Maße^11,35,36. Die orale Wirkung von Flavopiridol macht es praktisch einzigartig unter den Mitteln, deren Wirkung in Tiermodellen für Gefäßverletzungen nachgewiesen wurde. Seine Selektivität, seine Wirkungsstärke und seine leichte Verabreichbarkeit machen Flavopiridol zu einem ausgezeichneten Mittel für die Untersuchung des therapeutischen Nutzens der Inhibierung des Zellzyklus in vivo im Falle von Gefäßverletzungen beim Menschen.
Wir haben uns für die orale Verabreichung von Flavopiridol in einer Konzentration (5 mg/kg) entschieden, die der Hälfte der Konzentration entspricht, die Tumorwachstum in einem Nacktmaus-Xenograft-Modell inhibiert²⁷. Es ist anzumerken, dass Flavopiridol-Konzentrationen von 75 nmol/l in unseren Studien zu einer nahezu vollständigen Inhibierung der SMC-Proliferation führten, während mittlere Serumkonzentrationen von 425 nmol/l mit Dosen erreicht wurden, die unterhalb der toxischen Schwelle in Phase I-Studien therapieresistenter Karzinome lagen¹⁷. Unsere Ergebnisse weisen darauf hin, dass im Zusammenhang mit Gefäßerkrankungen wie der Restenose bereits wesentlich niedrigere Dosen von Zellzyklus-Inhibitoren wirksam sein könnten als sie im Falle von Neoplasien eingesetzt werden, was mit der vorteilhaften Begleiterscheinung einer verbesserten Verträglichkeit verbunden wäre.
Wenngleich wir gezeigt haben, dass Flavopiridol eine Blockierung des Wachstums von HASMC in Kultur induziert, ohne dabei deren Viabilität zu beeinträchtigen, und wir zum anderen eine verringerte Neointima-Bildung nach Flavopiridol-Behandlung in vivo nachgewiesen haben, können wir dennoch nicht sicher sein, dass die Blockierung des Zellzyklus der einzige Faktor ist, der die Neointima-Bildung bei Carotis-Läsionen reduziert. Flavopiridol kann in Abhängigkeit vom beobachteten Zelltyp eine Blockierung des Wachstums mit oder ohne gleichzeitige Verursachung von Apoptose induzieren²⁹. Interessanterweise inhibiert Flavopiridol die Apoptose in terminal differenzierten PC12-Zellen, zugleich induziert es jedoch die Apoptose in undifferenzierten proliferierenden PC12-Zellen²⁸. Während unsere in vitro-Experimente unter Bedingungen durchgeführt wurden, die dem Phänotyp von SMC vor Verletzung entsprächen, könnten SMC nach der Verletzung anders auf Flavopiridol reagieren, ja sogar einer Apoptose unterliegen. Wenngleich die Bedeutung der Apoptose im Zusammenhang mit Gefäßläsionen noch unklar ist, deutet die Tatsache, dass die Expression des Fas-Liganden in SMC beim Hasen nach Ballonverletzung Apoptose induziert und die Neointima-Bildung blockiert³⁷, doch darauf hin, dass für den Fall, dass Flavopiridol tatsächlich die Apoptose von SMC in vivo induzieren sollte, wie dies im Falle der proliferierenden PC12-Zellen der Fall ist, dies im Zusammenhang mit der Neointima-Bildung ein zur Heilung beitragendes Ereignis sein könnte. Auch andere Mechanismen können zur Wirkung von Flavopiridol auf die Bildung von Läsionen beitragen. Antisense Oligodesoxynukleotid-vermittelte Inhibierung des Zellzyklus beispielsweise verbessert die Endothel-Funktion in Venen-Transplantaten beim Hasen³⁸. Weitere Studien werden zur Aufklärung der Mechanismen der Wirkungen, die Flavopiridol neben der Blockierung des Wachstums auf SMC in vivo hat, erforderlich sein. Unter Berücksichtigung der nachgewiesenen Rolle der SMC-Proliferation bei der Bildung von Läsionen nach Carotis-Verletzungen der Ratte^2,3, ist es interessant anzumerken, dass trotz zu der tiefgreifenden Wirkung von Flavopiridol in vitro die Fähigkeit von Flavopiridol, die Neointima-Bildung zu inhibieren, unter den Bedingungen unserer in vivo-Experimente zwar signifikant, aber doch weniger ausgeprägt war. Wir haben verschiedene Erklärungen für diese Beobachtung in Betracht gezogen. Es ist unwahrscheinlich, dass nach Absetzen des Flavopiridols eine beschleunigte SMC-Proliferation eintritt, da veränderte Proliferations-Indizes bis 14 Tage nach der Verletzung bestehen bleiben (7 und 9). Es ist wahrscheinlicher, dass entweder andere an der Bildung von Läsionen beteiligte Mechanismen, wie die SMC-Migration und die extrazelluläre Matrix-Produktion, weiterhin ihren Beitrag zur Bildung von Läsionen leisten, selbst wenn keine signifikante SMC-Proliferation stattfindet, oder dass die einmal tägliche Zufuhr von Flavopiridol nicht ausreicht, um die Proliferation in diesem Modell vollständig zu blockieren. Jüngere Daten, die darauf schließen lassen, dass die biologische Halbwertszeit von Flavopiridol nur 2,5 h beträgt, sprechen für die Richtigkeit der zweiten Hypothese; mit Hilfe weiterer Studien könnten noch effizientere Dosierungsregimes erarbeitet werden.
Unsere Ergebnisse lassen darauf schließen, dass Flavopiridol die SMC-Proliferation und damit auch die Neointima-Bildung in einem allgemein anerkannten Kleintiermodell für Gefäßerkrankungen inhibieren kann. Es muss betont werden, dass die Bedeutung der Inhibierung der SMC-Proliferation im Zusammenhang mit Gefäßläsionen des Menschen umstritten ist, und sie kann in Abhängigkeit von der Art der Läsion und dem Zeitpunkt, zu dem die Beobachtungen bezüglich der Proliferation angestellt werden, variieren. Der Proliferationsindex von SMC in humanen Atherektomie-Spezimen ist erstaunlich niedrig⁴⁰, wenngleich diese Spezimen möglicherweise nicht direkt die proliferatitiven Veränderungen in früheren, entscheidenderen Stadien der Entwicklung von Läsionen wiedergeben. Darüber hinaus kann unabhängig vom Neointima-Wachstum der Wundheilungsprozess der Arterien (arterial remodeling) Ursache eines wesentlichen Anteils der luminalen Obstruktionen nach Angioplastien beim Menschen sein⁴¹. Im Gegensatz dazu sind die Indizes für mitotische Aktivität in SMC in Atherektomie-Spezimen humaner Läsionen mit In-Stent-Restenose wesentlicher höher (25 % PCNA-positiv), was mit der bekannten Rolle der SMC-Hyperplasie in diesem Prozess in Einklang steht, nicht jedoch mit dem Remodeling. Da Stent-Implantationen und die klinische Problematik der In-Stent-Restenose zunehmen, wird sich auch der Bedarf an einem wirksamen Mittel zur Blockierung der Hyperplasie und der Neointima-Bildung von SMC weiter erhöhen. Auf Grund der Tatsache, dass Flavopiridol ein wirksames, oral verfügbares Arzneimittel mit spezifischer Cdk-inhibitorischer Aktivität ist und für den Menschen sichere Dosen bekannt sind, kann Flavopiridol als ein pharmakologisch geeignetes Mittel zur Prävention der In-Stent-Restenose beim Menschen betrachtet werden.
Verfahren und Ergebnisse:
Durch Verwendung gezüchteter humaner aortaler glatter Muskelzellen stellten wir fest, dass Flavopiridol bereits in Konzentrationen von 75 nmol/l zu einer nahezu vollständigen Inhibierung der durch basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor oder Thrombin induzierten Proliferation führt. In dieser Dosis inhibierte Flavopiridol, wie durch Histon-H₁-Phosphorylierung gezeigt wurde, die Cyclin-abhängige Kinase-Aktivität, hatte jedoch keinen Einfluss auf die MAP-Kinase-Aktivierung. Die Induktion der Zellzyklus-gekoppelten Proteine Cyclin D₁, Proliferating Cell Nuclear Antigen und Phosphoryliertes Retinoblastom-Protein wurde durch Flavopiridol ebenfalls blockiert. Flavopiridol hatte keinen Einfluss auf die Zellviabilität. Um zu untersuchen, ob Flavopiridol bei oraler Verabreichung in vivo eine ähnliche Aktivität aufweist, untersuchten wir die Neointima-Bildung in der Arteria Carotis der Ratte nach Ballonverletzung. Über eine Schlundsonde verabreichtes Flavopiridol (5 mg/kg) verringerte die Neointima-Fläche 7 beziehungsweise 14 Tagen nach der Verletzung um 35 % beziehungsweise 39 %.
Schlussfolgerungen:
Flavopiridol inhibiert das Wachstum von SMC in vitro und in vivo. Seine orale Verfügbarkeit und Selektivität für Cyclin-abhängige Kinasen macht Flavopiridol zu einem wirksamen therapeutischen Mittel zur Behandlung von SMC-reichen Gefäßläsionen.
LITERATURVERZEICHNIS

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Claims

Verwendung einer Verbindung der Formel I
Formel I in welcher R₁ für Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Aryl-C₁-C₄-alkyl; durch Halogen, Hydroxy oder Carboxy substituiertes C₁-C₆-Alkyl; C₃-C₆-Cycloalkyl, Pyridyl, Thienyl, C₃-C₆-Cycloalkyl-C₁-C₄-alkyl, C₂-C₆-Alkenyl, C₂-C₆-Alkinyl; Phenyl; durch Halogen, C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Alkoxy, Hydroxyl, Carboxyl, COO-Alkyl, CONH₂, CONH-Alkyl, CON(Alkyl)₂, Nitro, Trifluormethyl, Amino, C₁-C₄-Alkylamino, Di-C₁-C₄-alkylamino oder Phenyl mono- oder polysubstituiertes Phenyl; Naphthyl, Carboxyl, -CHO, COO-C₁-C₄-Alkyl, eine primäre Aminogruppe, Alkylamino, Aralkylamino, Dialkylamino, Amido, Arylamino, Diarylamino oder -CH₂O-C₁-C₄-Alkyl steht; R₂ für Wasserstoff, Alkyl. mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Aryl, Nitro, Amino, Di-C₁-C₄-alkylamino, Halogen, Hydroxyl, Alkoxy, -COOH; -COO-C₁-C₄-alkyl, -CHO, -CH₂OH oder -CH₂O-C₁-C₄-Alkyl steht; R₃ für Wasserstoff, C₁-C₄-Alkyl; durch Halogen, Hydroxy oder Carboxy substituiertes C₁-C₄-Alkyl; Hydroxyl, Carboxyl, Nitro, Amino, C₁-C₄-Alkylamino, Di-C₁-C₄-alkylamino, Halogen, -O-Alkyl-C(O)-alkyl, -CHO, -CH₂OH, -CH₂O-C₁-C₄-Alkyl oder R₂N-C(O)-O-steht, wobei R für H, C₁-C₆-Alkyl, Cycloalkyl steht; oder -O-Alkyl-C(O)-alkyl oder Aryl steht; R₄ für Wasserstoff, Hydroxyl, C₁-C₄-Alkoxy, C₁-C₄-Alkanoyloxy, C₁-C₄-Alkoxycarbonyl, Aryloxy, Amino, C₁-C₄-Alkylamino, Di-C₁-C₄-alkylamino oder R'₂-N-C(O)-O- steht, wobei R' für H, C₁-C₆-Alkyl, Cycloalkyl oder Aryl steht; R₅ für Wasserstoff, C₁-C₆-Alkyl, Aryl-C₁-C₄-alkyl, C₃-C₆-Cycloalkyl, C₃-C₆-Cycloalkyl-C₁-C₄-alkyl, Alkylamino, C₁-C₄-Alkanoyl, -C(O)-O-C₁-C₄-Alkyl oder Aroyl steht, wobei die Arylgruppe in R₁, R₂, R₃, R₄ und R₅ für unsubstituiertes Phenyl oder Phenyl, das durch Halogen, C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Alkoxy, Hydroxyl, Carboxyl, COO-Alkyl, CONH₂, CONH-Alkyl, CON(Alkyl)₂, Nitro, Trifluormethyl, Amino, C₁-C₄-Alkylamino, Di-C₁-C₄-alkylamino oder Phenyl mono- oder polysubstituiert ist; m für eine ganze Zahl zwischen 0 und 3 steht und n für 1 steht, oder eines pharmakologisch unbedenklichen Säureadditionssalzes davon zur Herstellung eines Arzneimittels für die Inhibierung der Proliferation von glätten Muskelzellen, wobei die Dosierung der Verbindung der Formel I weniger als 70%, vorzugsweise weniger als 60%, insbesondere weniger als 50% der Dosierung, die zur Kontrolle von Tumorwachstum erforderlich wäre, beträgt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Verbindung um eine Verbindung der. Formel Ia
Formel Ia handelt, in welcher R₁ für Wasserstoff, C₁-C₃-Alkyl, Naphthyl, Phenyl; Phenyl, das durch Halogen, C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Alkoxy, Hydroxyl, Carboxyl, COO-Alkyl, CONH₂, CONH-Alkyl, CON(Alkyl)₂, Nitro, Trifluormethyl, Amino, C₁-C₄-Alkylamino, Di-C₁-C₄-alkylamino oder Phenyl mono- oder polysubstituiert ist; Pyridyl oder Thienyl steht; R₂ für Wasserstoff oder C₁-C₃-Alkyl steht; R₅ für C₁-C₃-Alkyl, C₃-C₅-Cycloalkyl oder C₃-C₅-Cycloalkyl-C₁-C₄-alkyl steht.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Substituenten der Formel Ia die folgenden Bedeutungen haben R₁ steht für Phenyl, Thienyl, Pyridyl, Chlorphenyl, Dichlorphenyl, Methylphenyl, Aminophenyl, Bromphenyl, Hydroxyphenyl oder Naphthyl; R₂ steht für Wasserstoff und R₅ steht für Methyl.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Verbindung um (–)-cis-5,7-Dihydroxy-2-(2-chlorphenyl)-8-[4-(3-hydroxy-1-methyl)piperidinylj-4H-benzopyran-4-on (Flavopiridol) handelt.
Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-4, wobei das Arzneimittel für die Behandlung von Gefäßläsionen mit hohem Anteil. an glatten Muskelzellen bestimmt ist.
Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1–4, wobei das Arzneimittel für die Behandlung von Läsionen nach Ballonverletzungen bestimmt ist.
Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1–4, wobei das Arzneimittel für die Behandlung von Patienten nach Stentimplantation bestimmt ist.