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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein neues, langwirksames Mittel zur
Tumorsuppression und zur Hemmung der Tumorangiogenese, sowie dessen
Herstellung und Verwendung als Arzneimittel.
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Hintergrund der Erfindung
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Die
Kinasen Protein-Kinase 2 (CK2) und Protein Kinase D (PKD) sind an
das COP9 Signalosom (CSN) assoziiert (Uhle et al., 2003). Das CSN
ist ein Protein-Komplex, bestehend aus acht Untereinheiten, und
wirkt an der Schnittstelle zwischen Signaltransduktion und Ubiquitin-abhängiger Proteolyse
(Bech-Otschir et al., 2002).
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Der
Abbau bzw. die Stabilisierung verschiedener Substrate wird durch
das CSN kontrolliert (von Arnim, 2003).
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P53
und c-Jun werden durch das CSN, welches durch assoziierte Enzyme
Kinase-Aktivität
besitzt, phosphoryliert. Die phosphorylierte Form von p53 wird Ubiquitin-abhängig abgebaut
(Bech-Otschir et al., 2001), wohingegen die phosphorylierte Form
von c-Jun gegenüber
dem Ubiquitin/26S Proteasom stabilisiert wird (Naumann et al., 1999).
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Das
im Zellkern lokalisierte p53 ist ein Protein und bindet an definierte
Stellen der DNA. Auf diese Weise schaltet es Gene an, die das Wachstum
der Zellen beeinflussen. Ein aktives p53 in Tumorzellen kann also ein
unbegrenztes Wachstum verhindern und Apoptose auslösen.
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Die
intrazelluläre
Konzentration des Transkriptionsfaktors c-Jun hat Einfluss auf die
Produktion von VEGF (vascular endothelial growth factor) und somit
auch auf die Tumorangiogenese.
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Aus
der Literatur sind folgende Kinase-Inhibitoren bekannt:
- Emodin,
Curcumin und Resveratrol (De Moliner et al., 2003; Uhle et al.,
2003; Yoon et al., 2002).
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In
der Patentliteratur wurden gefunden:
- USA 6,673,843 01/2004
Arbiser
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Die
Anwendung von Curcumin zur Behandlung von Erkrankungen der Haut,
die durch Angiogenese charakterisiert sind.
- USA 6,646,013
11/2003 Barker et al.
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Die
Anwendung verschiedener Nährstoffe
zur Reduzierung des Colonkarzinoms.
- USA 6,359,000 03/2002
Jiang et al.
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Eine
Methode zur Behandlung von Krebs mit einer pharmazeutischen Komposition,
die ein Metabolit des Deutero Mycetes enthält.
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Die
bekannten Inhibitoren besitzen eine zu hohe Inhibitionskonstante
und sind somit für
einen Einsatz als Medikament zur Tumorsuppression und Hemmung der
Tumorangiogenese nicht geeignet.
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Es
ist Aufgabe der Erfindung, Inhibitoren bereitzustellen, die die
Aktivität
von Kinasen herabsetzen und durch ihre geringere Inhibitionskonstante
den Abbau bzw. die Stabilisierung von Proteinen wie p53 und c-Jun unterdrücken und
die somit als neue Mittel zur Tumorsuppression und zur Hemmung der
Tumorangiogenese eingesetzt werden können.
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Offenbarung
der Erfindung
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Überraschend
wurde gefunden, dass die vorstehend genannte Aufgabe durch die Verbindung
der allgemeinen Formel 1 gelöst
wird.
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Formel
1: 9,10-dihydroxy-1,4-dihydroanthracene-1,4-dione
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Dementsprechend
betrifft die vorliegende Erfindung eine Substanz mit der vorstehend
genannten Formel 1: 9,10-dihydroxy-1,4-dihydroanthracene-1,4-dione.
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Dargestellt
ist eine Struktur, die Einfluss auf die Aktivität von Protein-Kinasen nimmt.
Die Protein-Kinase 2 (CK2) und die Protein Kinase D (PKD), welche
an das COP9 Signalosom (CSN) assoziiert sind, werden durch diese
Struktur inhibiert.
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Die
vorliegende Substanz (9,10-dihydroxy-1,4-dihydroanthracene-1,4-dione)
inhibiert die Kinasen und somit das Signalosom wie die bekannten
Inhibitoren Curcumin, Emodin und Resveratrol.
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Die
Auswirkungen auf die Proteine p53 und c-Jun führen zu einer Tumorsuppression
und Hemmung der Tumorangiogenese. Die Substanz kann somit in der
medizinischen Behandlung von Krebserkrankungen eingesetzt werden.
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Weiterhin
ist die Erfindung auf pharmazeutische Produkte bezogen, welche die
unter Patentanspruch 1 genannte Substanz enthalten und auf Behandlungsmethoden,
bei denen die unter Patentanspruch 1 genannte Substanz in einer
wirksamen Menge und in einer pharmazeutisch akzeptierten Darreichungsform
gegen Krebserkrankungen eingesetzt wird.
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Das
Verfahren zur Herstellung eines neuen Mittels zur Tumorsuppression
und Hemmung der Tumorangiogenese besteht darin, daß die Substanz
9,10-dihydroxy-1,4-dihydroanthracene-1,4-dione mit einem oder mehreren geeigneten
phamakologischen Trägern
und/oder weiteren pharmakologischen Wirkstoffen gemischt und diese
Mischung in eine für
die Verabreichung geeignete Form gebracht wird.
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Vorzugsweise
werden diese Produkte in der Form von Tabletten, Pillen, Kapseln,
Pulver, Körnchen, sterile
parenterale Lösungen
oder Suspensionen, dosiertes Aerosol oder liquides Spray, Tropfen,
transdermalem Pflaster oder Suppositorien verabreicht; für orale,
intravenöse,
parenterale, intranasale, sublinguale oder rektale Darreichungsform,
oder für
die Verabreichung mittels Inhalation oder Insufflation.
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Alle
verwendeten Inhibitoren wurden in DMSO (Dimethylsulfoxid) gelöst. Die
Kinase-Aktivität
wurde mit 10 μCi
[γ-32P]ATP in einem Puffer, der 30 mM Tris,
pH 7.6, 10 mM KCl und 0.5 mM DTT enthält, bestimmt. C-Jun wurde,
wie schon zuvor beschrieben (Seeger et al., 1998), als Substrat
eingesetzt.
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Die
rekombinanten Enzyme CK2 und PKD, sowie der CSN Komplex aus menschlichen
Erythrozyten (Seeger et al., 1998) und etwa 1 μg des Substrates c-Jun wurden
mit den bekannten Inhibitoren Curcumin, Emodin, Resveratrol und
dem neuen Inhibitor 9,10-dihydroxy-1,4-dihydroanthracene-1,4-dione in verschiedenen
Konzentrationen (0, 20, 50, 100 und 200 μM) für 60 min bei 37°C inkubiert.
Die Proben wurden mittels SDS-PAGE auf einem 12.5 % Gel aufgetrennt,
mit Coomassie gefärbt,
getrocknet und auf einem Röntgenfilm entwickelt.
Anschließend
wurden die Daten densitometrisch ausgewertet und die IC50 Werte
berechnet.
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Zur Überprüfung der
Inhibition durch das erfindungsgemäße Mittel wurden in vitro Phosphorylierungen und
Zellkultur Versuche bezüglich
der p53 und c-Jun Konzentration durchgeführt.
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Überprüfung in der Zellkultur
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HeLa
Zellen wurden in RPMI 1640 Medium, welches 10% (v/v) Fötales Kälber Serum,
2 mM Glutamin (Life Technologies, Inc.), Penicillin (100 U/ml) und
Streptomycin (100 μg/ml)
enthält,
unter 5% CO2 Atmosphäre kultiviert.
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Zur Überprüfung der
Inhibition wurden 5-7 × 106 HeLa Zellen mit den bekannten Inhibitoren
Curcumin, Emodin, Resveratrol und dem neuen Inhibitor 9,10-dihydroxy-1,4-dihydroanthracene-1,4-dione
für 4 Stunden inkubiert.
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Die
Inhibitoren wurden in zwei Konzentrationen (50 und 200 μM) eingesetzt.
Nach der Behandlung wurden die Zellen gesammelt und mit eiskaltem
Lysis-Puffer (50 mM Tris, pH 8.0, 1% Triton-X-100, 1 mM EDTA, 150
mM NaCl, 1 μg/ml
Aprotinin, 1 μg/μl PMSF) wie
zuvor beschrieben lysiert (Bech-Otschir et al., 2001).
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Die
Zelllysate wurden mittels SDS-PAGE auf einem 12.5 % Gel aufgetrennt,
auf eine Nitrocellulose-Membran geblottet und mit einem o-Jun Antikörper behandelt.
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Zur
Bestimmung der intrazellulären
p53 Konzentration wurden B8 Zellen (Marine Fibroblasten) mit Iscoves
MEM Medium, welches 125 μg/ml
G418 enthält,
kultiviert. 5 × 106 Zellen pro Well werden mit den Inhibitoren
Curcumin, Emodin, Resveratrol und dem neuen Inhibitor 9,10-dihydroxy-1,4-dihydroanthracene-1,4-dione
für 4 Stunden
inkubiert.
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Die
Inhibitoren werden in den Konzentrationen 50 und 200 μM eingesetzt.
Nach der Behandlung werden die Zellen, wie bei den HeLa Zellen beschrieben,
lysiert, aufgetrennt und geblottet. Die Membran wird mit einem p53
Antikörper
behandelt.
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Alle
Western Blots wurden mittels der ECL (enhanced chemiluminescence)
Technik entwickelt. Überprüfung durch
in vitro Phosphorylierungen
Tabelle
1:
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Gezeigt
sind die IC50 Werte (μM)
für die
bekannten Inhibitoren Curcumin, Emodin, Resveratrol und den neuen
Inhibitor 9,10-dihydroxy-1,4-dihydroanthracene-1,4-dione. Die in
vitro Phosphorylierung wurde mit den rekombinanten Kinasen CK2 und
PKD und dem aus Erythrozyten aufgereinigten CSN-Komplex durchgeführt.
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Der
IC50 Wert gibt die Konzentration eines Inhibitors an, die eingesetzt
werden muss, um ein Enzym zu 50 % zu inhibieren.
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Konzentration
HeLa Zellen c-Jun
Tabelle
2:
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Dargestellt
sind die errechneten IC50 Werte (μM)
für die
bekannten Inhibitoren Curcumin, Emodin, Resveratrol und den neuen
Inhibitor 9,10-dihydroxy-1,4-dihydroanthracene-1,4-dione bei Zellversuchen
mit einer Cervix-Carcinoma Zelllinie (HeLa).
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Die
Analysen wurden bezüglich
der Konzentration von c-Jun durchgeführt.
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Die
vorliegenden Tabelle (Tabelle 2) zeigt, dass 9,10-dihydroxy-1,4-dihydroanthra-cene-1,4-dione niedrigere
IC50 Werte bei Ze11kultur-Versuchen aufweist als die bereits bekannten
Inhibitoren.
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Zur
Herstellung einer festen Zusammensetzung, wie Tabletten, wird der
aktive Inhaltsstoff mit einem pharmazeutischen „Träger", z.B. mit konventionellen Inhaltsstoffen
wie Maisstärke,
Laktose, Saccharose, Talk, Stearinsäure, Magnesiumstearat, Dicalcium-Phosphat,
Gummi oder grenzflächenaktiven
Stoffen wie Sorbitan Monooleate, Polyethylen, Glykol und anderen
pharmazeutischen Verdünnungsmitteln,
wie z.B. Wasser gemixt. Damit entsteht eine feste Präformulierung
des pharmazeutischen Produktes, die eine homogene Mixtur der Substanz
dieser Erfindung enthält.
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Die
Tabletten oder Pillen der neuen Zusammensetzung können umhüllt oder
auf eine andere Weise verbunden werden, um eine Dosiereinheit zu
gewährleisten,
die den Vorteil einer verlängerten
Wirksamkeit bietet.
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Die
Tablette oder Pille kann beispielsweise eine innere und eine äußere wirksame
Dosis beinhalten. Die zwei Dosen können mit einer magensaftresistenten
Schicht überzogen
sein, welche eine Zersetzung im Magen vorbeugt und es den inneren
Komponenten erlaubt unversehrt in das Duodenum zu gelangen oder
eine verzögerte
Freigabe zu bewirken.
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Eine
Vielzahl von Materialien können
für diese
magensaftresistente Schicht oder Umhüllungen verwendet werden. Diese
Materialien beinhalten eine Anzahl von polymeren Säuren und
ein Gemisch aus polymerer Säure
mit Materialien wie Schellack, Celyl-Alkohol und Zellulose-Acetat.
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Wenn
man bei dieser Präformulierung
von einer homogenen Mixtur ausgeht, dann ist damit gemeint, dass
der aktive Inhaltsstoff sich so innerhalb der Mixtur verteilt hat,
dass diese Mixtur in gleichermaßen
wirksame Teile unterteilt werden kann, die in Darreichungsformen
wie Tablette, Pillen, Zäpfchen
und Kapseln verabreicht werden können.
Die feste Präformulierung
wird dann in eine Dosiereinheit, wie oben beschrieben, unterteilt,
die zwischen 0.1 und 500 mg des aktiven Inhaltsstoffes, der in dieser
Erfindung beschrieben ist, enthält.
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Typische
Dosiereinheiten beinhalten zwischen 1 und 100 mg, zum Beispiel 1,
2, 5, 10, 25, 50 oder 100 mg, des aktiven Inhaltsstoffes.
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Die
flüssigen
Darreichungsformen, in denen die neuen Zusammensetzungen der vorliegenden
Erfindung oral oder per Injektion verabreicht werden sollen, umfassen
wässrige
Lösungen,
angemessen wohlschmeckende Sirups, wässrige oder ölige Suspensionen
und aromatische Emulsionen mit Speiseölen wie Baumwollsamenöl, Sesamöl, Kokosnussöl oder Erdnussöl, genauso
wie Elixire und ähnliche
pharmazeutische Vehikel.
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Angemessene
zerstäubende
oder auflösende
Agentien für
wässrige
Lösungen
berücksichtigen
synthetische und natürliche
Gummis wie Tragacanth, Acacia, Alignat, Dextran, Natrium-Carboxymethylzellulose, Methyl-zellulose,
Polyvinyl-Pyrrolidone oder Gelatine.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Struktur dieser Erfindung
im Zusammenhang mit der Herstellung eines Medikamentes und einer
Behandlungsmethode zur Behandlung von Krebs bezüglich des menschlichen Körpers.
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Zur
Behandlung von Krebs sind 1 bis 250 mg des erfindungsgemäßen Mittels/kg
Körpergewicht
pro Tag, bevorzugt etwa 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag, ein angemessenes
Dosierungslevel. Die Substanzen sollten über eine Infusion oder bei
einer Kur ein- bis viermal am Tag dargereicht werden. In manchen
Fällen kann
eine Dosierung außerhalb
dieser Dosierungen notwendig sein.
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Die
Dosierung der erfindungsgemäßen Verbindung
ist naturgemäß stark
von der Applikationsart und der zu therapierenden Erkrankung abhängig. Bei
lokaler Applikation zeichnet sich die Verbindung nach der Formel
1 bereits bei Dosen im μM-Bereich
durch eine hohe Wirksamkeit aus. Aber auch oberhalb dieses Bereichs
lasst sich die Verbindung nach Formel 1 sinnvoll einsetzen.
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Wie
gefunden wurde, zeichnet sich die Verbindung der Formel 1 durch
vielfältige
Anwendungsmöglichkeiten
auf therapeutischem Gebiet aus.
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Hervorzuheben
sind solche Anwendungsmöglichkeiten,
für welche
die erfindungsgemäße Verbindung der
Formel 1 aufgrund ihrer pharmazeutischen Wirksamkeit zur Tumorsuppression
und Hemmung der Tumorangiogenese eingesetzt wird. Dies sind beispielsweise
die Therapie von soliden Tumoren wie z.B. Colonkarzinom, Cervixkarzinom
und Lungenkrebs.
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Die
Verbindung(en) der allgemeinen Formel 1 können allein oder in Kombination
mit anderen pharmakologisch aktiven Wirkstoffen eingesetzt werden.
Es handelt sich hierbei insbesondere um Chemotherapeutika.
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- Bech-Otschir, D., Kraft, R., Huang, X., Henklein, P., Kapelari,
B., Pollmann, C., and Dubiel, W. (2001). COP9 signalosome-specific
phosphorylation targets p53 to degradation by the ubiquitin system.
Embo J20, 1630-9.
- Bech-Otschir, D., Seeger, M., and Dubiel, W. (2002). The COP9
signalosome: at the interface between signal transduction and ubiquitin-dependent
proteolysis. In "J
Cell Sci", Vol.
115, pp. 467-73.
- De Moliner, E., Moro, S., Sarno, S., Zagotto, G., Zanotti, G.,
Pinna, L. A., and Battistutta, R. (2003). Inhibition of protein
kinase CK2 by anthraquinone-related compounds. A structural insight.
J Biol Chem 278, 1831-6.
- Naumann, M., Bech-Otschir, D., Huang, X., Ferrell, K., and Dubiel,
W. (1999). COP9 signalosome-directed c-Jun activation/stabilization
is independent of JNK. J Biol Chem 274, 35297-300.
- Seeger, M., Kraft, R., Ferrell, K., Bech-Otschir, D., Dumdey,
R., Schade, R., Gordon, C., Naumann, M., and Dubiel, W. (1998).
A novel protein complex involved in signal transduction possessing
similarities to 26S proteasome subunits. Faseb J 12, 469-78.
- Uhle, S., Medalia, O., Waldron, R., Dumdey, R., Heuklein, P.,
Bech-Otschir, D., Huang, X., Berse, M., Sperling, J., Schade, R.,
and Dubiel, W. (2003). Protein kinase CK2 and protein kinase D are
associated with the COP9 signalosome. Embo J22, 1302-12.
- von Arnim, A. G. (2003). On again – off again: COP9 signalosome
turns the key on protein degradation. Curr Opin Plant Biol 6, 520-9.
- Yoon, S. H., Kim, Y. S., Ghim, S. Y., Song, B. H., and Bae,
Y. S. (2002). Inhibition of protein kinase CKII activity by resveratrol,
a natural compound in red wine and grapes. Life Sci 71, 2145-52.
