ES2226792T3

ES2226792T3 - El uso de derivados de 4-h-1-benzopiran-4-ona como inhibidores de la proliferacion de miocitos lisos.

Info

Publication number: ES2226792T3
Application number: ES00909918T
Authority: ES
Inventors: Winston Campbell Patterson; Jennifer A. Dumont
Original assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc; University of Texas System
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc; University of Texas System
Priority date: 1999-02-01
Filing date: 2000-01-18
Publication date: 2005-04-01
Anticipated expiration: 2020-01-18
Also published as: HUP0200804A2; HU229263B1; NO330512B1; TWI273907B; AP1469A; PT1150746E; BR0007911A; EA004786B1; KR20010093309A; CR6448A; UA73110C2; DE60013555T2; HK1042445A1; RS50242B; CZ300395B6; AP2001002218A0; CZ20012804A3; ZA200105596B; EP1150746A2; CN1338958A

Abstract

El uso de un compuesto de **fórmula** donde R1 es hidrógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, aril-alquiloC1-C4; alquiloC1-C6 sustituido con halógeno, hidroxi o carboxi; cicloalquiloC3-C6, piridilo, tienilo, cicloalquilC3-C6-alquiloC1-C4, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, fenilo; fenilo, mono- o polisustituido con halógeno, alquiloC1-C4, alcoxiC1-C4, hidroxi, carboxi, COO-alquilo, CONH2, CONH-alquilo, CON(alquilo)2, nitro, trifluorometilo, amino, alquilC1-C4-amino, di-alquilC1-C4-amino, o fenilo; naftilo, carboxilo, -CHO, COO-alquiloC1-C4, un amino primario, alquilamino, aralquilamino, dialquilamino, amido, arilamino, diarilamino, o -CH2O-alquilo C1-C4; R2 es hidrógeno, alquilo con 1 a 6 átomos de carbono, arilo, nitro, amino, di-alquilC1-C4-amino, un halógeno, hidroxi, alcoxi, -COOH, -COO-alquiloC1-C4, -CHO, -CH2OH o -CH2O-alquiloC1-C4, o una de sus sales de adición de ácido farmacológicamente aceptables para la producción de un producto farmacéutico para la inhibición de la proliferación de músculo liso, donde la dosificación del compuesto de fórmula 1 es menos del 70%, preferiblemente menos del 60%, en particular menos del 50% de la dosificación que sería necesaria para controlar el crecimiento celular.

Description

El uso de derivados de 4-H-1-benzopiran-4-ona como inhibidores de la proliferación de miocitos lisos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de derivados de 4-H-1-benzopiran-4-ona como inhibidores de la proliferación de miocitos lisos (SMC, por sus siglas en inglés "smooth muscle cell"), a dosificaciones que son menores que 70% de la dosificaciones que serían necesarias para reprimir el crecimiento tumoral.

Declaración acerca del patrocinio federal de la investigación o el desarrollo

La presente invención se hizo con subvenciones de los Institutos Nacionales de la Salud, núms. HL03658 y AG15234.

Antecedentes de la invención

Las respuestas celulares al daño vascular - disfunción, activación, desdiferenciación, proliferación y migración celular - culminan en episodios clínicos tales como restenosis, que ocurre tras la angioplastia con globo y colocación de una endoprótesis vascular ("stent") para el tratamiento de la enfermedad aterosclerótica humana^{1}. La proliferación de miocitos lisos (SMC) es una característica común, y quizá unificadora, de los modelos de daño vascular, y los SMC son el principal componente celular de las lesiones en la neoíntima ^{2, \ 3}. El uso creciente de las endoprótesis vasculares para el tratamiento de la enfermedad coronaria va asociado a un interés renovado por la inhibición de la proliferación de SMC, ya que la restenosis en la endoprótesis es casi enteramente dependiente de la formación de neoíntima y de la hiperplasia de los SMC ^{4}. Se estima que, sólo en el año 1997, del orden de 100.000 pacientes con restenosis en la endoprótesis necesitaron tratamiento ^{5}; por tanto, un inhibidor eficaz de la hiperplasia de SMC, de fácil administración, tendría profundas ramificaciones clínicas y económicas^{6}.

Los esfuerzos por inhibir la proliferación de los SMC en modelos de daño vascular, ya sea por modulación de mediadores celulares de la respuesta proliferativa o por interferencia directa con la maquinaria del ciclo celular, han aportado importantes conocimientos acerca de la formación de neoíntima. La progresión del ciclo celular es un episodio estrictamente controlado, regulado positivamente por las cinasas dependientes de ciclina (Cdks) y sus subunidades reguladoras de ciclina ^{7}, y negativamente por los inhibidores de Cdks y los genes supresores de tumores tales como la proteína del retinoblastoma ^{8}. La sobreexpresión, mediada por adenovirus, de inhibidores de Cdks endógenos p21 y p27^{kip1} o de una forma constituyentemente activa de Rb bloquea la formación de neoíntima en el modelo de daño en carótida de rata ^{9-11}; de modo similar, la inhibición de la actividad del factor de transcripción E2F por sobreexpresión competitiva de ADN cognado también inhibe la proliferación de SMC y la formación de neoíntima ^{12}. Estos estudios avalan la hipótesis general de que la inhibición del ciclo celular es una diana atractiva para la intervención en la formación de lesiones vasculares.

Si bien las intervenciones genéticas han ayudado en la disección de los mecanismos que regulan la formación de neoíntima, adolecen del inconveniente de no ser, ahora mismo, clínicamente adecuadas para el tratamiento de la enfermedad vascular en los seres humanos. Un compuesto de bajo peso molecular, soluble en agua, con efectos reguladores específicos del ciclo celular, particularmente uno que tuviera actividad por vía oral, tendría una amplia aplicabilidad tanto del punto de vista experimental, como potencialmente clínico. La flavona identificada recientemente, flavopiridol, es un inhibidor de Cdks que bloquea potencialmente la actividad de Cdk_{2}, Cdc_{2}, y Cdk_{4}^{13-16}. A diferencia de otros inhibidores farmacológicos de Cdks, el flavopiridol es digno de mención por su especificidad hacia cinasas, su disponibilidad oral y su potencia, siendo eficaz en concentraciones nanomolares ^{16}. Estas características únicas dan como resultado un perfil de efectos secundarios que ha conducido al ensayo de flavopiridol en la fase 1 de estudios clínicos para el tratamiento de neoplasmas resistentes al tratamiento^{17}. Dadas estas propiedades, ahora se ha examinado la capacidad del flavopiridol para inhibir la proliferación de SMC in vitro y después del daño por un globo en la arteria carótida de la rata. Se demuestra que el flavopiridol es un inhibidor potente y selectivo de la progresión del ciclo celular y que detiene la proliferación de SMC tanto in vivo como in vitro; además, la formación de neoíntima es bloqueada eficazmente por dosis orales de flavopiridol menores que aquéllas en las se han reconocido efectos tóxicos para los seres humanos.

Ahora se ha encontrado sorprendentemente que los derivados de 4-H-1-benzopiran-4-ona son adecuados como inhibidores de la proliferación de SMC. Se sabe que los derivados de 4-H-1-benzopiran-4-ona son adecuados para reprimir tumores. Sin embargo, es sorprendente que los derivados de 4-H-1-benzopiran-4-ona de acuerdo con la presente invención actúen eficazmente como inhibidores de la proliferación de SMC a niveles de dosificación menores que los niveles de dosificación que han sido utilizados en la represión del crecimiento tumoral.

Por consiguiente, un objeto de la presente invención es el uso de derivados de 4-H-1-benzopiran-4-ona como inhibidores de la proliferación de miocitos lisos.

Figura 1. Efecto de flavopiridol sobre la síntesis de ADN de HASMC. A. Se trataron HASMC estables en ausencia (-) o presencia (+) de bFGF (10 ng/ml) y con las concentraciones indicadas de flavopiridol (nmol/l) durante 24 h. La incorporación de BrdU como medida de la proliferación se determinó por un ensayo basado en ELISA y se expresó como porcentaje de incorporación en ausencia de tratamiento con bFGF. *p<0,05, comparado con células no tratadas. \daggerp<0,05, comparado con tratamiento con bFGF en ausencia de flavopiridol. B. Se trataron HASMC con bFGF (10 ng/ml), trombina (2 U/ml) o vehículo en presencia o ausencia de flavopiridol (75 nmol/L) y se midió la incorporación de BrdU. *p<0,05, comparado con células no tratadas. **p<0,05, comparado con tratamiento con bFGF a solas. p<0,05, comparado con tratamiento con trombina a solas.

Figura 2. Efecto de flavopiridol sobre la proliferación de HASMC. Se trataron HASMC estables con bFGF (10 ng/ml) a solas (\bullet), bFGF y flavopiridol (75 nmol/L) (\bullet) o vehículo (\bullet) durante los tiempos indicados y se determinó el número de células después de cada tratamiento. Los resultados se expresan como las cuentas de células por pocillo (X10^{3}).

Figura 3. Efecto de flavopiridol sobre la actividad de cinasa dependiente de ciclina en HASMC. Se trataron HASMC estables con bFGF (10 ng/ml), trombina (2 U/ml) o vehículo en presencia o ausencia de flavopiridol (75 nmol/L), y se cuantificó la fosforilación de histona H1 como medida de actividad Cdk y se expresó como el porcentaje de actividad Cdk en ausencia de tratamiento con bFGF. \text{*}p<0,05, comparado con células no tratadas. **p<0,05, comparado con tratamiento con bFGF a solas. p<0,05, comparado con tratamiento con trombina a solas.

Figura 4. Regulación con flavopiridol de las proteínas relacionadas con el ciclo celular. Se trataron HASMC estables en presencia (+) o ausencia (-) de bFGF (10 ng/ml), trombina (2 U/ml), y/o flavopiridol (75 nmol/L) durante 24 h. Se realizó una inmunotransferencia de lisados celulares con anticuerpos específicos que reconocen ciclina D_{1} (panel superior), PCNA (panel central), y Rb fosforilado (pRb) e hiperfosforilado (panel inferior).

Figura 5. Efectos de flavopiridol sobre la actividad de MAP cinasa en HASMC. Se trataron HASMC estables en presencia (+) o ausencia (-) de bFGF (10 ng/ml), trombina (2 U/ml), PD98059 (30 \mumol/L) y/o flavopiridol (75 nmol/L) durante 30 min. Se midieron los niveles de Erk1 (pErk1) y Erk2 (pErk2) fosforilados por inmunotransferencia con un anticuerpo específico para fosforilación que reconoce ambas proteínas (panel superior). Se midió la actividad MAP cinasa con un ensayo de cinasa en gel, utilizando la proteína básica de mielina como sustrato (panel
inferior).

Figura 6. Viabilidad de HASMC después del tratamiento con flavopiridol. Se trataron HASMC estables con flavopiridol (75 nmol/L), TNF-\Upsilon (50 ng/ml), o vehículo las veces indicadas. Se estimó la viabilidad celular por exclusión del azul tripano. Los resultados se expresan como el porcentaje de células viables a células totales contadas.

Figura 7. Inhibición de la formación de neoíntima en la arteria carótida de ratas por flavopiridol después del daño por un globo. Se midieron las relaciones neoíntima/media en cortes histológicos de arterias carótidas de ratas tratadas con o sin flavopiridol (5 mg/kg) durante 5 días después del daño. Las arterias se examinaron 7 (n = 12) y 14 (n = 12) días después del daño. También se da el porcentaje de núcleos positivos en PCNA (\pm SEM, expresado como un porcentaje de núcleos contados) en la neoíntima de las arterias a partir de cada punto de tiempo y cada grupo de tratamiento. *p<0,05, comparado con tratamiento con vehículo.

Figura 8. Cortes histológicos de arterias carótidas de ratas. Los cortes son de arterias 7 (paneles A y B) y 14 (paneles C y D) días después del daño. Las arterias indicadas en los paneles A y C son de ratas tratadas con flavopiridol (5 mg/kg) por sonda gástrica; las arterias de los paneles B y D eran de ratas tratadas con vehículo a solas. Ampliación original, 100 aumentos.

Figura 9. Expresión de Cdk2 después del daño por un globo en arterias carótidas de ratas. Los cortes son de arterias 7 (paneles A y B) y 14 (paneles C y D) días después del daño. Las arterias indicadas en los paneles A y C son de ratas tratadas con flavopiridol (5 mg/kg) por sonda gástrica; las arterias de los paneles B y D eran de ratas tratadas con vehículo a solas. Los núcleos positivos en Cdk2, localizados predominantemente en la neoíntima, se tiñen con azul Vector por el método de la fosfatasa alcalina. Ampliación original, 100 aumentos.

Los 4-H-1-benzopiranos adecuados son compuestos de fórmula

1

donde

R_{1} es hidrógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, aril-alquiloC_{1}-C_{4}; alquiloC_{1}-C_{6} sustituido con halógeno, hidroxi o carboxi; cicloalquiloC_{3}-C_{6}, piridilo, tienilo, cicloalquilC_{3}-C_{6}-alquiloC_{1}-C_{4}, alquenilo C_{2}-C_{6}, alquinilo C_{2}-C_{6}, fenilo; fenilo, mono- o polisustituido con halógeno, alquiloC_{1}-C_{4}, alcoxiC_{1}-C_{4}, hidroxi, carboxi, COO-alquilo, CONH_{2}, CONH-alquilo, CON(alquilo)_{2}, nitro, trifluorometilo, amino, alquilC_{1}-C_{4}-amino, di-alquilC_{1}-C_{4}-amino, o fenilo; naftilo, carboxilo, -CHO, COO-alquiloC_{1}-C_{4}, un amino primario, alquilamino, aralquilamino, dialquilamino, amido, arilamino, diarilamino, o -CH_{2}O-alquilo C_{1}-C_{4};

R_{2} es hidrógeno, alquilo con 1 a 6 átomos de carbono, arilo, nitro, amino, di-alquilC_{1}-C_{4}-amino, un halógeno, hidroxi, alcoxi, -COOH, -COO-alquiloC_{1}-C_{4}, -CHO, -CH_{2}OH o -CH_{2}O-alquiloC_{1}-C_{4};

R_{3} es hidrógeno, alquiloC_{1}-C_{4}; alquiloC_{1}-C_{4} sustituido con halógeno, hidroxi o carboxi; hidroxi, carboxi, nitro, amino, alquilC_{1}-C_{4}-amino, di-alquilC_{1}-C_{4}-amino, halógeno, -O-alquil-C(O)-alquilo, -CHO, -CH_{2}OH, -CH_{2}O-alquiloC_{1}-C_{4} o R_{2}N-C(O)-O-, donde R es H, alquiloC_{1}-C_{6}, cicloalquilo; u -O-alquil-C(O)-alquilo o arilo;

R_{4} es hidrógeno, hidroxi; alcoxiC_{1}-C_{4}, alcanoilC_{1}-C_{4}-oxi, alcoxiC_{1}-C_{4}-carbonilo, ariloxi, amino, alquilC_{1}-C_{4}-amino, di-alquilC_{1}-C_{4-}amino, o R'_{2}-N-C(O)-O- donde R' es H, alquiloC_{1}-C_{6}, cicloalquilo o arilo;

R_{5} es hidrógeno, alquiloC_{1}-C_{6}, aril-alquiloC_{1}-C_{4}, cicloalquiloC_{3}-C_{6}, cicloalquilC_{3}-C_{6}-alquiloC_{1}-C_{4}, alquilamino, alcanoíloC_{1}-C_{4}, -C(O)-O-alquiloC_{1}-C_{4} o aroílo, donde el grupo arilo en R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, y R_{5} es fenilo sin sustituir o fenilo que está mono o polisustituido con halógeno, alquiloC_{1}-C_{4}, alcoxiC_{1}-C_{4}, hidroxi, carboxi, COO-alquilo, CONH_{2}, CONH-alquilo, CON(alquilo)_{2}, nitro, trifluorometilo, amino, alquilC_{1}-C_{4}-amino, di-alquilC_{1}-C_{4}-amino o fenilo;

m es un número entero entre 0 y 3 y n es 1, o una de sus sales de adición de ácido farmacológicamente aceptables.

Los compuestos de acuerdo con la invención tienen dos centros de asimetría, uno en el que el anillo heterocíclico que contiene nitrógeno está condensado al resto de benzopirano (C-4'), y el otro en el átomo de carbono sustituido con R_{4} (C-3'), lo que significa que son posibles dos pares de isómeros ópticos. La definición de los compuestos de acuerdo con la invención abarca todos los posibles estereoisómeros y sus mezclas. De manera muy particular, abarca las formas racémicas y los isómeros ópticos aislados que tienen la actividad especificada. Los dos racematos se pueden resolver por métodos físicos tales como, por ejemplo, cristalización fraccionada. Los isómeros ópticos individuales se pueden obtener a partir de los racematos por métodos convencionales, tales como, por ejemplo, formación de la sal con un ácido ópticamente activo seguida de cristalización.

Ejemplos de grupos alquilo que son adecuados para R_{1} a R_{5} son radicales de cadena lineal o ramificada que tienen hasta 6, preferiblemente hasta 5 átomos de carbono, por ejemplo los grupos metilo, propilo, isopropilo, t-butilo, pentilo o ispopentilo.

Ejemplos de grupos alquilo sustituidos que son adecuados para R_{1} a R_{5} son haloalquilo tal como trifluorometilo, hidroxialquilo tal como hidroxietilo, o carboxialquilo, tal como carboxietilo.

Ejemplos adecuados de un grupo cicloalquilo que tiene 3 a 6 átomos de carbono y se representa por R_{1} a R_{5} son ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo. El ciclopropilmetilo es un ejemplo de cicloalquilalquilo.

Un ejemplo de un grupo aralquilo que se representa por R_{1} a R_{5} es un grupo fenilalquilo en el que el grupo fenilo está sin sustituir o monosustituido o polisustituido con sustituyentes tales como halógeno, alquiloC_{1}-C_{4}, alcoxiC_{1}-C_{4} o nitro o con un grupo trifluorometilo, grupo amino y grupo amino sustituido.

Un ejemplo de un grupo arilo que se representa por R_{1} a R_{5} es un grupo fenilo que está sin sustituir o monosustituido o polisustituido con sustituyentes tales como halógeno, alquiloC_{1}-C_{4}, alcoxiC_{1}-C_{4}; hidroxi, carboxi, COO-alquilo, CONH_{2}, CONH-alquilo, CON(alquilo)_{2}, nitro o trifluorometilo, amino, alquilC_{1}-C_{4}-amino, di-alquilC_{1}-C_{4}-amino, grupos heterocíclicos aromáticos tales como grupos piridilo y radicales aromáticos policíclicos, tales como grupos naftilo.

Un ejemplo adecuado de un grupo alquilamino que se representa por R_{1} a R_{5} es (CH_{2})_{n}-NR_{6}R_{7}, donde n es 1 a 3 y R_{6} y R_{7} son alquilo y son como se han definido anteriormente en el caso de R_{1} a R_{5}; además, R_{6} y R_{7} junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos pueden formar juntos un anillo heterocíclico que contiene uno o más heteroátomos. Ejemplos adecuados de anillos heterocíclicos que se forman con R_{6} y R_{7} junto con el nitrógeno al que están unidos son piperidina, pirrolidina, morfolina, piperazina o imidazol, todos lo cuales pueden estar sin sustituir o sustituidos en una o más posiciones con alquiloC_{1}-C_{4}, alcoxiC_{1}-C_{4}o arilo o con un grupo hidroxilo o amino.

Ejemplos adecuados de sales de los compuestos según la invención con ácidos inorgánicos u orgánicos son el hidrocloruro, hidrobromuro, sulfato, fosfato, acetato, oxalato, tartrato, citrato, maleato o fumarato.

Se prefieren los compuestos de fórmula la

2

en la que R_{1} es hidrógeno, alquiloC_{1}-C_{3}, naftilo, fenilo; fenilo, mono- o polisustituido con halógeno, alquiloC_{1}-C_{4}, alcoxiC_{1}-C_{4}, hidroxi, carboxi, COO-alquilo, CONH_{2}, CONH-alquilo, CON(alquilo)_{2}, nitro, trifluorometilo, amino, alquilC_{1}-C_{4}-amino, di-alquilC_{1}-C_{4}-amino, o fenilo; piridilo o tienilo;

R_{2} es hidrógeno o alquiloC_{1}-C_{3};

R_{5} es cicloalquiloC_{1}-C_{3}, cicloalquiloC_{3}-C_{5}, o cicloalquilC_{3}-C_{5}-alquiloC_{1}-C_{4}.

Se prefieren en particular los compuestos de fórmula Ia en que R_{1} es fenilo, tienilo, piridilo, clorofenilo, diclorofenilo, metilfenilo, aminofenilo, bromofenilo, hidroxifenilo o naftilo;

R_{2} es hidrógeno y

R_{5} es metilo.

Un compuesto de especial importancia es (-)-cis-5,7-dihidroxi-2-(2-clorofenil)-8-[4-(3-hidroxi-1-metil)-piperidinil] -4H-benzopiran-4-ona (Flavopiridol), particularmente en forma de hidrocloruro.

Los compuestos según la presente invención se pueden preparar de acuerdo con la descripción de la patente de EE.UU. núms. 4.900.727 y 5.284.856. Los ejemplos de dichas patentes de EE.UU. también son de relevancia para la presente solicitud.

Los compuestos según la presente invención inhiben la proliferación de miocitos lisos. Por lo tanto, también son materia objeto de la invención los productos farmacéuticos para la inhibición de la proliferación de los miocitos lisos, que contienen al menos un compuesto de la fórmula I, definida anteriormente, o al menos una de sus sales de adición de ácido farmacológicamente aceptables, y el uso de un compuesto de fórmula I, definida anteriormente, para la preparación de un producto farmacéutico que tiene una acción inhibidora de la proliferación de los miocitos lisos. Las áreas de aplicación típicas para los compuestos según la presente invención son enfermedades/trastornos/daños que van acompañados de lesiones vasculares ricas en miocitos lisos. Un ejemplo muy importante en relación con esto son las lesiones que aparecen después del daño por un globo. Otra área de aplicación importante es la prevención de restenosis después de la implantación de una endoprótesis vascular.

Los derivados de 4H-1-benzopiran-4-ona se utilizan de acuerdo con la invención de la manera conocida generalmente, que es conocida por el experto en la técnica. Para los productos farmacéuticos, se emplea una cantidad eficaz de la sustancia activa mencionada ya sea a solas o, preferiblemente, en combinación con agentes auxiliares farmacéuticos adecuados en forma de comprimidos, comprimidos recubiertos, cápsulas, supositorios, emulsiones, suspensiones o soluciones, llegando a ser el contenido del compuesto activo hasta aproximadamente 95%, preferiblemente entre 10 y 75%.

Los expertos sabrán cuales son los agentes auxiliares adecuados para la formulación deseada del producto farmacéutico debido a sus conocimientos en la materia. Además de agentes auxiliares para comprimidos, o disolventes, formadores de gel, bases para supositorios y otros excipientes para la sustancia activa, es posible utilizar, por ejemplo, antioxidantes, dispersantes, emulsionantes, desespumantes, correctores del sabor, conservantes, solubilizantes o colorantes.

La sustancia activa se puede administrar por vía oral, parenteral, intravenosa o rectal, prefiriéndose la administración oral. Para una forma de administración oral, la sustancia activa se puede mezclar con otros compuestos junto con los aditivos que son adecuados para este propósito, tales como excipientes, estabilizantes o diluyentes inertes, y se pueden utilizar métodos convencionales para introducirlos en formas de administración adecuadas, tales como comprimidos, comprimidos recubiertos, cápsulas de gelatina dura y soluciones o suspensiones hidroalcohólicas u oleosas. Ejemplos de excipientes inertes que se pueden usar son goma arábiga, magnesia, lactosa, glucosa o almidón, en particular el almidón de maíz. En este contexto, la formulación se puede preparar en forma de un granulado seco o húmedo. Ejemplos de excipientes o disolventes oleosos adecuados son los aceites vegetales o animales, tales como el aceite de girasol o el aceite de hígado de bacalao.

Para administración subcutánea o intravenosa, se forma una solución, suspensión o emulsión de la sustancia activa, si es apropiado utilizando sustancias que son convencionales para este propósito, tales como solubilizantes, emulsionantes u otros agentes auxiliares. Ejemplos de disolventes adecuados son agua, solución fisiológica de cloruro de sodio o alcoholes, por ejemplo, etanol, propanol o glicerol, y también soluciones de azúcares, tales como los soluciones de glucosa o las soluciones de manitol, o una mezcla de los diversos disolventes que se han mencionado.

Los derivados de 4H-1-benzopiran-4-ona se administrarán a una dosis que es menor que 70%, preferiblemente menor que 60%, en particular menor que 50% de la dosificación que se utiliza para reprimir el crecimiento tumoral en el mamífero respectivo. Un ejemplo sería - en el modelo de xenoinjerto en ratones desprovistos de sistema inmune - una dosis de aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal administrados oralmente una vez al día. Esto es la mitad de la dosis que inhibe el crecimiento tumoral en el mismo modelo animal (Drees et al. Clin. Cancer Res. 1997; 3: 273-279).

Las propiedades farmacocinéticas de los derivados de 4H-1-benzopiran-4-ona podrían obligar a administrar dicho compuesto varias veces al día o elegir formulaciones de liberación lenta.

Ejemplos 1. El flavopiridol inhibe la proliferación de miocitos lisos y la formación de neoíntima in vivo en un daño en carótida de rata tomado como modelo de daño vascular

Se empleó el modelo bien establecido de daño en carótida de rata, en el que la formación de una lesión en la neoíntima después del daño inducido por un catéter es críticamente dependiente de la proliferación de SMC (Clowes et al. Lab. Invest. 1983; 49:327-333, Clowes et al. Circ. Res. 1985; 56:139-145) para examinar si el Flavopiridol induce la parada del crecimiento de SMC in vivo, igual que lo hace in vitro. Se administró flavopiridol oralmente a una dosis de 5 mg/kg una vez al día, empezando el día del daño y durante cuatro días después, ya que este período de tiempo abarca la inducción inicial de Cdk2 y la primera onda de proliferación de SMC en este modelo (Circ. Res. 1995; 77:445-465, Circ. Res. 1997; 80:418-426). Se cuantificaron las áreas promediadas de la íntima y de la media 7 y 14 días después del daño, y el tamaño de la lesión en la neoíntima se expresó como la relación del área de la neoíntima al área de la media. Tanto el grupo tratado como el no tratado estaban compuestos por doce animales. La relación en 7 días fue 1,00+/-0,05 en arterias de ratas tratadas con vehículo y 0,65+/-0,04 en arterias de ratas tratadas con Flavopiridol, una reducción del 35%. La relación neoíntima/media en 14 días fue 1,08+/-0,04 en ratas tratadas con vehículo y 0,66+/-0,03 en ratas tratadas con Flavopiridol, una reducción del 38,9%. Estos efectos fueron estadísticamente significativos en los dos puntos de tiempo (P < 0,05).

Métodos

Materiales - El Flavopiridol, (L86-8275, (-)-cis -5,7-dihidroxi-2-(2-clorofenil)-8-[4-(3-hidroxi-1-metil)piperidinil] -4H-benzopiran-4-ona), fue proporcionado por Hoechst Marion Roussel, Inc., y se disolvió en dimetilsulfóxido como una solución madre de 50 mmol/L para experimentos con cultivos celulares o en agua para experimentos in vivo. El factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) fue comprado a Collaborative Biochemical y la trombina a Sigma. El inhibidor de MEK1, PD98059, se obtuvo de New England Biolabs.

Cultivo de células - Los miocitos de aortas humanas (HASMC) se obtuvieron de Clonetics y se cultivaron como se ha descrito anteriormente ^{18}. Las células se utilizaron en los pases 5-9. Antes de realizar los experimentos, se paró el crecimiento celular a 80% de confluencia durante 48 h con medio que contenía 0,2% de suero bovino fetal.

Proliferación celular ELISA - La proliferación celular se midió por ELISA (Amersham Life Science). Los HASMC se cultivaron en placas de 96 pocillos recubiertos de gelatina y se hicieron estables. Las células se trataron con 10 ng/ml de bFGF, 2 U/ml de trombina, o vehículo durante 24 h. El flavopiridol (75 nmol/L) se administró 1 h antes del tratamiento con el factor de crecimiento. Se añadió 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) a una concentración final de 10 \mumol/L durante las 2 últimas horas del tratamiento. La incorporación de BrdU se midió como se ha descrito ^{19}. Los resultados se expresan como valor medio \pm ETM para 12 muestras por condición a partir de dos experimentos independientes.

Recuentos de células - Los HASMC cuyo crecimiento se paró en 50% de confluencia en placas de 6 pocillos se trataron con o sin flavopiridol (75 nmol/L) o bFGF (10 ng/ml). A intervalos después del tratamiento, las células se tripsinaron y se determinaron los números de células utilizando un hemocitómetro.

Análisis por transferencia Western - Los HASMC estables se trataron en presencia o ausencia de factores de crecimiento y/o flavopiridol como se indica. El análisis por transferencia Western se realizó como se ha descrito previamente ^{18}. Los anticuerpos primarios fueron: un anticuerpo policlonal anti-ciclina D1 humana (M-20, Santa Cruz), un anticuerpo monoclonal anti-antígeno nuclear expresado en células humanas en proliferación (PC10, Sigma), un anticuerpo monoclonal MAP-cinasa (Erk1/Erk2) p44/42 fosfoespecífico (New England Biolabs), y un anticuerpo monoclonal anti-Rb (G3-245, Pharmigen), que reconoce a la especie Rb fosforilada (pRb) y altamente fosforilada (ppRb). Para estudios de inmunotransferencia, los experimentos se repitieron al menos tres veces.

Actividad Cdk - Se trataron HASMC estables con agonistas e inhibidores durante 24 h y se prepararon lisados celulares totales como se describe para la transferencia Western. El ensayo de cinasa se realizó con un kit de ensayo de histona H_{1}-cinasa (Upstate Biotechnology) siguiendo las instrucciones del fabricante. Dicho brevemente, se mezclaron en un tubo de centrífuga 10 \mul de inhibidores peptídicos para la proteína cinasa C (2 \mumol/L) y la proteína cinasa A (2 \mumol/L), 100 \mug de lisado de células, 10 \mul de tampón de ensayo y 10 \mul de una mezcla que contenía 75 \mumol/L de cloruro de magnesio, 500 \mumol/L de ATP y 1 \muCi/ml [\gamma-^{32}P]ATP. Después de incubar a 30ºC durante 10 min, se pipetearon alícuotas sobre papeles de fosfocelulosa. Los papeles se lavaron en ácido fosfórico al 0,75% y seguidamente se midió la cantidad de cpm en un contador de centelleo (Beckman). Los resultados se expresan como la media \pm ETM para tres muestras y son representativos de tres experimentos independientes.

Ensayo de cinasa en el gel - Se trataron HASMC estables con factores de crecimiento durante 30 min y se prepararon lisados celulares totales como se describe para la transferencia Western. En algunos experimentos, los HASMC se trataron previamente durante 60 min con 30 \mumol/L de PD98059, flavopiridol, o vehículo. Se resolvieron cantidades iguales de proteínas (50 \mug/calle) en un gel de poliacrilamida que se copolimerizó con 350 \mug/ml de proteína básica de mielina. El gel se trató con [\gamma-^{32}P]ATP y se realizó una autorradiografía como está descrito ^{19}.

Exclusión del azul tripano - Se hicieron crecer HASMC en placas de 5 cm hasta baja confluencia y se paró el crecimiento como se ha descrito. Las células se trataron con flavopiridol (75 nmol/L) o con factor de necrosis tumoral-\Upsilon (TNF-\Upsilon; 50 ng/ml) el número indicado de veces. Tras la separación del medio, se añadió azul tripano al 0,4% en solución salina tamponada con fosfato a las placas. Después de 5 minutos, las células de las placas se contaron al microscopio. Las células azules se contaron como células no viables.

Modelo de daño en carótida de rata - El daño en arteria carótida de la rata se hizo esencialmente como está descrito ^{2}. Se anestesiaron machos adultos de ratas Sprague-Dawley (400-500 g, Zivic-Miller) con una inyección intraperitoneal de cetamina (2 mg/ kg) y xilazina (4 mg/kg). Después se canuló la carótida interna izquierda con un catéter de emoloctomía 2F. El globo se infló con solución salina y se arrastró a través de la arteria tres veces para provocarle daño distendiéndola y desnudándola. La arteria carótida derecha no se dañó y sirvió como control para cada animal. Inmediatamente después de recuperarse de la anestesia y durante cuatro días más, se administró a las ratas flavopiridol (5 mg/kg en agua) o agua por sonda gástrica siguiendo un método ciego. Todas las ratas sobrevivieron a la cirugía y no hubo signos manifiestos de toxicidad relacionada con la administración del fármaco a las dosis utilizadas. En puntos específicos de tiempo después del daño en la carótida, las ratas se anestesiaron como antes y se perfundieron sistémicamente con 4% de paraformaldehído en solución salina tamponada con fosfato. Se extirparon las arterias carótidas izquierda y derecha y se distendieron por inyección de paraformaldehído al 4% a través de la luz, y seguidamente se deshidrataron y almacenaron en etanol al 70% a 4ºC. La inmunohistoquímica se efectuó como se ha descrito previamente^{18}, utilizando el anticuerpo monoclonal PCNA y el anticuerpo policlonal anti-Cdk2 humana (M2-G, Santa Cruz).

Análisis por imagen - Se separaron las regiones distal y proximal extremas de cada arteria (aprox. 500 \mum). Se analizaron diez cortes intermedios de cada arteria (8 \mum cada uno) distanciados 500 \mum. Los cortes se fijaron y tiñeron con hematoxilina y eosina como se ha descrito previamente ^{18}. Utilizando un microscopio Nikon Diaphot 300 y un objetivo de 4 aumentos se capturó cada corte como una imagen digital utilizando una videocámara Hamamatsu C5985 y TCPro 2.41 (Coreco, Inc.). Se determinaron las áreas de la media y la neoíntima utilizando el programa informático NIH Image. Los límites entre la media y la neoíntima fueron determinados por un primer revisor del corte (A.M) y verificado siguiendo un método ciego por un segundo revisor (C. P.). El tamaño de la lesión se expresó como la relación neoíntima/media. Los resultados para cada grupo se expresaron como valor medio \pm ETM. En cada grupo eran interpretables 92% o más de las imágenes; las restantes adolecían de artefactos de fijación y no se analizaron.

Análisis estadístico - En los casos adecuados, los resultados de los estudios cuantitativos se expresaron como el valor medio \pm ETM. Para los grupos de tratamiento múltiple, se aplicó un ANOVA factorial seguido por el ensayo de diferencia significativa mínima de Fisher. El significado estadístico fue aceptado a p < 0,05.

Resultados

El flavopiridol inhibe la proliferación de HASMC - Basándose en la capacidad del flavopiridol para inhibir la proliferación de diversas líneas de células tumorales, se ensayó la hipótesis de que su uso bloquearía el crecimiento de SMC humanos de cultivos primarios. Los HASMC con su crecimiento parado se trataron con el mitógeno bFGF (10 ng/ml) de SMC durante 24 h en presencia de concentraciones crecientes de flavopiridol y se midió la proliferación por un ensayo basado en ELISA. En comparación con las células no tratadas, la proliferación de células tratadas con bFGF creció 5,4 veces (Figura 1A). El pretratamiento durante 1 h con tan sólo 50 nmol/L de flavopiridol disminuyó significativamente la proliferación de HASMC (a 3,9 veces, p < 0,05), un efecto que fue casi máximo a concentraciones de 75 nmol/L. Se obtuvieron resultados similares utilizando la captación de timidina como una medida independiente de síntesis de ADN (no indicados).

Para ensayar la generalidad de los efectos del flavopiridol sobre la proliferación de SMC, se examinó su efecto sobre la mitogénesis incitada por trombina (2 U/ml), que actúa a través de un receptor acoplado a las proteínas G, en comparación con bFGF, que estimula a un miembro de la familia de las tirosina-cinasas receptoras. El flavopiridol (75 nmol/L) inhibe de forma significativa y potente tanto la proliferación de HASMC inducida por bFGF como la inducida por trombina (5,4 veces frente a 1,8 veces y 2,4 veces frente a 0,7 veces, respectivamente, p < 0,05, Figura 1 B). Se realizaron recuentos de células para confirmar que el efecto del flavopiridol sobre la progresión del ciclo celular en HASMC realmente reflejaba los cambios en la proliferación. bFGF (10 ng/ml) indujo un incremento del triple en el número de células después de tres días de tratamiento (Figura 2). De forma similar a lo que muestran los resultados de los ensayos basados en ELISA, el flavopiridol (75 nmol/L) bloqueó eficientemente la proliferación inducida por bFGF.

El flavopiridol inhibe la actividad Cdk y la expresión génica relacionada con el ciclo celular en HASMC - Para evaluar el efecto específico del flavopiridol sobre la maquinaria del ciclo celular, se mido la actividad de histona H1-cinasa en lisados celulares de HASMC estimulados con factor de crecimiento. La fosforilación de histona H1 refleja las actividades de Cdc_{2} y Cdk_{2}^{20}. El tratamiento de HASMC con bFGF y trombina dio como resultado incrementos de 4,4 y 3,6 veces, respectivamente, en la actividad de histona H1-cinasa (Figura 3). Estos incrementos en la actividad de cinasa dependiente de ciclina fueron bloqueados íntegramente por pretratamiento con flavopiridol (75 nmol/L).

También se utilizó el análisis por transferencia Western para ver si el flavopiridol influía en la regulación inducida por factor de crecimiento de las proteínas relacionadas con el ciclo celular en HASMC. La ciclina D_{1} es una ciclina en fase G_{1} que es regulada en ascenso por estimulación del factor de crecimiento y es degradada rápidamente durante su privación en el ciclo celular^{21}. Los niveles de proteína ciclina D1 son regulados en ascenso 6,3 veces y 3,2 veces, respectivamente, en respuesta al tratamiento con bFGF y trombina durante 24 h (Figura 4), un efecto que podría ser bloqueado completamente por pretratamiento con flavopiridol. De modo similar, el aumento en la expresión de PCNA, que se sintetiza predominantemente durante la fase S conjuntamente con el ADN de replicación ^{22}, también fue bloqueada por el pretratamiento con flavopiridol. Como medida final de las proteínas relacionadas con el ciclo celular, se examinó la fosforilación de Rb en respuesta a la expresión del factor de crecimiento utilizando un anticuerpo que reconoce Rb fosforilado. Rb es un regulador del ciclo celular que se une al factor E2F inactivándolo cuando Rb está en el estado no fosforilado ^{23} y que induce la parada in vivo del crecimiento de SMC^{11}. La fosforilación inactiva Rb y permite que transcurra la progresión a través de la fase S. El análisis de la fosforilación de Rb es particularmente relevante ya que Rb es una diana para Cdk_{2} y Cdk_{4} in vivo. Tanto la trombina como el bFGF indujeron la hiperfosforilación de Rb, un efecto que fue inhibido por flavopiridol. Tomados juntos, estos resultados indican que el flavopiridol influye en la expresión y actividad de los elementos de control del ciclo celular relacionados con las fases G_{1} y S en HASMC en asociación con sus efectos inhibidores del crecimiento.

El flavopiridol no tiene ningún efecto sobre la actividad o fosforilación de MAP-cinasa - Para garantizar que el flavopiridol estaba actuando específicamente a nivel del ciclo celular, en vez de hacerlo inespecíficamente sobre rutas de cinasas curso arriba, se ha medido la fosforilación y la actividad de Erkl (p44 MAP cinasa) y Erk2 (p42 MAP cinasa), dos miembros de la familia de las MAP-cinasas. Se han elegido estas cinasas porque están inmediatamente curso arriba de episodios transcripcionales que ocurren en respuesta a estímulos de crecimiento y curso abajo de diversas rutas señalizadoras mitogénicas críticas ^{24}. Una respuesta intacta de MAP-cinasas indica que las rutas mitogénicas curso arriba están intactas también. Se ha medido el estado de fosforilación de Erkl y Erk2 con un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente las formas fosforiladas y, por tanto, activadas. Como control en estos experimentos, se ha utilizado PD98059, un inhibidor potente y selectivo de la activación de MAP cinasa ^{25}. Se detectó un incremento en la cantidad de Erkl y Erk2 después del tratamiento de HASMC con trombina y bFGF durante 30 min, en comparación con las células no tratadas (Figura 5, panel superior). La fosforilación de Erkl y Erk2 tanto por trombina como por bFGF se bloqueó por tratamiento con PD98059, pero no con flavopiridol. Para confirmar estos hallazgos, se midió la actividad de Erkl y Erk2 por un ensayo de cinasa en el gel (Figura 5, panel inferior). De nuevo, se encontró que las actividades de Erk1 y Erk2 crecieron en respuesta a trombina y bFGF, un efecto que era inhibible por PD98059 pero no por flavopiridol. Estos experimentos, conjuntamente con los presentados en las Figuras 3 y 4, aportan pruebas de que los efectos del flavopiridol sobre la proliferación de HASCM son debidos a una parada específica de la maquinaria del ciclo celular al bloquear la actividad Cdk sin afectar a los episodios señalizadores curso arriba.

El flavopiridol no disminuye la viabilidad de HASMC - Informes previos de actividad de flavopiridol en otros tipos de células han demostrado que, dependiendo de la línea celular, el flavopiridol puede o bien inducir la parada del crecimiento sin afectar a la viabilidad, o producir apoptosis ^{16,26-29}. Por lo tanto, se estimó si el flavopiridol disminuía la viabilidad de HASMC midiendo la exclusión del azul tripano en diversos puntos de tiempo después del tratamiento. HASMC estables fueron tratados con flavopiridol (75 nmol/L), vehículo o TNF-\Upsilon (50 ng/mi), una citocina que se sabe que induce apoptosis en este tipo de células ^{30}. Si bien TNF-\Upsilon disminuye potentemente la viabilidad de HASMC, dando como resultado la muerte de prácticamente todas las células tratadas durante 24 h, el flavopiridol no tuvo ese efecto (Figura 6). Se ha observado que con concentraciones más altas e incubaciones más prolongadas, pueden ocurrir algunos descensos de viabilidad en presencia de flavopiridol (no mostrado). Sin embargo, en las condiciones ensayadas, el flavopiridol induce principalmente la parada del crecimiento, sin afectar a la viabilidad de SMC.

Flavopiridol inhibe la proliferación de miocitos lisos y la formación de neoíntima in vivo en un modelo de daño vascular en carótida de rata - Se utilizó el modelo bien conocido de daño en carótida de rata, en el que la formación de una lesión en la neoíntima después del daño inducido con un catéter es críticamente dependiente de la proliferación de SMC ^{2, \ 3}, para examinar si el flavopiridol induce parada del crecimiento de SMC in vivo, igual que lo hace in vitro. Se administró flavopiridol oralmente a una dosis de 5 mg/kg una vez al día, empezando el día del daño y durante cuatro días después, ya que este período de tiempo abarca la inducción inicial de Cdk2 y la primera onda de proliferación de SMC en este modelo ^{31},^{32}. Se cuantificaron las áreas promediadas de la íntima y de la media 7 y 14 días después del daño, y el tamaño de la lesión en la neoíntima se expresó como la relación del área de la neoíntima al área de la media. Tanto el grupo tratado como el no tratado estaba compuesto por doce animales. La relación neoíntima/media en 7 días fue 1,00 \pm 0,05 en arterias de ratas tratadas con vehículo y 0,65 \pm 0,04 en arterias de ratas tratadas con flavopiridol, una reducción del 35,0%. (Figura 7). La relación neoíntima/media en 14 días fue 1,08 \pm 0,04 en ratas tratadas con vehículo y 0.66 \pm 0,03 en ratas tratadas con Flavopiridol, una reducción del 38,9%. Estos efectos fueron estadísticamente significativos en los dos puntos de tiempo (P < 0,05). En la Figura 8 se muestran cortes arteriales representativos.

Con el fin de demostrar directamente que el flavopiridol inhibe la proliferación de miocitos lisos, se tiñeron cortes para la expresión de PCNA en campos representativos de cada arteria y se determinó el porcentaje de núcleos positivos en PCNA en la neoíntima. En 7 días, 31,1 \pm 7,2% de núcleos en arterias dañadas de las ratas no tratadas fueron positivos en PCNA, mientras que sólo 11,8 \pm 1,5% de arterias dañadas en ratas tratadas con flavopiridol fueron positivos en PCNA (Figura 7 p < 0,05). En 14 días, estaban presentes núcleos positivos en PCNA en 10,4 \pm 2,0% de células neoíntimas de arterias de rata dañadas tratadas, pero sólo en 2 \pm 0,5% de células neoíntimas de arterias de rata dañadas sin tratar (p < 0,05). (Raramente se veían núcleos positivos en PCNA en arterias sin dañar independientemente del tratamiento). De modo similar, las células positivas en Cdk_{2} eran mucho menos comunes en la neoíntima de ratas tratadas con flavopiridol (Figura 9, paneles A y C), comparadas con arterias de ratas sin tratar (paneles B y D), tanto 7 como 14 días después del daño.

Discusión

En el presente estudio, se ha examinado si el nuevo inhibidor de Cdk, flavopiridol, el inhibidor más potente y específico de Cdks que se conoce, es un candidato adecuado para inhibir la proliferación de SMC in vivo, particularmente en el marco del daño vascular. Los intentos previos de acceder terapéuticamente a la maquinaria del ciclo celular para el tratamiento de la enfermedad vascular han aportado un fundamento para los presentes estudios ^{9-12}; sin embargo, los métodos empleados para este fin se han basado en tecnologías de transferencia de genes para inhibir la progresión del ciclo celular. Actualmente hay grandes obstáculos que impiden la aplicación clínica de estas
técnicas ^{33}. Durante el curso de los presentes estudios, se informó que CVT-313, un compuesto identificado recientemente que también tiene propiedades inhibidoras de Cdk pero a concentraciones micromolares, puede inhibir también la formación de neoíntima; sin embargo, se requería que CVT-313 fuera instilado en la arteria carótida en el momento del daño para producir este efecto ^{34}. En cambio, aquí se demuestra que el flavopiridinol, cuando se administra oralmente, puede inhibir potentemente la formación de neoíntima, en un grado comparable con otros agentes clínicamente
relevantes ^{11, \ 35, \ 36}. La actividad oral del flavopiridol lo hace virtualmente único entre los agentes que, a ciencia cierta, son activos en modelos animales de daño vascular. Su selectividad, potencia y facilidad de administración hacen del flavopiridol un excelente candidato para examinar los beneficios terapéuticos de la inhibición in vivo del ciclo celular en lesiones vasculares humanas.

Según esta invención se elige administrar flavopiridol oralmente en una concentración (5 mg/kg) que es la mitad de la que inhibe el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto en ratones desprovistos de sistema inmune ^{27}. Es notable que concentraciones de flavopiridol de 75 nmol/L den como resultado la inhibición casi completa de la proliferación de SMC en estos estudios, si bien se obtuvo una mediana de concentraciones en suero de 425 nmol/L a dosis inferiores al umbral tóxico en estudios humanos en Fase 1 de carcinoma resistente al tratamiento ^{17}. Los resultados aquí expresados sugieren que dosis mucho más bajas de inhibidores del ciclo celular que las utilizadas para tratar neoplasias pueden ser eficaces en el marco de las enfermedades vasculares tales como restenosis, con el consiguiente beneficio de tolerabilidad incrementada.

Aunque ahora se haya demostrado que el flavopiridol induce parada del crecimiento sin afectar a la viabilidad de HASCM en cultivo, y se haya demostrado la disminución de la formación de neoíntima después del tratamiento con flavopiridol in vivo, no se puede garantizar que la parada del ciclo celular sea el único factor que reduce la formación de neoíntima en lesiones de carótida. El flavopiridol puede inducir parada del crecimiento induciendo o sin inducir apoptosis, dependiendo del tipo de célula observado^{29}. Es interesante que el flavopiridol inhibe la apoptosis en células PC12 que han sido finalmente diferenciadas, y sin embargo induce apoptosis en células PC12 no diferenciadas que están proliferando^{28}. Aunque los experimentos in vitro han sido llevados a cabo en condiciones que simularían el fenotipo de SMC antes del daño, es posible que SMC puedan responder de forma diferente al flavopiridol después del daño y puedan incluso experimentar apoptosis. Si bien el papel de la apoptosis en lesiones vasculares no está claro, la expresión del ligando Fas en SMC induce apoptosis y bloquea la formación de neoíntima en conejos tras un daño por un globo^{37}, lo que sugiere que si el flavopiridol induce realmente la apoptosis de SMC in vivo, como lo hace sobre células PC12 proliferantes, esto puede ser un fenómeno saludable en el contexto de la formación de neoíntima. Otros mecanismos también pueden contribuir a los efectos del flavopiridol sobre la formación de lesiones. Por ejemplo, la inhibición del ciclo celular mediada por oligodesoxinucleotidos mejora la función endotelial en injertos de vena de conejo^{38}. Se precisarán estudios adicionales para abordar otros mecanismos de los efectos del flavopiridol sobre SMC in vivo, distintos de la parada del crecimiento. Dado el papel demostrado de la proliferación de SMC en la formación de lesiones después del daño en carótida de rata ^{2, \ 3}, es interesante destacar que, a pesar de los profundos efectos del flavopiridol in vitro, su capacidad de inhibir la formación de neoíntima (aun siendo significativos) eran más modestos en las condiciones de los experimentos in vivo. Se han considerado varias explicaciones para esta observación. Es improbable que ocurra una proliferación acelerada de SMC después del cese de flavopiridol ya que las diferencias en los índices de proliferación se mantienen hasta 14 días después del daño (Figuras 7 y 9). Es más plausible o bien que otros componentes de formación de lesiones, tales como la migración de SMC y la producción de matriz extracelular, contribuyan todavía a la formación de lesiones, incluso en ausencia de proliferación significativa de SMC, o que la administración de flavopiridol una vez al día sea insuficiente para parar la proliferación por completo en este modelo. Los datos recientes que indican que la semivida biológica del flavopiridol es de tan sólo 2,5 h sugieren que esta última hipótesis puede ser correcta; estudios adicionales pueden ser capaces de identificar un régimen de dosificación aún más eficaz ^{39}.

Estos resultados indican que el flavopiridol puede inhibir la proliferación de SMC y, por tanto, la formación de neoíntima en un modelo de enfermedad vascular en animales pequeños, bien aceptado. Se debe indicar que la relevancia de la inhibición de la proliferación de SMC es controvertible en lesiones vasculares humanas, y puede diferir dependiendo de la naturaleza de la lesión y del momento en el que se hacen observaciones de la proliferación. El índice proliferativo de SMC en muestras de aterectomía es marcadamente bajo^{40}, aunque es posible que estas muestras no reflejen los cambios proliferativos en etapas anteriores, más críticas, en el desarrollo de lesiones. Además, la remodelación arterial independiente del crecimiento de la neoíntima puede ser responsable de una proporción significativa de obstrucción luminal después de realizar una angioplastia en seres humanos ^{41}. En cambio, los índices de actividad mitótica en SCM son mucho más altos (25% positivos en PCNA) en muestras de aterectomía de lesiones humanas con restenosis en la endoprótesis vascular, lo que concuerda con el papel establecido de la hiperplasia de SMC, pero sin remodelación, en este proceso ^{4}. A medida que aumenten las colocaciones de endoprótesis vasculares y los problemas clínicos de la restenosis en las endoprótesis, aumentará la necesidad de un medio eficaz para parar la hiperplasia de SMC y la formación de neoíntima. Como el flavopiridol es un potente fármaco, disponible para administrar por vía oral, con actividad inhibidora de Cdk específica, y como las dosis seguras de flavopiridol son conocidas para los seres humanos, el flavopiridol puede considerarse como un candidato farmacológico para la prevención de restenosis en las endoprótesis vasculares en los seres humanos.

Métodos y resultados

Usando miocitos lisos aórticos humanos cultivados, se ha encontrado que el flavopiridol a concentraciones de tan sólo 75 nmol/L ha dado como resultado una inhibición casi completa de la proliferación inducida por factor de crecimiento de fibroblastos básico y por trombina. A esta dosis, el flavopiridol inhibió la actividad de cinasa dependiente de ciclina, medida por la fosforilación de histona H_{1}, pero no tuvo ningún efecto sobre la activación de MAP cinasa. La inducción de las proteínas relacionadas con el ciclo celular ciclina D_{1}, antígeno nuclear de células en proliferación y proteína de retinoblastoma fosforilada también fue bloqueada por flavopiridol. El flavopiridol no tuvo efecto sobre la viabilidad celular. Para ensayar si el flavopiridol tenía una actividad similar in vivo cuando se administraba oralmente, se examinó la formación de neoíntima en arterias carótidas de rata después de la lesión con globo. El flavopiridol (5 mg/kg) administrado por sonda gástrica redujo el área de neoíntima en un 35% y un 39% a los 7 y 14 días, respectivamente, después del daño.

Conclusiones

El flavopiridol inhibe el crecimiento de SMC in vitro e in vivo. Su disponibilidad oral y su selectividad hacia cinasas dependientes de ciclina lo convierten en una herramienta terapéutica potencial en el tratamiento de lesiones vasculares ricas en SMC.

Referencias

1. Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature 1993; 362:801-9.

2. Clowes AW, Reidy MA, Clowes MM. Kinetics of cellular proliferation after arterial injury. Lab. Invest. 1983; 49: 327-333.

3. Clowes A, Schwartz S. Significance of quiescent smooth muscle migration in the injured rat carotid artery. Circ. Res. 1985; 56:139-145.

4. Kearney M, Pieczek A, Haley L, Losordo DW, Andres V, Schainfeld R, Rosenfield K, Isner JM. Histopathology of in-stent restenosis in patients with peripheral artery disease. Circulation 1997; 95:1998-2002.

5. Mintz GS, Hoffmann R, Mehran R, Pichard AD, Kent KM, Satler LF, Popma JJ, Leon MB. In-stent restenosis: the Washington Hospital Center experience. Am. J. Cardiol. 1998; 81:7E-13E.

6. Califf RM. Restenosis: the cost to society. Am. Heart J. 1995; 130:680-684.

7. Sherr CJ. Mammalian G_{1} cyclins. Cell 1993; 73:1059-1065.

8. Hunter T. Braking the cycle. Cell 1993; 75:839-841.

9. Chen D, Krasinski D, Chen D, Sylvester A, Chen J, Nisen PD, Andres V. Downregulation of cyclin-dependent kinase 2 activity and cyclin A promoter activity in vascular smooth muscle cells by p27KIP^{1}, an inhibitor of neointima formation in the rat carotid artery. J. Clin. Invest. 1997; 99:2334-2341.

10. Chang MW, Barr E, Lu MM, Barton K, Leiden JM. Adenovirus-mediated overexpression of the cyclin/cyclin-dependent kinase inhibitor, p21 inhibits vascular smooth muscle cell proliferation and neointima formation in the rat carotid artery model of balloon angioplasty. J. Clin. Invest. 1995; 96:2260-2268.

11. Chang MW, Barr E, Seltzer J, Jiang Y-Q, Nabel EG, Parmacek MS, Leiden JM. Cytostatic gene therapy for vascular proliferative disorders with a constitutively active form of the retinoblastoma gene product. Science 1995; 267:518-522.

12. Morishita R, Gibbons GH, Horiuchi M, Ellison KE, Nakajima M, Zhang L, Kaneda Y, Ogihara T, Dzau VJ. A gene therapy strategy using a transcription factor decoy of the E2F binding site inhibits smooth muscle proliferation in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995; 92:5855-5859.

13. Losiewitz MD, Carlson BA, Kaur G, Sausville EA, Worland PJ. Potent inhibition of Cdc2 kinase activity by the flavanoid, L86-8275. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994; 201:589-595.

14. Carlson BA, Dubay MM, Sausville EA, Brizuela L, Worland PJ. Flavopiridol induces G_{1} arrest with inhibition of cyclin-dependent kinase (CDK) 2 and CDK4 in human breast carcinoma cells. Canc. Res. 1996; 56:2973-2978.

15. de Azevedo WF, Mueller-Dieckmann H-J, Schuze-Gahmen U, Worland PJ, Sausville E, Kim S-H. Structural basis for specificity and potency of a flavanoid inhibitor of human Cdk2, a cell cycle kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93:2735-2740.

16. Kaur G, Stetler-Stevenson M, Sebers S, Worland P, Sedlacek H, Myers C, Czech J, Naik R, Sausville E. Growth inhibition with reversible cell cycle arrest of carcinoma cells by flavone L86-8275. J. Natl. Canc. Inst. 1992; 84: 1736-1740.

17. Senderowicz AM, Headlee D, Stinson S, Lush RM, Figg WD, Pluda J, Sausville EA. A Phase 1 trial of flavopiridol (FLA), a novel cyclin-dependent kinase inhibitor, in patients with refractory neoplasm. Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 1997; 16:226a. Abstract.

18. Ruef J, Hu ZY, Yin L-Y; Wu Y, Hanson SR, Kelly AB, Harker LA, Rao GN, Runge MS, Patterson C. Induction of vascular endothelial growth factor in balloon-injured baboon arteries. Circ. Res. 1997; 81:24-33.

19. Ruef J, Rao GN, Li F, Bode C, Patterson C, Bhatnagar A, Runge MS. Induction of rat aortic smooth muscle cell growth by the lipid peroxidation product 4-hydroxy-2-nonenal. Circulation 1998; 97:1071-1078.

20. Swank RA, Th'ng JP, Guo XW, Valdez J, Bradbury EM, Gurley LR. Four distinct cyclin-dependent kinases phosphorylate histone H_{1} at all of its growth related phosphorylation sites. Biochemistry 1997; 36:13761-13768.

21. Matsushime H, Roussel MF, Ashmun RA, Sherr CJ. Colony-stimulating factor 1 regulates novel cyclins during the G_{1} phase of the cell cycle. Cell 1991; 65:701-713.

22. Bravo R. Synthesis of the nuclear protein (PCNA) and its relationships with DNA replication. Exp. Cell Res. 1986; 163:287-293.

23. Ewen ME, Sluss HK, Sherr CJ, Matsushime H, Kato JY, Livingston DM. Functional interaction of the retinoblastoma protein with mammalian D-type cyclins. Cell 1993; 7:487-497.

24. Hunter T. Protein kinases and phosphatases: The yin and yang of protein phosphorylation and signaling. Cell 1995; 80:225-236.

25. Payne DM, Rossomando AJ, Martino P, Erickson AK, Her J-H, Shabanowitz J, Hunt DF, Weber MJ, Sturgill TW. Identification of the regulatory phosphorylation sites in pp42/mitogen-activated protein kinase (MAP kinase). EMBO J. 1991-110:885-892.

26. Konig A, Schwartz GK, Mohammad RM, Al-Katib A, Gabrilove JL. The novel cyclin-dependent kinase inhibitor flavopiridol downregulates Bcl-2 and induces growth arrest and apoptosis in chronic B-cell leukemia lines. Blood 1997; 90:4307-4312.

27. Drees M, Dengler WA, Roth T, Labonte H, Mayo J, Malspeis L, Grever M, Sausville EA, Fieberg HH. Flavopiridol (L86-8275): Selective antitumor activity in vitro and activity in vivo for prostate carcinoma cells. Clin. Cancer Res. 1997; 3:273-279.

28. Park DS, Rarinelli SE, Greene LA. Inhibitors of cyclin-dependent kinases promote survival of post-mitotic neuronally differentiated PC12 cells and sympathetic neurons. J. Biol. Chem. 1996; 271:8161-8169.

29. Parker BW, Kaur G, Nieves-Niera W, Taimi M, Kohlhagen G, Shimizu T, Losiewicz MD, Pommier Y, Sausville EA, Senderowicz AM. Early induction of apoptosis in hematopoietic cell lines after exposure to flavopiridol. Blood 1998; 91:458-465.

30. Geng YJ, Wu Q, Muszynski M, Hansson GK, Libby P. Apoptosis of vascular smooth muscle cells induced by in vitro stimulation with interferon-gamma, tumor necrosis factor-alpha, and interleukin-1 beta. Arterioscler. Thromb. Biol. 1996; 16:19-27.

31. Schwartz SM, deBlois D, O'Brien ERM. The intima: soil for atherosclerosis and restenosis. Circ. Res. 1995; 77:445-465.

32. Wei GL, Krasinkski K, Kearney M, Isner JM, Walsh K, Andres V. Temporally and spatially coordinated expression of cell cycle regulatory factors after angioplasty. Circ. Res. 1997; 80:418-426.

33. de Young MB, Dichek DA. Gene therapy for restenosis. Circ. Res. 1997; 82:306-313.

34. Brooks EE, Gray NS, Joly A, Kerwar SS, Lum R, Mackman RL, Norman TC, Rosete J, Rowe M, Schow SR, Schultz TG, Wang X, Wick MM, Shiffman D. CVT-313, a specific and potent inhibitor of CDK2 that prevents neointimal formation. J. Biol. Chem. 1997; 272:299207-29911.

35. Sirois MG, Simons M, Edelman ER. Antisense oligonucleotide inhibition of PDGFR-b receptor subunit expression directs suppression of intimal thickening. Circulation 1997; 95:669-676.

36. Rade JJ, Schulick AH, Virmani R, Dichek DA. Local adenoviral-mediated expression of recombinant hirudin reduces neointima formation after arterial injury. Nature Med. 1996; 2:293-298.

37. Sata M, Perlman H, Muruve DA, Silver M, Ikebe M, Libermann TA, Oettgen P, Walsh K. Fas ligand gene transfer to the vessel wall inhibits neointima formation and overrides the adenovirus-mediated T cell response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998; 95:1213-1217.

38. Mann MJ, Gibbons GH, Tsao PS, von der Leyen HE, Cooke JP, Buitrago R, Kernoff R, Dzau VJ. Cell cycle inhibition preserves endothelial function in genetically engineered rabbit vein grafts. J. Clin. Invest. 1997; 99: 1295-1301.

39. Arguello F, Alexander M, Sterry JA, Tudor G, Smith EM, Kalavar NT, Greene JF, Koss W, Morgan CD, Stinson SF, Siford TJ, Alvord WG, Klabansky RL, Sausville EA. Flavopiridol induces apoptosis of normal lymphoid cells, causes immunosuppression, and has potent antitumor activity in vivo against human leukemia and lymphoma xenografts. Blood 1998; 91:2482-2490.

40. O'Brien ER, Alpers CE, Stewart DK, Ferguson M, Tran N, Gordon D, Benditt EP, Hinohara T, Simpson JB, Schwartz SM. Proliferation in primary and restenotic coronary atherectomy tissue: implications for anti-proliferative therapy. Circ. Res. 1993; 73:223- 231.

\newpage

41. Mintz GS, Popma JJ, Pichard AD, Kent KM, Satler LR, Wong SC, Hong MD, Kovach JA, Leon MB. Arterial remodeling after coronary angioplasty: a serial intravascular ultrasound study. Circulation 1996; 94:35-43.

Claims

1. El uso de un compuesto de fórmula I

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

donde

R_{4} es hidrógeno, hidroxi; alcoxiC_{1}-C_{4}, alcanoilC_{1}-C_{4-}oxy, alcoxiC_{1}-C_{4}-carbonilo, ariloxi, amino, alquilC_{1}-C_{4}-amino, di-alquilC_{1}-C_{4-}amino, o R'_{2}-N-C(O)-O- donde R' es H, alquiloC_{1}-C_{6}, cicloalquilo o arilo;

R_{5} es hidrógeno, alquiloC_{1}-C_{6}, aril-alquiloC_{1}-C_{4}, cicloalquiloC_{3}-C_{6}, cicloalquilC_{3}-C_{6}-alquiloC_{1}-C_{4}, alquilamino, alcanoíloC_{1}-C_{4}, -C(O)-O-alquiloC_{1}-C_{4} o aroílo, donde el grupo arilo en R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, y R_{5} es fenilo sin sustituir o fenilo que está mono o polisustituido con halógeno, alquiloC_{1}-C_{4}, alcoxiC_{1}-C_{4}, hidroxi, carboxi, COO-alquilo, CONH_{2}, CONH-alquilo, CON(alquilo)_{2}, nitro, trifluorometilo, amino, alquilC_{1}-C_{4}-amino, di-alquilC_{1}-C_{4}-amino o fenilo; m es un número entero entre 0 y 3 y n es 1,

o una de sus sales de adición de ácido farmacológicamente aceptables para la producción de un producto farmacéutico para la inhibición de la proliferación de músculo liso, donde la dosificación del compuesto de fórmula 1 es menos del 70%, preferiblemente menos del 60%, en particular menos del 50% de la dosificación que sería necesaria para controlar el crecimiento celular.

2. El uso de la reivindicación 1, en donde el compuesto es un compuesto de fórmula Ia

4

R_{2} es hidrógeno o alquiloC_{1}-C_{3};

3. El uso de la reivindicación 2, donde los sustituyentes en la fórmula Ia tienen los significados siguientes:

R_{1} es fenilo, tienilo, piridilo, clorofenilo, diclorofenilo, metilfenilo, aminofenilo, bromofenilo, hidroxifenilo o naftilo;

R_{2} es hidrógeno y

R_{5} es metilo.

4. El uso de la reivindicación 1, donde el compuesto es (-)-cis-5,7-dihidroxi-2-(2-clorofenil)-8-[4-(3-hidroxi-metil)-piperidinil] -4H-benzopiran-4-ona (Flavopiridol).

5. El uso según una o más de las reivindicaciones 1-4, donde el producto farmacéutico es para el tratamiento de lesiones vasculares ricas en miocitos lisos.

6. El uso según una o más de las reivindicaciones 1-4, donde el producto farmacéutico es para el tratamiento de lesiones después del daño producido con un globo.

7. El uso según una o más de las reivindicaciones 1-4, donde el producto farmacéutico es para el tratamiento de pacientes después de la implantación de una endoprótesis vascular.