SK286747B6 - Použitie 4H-1-benzopyran-4-ónových derivátov ako inhibítorov proliferácie buniek hladkých svalov - Google Patents
Použitie 4H-1-benzopyran-4-ónových derivátov ako inhibítorov proliferácie buniek hladkých svalov Download PDFInfo
- Publication number
- SK286747B6 SK286747B6 SK1086-2001A SK10862001A SK286747B6 SK 286747 B6 SK286747 B6 SK 286747B6 SK 10862001 A SK10862001 A SK 10862001A SK 286747 B6 SK286747 B6 SK 286747B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- alkyl
- carbon atoms
- group
- radical contains
- flavopiridol
- Prior art date
Links
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 55
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 150000004777 chromones Chemical class 0.000 title abstract description 9
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 title description 8
- BIIVYFLTOXDAOV-YVEFUNNKSA-N alvocidib Chemical compound O[C@@H]1CN(C)CC[C@@H]1C1=C(O)C=C(O)C2=C1OC(C=1C(=CC=CC=1)Cl)=CC2=O BIIVYFLTOXDAOV-YVEFUNNKSA-N 0.000 claims abstract description 106
- 229950010817 alvocidib Drugs 0.000 claims abstract description 105
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims abstract description 30
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims abstract description 27
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims abstract description 27
- 230000003902 lesion Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 231100000216 vascular lesion Toxicity 0.000 claims abstract description 8
- 238000002513 implantation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 92
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 49
- -1 COO-alkyl Chemical group 0.000 claims description 32
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 25
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 22
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 20
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 18
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 17
- 125000004663 dialkyl amino group Chemical group 0.000 claims description 15
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 15
- 125000003282 alkyl amino group Chemical group 0.000 claims description 14
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 claims description 14
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 12
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 claims description 12
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 10
- 150000002367 halogens Chemical group 0.000 claims description 9
- 125000002023 trifluoromethyl group Chemical group FC(F)(F)* 0.000 claims description 9
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 8
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 claims description 7
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 claims description 7
- 125000004076 pyridyl group Chemical group 0.000 claims description 7
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000006297 carbonyl amino group Chemical group [H]N([*:2])C([*:1])=O 0.000 claims description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 6
- 125000001544 thienyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 claims description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 4
- 125000001316 cycloalkyl alkyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 4
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000004182 2-chlorophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(Cl)=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 3
- 125000003386 piperidinyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000004169 (C1-C6) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000004453 alkoxycarbonyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000001691 aryl alkyl amino group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000001769 aryl amino group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000004104 aryloxy group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000004799 bromophenyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000000068 chlorophenyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000004986 diarylamino group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000004188 dichlorophenyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 125000004464 hydroxyphenyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000003944 tolyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000005913 (C3-C6) cycloalkyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 abstract description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 44
- 210000005119 human aortic smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 39
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 38
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 32
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 28
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 17
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 17
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 16
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 15
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 15
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 14
- 102000009339 Proliferating Cell Nuclear Antigen Human genes 0.000 description 13
- 230000008692 neointimal formation Effects 0.000 description 12
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 12
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 9
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 9
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 8
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 8
- 101150018665 MAPK3 gene Proteins 0.000 description 8
- 101150024075 Mapk1 gene Proteins 0.000 description 8
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 208000024248 Vascular System injury Diseases 0.000 description 6
- 208000012339 Vascular injury Diseases 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 6
- 102000003903 Cyclin-dependent kinases Human genes 0.000 description 5
- 108090000266 Cyclin-dependent kinases Proteins 0.000 description 5
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 5
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 5
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 5
- 229940043378 cyclin-dependent kinase inhibitor Drugs 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 5
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 5
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 4
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241001504519 Papio ursinus Species 0.000 description 4
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 4
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 4
- 101150073031 cdk2 gene Proteins 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000006369 cell cycle progression Effects 0.000 description 4
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 4
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 4
- 238000000021 kinase assay Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 4
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 3
- 101000817629 Homo sapiens Dymeclin Proteins 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000002875 cyclin dependent kinase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- NQVIIUBWMBHLOZ-UHFFFAOYSA-N 2-[2-hydroxyethyl-[6-[(4-methoxyphenyl)methylamino]-9-propan-2-ylpurin-2-yl]amino]ethanol Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1CNC1=NC(N(CCO)CCO)=NC2=C1N=CN2C(C)C NQVIIUBWMBHLOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JVJFIQYAHPMBBX-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxynonenal Chemical compound CCCCCC(O)C=CC=O JVJFIQYAHPMBBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091007914 CDKs Proteins 0.000 description 2
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 description 2
- 102000003910 Cyclin D Human genes 0.000 description 2
- 108090000259 Cyclin D Proteins 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010093502 E2F Transcription Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000001388 E2F Transcription Factors Human genes 0.000 description 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108050002653 Retinoblastoma protein Proteins 0.000 description 2
- 229940124639 Selective inhibitor Drugs 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 108010052344 histone H1 kinase Proteins 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 125000006559 (C1-C3) alkylamino group Chemical group 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 206010003162 Arterial injury Diseases 0.000 description 1
- KYNSBQPICQTCGU-UHFFFAOYSA-N Benzopyrane Chemical group C1=CC=C2C=CCOC2=C1 KYNSBQPICQTCGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 125000000882 C2-C6 alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003601 C2-C6 alkynyl group Chemical group 0.000 description 1
- GAWIXWVDTYZWAW-UHFFFAOYSA-N C[CH]O Chemical group C[CH]O GAWIXWVDTYZWAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940123587 Cell cycle inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 102000008130 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010049894 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000006311 Cyclin D1 Human genes 0.000 description 1
- 108010058546 Cyclin D1 Proteins 0.000 description 1
- 102000002431 Cyclin G Human genes 0.000 description 1
- 108090000404 Cyclin G1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 239000001828 Gelatine Substances 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 101000980756 Homo sapiens G1/S-specific cyclin-D1 Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical class Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000012820 MEK1 Inhibitor Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102000044589 Mitogen-Activated Protein Kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108700015928 Mitogen-activated protein kinase 13 Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 208000034827 Neointima Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 1
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 1
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- GAMYVSCDDLXAQW-AOIWZFSPSA-N Thermopsosid Natural products O(C)c1c(O)ccc(C=2Oc3c(c(O)cc(O[C@H]4[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O4)c3)C(=O)C=2)c1 GAMYVSCDDLXAQW-AOIWZFSPSA-N 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 239000010775 animal oil Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 210000003433 aortic smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000006615 aromatic heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004181 carboxyalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000003026 cod liver oil Substances 0.000 description 1
- 235000012716 cod liver oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 125000001995 cyclobutyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001511 cyclopentyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001559 cyclopropyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C1([H])* 0.000 description 1
- 125000004186 cyclopropylmethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C1([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 230000008753 endothelial function Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229930003944 flavone Natural products 0.000 description 1
- 150000002212 flavone derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000011949 flavones Nutrition 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-L fumarate(2-) Chemical class [O-]C(=O)\C=C\C([O-])=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-L 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009422 growth inhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 125000001188 haloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 102000047723 human CCND1 Human genes 0.000 description 1
- 150000003840 hydrochlorides Chemical class 0.000 description 1
- 125000002768 hydroxyalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006951 hyperphosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 125000001972 isopentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000010150 least significant difference test Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000003859 lipid peroxidation Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000395 magnesium oxide Substances 0.000 description 1
- CPLXHLVBOLITMK-UHFFFAOYSA-N magnesium oxide Inorganic materials [Mg]=O CPLXHLVBOLITMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXZKOIWUVFPNLO-UHFFFAOYSA-N magnesium;oxygen(2-) Chemical compound [O-2].[Mg+2] AXZKOIWUVFPNLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002688 maleic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002757 morpholinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000012053 oil suspension Substances 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 150000003891 oxalate salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012660 pharmacological inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000009520 phase I clinical trial Methods 0.000 description 1
- 125000003884 phenylalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000004193 piperazinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000719 pyrrolidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000007781 signaling event Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000013222 sprague-dawley male rat Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000005477 standard model Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 125000000547 substituted alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000002511 suppository base Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003892 tartrate salts Chemical class 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002100 tumorsuppressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003966 vascular damage Effects 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- VHBFFQKBGNRLFZ-UHFFFAOYSA-N vitamin p Natural products O1C2=CC=CC=C2C(=O)C=C1C1=CC=CC=C1 VHBFFQKBGNRLFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
- A61K31/436—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having oxygen as a ring hetero atom, e.g. rapamycin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
- A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
- A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
- A61K31/453—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a six-membered ring with oxygen as a ring hetero atom
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Neurology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
Abstract
Použitie 4H-1-benzopyran-4-ónových derivátov všeobecného vzorca (I), výhodne flavopiridolu, na výrobu liečiva na inhibíciu proliferácie buniek hladkých svalov, ktorá je potrebná najmä pri liečbe vaskulárnych lézií bohatých na bunky hladkých svalov, lézií po poškodení balónikom po bolónikovej angioplastike a pri liečbe pacientov po implantácii stentov.
Description
Vynález sa týka použitia 4H-1 -benzopyran-4-ónových derivátov ako inhibítorov proliferácie buniek hladkých svalov.
Doterajší stav techniky
Bunkové odpovede na vaskuláme poškodenie, medzi ktoré patri bunková disfunkcia, aktivácia, dediferenciácia, proliferácia a migrácia, kulminujú v klinických príhodách, akými sú restenózy, ku ktorým dochádza po balónikovej angioplastike a uložení stentu v rámci liečby humánnych aterosklerotických ochorení. Proliferácia buniek hladkých svalov (SMC - Smooth Muscle Celí) je spoločným a zrejme aj zjednocujúcim znakom modelov vaskulámeho poškodenia a SMC sú hlavnou celulárnou zložkou neointimálnych lézií. Obnovený záujem o inhibíciu proliferácie buniek hladkých svalov sprevádzal častejšie používanie stentov pri liečbe koronárnych ochorení, pretože restenózy spôsobené stentami (restenózy in-stent) sú takmer výlučne závislé od neomtimálnej formácie a hyperplázie (zväčšenie počtu buniek) SMC. Odhaduje sa, že len v roku 1997 vyžadovalo liečenie až 100 000 pacientov s restenózami in-stent. V dôsledku toho by ľahko aplikovateľný účinný inhibitor hyperplázie SMC mohol mať značný klinický a ekonomický dopad.
Pokusy inhibovať proliferáciu SMC v modeloch vaskulámeho poškodenia buď moduláciou bunkových mediátorov proliferačnej odpovede alebo priamou interferenciou s mechanizmom bunkového cyklu poskytli zaujímavé pohľady na neointimálnu formáciu. Progresia bunkového cyklu je prísne kontrolovaným dejom pozitívne regulovaným cyklín-dependentnými kinázami (Cdks) a ich cyklinovými regulačnými podjednotkami a negatívne regulovanými inhibítormi Cdk a nádor-supresívnymi génmi, akými sú retinoblastómový protein (Rb) a p53. Adenovírusovo sprostredkovaná nadmerná expresia endogénnych Cdk inhibítorov ρ21 a p27klp 1 alebo konštitutívne aktívna forma Rb blokujú neointimálnu tvorbu v modeli poškodenia potkanej karotídy; podobne inhibícia aktivity transkripčného faktora E2F kompetitívnou nadmernou expresiou príbuzných DNA väzbových miest tiež inhibuje proliferáciu SMC a neointimálnu tvorbu. Tieto štúdie podporujú všeobecnú hypotézu, že inhibícia bunkového cyklu predstavuje príťažlivý cieľ zásahu do tvorby vaskulárnych lézií.
Aj keď genetické zásahy napomáhali pri rozrušení mechanizmov regulujúcich neointimálnu tvorbu, sú jednako nevýhodné vzhľadom na to, že v súčasnosti nie sú ešte vhodné na klinickú liečbu vaskulámych chorôb u ľudí. Preto by vo vode rozpustná nízkomolekuláma zlúčenina so špecifickým regulačným účinkom na bunkový cyklus, hlavne v prípade orálneho podania, mala širokú aplikovateľnosť, tak experimentálnu ako aj potenciálne klinickú. Nedávno identifikovaný flavón, flavopiridol, je inhibítorom Cdk, ktorý účinne blokuje aktivitu Cdk2, Cdc2 a Cdk4. Na rozdiel od ostatných farmakologických inhibítorov Cdk je flavopiridol pozoruhodný kvôli svojej špecificite vzhľadom na kinázu, jeho prístupnosť pri orálnom podaní a jeho potencia vzhľadom na to, že je účinný pri nanomolámych koncentráciách. Následkom týchto jedinečných charakteristík je priaznivý profil vedľajších účinkov, ktorý viedol k testovaniu flavopiridolu vo fáze I klinických testov v rámci liečby neoplaziem odolávajúcich liečbe.
Podstata vynálezu
Vzhľadom na tieto vlastnosti bola teraz v rámci vynálezu skúmaná schopnosť flavopiridolu inhibovať proliferáciu SMC in vitro a po poškodení potkanej karotídy v dôsledku balónikovej angioplastiky. Preukázalo sa, že flavopiridol je účinným a selektívnym inhibítorom progresie bunkového cyklu a že zastavuje proliferáciu SMC tak in vivo ako aj in vitro; okrem toho orálne dávky flavopiridolu, ktoré sú nižšie ako dávky, o ktorých je známe, že majú na človeka toxický účinok, účinne blokujú neointimálnu tvorbu.
Teraz sa s prekvapením zistilo, že 4/7-1 -benzopyran-4-ónové deriváty sú vhodné ako inhibítory proliferácie SMC. Je známe, že 4//-l-benzopyran-4-ónové deriváty sú vhodné na kontrolu nádorov. Je však prekvapujúce, že 4/7-1-benzopyran-4-ónové deriváty podľa vynálezu pôsobia účinne ako inhibitor proliferácie SMC v hladinách dávok nižších, ako sú hladiny, ktoré musia byť použité na kontrolu nádorového rastu.
V súlade s uvedeným je predmetom vynálezu použitie 4H-l-benzopyran-4-ónových derivátov ako inhibítorov proliferácie buniek hladkých svalov.
Vhodnými 4/7-1-benzopyránmi sú zlúčeniny so všeobecným vzorcom (I)
v ktorom
R1 znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 uhlíkových atómov, arylalkylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 uhlíkových atómov a substituovanú halogénom, hydroxyskupinou alebo karboxyskupinou; cykloalkylovú skupinu obsahujúcu 3 až 6 uhlíkových atómov, pyridylovú skupinu, tienylovú skupinu, alkyl(cykloalkyl)-ovú skupinu, v ktorej cykloalkylový zvyšok obsahuje 3 až 6 uhlíkových atómov a alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy; alkenylovú skupinu obsahujúcu 2 až 6 uhlíkových atómov, alkynylovú skupinu obsahujúcu 2 až 6 uhlíkových atómov, fenylovú skupinu; fenylovú skupinu mono- alebo polysubstituovanú halogénom, alkylovou skupinou obsahujúcou 1 až 4 uhlíkové atómy, alkoxyskupinou obsahujúcou 1 až 4 uhlíkové atómy, hydroxylovou skupinou, karboxylovou skupinou, COO-alkylovou skupinou, skupinou CONH2, CONH-alkylovou skupinou, CON (alkyl)2-ovou skupinou, nitroskupinou, trifluórmetylovou skupinou, aminoskupinou, alkylaminoskupinou, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, dialkylaminoskupinou, v ktorej každý alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy alebo fenylovou skupinou; naftylovú skupinu, karboxylovú skupinu, skupinu -CHO, COO-alkylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, primárnu aminoskupinu, alkylaminoskupinu, aralkylaminoskupinu, dialkylaminoskupinu, amidoskupinu, arylaminoskupinu, diarylaminoskupinu alebo CH2O-alkylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy;
R2 znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 uhlíkových atómov, arylovú skupinu, nitroskupinu, aminoskupinu, dialkylaminoskupinu, v ktorej každý alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, atóm halogénu, hydroxylovú skupinu, alkoxyskupinu, skupinu -COOH, -COO-alkylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, skupinu -CHO, skupinu -CH2OH alebo -CH2O-alkylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy;
R3 znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 4 uhlíkové atómy; alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 4 uhlíkové atómy a substituovanú halogénom, hydroxyskupinou alebo karboxyskupinou; hydroxylovú skupinu, karboxylovú skupinu, nitroskupinu, aminoskupinu, alkylaminoskupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, dialkylaminoskupinu, v ktorej každý alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, atóm halogénu, -O-alkyl-C(O)-alkylovú skupinu, skupinu -CHO, skupinu -CH2OH, -CH2O-alkylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, alebo skupinu R2N-C(O)-O-, v ktorej R znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu obsahujúci 1 až 6 uhlíkových atómov alebo cykloalkylovú skupinu; alebo -O-alkyl-C(O)-alkylovú skupinu, alebo arylovú skupinu;
R4 znamená atóm vodíka, hydroxylovú skupinu, alkoxyskupinu obsahujúcu 1 až 4 uhlíkové atómy, alkanoyloxyskupinu obsahujúcu 1 až 4 uhlíkové atómy, alkoxykarbonylovú skupinu, v ktorej alkoxyzvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, aryloxyskupinu, aminoskupinu, alkylaminoskupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, dialkylaminoskupinu, v ktorej každý alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy alebo skupinu R2'-N-C(O)-O-, v ktorej R' znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 uhlíkových atómov, cykloalkylovú skupinu alebo arylovú skupinu;
R5 znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 uhlíkových atómov, arylalkylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, cykloalkylovú skupinu obsahujúcu 3 až 6 uhlíkových atómov, alkyl(cykloalkyl)-ovú skupinu, v ktorej cykloalkylový zvyšok obsahuje 3 až 6 uhlíkových atómov a alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, alkylaminoskupinu, alkanoylovú skupinu obsahujúcu 1 až 4 uhlíkové atómy, -C(O)-O-alkylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy alebo arylovú skupinu, pričom arylová skupina vo významoch R1, R2, R3, R4 a R5 znamená nesubstituovanú fenylovú skupinu alebo fenylovú skupinu, ktorá je mono- alebo polysubstituovaná halogénom, alkylovou skupinou obsahujúcou 1 až 4 uhlíkové atómy, alkoxyskupinou obsahujúcou 1 až 4 uhlíkové atómy, hydroxylovou skupinou, karboxylovou skupinou, COO-alkylovou skupinou, skupinou CONH2, CONH-alkylovou skupinou, CON(alkyl)2'ovou skupinou, nitroskupinou, trifluórmetylovou skupinou, aminoskupinou, alkylaminoskupinou, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, dialkylaminoskupinou, v ktorej každý alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy alebo fenylovú skupinu;
m znamená celé číslo 0 až 3 a n znamená 1, alebo jej soľ farmakologicky prijateľnej adičnej kyseliny.
Zlúčeniny podľa vynálezu majú dve asymetrické centrá, a to jedno v mieste, kde je heterocyklický kruh obsahujúci dusík kondenzovaný s benzopyránovým zvyškom (C-4'j a druhé v R4-substituovanom uhlíkovom atóme (C-3'), čo znamená, že sú v tomto prípade možné dva páry optických izomérov. Definícia zlúčenín podľa vynálezu zahŕňa všetky možné stereoizoméry a ich zmesi. Táto definícia zahŕňa hlavne racemické formy a izolované optické izoméry majúce špecifikovanú účinnosť. Obidva racemáty môžu byť rozdelené fyzikálnymi metódami, medzi ktoré patrí hlavne frakcionačná kryštalizácia. Jednotlivé optické izoméry môžu byť získané z racemátov konvenčnými postupmi, medzi ktoré napríklad patrí vytvorenie soli s opticky aktívnou kyselinou a následná kryštalizácia.
Príkladmi alkylových skupín, ktoré sú vhodné ako významy pre R1 až R5, sú skupiny s rovným alebo rozvetveným reťazcom, obsahujúce až 6, výhodne až 5 uhlíkových atómov, pričom týmito skupinami sú napríklad metylová skupina, etylová skupina, propylová skupina, izopropylová skupina, ŕerc-butylová skupina, pentylová skupina alebo izopentylová skupina.
Príkladmi substituovaných alkylových skupín, ktoré sú vhodné ako významy pre R1 až R’, sú halogénalkylová skupina, ako napríklad trifluórmetylová skupina, hydroxyalkylová skupina, ako napríklad hydroxyetylová skupina alebo karboxyalkylová, ako napríklad karboxyetylová skupina.
Vhodnými príkladmi cykloalkylovej skupiny, ktorá obsahuje 3 až 6 uhlíkových atómov, ako význam pre R1 až R5 sú cyklopropylová skupina, cyklobutylová skupina, cyklopentylová skupina alebo cyklohexylová skupina. Cyklopropylmetylová skupina je príkladom cykloalkylalkylovej skupiny.
Príkladom aralkylovej skupiny, ktorá je vhodná ako význam pre R1 až R5, je fenylalkylová skupina, v ktorej je fenylová skupina nesubstituované alebo monosubstituovaná, alebo polysubstituovaná substituentmi, ako sú halogén, alkylová skupina obsahujúca 1 až 4 uhlíkové atómy, alkoxyskupina obsahujúca 1 až 4 uhlíkové atómy alebo nitroskupina; alebo trifluórmetylovou skupinou, aminoskupinou a substituovanou aminoskupinou.
Príkladom arylovej skupiny, ktorá je vhodná ako význam pre R1 až R5, je fenylová skupina, ktorá je nesubstituovaná alebo monosubstituovaná, alebo polysubstituovaná substituentmi, ako sú halogén, alkylová skupina obsahujúca 1 až 4 uhlíkové atómy, alkoxyskupina obsahujúca 1 až 4 uhlíkové atómy, hydroxylová skupina, karboxylová skupina, COO-alkylová skupina, skupina CONH2, CONH-alkylová skupina, CON(alkyl)2 skupina, nitroskupina alebo trifluórmetylová skupina, aminoskupina, alkylaminoskupina, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, dialkylaminoskupina, v ktorej každý alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, aromatické heterocyklické skupiny, ako napríklad pyridilová skupina a polycyklické aromatické skupiny, ako napríklad naftylová skupina.
Vhodným príkladom alkylaminoskupiny vo významoch R1 až R5 je skupina (CH2)n-NR6R7, v ktorej n znamená 1 až 3 a R6 a R7 znamenajú alkylovú skupinu a majú uvedený význam v prípade, keď R1 až R5 znamenajú alkylovú skupinu; navyše R6 a R7 môžu tvoriť spoločne s atómom dusíka, ku ktorému sú viazané, heterocyklickú skupinu obsahujúcu jeden alebo viac heteroatómov. Vhodnými príkladmi heterocyklických skupín, ktoré sú tvorené z R6 a R7 spoločne s atómom dusíka, ku ktorému sú viazané, sú piperidinylová skupina, pyrolidinylová skupina, morfolinylová skupina, piperazinylová skupina alebo imidazolylová skupina, pričom všetky tieto skupiny môžu byť nesubstituované alebo substituované v jednej alebo niekoľkých polohách alkylovou skupinou obsahujúcou 1 až 4 uhlíkové atómy, alkoxyskupinou obsahujúcou 1 až 4 uhlíkové atómy alebo arylovou skupinou, alebo hydroxylovou skupinou, alebo aminoskupinou.
Vhodnými príkladmi solí zlúčenín podľa vynálezu s anorganickými alebo organickými kyselinami sú hydrochloridy, hydrobromidy, sulfáty, fosfáty, acetáty, oxaláty, tartráty, citráty, maleáty alebo íumaráty.
Výhodnými zlúčeninami v rámci vynálezu sú zlúčeniny so všeobecným vzorcom (la),
v ktorom
R1 znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 3 uhlíkové atómy, naftylovú skupinu, fenylovú skupinu; fenylovú skupinu mono- alebo polysubstituovanú halogénom, alkylovou skupinou obsahujúcou 1 až 4 uhlíkové atómy, alkoxyskupinou obsahujúcou 1 až 4 uhlíkové atómy, hydroxylovou skupinou, karboxylovou skupinou, COO-alkylovou skupinou, skupinou CONH2, CONH-alkylovou skupinou, CON(alkyl)2-ovou skupinou, nitroskupinou, trifluórmetylovou skupinou, aminoskupinou, alkylaminoskupinou, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, dialkylaminoskupinou, v ktorej každý alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy alebo fenylovou skupinou; pyridylovú skupinu alebo tienylovú skupinu;
R2 znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 3 uhlíkové atómy a
R5 znamená alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 3 uhlíkové atómy, cykloalkylovú skupinu obsahujúcu 3 až 5 uhlíkových atómov alebo alkyl(cykloalkyl)-ovú skupinu, v ktorej cykloalkylový zvyšok obsahuje 3 až 5 uhlíkových atómov a alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy.
Obzvlášť výhodnými zlúčeninami sú zlúčeniny so všeobecným vzorcom (la), v ktorom
R1 znamená fenylovú skupinu, tienylovú skupinu, pyridylovú skupinu, chlórfenylovú skupinu, dichlórfenylovú skupinu, metylfenylovú skupinu, aminofenylovú skupinu, brómfenylovú skupinu, hydroxyfenylovú skupinu alebo naftylovú skupinu;
R2 znamená atóm vodíka a
R5 znamená metylovú skupinu.
Obzvlášť dôležitou zlúčeninou je (-)-czs-5,7-dihydroxy-2-(2-chlórfenyl)-8-[4-(3-hydroxy-l-metyl)-piperidinyl]-4//-benzopyran-4-ón (flavopiridol), hlavne vo forme hydrochloridu.
Zlúčeniny, ktoré sa používajú podľa vynálezu, môžu byť pripravené postupmi opísanými v patentových dokumentoch US 4 900 727 a 5 284 856. Konkrétne postupy príprav týchto zlúčenín sú uvedené v príkladových častiach týchto patentových dokumentov.
Zlúčeniny používané podľa vynálezu inhibujú proliferáciu buniek hladkých svalov. Ďalšími predmetmi vynálezu sú preto farmaceutické prípravky na inhibíciu proliferácie buniek hladkých svalov, ktorých podstata spočíva v tom, že obsahujú aspoň jednu už definovanú zlúčeninu so všeobecným vzorcom (I) alebo aspoň jednu z jej solí farmakologicky prijateľnej adičnej kyseliny a použitie už definovanej zlúčeniny so všeobecným vzorcom (I) na prípravu farmaceutického prípravku, krorý má inhibičný účinok na proliferáciu buniek hladkých svalov. Typickými oblasťami aplikácie zlúčenín podľa vynálezu sú choroby/poruchy/poškodenia, ktoré sú sprevádzané vaskulárnymi léziami buniek hladkých svalov. Veľmi dôležitým príkladom uvedených stavov sú lézie, ku ktorým dochádza po poškodeniach spôsobených balónikovou angioplastikou. Ďalšou oblasťou aplikácie je prevencia restenózy po implantácii stentov.
4H-l-Bcnzopyran-4-ónovc deriváty sa používajú podľa vynálezu všeobecne zvyčajným spôsobom, ktorý je odborníkom v danom odbore známy. Vo farmaceutických prípravkoch sa používa účinné množstvo uvedenej účinnej látky buď samotnej, alebo výhodne v kombinácii s vhodnými farmaceutickými pomocnými látkami vo forme tabliet, potiahnutých tabliet, kapsúl, čapíkov, emulzii, suspenzií alebo roztokov, pričom obsah účinnej zlúčeniny predstavuje v uvedených galenických formách až 95 %, výhodne 10 až 75 %.
Odborníkovi v danej oblasti je vzhľadom na jeho profesionálne vedomosti zrejmé, ktoré pomocné látky sú vhodné na požadované formulovanie farmaceutického prípravku. Popri pomocných látkach pre tablety alebo rozpúšťadlách, gélotvomých látkach a bázach pre čapíky a ostatných pomocných látkach pre účinnú látku je možné použiť napríklad antioxidačné činidlá, dispergačné činidlá, emulgačné činidlá, odpeňovače, látky korigujúce vôňu a chuť, konzervačné činidlá, solubilizačné činidlá alebo farbiace prísady.
Uvedená účinná látka môže byť podávaná orálne, parenterálne, intravenózne alebo rektálne, pričom výhodným spôsobom je orálne podanie. S cieľom vytvoriť prípravok s orálnym podaním môže byť účinná látka zmiešaná s ostatnými prísadami, ktoré sú vhodné na tento účel a ktorými sú napríklad pomocné látky, stabilizátory alebo inertné riedidlá, pričom na vyhotovenie takto získaných zmesi do vhodnej aplikačnej formy môžu byť použité zvyčajné postupy, pričom týmito aplikačnými formami sú hlavne tablety, potiahnuté tablety, tvrdé želatínové kapsuly a vodné alkoholové alebo olejové suspenzie alebo roztoky. Príkladmi použiteľných inertných pomocných látok sú arabská guma, oxid horečnatý, laktóza, glukóza alebo škrob, hlavne kukuričný škrob. V tomto kontexte môže byť formulácia pripravená ako suché granuly alebo vlhké granuly. Príkladmi vhodných olejovitých pomocných látok alebo rozpúšťadiel sú rastlinné alebo živočíšne oleje, akými sú napríklad slnečnicový olej alebo olej z treščej pečene.
Na subkutánne alebo intravenózne podanie sa tvorí roztok, suspenzia alebo emulzia účinnej látky s použitím pomocných látok, ktoré sa na daný účel konvenčné používajú a ktorými sú solubilizačné činidlá, emulgačné činidlá alebo ďalšie pomocné látky. Príkladmi vhodných rozpúšťadiel sú voda, fyziologický roztok chloridu sodného alebo alkoholy, napríklad etanol, propanol alebo glycerol, ale tiež roztoky cukrov, akými sú napríklad roztoky glukózy alebo manitolu, alebo zmesi rôznych už zmienených rozpúšťadiel.
Dávka 4H-l-benzopyran-4-ónových derivátov, ktorá je určená na denné podávanie, bude zvolená tak, aby zodpovedala požadovanému účinku. 4//-l-Benzopyran-4-ónové deriváty môžu byť podávané v dávke, ktorá je nižšia ako 70 %, výhodne nižšia ako 60 %, predovšetkým nižšia ako 50 % dávky, ktorá sa používa na kontrolu nádorového rastu u daného cicavca. Príkladom by bola v rámci modelu cudzorodého štepu pri myšiach kmeňa „nude“ dávka asi 5 mg/kg telesnej hmotnosti podaná orálne jedenkrát denne. Táto dávka je polovicou dávky, ktorá inhibuje nádorový rast pri tom istom živočíšnom modeli (Drees a kol., Clin. Cancer Res. 1997, 3:273 -279).
Farmakokinetické vlastnosti 4//-l-benzopyran-4-ónových derivátov by mohli viesť k nevyhnutnosti podávať uvedenú zlúčeninu niekoľkokrát denne alebo použiť formuláciu s postupným uvoľňovaním účinnej látky.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Na pripojených výkresoch:
Obr. 1 znázorňuje účinok flavopiridolu na syntézu HASMC DNA. 1A: HASMC zastavené v raste boli ošetrené v neprítomnosti (-) alebo prítomnosti (+) bFGF (10 ng/ml) a pri ukázaných koncentráciách flavopiridolu (nmol/1) počas 24 hodín. Inkorporácia BrdU ako meradlo proliferácie bola určená stanovením na báze ELISA metódy a vyjadrená ako percentuálny podiel inkorporácie bez ošetrenia bFGF. *p < 0,05, v porovnaní s neošetrenými bunkami, tp < 0,05, v porovnaní s ošetrením s bFGF v neprítomnosti flavopiridolu. 1B: HASMC boli ošetrené s bFGF (10 ng/ml), trombínom (2U/ml) alebo vehikulom v prítomnosti alebo neprítomnosti flavopiridolu (75 nmoVl) a merala sa inkorporácia BrdU. *p < 0,05, v porovnaní s neošetrenými bunkami. **p < 0,05, v porovnaní s ošetrením len s bFGF. tp < 0,05, v porovnaní s ošetrením len s trombínom.
Obr. 2 znázorňuje účinok flavopiridolu na proliferáciu HASMC. Zastavené v raste HASMC boli ošetrené len s bFGF (10 ng/ml) (A), bFGF a flavopiridolom (75 nmol/1) (·) alebo vehikulom () počas indikovaných dôb a po ošetrení boli stanovené množstvá buniek. Výsledky sú vyjadrené ako počet buniek na jamku (x 103).
Obr. 3 znázorňuje účinok flavopiridolu na aktivitu cyklindependentnej kinázy v HASMC. HASMC zastavené v raste boli ošetrené s bFGF (10 ng/1), trombínom (2 U/ml) alebo vehikulom v prítomnosti alebo neprítomnosti flavopiridolu (75 nmol/1), pričom bola kvantifikovaná fosforylácia histónu Hl ako meradlo aktivity Cdk a vyjadrená ako percentuálna aktivita Cdk bez ošetrenia s bFGF. *p < 0,05, v porovnaní s neošetrenými bunkami. **p < 0,05, v porovnaní s ošetrením len s bFGF. tp < 0,05, v porovnaní s ošetrením len s trombínom.
Obr. 4 znázorňuje reguláciu proteínov vzťahujúcich sa na bunkový cyklus flavopiridolom. HASMC zastavené v raste boli ošetrené v prítomnosti (+) alebo v neprítomnosti (-) bFGF (10 ng/ml), trombínu (10 ng/ml) a/alebo flavopiridolu (75 nmol/1) počas 24 hodín. Uskutočnil sa imunobloting bunkových lyzátov použitím špecifických protilátok pre cyklín Dl (horný rad), PCNA (stredný rad), fosforylovaný (pRb) a hyperfos forylovaný (ppRb) Rb (spodný rad).
Obr. 5 znázorňuje účinky flavopiridolu na aktivitu MAP kinázy v HASMC. Zastavené v raste HASMC boli ošetrené v prítomnosti (+) alebo v neprítomnosti (-) bFGF (10 ng/ml), trombínu (2U/ml), PD98059 (30 (pmol/l) a/alebo flavopiridolu (75 nmol/1). Hladiny fosforylovaného Erkl (pErkl) a Erk2 (pErk2) boli merané imunoblotingom s fosforylačne špecifickou protilátkou rozpoznávajúcou obidva proteiny (horný rad). Aktivita MAP kinázy bola meraná kinázovým stanovením v géli použitím myelinového bazálneho proteínu ako substrátu (spodný rad).
Obr. 6 znázorňuje životnosť HASMC po liečbe flavopiridolom. Zastavené v raste HASMC boli ošetrené flavopiridolom (75 nmol/1), TNF-a (50 ng/ml) alebo vehikulom počas uvedených dôb. Bunková životnosť bola vyhodnotená použitím farbenia trypánovou modrou. Získané výsledky sú vyjadrené ako percentuálny podiel živých buniek vzhľadom na celkový počet buniek.
Obr. 7 znázorňuje inhibíciu neointimálnej tvorby v potkanej karotíde po poškodení, spôsobenom balónikovou angioplastikou, flavopiridolom. Neointimálne/mediálne pomery boli merané v histologických rezoch alebo potkaních karotídach neošetrených alebo ošetrených flavopiridolom (5 mg/kg) počas 5 dní po poškodení. Artérie boli skúmané 7 (n = 12) a 14 (n = 12) dní po poškodení. Podobne je uvedený percentuálny podiel PCNA-pozitívnych jadier (±SEM, vyjadrené ako percentuálny podiel počítaných jadier) v neointimách artérií pre každý časový úsek a ošetrovanú skupinu. *p < 0,05, v porovnaní s ošetrením s vehikulom.
Obr. 8 znázorňuje histologické rezy potkaních karotíd. Rezy sú získané 7 dní (obr. 8A a 8B) a 14 dní (obr. 8C a 8D) po poškodení. Artérie zobrazené na obr. 8A a 8C boli získané z potkanov ošetrených flavopiridolom (5 mg/kg) podávaným v potrave; artérie na obr. 8B a 8D boli získané z potkanov ošetrovaných len vehikulom. Rezy sú na obrázkoch zväčšené 100-krát.
Obr. 9 znázorňuje expresiu Cdk2 po poškodení potkaních karotíd balónikovou angioplastikou. Rezy artérií sú získané 7 dní (obr. 9A a 9B) a 14 dní (obr. 9C a 9D) po poškodení. Artérie zobrazené na obr. 9A a obr. 90 boli získané z potkanov ošetrených flavopiridolom (5 mg/kg) podávaným v potrave, zatiaľ čo artérie zobrazené na obr. 9B a obr. 9D boli získané z potkanov, ktoré boli ošetrené len samotným vehikulom. Cdk2-pozitivne jadrá, nachádzajúce sa hlavne v neointime, sa zafarbia farbivom „Vector blue” s použitím alkalickofosfatázovej metódy. Rezy sú na obrázkoch zväčšené 1 OO-krát.
V nasledujúcej časti opisu bude vynález bližšie objasnený pomocou konkrétnych príkladov jeho uskutočnenia, pričom tieto príklady majú len ilustračný charakter a nijakým spôsobom neobmedzujú vlastný rozsah vynálezu, ktorý je jednoznačne vymedzený definíciou patentových nárokov a obsahom opisnej časti.
Príklady uskutočnenia vynálezu
1. Flavopiridol inhibuje proliferáciu buniek hladkých svalov a neointimálnu tvorbu in vivo v rámci modelu vaskulámeho poškodenia potkanej karotídy.
Štandardný model poškodenia potkanej karotídy, pri ktorom je tvorba neointimálnej lézie po poškodení indukovanom katétrom kriticky závislá od proliferácie SMC (Clowes a kol., Lab. Invest. 1983, 49: 327 - 333, Clowes a kol., Circ. Res. 1985, 56: 139 - 145) na štúdium, či flavopiridol spôsobuje zastavenie rastu SMC in vivo rovnako, ako je toho schopný in vitro.
Flavopiridol bol podávaný orálne v dávke 5 mg/kg jedenkrát denne, pričom sa s jeho podávaním začalo dňa, v ktorom došlo k poškodeniu, a pokračuje počas štyroch nasledujúcich dní, pretože táto časová etapa pokrýva prvotnú indukciu Cdk2 a prvú vlnu proliferácie SMC v tomto modeli (Circ. Res. 1995, 77: 445 - 465, Circ. Res. 1997, 80: 418 - 426). Stredné intimálne a mediálne oblasti boli kvantifikované 7 až 14 dní po uvedenom poškodení a rozsah neointimálnej lézie bol vyjadrený ako pomer neointimálnej oblasti k mediálnej oblasti. V každej ošetrenej a neošetrenej skupine bolo dvanásť zvierat. Uvedený pomer bol v siedmom dni 1,00+/-0,05 v artériách potkanov ošetrených vehikulom, zatiaľ čo v artériách potkanov ošetrených flavopiridolom tento pomer predstavoval 0,65+/-0,04, čo predstavuje zníženie rovnajúce sa 35 %. V štrnástom dni bol pomer neointimálnej/mediálnej oblasti 1,08+/-0,04 v artériách potkanov ošetrených vehikulom, zatiaľ čo rovnaký pomer predstavoval 0,66+/-0,03 v artériách potkanov ošetrených flavopiridolom, čo predstavuje zníženie o 38,9 %. Tieto účinky boli štatisticky významné pri oboch časových údajoch (P < 0,05).
Metódy
Materiály: Flavopiridol (L86 - 8275, (-)-cri-5,7-dihydroxy-2-(2-chlórfenyl)-8-[4-(3-hydroxy-l-metyl)piperidinyl]-4ŕ/-benzopyran-4-ón) bol poskytnutý spoločnosťou Hoechst Marion Russel, lnc. a bol rozpustený v dimetylsulfoxide ako zásobný roztok s koncentráciou 50 mmol/1 na experimenty s bunkovými kultúrami alebo vo vode na experimenty in vivo. Bazálny fibroblastový rastový faktor (bFGF) je komerčne dostupný od spoločnosti Collaborative Biochemical a trombin je komerčne dostupný od spoločnosti Sigma. MEK1 inhibítor PD98059 sa získal od spoločnosti New England Biolabs.
Bunkové kultúry: Bunky hladkého svalu ľudskej aorty (HASMC - Human Aortic Smooth Muscle Cells) sa získali od spoločnosti Clonetics a kultivovali spôsobom opísaným v Ruef J. a kol., Induction of vascular endothelial growth in ballon-injured baboon arteries, Circ. Res. 1997, 81: 24 - 33. Bunky boli použité pri pasážach 5-9. Ešte pred uskutočnením experimentov bol rast buniek zastavený pri 80 % konfluencii počas 48 hodín s použitím média obsahujúceho 0,2 % fetálneho bovínneho séra.
Meranie bunkovej proliferácie ELISA metódou: Bunková proliferácia sa merala ELISA metódou (Amersham Life Science). HASMC boli kultivované v 96-jamkových platničkách potiahnutých želatínou a prevedené do stavu zastaveného rastu. Tieto bunky boli potom ošetrené s 10 mg/ml bFGF, 2 U/ml trombinu alebo vehikulom počas 24 hodím. Flavopiridol (75 nmol/1) bol podaný 1 hodinu pred ošetrením s rastovým faktorom. 5-Bróm-2'-deoxyuridin (BrdU) bol pridaný na dosiahnutie výslednej koncentrácie 10 pmol/l v priebehu posledných dvoch hodín ošetrenia. Inkorporácia BrdU bola meraná spôsobom opísaným v Ruef J. a kol., Induction of rat aortic smooth muscle celí growth by the lipid peroxidation product 4-hydroxy-2-nonenal, Circulaticn 1998, 97: 1071 - 1078. Získané výsledky sú vyjadrené ako stredná hodnota +/-SEM pre 12 vzoriek pri dvoch nezávislých experimentoch.
Počítanie buniek: Bunky HASMC zastavené v raste, narastené do 50 % konfluencie na 6-jamkových platničkách boli ošetrené alebo neošetrené s flavopiridolom (75 nmol/1) alebo bFGF (10 ng/ml). V intervaloch po ošetreniach boli bunky vystavené pôsobeniu trypsínu a počet buniek bol stanovený použitím hemocytometru.
Analýza Westem blot: Bunky HASMC zastavené v raste boli ošetrené alebo neošetrené rastovými faktormi a/alebo flavopiridolom, ako už bolo uvedené. Analýza Westem blot bola uskutočnená spôsobom opísaným v Ruef J. a kol., Induction of vascular endothelial growth in ballon-injured baboon arteries, Circ. Res. 1997, 81: 24 - 33. Primárnymi protilátkami boli: polyklonálna protilátka proti humánnemu cyklínu Dl (M-20, Šanta Cruz), monoklonálna protilátka proti humánnemu jadrovému antigénu proliferácie buniek (PCNA) komerčne dostupná od spoločnosti Sigma pod označením PC 10, monoklonálna fosforylačne špecifická protilátka proti p44/42 (Erkl/Erk2) MA P kináze (New England Biolabs) a monoklonálna protilátka anti-Rb (G3-245, Pharmigen), ktoré sú špecifické pre fosforylované (pRb) a vysoko fosforylované (ppRb) druhy Rb. Pri imunoblotingových štúdiách sa experimenty opakovali aspoň trikrát.
Aktivita Cdk: Zastavené v raste bunky HASMC boli ošetrené s agonistami a inhibítormi počas 24 hodín, pričom celkové bunkové lyzáty sa pripravili spôsobom uvedeným v súvislosti s analýzou Westem bloting. Kinázové stanovenia sa uskutočnili použitím súpravy Histone II| kinase assay kit (Upstate Biotechnology) podľa inštrukcií výrobcu. Stručne špecifikované: 10 μΐ peptidových inhibítorov proteinkinázy C (2 pmol/l) a proteinkinázy A (2 pmol/l), 100 pg bunkového lyzátu, 10 μΐ testového pufra a 10 μΐ zmesi obsahujúcej 75 pmol/l chloridu horečnatého, 500 pmol/l ATP a 1 pCi/ml [γ-32Ρ]ΑΤΡ sa zmieša v mikrocentrifugačnej skúmavke. Po inkubácii pri teplote 30 °C počas 10 minút sa odpipetujú alikvóty na fosfocelulózové papiere. Tieto papiere sa premyjú v 0,75 % kyseline fosforečnej a následne sa zmerajú rozpady za minútu v scintilačnom počítači (Beckman). Získané výsledky sú vyjadrené ako stredná hodnota +/-SEM pre tri vzorky a reprezentujú výsledky troch nezávislých meraní.
Kinázové stanovenie v géli: Zastavené v raste bunky HASMC boli ošetrené rastovým faktorom počas 30 minút a následne sa pripravili celkové bunkové lyzáty spôsobom, ktorý už bol opísaný v súvislosti s analýzou Westem bloting. V niektorých experimentoch boli bunky HASMC predbežne spracované počas 60 minút s 30 μιηοΐ/ΐ PD98059, flavopiridolom alebo vehikulom.
Rovnaké množstvá proteínov (50 pg/dráha) boli rozdelené v polyakrylamidovom géli, ktorý bol kopolymerizovaný s 350 pg/ml myelínového bazálneho proteínu. Tento gél bol potom ošetrený s [γ-32Ρ]ΑΤΡ a podrobený autorádiografii spôsobom opísaným v Ruef J. a kol., Induction of rat aortic smooth muscle celí growth by the lipid peroxidation product 4-hydroxy-2-nonenal, Circulation 1998, 97: 1071 - 1078.
Farbenie trypánovou modrou: Bunky HASMC boli kultivované v 5 cm Petriho miskách pri nízkej konfluencii a zastavenom raste podľa už opísaného spôsobu. Tieto bunky boli potom ošetrené s flavopiridolom (75 nmol/1) alebo faktorom nádorovej nekrózy-a (TNF-a, 50 ng/ml) v priebehu uvedených časov. Po odstránení média sa do Petriho misiek pridala 0,4 % trypánová modrá vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom. Po 5 minútach sa bunky v Petriho miskách spočítali pod mikroskopom. Modré bunky sa rátali ako bunky neživé.
Model poškodenia potkanej karotídy: Poškodenie potkanej karotídy bolo v podstate uskutočnené spôsobom opísaným v Clowes A. W. a kol., Kinetics of cellular proliferation after arterial injury, Lab. Invest. 1983, 49: 327 - 333. Dospelé potkanie samčeky kmeňa Sprague-Dawley (telesná hmotnosť 400 až 500 g, Zivic-Miller) boli anestetizované intraperitoneálnou injekciou ketaminu (2 mg/kg) a xylazínu (4 mg/kg). Ľavá vnútorná karotida bola potom kanylovaná embolektomickým katétrom 2F. Balónik bol nafúknutý fyziologickým roztokom a ťahaný trikrát cez artériu s cieľom vytvoriť rozšírené a obnažené poškodenia. Pravá karotida sa nepoškodí a slúži ako kontrolný subjekt pre každé zviera. Bezprostredne, ako sa zvieratá preberú z anestézie a ďalej ešte počas štyroch nasledujúcich dní bol potkanom v potrave podávaný flavopiridol (5 mg/kg vo vode) alebo len voda ako slepý pokus. Všetky potkany zákrok prežili a neprejavovali žiadnu známku otravy po podaní účinnej látky pri použitých dávkach. V špecifikovaných časových intervaloch po poškodení karotídy boli potkany anestetizované uvedeným spôsobom a podrobené systémovej fixácii pomocou perfúzie s 4 % paraformaldehydom vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom. Pravá aj ľavá karotida bola vybratá a roztiahnutá injekciou 4 % paraformaldehydu cez priesvit artérie a následne bola dehydratovaná a uchovávaná v 70 % etanole pri teplote 4 °C.
Imunohistochémia bola vyhotovená spôsobom opísaným v Ruef J. a kol., Induction of vascular endothelial growth in ballon-injured baboon arteries, Circ. Res. 1997, 81: 24 - 33 použitím monoklonálnej protilátky PCNA a polyklonálnej protilátky proti humánnej Cdk2 (M2-G, Šanta Cruz).
Obrazová analýza: Okrajové distálne a proximálne oblasti každej artérie boli odstránené (približne 500 pm). Z každej artérie bolo analyzovaných desať intermediámych prierezov (každý 8 pm) odobratých 500 pm od seba. Rezy boli fixované a zafarbené hematoxylínom a eozínom spôsobom opísaným v Ruef J. a koľ, Induction of vascular endothelial growth in ballon-injured baboon arteries, Circ. Res. 1997, 81: 24 - 33. Použitím mikroskopu Nikon Diaphot 300 a 4-násobného objektívu bol každý prierez artériou zaznamenaný ako digitálny obraz pomocou videokamery Hamamatsu C5985 a TCPro 2.41 (Coreco, Inc.). Mediálne a neointimálne oblasti boli stanovené použitím softvéru NIH Image. Hranice mediálnych a neointimálnych oblastí boli stanovené jedným prehliadačom (A. M) a overené slepou skúškou pomocou druhého prehliadača (C. P.). Veľkosť lézie bola vyjadrená ako neointimálny/mediálny pomer. Výsledky v každej skupine boli vyjadrené ako stredná hodnota +/-SEM. 92 % alebo ešte viac obrazov každej skupiny bolo interpretovateľných; zvyšné obrazy boli poznamenané artefaktmi spôsobenými fixáciou a neboli analyzované.
Štatistická analýza: V prípadoch, keď to bolo vhodné, boli údaje z kvantitatívnych štúdií vyjadrené ako stredná hodnota +/-SEM. Pri viacnásobne ošetrených skupinách bol použitý faktoriálny ANOVA test a následný Fisherov test najmenšej významnej diferencie. Štatistický význam bol akceptovaný pri p < 0,05.
Výsledky
Flavopiridol mhibuje proliferáciu buniek HASMC: Na základe schopnosti flavopiridolu inhibovať proliferáciu rôznych nádorových bunkových línií bola testovaná hypotéza spočívajúca v tom, že flavopiridol by mohol blokovať rast primárnej kultúry ľudských SMC. Bunky HASMC zastavené v raste boli ošetrené pou žitím SMC mitogénu bFGF (10 ng/ml) počas 24 hodín v prítomnosti zvyšujúcich sa koncentrácií flavopiridolu a proltferácia bola meraná stanovením na báze ELISA metódy. V porovnaní s neošetrenými bunkami bola proliferácia buniek ošetrených s bFGF zvýšená 5,4-krát (obr. 1A). Predbežné jednohodinové ošetrenie s použitím len 50 nmol/1 flavopiridolu významne znížilo proliferáciu buniek HASMC (na 3,9-krát, p < 0,05), pričom takmer maximálny účinok bol dosiahnutý pri koncentrácii 75 nmol/1. Rovnaké výsledky boli získané použitím inkorporácie tymidínu, ktorá predstavuje nezávislé meranie syntézy DNA (nezobrazené).
S cieľom testovať všeobecnosť účinkov flavopiridolu na proliferáciu SMC bol skúmaný jeho účinok na mitogenézu indukovanú trombínom (2 U/ml), ktorý pôsobí cez receptor spojený s G proteínom, na rozdiel od bFGF, ktorý stimuluje člena rodiny receptorov tyrozinkinázy. Flavopiridol (75 nmol/1) významne a účinne inhibuje tak proliferáciu buniek HASMC indukovanú s bFGF, ako aj proliferáciu indukovanú s trombínom (5,4-krát versus 1,8-krát resp. 2,4-krát versus 0,7-krát, p < 0,05, obr. 1B). Uskutočnilo sa počítanie buniek s cieľom potvrdiť, že účinok flavopiridolu na priebeh bunkového cyklu v bunkách HASMC skutočne odráža zmeny v proliferácii. bFGF (10 ng/ml) indukoval trojnásobné zvýšenie počtu buniek po troch dňoch ošetrenia (obr. 2). Súhlasne s výsledkami získanými pri stanovení na báze ELISA metódy flavopiridol (75 nmoVl) účinne blokoval proliferáciu indukovanú s bFGF.
Flavopiridol inhibuje aktivitu Cdk a expresiu génov súvisiacich s bunkovým cyklom v bunkách HASMC: S cieľom vyhodnotiť špecifický účinok flavopiridolu na mechanizmus bunkového cyklu bola meraná kinázová aktivita histónu Hl v bunkových lyzátoch z buniek HASMC stimulovaných rastovým faktorom. Fosfory lácia histónu Hl je indikátorom aktivít Cdc2 a Cdk2. V dôsledku ošetrenia buniek HASMC faktorom bFGF a trombínom nastalo 4,4-násobné, resp. 3,6-násobné zvýšenie histón Hl kinázovej aktivity (obr. 3). Tieto zvýšenia aktivity cyklín-dependentnej kinázy boli úplne blokované predbežným ošetrením s flavopiridolom (75 nmol/1).
Použitím analýzy Westem blotingu sa takisto skúmalo, či flavopiridol ovplyvňuje rastovým faktorom indukovanú reguláciu proteínov súvisiacich s bunkovým cyklom v bunkách HASMC. Cyklín Dj je cyklín G, fázy, ktorý je pozitívne regulovaný stimuláciou rastovým faktorom a rýchle odbúravaný v priebehu vystúpenia z bunkového cyklu. Hladiny proteínu cyklínu D1 boli regulované smerom nahor 6,3-krát, resp. 2,2-krát ako odpoveď na ošetrenie s bFGF a s trombínom počas 24 hodín (obr. 4), čo je účinok, ktorý by mohol byť úplne blokovaný predbežným spracovaním s flavopiridolom. Podobne zvýšená expresia PCNA, ktorý je prevažne syntetizovaný v priebehu fázy S bunkového cyklu súbežne s replikáciou DNA, bola tiež blokovaná predbežným ošetrením flavopiridolom. Ako konečný aspekt proteínov súvisiacich s bunkovým cyklom bola skúmaná fosforylácia Rb ako odpoveď na expresiu rastového faktora použitím protilátky špecifickej pre fosforylovaný Rb. Rb je regulátorom bunkového cyklu, ktorý sa viaže na transkripčný faktor E2F a inaktivuje ho, keď je Rb v nefosforylovanom stave a indukuje zastavenie rastu SMC in vivo. Fosforylácia inaktivuje Rb a umožňuje priebeh fázy S bunkového cyklu. Analýza fosforylácie Rb je obzvlášť relevantná vzhľadom na to, že Rb je cieľom Cdk2 a Cdki in vivo.
Tak trombín ako aj bFGF indukovali hyperfosforyláciu Rb, čo je účinok, ktorý bol inhibovaný flavopiridolom. Spoločne tieto výsledky ukazujú, že flavopiridol ovplyvňuje expresiu a aktivitu prvkov regulácie bunkového cyklu G1 a S fázy v bunkách HASMC v súvislosti s jeho inhibičnými účinkami na rast.
Flavopiridol nemá účinok na fosforyláciu alebo aktivitu MAP kinázy: S cieľom uistiť sa, že flavopiridol pôsobil špecificky na úrovni bunkového cyklu a nie nešpecifický na hornú časť kinázovej kaskády, bola meraná fosforylácia a aktivita Erkl (p44 MAP kináza) a Erk2 (p42 MAP kináza), čo sú dvaja členovia rodiny MAP kináz. Na uvedené meranie boli vybraté kinázy vzhľadom na to, že sa nachádzajú bezprostredne pred transkripčnými dejmi, ku ktorým dochádza v odpovedi na rastové stimuly a bezprostredne za radom kritických mitogénnych signálnych ciest. Nedotknutá odpoveď MAP kinázou ukazuje, že sú nedotknuté tiež predchádzajúce mitogénne cesty. Meraný bol fosforylačný stav Erkl a Erk2 použitím monoklonálnej protilátky, ktorá špecificky rozpoznáva fosforylované, a teda aktivované formy. Ako kontrolný subjekt pri týchto experimentoch bol použitý PD98059, čo je účinný a selektívny inhibítor aktivácie MAP kinázy. Po ošetrení buniek HASMC s trombínom a s bFGF počas 30 minút bolo v porovnaní s neošetrenými bunkami detegované zvýšené množstvo fosforylovaných Erkl a Erk2 (obr. 5, horný rad). Fosforylácia Erkl a Erk2 tak trombínom ako aj faktorom bFGF bola blokovaná predbežným ošetrením použitím PD98059, ale nie flavopiridolu. S cieľom potvrdiť tieto zistenia bola meraná aktivita Erkl a Erk2 kinázovým stanovením v géli (obr. 5, spodný rad). Znovu sa zistilo, že aktivity Erkl a Erk2 boli zvýšené ako odpoveď na trombín a bFGF, čo je účinok, ktorý bol inhibovateľný produktom PD98059, ale nie flavopiridolom. Tieto experimenty spoločne s experimentmi, ktorých výsledky sú zobrazené na obr. 3 a 4, poskytujú dôkaz toho, že účinky flavopiridolu na proliferáciu buniek HASMC sú spôsobené špecifickým zastavením mechanizmu bunkového cyklu blokovaním aktivity Cdk, bez toho, že by pri tom boli ovplyvnené predchádzajúce signálne deje.
Flavopiridol neznižuje životnosť buniek HASMC: Skoršie štúdie, týkajúce sa aktivity flavopiridolu v ostatných typoch buniek, ukázali, že v závislosti od bunkovej línie môže flavopiridol buď indukovať zastavenie rastu bez ovplyvnenia životnosti buniek, alebo môže spôsobiť apoptózu. Bolo preto zisťované, či flavopiridol znižuje životnosť buniek HASMC farbením vzoriek bunkovej kultúry trypánovou modrou v rôz nych časových intervaloch po liečbe. Zastavené v raste HASMC boli ošetrené s flavopiridolom (75 nmol/1), vehikulom alebo TNF-a (50 ng/ml), čo je cytokín, o ktorom je známe, že indukuje apoptózu pri tomto type buniek. Zatiaľ čo TNF-α účinne znížil životnosť buniek HASMC, čoho dôsledkom bola smrť v podstate všetkých buniek po 24 hodinách, flavopiridol nemal taký účinok (obr. 6). Zistilo sa, že použitím vyšších koncentrácií a dlhších inkubačných dôb môže dôjsť k určitému zníženiu životnosti buniek v prítomnosti flavopiridolu (nie je zobrazené). Ale v podmienkach testu flavopiridol predovšetkým indukuje zastavenie rastu buniek bez ovplyvnenia životnosti SMC.
Flavopiridol inhibuje proliferáciu buniek hladkých svalov a neointimálnu tvorbu in vivo v modeli vaskulámeho poškodenia potkanej karotídy: Použitý bol zavedený model poškodenia potkanej karotidy, v ktorom je tvorba neointimálnej lézie po poškodení indukovanom katétrom kriticky závislá od proliferácie SMC s cieľom skúmať, či flavopiridol indukuje zastavenie rastu SMC in vivo, ako je toho schopný in vitro. Flavopiridol bol podávaný v dávke 5 mg/kg jedenkrát denne, pričom sa s podaním začalo v dni poškodenia a v podávaní sa pokračovalo ešte počas štyroch nasledujúcich dní, pretože tento časový interval pokrýva v tomto modeli prvotnú indukciu Cdk2 a prvú vlnu proliferácie SMC. Kvantifikovali sa stredné intimálne a mediálne oblasti 7 a 14 dní po poškodení, pričom rozsah neointimálnej lézie sa vyjadril ako pomer neointimálnej oblasti k mediálnej oblasti.
V každej ošetrenej a neošetrenej skupine bolo dvanásť zvierat. Neointimálny/mediálny pomer v siedmom dni bol 1,00 ±0,05 v artériách potkanov ošetrovaných vehikulom a 0,6510,04 v artériách ošetrovaných flavopiridolom, čo predstavuje zníženie rovnajúce sa 35,0 % (obr. 7). V štrnástom dni bol neointimálny/ mediálny pomer 1,0810,04 pri potkanoch ošetrených vehikulom a 0,6610,03 pri potkanoch ošetrených flavopiridolom, čo predstavuje zníženie rovnajúce sa 38,9 %. Tieto výsledky boli štatisticky významné v oboch uvedených časových údajoch (p < 0,05). Reprezentatívne arteriálne rezy sú zobrazené na obr. 8.
S cieľom priamo ukázať, že flavopiridol inhibuje proliferáciu buniek hladkých svalov, boli rezy pre expresiu PCNA v reprezentatívnych oblastiach z každej artérie vyfarbené a stanovil sa percentuálny podiel PCNA-pozitívnych jadier v neointime. V siedmom dni bolo 31,1 ±7,2 % jadier v poškodených artériách neošetrených potkanov PCNA-pozitívnych, zatiaľ čo len 11,8 ±1,5 % poškodených artérií potkanov ošetrených flavopiridolom bolo PCNA-pozitívnych (obr. 7; p < 0,05). V štrnástom dni boli PCNA-pozitívne jadrá prítomné v 10,4 ±2,0 % neointimálnych buniek z ošetrených poškodených potkaních artérií, ale len v 4,2 ±0,5 % neointimálnych buniek z neošetrených potkaních artérií (p < 0,05). (PCNA-pozitívne jadrá boli zriedka pozorované v nepoškodených artériách, a to bez ohľadu na typ ošetrenia). Podobne boli Cdk2-pozitívne bunky oveľa menej bežné v neointime potkanov ošetrených flavopiridolom (obr. 9, rad A a C), a to v porovnaní s artériami neošetrených potkanov (rad B a D) tak 7 dní ako aj 14 dní po poškodení.
Diskusia
V uvedených štúdiách bolo skúmané, či nový Cdk inhibítor, ktorým je flavopiridol predstavujúci najúčinnejší a špecifický inhibítor Cdk, je vhodným kandidátom na inhibíciu proliferácie SMC in vivo, obzvlášť sprevádzajúci vaskuláme poškodenia. Na tieto štúdie poskytli racionálny základ predchádzajúce pokusy zasiahnuť terapeuticky do mechanizmu bunkového cyklu s cieľom liečby vaskulámych ochorení; jednako metódy použité na tento cieľ spočívali v technológii prenosu génov použité na inhibíciu priebehu bunkového cyklu. V súčasnosti klinickému použitiu týchto techník však bránia zatiaľ neprekonateľné prekážky. V priebehu štúdií súvisiacich s touto prihláškou vynálezu bolo publikované, že CVT-313, čo je nedávno identifikovaná zlúčenina, ktorá má tiež Cdk inhibičné vlastnosti, ale pri mikromolárnych koncentráciách môže tiež inhibovať neointimálnu tvorbu; bolo však nevyhnutné, aby CVT-313 bola zavedená do karotídy v dobe, počas ktorej dochádza k poškodeniu, aby sa dosiahol požadovaný účinok. Na rozdiel od toho bolo v rámci tejto prihlášky vynálezu dokázané, že flavopiridol v prípade, že je podaný orálne, môže účinne inhibovať neointimálnu tvorbu a to v miere, ktorá je porovnateľná s mierou účinku ostatných relevantných klinických činidiel. Táto orálna účinnosť flavopiridolu je medzi činidlami, o ktorých je známe, že sú účinné vo zvieracích modeloch vaskulárneho poškodenia, výnimočná. Selektivita, účinnosť a ľahkosť podania robí z flavopiridolu vynikajúceho kandidáta na skúmanie terapeutických výhod inhibície bunkového cyklu in vivo pri humánnych vaskulámych léziách.
Určilo sa podávať flavopiridol orálne v koncentrácii (5 mg/kg), ktorá sa rovná polovičnej koncentrácii, ktorá inhibuje nádorový rast pri modeli „nude myší s cudzorodým štepom. Je pozoruhodné, že koncentrácie flavopiridolu 75 nmol/1 majú za následok takmer úplnú inhibíciu proliferácie SMC, pričom stredné koncentrácie v krvnom sére rovnajúce sa 425 nmol/1 boli dosiahnuté pri dávkach, ktoré ležia pod prahom toxicity vo fáze I štúdií týkajúcich sa liečby ťažko liečiteľných ľudských karcinómov. Výsledky získané v rámci tejto prihlášky vedú k záveru, že pri potlačení vaskulámych ochorení, medzi ktoré patria restenózy, môžu byť účinné oveľa nižšie dávky inhibítorov bunkového cyklu, ako sú dávky použité v rámci neoplázie a so sprievodným úžitkom v podobe zvýšenej tolerability.
Aj keby sa podarilo dokázať, že flavopiridol indukuje zastavenie bunkového rastu bez ovplyvnenia životnosti buniek HASMC v bunkovej kultúre a že dochádza k zníženiu neointimálnej tvroby po liečbe flavopiri dolom, nepodarilo sa dosiahnuť istoty v tom, že zastavenie bunkového cyklu je jediným faktorom obmedzujúcim neointimálnu tvorbu pri léziách karotídy. Flavopiridol môže indukovať zastavenie bunkového rastu so súčasným indukovaním alebo bez súčasného indukovania apoptózy, a to v závislosti od pozorovaného typu buniek. Je zaujímavé, že flavopiridol inhibuje apoptózu v bunkách PC12, ktoré boli terminálne diferencované a tiež indukuje apoptózu v nediferencovaných bunkách PC12, ktoré sú proliferujúce. Aj keď experimenty in vitro uskutočnené v rámci tejto prihlášky vynálezu boli uskutočnené v podmienkach, ktoré by napodobňovali fenotyp SMC pred poškodením, je možné, že SMC môžu mať odlišnú odpoveď na flavopiridol po poškodení a že v nich môže dokonca dôjsť k apoptóze. Zatiaľ čo úloha apoptózy pri vaskulámych léziách je nejasná, expresia Ugandu Fas v SMC indukuje apoptózu a blokuje neointimálnu tvorbu pri králikoch po poškodení spôsobenom balónikovou angioplastikou, čo vedie k záveru, že ak flavopiridol skutočne indukuje apoptózu SMC in vivo, ako je to v proliferujúcich bunkách PC12, potom môže ísť o užitočný jav v kontexte neointimálnej tvorby. Aj ostatné mechanizmy môžu rovnako prispievať k účinkom flavopiridolu na tvorbu lézií. Tak napríklad inhibícia bunkového cyklu sprostredkovaná „antisense“ oligodeoxynukleotidom zlepšuje endotelovú funkciu pri králičom žilom štepe. S cieľom objasniť účinky flavopiridolu na SMC in vivo, odlišných ako zastavenie rastu buniek, bude ešte nevyhnutné realizovať ďalšie doplňujúce štúdie.
Vzhľadom na demonštrovanú úlohu proliferácie SMC pri tvorbe lézií po poškodení potkanej karotídy je zaujímavé uviesť, že napriek výrazným účinkom flavopiridolu in vitro bola jeho schopnosť inhibovať neointimálnu tvorbu (hoci významná) skromnejšia v podmienkach experimentov in vivo. Uvažovalo sa o niekoľkých vysvetleniach tohto pozorovania. Je nepravdepodobné, že by urýchlená proliferácia SMS nastávala po ukončení podávania flavopiridolu, pretože rozdiely v proliferačných indexoch sú trvalé v priebehu 14 dní po poškodení (obr. 7 a obr. 9). Prijateľnejším je vysvetlenie, že buď aj ďalšie zložky tvorby lézie, akými sú SMC migrácia a produkcia extracelulámej medzibunkovej hmoty (matrix), tiež prispievajú k tvorbe lézie a to dokonca aj v neprítomnosti významnej proliferácie SMC, alebo že dodanie flavopiridolu jedenkrát denne je nedostatočné na úplné zastavenie proliferácie v uvedenom modeli. Nedávno zistené údaje ukazujúce, že biologický polčas flavopiridolu predstavuje len 2,5 hodiny, vedú k záveru, že pravdepodobne bude správnejšia skôr druhá z uvedených hypotéz. Uskutočnením ďalších štúdií bude možné zistiť pravdepodobne ešte účinnejší dávkový režim.
Získané výsledky ukazujú, že flavopiridol je schopný inhibovať proliferáciu SMC a teda aj neointimálnu tvorbu vo všeobecne uznávaných malých zvieracích modeloch vaskulámeho ochorenia. Je potrebné zdôrazniť, že relevancia inhibície proliferácie SMC je diskutabilná pri ľudských vaskulámych léziách a môže sa líšiť v závislosti od charakteru lézie a od času, pri ktorom sa uskutočňuje pozorovanie proliferácie. Proliferačný index SMC pri humánnych aterektomických vzorkách je pozoruhodne nízky, aj keď tieto vzorky nemusia odrážať proliferačné zmeny v skorších a kritickejších štádiách rozvoja lézií. Okrem toho arteriálny remodeling nezávislý od neointimálneho rastu môže byť zodpovedný za významnú mieru luminálnej obštrukcie po angioplastike u ľudí. Na rozdiel od toho, indexy mitotickej aktivity v SMC sú oveľa vyššie (25 % PCNA-pozitívnych subjektov) v aterektomických vzorkách ľudských lézií s restenózou indukovanou zavedením stentov, čo je konzistentné s prijatou úlohou SMC hyperplázie, ale nie remodelingu. Vzhľadom na to, že dochádza k rastúcemu počtu aplikácií stentov a teda aj k rastúcemu počtu klinických problémov súvisiacich s restenózami po zavedení stentov, existuje potreba mať k dispozícii účinný prostriedok na zastavenie SMC hyperplázie a neointimálnej tvorby. Pretože flavopiridol je účinná, orálne biodostupná účinná látka so špecifickou Cdk-inhibičnou účinnosťou a pretože sú známe bezpečné dávky flavopiridolu pre ľudských pacientov, môže byť flavopiridol považovaný za farmakologického kandidáta na prevenciu restenóz u ľudí spojených so zavedením stentov.
Metódy a výsledky
Pri použití kultivovaných ľudských buniek hladkého svalu aorty sa zistilo, že flavopiridol v koncentrácii len 75 nmol/1 má za následok takmer úplnú inhibíciu proliferácie indukovanú bazálnym fibroblastovým rastovým faktorom a trombínom. Pri uvedenej dávke flavopiridol inhiboval aktivitu cyklín-dependentnej kinázy, čo bolo potvrdené meraním fosforylácie histónu Hl, ale nemal vplyv' na aktiváciu MAP kinázy. Flavopiridolom bola rovnako blokovaná indukcia proteínu cyklín D, súvisiaceho s bunkovým cyklom, jadrového antigénu proliferujúcich buniek a fosforylovaného retinoblastómového proteínu. Flavopiridol nemal žiadny účinok na životnosť buniek. S cieľom testovať, či flavopiridol má podobnú účinnosť in vivo v prípade, že je podávaný orálne, bola skúmaná neointimálna tvorba v potkaních karotídach po poškodení balónikovou angioplastikou. Flavopiridol (5 mg/kg) podávaný v potrave redukoval neointimálnu oblasť o 35 % a 39 % 7 resp. 14 dní po poškodení.
Závery
Flavopiridol inhibuje SMC rast in vitro a in vivo. Jeho orálna biodostupnosť a selektivita pre cyklín-dependentnej kinázy z neho robí potenciálny terapeutický nástroj pri liečbe SMC vaskulámych léziách.
Claims (9)
1. Použitie zlúčeniny všeobecného vzorca (I) v ktorom
R1 znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 uhlíkových atómov, arylalkylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 uhlíkových atómov a substituovanú halogénom, hydroxyskupinou alebo karboxyskupinou; cykloalkylovú skupinu obsahúcu 3 až 6 uhlíkových atómov, pyridylovú skupinu, tienylovú skupinu, cykloalkylalkylovú skupinu, v ktorej cykloalkylový zvyšok obsahuje 3 až 6 uhlíkových atómov a alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, alkenylovú skupinu obsahujúcu 2 až 6 uhlíkových atómov, alkinylovú skupinu obsahujúcu 2 až 6 uhlíkových atómov, fenylovú skupinu; fenylovú skupinu mono- alebo polysubstituovanú halogénom, alkylovou skupinou obsahujúcou 1 až 4 uhlíkové atómy, alkoxyskupinou obsahujúcou 1 až 4 uhlíkové atómy, hydroxylovou skupinou, karboxylovou skupinou, COO-alkylovou skupinou, skupinou CONH2, CONH-alkylovou skupinou, skupinou CON(alkyl)2, nitroskupinou, trifluórmetylovou skupinou, aminoskupinou, alkylaminoskupinou, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, dialkylaminoskupinou, v ktorej každý alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy alebo fenylovou skupinou; naftylovú skupinu, karboxylovú skupinu, skupinu -CHO, COO-alkylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, primárnu aminoskupinu, alkylaminoskupinu, aralkylaminoskupinu, dialkylaminoskupinu, amidoskupinu, arylaminoskupinu, diarylaminoskupinu alebo CH2O-alkylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy;
R2 znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 uhlíkových atómov, arylovú skupinu, nitroskupinu, aminoskupinu, dialkylaminoskupinu, v ktorej každý alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, atóm halogénu, hydroxylovú skupinu, alkoxyskupinu, skupinu -COOH, -COO-alkylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, skupinu -CHO, skupinu -CH2OH alebo -CH2O-alkylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy;
R3 znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 4 uhlíkové atómy; alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 4 uhlíkové atómy a substituovanú halogénom, hydroxyskupinou alebo karboxyskupinou; hydroxylovú skupinu, karboxylovú skupinu, nitroskupinu, aminoskupinu, alkylaminoskupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, dialkylaminoskupinu, v ktorej každý alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, atóm halogénu, -O-alkyl-C(O)-alkylovú skupinu, skupinu -CHO, skupinu -CH2OH, -CH2O-alkylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, alebo skupinu R2N-C(O)-O-, v ktorej R znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 uhlíkových atómov, cykloalkylovú skupinu; alebo -O-alkyl-C(O)- alkylovú skupinu alebo arylovú skupinu;
R4 znamená atóm vodíka, hydroxylovú skupinu, alkoxyskupinu obsahujúcu 1 až 4 uhlíkové atómy, alkanoyloxyskupinu obsahujúcu 1 až 4 uhlíkové atómy, alkoxykarbonylovú skupinu, v ktorej alkoxyzvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, aryloxyskupinu, aminoskupinu, alkylaminoskupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, dialkylaminoskupinu, v ktorej každý alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy alebo skupinu R2'-N-C(O)-O-, v ktorej R' znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 uhlíkových atómov, cykloalkylovú skupinu alebo arylovú skupinu;
R5 znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 6 uhlíkových atómov, arylalkylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, cykloalkylovú skupinu obsahujúcu 3 až 6 uhlíkových atómov, cykloalkylalkylovú skupinu, v ktorej cykloalkylový zvyšok obsahuje 3 až 6 uhlíkových atómov a alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, alkylaminoskupinu, alkanoylovú skupinu obsahujúcu 1 až 4 uhlíkové atómy, -C(O)-O-alkylovú skupinu, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy alebo arylovú skupinu, pričom arylová skupina vo významoch R1, R2, R3, R4 a R5 znamená nesubstituovanú fenylovú skupinu alebo fenylovú skupinu, ktorá je mono- alebo polysubstituovaná halogénom, alkylovou skupinou obsahujúcou 1 až 4 uhlíkové atómy, alkoxyskupinou obsahujúcou 1 až 4 uhlíkové atómy, hydroxylovou skupinou, karboxylovou skupinou, COO-alkylovou skupinou, skupinou CONH2, CONH-alkylovou skupinou, skupinou CON(alkyl)2, nitroskupinou, trifluórmetylovou skupinou, aminoskupinou, alkylamino skupinou, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, dialkylaminoskupinou, v ktorej každý alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy alebo fenylovou skupinou;
m znamená celé číslo 0 až 3 a n znamená 1, alebo jej farmakologicky prijateľných adičných solí s kyselinou na výrobu liečiva na inhibíciu proliferácie buniek hladkých svalov, pričom dávka zlúčeniny vzorca (I) je menej ako 70 % dávky, ktorá by bola nutná na kontrolu rastu tumoru, pričom uvedená hodnota sa vzťahuje na hmotnostné, objemové alebo moláme percentá.
2. Použitie podľa nároku 1, kde dávka zlúčeniny vzorca (I) je menej ako 60 % dávky, ktorá by bola nutná na kontrolu rastu tumoru, pričom uvedená hodnota sa vzťahuje na hmotnostné, objemové alebo moláme percentá.
3. Použitie podľa nároku 1 alebo 2, kde dávka zlúčeniny vzorca (I) je menej ako 50 % dávky, ktorá by bola nutná na kontrolu rastu tumoru, pričom uvedená hodnota sa vzťahuje na hmotnostné, objemové alebo moláme percentá.
4. Použitie podľa niektorého z nárokov 1 až 3, kde zlúčeninou so všeobecným vzorcom (I) je zlúčenina so
v ktorom
R1 znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 3 uhlíkové atómy, naftylovú skupinu, fenylovú skupinu; fenylovú skupinu mono- alebo polysubstituovanú halogénom, alkylovou skupinou obsahujúcou 1 až 4 uhlíkové atómy, alkoxyskupinou obsahujúcou 1 až 4 uhlíkové atómy, hydroxylovou skupinou, karboxylovou skupinou, COO-alkylovou skupinou, skupinou CONH2, CONH-alkylovou skupinou, skupinou CON(alkyl)2, nitroskupinou, trifluórmetylovou skupinou, aminoskupinou, alkylaminoskupinou, v ktorej alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy, dialkylaminoskupinou, v ktorej každý alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy alebo fenylovou skupinou; pyridylovú skupinu alebo tienylovú skupinu;
R2 znamená atóm vodíka, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 3 uhlíkové atómy a
R5 znamená alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 3 uhlíkové atómy, cykloalkylovú skupinu obsahujúcu 3 až 5 uhlíkových atómov alebo cykloalkylalkylovú skupinu, v ktorej cykloalkylový zvyšok obsahuje 3 až 5 uhlíkových atómov a alkylový zvyšok obsahuje 1 až 4 uhlíkové atómy.
5. Použitie podľa nároku 4, kde všeobecné symboly všeobecného vzorca (la) majú nasledujúce významy: R1 znamená fenylovú skupinu, tienylovú skupinu, pyridylovú skupinu, chlórfenylovú skupinu, dichlórfenylovú skupinu, metylfenylovú skupinu, aminofenylovú skupinu, brómfenylovú skupinu, hydroxyfenylovú skupinu alebo naftylovú skupinu,
R2 znamená atóm vodíka a R5 znamená metylovú skupinu.
6. Použitie podľa niektorého z nárokov 1 až 3, kde zlúčeninou všeobecného vzorca (I) je flavopiridol, ktorý je (-)-crí-5,7-dihydroxy-2-(2-chlórfenyl)-8-[4-(3-hydroxy-l-metyl)piperidinyl]-4/7-benzopyran-4-ón.
7. Použitie podľa niektorého z nárokov 1 až 6, kde farmaceutický prípravok je na liečbu vaskulámych lézií bohatých na bunky hladkých svalov.
8. Použitie podľa niektorého z nárokov 1 až 6, kde farmaceutický prípravok je na liečbu lézií po poškodení balónikom.
9. Použitie podľa niektorého z nárokov 1 až 6, kde farmaceutický prípravok je na liečbu pacientov po implantácii stentov.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US24338099A | 1999-02-01 | 1999-02-01 | |
| US09/468,665 US6399633B1 (en) | 1999-02-01 | 1999-12-21 | Use of 4-H-1-benzopryan-4-one derivatives as inhibitors of smooth muscle cell proliferation |
| PCT/US2000/001104 WO2000044362A2 (en) | 1999-02-01 | 2000-01-18 | The use of 4-h-1-benzopyran-4-one derivatives as inhibitors of smooth muscle cell proliferation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK10862001A3 SK10862001A3 (sk) | 2002-07-02 |
| SK286747B6 true SK286747B6 (sk) | 2009-04-06 |
Family
ID=22918541
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1086-2001A SK286747B6 (sk) | 1999-02-01 | 2000-01-18 | Použitie 4H-1-benzopyran-4-ónových derivátov ako inhibítorov proliferácie buniek hladkých svalov |
Country Status (38)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6399633B1 (sk) |
| EP (1) | EP1150746B1 (sk) |
| JP (1) | JP4755759B2 (sk) |
| KR (1) | KR100793047B1 (sk) |
| CN (1) | CN1219556C (sk) |
| AP (1) | AP1469A (sk) |
| AR (1) | AR042569A1 (sk) |
| AT (1) | ATE275428T1 (sk) |
| AU (1) | AU777368B2 (sk) |
| BG (1) | BG65151B1 (sk) |
| BR (1) | BR0007911A (sk) |
| CA (1) | CA2360668C (sk) |
| CR (1) | CR6448A (sk) |
| CZ (1) | CZ300395B6 (sk) |
| DE (1) | DE60013555T2 (sk) |
| DK (1) | DK1150746T3 (sk) |
| EA (1) | EA004786B1 (sk) |
| EE (1) | EE04851B1 (sk) |
| ES (1) | ES2226792T3 (sk) |
| HK (1) | HK1042445B (sk) |
| HR (1) | HRP20010521A2 (sk) |
| HU (1) | HU229263B1 (sk) |
| ID (1) | ID30180A (sk) |
| IL (1) | IL144668A (sk) |
| ME (1) | MEP10508A (sk) |
| NO (1) | NO330512B1 (sk) |
| NZ (1) | NZ512822A (sk) |
| OA (1) | OA11755A (sk) |
| PL (1) | PL197693B1 (sk) |
| PT (1) | PT1150746E (sk) |
| RS (1) | RS50242B (sk) |
| SI (1) | SI1150746T1 (sk) |
| SK (1) | SK286747B6 (sk) |
| TR (1) | TR200102223T2 (sk) |
| TW (1) | TWI273907B (sk) |
| UA (1) | UA73110C2 (sk) |
| WO (1) | WO2000044362A2 (sk) |
| ZA (1) | ZA200105596B (sk) |
Families Citing this family (58)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0102480D0 (en) * | 2001-01-31 | 2001-03-14 | Cyclacel Ltd | Marker |
| PL211300B1 (pl) * | 2002-04-17 | 2012-05-31 | Cytokinetics Inc | Związek i kompozycja zawierająca ten związek |
| US7132100B2 (en) | 2002-06-14 | 2006-11-07 | Medimmune, Inc. | Stabilized liquid anti-RSV antibody formulations |
| US7425618B2 (en) | 2002-06-14 | 2008-09-16 | Medimmune, Inc. | Stabilized anti-respiratory syncytial virus (RSV) antibody formulations |
| US20040106647A1 (en) * | 2002-06-28 | 2004-06-03 | Schneider Michael D. | Modulators of Cdk9 as a therapeutic target in cardiac hypertrophy |
| US20040082613A1 (en) * | 2002-06-28 | 2004-04-29 | Schneider Michael D. | Modulators of Cdk9 as a therapeutic target in cardiac hypertrophy |
| EP1539234A4 (en) * | 2002-09-05 | 2006-02-15 | Medimmune Inc | METHODS OF PREVENTING OR TREATING CELLULAR MALIGNITES BY ADMINISTERING CD2 ANTAGONISTS |
| US8034831B2 (en) | 2002-11-06 | 2011-10-11 | Celgene Corporation | Methods for the treatment and management of myeloproliferative diseases using 4-(amino)-2-(2,6-Dioxo(3-piperidyl)-isoindoline-1,3-dione in combination with other therapies |
| US7563810B2 (en) | 2002-11-06 | 2009-07-21 | Celgene Corporation | Methods of using 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydroisoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione for the treatment and management of myeloproliferative diseases |
| EP2316487B1 (en) | 2003-04-11 | 2014-06-11 | MedImmune, LLC | Recombinant IL-9 antibodies & uses thereof |
| JP4934426B2 (ja) | 2003-08-18 | 2012-05-16 | メディミューン，エルエルシー | 抗体のヒト化 |
| US20060228350A1 (en) * | 2003-08-18 | 2006-10-12 | Medimmune, Inc. | Framework-shuffling of antibodies |
| EP2422811A2 (en) | 2004-10-27 | 2012-02-29 | MedImmune, LLC | Modulation of antibody specificity by tailoring the affinity to cognate antigens |
| JP5153613B2 (ja) | 2005-03-18 | 2013-02-27 | メディミューン，エルエルシー | 抗体のフレームワーク・シャッフル |
| KR20080025174A (ko) | 2005-06-23 | 2008-03-19 | 메디뮨 인코포레이티드 | 응집 및 단편화 프로파일이 최적화된 항체 제제 |
| WO2007010342A1 (en) * | 2005-07-15 | 2007-01-25 | Sahajanand Biotech Private Limited | Implantable medical devices comprising a flavonoid or derivative thereof for prevention of restenosis |
| JP2008255008A (ja) * | 2005-07-19 | 2008-10-23 | Tokyo Medical & Dental Univ | 滑膜細胞増殖抑制剤 |
| NZ566180A (en) * | 2005-07-29 | 2011-04-29 | Resverlogix Corp | Pharmaceutical compositions for the prevention and treatment of complex diseases and their delivery by insertable medical devices |
| JP5209625B2 (ja) | 2006-08-28 | 2013-06-12 | 協和発酵キリン株式会社 | アンタゴニストのヒトｌｉｇｈｔ特異的ヒトモノクローナル抗体 |
| PL2118074T3 (pl) | 2007-02-01 | 2014-06-30 | Resverlogix Corp | Związki chemiczne do celów profilaktyki i leczenia chorób układu sercowo-naczyniowego |
| AU2008232902B2 (en) | 2007-03-30 | 2013-10-03 | Medlmmune, Llc | Antibody formulation |
| ES2532402T3 (es) | 2008-06-26 | 2015-03-26 | Resverlogix Corporation | Métodos de preparación de derivados de quinazolinona |
| ES2542835T3 (es) | 2009-01-08 | 2015-08-12 | Resverlogix Corporation | Compuestos para la prevención y el tratamiento de enfermedades cardiovasculares |
| EP2408454A2 (en) | 2009-03-18 | 2012-01-25 | Resverlogix Corp. | Novel anti-inflammatory agents |
| JP5813626B2 (ja) | 2009-04-22 | 2015-11-17 | レスバーロジックス コーポレイション | 新規抗炎症剤 |
| US20130225530A1 (en) | 2010-07-12 | 2013-08-29 | Dkfz Deutsches Krebsforschungszentrum | Wogonin for the prevention and therapy of cardiac hypertrophy |
| DK2668210T3 (da) | 2011-01-26 | 2020-08-24 | Celldex Therapeutics Inc | Anti-kit antistoffer og anvendelser deraf |
| KR102011641B1 (ko) | 2011-11-01 | 2019-08-19 | 리스버로직스 코퍼레이션 | 치환된 퀴나졸리논을 위한 경구 즉시 방출 제형 |
| CN116574185A (zh) | 2012-07-25 | 2023-08-11 | 塞尔德克斯医疗公司 | 抗kit抗体及其用途 |
| CA2887129A1 (en) | 2012-10-09 | 2014-04-17 | Igenica, Inc. | Anti-c16orf54 antibodies and methods of use thereof |
| WO2014080290A2 (en) | 2012-11-21 | 2014-05-30 | Rvx Therapeutics Inc. | Cyclic amines as bromodomain inhibitors |
| US9765039B2 (en) | 2012-11-21 | 2017-09-19 | Zenith Epigenetics Ltd. | Biaryl derivatives as bromodomain inhibitors |
| MX2015007921A (es) | 2012-12-21 | 2016-03-03 | Zenith Epigenetics Corp | Compuestos heterociclicos novedosos como inhibidores de bromodominio. |
| SG11201509982UA (sk) | 2013-06-06 | 2016-04-28 | Igenica Biotherapeutics Inc | |
| DK3041507T3 (da) | 2013-08-26 | 2021-07-26 | Biontech Res And Development Inc | Nukleinsyrer, der koder for humane antistoffer mod sialyl-lewis a |
| GB201403775D0 (en) | 2014-03-04 | 2014-04-16 | Kymab Ltd | Antibodies, uses & methods |
| KR102614642B1 (ko) | 2014-06-04 | 2023-12-19 | 바이오엔테크 리서치 앤드 디벨롭먼트 인코포레이티드 | 강글리오사이드 ｇｄ２에 대한 사람 단클론 항체 |
| PT3333191T (pt) | 2014-12-11 | 2020-12-15 | Pf Medicament | Anticorpos anti-c10orf54 e suas utilizações |
| BR112017015880A2 (pt) | 2015-03-03 | 2018-07-31 | Kymab Ltd | anticorpos, usos e métodos |
| JO3789B1 (ar) | 2015-03-13 | 2021-01-31 | Resverlogix Corp | التراكيب والوسائل العلاجية المعتمدة لمعالجة الامراض المتعلقة بالمتممة |
| RU2717829C2 (ru) | 2015-04-20 | 2020-03-26 | Толеро Фармасьютикалз, Инк. | Прогнозирование ответа на альвоцидиб с помощью анализа профиля митохондрий |
| TR201911032T4 (tr) | 2015-05-18 | 2019-08-21 | Tolero Pharmaceuticals Inc | Artırılmış biyoyararlanıma sahip alvocıdıb ön ilaçları. |
| JP7083497B2 (ja) | 2015-08-03 | 2022-06-13 | スミトモ ファーマ オンコロジー， インコーポレイテッド | がんの処置のための併用療法 |
| EP3909983A1 (en) | 2015-12-02 | 2021-11-17 | STCube & Co. Inc. | Antibodies and molecules that immunospecifically bind to btn1a1 and the therapeutic uses thereof |
| KR20180100122A (ko) | 2015-12-02 | 2018-09-07 | 주식회사 에스티사이언스 | 당화된 btla(b- 및 t-림프구 약화인자)에 특이적인 항체 |
| CN109803684B (zh) | 2016-08-23 | 2022-08-23 | 卫材 R&D 管理有限公司 | 用于治疗肝细胞癌的组合疗法 |
| EP3534947A1 (en) | 2016-11-03 | 2019-09-11 | Kymab Limited | Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods |
| US11279694B2 (en) | 2016-11-18 | 2022-03-22 | Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. | Alvocidib prodrugs and their use as protein kinase inhibitors |
| EP4218820A3 (en) | 2017-03-16 | 2023-09-20 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Combination therapies for the treatment of breast cancer |
| CN111051346A (zh) | 2017-05-31 | 2020-04-21 | 斯特库伯株式会社 | 使用免疫特异性结合btn1a1的抗体和分子治疗癌症的方法 |
| KR20200015602A (ko) | 2017-05-31 | 2020-02-12 | 주식회사 에스티큐브앤컴퍼니 | Btn1a1에 면역특이적으로 결합하는 항체 및 분자 및 이의 치료적 용도 |
| EP3635007A1 (en) | 2017-06-06 | 2020-04-15 | STCube & Co., Inc. | Methods of treating cancer using antibodies and molecules that bind to btn1a1 or btn1a1-ligands |
| WO2019055579A1 (en) | 2017-09-12 | 2019-03-21 | Tolero Pharmaceuticals, Inc. | TREATMENT REGIME FOR CANCERS THAT ARE INSENSITIVE TO BCL-2 INHIBITORS USING THE MCL-1 ALVOCIDIB INHIBITOR |
| US11707522B2 (en) | 2017-10-13 | 2023-07-25 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Human antibodies to Tn antigen |
| EP3824287A1 (en) | 2018-07-20 | 2021-05-26 | Pierre Fabre Médicament | Receptor for vista |
| KR20210099066A (ko) | 2018-12-04 | 2021-08-11 | 스미토모 다이니폰 파마 온콜로지, 인크. | 암의 치료를 위한 작용제로서 사용하기 위한 cdk9 억제제 및 그의 다형체 |
| US11793802B2 (en) | 2019-03-20 | 2023-10-24 | Sumitomo Pharma Oncology, Inc. | Treatment of acute myeloid leukemia (AML) with venetoclax failure |
| CN113559244B (zh) * | 2021-08-02 | 2023-12-26 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | Ctrp13脂肪因子的新用途 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IN164232B (sk) * | 1986-04-11 | 1989-02-04 | Hoechst India | |
| US5284856A (en) * | 1988-10-28 | 1994-02-08 | Hoechst Aktiengesellschaft | Oncogene-encoded kinases inhibition using 4-H-1-benzopyran-4-one derivatives |
| US5733920A (en) | 1995-10-31 | 1998-03-31 | Mitotix, Inc. | Inhibitors of cyclin dependent kinases |
| US5849733A (en) | 1996-05-10 | 1998-12-15 | Bristol-Myers Squibb Co. | 2-thio or 2-oxo flavopiridol analogs |
| US5908934A (en) | 1996-09-26 | 1999-06-01 | Bristol-Myers Squibb Company | Process for the preparation of chiral ketone intermediates useful for the preparation of flavopiridol and analogs |
| ES2301194T3 (es) | 1997-02-05 | 2008-06-16 | Warner-Lambert Company Llc | Pirido 2,3-d pirimidinas y 4-aminopirimidinas como inhibidores de la proliferacion celular. |
-
1999
- 1999-12-21 US US09/468,665 patent/US6399633B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-01-18 EA EA200100742A patent/EA004786B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-01-18 AP APAP/P/2001/002218A patent/AP1469A/en active
- 2000-01-18 RS YU54401A patent/RS50242B/sr unknown
- 2000-01-18 NZ NZ512822A patent/NZ512822A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-01-18 AU AU32098/00A patent/AU777368B2/en not_active Ceased
- 2000-01-18 DE DE60013555T patent/DE60013555T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-18 PL PL350735A patent/PL197693B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2000-01-18 TR TR2001/02223T patent/TR200102223T2/xx unknown
- 2000-01-18 ES ES00909918T patent/ES2226792T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-18 CZ CZ20012804A patent/CZ300395B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-01-18 EE EEP200100385A patent/EE04851B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-01-18 IL IL14466800A patent/IL144668A/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-01-18 BR BR0007911-1A patent/BR0007911A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-01-18 AT AT00909918T patent/ATE275428T1/de active
- 2000-01-18 UA UA2001075481A patent/UA73110C2/uk unknown
- 2000-01-18 WO PCT/US2000/001104 patent/WO2000044362A2/en active IP Right Grant
- 2000-01-18 CA CA002360668A patent/CA2360668C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-01-18 SK SK1086-2001A patent/SK286747B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-01-18 HU HU0200804A patent/HU229263B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2000-01-18 EP EP00909918A patent/EP1150746B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-18 SI SI200030517T patent/SI1150746T1/xx unknown
- 2000-01-18 JP JP2000595666A patent/JP4755759B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-01-18 OA OA1200100196A patent/OA11755A/en unknown
- 2000-01-18 ID IDW00200101696A patent/ID30180A/id unknown
- 2000-01-18 PT PT00909918T patent/PT1150746E/pt unknown
- 2000-01-18 ME MEP-105/08A patent/MEP10508A/xx unknown
- 2000-01-18 KR KR1020017009716A patent/KR100793047B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-01-18 DK DK00909918T patent/DK1150746T3/da active
- 2000-01-18 CN CNB008032513A patent/CN1219556C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-01-25 TW TW089101215A patent/TWI273907B/zh not_active IP Right Cessation
- 2000-02-01 AR ARP000100420A patent/AR042569A1/es not_active Application Discontinuation
-
2001
- 2001-07-05 NO NO20013335A patent/NO330512B1/no not_active IP Right Cessation
- 2001-07-06 ZA ZA200105596A patent/ZA200105596B/en unknown
- 2001-07-11 HR HR20010521A patent/HRP20010521A2/hr not_active Application Discontinuation
- 2001-07-27 BG BG105751A patent/BG65151B1/bg unknown
- 2001-08-23 CR CR6448A patent/CR6448A/es not_active Application Discontinuation
-
2002
- 2002-05-31 HK HK02104062.3A patent/HK1042445B/zh not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK286747B6 (sk) | Použitie 4H-1-benzopyran-4-ónových derivátov ako inhibítorov proliferácie buniek hladkých svalov | |
| US10214491B2 (en) | Activators and therapeutic applications thereof | |
| WO2003037323A2 (en) | Inhibitors of the fatty acid oxidation for prophylaxis and treatment of diseases related to mitochondrial dysfunction | |
| US6348493B1 (en) | Treatment and prevention of hepatic disorders | |
| US7056908B2 (en) | Pharmaceutical compositions and methods for preventing skin tumor formation and causing regression of existing tumors | |
| US8530457B2 (en) | Method for the treatment of lymphangioleiomyomatosis (LAM) | |
| MXPA01007278A (en) | The use of 4-h-1-benzopyran-4-one derivatives as inhibitors of smooth muscle cell proliferation | |
| US20110201618A1 (en) | Kmups inhibiting proliferation and obliteration of pulmonary artery | |
| US6495588B2 (en) | Scytonemin and methods of using thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees |
Effective date: 20140118 |