JP2002535356A

JP2002535356A - ４−ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン誘導体の平滑筋細胞増殖インヒビターとしての使用

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Publication number: JP2002535356A
Application number: JP2000595666A
Authority: JP
Inventors: ウィンストン・カムブル・パタースン; ジェニファー・エイ・デューモント
Original assignee: アベンティス・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテツド; ユニヴァーシティ・オブ・テキサス・システム．ボード・オブ・リージェンツ
Priority date: 1999-02-01
Filing date: 2000-01-18
Publication date: 2002-10-22
Anticipated expiration: 2020-01-18
Also published as: EP1150746B1; SI1150746T1; WO2000044362A3; TR200102223T2; KR100793047B1; AP2001002218A0; US6399633B1; JP4755759B2; AR042569A1; OA11755A; PT1150746E; IL144668A; NO330512B1; HK1042445B; BG105751A; PL197693B1; NZ512822A; EE200100385A; YU54401A; AU3209800A

Abstract

(57)【要約】平滑筋細胞（ＳＭＣ）の増殖は血管損傷の多くの動物モデルおよび同様に多くのヒト損傷における新内膜形成の重要な成分である。遺伝子移入技術による細胞周期の阻害は多くの動物モデルにおいてＳＭＣの増殖および損傷形成を遮断できるがこれらの方法はまだヒト疾患の処置には適用できない。フラボピリドールは最近同定された強力な、経口的に利用できるサイクリン依存性キナーゼインヒビターである。血管疾患における平滑筋細胞（ＳＭＣ）増殖の役割を考慮して、本発明者らは、最近同定されたサイクリン依存性キナーゼインヒビターのフラボピリドールのＳＭＣ増殖に対する作用をインビトロおよびインビボで調べた。フラボピリドール（７５ nmol／Ｌ）は、ＳＭＣの増殖を強力に遮断し、その作用はサイクリン依存性キナーゼ活性および細胞周期関連遺伝子発現の下方調整を伴った。本発明者らは、ラット頚動脈損傷モデルにおいてインビボで、ＳＭＣの増殖に対するフラボピリドールの作用を調べた。フラボピリドール（５ mg／kg）はバルーン傷害後７および１４日目に新内膜のサイズをそれぞれ３５％および３９％低下させた。フラボピリドールはＳＭＣに富んだ血管の損傷の処置における強力な治療的ツールである可能性がある。４−Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン誘導体は平滑筋細胞の増殖を低投与量レベルで阻害する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】

本発明は平滑筋細胞（ＳＭＣ）の増殖のインヒビターとしての４−Ｈ−１−ベ
ンゾピラン−４−オン誘導体の使用に関する。

【０００２】

【政府の援助による研究開発に関する記述】

本発明は、グラント番号ＨＬ03658 およびＡＧ15234 の National Institute
of Health からの援助を受けた。

【０００３】

【背景技術】

血管損傷に対する細胞性応答−細胞性機能不全、活性化、脱分化、増殖および
遊走−はヒトの動脈硬化症の処置のためのバルーン血管形成およびステント置換
後に起こる再狭窄のような臨床的事象に終わる⁽¹⁾。平滑筋細胞（ＳＭＣ）の増
殖は血管損傷モデルの共通な、多分画一化する特徴であり、ＳＭＣは新たな内膜
損傷の主要な成分である^(2.3)。ＳＭＣ増殖の阻害に再び興味がもたれるように
なったのは、冠状動脈疾患の処置に対するステントの使用の増加に伴うものであ
る。インステント再狭窄はほとんど完全に新内膜形成およびＳＭＣの過形成に依
存する⁽⁴⁾からである。インステント再狭窄患者の１００,０００例もが１９９７
年だけで処置を必要としている⁽⁵⁾。したがって、投与が容易で効果的なＳＭＣ
過形成のインヒビターは重要な臨床的および経済的問題である⁽⁶⁾。

【０００４】増幅応答の細胞性メディエーターの調節または細胞周期機構への直接的な干渉
のいずれかによる、血管損傷モデルにおけるＳＭＣ増殖を阻害する努力は内膜形
成に重要な洞察を与えてきた。細胞周期の進行はサイクリン依存性キナーゼ（Ｃ
ｄｋ）およびそれらのサイクリン調節サブユニット⁽⁷⁾によりポジティブになら
びにＣｄｋインヒビターおよび腫瘍サプレッサー遺伝子たとえば網膜芽腫タンパ
ク質（Ｒｂ）およびｐ53⁽⁸⁾によってネガティブに調節される厳密に制御された
現象である。内因性Ｃｄｋインヒビターｐ21およびｐ27^kip1またはＲｂの構成的
活性型のアデノウイルス−仲介過剰発現は、ラット頚動脈損傷モデルにおける新
内膜形成を遮断する^(9-11)。同様に、同種のＤＮＡ結合部位の競合的過剰発現に
よる転写因子Ｅ２Ｆの活性の阻害もＳＭＣの増殖および新内膜形成を阻害する⁽¹ ²⁾ 。このような研究は、細胞周期の阻害が血管損傷の形成における介入に魅力的
な標的であるとの一般的仮説を支持している。

【０００５】遺伝子的介入は新内膜形成を調節する機構の解明に補助とはなったが、ヒトに
おける血管疾患の処置には、現在では臨床的に適当でない欠点が明らかになって
いる。特異的な細胞周期調節作用とくに経口的に活性な作用を有する水溶性の低
分子量化合物が、実験的にもまた多分臨床的にも広い適用性を有するものと考え
られる。最近同定されたフラボンであるフラボピリドールはＣｄｋ₂，Ｄｄｃ₂お
よびＣｄｋ₄の活性を強力に遮断するＣｄｋインヒビターである^(13-16)。Ｃｄｋ
の他の薬理学的インヒビターとは異なりフラボピリドールはそのキナーゼ特異性
、その経口的利用性およびその効力において顕著であり、ナノモルの濃度で有効
である⁽¹⁶⁾。これらのユニークな特徴は好ましい副作用プロファイルを生じ、不
応性新生物の処置におけるフラボピリドールのフェーズＩ臨床試験におけるテス
トが行われるようになった⁽¹⁷⁾。これらの性質に鑑み、本発明者らはインビトロ
およびラット頚動脈に対するバルーン損傷後におけるフラボピリドールのＳＭＣ
増殖阻害能を検討した。本発明者らは、フラボピリドールが細胞周期の進行の強
力な選択的インヒビターであり、それはインビボおよびインビトロの両者でＳＭ
Ｃの増殖を停止させることを証明した。しかも、ヒトにおいて毒性作用を有する
ことが知られている用量よりも低いフラボピリドールの経口用量によって、新内
膜形成が効果的に遮断される。

【０００６】驚くべきことに今回、４−Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン誘導体はＳＭＣ増
殖のインヒビターとして適当であることが見いだされた。４−Ｈ−１−ベンゾピ
ラン−４−オン誘導体は腫瘍の制御に適当であることが知られている。しかしな
がら驚くべきことに、本発明による４−Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン誘導体
は、腫瘍の増殖の制御に使用されねばならない投与量レベルよりも低い投与量で
ＳＭＣ増殖インヒビターとして有効に作用する。

【０００７】

【発明の開示】

したがって本発明の主題は 4−Ｈ−1−ベンゾピラン−4−オン誘導体の平滑筋
増殖のインヒビターとしての使用である。

【０００８】添付図面において、図１は、フラボピリドールのＨＡＳＭＣにおけるＤＮＡ合成に対する作用を示
す。１Ａ：休止ＨＡＳＭＣをｂＦＧＦ（１０ng／ml）の不存在下（−）または存在
下（＋）に、指示した濃度のフラボピリドール（nmol／Ｌ）で２４時間処置した
。増殖の指標としてＢrdＵの取り込みを、ＥＬＩＳＡベースのアッセイにより測
定し、ｂＦＧＦ処置の不存在下における取り込みの百分率として表示した。^*ｐ
＜０.０５，非処置細胞との比較。⁺ｐ＜０.０５，フラボピリドールの不存在に
おけるｂＦＧＦ処置との比較；１Ｂ：ＨＡＳＭＣはフラボピリドール（７５nmol／ml）の不存在の存在下にｂ
ＦＧＦ（１０ng／ml）、トロンビン（２Ｕ／ml）またはビヒクルにより処置し、
ＢrdＵの取り込みを測定した。^*ｐ＜０.０５，非処置細胞との比較。^**ｐ＜０.
０５，ｂＦＧＦ単独処置との比較。⁺ｐ＜０.０５，トロンビン単独処置との比較
。

【０００９】図２は、フラボピリドールのＨＡＳＭＣ増殖に対する作用。休止ＨＡＳＭＣを
ｂＦＧＦ（１０ng／ml）単独（□）、ｂＦＧＦとフラボピリドール（７５nmol／
Ｌ）（□）またはビヒクル（□）で指示した時間処置し、処置後の細胞数を測定
した。結果は、ウエルあたりの細胞数（×１０³）で表す。

【００１０】図３は、ＨＡＳＭＣにおけるサイクリン依存性キナーゼ活性に対するフラボピ
リドールの作用。休止ＨＡＳＭＣを、ｂＦＧＦ（１０ng／ml）、トロンビン（２
Ｕ／ml）またはビヒクルによってフラボピリドール（７５nmol／Ｌ）の存在下ま
たは不存在下に処置し、ヒストンＨ１のリン酸化をＣｄｋ活性の指標として定量
し、ｂＦＧＦ処置を行わなかった場合のＣｄｋ活性の百分率として表す。^*ｐ＜
０.０５，非処置細胞との比較。^**ｐ＜０.０５，ｂＦＧＦ単独処置との比較。⁺
ｐ＜０.０５，トロンビン単独処置との比較。

【００１１】図４は、フラボピリドールによる細胞周期関連タンパク質の調整。休止ＨＡＳ
ＭＣを、ｂＦＧＦ（１０ng／ml）、トロンビン（２Ｕ／ml）および／またはフラ
ボピリドール（７５nmol／Ｌ）の存在下（＋）または不存在下（−）に、２４時
間処置した。細胞溶解物のイムノブロッティングをサイクリンＤ₁（最上段のパ
ネル）、ＰＣＮＡ（中段のパネル）、ならびにリン酸化（ｐＲｂ）および過リン
酸化（ｐｐＲｂ）Ｒｂ（最下段のパネル）を認識する特異的抗体を用いて実施し
た。

【００１２】図５は、ＨＡＳＭＣにおけるＭＡＰキナーゼ活性に対するフラボピリドールの
作用。休止ＨＡＳＭＣをｂＦＧＦ（１０ng／ml）、トロンビン（２Ｕ／ml）、Ｐ
Ｄ98059（３０μmol／Ｌ）および／またはフラボピリドール（７５nmol／Ｌ）の
存在下（＋）または不存在下（−）に３０分間処置した。リン酸化Ｅrk１（ｐＥ
rk１）およびＥrk２（ｐＥrk２）のレベルを、両タンパク質を認識するリン酸化
特異的抗体でのイムノブロッティングにより測定した（上方のパネル）。ＭＡＰ
キナーゼ活性はミエリン塩基性タンパク質を基質として用いてインゲルキナーゼ
アッセイにより測定した（下方のパネル）。

【００１３】図６は、フラボピリドール処置後のＨＡＳＭＣの生存能。休止ＨＡＳＭＣをフ
ラボピリドール（７５nmol／Ｌ）、ＴＮＦ−□（５０ng／ml）またはビヒクルで
指示時間処置した。細胞の生存能はトリパンブルー排除によって評価した。結果
は計数された総細胞に対する生存細胞の百分率として表す。

【００１４】図７は、ラット頚動脈のバルーン傷害後新内膜形成のフラボピリドールによる
阻害。新内膜／中膜比は組織切片、または損傷後５日間フラボピリドール（５mg
／kg）で処置したもしくは処置しなかったラット頚動脈で測定した。動脈は損傷
後７日目（ｎ＝１２）および１４日目（ｎ＝１２）に調べた。各時点および各処
置群からの動脈の新内膜におけるＰＣＮＡ陽性核の百分率（±ＳＥＭ，カウント
された核の百分率で表す）も示す。^*ｐ＜０.０５，ビヒクル処置との比較。

【００１５】図８は、ラット頚動脈からの組織切片。切片は損傷後７日（パネルＡおよびＢ
）および14日後（パネルＣおよびＤ）の動脈からのものである。パネルＡおよび
Ｃに示す動脈は胃チューブによるフラボピリドール（５mg／kg）処置ラットから
、パネルＢおよびＤの動脈は、ビヒクル単独処置ラットからのものである。元の
倍率，×１００。

【００１６】図９は、ラット頚動脈におけるバルーン傷害後のＣdk２の発現。切片は損傷後
７日（パネルＡおよびＢ）および１４日後（パネルＣおよびＤ）の動脈からのも
のである。パネルＡおよびＣに示す動脈は胃チューブによるフラボピリドール（
５mg／kg）処置ラットから、パネルＢおよびＤの動脈はビヒクル単独処置ラット
からのものである。新内膜に優勢に局在するＣdk２−陽性核は、アルカリホスフ
ァターゼ法によってベクターブルーで染色した。元の倍率，×１００。

【００１７】適当な４−Ｈ−１−ベンゾピランは、式

【化３】［式中、Ｒ₁は、水素；１〜６個の炭素原子を有するアルキル；アリール−Ｃ₁〜Ｃ₄−
アルキル；ハロゲン、ヒドロキシもしくはカルボキシにより置換されたＣ₁〜Ｃ₆ −アルキル；Ｃ₃〜Ｃ₆−シクロアルキル；ピリジル；チエニル；Ｃ₃〜Ｃ₆−シク
ロアルキル−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル；Ｃ₂〜Ｃ₆−アルケニル；Ｃ₂〜Ｃ₆−アルキニ
ル；フェニル；ハロゲン、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルコキシ、ヒドロ
キシル、カルボキシル、ＣＯＯ−アルキル、ＣＯＮＨ₂、ＣＯＮＨ−アルキル、
ＣＯＮ(アルキル)₂、ニトロ、トリフルオロメチル、アミノ、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキ
ルアミノ、ジ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルアミノもしくはフェニルによってモノもしく
はポリ置換されたフェニル；ナフチル、カルボキシル、−ＣＨＯ、ＣＯＯ−Ｃ₁
〜Ｃ₄−アルキル、一級アミノ、アルキルアミノ、アラルキルアミノ、ジアルキ
ルアミノ、アミド、アリールアミノ、ジアリールアミノまたは−ＣＨ₂Ｏ−Ｃ₁〜
Ｃ₄−アルキルであり、

【００１８】Ｒ₂は、水素；１〜６個の炭素原子を有するアルキル；アリール；ニトロ；ア
ミノ；ジ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルアミノ；ハロゲン；ヒドロキシル；アルコキシ；
−ＣＯＯＨ；−ＣＯＯ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル；−ＣＨＯ；−ＣＨ₂ＯＨまたは−
ＣＨ₂Ｏ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルであり、Ｒ₃は水素；Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル；ハロゲン、ヒドロキシもしくはカルボキシ
によって置換されたＣ₁〜Ｃ₄−アルキル；ヒドロキシル；カルボキシル；ニトロ
；アミノ；Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルアミノ；ジ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルアミノ；ハロゲ
ン；−Ｏ−アルキル−Ｃ(Ｏ)−アルキル；−ＣＨＯ；−ＣＨ₂ＯＨ；−ＣＨ₂Ｏ−
Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル；Ｒ₂Ｎ−Ｃ(Ｏ)−Ｏ−（式中、ＲはＨ、Ｃ₁〜Ｃ₆−アルキ
ル；シクロアルキルである）、または −Ｏ−アルキル−Ｃ(Ｏ)−アルキルもし
くはアリールであり、

【００１９】Ｒ₄は、水素；ヒドロキシル；Ｃ₁〜Ｃ₄−アルコキシ、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルカノイ
ルオキシ、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルコキシカルボニル；アリールオキシ；アミノ；Ｃ₁〜
Ｃ₄−アルキルアミノ；ジ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルアミノ；またはＲ′₂−Ｎ−Ｃ(
Ｏ)−Ｏ−（式中、Ｒ′はＨ、Ｃ₁〜Ｃ₆−アルキル、シクロアルキルまたはアリ
ールである）であり、Ｒ₅は、水素、Ｃ₁〜Ｃ₆−アルキル；アリール−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル；Ｃ₃〜Ｃ ₆ −シクロアルキル；Ｃ₃〜Ｃ₆−シクロアルキル−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル；アルキ
ルアミノ；Ｃ₁〜Ｃ₄−アルカノイル；−Ｃ(Ｏ)−Ｏ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルまたは
アロイルであり、

【００２０】Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅中のアリール基は非置換フェニルであるかまた
はハロゲン、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルコキシ、ヒドロキシル、カル
ボキシル、ＣＯＯ−アルキル、ＣＯＮＨ₂、ＣＯＮＨ−アルキル、ＣＯＮ（アル
キル)₂、ニトロ、トリフルオロメチル、アミノ、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルアミノ、ジ
−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルアミノまたはフェニルによってモノまたはポリ置換された
フェニルであり、ｍは０〜３の整数であり、ｎは１である］の化合物またはそれらの医薬的に許容される塩である。

【００２１】本発明の化合物は２つの不斉中心を有する。一方は窒素を含有するヘテロ環が
ベンゾピラン部分に融合する位置（Ｃ−４′）であり、他方はＲ₄で置換された
炭素原子（Ｃ−３′）であり、これは２対の光学的異性体が可能であることを意
味する。本発明による化合物の定義には、すべての可能な立体異性体およびそれ
らの混合物を包含する。とくにラセミ型および特異的な活性を有する単離された
光学異性体が包含される。２つのラセミ体は物理的な方法たとえば分別結晶によ
って分割することができる。個々の光学異性体はラセミ化合物から慣用方法たと
えば光学的に活性な酸との塩の形成ついで結晶化によって得られる。

【００２２】Ｒ₁〜Ｒ₅として適当なアルキル基の例は、６個まで好ましくは５個までの炭素
原子を有する直鎖状または分岐状の基であり、たとえばメチル、エチル、プロピ
ル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ペンチルまたはイソペンチル基である。

【００２３】Ｒ₁〜Ｒ₅として適当な置換アルキル基の例は、ハロアルキルたとえばトリフル
オロメチル、ヒドロキシアルキルたとえばヒドロキシエチル、またはカルボキシ
アルキルたとえばカルボキシエチルである。

【００２４】３〜６個の炭素原子を有し、Ｒ₁〜Ｒ₅で表されるシクロアルキル基の適当な例
は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルまたはシクロヘキシルであ
る。シクロプロピルメチルはシクロアルキルアルキルの例である。

【００２５】Ｒ₁〜Ｒ₅によって表されるアラルキル基の例はフェニルアルキル基であり、フ
ェニル基は非置換であるかまたはハロゲン、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₄−ア
ルコキシまたはニトロのような置換基またはトリフルオロメチル基、アミノ基お
よび置換アミノ基によってモノまたはポリ置換されている。

【００２６】Ｒ₁〜Ｒ₅によって表されるアリール基の例は、フェニル基（この場合、フェニ
ル基は非置換であるか、またはハロゲン、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₄−アル
コキシ、ヒドロキシル、カルボキシル、ＣＯＯ−アルキル、ＣＯＮＨ₂、ＣＯＮ
Ｈ−アルキル、ＣＯＮ（アルキル)₂、ニトロもしくはトリフルオロメチル、アミ
ノ、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルアミノ、ジ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルアミノのような置換基
によってモノまたはポリ置換されている）、芳香族ヘテロ環基たとえばピリジル
基、および多環式芳香族基たとえばナフチル基である。

【００２７】Ｒ₁〜Ｒ₅によって表されるアルキルアミノ基の適当な例は (ＣＨ₂)_n−ＮＲ₆Ｒ ₇ （式中、ｎは１〜３であり、Ｒ₆およびＲ₇はアルキルであって、アルキルＲ₁〜
Ｒ₅の場合に上記で定義した通りであり、さらにＲ₆およびＲ₇両者はそれらが結
合する窒素原子とともに１個または２個以上のヘテロ原子を有するヘテロシクロ
環であることができる）である。Ｒ₆およびＲ₇によりそれらが結合する窒素とと
もに形成するヘテロシクロ環の適当な例は、ピペリジン、ピロリジン、モルホリ
ン、ピペラジンまたはイミダゾールであり、これらはすべて非置換であるか、ま
たは１個もしくは２個以上の位置でＣ₁〜Ｃ₄−アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルコキシ
もしくはアリールまたはヒドロキシルもしくはアミノ基により置換されていても
よい。

【００２８】本発明の化合物の無機酸または有機酸との塩の適当な例は、塩酸塩、臭化水素
酸塩、硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、マレイ
ン酸塩またはフマル酸塩である。

【００２９】式Ｉａ

【化４】［式中、Ｒ₁は、水素；Ｃ₁〜Ｃ₃−アルキル；ナフチル；フェニル；ハロゲン、Ｃ₁〜Ｃ ₄ −アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルコキシ、ヒドロキシル、カルボキシル、ＣＯＯ−
アルキル、ＣＯＮＨ₂、ＣＯＮＨ−アルキル、ＣＯＮ(アルキル)₂、ニトロ、トリ
フルオロメチル、アミノ、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルアミノ、ジ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル
アミノもしくはフェニルによってモノもしくはポリ置換されたフェニル；ピリジ
ル；またはチエニルであり、Ｒ₂は、水素またはＣ₁〜Ｃ₃−アルキルであり、Ｒ₅は、Ｃ₁〜Ｃ₃−アルキル；Ｃ₃〜Ｃ₅−シクロアルキル；またはＣ₃〜Ｃ₅−
シクロアルキル−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルである］の化合物が好ましい。

【００３０】式Ｉａにおいて、Ｒ₁は、フェニル、チエニル、ピリジル、クロロフェニル、
ジクロロフェニル、メチルフェニル、アミノフェニル、ブロモフェニル、ヒドロ
キシフェニルまたはナフチルであり、Ｒ₂は水素であり、Ｒ₅はメチルである化合物がとくに好ましい。

【００３１】とくに重要な化合物は、(−)−シス−５,７−ジヒドロキシ−２−（２−クロ
ロフェニル）−８−［４−（３−ヒドロキシ−１−メチル）ピペリジニル］−４
Ｈ−ベンゾピラン−４−オン（フラボピリドール）、とくにその塩酸塩型である
。

【００３２】本発明の化合物は、米国特許第 4,900,727 号および米国特許第 5,284,856 号
の開示に従い調製することができる。これらの開示は引用により本明細書に導入
される。上記米国特許の実施例も本出願に関連する。

【００３３】本発明の化合物は平滑筋細胞の増殖を阻害する。したがって、本発明の更なる
主題はまた、上に定義した式Ｉの化合物少なくとも１種またはその医薬的に許容
される酸付加塩少なくとも１種を含有する平滑筋細胞の増殖を阻害する医薬であ
り、平滑筋細胞の増殖阻害作用を有する医薬の製造のための上に定義した式Ｉの
化合物の使用である。本発明の化合物の典型的な適用範囲は、平滑筋細胞に富ん
だ血管の損傷に伴う疾患／障害／傷害である。したがって、きわめて重要な例は
バルーン傷害後の損傷である。他の重要な適用範囲はステント植え込み後の再狭
窄の予防である。

【００３４】４−Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン誘導体は、本発明によれば、熟練者には
よく知られた一般に既知の様式で使用される。医薬には、上述の活性物質の有効
量がそのままでまたは好ましくは適当な医薬補助剤と配合して錠剤、コート錠、
カプセル、坐剤、乳化液、懸濁液または溶液の形態で使用され、活性化合物の含
量は約９５％まで、好ましくは１０〜７５％である。

【００３５】どのような補助剤が所望の医薬製剤に適当であるかは熟練者には専門的知識に
より明らかである。錠剤用補助剤、溶媒、ゲル形成剤、坐剤基剤および活性物質
用の他の賦形剤のほかに、たとえば抗酸化剤、分散剤、乳化剤、消泡剤、矯味剤
、防腐剤、可溶化剤または着色剤を使用することが可能である。

【００３６】活性物質は、経口的に、非経口的に、静脈内的にまたは経直腸的に投与するこ
とができる。経口投与が好ましい。経口投与の剤形のためには、活性物質を、こ
の目的に適当な添加物たとえば賦形剤、安定剤または不活性希釈剤とともに他の
化合物と混合して、これを適当な投与剤形、たとえば錠剤、コート錠、硬質ゼラ
チンカプセルおよび含水アルコール性または油性懸濁液または溶液の形態にする
ため慣用方法が使用できる。使用できる不活性賦形剤の例には、アラビアゴム、
マグネシア、ラクトース、グルコースまたはデンプン、とくにトウモロコシデン
プンがある。この関係では、製剤は、乾燥顆粒または湿潤顆粒として調製するこ
とができる。適当な油性賦形剤または溶媒の例には、植物油または動物油たとえ
ばヒマワリ油または鱈肝油がある。

【００３７】皮下または静脈内投与には、活性物質の溶液、懸濁液または乳化液を適宜この
目的に慣用される物質、たとえば可溶化剤、乳化剤または他の補助剤を使用して
形成させる。適当な溶媒の例は、水、生理的食塩溶液またはアルコールたとえば
エタノール、プロパノールもしくはグリセロールおよび糖溶液たとえばグルコー
ス溶液もしくはマンニトール溶液、または上述の各種溶媒の混合物である。

【００３８】毎日投与される４−Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン誘導体の用量は望ましい
効果に適するように選択される。４−Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン誘導体は
それぞれの哺乳動物において腫瘍の増殖の制御に使用される投与量の７０％より
低い用量、好ましくは６０％より低い用量、とくに５０％より低い用量で投与す
ることができる。一例としてヌードマウスの異種移植モデルにおいては約５mg／
kg体重の用量が１日１回経口投与される。これは同じ動物モデルにおいて腫瘍の
増殖を阻止する投与量の半量である（Dreesら, Clin.Cancer Res. 1997; 3: 273
−279）。

【００３９】４−Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン誘導体は、その薬物動態学的性質から１
日に数回その化合物を投与するかまたは徐放性製剤を選択する必要がある。

【００４０】

【実施例】

フラボピリドールは、インビボで血管損傷のラット頚動脈損傷モデルにおいて
平滑筋細胞の増殖および新内膜形成を阻害する。カテーテル誘発損傷後の新内膜損傷の形成がＳＭＣの増殖に決定的に依存する
確立されたラット頚動脈損傷モデル（Clowesら, Lab.Invest. 1983, 49: 327-33
3, Clowesら, Circ.Res. 1985, 56: 139−145）を用いて、フラボピリドールが
インビトロにおけると同様にインビボにおいてＳＭＣの増殖停止を誘導するか否
かを調べた。フラボピリドールは、損傷の日に開始して１日１回５mg／kgの用量
で以後４日間経口的に投与した。このモデルではこの期間がＣdk２の初期の誘導
およびＳＭＣ増殖の最初の波をカバーするからである（Circ.Res. 1995; 77: 44
5−465, Circ.Res. 1997; 80: 418-426）。平均内膜および中膜面積を損傷後７
および１４日後に定量し、新たな内膜損傷のサイズを新内膜対中膜面積の比で表
した。それぞれ１２匹の動物を処置群および非処置群とした。７日目の比はビヒ
クル処置ラットの動脈で１.００±０.０５、フラボピリドール処置ラットの動脈
で０.６５±０.０４であり、３５％の減少がみられた。１４日目の新内膜／中膜
比はビヒクル処置ラット１.０８±０.０４、フラボピリドール処置ラット０.６
６±０.０３であり、３８.９％の減少がみられた。これらの効果は両時点におい
て統計的に有意であった（Ｐ＜０.０５）。

【００４１】方法材料 - フラボピリドール（Ｌ86−8275，(−)−シス，−５,７−ジヒドロキシ
−２−（２−クロロフェニル）−８−［４−（３−ヒドロキシ−１−メチル）ピ
ペリジニル］−４Ｈ−ベンゾピラン−４−オン）は Hoechst Marion Roussel,In
c. により提供され、細胞培養実験では５０mmol／Ｌの保存溶液としてジメチル
スルホキシドに溶解し、インビボでの実験には水に溶解した。塩基性線維芽細胞
増殖因子（ｂＦＧＦ）は、Collaborative Biochemical から、トロンビンは Sig
ma から購入した。ＭＥＫ１インヒビターＰＤ98059 は New England Biolabs か
ら入手した。

【００４２】細胞培養 - ヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ）は Clonetics から得られ、
以前に記載されたようにして⁽¹⁸⁾培養した。細胞は５〜９回の継代後に使用した
。実験の実施前に、細胞は、０.２％ウシ胎児血清を含むメジウムで８０％コン
フルーエントに４８時間、増殖を停止させた。

【００４３】細胞増殖ＥＬＩＳＡ - 細胞の増殖はＥＬＩＳＡ（Amersham Life Science）に
より測定した。ＨＡＳＭＣはゼラチンで覆った９６−ウエルプレート中で増殖さ
せ、休止させた。細胞を１０ng／mlのｂＦＧＦ、２Ｕ／mlのトロンビン、または
ビヒクルで２４時間処置した。フラボピリドール（７５nmol／Ｌ）を増殖因子処
置の１時間前に投与した。５−ブロモ−２′−デオキシウリジン（ＢrdＵ）を処
置の最後の２時間の間１０μmol／Ｌの最終濃度に添加した。ＢrdＵの取り込み
を記載のように⁽¹⁹⁾測定した。結果は２回の独立した実験において各条件あたり
１２例のサンプルについての平均±ＳＥＭとして表す。

【００４４】細胞数 - ６−ウエルのプレート中で５０％コンフルーエントに増殖させた増
殖休止ＨＡＳＭＣをフラボピリドール（７５nmol／Ｌ）またはｂＦＧＦ（１０ng
／ml）により処置しまたは処置せず、処置後の様々な時点で細胞をトリプシン処
理し、ヘモサイトメーターを用いて細胞数を測定した。

【００４５】ウエスタンブロット分析 - 休止ＨＡＳＭＣを指示したように増殖因子および
／またはフラボピリドールの存在下または不存在下に処置した。ウエスタンブロ
ット分析は、既報⁽¹⁸⁾のように実施した。一次抗体は、ポリクローナル抗−ヒト
サイクリンＤ１抗体（Ｍ−20，Santa Cruz）、モノクローナル抗−ヒト増殖細胞
核抗原（ＰＣＮＡ）抗体（ＰＣ10，Sigma）、リン酸化特異的ｐ44／42（Ｅrk1／
Ｅrk２）ＭＡＰキナーゼモノクローナル抗体（New England Biolabs）ならびに
リン酸化（ｐＲb）および高リン酸化（ppＲb）Ｒｂ種を認識するモノクローナル
抗−Ｒｂ抗体（Ｇ3−245, Pharmigen）とした。イムノブロッティングの研究に
は、実験を少なくとも３回反復した。

【００４６】Ｃｄｋ活性 - 休止ＨＡＳＭＣをアゴニストおよびインヒビターで２４時間処
置し、総細胞溶解物をウエスタンブロットについて記述したように調製した。キ
ナーゼアッセイはヒストンＨ₁キナーゼアッセイキット（Upstate Biotechnology
）を用いて製造業者の指示に従って実施した。略述すれば、プロテインキナーゼ
Ｃ（２μmol／Ｌ）およびプロテインキナーゼＡ（２μmol／Ｌ）のペプチドイン
ヒビター１０μl、１００μgの細胞溶解物、１０μlのアッセイ緩衝液、ならび
に７５μmol／Ｌの塩化マグネシウム、５００μmol／ＬのＡＴＰおよび１μＣi
／mlの［γ−³²Ｐ]ＡＴＰを含む混合物１０μlを微小遠沈管中で混合した。３０
℃で１０分間インキュベートしたのち、そのアリコートをピペットでホスホセル
ロースペーパー上に取った。ペーパーを０.７５％リン酸中で洗浄し、ついで、c
pmをシンチレーションカウンター（Beckman）中で測定した。結果は３つのサン
プルの平均±ＳＥＭで表し、３つの独立の実験の代表値とする。

【００４７】インゲルキナーゼアッセイ - 休止ＨＡＳＭＣを増殖因子で３０分間処置し、
総細胞溶解物をウエスタンブロットについて記述したのと同様に調製した。一部
の実験においてはＨＡＳＭＣを６０分間、３０μmol／ＬのＰＤ98059、フラボピ
リドールまたはビヒクルにより前処理した。等量のタンパク質（５０μg／レー
ン）を３５０μg／mlのミエリン塩基性タンパク質と共重合したポリアクリルア
ミドゲル上に溶解した。ゲルを［γ−³²Ｐ］ＡＴＰで処理し、オートラジオグラ
フィーを以前に記載されたように⁽¹⁹⁾実施した。

【００４８】トリパンブルー排除─ＨＡＳＭＣは５cmのディッシュ中で低コンフルーエント
に増殖させて、記載のように増殖を休止させた。細胞はフラボピリドール（７５
nmol／Ｌ）または腫瘍壊死因子−□（ＴＮＦ−□，５０ng／ml）で指示した時間
処理した。メジウムの除去後、リン酸緩衝食塩溶液中０.４％のトリパンブルー
をディッシュに加えた。５分後、ディッシュ中の細胞を顕微鏡下に計数した。青
色の細胞を非生存細胞として数えた。

【００４９】ラット頚動脈損傷モデル─ラット頚動脈への損傷の作成は本質的に既述のよう
に⁽²⁾実施した。成熟雄性 Sprague-Dawley ラット（４００〜５００ｇ, Zivic-M
iller）をケタミン（２mg／kg）およびキシラジン（４mg／kg）の腹腔内注射に
よって麻酔した。ついで、左内頚動脈に２Ｆ塞栓切除術カテーテルを挿入した。
バルーンを生理食塩水で膨張させ、動脈を横切して３回引き抜き、拡張して表面
が剥がれた損傷を作成した。右頚動脈には損傷を与えないで各動物の損傷の対照
として用いた。麻酔から回復した直後およびさらに４日後、ラットには盲検様式
で胃チューブによってフラボピリドール（水中５mg／kg）もしくは水を投与した
。ラットはすべて、手術後も生存し、使用した用量での薬物投与に関連した毒性
の明らかな兆候は示さなかった。頚動脈損傷後の特定の時間にラットを上述のよ
うに麻酔し、リン酸緩衝食塩溶液中４％パラホルムアルデヒドにより全身的に灌
流固定した。右および左頚動脈を摘出し、４％パラホルムアルデヒドの管腔内注
射によって膨張させ、ついで脱水させて７０％エタノール中４℃で保存した。免
疫組織化学的検討は以前に記載されたように¹⁸、モノクローナルＰＣＮＡ抗体お
よびポリクローナル抗-ヒトＣdk２抗体（Ｍ２−Ｇ，Santa Cruz）を用いて実施
した。

【００５０】イメージ分析─各動脈の最遠位および最近位領域（ほぼ５００μm）を除去し
た。各動脈から５００μm離して採取した１０個の中間断片（それぞれ８μm）を
分析した。スライドを固定し、以前に記載されたように¹⁸ヘマトキシリンおよび
エオシンで染色した。Nikon Diaphot 300 顕微鏡および４×対物レンズを用い、
各断片を Hamamatsu C5985 ビデオカメラおよび TCPro 2.41（Coreco, Inc.）に
よってデジタル画像として捕らえた。中膜および新内膜面積をＮＩＨイメージソ
フトウエアを用いて測定した。中膜および新内膜の境界を一人のスライド観察者
（A.M.）により決定し、第二の観察者（C.P.）によりこれを盲検様式で確証した
。損傷のサイズは新内膜／中膜の比として表した。各グループの結果は平均±Ｓ
ＥＭで表した。各グループで９２％またはそれ以上のイメージが判断可能であっ
た。残りは固定のアーティファクトによるものと考えられ、分析しなかった。

【００５１】統計的解析─定量的研究からのデータは適宜、平均±ＳＥＭで表した。多重処
理群に対しては、階乗ＡＮＯＶＡついで Fisher の最小有意差検定を適用した。
統計的有意差はｐ＜０.０５とした。

【００５２】結果フラボピリドールはＨＡＳＭＣの増殖を阻害する─種々の腫瘍細胞系の増殖を
阻害するフラボピリドールの能力に基づいて、本発明者らはその使用は一次培養
ヒトＳＭＣの増殖を遮断するという仮説を試験した。増殖静止ＨＡＳＭＣを、フ
ラボピリドールの存在下その濃度を上昇させていって、２４時間、ＳＭＣマイト
ジェンｂＦＧＦ（１０ng／ml）で処置し、ＥＬＩＳＡ−ベースのアッセイによっ
て増殖を測定した。非処置細胞と比べてｂＦＧＦ処理細胞の増殖は５.４倍増加
した（図１Ａ）。わずか５０nmol／Ｌのフラボピリドールによる１時間の前処置
で、ＨＡＳＭＣの増殖は有意に低下し（３.９倍に，ｐ＜０.０５）、この効果は
７５nmol／Ｌの濃度でほぼ最大であった。類似した結果がＤＮＡ合成の独立した
指標としてのチミジン取り込みを用いても得られた（データは示していない）。

【００５３】ＳＭＣの増殖に対するフラボピリドールの作用の一般性を試験するため、本発
明者らはＧ−タンパク質カップリング受容体を通して働くトロンビン（２Ｕ／ml
）によって誘導される有糸分裂誘発に対するその作用を、チロシンキナーゼファ
ミリー受容体のメンバーを刺激するｂＦＧＦと比較して調べた。フラボピリドー
ル（７５nmol／Ｌ）は有意にかつ強力にｂＦＧＦ−およびトロンビン-誘導ＨＡ
ＳＭＣの増殖の両者（それぞれ、５.４倍対１.８倍および２.４倍対０.７倍、ｐ
＜０.０５，図１Ｂ）を阻害した。本発明者らは、ＨＡＳＭＣにおける細胞周期
の進行に対するフラボピリドールの作用が真に増殖の変化を反映するものである
ことを確認するため、細胞の計数を実施した。ｂＦＧＦ（１０ng／ml）は処置３
日後細胞数に３倍の増加を誘発した（図２）。同様の結果がＥＬＩＳＡ−ベース
のアッセイにおいてもみられ、フラボピリドール（７５nmol／Ｌ）はｂＦＧＦ誘
発増殖を効果的に遮断した。

【００５４】フラボピリドールはＨＡＳＭＣにおけるＣｄｋ活性および細胞周期−関連遺伝
子の発現を阻害する─細胞周期の機構に対するフラボピリドールの特異的な作用
を評価するため、本発明者らは増殖因子刺激ＨＡＳＭＣからの細胞溶解物におけ
るヒストンＨ１キナーゼ活性を測定した。ヒストンＨ１のリン酸化はＣdc₂およ
びＣdk₂の活性を反映する⁽²⁰⁾。ＨＡＳＭＣのｂＦＧＦおよびトロンビン処置は
ヒストンＨ１キナーゼ活性のそれぞれ４.４倍および３.６倍の増加を生じた（図
３）。サイクリン依存性キナーゼ活性のこれらの上昇はフラボピリドール（７５
nmol／Ｌ）の前処置により完全に遮断された。

【００５５】ウエスタンブロット分析により、本発明者らはまた、ＨＡＳＭＣにおける細胞
周期関連タンパク質の増殖因子が誘発する調節にフラボピリドールが影響するか
否かを検討した。サイクリンＤ₁は増殖因子刺激により上方調整されるＧ₁相サイ
クリンであり、細胞周期からの撤退時に速やかに分解される⁽²¹⁾。サイクリンＤ ₁ タンパク質のレベルは２４時間のｂＦＧＦおよびトロンビン処置に応答して、
それぞれ６.３倍および３.２倍に上方調整され（図４）、その作用はフラボピリ
ドールの前処置で完全に遮断された。同様に、Ｓ期にＤＮＡの複製とともに優先
的に合成される⁽²²⁾ＰＣＮＡの発現の増加もフラボピリドールの前処置で遮断さ
れた。細胞周期関連タンパク質の最終的な指標として、本発明者らは、リン酸化
Ｒｂを認識する抗体を用いて増殖因子の発現に応答するＲｂのリン酸化を調べた
。Ｒｂは、Ｒｂがリン酸化されていない状態では転写因子Ｅ２Ｆに結合し、それ
を不活性化する細胞周期レギュレーターであり、インビボにおいてＳＭＣの増殖
静止を誘導する⁽¹¹⁾。リン酸化がＲｂを不活性化し、Ｓ期を経過する進行を可能
にする。ＲｂはインビボにおいてＣdk₂およびＣdk₄の標的であることから、Ｒｂ
のリン酸化の分析はとくに有意義である。トロンビンおよびｂＦＧＦは、いずれ
もＲｂの過リン酸化を誘導し、その作用はフラボピリドールによって阻害された
。これらの結果を考え合わせるとフラボピリドールはその増殖阻害作用に伴いＨ
ＡＳＭＣにおいてＧ₁およびＳ期関連細胞周期コントロールエレメントに影響す
ることを指示する。

【００５６】フラボピリドールはＭＡＰキナーゼリン酸化または活性に対して作用しない─
フラボピリドールが、上流キナーゼ経路に非特異的ではなく細胞周期のレベルに
おいて特異的に作用していることを保証するため、本発明者らはＭＡＰキナーゼ
ファミリーの２つのメンバーであるＥrk１（ｐ44 ＭＡＰキナーゼ）およびＥrk
２（ｐ42 ＭＡＰキナーゼ）のリン酸化および活性を測定した。本発明者らはこ
れらのキナーゼを、それらが増殖刺激に応答して起こる転写現象のすぐ上流にあ
り、多くの重要なマイトジェンシグナリング経路の下流にあることから⁽²⁴⁾選択
した。ＭＡＰキナーゼによる完全な応答は上流のマイトジェン経路も完全である
ことを指示する。本発明者らは、リン酸化されしたがって活性化型を特異的に認
識するモノクローナル抗体によりＥrk１およびＥrk２のリン酸化状態を測定した
。これらの実験の対照としては、ＭＡＰキナーゼ活性化の強力な選択的インヒビ
ター²⁵であるＰＤ98059 を使用した。ＨＡＳＭＣのトロンビンおよびｂＦＧＦに
よる30分間処置ののちに、非処置細胞と比較して、リン酸化されたＥrk１および
Ｅrk２の量の増加が検出された（図５、上方パネル）。トロンビンおよびｂＦＧ
Ｆ両者によるＥrk１およびＥrk２のリン酸化はＰＤ98059の前処置によって遮断
されたが、フラボピリドールによっては遮断されなかった。これらの所見を確認
するために、本発明者らはインゲルキナーゼアッセイによってＥrk１およびＥrk
２の活性を測定した（図５、下方パネル）。この場合も、Ｅrk１およびＥrk２の
活性はトロンビンおよびｂＦＧＦに応答して増大し、この作用はＰＤ98059によ
り阻害されたが、フラボピリドールによっては阻害されなかった。これらの実験
を図３および４に示した結果と考え合わせるとＨＡＳＭＣの増殖に対するフラボ
ピリドールの作用は、上流のシグナリング現象には影響することなくＣｄｋ活性
を遮断することによって細胞周期機構の特異的な静止によることの証拠が提供さ
れる。

【００５７】フラボピリドールはＨＡＳＭＣの生存能を低下させない─他の細胞型における
フラボピリドール活性の以前の報告では、細胞系に依存して、フラボピリドール
は生存能に影響することなく増殖静止を誘導するかまたはアポトーシスを生じる
ことが証明されていた^(16.26-29)。したがって本発明者らは処置後の様々な時点
でトリパンブルーの排除を測定してフラボピリドールがＨＡＳＭＣの生存能を低
下させるか否かを評価した。休止ＨＡＳＭＣをフラボピリドール（７５nmol／Ｌ
）、ビヒクル、またはこの細胞タイプでアポトーシスを誘導することが知られて
いるサイトカイン³⁰、ＴＮＦ-□（５０ng／ml）で処置した。ＴＮＦ-□はＨＡＳ
ＭＣの生存能を強力に低下させ、２４時間処置した細胞の本質的にすべての死滅
を生じたが、フラボピリドールは作用を示さなかった（図６）。さらに高い濃度
およびさらに長いインキュベーションにより、フラボピリドールの存在下におい
て生存能のある程度の低下を生じることが記録された（データは示していない）
。しかしながら、試験した条件下には、フラボピリドールは主として増殖静止を
誘導し、ＳＭＣの生存能には影響しない。

【００５８】フラボピリドールは血管損傷のラット頚動脈損傷モデルにおいてインビボで平
滑筋細胞の増殖および新内膜形成を阻害する─本発明者らはフラボピリドールが
インビトロでみられたように、インビボでＳＭＣの増殖静止を誘導するか否かを
調べるためにカテーテル誘発損傷後の新たな内膜傷害がＳＭＣ増殖に決定的に依
存する確立されたラット頚動脈損傷モデル^(2.3)を使用した。本発明者らはフラ
ボピリドールを損傷の日に開始しその後４日間、この期間がＣdk₂の初期誘導お
よびこのモデルにおけるＳＭＣ増殖の第一波をカバーすること^(31.32)から、１
日に５mg／kgの用量で経口的に投与した。平均内膜および中膜面積を損傷後、７
および１４日目に定量し、新内膜の損傷のサイズを中膜面積に対する新内膜面積
の比として表した。それぞれ１２匹の動物を処置および非処置群とした。７日目
の新内膜／中膜比は、ビヒクル処置ラットにおいて１.００±０.０５、フラボピ
リドール処置ラットにおいては０.６５±０.０４であり、３５.０％の低下がみ
られた（図７）。１４日目の新内膜／中膜比はビヒクル処置ラットにおいて１.
０８±０.０４、フラボピリドール処置ラットにおいて０.６６±０.０３であり
、低下は３８.９％であった。これらの作用はいずれの時点においても統計的に
有意（ｐ＜０.０５）であった。代表的な動脈切片を図８に示す。

【００５９】フラボピリドールが平滑筋細胞の増殖を阻害することを直接証明するために、
本発明者らは各動脈からの切片を、代表的領域におけるＰＣＮＡの発現のために
染色し、新内膜におけるＰＣＮＡ陽性核の百分率を測定した。７日目には非処置
ラットからの損傷動脈における核の３１.１±７.２％がＰＣＮＡ陽性であったが
、フラボピリドール処置ラットの損傷動脈においては１１.８±１.５％のみがＰ
ＣＮＡ陽性であった（図７；ｐ＜０.０５）。１４日目には、ＰＣＮＡ陽性核は
処置ラットからの新内膜細胞の１０.４±２.０％に存在したが、非処置損傷ラッ
ト動脈からの新内膜細胞には４.２±０.５％に存在したのみであった（ｐ＜０.
０５）（ＰＣＮＡ陽性核は処置には無関係に非損傷動脈には稀にしかみられない
）。同様にＣdk₂−陽性細胞は、損傷後７および１４日目のいずれにおいても、
非処置ラットからの動脈と比較して（パネルＢおよびＤ）、フラボピリドール処
置ラットの新内膜においてはるかに低かった（パネルＢおよびＣ）。

【００６０】考察本研究において、本発明者らは新規なＣｄｋインヒビター、フラボピリドール
、知られている最も強力な特異的なＣｄｋインヒビターがＳＭＣのインビボでの
増殖とくに血管損傷のセッティングにおける阻害に適当な候補物質であるか否か
を調べた。血管疾患の処置のために細胞周期機構を治療的に標的とする以前の試
み^(9-12)は本研究の合理性を提供した。しかしながら、この目的に用いられたこ
れらの方法は細胞周期の進行を阻害する遺伝子移入技術によるものであった。現
在は、手に負えない障害がこれらの方法⁽³³⁾の臨床的適用を妨げている。本発明
者らの研究の過程で、わずかマイクロモルの濃度においてＣdk 阻害作用を有す
る最近同定された化合物ＣＶＴ-313 が新内膜の形成も阻害できることが報告さ
れた。しかしながら、ＣＶＴ-313 はこの作用を産生するためには、損傷の時点
で頚動脈中に浸透していることを要求する⁽³⁴⁾。これに反し、本発明者らは、フ
ラボピリドールが経口的に投与された場合、他の臨床的に関連する薬剤^(11.35.3 ⁶⁾ に匹敵する程度まで、新内膜の形成を強力に阻害できることを示した。フラボ
ピリドールの経口活性は、血管損傷の動物モデルにおいて活性であることが示さ
れている薬剤中で、それを実際上ユニークなものとする。その選択性、効力およ
び投与の容易性はフラボピリドールをヒト血管傷害におけるインビボでの細胞周
期阻害の治療的利益を検討すべき優れた候補にしている。

【００６１】本発明者らは、フラボピリドールを経口的に、腫瘍増殖を阻害する濃度の半分
の濃度でヌードマウス異種移植モデルに投与することを選択した⁽²⁷⁾。本発明者
らの検討において、フラボピリドール濃度７５nmol／Ｌがほぼ完全にＳＭＣ増殖
を阻害し、一方メジアン血清濃度４２５nmol／Ｌがヒト不応性癌の第一相の検討
における毒性閾値を下回る用量で得られたことは注目に値する⁽¹⁷⁾。本発明者ら
の結果は、腫瘍形成に使用される用量よりもはるかに低用量の細胞周期阻害剤が
、耐用性を同時に高めるという利益を示しながら再狭窄のような血管疾患を発症
させるのに有効であることを示唆している。

【００６２】本発明者らは、フラボピリドールが培養液中のＨＡＳＭＣの生存能に影響する
ことなく増殖の静止を誘導すること、およびインビボにおいてフラボピリドール
処置後に新内膜の形成が低下することを証明したが、本発明者らは細胞周期静止
が頚動脈損傷における新内膜形成を減少させる唯一の因子であるかどうかは保証
できなかった。フラボピリドールは、観察された細胞タイプに依存してアポトー
シスを誘発しまたは誘発することなく増殖静止を誘導することができる⁽²⁹⁾。興
味あることに、フラボピリドールは、最終的に分化したＰＣ12 細胞においてア
ポトーシスを阻害するが、増殖中の未分化ＰＣ12 細胞においてはアポトーシス
を誘発する⁽²⁸⁾。本発明者らのインビトロ実験は損傷前のＳＭＣの表現型を模倣
する条件下に実施されたが、損傷後にはＳＭＣがフラボピリドールに異なる応答
をしてアポトーシスさえ受ける可能性もある。血管損傷におけるアポトーシスの
役割は不明であるが、ＳＭＣにおけるＦas リガンドの発現がアポトーシスを誘
発し、バルーン損傷後のウサギにおいて新内膜の形成を遮断すること⁽³⁷⁾は、フ
ラボピリドールが、増殖中のＰＣ12 細胞におけるように、実際にインビボでＳ
ＭＣのアポトーシスを誘発することを示唆し、これは新内膜形成に関連する有益
な現象であるかもしれない。傷害形成に対するフラボピリドールの作用に他の機
構が寄与する可能性も考えられる。たとえば、アンチセンスオリゴデオキシヌク
レオチド仲介細胞周期の阻害はウサギ静脈移植において内皮機能を改善する⁽³⁸⁾ 。フラボピリドールの作用機構の解明にはインビボにおけるＳＭＣに対する増殖
静止以外の他の研究が必要である。

【００６３】ラット頚動脈損傷後の傷害形成におけるＳＭＣ増殖の証明された役割^(2.3)を
考慮すれば、インビトロでのフラボピリドールの強力な作用にもかかわらず、興
味あることに、本発明者らのインビボ実験の条件下におけるその新内膜形成阻害
は（有意ではあるが）緩和すぎることは注目すべきである。この観察について、
本発明者らはいくつかの説明を考慮した。損傷後１４日間もの長期間、増殖指数
の差は維持されるているので、加速されたＳＭＣの増殖がフラボピリドールの中
止後に起こることは考えにくい（図７および９）。傷害形成の他の成分、たとえ
ばＳＭＣの遊走および細胞外マトリックスの産生が有意なＳＭＣ増殖の不存在下
にも依然として傷害形成に寄与している、または１日１回のフラボピリドールの
送達は、このモデルにおける増殖を完全に静止させるには不十分であるかのいず
れかの方がよりもっともらしい。フラボピリドールの生物学的半減期が２.５時
間と短いことを示す最近のデータは後者の仮説が正しいことを示唆している。更
なる研究により、さらに有効な投与基準が確認できるものと考えられる⁽³⁹⁾。

【００６４】本発明者らの結果は、フラボピリドールがＳＭＣの増殖、したがって血管損傷
の許容された小動物モデルにおける新内膜の形成を阻害できることを指示する。
ＳＭＣ増殖の阻害のヒト血管傷害における関連性については議論があり、傷害の
性質および増殖の観察を行う時点に依存して異なる可能性があることを指摘しな
ければならない。ヒト粥腫切除標本におけるＳＭＣの増殖指数は著しく低い⁽⁴⁰⁾ が、これらの標本は初期の、損傷発生のより重要な段階における変化を反映して
いない。さらに、新内膜増殖に独立な動脈再形成が、ヒトにおける血管形成後の
管腔傷害の有意な割合を説明する可能性がある⁽⁴¹⁾。これに反し、ＳＭＣにおけ
る有糸分裂活性指数はインステント再狭窄でのヒト損傷からの粥腫切除標本にお
いて、著しく高く（２５％ＰＣＮＡ−陽性）、この方法におけるＳＭＣ過形成の
確立された役割と一致したが、再形成ではこのようなことはない⁽⁴⁾。ステント
置換およびインステント再狭窄の臨床的な問題が増加していることからＳＭＣ過
形成および新内膜形成を停止させる有効な手段の必要性も増大している。フラボ
ピリドールは特異的なＣdk−阻害活性を有する強力な、経口的に利用可能な薬剤
であることから、またヒトにおけるフラボピリドールの安全な用量は既知である
ことから、フラボピリドールはヒトにおけるインステント再狭窄の予防の薬理学
的候補と考えることができる。

【００６５】方法および結果：培養ヒト大動脈平滑筋細胞を用いて本発明者らは７５nmol／
Ｌという低い濃度で、フラボピリドールが塩基性線維芽細胞増殖因子およびトロ
ンビン誘発増殖のほぼ完全な阻害を生じることを見いだした。この用量で、フラ
ボピリドールはヒストンＨ₁のリン酸化により測定したサイクリン依存性キナー
ゼ活性を阻害したが、ＭＡＰキナーゼの活性化には影響しなかった。細胞周期関
連タンパク質、サイクリンＤ₁、増殖中の細胞核抗原およびリン酸化網膜芽腫タ
ンパク質の誘導もフラボピリドールによって遮断された。フラボピリドールは細
胞の生存能には影響しなかった。フラボピリドールがインビボで経口的に投与さ
れた場合にも同じ活性をもつか否かを試験するため、本発明者らはラット頚動脈
におけるバルーン損傷後の新内膜形成を調べた。胃チューブによって投与された
フラボピリドール（５mg／kg）は、損傷後７日および１４日に新内膜の面積をそ
れぞれ３５％および３９％低下させた。

【００６６】結論：フラボピリドールはインビトロおよびインビボでＳＭＣの増殖を阻害す
る。その経口利用性およびサイクリン依存性キナーゼに対するその選択性はそれ
をＳＭＣに富んだ血管傷害の処置における強力な治療手段とする。

【００６７】参考文献１．Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the
1990s. Nature 1993; 362: 801-9。２．Clowes AW, Reidy MA, Clowes MM. Kinetics of cellular proliferation
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【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】フラボピリドールのＨＡＳＭＣにおけるＤＮＡ合成に対する作用を示す。

【図１Ｂ】フラボピリドールのＨＡＳＭＣにおけるＤＮＡ合成に対する作用を示す。

【図２】フラボピリドールのＨＡＳＭＣ増殖に対する作用を示す。

【図３】ＨＡＳＭＣにおけるサイクリン依存性キナーゼ活性に対するフラボピリドール
の作用を示す。

【図４】フラボピリドールによる細胞周期関連タンパク質の調整を示す。

【図５】ＨＡＳＭＣにおけるＭＡＰキナーゼ活性に対するフラボピリドールの作用を示
す。

【図６】フラボピリドール処置後のＨＡＳＭＣの生存能を示す。

【図７】ラット頚動脈のバルーン傷害後新内膜形成のフラボピリドールによる阻害を示
す。

【図８】ラット頚動脈からの組織切片を示す。パネルＡおよびＢは損傷後７日の、そし
てＣおよびＤは損傷後１４日後の動脈からのものである。

【図９】ラット頚動脈におけるバルーン傷害後のＣｄｋ２の発現を示す。パネルＡおよ
びＢは損傷後７日の、そしてＣおよびＤは損傷後１４日後の動脈からのものであ
る。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年３月２３日（２００１．３．２３）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０００７】

【発明の開示】したがって本発明の主題は４−Ｈ−1−ベンゾピラン−４−オン誘導体の平滑
筋細胞増殖のインヒビターとしての使用である。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０００８】添付図面において、図１は、フラボピリドールのＨＡＳＭＣにおけるＤＮＡ合成に対する作用を示
す。１Ａ：休止ＨＡＳＭＣをｂＦＧＦ（１０ng／ml）の不存在下（−）または存在
下（＋）に、指示した濃度のフラボピリドール（nmol／Ｌ）で２４時間処置した
。増殖の指標としてＢrdＵの取り込みを、ＥＬＩＳＡベースのアッセイにより測
定し、ｂＦＧＦ処置の不存在下における取り込みの百分率として表示した。^*ｐ
＜０.０５，非処置細胞との比較。⁺ｐ＜０.０５，フラボピリドールの不存在に
おけるｂＦＧＦ処置との比較；１Ｂ：ＨＡＳＭＣはフラボピリドール（７５nmol／Ｌ）の存在下または不存在
下にｂＦＧＦ（１０ng／ml）、トロンビン（２Ｕ／ml）またはビヒクルにより処
置し、ＢrdＵの取り込みを測定した。^*ｐ＜０.０５，非処置細胞との比較。^**ｐ
＜０.０５，ｂＦＧＦ単独処置との比較。⁺ｐ＜０.０５，トロンビン単独処置と
の比較。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０００９】図２は、フラボピリドールのＨＡＳＭＣ増殖に対する作用。休止ＨＡＳＭＣを
ｂＦＧＦ（１０ng／ml）単独（^*）、ｂＦＧＦとフラボピリドール（７５nmol／
Ｌ）（^*）またはビヒクル（^*）で指示した時間処置し、処置後の細胞数を測定し
た。結果は、ウエルあたりの細胞数（×１０³）で表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 １０５Ａ６１Ｐ 43/00 １０５１１１１１１Ｃ０７Ｄ 405/04 Ｃ０７Ｄ 405/04 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ウィンストン・カムブル・パタースンアメリカ合衆国テキサス州77550．ガルヴェストン．アヴェニュー・エム1915 (72)発明者ジェニファー・エイ・デューモントアメリカ合衆国マサチューセッツ州01450．グロートン．フォーンテラスレーン37 Ｆターム(参考） 4C063 AA01 BB01 CC79 DD10 EE01 4C086 AA01 AA02 BC21 GA02 GA07 MA01 MA04 NA14 ZA36 ZA45 ZA94 ZB21 ZB26 ZC20

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】平滑筋細胞の増殖を阻害する方法において、式Ｉ【化１】［式中、Ｒ₁は、水素；１〜６個の炭素原子を有するアルキル；アリール−Ｃ₁〜Ｃ₄−
アルキル；ハロゲン、ヒドロキシもしくはカルボキシにより置換されたＣ₁〜Ｃ₆ −アルキル；Ｃ₃〜Ｃ₆−シクロアルキル；ピリジル；チエニル；Ｃ₃〜Ｃ₆−シク
ロアルキル−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル；Ｃ₂〜Ｃ₆−アルケニル；Ｃ₂〜Ｃ₆−アルキニ
ル；フェニル；ハロゲン、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルコキシ、ヒドロ
キシル、カルボキシル、ＣＯＯ−アルキル、ＣＯＮＨ₂、ＣＯＮＨ−アルキル、
ＣＯＮ(アルキル)₂、ニトロ、トリフルオロメチル、アミノ、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキ
ルアミノ、ジ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルアミノもしくはフェニルによってモノもしく
はポリ置換されたフェニル；ナフチル、カルボキシル、−ＣＨＯ、ＣＯＯ−Ｃ₁
〜Ｃ₄−アルキル、一級アミノ、アルキルアミノ、アラルキルアミノ、ジアルキ
ルアミノ、アミド、アリールアミノ、ジアリールアミノまたは−ＣＨ₂Ｏ−Ｃ₁〜
Ｃ₄−アルキルであり、Ｒ₂は、水素；１〜６個の炭素原子を有するアルキル；アリール；ニトロ；ア
ミノ；ジ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルアミノ；ハロゲン；ヒドロキシル；アルコキシ；
−ＣＯＯＨ；−ＣＯＯ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル；−ＣＨＯ；−ＣＨ₂ＯＨまたは−
ＣＨ₂Ｏ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルであり、Ｒ₃は水素；Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル；ハロゲン、ヒドロキシもしくはカルボキシ
によって置換されたＣ₁〜Ｃ₄−アルキル；ヒドロキシル；カルボキシル；ニトロ
；アミノ；Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルアミノ；ジ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルアミノ；ハロゲ
ン；−Ｏ−アルキル−Ｃ(Ｏ)−アルキル；−ＣＨＯ；−ＣＨ₂ＯＨ；−ＣＨ₂Ｏ−
Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル；Ｒ₂Ｎ−Ｃ(Ｏ)−Ｏ−（式中、ＲはＨ、Ｃ₁〜Ｃ₆−アルキ
ル；シクロアルキルである）または−Ｏ−アルキル−Ｃ(Ｏ)−アルキルもしくは
アリールであり、Ｒ₄は、水素；ヒドロキシル；Ｃ₁〜Ｃ₄−アルコキシ、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルカノイ
ルオキシ、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルコキシカルボニル；アリールオキシ；アミノ；Ｃ₁〜
Ｃ₄−アルキルアミノ；ジ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルアミノ；またはＲ′₂−Ｎ−Ｃ(
Ｏ)−Ｏ−（式中、Ｒ′はＨ、Ｃ₁〜Ｃ₆−アルキル；シクロアルキルまたはアリ
ールである）であり、Ｒ₅は、水素、Ｃ₁〜Ｃ₆−アルキル；アリール−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル；Ｃ₃〜Ｃ ₆ −シクロアルキル；Ｃ₃〜Ｃ₆−シクロアルキル−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル；アルキ
ルアミノ；Ｃ₁〜Ｃ₄−アルカノイル；−Ｃ(Ｏ)−Ｏ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルまたは
アロイルであり、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅中のアリール基は非置換フェニルであるかまた
はハロゲン、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルコキシ、ヒドロキシル、カル
ボキシル、ＣＯＯ−アルキル、ＣＯＮＨ₂、ＣＯＮＨ−アルキル、ＣＯＮ（アル
キル)₂、ニトロ、トリフルオロメチル、アミノ、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルアミノ、ジ
−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルアミノまたはフェニルによってモノまたはポリ置換された
フェニルであり、ｍは０〜３の整数であり、ｎは１である］の化合物またはそれらの医薬的に許容される酸付加塩の有効量を患者に投与する
ことからなる方法。
【請求項２】化合物は式Ｉａ【化２】［式中、Ｒ₁は、水素；Ｃ₁〜Ｃ₃−アルキル；ナフチル；フェニル；ハロゲン、Ｃ₁〜Ｃ ₄ −アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルコキシ、ヒドロキシル、カルボキシル、ＣＯＯ−
アルキル、ＣＯＮＨ₂、ＣＯＮＨ−アルキル、ＣＯＮ(アルキル)₂、ニトロ、トリ
フルオロメチル、アミノ、Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルアミノ、ジ−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキル
アミノもしくはフェニルによってモノもしくはポリ置換されたフェニル；ピリジ
ル；またはチエニルであり、Ｒ₂は、水素またはＣ₁〜Ｃ₃−アルキルであり、Ｒ₅は、Ｃ₁〜Ｃ₃−アルキル；Ｃ₃〜Ｃ₅−シクロアルキル；またはＣ₃〜Ｃ₅−
シクロアルキル−Ｃ₁〜Ｃ₄−アルキルである］の化合物である請求項１記載の方法。
【請求項３】式Ｉａの置換基は以下の意味、すなわちＲ₁は、フェニル、チエニル、ピリジル、クロロフェニル、ジクロロフェニル
、メチルフェニル、アミノフェニル、ブロモフェニル、ヒドロキシフェニルまた
はナフチルであり、Ｒ₂は水素であり、Ｒ₅はメチルである、請求項２記載の方法。
【請求項４】化合物は、(−)−シス−５,７−ジヒドロキシ−２−（２−
クロロフェニル）−８−［４−（３−ヒドロキシ−１−メチル）ピペリジニル］
−４Ｈ−ベンゾピラン−４−オン（フラボピリドール）である請求項１記載の方
法。
【請求項５】平滑筋細胞の増殖を阻害する医薬の製造のための請求項１〜
４のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項６】医薬は平滑筋細胞に富んだ血管病変の処置用である請求項５
記載の使用。
【請求項７】医薬はバルーン外傷後の損傷の処置用である請求項５または
６記載の使用。
【請求項８】医薬はステント移植後の患者の処置用である請求項５または
６記載の使用。
【請求項９】平滑筋細胞の増殖を阻害するための請求項１〜４のいずれか
に記載の化合物を含有する医薬。
【請求項１０】腫瘍の増殖を制御するために必要な投与量の７０％未満、
好ましくは６０％未満、とくに好ましくは５０％未満の投与量で化合物の投与を
行う請求項９記載の医薬。